EP2582370A1 - Compositions à base de flavones et d'anthelminthiques - Google Patents

Compositions à base de flavones et d'anthelminthiques

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Publication number
EP2582370A1
EP2582370A1 EP11735482.9A EP11735482A EP2582370A1 EP 2582370 A1 EP2582370 A1 EP 2582370A1 EP 11735482 A EP11735482 A EP 11735482A EP 2582370 A1 EP2582370 A1 EP 2582370A1
Authority
EP
European Patent Office
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group
formula
flavone
use according
vertebrate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11735482.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Dominique Kerboeuf
Fabrice Guegnard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2582370A1 publication Critical patent/EP2582370A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents

Definitions

  • the present invention relates to compositions based on flavones and anthelmintics and their uses for the treatment of parasitoses.
  • Polyparasitism is common in most higher eukaryotic organisms, but it is not always possible to effectively control the causative parasites. Despite the existence of therapeutic agents belonging to different chemical families, the detection and eradication of a parasite in a higher organism remains very difficult. On the one hand, the resulting pathologies (vitamin and mineral deficiencies, anemia, abnormal hematopoiesis, immune system deficiency, etc.) are not always specific for a parasitosis or a type of parasite, other the intensity of the disorders observed in the host depends on many factors, such as its resistance to parasites (itself dependent on its age, sex, general condition, environment and lifestyle), but also number and different types of parasites that feeds without his knowledge.
  • the prevention of parasitosis is possible by a modification of the ecosystem (for example by the destruction of mosses on pastures which constitute a shelter for the free stages of parasites), and especially by chemical treatment.
  • This last method of prophylaxis is restrictive and sometimes toxic for the host to be treated and for the environment in which residues are released.
  • resistant parasites are gradually selected in the parasite population.
  • the parasites are also capable of becoming resistant to several chemical families of antiparasitics according to the mechanism of multiple drug resistance (MDR), known for other classes of therapeutic agents and which also concerns pest Control.
  • MDR multiple drug resistance
  • chemoresistance mainly involves the presence of efflux membrane pumps, which allow the parasites to prevent the entry of toxic compounds into their cytoplasm and return them to the extracellular medium.
  • the best known efflux pump is the P-glycoprotein (P-gp or Pgp), which belongs to the ABC transporter family (ATP Binding Cassette) (Xu, M., Molento, M., Blackhall, W., Ribeiro , P., Beech, R., Prichard, R.
  • Ivermectin resistance in nematodes may be caused by alteration of P-glycoprotein homolog. Mol. Biochem. Parasitol. (1998) 91 (2) : 327-35); Kerboeuf, D., Blackhall, W., Kaminsky, R., von Samson-Himmelstjerna, G. P-glycoprotein in helminths: Function and perspectives for anthelmintic treatment and reversal of resistance. Int. J. Antimicrob. agents . (2003) 22 (3) : 332-46). Two publications mention the use of inhibitors of this protein pump to reinforce the action of two antiparasitics: moxidectin (MOX) and ivermectin (IVM).
  • MOX moxidectin
  • IVM ivermectin
  • the quercetin dose should be 12-fold higher in susceptible nematodes and 27-fold in resistant nematodes (Bartley, D., J., McAllister, H. ., Bartley, Y., Dupuy, J. Ménez, C., Alvinerie, M., Jackson, F., Lespine, A.
  • P-glycoprotein interfering agents ivermectin potentiate susceptibility in ivermectin sensitive and resistant isolates of Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus. Parasitology (2009) 136 1081-1088, Cambridge University Press).
  • WO2009 / 018326 describes methods for formulating various flavonoids for various therapeutic applications and, inter alia, an increased effect on human P-gp resulting from a better solubilization of fisetine. Kitagawa et al.
  • Kitagawa et al. demonstrate that it does not significantly inhibit human P-gp, unlike quercetin.
  • the inhibitory action of quercetin against nematode P-gp was comparable to that found by Kitagawa et al . vis-à-vis the human P-gp.
  • WO 02/069949 discloses compositions comprising circilliol or trimethoxyflavones associated with antiparasitic compounds and for treating parasitic diseases in humans; none of the parasites mentioned is a nematode. In addition, the only examples relate to antitumor activity.
  • WO 2008/0859925 describes the activity of new flavones from Struthiola Argenta on the nematode H. contortus. The majority of these flavones are inactive in vitro and in vivo .
  • WO 01/03681 describes the use of flavone derivatives, optionally combined with other anti-infective agents in the treatment of parasites that are not nematodes. At no time is there any mention of any synergy between the flavones and the compounds to which they could be associated.
  • WO 2007/135592 discloses flavone dimers and their ability to reduce the drug resistance of certain parasites.
  • the parasites specifically described are those of the genus Leishmania and the drugs stibogluconate and pentamidine.
  • Apigenin dimers inhibit and reverse pentamidine resistance in the genus Leishmania while the monomers are not active.
  • the present invention therefore follows from the surprising discovery made by the inventors, that certain flavonoid P-gp inhibitors of vertebrates do not have the same inhibitory efficiency with respect to p-gp parasites on which they have proved to be much more assets.
  • the present invention thus provides novel flavone-based antiparasitic treatments, targeting more specifically the p-gp parasites, unlike those based on quercetin described by Dupuy et al. , and by Bartley et al. previously mentioned, which act as well on the P-gp of the host as on that of the parasite.
  • An object of the present invention is therefore to provide novel preventive and curative antiparasitic treatments, said treatments having a significant safety for the host to be treated and for its environment, also having a significant efficacy against sensitive nematodes and / or nematodes resistant, including with a lower than normal dose of pest control.
  • This invention therefore has three important advantages. It firstly makes it possible to increase the bioavailability of parasiticides in parasites, and thus to reduce the amount to be used and administered to the host because of an increased efficacy against parasites.
  • the present invention relates firstly to a composition for pharmaceutical or veterinary use comprising at least one anthelmintic compound and at least one compound of one of the flavonoid families, the flavones of formula (I) below: wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, and present in an amount making it possible to increase the bioavailability of the at least one anthelmintic compound by inhibition of P-glycoprotein in nematodes, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another
  • antihelmintic compound or antihelminthic compound is meant a pest control compound which makes it possible to kill (vermicidal action) at least one type of worm belonging to the phylum Helminthes metazoans or allowing its expulsion (deworming action) out of the 'host.
  • the anthelmintic activity of a compound can for example be measured by an Egg Hatch Test (EHT) for compounds belonging to the benzimidazole family, or by a larval development test ( LDT, "Larval Development Test”) for macrocyclic lactones, and any other type of equivalent test.
  • EHT Egg Hatch Test
  • LDT larval development test
  • holosides as well as diholosides and triholosides; non-limiting examples include apioglucose, galactose, glucose, glucopyranose, glucuronic acid, laminaribiose, neohesperidosis, primeverose, rhamnose, robinose, rutinose and sambubiosis.
  • glycosidic bond is meant an O-glycosidic or C-glycosidic bond, preferably O-glycosidic.
  • glycoprotein P is meant the glycoprotein known to those skilled in the art for its involvement in multidrug resistance. It is a transmembrane receptor of the plasma membrane, existing in various forms in many eukaryotes, and capable of expelling some xenobiotics present in the cytoplasm to the extracellular medium thanks to the energy provided by ATP consumption. .
  • glycoprotein P is meant a lowering of the antixenobiotic activity of P-gp. This lowering results in a decrease in the LD50 (lethal dose killing 50% of the population) for a xenobiotic (including an anthelmintic) and an organism considered. This lowering of the LD50 can be visualized by a larval development test (LDT) whatever the compound used. Inhibition can also be demonstrated by in vitro measurement of the efflux activity of the pump ("Rhodamine 123 assay").
  • nematode any type of round worm belonging to the phylum Helminthes Metazoans. Examples of major nematode genera in biology and parasitic pathology are given below.
  • flavones represented by the general formula (I) are: acacetin, apigenin, chrysin, chrysoerol, diosmetin, eupatilin, galangin, luteolin, oroxylin A, robinetin, scutellarein, tricine, wogonine, and in particular baicalein, fisetine, kaempferol, myricetin, geraldol, and silybin.
  • hydroxy precursor group any group which can be metabolized in vivo to give an OH group, for example an ester group, an ether group, an alkoxy group, especially methoxy (as in the formula of geraldol), a sulfonate group, a ketone or an aldehyde.
  • ester group By way of example of an ester group, mention may be made of the groups - (CO) -R where R represents a hydrogen atom or a straight or branched (C 1 -C 5 ) alkyl group chosen from the group comprising methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, pentyl, and 2-methylbutyl. These alkyl groups may be partially or fully halogenated, i.e., the hydrogen atoms may be partially or completely replaced by the same or different halogen atoms.
  • only the group R7 of the general formula (I) is a sugar as defined above.
  • said composition for pharmaceutical or veterinary use is a composition in which the at least one flavone of formula (I) has the following formula (II): wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 are as previously defined.
