EP2461666A1 - Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant - Google Patents

Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant

Info

Publication number
EP2461666A1
EP2461666A1 EP10740621A EP10740621A EP2461666A1 EP 2461666 A1 EP2461666 A1 EP 2461666A1 EP 10740621 A EP10740621 A EP 10740621A EP 10740621 A EP10740621 A EP 10740621A EP 2461666 A1 EP2461666 A1 EP 2461666A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plant
sequence seq
brassica
sequence
plants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10740621A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Reinhard Hemker
Stefan Abel
Jean-Eric Dheu
Laurent Hanneton
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Limagrain Europe SA
Original Assignee
Limagrain Europe SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Limagrain Europe SA filed Critical Limagrain Europe SA
Publication of EP2461666A1 publication Critical patent/EP2461666A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the field of the invention is that of plant breeding, and in particular the development of new hybrids of rapeseed, Brassica napus, oleracea and Constantpa.
  • Canola cultivation also called canola across the Atlantic, is widespread on all continents because of its many strengths in both the food and industrial fields. Indeed, rapeseed allows a large production of oil widely used as a food product but also as a biofuel especially in the automotive industry or otherwise. Rapeseed also allows the production of cakes which are an interesting source of protein in animal feed (livestock, pigs and poultry).
  • oilseed rape oil has been restricted for a long time because of its high content of erucic acid. Indeed, depending on the varieties of rapeseed, the erucic acid level could represent up to 50% of the total fatty acids of the plant and thus have a detrimental impact on human health.
  • rapeseed for the manufacture of oilcakes has also been slowed down for a long time because of the high levels of glucosinolates contained in the seeds.
  • seed milling releases the enzyme myrosinase which converts seed glucosinolates into various by-products such as glucoses, thiocyanates, isothiocyanates and nitriles which can lead to metabolic disorders in mammals.
  • myrosinase which converts seed glucosinolates into various by-products such as glucoses, thiocyanates, isothiocyanates and nitriles which can lead to metabolic disorders in mammals.
  • the broad development of the rapeseed crop is mainly due to two major technical advances: the reduction of the erucic acid level in the oil as well as the decrease of the glucosinolate level in the seeds.
  • Rapeseed being an autogamous species, these varieties have long been only population varieties and not hybrid plants.
  • hybrid rapeseed plants has multiple interests, both for the farmer and the breeder, since this makes it possible to obtain improved plants with qualities of heterosis (or hybrid vigor), of homeostasis ( plant stability in different environments), the ability to introduce and combine resistance genes to insects, fungi, bacteria or viruses, or adaptation to abiotic stresses.
  • this development of hybrid rape plants requires effective means of controlling pollination. To do this, have been developed cytoplasmic male sterility techniques (or CMS for Cytoplasmic MaIe Sterility) such as Polima systems, Kosena and especially Ogura.
  • the Ogura cytoplasmic male sterility system is based on the use of a male sterility determinant derived from the radish cytoplasm (Raphanus sativus), which was transferred from radish into Brassica napus by inter-specific crosses, rescues of embryos and backcrossings (Bannerot et al, 1974). Protoplast fusion was required to produce sterile male cytoplasmic hybrids (Pelletier et al., 1983). But CMS Ogura cytoplasmic male sterility being dominant, the hybrid rapeseed plant does not produce pollen, and without pollen, the plant does not produce seeds. To remedy this situation and obtain a harvest, it is necessary for the male parent of the hybrid to contain a gene for restoring male fertility.
  • the plants obtained carrying this Rf gene for restoring male fertility have two major drawbacks: a significant increase in the glucosinolate levels in the seeds and a significant decrease in the agronomic characteristics of the plant such as a decrease in the amount of seeds produced, decreased disease resistance and increased susceptibility to lodging.
  • These disadvantages seem directly related to the introgression fragment carrying the Rf gene for restoring cytoplasmic male fertility transferred from Raphanus sativus.
  • This chromosomal region does not Not including the Rf restoration gene, it also includes one or more genes that cause the aforementioned drawbacks.