  • said composition for pharmaceutical or veterinary use is a composition in which the at least one flavone of formula (I) is a flavonol corresponding to the following formula (III): wherein R1, R2, R3, R5 and R7 are as previously defined, said flavonol of formula (III) being chosen in particular from the group comprising fisetine and myricetin.
  • Flavone is meant the flavone of formula (III) in which R1, R2 and R7 represent an OH group and R3 and R5 represent a hydrogen atom.
  • myricetin is meant the flavone of formula (III) in which R1, R2, R3, R5 and R7 represent an OH group.
  • Another object of the present invention is a composition for pharmaceutical or veterinary use according to any one of the preceding definitions, for its use in the treatment or prevention of parasitosis in a vertebrate.
  • parasitosis in particular a helminthiasis.
  • the parasitosis is a nematodosis.
  • nematodosis is meant a parasitosis due to a nematode, in particular a trichostrongylosis, for example a haemonchosis.
  • Haemonchosis means parasitosis by the Haemonchus contortus nematode, a study model for trichostrongyloses.
  • the parasitosis involves at least one so-called resistant parasite.
  • Parenter means a eukaryotic animal or plant that lives at least part of its existence at the expense of another organism.
  • resistant is meant a chemo-resistant parasite. This chemoresistance is present when the frequency of parasites able to tolerate doses of conventional pest control compounds is higher in a population than in a normal population of parasites of the same species. It is moreover transmissible to the descendants. (PRICHARD RK et al., The problem of anthelmintic resistance in nematodes, Australian Veterinary Journal, (1980), 56 : 239-51).
  • resistance resistance to a single molecule
  • family resistance resistance to two or more compounds of the same family of antiparasitic agents
  • multiple resistance resistance to at least two compounds belonging to a single molecule
  • cross-resistance resistance to several antiparasitic agents conferred by one or more mutations occurring on a gene.
  • Each resistance can be further primary (appeared before the beginning of the pest control) or secondary (appeared during said treatment).
  • resistant used in the context of the present invention refers to a simple resistance at least but the invention applies to cases of cross resistance, family or multiple, whether primary or secondary type.
  • this resistance can be induced by many factors.
  • resistant strains of H. contortus have been shown to have a higher than normal number of P-gp efflux pumps, thereby more easily eliminating the doses of antiparasitic agents (KERBOEUF, D. P-glycoprotein in helminths: function and perspectives for anthelmintic treatment and reversal of resistance, Int J Antimicrob Agents (2003), 22 (3) : 332-46).
  • the parasite is a resistant nematode.
  • the vertebrate is selected from the group consisting of bovines, goats (sheep and goats), equines, birds and humans.
  • the dosage of anthelmintic and flavones of formula (I) depends particularly on the mode of administration, and is easily determined by those skilled in the art. Likewise, the choice of an acceptable pharmaceutical or veterinary vehicle is determined by those skilled in the art.
  • the compounds of formula (I) may further be administered in an encapsulated, in particular nanoencapsulated, form in pegylated liposomes, or in sustained release or sequential release forms or in forms including solubilizing agents (for example cyclodextrins such as described in WO2009 / 018326) so as to increase their bioavailability.
  • the treatment may be continuous or sequential, delivering said compounds, pharmaceutical or veterinary compositions in a continuous manner and possibly constant, or in discontinuous form, by one or more daily administrations, possibly renewed several days, either consecutive, or with latency without treatment between administrations.
  • compositions of the invention may in particular be administered systemically (generally) enterally or parenterally, and topically.
  • entertal means in particular the bone orally or per the perlinguale way and rectal.
  • parenteral route is meant in particular the subcutaneous route, the intramuscular route and the intravenous route.
  • topical route is meant in particular the nasal route, the pulmonary route, the cutaneous or percutaneous or trans-dermal route.
  • compositions for pharmaceutical or veterinary use comprising at least one anthelmintic compound and at least one flavone of formula (I) below: wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy, and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, and making it possible to increase the bioavailability of the anthelmintic compound by inhibiting P-glycoprotein in nematodes, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin, for simultaneous administration, sequential or spread over time.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen
  • compositions comprising at least one anthelmintic agent and at least one flavone of formula (I) below: wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin, to lower the resistance of the nematodes to the at least one said anthelmintic agent.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic
  • Another object of the invention is therefore a method for lowering the resistance of nematodes to at least one anthelmintic agent, said method comprising administering to a subject in need thereof, a compound of formula (I) in free form. or as a pharmaceutically acceptable salt, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin.
  • composition for pharmaceutical or veterinary use according to any one of the preceding definitions, is formulated for oral, parenteral or topical administration.
  • Yet another object of the present invention is a combination for increasing the bioavailability of at least one anthelmintic compound which comprises the at least one said anthelmintic compound and a sufficient amount of at least one flavone of the following formula (I): wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin, in a form usable for co-administration.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group
  • Yet another object of the present invention is the use of at least one flavone of formula (I) below: wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin, for the preparation of a drug capable of inhibiting P-glycoprotein in nematodes and treating parasitic diseases, especially nematodoses.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a a precursor group of hydroxy and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (I) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavone of formula (I) being in free form or in pharmaceutically acceptable salt form, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin, for the preparation of a medicament capable of increasing the bioavailability of anthelmintics in nematodes.
  • the at least one flavone of formula (I) corresponds to the following formula (II): wherein R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a precursor group hydroxy selected from the group consisting of an ester group, an ether group, an alkoxy group, a sulfonate group, a ketone or an aldehyde and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (II) by its anomeric carbon via a glycosidic bond.
  • R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a precursor group hydroxy selected from the group consisting of an ester group, an ether group, an alkoxy group, a sulfonate group, a ketone or an alde
  • the at least one flavone of formula (I) is a flavonol corresponding to the following formula (III): wherein R1, R2, R3, R5 and R7 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a chosen hydroxy precursor group; in the group comprising an ester group, an ether group, an alkoxy group, a sulphonate group, a ketone or an aldehyde and a sugar bonded to one of the aromatic rings of the flavone of formula (III) by its anomeric carbon via a glycosidic bond, said flavonol of formula (III) being chosen in particular from the group comprising fisetine and myricetin.
  • R1, R2, R3, R5 and R7 independently of one another are an atom or a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, an OH group, a chosen hydroxy precursor group; in the group comprising an ester group, an ether group, an
  • the at least one anthelmintic is chosen from the group comprising: levamisole; macrocyclic lactones selected from the group comprising avermectins such as ivermectin, eprinomectin, abamectin, doramectin, or the group comprising milbemycins such as moxidectin; the benzimidazole derivatives chosen from albendazole, thiabenzole, mebendazole, fenbendazole, oxfendazole, febantel, and oxibendazole.
  • levamisole macrocyclic lactones selected from the group comprising avermectins such as ivermectin, eprinomectin, abamectin, doramectin, or the group comprising milbemycins such as moxidectin
  • the benzimidazole derivatives chosen from albendazole, thiabenzole, me
  • the compounds are used in the treatment or prevention of parasitosis in a vertebrate, in particular a nematodosis, especially a haemonchosis.
  • the parasitosis involves at least one so-called resistant parasite, especially a resistant nematode.
  • the subject of the present invention is a method for increasing the bioavailability of an anthelmintic in nematodes comprising administering to a subject in need thereof, a compound of formula (I) in free form or in pharmaceutically acceptable salt form. acceptable, provided that the flavone of formula (I) is not quercetin.
  • FIGS. 1a and 1b are histograms representing the results obtained for Rhodamine 123 accumulation tests according to the protocol given in example 1. They concern 14 flavonoids and 3 other assimilated compounds (naphthoflavone, silybin and xanthone) tested at different concentrations (20, 50, 100, and 200 ⁇ M). These Figures are ordered the percentage of accumulation of rhodamine 123 relative to the control without modulator in the eggs of model nematode Haemonchus contortus sensitive (HcS-Weyb - solid rectangles) or resistant (HcR-Guad - hatched rectangles). The abscissa gives the name and concentration of the compounds tested which have been added individually to the media containing said eggs:
  • the amount of R123 accumulating in eggs in the presence of a potent ATPase inhibitor, sodium orthovanadate, is approximately 500%.
  • the lack of results corresponds to product concentrations with solubility problems.
  • Figures 2a and 2b show the results given in Figure 1 as curves.
  • the abscissae of Figures 2a and 2b indicate the concentration (in ⁇ M) of each potential inhibitor. Their ordinates are identical to those of Figures 1a and 1b.
  • Figure 1a H. sensitive contortus
  • Figure 1b H. resistant contortus .
  • Figures 3a, 3b and 3c represent the three best results obtained for larval developmental tests (LDT). Each figure has for ordinate the percentage of larvae which develop according to the quantity of anthelmintic used, and given as abscissa.
  • the anthelmintics used are eprinomectin for Figure 3a and 3b and doramectin for Figure 3c. Each curve represents a different combination of an anthelmintic and an inhibitor.
  • the anthelmintic combination and its solvent DMSO 1% is used as a negative control (absence of inhibitor of P-gp).
  • Figure 4 shows other results obtained for larval development tests (LDT).
  • the two histograms (the left one for the sensitive nematodes and the right one for the resistant ones) have, as ordinates, the percentage of additional parasite reduction compared with the anthelmintic alone for the different combinations of anthelmintic (doramectin or eprinomectin) and inhibitor (fisetin or myricetin).
  • the abscissae of the histograms indicate the type of anthelmintic used.
  • Figure 5 illustrates additional reduction results (%) related to addition of P-gp inhibitor to anthelmintic for number of worms and number of eggs (OPG, eggs per gram of faeces) of the nematode H. resistant contortus obtained for an in vivo test in lamb.
  • the anthelmintic and inhibitor selected for this trial were among those that gave the best results in in vitro tests, namely doramectin and fisetine (respectively). Eprinomectin not currently receiving marketing authorization for sheep in France was not selected for this trial.
  • Figures 6a, 6b, 6c give results obtained for a new in vivo test in the parasite load lamb reduction and the number of resistant H. contortus fecal eggs.
  • Figure 6a shows the results obtained for the OPG test. It has for ordinate the percentage of reduction of the number of fecal eggs.
  • Figure 6b is ordered the parasitic load expressed in number of worms 14 days after treatment, and Figure 6c the percentage reduction of the parasite load (established from the data of Figure 6b).
  • the abscissa of these three figures represents the quantity of anthelmintic administered (expressed in ⁇ g / kg body weight of treated vertebrate).
  • Example 1 r ed results obtained for tests of ' accumulation of Rhodamine 123 ( “ R123 assay " ) with quantification spectrofluo rim th be
  • Example 2 d tests ed larval development (LDT) in n ed nematodes
  • Example 3 tests in vivo at l ' lamb infest ed by H. contortus r ed sistants
  • the experiment was conducted on infested 3-month-old lambs with 6000 nematode larvae Haemonchus contortus isolate resistant to anthelmintics on day 0 (D0).
  • D33 with doramectin solution for injection at low doses (10 to 30 ⁇ g / kg depending on the batch of animals) compared to the dose recommended by the manufacturer (200 ⁇ g / kg for sensitive parasites).
  • the doses are higher than 400 ⁇ g / kg, sometimes 600 ⁇ g / kg.
  • One in two animals is treated with fisetine administered for 5 days (D33 to D37) in subcutaneous injection and in addition.
  • the experiment was conducted on 3-month-old lambs infested with 6000 Haemonchus contortus nematode larvae, an anthelmintic resistant isolate at day 0 (D0).
  • D39 doramectin solution for injection at different doses, including the manufacturer's recommended dose (200 ⁇ g / kg body weight of treated vertebrate), a lower dose (100 ⁇ g / kg body weight of treated vertebrate) , and a dose currently used for the treatment of lambs infected with resistant nematodes (400 ⁇ g / kg body weight of treated vertebrate) but not recommended by the manufacturer.
  • One animal in two is treated with fisetin administered for 5 days (D39 to D43) orally in addition to the dose of 30 mg / kg.
  • the control of the infestation is done by coproscopic examinations (count of the eggs emitted by worms in the feces) at day 50 and by counting the number of adult worms in the abomasum at day 53.

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Abstract

Compositions à base de flavones et d' anthelminthiques, et leurs utilisations pour le traitement de parasitoses dues à des nématodes.

Description

    COMPOSITIONS À BASE DE FLAVONES ET D’ANTHELMINTHIQUES
  • La présente invention a pour objet des compositions à base de flavones et d’anthelminthiques et leurs utilisations pour le traitement de parasitoses.
  • Le polyparasitisme est fréquent chez la plupart des organismes eucaryotes supérieurs, sans qu’il ne soit toujours possible de combattre avec efficacité les parasites responsables. Malgré l’existence d’agents thérapeutiques appartenant à différentes familles chimiques, la mise en évidence et l’éradication d’un parasite chez un organisme supérieur reste très difficile. En effet, d’une part les pathologies résultantes (carences en vitamines et minéraux, anémie, hématopoïèse anormale, déficience du système immunitaire, etc.) ne sont pas toujours spécifiques d’une parasitose ou d’un type de parasite, d’autre part l’intensité des troubles observés chez l’hôte dépend de nombreux facteurs, tels que sa résistance aux parasites (elle-même fonction de son âge, son sexe, son état général, son environnement et son mode de vie), mais aussi du nombre et des différents types de parasites qu’il alimente à son insu.
  • La prévention des parasitoses est possible par une modification de l'écosystème (par exemple par destruction des mousses sur les pâturages qui constituent un abri pour les stades libres de parasites), et surtout par traitement chimique. Cette dernière méthode de prophylaxie est contraignante et parfois toxique pour l’hôte à soigner et pour l’environnement dans lequel des résidus sont libérés. De plus, des parasites résistants sont petit à petit sélectionnés dans la population de parasites.
  • L’apparition de parasites résistants à une famille d’antiparasitaires est particulièrement dommageable dans les élevages où les éleveurs administrent alors des antiparasitaires à leurs animaux à des doses souvent très supérieures à celles recommandées, pensant de cette façon augmenter leur efficacité. La toxicité des traitements devient dès lors importante pour les animaux soignés, et ne permet généralement pas l’élimination des parasites les plus résistants, qui se trouvent être en outre avantagés par la disparition des parasites dits sensibles. Aucune de ces solutions n’est donc sans conséquence pour l’hôte infesté ou pour l’environnement.
  • Les parasites sont aussi capables de devenir résistants à plusieurs familles chimiques d’antiparasitaires selon le mécanisme de la résistance multiple aux médicaments (MDR, « multi-drug resistance »), connue pour d’autres classes d’agents thérapeutiques et qui concerne également les antiparasitaires. Dans ce cas, la chimiorésistance implique principalement la présence de pompes membranaires d’efflux, qui permettent aux parasites d’empêcher la pénétration des composés toxiques dans leur cytoplasme et de les renvoyer dans le milieu extracellulaire. La plus connue des pompes d’efflux est la glycoprotéine P (P‑gp ou Pgp), qui appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette) (Xu, M., Molento, M., Blackhall, W., Ribeiro, P., Beech, R., Prichard, R. Ivermectin resistance in nematodes may be caused by alteration of P-glycoprotein homolog. Mol. Biochem. Parasitol. (1998), 91(2): 327-35) ; Kerboeuf, D., Blackhall, W., Kaminsky, R., von Samson-Himmelstjerna, G. P‑glycoprotein in helminths: function and perspectives for anthelmintic treatment and reversal of resistance. Int. J. Antimicrob. Agents. (2003), 22(3): 332-46). Deux publications mentionnent l’utilisation d’inhibiteurs de cette pompe protéique pour renforcer l’action de deux antiparasitaires : la moxidectine (MOX) et l’ivermectine (IVM). La première publication de Dupuy et al. décrit la co-administration sous-cutanée de quercétine (un composé naturel de la famille des flavonoïdes) et de moxidectine, la quercétine permettant d’accroître in vivo la biodisponibilité de la moxidectine chez l’agneau ; dans cet article, les auteurs montrent un blocage de la glycoprotéine P de l’hôte, et ne mentionnent aucun effet chez le parasite ni sur des nématodes résistants. L’augmentation de la moxidectine dans les tissus de l’hôte a certes pour conséquence une augmentation de la concentration d’anthelminthique au site d’implantation du parasite mais en même temps, les résidus sont multipliés par deux dans l’organisme du vertébré et dans les produits qu’il excrète (bile et sécrétions intestinales) entraînant ainsi un doublement non souhaitable de la contamination de l’environnement. (Dupuy, J., Larrieu, G., Sutra, J. F., Lespine, A. and Alvinerie, M. Enhancement of moxidectin bioavailability in lamb by a natural flavonoid: quercetin. Veterinary Parasitology (2003), 112(4): 337-347). La deuxième publication de Bartley et al. décrit quant à elle l’effet potentialisateur in vitro de la quercétine sur l’action de l’ivermectine contre le nématode Teladorsagia circumcincta. Néanmoins, pour obtenir un effet identique à celui observé pour l’inhibiteur de référence le valspodar, la dose de quercétine doit être 12 fois plus élevée chez les nématodes sensibles et 27 fois chez les nématodes résistants (Bartley, D., J., McAllister, H., Bartley, Y., Dupuy, J. Ménez, C., Alvinerie, M., Jackson, F., Lespine, A. P-glycoprotein interfering agents potentiate ivermectin susceptibility in ivermectin sensitive and resistant isolates of Teladorsagia circumcincta and Haemonchus contortus. Parasitology (2009), 136: 1081-1088, Cambridge University Press).
  • Cependant, si la quercétine semble dans ces deux cas renforcer l’action des antiparasitaires (MOX et IVM), celle-ci inhibe aussi de façon inévitable les pompes P‑gp des vertébrés (voir Dupuy et al., précédemment cité), les privant de ce fait d’un système de détoxification vital.