  • Patent Application WO98 / 27806 (Pioneer) relates to the creation of hybrid Brassica plants comprising the Rf gene for restoring male fertility and having a glucosinolate content of less than 30 ⁇ mol per gram of dry matter and an acid level. erucic less than 2% by weight of the total fatty acid content. These plants are obtained by crossing between a first parent selected from four different lines and a second parent having a glucosinolate level sufficiently low for the hybrid to have a level below 30 ⁇ mol. The link between the Rf restorative gene and the locus responsible for elevated glucosinolate levels has been broken, thus making it possible to obtain restorer hybrids of male fertility and having low glucosinolate levels. However, this is the creation of hybrids, not stable restorative lines.
  • Patent application WO 2005/074671 shows the realization of a particular recombination event between the Rf gene for restoring male fertility and the gene or genes linked to high levels of glucosinolates in the seeds.
  • This event is characterized by specific markers.
  • the plant produced containing this recombination event is identified by the marker E33M47 but not by the marker OPY 17.
  • the patent application is silent when the agronomic characteristics of the plant produced, in particular on the level of its seed production.
  • the reduction of the glucosinolate level in the seeds is a necessity for any commercialized plant, the reduction of its agronomic qualities, in particular its grain production, must be absolutely avoided.
  • the patent application WO 2005/002324 (INRA) relates to the development of a method for producing the Rf line restoring male fertility "double zero", that is to say having a low level of acid erucic in the oil and a low level of glucosinolates in the seeds.
  • the inventors irradiated, before meiosis, plants derived from 'a cross between restored' double zero 'CMS lines and the' double zero 'Drakkar line.
  • one of the essential objectives of the invention is to obtain a Brassica Rf line restoring male fertility overcoming all the drawbacks mentioned above and in particular a Rf restoring line with low levels of glucosinolates and erucic acid. as well as his seeds and his descendants.
  • Another object of the invention is to obtain seeds and hybrid Brassica plants with low glucosinolate and erucic acid levels containing the Rf gene restoring male fertility for the Ogura system retaining valuable agronomic qualities.
  • Another object of the invention is to obtain the seeds of said line Rf and said hybrid plants and the progeny of these plants.
  • Another essential objective of the invention is to provide an efficient, fast and economical method for producing these low-glucosinolate and erucic acid hybrid plants that restore male fertility.
  • Another object of the invention is to provide male fertility restoring plants with increased agronomic qualities.
  • Rf restoring line with low levels of glucosinolates and erucic acid and having increased agronomic qualities, in particular a good grain production.
  • This line has been called R7631. It is more specifically a Brassica line restoring male fertility due to the Ogura system of male cytoplasmic sterility (CMS Ogura). It presents a new genetic profile with an introgression fragment restoring male fertility different and shorter than those disclosed in the prior art but not too short so as to obtain good agronomic qualities.
  • This line has been designed and identified, after numerous crosses, selections and other experiments using molecular biology and especially thanks to precise molecular markers that allowed to establish its genetic profile and thus to determine its new character and more performant compared to existing lines, especially on fertility.
  • This line was also designed using techniques that did not use irradiation before meiosis. Indeed, it is the merit of the inventors to have designed such a restorative line not only without resorting to irradiation in a chromosomal region where homologous recombinations are particularly difficult but also to have succeeded in establishing a lineage while the Introgression carrying the gene for restoring male fertility in the Ogura system is particularly unstable.
  • the invention also relates to hybrid plants designed by crossing from said restoring line Rf low glucosinolates and erucic acid and their production process which consists, inter alia, to cross a plant of the restorative line Rf with another plant, preferably Brassica.
  • the invention also relates to brassica plants restoring male fertility and having very interesting agronomic qualities. Finally, the invention also relates to the various applications of the above plants, especially in the food field (oil production and / or cake).
  • plant is meant for example a plant at any stage of development whatsoever, including: embryo, or any other seedling stage or adult plant.
  • male or male parent is meant for example a plant used as a pollen donor in a cross.
  • a female or female parent is a plant used as a pollen recipient, or egg donor in a cross.
  • plant part is meant, for example, pollen, ova, embryos, leaves, anthers, stems, petioles, roots, fruits, seeds, flowers, buds, protoplasts, calli cells and cell tissues.
  • progeny of the plant is meant for example a plant embryo, a plant, seeds and seeds of the parent plant.
  • hybrid plant is meant, for example, a plant derived from the cross between two genetically different parents.
  • hybrid F1 a plant of the first generation of a cross between two genetically distinct homozygous parents, for example two distinct varieties, we speak of hybrid F1.