  • Il existe par conséquent un besoin important en nouveaux traitements antiparasitaires, qui soient efficaces à la fois contre les parasites sensibles et résistants, et qui préservent d'autre part la santé de l’hôte infesté ainsi que son environnement.
  • Parmi les inhibiteurs de pompes P-gp figurent des composés naturels appartenant à la famille des flavonoïdes. WO2009/018326 décrit des modalités de formulation de divers flavonoïdes en vue d’applications thérapeutiques variées et, entre autres, un effet accru vis-à-vis de P-gp humaines résultant d’une meilleure solubilisation de la fisétine. Kitagawa et al. décrivent pour leur part l’action inhibitrice de flavonoïdes tels que le kaempférol, la baicaleine, la myricétine, la fisétine, et la morine sur les pompes P-gp de cellules humaines KB-C2, et ce par le contrôle de l’accumulation d’un anticancéreux à l’intérieur de celles-ci (Kitagawa, S., Nabekura, T., Takahashi, T., Nakamura, Y., Sakamoto, H., Tano, H., Hirai, M., Tsukahara, G. Structure-activity relationships of the inhibitory effects of flavonoids on P-glycoprotein-mediated transport in KB-C2 cells. Biol. Pharm. Bull. (2005), 28(12): 2274-8). Cependant, si la fisétine est citée dans ces deux publications, Kitagawa et al. démontrent qu’elle inhibe de façon peu importante les P‑gp humaines, contrairement à la quercétine. L’action inhibitrice de la quercétine vis-à-vis des P-gp de nématodes s’est montrée comparable à celle constatée par Kitagawa et al. vis-à-vis des P‑gp humaines. Rien ne laissait donc à penser que l’action inhibitrice d’autres flavonoïdes de la même famille chimique serait supérieure sur les P‑gp des nématodes par rapport aux P-gp de vertébrés.
  • Wong et al. (Journal of Antimicrobial chemotherapy, 2009, 63, 1179-1190) décrivent un effet synergique entre la quinacrine, antipaludéen dérivé de la quinine et un dimère de l’apigénine dont la structure est différente des composés utilisés dans la présente invention sur un protozoaire Leishmania résistant à la pentamidine. Cette action synergique est liée aux effets respectifs de chaque composé et non pas à une modification de la biodisponibilité de l’un par l’autre.
  • WO 02/069949 décrit des compositions comprenant du circilliol ou des triméthoxyflavones associés à des composés antiparasitaires et permettant de traiter des maladies parasitaires chez l’homme ; aucun des parasites cités n’est un nématode. Par ailleurs les seuls exemples concernent une activité antitumorale.
  • WO 2008/0859925 décrit l’activité de nouvelles flavones issues de Struthiola Argenta sur le nématode H. contortus. La majorité de ces flavones sont inactives in vitro et in vivo.
  • WO 01/03681 décrit l’utilisation de dérivés de flavones, éventuellement associées à d’autres agents antiinfectieux dans le traitement de parasites qui ne sont pas des nématodes. A aucun moment il n’est mentionné une quelconque synergie entre les flavones et les composés auxquels elles pourraient être associées.
  • WO 2007/135592 décrit des dimères de flavones et leur capacité à réduire la résistance aux drogues de certains parasites. Les parasites spécifiquement décrits sont ceux du genre Leishmania et les drogues le stibogluconate et la pentamidine. Les dimères de l’apigénine inhibent et renversent la résistance à la pentamidine chez le genre Leishmania alors que les monomères ne sont pas actifs.
  • Young-Ah Yoon et al. rapportent les résultats d’une étude de structure-activité sur 13 flavones testées sur C. elegans nématode libre utilisé comme modèle d’étude d’une activité anthelminthique. Ces flavones ne sont jamais associées à d’autres antiparasitaires et les problèmes de résistance aux drogues ne sont pas abordés.
  • La présente invention découle donc de la découverte surprenante réalisée par les inventeurs, que certains flavonoïdes inhibiteurs de P‑gp des vertébrés ne possèdent pas la même efficacité inhibitrice vis-à-vis des P‑gp de parasites sur lesquelles ils se sont révélés beaucoup plus actifs. La présente invention offre de ce fait de nouveaux traitements antiparasitaires à base de flavones, ciblant plus spécifiquement les P‑gp de parasites, contrairement à ceux à base de quercétine décrits par Dupuy et al., et par Bartley et al. précédemment cités qui agissent aussi bien sur la P-gp de l’hôte que sur celle du parasite.
  • Un objectif de la présente invention est donc de fournir de nouveaux traitements préventifs et curatifs antiparasitaires, lesdits traitements ayant une innocuité importante pour l’hôte à soigner et pour son environnement, présentant de plus une efficacité importante contre les nématodes sensibles et/ou les nématodes résistants, y compris avec une dose d’antiparasitaire inférieure à la normale. Cette invention présente par conséquent trois avantages considérables. Elle permet tout d’abord d’augmenter la biodisponibilité des antiparasitaires chez les parasites, et de réduire ainsi la quantité à utiliser et à administrer à l’hôte du fait d’une efficacité accrue vis-à-vis des parasites. Elle concerne ensuite des inhibiteurs plus spécifiques des P-gp de parasites, ayant pour certains une efficacité au moins aussi importante que la quercétine, et sans les inconvénients de cette molécule pour le vertébré traité (l’inconvénient étant l’inhibition de son propre système de détoxification par P‑gp). Enfin, elle offre de nouvelles compositions antiparasitaires efficaces contre les parasites sensibles et/ou résistants, en abaissant le niveau de résistance de ces derniers.
  • La présente invention concerne tout d’abord une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire comprenant au moins un composé anthelminthique et au moins un composé d’une des familles de flavonoïdes, les flavones de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, et présente dans une quantité permettant d’augmenter la biodisponibilité de l’au moins un composé anthelminthique par inhibition de la glycoprotéine P chez les nématodes,
    sous réserve que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine.
  • Par « composé anthelminthique » (ou composé antihelminthique), on entend un composé antiparasitaire permettant de tuer (action vermicide) au moins un type de vers appartenant à l’embranchement des Métazoaires Helminthes ou permettant de provoquer son expulsion (action vermifuge) hors de l’hôte. L’activité anthelminthique d’un composé peut par exemple être mesurée par un test d’éclosion des œufs des parasites (EHT, « Egg Hatch Test ») pour les composés appartenant à la famille des benzimidazoles, ou par un test de développement larvaire (LDT, « Larval Development Test ») pour les lactones macrocycliques, et par tout autre type de test équivalent.
  • Par « sucre », on entend aussi bien des holosides, que des diholosides et des triholosides ; on peut citer à titre d’exemples non limitatifs l’apioglucose, le galactose, le glucose, le glucopyranose, l’acide glucuronique, le laminaribiose, le néohespéridose, le primeverose, le rhamnose, le robinose, le rutinose et le sambubiose.
  • Par « liaison glycosidique », on entend une liaison O-glycosidique ou C‑glycosidique, de préférence O-glycosidique.
  • Par « glycoprotéine P » (P-gp), on entend la glycoprotéine connue de l’homme du métier pour son implication dans la multirésistance aux médicaments. Il s’agit d’un récepteur transmembranaire de la membrane plasmique, existant sous différentes formes chez de nombreux eucaryotes, et capable d’expulser certains xénobiotiques présents dans le cytoplasme vers le milieu extracellulaire grâce à l’énergie fournie par la consommation d’ATP.
  • Par « inhibition de la glycoprotéine P », on entend un abaissement de l’activité antixénobiotique de la P-gp. Cet abaissement se traduit par une diminution de la DL50 (dose létale tuant 50% de la population) pour un xénobiotique (notamment un anthelminthique) et un organisme considéré. Cet abaissement de la DL50 peut être visualisé par un test de développement larvaire (LDT, Larval Development test) et ce quel que soit le composé utilisé. L’inhibition peut aussi être démontrée par une mesure in vitro de l’activité d’efflux de la pompe (« Rhodamine 123 assay »).
  • Par « nématode », on entend tout type de vers rond appartenant au phylum des Métazoaires Helminthes. Des exemples de genres de nématodes majeurs en biologie et en pathologie parasitaire sont donnés ci-dessous.