  • Introgression means, for example, a fragment of DNA of one species introduced into the genome of a plant of another species.
  • the introgression according to the invention comes from radish (Raphanus sativus) and was transferred to a Brassica, preferably a Brassica oleracea.
  • recombination event is meant for example a DNA fragment introduced by genetic recombination which consists of an exchange of genetic information between two different genomes or between two chromosomes.
  • Rf gene is meant, for example, the gene for restoring male fertility derived from radish and this in the Ogura male cytoplasmic sterility system.
  • Rf line for example means a Brassica line or Brassica plant whose genome includes the Rf gene for restoring male fertility from radish and this in the Ogura male cytoplasmic sterility system.
  • glucosinolates and erucic acid for example means a plant having both a level of erucic acid less than or equal to 2% of the total fatty acids contained in the plant, preferably less than or equal to at 0.5% and more preferably at 0.1% and a level of glucosinolates in its seeds less than or equal to 25 ⁇ mol per gram of seed, preferably between 10 and 16 ⁇ mol per gram of seeds, at 9% of moisture in the seeds.
  • low glucosinolate level or low glucosinolate level is meant the above-mentioned limit rate. The same goes for erucic acid.
  • plant CMS O aura is meant for example a Brassica plant carrying a male Ogura sterility determinant as defined in Bon Subscribe et al (1991) Curr.
  • -By recurrent plant or recurrent line or recipient line we mean a plant
  • Brassica of the napus or oleracea species which does not contain the fertility restoration trait or Rf gene and which receives it by crossing with the so-called donor Brassica napus plant deposited under No. NCIMB 41646.
  • -Backcrossing is the crossing of descendants from the first cross between the donor line and the recurrent line, with the recurrent lineage and so on until the genome of the donor line is replaced by that of the recurrent lineage. except for the introgressed region including the Rf gene.
  • Molecular marker means, for example, a specific fragment of a DNA sequence that can be identified within the genome of an individual and that can be used in particular to locate a gene of interest, to verify whether an individual has inherited a particular characteristic of a parent or differentiate individuals. It may or may not be a coding sequence. The marker may be dominant, co-dominant. The detection of the molecular marker, or its non-detection, makes it possible to select the individuals presenting the gene of interest or the particular characteristic, or on the contrary, not to select the individuals that do not have the gene of interest or the particular characteristic .
  • the molecular markers make it possible to quickly test the plants resulting from given crosses, the seeds of said plants or parts of plants and to identify the plants with low levels of glucosinolates and erucic acid having the restoring gene of the plant. male fertility.
  • a specific molecular marker according to the present invention is a molecular marker specifically identifying the presence or absence of the Rf gene restoring male fertility and the combined use of several selected markers will make it possible to differentiate the restored plant comprising the Rf gene from unrestored plants. not including the Rf gene or other plants produced in the prior art.
  • nucleotide primer or primer is meant for example an artificial DNA sequence, short (of at least 12 to 30 base pairs or nucleotides) complementary to one of the strands of the DNA fragment that is to be amplified. by polymerase chain reaction (PCR) or that it is desired to sequence. In this case, specific primers of the marker to be tested are chosen. The primers are designated on the sequence of the region to be amplified and it is verified that the amplicon is monolocus and co-generated with the Rf gene.
  • allele is meant according to the present invention the various versions of a given DNA sequence located at a given chromosomal location (location on a chromosome), in this case in the chromosomal region of the Rf gene.
  • the Rf line also called R7631
  • the first subject of the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for the restoration of male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that said genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
  • the present Rf line according to the invention comprises the Rf gene and is characterized in that its genome does not exhibit the E33M47 marker defined by the a pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 2.
  • the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, characterized in that:
  • said genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers consisting, on the one hand, of the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2, and
  • said genome of the plant has the Brassica allele, preferably napus, oleracea or Profpa, more preferably napus or oleracea, of the OPY marker
  • nucleotide primers constituted firstly by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly by the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 4.
  • the present Rf line according to the invention comprises the Rf gene and is characterized in that its genome does not have the E33M47 marker (no amplified radish allele) defined by the pair of genes.
  • nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and on the other hand by the sequence SEQ ID No. 2 and in that said genome has the marker OPY 17 (amplified Brassica allele, of preferably napus, oleracea or Ranpa, more preferably napus or oleracea) defined by the pair of nucleotide primers consisting of SEQ ID No. 3, on the one hand, and SEQ ID No. 4 on the other hand.
  • the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility. characterized in that
  • said genome does not show the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID N 1, and secondly, by the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2,
  • said genome of the plant has at least one marker among the following markers:
  • a Brassica allele preferably napus, oleracea or raspa, more preferably napus or oleracea, of the OPY 17 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least a sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID N 4,
  • a radic allele of the OPC2 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 5 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 5, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 6 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 6, a radish allele of the OPF10 tag defined by the pair of nucleotide primers. consisting on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 7 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No.
  • the molecular markers tested make it possible to detect the presence of the Rf restorer gene in the tested plants. They make it possible to determine the genotype of the plants obtained before their flowering, which saves breeders time but also space because plants with inappropriate genotypes are eliminated.
  • these molecular analyzes make it possible to roughly determine the size of the introgression fragment in comparison with known restorative lines. Analyzes of the crosses with the molecular markers made it possible to affirm that the restorative line has a new genetic profile and a fragment of introgression which is different and probably shorter than that of the restorative lines described in the prior art. Molecular markers also make it possible to determine whether the tested plants are homozygous or heterozygous for the Rf restoration gene, among others.
  • the different molecular markers were tested by polymerase chain reaction (PCR) with specific and appropriately defined pairs of primers.
  • the introgression fragment according to the invention could be detected by other known molecular biology techniques such as the use of radiolabeled probes.
  • Said specific primers of said molecular markers have been generated by standard methods known to those skilled in the art.
  • sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 are specific for the molecular marker E33M47 and have the following sequences:
  • SEQ ID No. 2 primer CAA GAT TAT AGC CTA TAC CTA GG
  • the marker E33M47 when defined by the pair of primers SEQ ID No. 1 / SEQ ID No. 2 above allows amplification by PCR, in the restorative lines of the prior art, of a fragment of about 135 base pairs from the radish genome but no labeling was detected in the Rf line of the present invention. This therefore means that the Rf line according to the invention no longer has the region from the radish detected in the lines of the prior art. This line Rf according to the invention is therefore different from the prior art.
  • the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 are specific for the molecular marker OPY 17 and have the following sequences:
  • Primer SEQ ID NO: 3 ACG TGG TGA CAT GGA GGA CTT TCT G
  • Antisense Primer SEQ ID No. 4 GTG CTG TAT TCT ACC TCA TCA TTA AA
  • the OPY 17 marker according to the present invention when it is defined by the pair of primers SEQ ID No. 3 / SEQ ID No. 4 ci above, for example, corresponds to a fragment of approximately 885 base pairs originating from the genome of Brassica napus (brassica napus allele).
  • the same primers SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 defining the marker OPY 17 allow to amplify by PCR a fragment of about 305 base pairs from the genome of radish and not Brassica napus.
  • the DNA fragment of the plant according to the invention which comprises this marker OPY 17 is advantageously derived from a homologous recombination between the DNA fragment derived from the radish and the Brassica genome, in particular for the Rf gene region.
  • the 885 base pair allele corresponds to the Rf allele from Brassica and not the radish which corresponds to a 305 base pair allele.
  • the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 are specific for the molecular marker OPC2 and have the following sequences:
  • Antisense Primer SEQ ID No. 6 TCA GGT TCA CAC AGC AGC ATA
  • SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 are specific for the molecular marker OPF10 and have the following sequences:
  • Sequence primer SEQ ID No. 7 CTG ATG AAT CTC GGT GAG AC
  • Antisense primer SEQ ID NO: 8 CGC GTT TAT GCC TTG ATC TC sequences
  • SEQ ID NO 9 and SEQ ID N 0 IO are specific for the molecular marker and to OPN20 sequences:
  • Sequential primer SEQ ID No. 9 ATA GGT TCC TGG AGC AG TG TG
  • Antisense primer SEQ ID N 0 IO ATA GTC GCA AGA AAC CGC TC sequences SEQ ID N 0 I l and SEQ ID NO: 12 are specific to the DPO 15 and molecular marker for sequences:
  • Antisense Primer SEQ ID No. 12 AAA AAA GCA CCC GAG AAT CT More details concerning the above-mentioned SEQ ID No. 1 to 12 sequences are given below in the examples.