  • Dans la classe des Secernentasida :
    • Ordre des Rhabditorida
      • Famille des Rhabditidae, le nématode libre modèle biologique Caenorhabditis ;
    • Ordre des Strongylorida Famille des Strongyloididae : Strongyloides ;
      • Famille des Ancylostomatidae : Ancylostoma, Bunostomum, Necator, Uncinaria ;
      • Famille des Strongylidae : Strongylus, Chabertia, Oesophagostomum ;
      • Famille des Syngamidae : Syngamus ;
      • Famille des Tricostrongylidae : Cooperia, Haemonchus, Hyostrongylus, Ostertagia, Teladorsagia, Trichostrongylus, Graphidium, Nematodirus, Heligmosomoides, Nippostrongylus, Ornithostrongylus, Amidostomum ;
      • Famille des Metastrongylidae : Dictyocaulus, Metastrongylus, Angiostrongylus, Cystocaulus, Muellerius, Protostrongylus ;
    • Ordre des Ascaridorida :
      • Famille des Heterakidae : Heterakis ;
      • Famille des Ascarididae : Ascaris, Parascaris, Toxocara ;
      • Famille des Oxyuridae : Aspiculuris, Enterobius, Oxyuris, Syphacia ;
    • Ordre des Spirurorida :
      • Famille des Filariidae : Filaria ;
      • Famille des Onchocercidae : Brugia, Litomosoides, Wuchereria, Dirofilaria, Loa, Onchocerca ;
      • Famille des Stephanofilaridae : Setaria ;
  • Dans la classe des Adenophorasida :
    • Ordre des Dorilaimorida :
      • Famille des Trichuridae Trichuris, Capillaria ;
      • Famille des Trichinellidae Trichinella ;
  • Des exemples de flavones représentées par la formule générale (I) sont : l’acacétine, l’apigénine, la chrysine, le chrysoériol, la diosmétine, l’eupatiline, la galangine, la lutéoline, l’oroxyline A, la robinétine, la scutellaréine, la tricine, la wogonine, et notamment la baicaléine, la fisétine, le kaempférol, la myricétine, le géraldol, ainsi que la silybine.
  • Par « groupement précurseur d’hydroxy », on entend tout groupe qui peut être métabolisé in vivo pour donner un groupement OH, par exemple un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, notamment méthoxy (comme dans la formule du géraldol), un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde. A titre d’exemple de groupe ester, on peut citer les groupes -(CO)-R où R représente un atome d’hydrogène ou un groupe alkyle en (C1-C5) droit ou ramifié choisi dans le groupe comprenant méthyle, éthyle, propyle, 1-méthyléthyle, butyle, 1-méthylpropyle, 2-méthylpropyle, 1,1-diméthyléthyle, pentyle, et 2‑methylbutyle. Ces groupes alkyles peuvent être partiellement ou totalement halogénés, c’est-à-dire que les atomes d’hydrogène peuvent être partiellement ou totalement remplacés par des atomes d’halogène identique ou différent. On peut citer à titre d’exemple les groupes chlorométhyle, dichlorométhyle, trichlorométhyle, fluorométhyle, difluorométhyle, trifluorométhyle, chlorofluorométhyle, dichlorofluorométhyle, chlorodifluorométhyle, 1-fluoroéthyle, 2-fluoroéthyle, 2,2-difluoroéthyle, 2,2,2-trifluoroéthyle, 2-chloro-2-fluoroéthyle, 2-chloro-2,2-difluoroéthyle, 2,2-dichloro-2- fluoroéthyle, 2,2,2-trichloroéthyle and pentafluoroéthyle.
  • Dans un mode de réalisation avantageux, seul le groupement R7 de la formule générale (I) est un sucre tel que défini précédemment.
  • Dans un mode de réalisation avantageux, ladite composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire est une composition dans laquelle la au moins une flavone de formule (I) répond à la formule (II) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis précédemment.
  • Dans un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire est une composition dans laquelle la au moins une flavone de formule (I) est un flavonol répondant à la formule (III) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 sont tels que définis précédemment,
    ledit flavonol de formule (III) étant choisi notamment dans le groupe comprenant la fisétine et la myricétine.
  • Par « fisétine », on entend la flavone de formule (III) dans laquelle R1, R2 et R7 représentent un groupement OH et R3 et R5 représentent un atome d’hydrogène.
  • Par « myricétine », on entend la flavone de formule (III) dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 représentent un groupement OH.
  • Dans un autre mode de réalisation encore plus avantageux, la présente invention concerne une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire, dans laquelle le au moins un anthelminthique présent dans la une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire est choisi dans le groupe comprenant :
    • le lévamisole ;
    • les lactones macrocycliques choisies dans le groupe comprenant les avermectines telles que l'ivermectine (IVM), l'éprinomectine (EPR), l'abamectine (ABA), la doramectine (DOR), ou dans le groupe comprenant les milbémycines telle que la moxidectine (MOX) ;
    • les dérivés du benzimidazole choisis parmi l'albendazole (ABZ), le thiabenzole (TBZ), le mébendazole, le fenbendazole, l’oxfendazole, le fébantel, et l’oxibendazole.
  • Un autre objet de la présente invention est une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire selon l'une quelconque des définitions précédentes, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une parasitose chez un vertébré.
  • Par « parasitose », on entend notamment une helminthiase.
  • Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, la parasitose est une nématodose.
  • Par « nématodose », on entend une parasitose due à un nématode, en particulier une trichostrongylose, par exemple une haemonchose.
  • Par « haemonchose », on entend une parasitose par le nématode Haemonchus contortus, modèle d’étude pour les trichostrongyloses.
  • Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la parasitose implique au moins un parasite dit résistant.
  • Par « parasite », on entend un animal ou un végétal eucaryote qui vit une partie au moins de son existence aux dépends d’un autre organisme.
  • Par « résistant », on entend un parasite chimio-résistant. Cette chimio-résistance est présente quand la fréquence des parasites capables de tolérer des doses de composés antiparasitaires usuels est plus importante au sein d’une population que dans une population normale de parasites de la même espèce. Elle est de plus transmissible à la descendance. » (PRICHARD R.K. et al. The problem of anthelmintic resistance in nematodes. Australian Veterinary Journal. (1980), 56: 239-51). Les différents types de résistances sont : la résistance simple (résistance à une seule molécule), la résistance de famille (résistance à deux composés au moins d’une même famille d’antiparasitaires), la résistance multiple (résistance à aux moins deux composés appartenant à des familles d’antiparasitaires différentes) et la résistance croisée (résistance à plusieurs antiparasitaires conférée par une ou plusieurs mutations survenue(s) sur un gène). Chaque résistance peut de plus être primaire (apparue avant le début du traitement antiparasitaire) ou secondaire (apparue au cours dudit traitement). Le terme « résistant » employé dans le cadre de la présente invention fait référence à une résistance simple au moins mais l’invention s’applique aux cas de résistance croisée, de famille ou multiple, qu’ils soient de type primaire ou secondaire. D’autre part, cette résistance peut être induite par de nombreux facteurs. Par exemple, il a été montré que des souches résistantes de H. contortus possèdent un nombre de pompes d’efflux P-gp supérieur à la normale, éliminant par conséquent plus facilement les doses d'antiparasitaires (KERBOEUF, D. P-glycoprotein in helminths: function and perspectives for anthelmintic treatment and reversal of resistance. Int J Antimicrob Agents. (2003), 22(3): 332-46).
  • Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le parasite est un nématode résistant.
  • Dans un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, le vertébré est choisi dans le groupe comprenant les bovinés, les caprinés (ovins et caprins), les équidés, les oiseaux et l’humain.
  • Le dosage de l’anthelminthique et des flavones de formule (I) dépend particulièrement du mode d’administration, et est aisément déterminé par l’homme de métier. De même, le choix d’un véhicule pharmaceutique ou vétérinaire acceptable est déterminé par l’homme du métier. Les composés de formule (I) peuvent en outre être administrés sous une forme encapsulée, en particulier nanoencapsulée, dans des liposomes pégylés, ou sous formes à libération prolongée ou à relarguage séquentiel ou sous formes incluant des agents solubilisants (par exemple des cyclodextrines tel que décrit dans WO2009/018326) de manière à augmenter leur biodisponibilité.
  • Le traitement peut être continu ou séquentiel, délivrant lesdits composés, compositions pharmaceutiques ou vétérinaires de manière continue et éventuellement constante, ou sous forme discontinue, par une ou plusieurs administrations quotidiennes, éventuellement renouvelées plusieurs jours, soit consécutifs, soit avec une latence sans traitement entre les administrations.
  • Les composés, ainsi que les compositions pharmaceutiques ou vétérinaires de l’invention peuvent notamment être administrés par voie systémique (générale) entérale ou parentérale, et par voie topique.
  • Par « voie entérale », on entend notamment la voie orale ou per os, la voie perlinguale ainsi que la voie rectale.
  • Par « voie parentérale », on entend notamment la voie sous‑cutanée, la voie intramusculaire et la voie intraveineuse.
  • Par « voie topique », on entend notamment la voie nasale, la voie pulmonaire, la voie cutanée ou percutanée ou trans-dermique.
  • A titre d’exemple, on peut citer une composition dans laquelle le au moins un anthelminthique est présent dans une quantité unitaire :
    • de 5 à 10 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour le lévamisole, ou
    • de 5 à 600 µg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour les lactones macrocycliques, ou
    • de 5 à 300 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour les dérivés du benzimidazole,
      et la au moins une flavone de formule est présente dans une quantité unitaire de 2,5 à 50 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter, de préférence de 2,5 à 40 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter et encore plus préférablement de 2,5 à 30 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter.
  • Un autre objet de la présente invention est une composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire comprenant au moins un composé anthelminthique et au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy, et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, et permettant d’augmenter la biodisponibilité du composé anthelminthique par inhibition de la glycoprotéine P chez les nématodes,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    pour une administration simultanée, séquentielle ou étalée dans le temps.
  • Encore un autre objet de la présente invention est une composition comprenant au moins un agent anthelminthique et au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    pour abaisser la résistance des nématodes à l’au moins un dit agent anthelminthique.
  • Un autre objet de l’invention est donc une méthode pour abaisser la résistance des nématodes à au moins un agent anthelminthique, ladite méthode comprenant l’administration chez un sujet qui en a besoin, d’un composé de formule (I) sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine.
  • Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire selon l'une quelconque des définitions précédentes, est formulée pour une administration orale, parentérale ou topique.
  • Encore un autre objet de la présente invention est une combinaison pour augmenter la biodisponibilité d’au moins un composé anthelminthique qui comprend le au moins un dit composé anthelminthique et une quantité suffisante d’au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    sous une forme utilisable pour une co-administration.
  • Encore un autre objet de la présente invention est l’utilisation d’au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    pour la préparation d’un médicament apte à inhiber la glycoprotéine P chez les nématodes et à traiter les parasitoses, notamment les nématodoses.
  • Enfin, un autre objet de la présente invention est l’utilisation d’au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    pour la préparation d’un médicament apte à augmenter la biodisponibilité des anthelminthiques chez les nématodes.
  • Dans un mode de réalisation avantageux de l’utilisation selon l’invention, la au moins une flavone de formule (I) répond à la formule (II) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (II) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique.
  • Dans un autre mode de réalisation avantageux de l’utilisation selon l’invention, la au moins une flavone de formule (I) est un flavonol répondant à la formule (III) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (III) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ledit flavonol de formule (III) étant choisi notamment dans le groupe comprenant la fisétine et la myricétine.
  • Dans un autre mode de réalisation avantageux de l’utilisation selon l’invention, le au moins un anthelminthique est choisi dans le groupe comprenant :
    -le lévamisole ;
    -les lactones macrocycliques choisies dans le groupe comprenant les avermectines telles que l'ivermectine, l'éprinomectine, l'abamectine, la doramectine, ou dans le groupe comprenant les milbémycines telle que la moxidectine ;
    -les dérivés du benzimidazole choisis parmi l'albendazole, le thiabenzole, le mébendazole, le fenbendazole, l’oxfendazole, le fébantel, et l’oxibendazole.
  • Conformément à l’invention, les composés sont utilisés dans le traitement ou la prévention d'une parasitose chez un vertébré, en particulier une nématodose, notamment une haemonchose.
  • Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la parasitose implique au moins un parasite dit résistant, notamment un nématode résistant.
  • Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention le au moins un composé anthelminthique et la au moins une flavone de formule (I) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, et permettant d’augmenter la biodisponibilité du composé anthelminthique par inhibition de la glycoprotéine P chez les nématodes,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine, sont utilisés pour une administration simultanée, séquentielle ou étalée dans le temps.
  • Enfin la présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la biodisponiblité d’un anthelminthique chez les nématodes comprenant l’administration chez un sujet qui en a besoin, d’un composé de formule (I) sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine.
  • Les exemples 1 à 3 et les Figures 1 à 7 qui suivent illustrent l’invention.
  • Les Figures 1a et 1b sont des histogrammes représentant les résultats obtenus pour des tests d’accumulation de Rhodamine 123 selon le protocole donné dans l’exemple 1. Ils concernent 14 flavonoïdes et 3 autres composés assimilés (la naphtoflavone, la silybine et la xanthone) testés à des concentrations différentes (20, 50, 100, et 200 μM). Ces Figures ont pour ordonnées le pourcentage d’accumulation de rhodamine 123 par rapport au témoin sans modulateur dans les œufs du nématode modèle Haemonchus contortus sensible (HcS-Weyb – rectangles pleins) ou résistant (HcR-Guad – rectangles hachurés). L'abscisse donne le nom et la concentration des composés testés qui ont été ajoutés individuellement aux milieux contenant lesdits œufs :
  • 1 : Témoin ; 2 : Vanadate 500 μM ; 3 : Kaempférol 20 μM ; 4 : Kaempférol 50 μM ; 5 : Kaempférol 100 μM ; 6 : Kaempférol 200 μM ; 7 : Fisétine 20 μM ; 8 : Fisétine 50 μM ; 9 : Fisétine 100 μM ; 10 : Fisétine 200 μM ; 11 : Apigénine 20 μM ; 12 : Apigénine 50 μM ; 13 : Apigénine 100 μM ; 14 : Apigénine 200 μM ; 15 : Génistéine 20 μM ; 16 : Génistéine 50 μM ; 17 : Génistéine 100 μM ; 18 : Génistéine 200 μM ; 19 : Baicaléine 20 μM ; 20 : Baicaléine 50 μM ; 21 : Baicaléine 100 μM ; 22 : Baicaléine 200 μM ; 23 : Biochanine A 20 μM ; 24 : Biochanine A 50 μM ; 25 : Biochanine A 100 μM ; 26 : Biochanine A 200 μM ; 27 : Chrysine 20 μM ; 28 : Chrysine 50 μM ; 29 : Chrysine 100 μM ; 30 : Chrysine 200 μM ; 31 : Flavanone 20 μM ; 32 : Flavanone 50 μM ; 33 : Flavanone 100 μM ; 34 : Flavanone 200 μM ; 35 : Flavone 20 μM ; 36 : Flavone 50 μM ; 37 : Flavone 100 μM ; 38 : Flavone 200 μM ; 39 : Formononétine 20 μM ; 40 : Formononétine 50 μM ; 41 : Formononétine 100 μM ; 42 : Formononétine 200 μM ; 43 : Galangine 20 μM ; 44 : Galangine 50 μM ; 45 : Galangine 100 μM ; 46 : Galangine 200 μM ; 47 : Myricétine 20 μM ; 48 : Myricétine 50 μM ; 49 : Myricétine 100 μM ; 50 : Myricétine 200 μM ; 51 : Naphtoflavone 20 μM ; 52 : Naphtoflavone 50 μM ; 53 : Naphtoflavone 100 μM ; 54 : Naphtoflavone 200 μM ; 55 : Naringénine 20 μM ; 56 : Naringénine 50 μM ; 57 : Naringénine 100 μM ; 58 : Naringénine 200 μM ; 59 : Quercétine 20 μM ; 60 : Quercétine 50 μM ; 61 : Quercétine 100 μM ; 62 : Quercétine 200 μM ; 63 : Silybine 20 μM ; 64 : Silybine 50 μM ; 65 : Silybine 100 μM ; 66 : Silybine 200 μM ; 67 : Xanthone 20 μM ; 68 : Xanthone 50 μM ; 69 : Xanthone 100 μM ; 70 : Xanthone 200 μM.
  • La quantité de R123 s'accumulant dans les œufs en présence d'un puissant inhibiteur d'ATPase, l'orthovanadate de sodium, correspond environ à la valeur 500 %. L’absence de résultats correspond à des concentrations de produits présentant des problèmes de solubilité.
  • Les Figures 2a et 2b reprennent les résultats donnés dans la Figure 1 sous forme de courbes. Les abscisses des Figures 2a et 2b indiquent la concentration (en μM) de chaque inhibiteur potentiel. Leurs ordonnées sont identiques à celles des Figures 1a et 1b. Figure 1a : H. contortus sensibles ; Figure 1b : H. contortus résistants.
  • Les Figures 3a, 3b et 3c représentent les trois meilleurs résultats obtenus pour les tests de développement larvaires (LDT). Chaque figure a pour ordonnée le pourcentage de larves qui se développent en fonction de la quantité d'anthelminthique utilisée, et donnée en abscisse. Les anthelminthiques utilisés sont l’éprinomectine pour la Figure 3a et 3b et la doramectine pour la Figure 3c. Chaque courbe représente une combinaison différente d'un anthelminthique et d'un inhibiteur. La combinaison anthelminthique et de son solvant le DMSO 1% est utilisée comme témoin négatif (absence d’inhibiteur des P-gp).
  • La Figure 4 représente d'autres résultats obtenus pour les tests de développement larvaires (LDT). Les deux histogrammes (celui de gauche pour les nématodes sensibles et celui de droite pour les résistants) ont pour ordonnées le pourcentage de réduction supplémentaire de parasites par rapport à l’anthelminthique seul pour les différentes combinaisons d’anthelminthique (doramectine ou éprinomectine) et d’inhibiteur (fisétine ou myricétine). Les abscisses des histogrammes indiquent le type d’anthelminthique utilisé.