  • the Brassica plant as defined above is chosen from Brassica napus, oleracea and Ranpa. Very preferably, a Brassica napus or Brassica oleracea plant is chosen, and even more preferably, a Brassica napus plant is chosen.
  • the present invention also relates to seeds derived from the Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid as defined above. These seeds preferably have a level of glucosinolates less than or equal to 25 ⁇ mol per gram of seed at 9% moisture in the seeds, preferably preferably between 10 and 16 ⁇ mol per gram of seeds, and contain in their genome at least the Rf restorer gene. In addition, these seeds also have a level of erucic acid less than or equal to 2% of the total fatty acids contained in the seed, preferably less than or equal to 0.5% and more preferably still 0.1%. These levels of erucic acid can be obtained by near infra-red spectroscopy analyzes.
  • the invention also relates to the progeny of the Brassica plant, preferably Brassica napus or oleracea or raspa, as defined above.
  • the offspring covers seeds, seeds, plants and any part of plants.
  • the present invention also relates to a Brassica napus plant with low levels of glucosinolates and erucic acid derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646 whose genome comprises a DNA fragment resulting from a recombination event containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that its genome does not show any radish allele of the E33M47 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
  • the present Brassica napus restorer plant with low levels of glucosinolates and erucic acid is characterized in that its genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, secondly, by the sequence SEQ ID No. 2.
  • progeny which is also an object of the invention, also has the criteria of low levels of glucosinolates and erucic acid according to the invention and restorer according to the genotypic and phenotypic segregation.
  • the present invention relates to a Brassica napus plant with low levels of glucosinolates and erucic acid derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646 whose genome comprises a DNA fragment derived from a recombination event containing the Rf gene for the restoration of male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, characterized in that:
  • said genome of the plant does not have any radish allele of the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2, and
  • said genome of the plant has the Brassica napus allele of the marker OPY 17 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least one sequence comprising at least 12 nucleotides consecutive sequences of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly, by the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 4.
  • the present Brassica napus restorer plant with low levels of glucosinolates and erucic acid is characterized in that its genome does not exhibit the marker E33M47 (non-amplified radish allele) defined by the pair of nucleotide primers consisting of on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 2 and in that its genome has the marker OPY 17 (amplified brassica napus allele) defined by the pair of primers nucleotides constituted, on the one hand, by SEQ ID No. 3 and, on the other hand, by SEQ ID No. 4.
  • Its offspring which is also an object of the invention, also has the criteria of low levels of glucosinolates and erucic acid and the restorative nature as a function of genotypic and phenotypic segregation.
  • rapeseed (Brassica napus) is an allogamous species
  • This line Rf then consists of a valuable tool for the realization of new plants whose agronomic and genetic qualities are improved (heterosis, homeostasis, resistance to various pathogens).
  • the plants according to the present invention can also be characterized with molecular markers other than E33M47.
  • markers are, for example, OPC2, OPF10, OPN20, OPY17 and OPH15 and are defined by the primers given above or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequences respectively given above (SEQ ID NO: 3 to 12).
  • the plants according to the invention do not systematically show any labeling with E33M47 (no radish allele or amplified brassica, preferably napus, oleracea or Profpa, more preferably napus or oleracea) and secondly, have for example a labeling with at least one of the following markers:
  • OPY 17 (a Brassica allele, preferably napus, oleracea or Profpa, more preferably napus or oleracea),
  • OPN20 (a Brassica allele, preferably napus, oleracea or Profpa, more preferably napus or oleracea),
  • Another subject of the present invention relates to a process for obtaining a Brassica plant as defined above, characterized in that it comprises the following stages: a) Implementing a Brassica napus male plant resulting from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, and comprising a fragment of radish genome comprising the fertility gene Rf, and preferably comprising an Ogura CMS cytoplasm,
  • step c) Cross the plants of step a) with the plants of step b),
  • step b) Backcrossing with the plant of step b) to obtain the introgression of the radish DNA fragment containing the Rf gene present in the genome of Brassica napus plant seeds deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, in the genome of said recurrent plant. f) Select fertile plants.
  • step f) Cross the plants of step f) together to obtain homozygous plants.
  • the female of step b) can be a Brassica napus female.