  • La Figure 5 illustre des résultats de réduction supplémentaire (%) liée à l’adjonction d’inhibiteur de P-gp à l’anthelminthique pour le nombre de vers et le nombre d'œufs (OPG, oeufs par gramme de fèces) du nématode H. contortus résistant obtenus pour un essai in vivo chez l'agneau. L'anthelminthique et l'inhibiteur retenus pour cet essai sont parmi ceux qui ont donné les meilleurs résultats lors des tests in vitro, soit la doramectine et la fisétine (respectivement). L’éprinomectine ne bénéficiant pas actuellement d’AMM pour les ovins en France n’a pas été retenue pour cet essai. En ordonnée : le pourcentage de réduction supplémentaire de la charge parasitaire et du nombre d'œufs ; en abscisse : les résultats OPG (gauche), et les résultats de la charge parasitaire (droite).
  • Les Figures 6a, 6b, 6c donnent des résultats obtenus pour un nouvel essai in vivo chez l’agneau de réduction de la charge parasitaire et du nombre d'œufs fécaux de H. contortus résistants. La figure 6a représente les résultats obtenus pour le test OPG. Elle a pour ordonnée le pourcentage de réduction du nombre d’œufs fécaux. La figure 6b a pour ordonnée la charge parasitaire exprimée en nombre de vers 14 jours après le traitement, et la Figure 6c le pourcentage de réduction de la charge parasitaire (établi à partir des données de la Figure 6b). L'abscisse de ces trois figures représente la quantité d’anthelminthique administrée (exprimée en μg/kg de poids vif du vertébré traité).
  • Exemple 1   : r é sultats obtenus pour des essais d ’ accumulation de Rhodamine 123 ( «  R123 assay   » ) avec quantification au spectrofluo rim è tre
  • Mat é riels
  • Animal infesté par Haemonchus contortus résistant souche « Guadeloupe » (HcR‑Guad) ;
  • Préparation des solutions :
    • solution de Rhodamine 123 (Sigma-Aldrich® – R8004 - conservée depuis sa mise en solution, le 19/10/06, en azote liquide - [R123] = 1000 μg/ml – MW = 380,8 g/mol) :
      • solution fille à 1,5 μM (0,57 μg/mL) : 114 μl de R123 à 1000 μg/mL q.s.p. 200 mL d’E.D. (eau distillée) ;
    • solution d’ orthovanadate de sodium (vanadate) :
      • vanadate : Sigma-Aldrich® – S6508 - MW = 183,91 g/mol ;
      • solution de Vanadate à 50 mM : 18,4 mg de Vanadate en poudre q.s.p. 2 mL d’E.D. ;
    • solutions de fisétine :
      • fisétine : Sigma-Aldrich® – F4043 - MW = 286,24 g/mol ;
      • solution de fisétine – 20 mM : 1,43 mg de fisétine en poudre q.s.p. 250 μl de DMSO ;
      • solution de fisétine - 5 mM : 50 μl de fisétine à 20 mM q.s.p. 200 μl de DMSO ;
    • solutions de quercétine :
      • quercétine : Sigma-Aldrich® – Q0125 - MW = 338,26 g/mol ;
      • solution de quercétine – 20 mM : 1,69 mg de quercétine en poudre q.s.p. 250 μl de DMSO ;
      • solution de quercétine - 5 mM : 50 μl de quercétine à 20 mM q.s.p. 200 μl de DMSO.
  • Protocole   : Accumulation de la Rhodamine 123 en pr é sence ou non de modulateurs
    • Accumulation R123 : dans un tube en verre de 5 mL, introduction de 15 000 œufs d’HcR‑Guad. Après centrifugation et retrait du surnageant, ajout de 2 mL d’une solution de R123 à 1,5 μM, et incubation à +20°C pendant 5 min, à l'abri de la lumière ;
    • Accumulation de R123 + modulateur (inhibiteur) : ajout du modulateur ou d’un volume égal de DMSO (détails dans le Tableau 1 ci-dessous), et incubation à +20°C pendant 10 min, à l'abri de la lumière ;
    • Rinçages : après centrifugation et retrait du surnageant, ajout de 5 mL d’eau distillée glacée ;
    • Lecture au spectrofluorimètre QuantaMaster™, Photon Technology International (PTI), USA.
      • après remise en suspension du culot d'œufs dans 1 mL d'ED à température du laboratoire (température ambiante), incubation à température du laboratoire, et à l’abri de la lumière pendant 60 min, puis transfert de 900 μl dans une micro cuve et lecture au spectrofluoromètre ;
      • réglages fentes : F1 = 1t. ; F2 = 1t. ; F4 = 1t. et F3 = 1t ;
      • λ excitation = 495 nm ;
      • λ émission = 525 nm.
  • Tableau 1 – Exemples de préparation des solutions pour le test à la R123 Tableau 1
    Nom du modulateur Volume R123 Modulateur
    Volume Concentration
    Témoin 2000 μl 20 μl DMSO
    Vanadate 500 μM 2000 μl 20 μl 50 mM
    Fisétine 20 μM 2000 μl 8 μl 5 mM
    50 μM 2000 μl 20 μl 5 mM
    100 μM 2000 μl 10 μl 20 mM
    200 μM 2000 μl 20 μl 20 mM
    Quercétine 20 μM 2000 μl 8 μl 5 mM
    50 μM 2000 μl 20 μl 5 mM
    100 μM 2000 μl 10 μl 20 mM
    200 μM 2000 μl 20 μl 20 mM
  • Les inhibiteurs potentiels ont été testés sur des œufs de H. contortus susceptibles et résistants, et leur effet comparé à celui de l’orthovanadate de sodium (SOV, Sodium Orthovanadate) qui s’est révélé être très efficace tant contre les nématodes sensibles que contre les nématodes résistants (Figure 1). Ce composé permet d’accroître la quantité de R123 accumulée chez les nématodes de 5 fois (ordonnée de 500%) celle constatée en l'absence d’inhibiteur (ordonnée de 100%). Sur l’ensemble des inhibiteurs potentiels donnés en abscisse, 7 présentent un effet modulateur notable (ordonnée différente de 100%, Tableau 2). La fisétine présente un effet inhibiteur très fort proche de celui de l’orthovanadate de sodium contre les nématodes sensibles et résistants.

  • Tableaux 2 et 3 – Accumulation de R123 (% par rapport au témoin) Tableau 2
    [flavonoïdes] Moyennes ±Ecart type
    Kaempférol Fisétine Apigénine
    HcS-Weyb 0 μM 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6
    20 μM 136 ± 2 148 ± 4 81 ± 8
    50 μM 132 ± 9 204 ± 10 105 ± 4
    100 μM 152 ± 0 338 ± 35
    200 μM 188 ± 34 272 ± 16
    HcR-Guad 0 μM 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6
    20 μM 166 ± 9 217 ± 5 108 ± 10
    50 μM 181 ± 13 327 ± 22 163 ± 14
    100 μM 242 ± 8 431 ± 28 215 ± 11
    200 μM 258 ± 34 376 ± 12
  • Tableau 3
    [flavonoïdes] Moyennes ±Ecart type
    Baicaléine Myricétine Quercétine Silybine
    HcS-
    Weyb    		 0 μM 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6
    20 μM 131 ± 8 168 ± 4 191 ± 8 103 ± 6
    50 μM 154 ± 3 210 ± 6 249 ± 2 115 ± 9
    100 μM 177 ± 7 283 ± 12 165 ± 10
    200 μM 149 ± 10 276 ± 7 175 ± 25
    HcR-
    Guad    		 0 μM 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6 100 ± 6
    20 μM 159 ± 13 164 ± 12 210 ± 9 109 ± 1
    50 μM 198 ± 2 210 ± 9 281 ± 7 114 ± 4
    100 μM 200 ± 17 141 ± 5
    200 μM 124 ± 23 138 ± 16
  • Ces résultats (Figures 2a et 2b et Tableaux 2 et 3) témoignent par conséquent de l’existence d’une différence structurale entre les P‑gp de nématodes et de vertébrés. Ces résultats démontrent encore que la fisétine permet d’inhiber les pompes P-gp des nématodes résistants avec plus d’efficacité que la quercétine lorsque celles-ci sont utilisées individuellement à 50 μM. Ces résultats permettent d’envisager des compositions comprenant un inhibiteur de P‑gp des nématodes qui n’est pas la quercétine, mais qui possède une efficacité au moins équivalente, c’est-à-dire, des compositions antiparasitaires incluant un inhibiteur des P-gp des nématodes mais qui soit peu spécifique des P‑gp du vertébré à traiter.
  • Exemple 2 : tests de d é veloppement larvaires (LDT) chez les n é matodes
  • Les résultats obtenus pour ces tests sont donnés dans les Figures 3a, 3b, 3c et 4. L’utilisation de la DL50 comme indicateur de l'efficacité d'une combinaison inhibiteur/anthelminthique donnée ne rend pas compte de l’effet maximum éventuellement obtenu avec des doses plus élevées d’anthelminthique.
  • Chez les parasites résistants (Figure 4), les combinaisons fisétine/éprinomectine et myricétine/éprinomectine donnent les meilleurs résultats ; la combinaison fisétine/doramectine a un effet comparable à celui observé pour les parasites sensibles.
  • Exemple 3   : essais in vivo chez l ’ agneau infest é par des H. contortus r é sistants
  • 1 er essai   : traitement à la doramectine compl é ment é par des injections sous-cutan é es de fis é tine
  • Protocole
  • L’expérimentation a été menée sur des agneaux de 3 mois infestés avec 6000 larves du nématode Haemonchus contortus, isolat résistant aux anthelminthiques au jour 0 (J0). Un traitement à J33 à l’aide de doramectine solution injectable à doses faibles (de 10 à 30 μg/kg selon le lot d’animaux) par rapport à la dose recommandée par le fabriquant (de 200 μg/kg pour des parasites sensibles). Il n’y a par ailleurs aucune recommandation du fabriquant pour les parasites résistants mais, en élevage, les doses sont supérieures à 400 μg/kg, parfois 600 μg/kg. Un animal sur deux est traité à l’aide de fisétine administrée pendant 5 jours (J33 à J37) en injection sous-cutanée et en complément. Trois doses ont été testées : 2,5, 5 ou 10 mg/kg. Le contrôle de l’infestation se fait par examens coproscopiques (numération des œufs émis par les vers dans les fèces) à J54 et par numération du nombre de vers adultes dans la caillette à J56.
  • R é sultats
  • Réduction du nombre d’œufs :
    • aucune réduction avec la doramectine seule quelle que soit la dose ;
    • réduction de 64 % avec la combinaison de doramectine 20 μg/kg et de fisétine à 30 mg/kg (1600 œufs / g contre 4400 œufs / g chez les témoins non traités, Figure 5).
  • Réduction du nombre de vers :
    • doramectine seule 20 µg/kg : réduction de 4 % ;
    • doramectine plus fisétine : combinaison la plus active doramectine 20 μg/kg et fisétine 30 mg/kg, avec une réduction de 35 % par rapport au témoin doramectine seule (Figure 5).
  • Cet essai permet de confirmer qu’in vivo la combinaison anthelminthique plus inhibiteur a un effet, certes faible mais qui va dans le même sens que celui constaté par les deux tests in vitro (accumulation de rhodamine 123 et test « LDT » de développement des larves). Deux hypothèses peuvent expliquer la faible efficacité :
    • la dose de doramectine est insuffisante pour des parasites résistants,
    • la fisétine administrée en injection sous-cutanée s’est mal résorbée (observation post‑abattage).
  • 2 è me essai   : traitement à la doramectine compl é ment é par des prises orales de fis é tine
  • Protocole
  • L’expérimentation a été menée sur des agneaux de 3 mois infestés avec 6000 larves du nématode Haemonchus contortus, isolat résistant aux anthelminthiques au jour 0 (J0). Un traitement à J39 à l’aide de doramectine solution injectable à différentes doses incluant la dose recommandée par le fabricant (200 μg/kg de poids vif du vertébré traité), une dose inférieure (100 μg/kg de poids vif du vertébré traité), et une dose actuellement utilisée pour le traitement des agneaux infectés par des nématodes résistants (400 μg/kg de poids vif du vertébré traité) mais non recommandée par le fabriquant. Un animal sur deux est traité à l’aide de fisétine administrée pendant 5 jours (J39 à J43) par voie orale en complément à la dose de 30 mg/kg. Le contrôle de l’infestation se fait par examens coproscopiques (numération des œufs émis par les vers dans les fèces) à J50 et par numération du nombre de vers adultes dans la caillette à J53.
  • R é sultats
  • Réduction du nombre d’œufs (Figure 6a) :
    • réduction avec doramectine seule : 33 % à 200 μg/kg et 57 % à 400 μg/kg ;
    • réduction avec la combinaison de doramectine et de fisétine : 71 % à 100 μg/kg, 73% à 200 μg/kg et 94% à 400 μg/kg.
  • Réduction du nombre de vers (Figures 6b et 6c) :
    • doramectine seule : réduction maximale 66% à la dose de 400 μg / kg ;
    • doramectine plus fisétine : 32% à 100 μg/kg, 50% à 200 μg/kg et 78% à 400 μg.
  • Ces résultats indiquent que la présence de fisétine permet d’atteindre une efficacité proche de 100% avec la doramectine à la plus forte dose (400 μg/kg de poids vif du vertébré traité). La charge parasitaire a pu être réduite de près de 40% grâce à la combinaison fisétine (administrée à 30 mg/kg de poids vif du vertébré traité en pré- et post-traitement à la doramectine) et doramectine (administrée à 400 μg/kg de poids vif du vertébré traité).
  • Cet essai permet de confirmer qu’in vivo la combinaison anthelminthique et inhibiteur de pompe d’efflux (la fisétine) a un effet très significatif à la fois sur l’excrétion d’œufs et sur le nombre de vers d’un isolat de nématodes très résistant aux anthelminthiques.

Claims (14)

  1. Utilisation d’au moins un composé de formule (I) suivante :
    dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine,
    pour la préparation d’un médicament apte à augmenter la biodisponibilité des anthelminthiques chez les nématodes.
  2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle la au moins une flavone de formule (I) répond à la formule (II) suivante :
    dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (II) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique.
  3. Utilisation la revendication 2, dans laquelle la au moins une flavone de formule (I) est un flavonol répondant à la formule (III) suivante :
    dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (III) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ledit flavonol de formule (III) étant choisi notamment dans le groupe comprenant la fisétine et la myricétine.
  4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le au moins un anthelminthique est choisi dans le groupe comprenant :
    -le lévamisole ;
    -les lactones macrocycliques choisies dans le groupe comprenant les avermectines telles que l'ivermectine, l'éprinomectine, l'abamectine, la doramectine, ou dans le groupe comprenant les milbémycines telle que la moxidectine ;
    -les dérivés du benzimidazole choisis parmi l'albendazole, le thiabenzole, le mébendazole, le fenbendazole, l’oxfendazole, le fébantel, et l’oxibendazole.
  5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une parasitose chez un vertébré, en particulier d’une nématodose, notamment d’une haemonchose.
  6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle la parasitose implique au moins un parasite dit résistant.
  7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 6, dans laquelle le vertébré est choisi dans le groupe comprenant les bovinés, les caprinés (ovins et caprins), les équidés, les oiseaux et l’humain.
  8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans laquelle le au moins un anthelminthique est présent dans une quantité unitaire :
    -de 5 à 10 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour le lévamisole, ou
    -de 5 à 600 µg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour les lactones macrocycliques, ou
    -de 5 à 300 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter pour les dérivés du benzimidazole,
    et la au moins une flavone de formule (I) est présente dans une quantité unitaire de 2,5 à 50 mg/kg de poids vif du vertébré à traiter.
  9. Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle le au moins un composé anthelminthique et la au moins une flavone de formule (I) suivante :
    dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (I) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ladite flavone de formule (I) étant sous forme libre ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable, et permettant d’augmenter la biodisponibilité du composé anthelminthique par inhibition de la glycoprotéine P chez les nématodes,
    à condition que, la flavone de formule (I) ne soit pas la quercétine, sont utilisés pour une administration simultanée, séquentielle ou étalée dans le temps.
  10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle la composition est formulée pour une administration orale, parentérale ou topique.
  11. Composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire comprenant au moins un composé anthelminthique et au moins une flavone de formule (I) qui est un flavonol répondant à la formule (III) suivante : dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 représentent indépendamment les uns des autres un atome ou un groupement choisi dans le groupe constitué d’un atome d’hydrogène, d’un groupement OH, d’un groupement précurseur d’hydroxy choisi dans le groupe comprenant un groupe ester, un groupe éther, un groupe alcoxy, un groupe sulfonate, une cétone ou un aldéhyde et d’un sucre lié à l’un des noyaux aromatiques de la flavone de formule (III) par son carbone anomérique via une liaison glycosidique,
    ledit flavonol de formule (III) étant choisi notamment dans le groupe comprenant la fisétine et la myricétine.
  12. Composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans laquelle le au moins un anthelminthique est choisi dans le groupe comprenant :
    -le lévamisole ;
    -les lactones macrocycliques choisies dans le groupe comprenant les avermectines telles que l'ivermectine, l'éprinomectine, l'abamectine, la doramectine, ou dans le groupe comprenant les milbémycines telle que la moxidectine ;
    -les dérivés du benzimidazole choisis parmi l'albendazole, le thiabenzole, le mébendazole, le fenbendazole, l’oxfendazole, le fébantel, et l’oxibendazole.
  13. Composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire selon l'une quelconque des revendications 11 et 12, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention d'une parasitose chez un vertébré, en particulier d’une nématodose, notamment d’une haemonchose.
  14. Composition à usage pharmaceutique ou vétérinaire selon la revendication 13, dans laquelle la parasitose implique au moins un parasite dit résistant.
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