  • it is a female of a plant of another variety than the plant derived from the seed deposited in the collection under the name Brassica napus NCIMB 41646 or a Brassica of a species other than Brassica napus , such as Brassica oleracea.
  • a selection of fertile plants can be made at the end of step d) and step f). It is done through morphological criteria, such as the presence of flowers. Such a selection is well known to those skilled in the art. Backcrossing is done to increase the percentage of the genome of the female recurrent plant and thus reduce the amount of Brassica napus genome in the plant obtained after crossing.
  • the number of backcrosses performed is repeated as many times to obtain a percentage of at least 80% of the genome of the female plant used in the cross, preferably at least 98%. These practices are widely known to those skilled in the art.
  • the recurrent female plant is a Brassica oleracea plant.
  • the presence or absence of the fertility gene Rf should be verified. This is done through visual markers, morphological such as the presence of fertile flowers or using molecular markers as defined in the present application.
  • step e) comprises an additional step e ') of implementing the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2 and plant selection not including this marker E33M47.
  • the present invention covers Brassica plants obtained at the end of one or the other of the processes described above.
  • another subject of the invention relates to a hybrid plant with low levels of glucosinolates and erucic acid comprising a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that It is obtained by crossing a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid, preferably Brassica napus, oleracea and Ranpa, preferably Brassica napus, or a Brassica plant derived from the seed deposited NCIMB 41646 as defined above. as a male parent and another plant
  • Brassica with low levels of glucosinolates and erucic acid having cytoplasmic male sterility (CMS Ogura) as a female parent.
  • Another subject of the invention relates to the hybrid seeds derived from the hybrid plant as defined above as well as the progeny of said hybrid plant.
  • a new subject of the present application relates to a Brassica plant, preferably Brassica napus, oleracea and Ranpa, optionally obtained from NCIMB filed seed 41646, whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for the restoration of male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, showing increased agronomic qualities, characterized in that it meets at least one of the following agronomic criteria:
  • the number of seeds produced per plant is increased by at least 25%, preferably 30%, relative to the reference plant Billy produced under given conditions,
  • the number of siliques per ampe is increased by at least 8%, preferably
  • the length of the siliques is increased by at least 10%, preferably 12%, relative to the Billy reference plant produced under given conditions.
  • the level of glucosinolates contained in the seeds of said Brassica plants according to the invention as defined above and whose genome comprises a DNA fragment containing the gene Restoration Rf of the male fertility for the CMS Ogura system is preferably decreased by at least 20%, preferably 30% relative to the seeds of Brassica plants from another restorative line such as the restorative line R2864-BSD .
  • the invention relates to a hybrid Brassica plant as defined above, the genome of which comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, presenting increased agronomic qualities, characterized in that it meets at least one of the following agronomic criteria:
  • the number of seeds produced per silique is increased by at least 7%, preferably at least 8%, more preferably between 8% and 15% relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions,
  • the number of siliques per ampe is increased by at least 10%, preferably 20%, relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions,
  • the length of the siliques is increased by at least 2%, preferably 10% relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions.
  • the reference hybrid used is a restorative hybrid that is either a hybrid between R2864-BSD as the male parent and FBHC215 as the female parent, a hybrid between R2864-BSD (male) and F02228 (female).
  • the agronomic data obtained with the hybrids according to the invention show that the values concerning the number of seeds produced by siliques, the number of siliques per ampe and the length of the siliques are always greater than those of the reference hybrid, demonstrating the good agronomic qualities of a hybrid plant according to the invention.
  • Another subject of the present invention relates to a method for producing hybrid plants as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
  • a) implement a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid, preferably Brassica napus, oleracea or Ranpa, more preferably Brassica napus, optionally obtained from the deposited seed NCIMB 41646, the genome of which comprises a fragment of DNA containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility as defined above, and reproduced to be homozygous, said plant being used as a pollinator, b) implementing a Brassica CMS plant Ogura system with low levels of glucosinolates and erucic acid from a given line or variety, as a female plant,
  • step c) cross between the plant of step a) and the plant of step b) to obtain a hybrid plant
  • step d) harvesting the hybrid seeds from the plant obtained at the end of step c).
  • step a) harvesting the hybrid seeds from the plant obtained at the end of step c).
  • a last subject of the invention covers the use of the plants as defined above, whether they are Brassica Rf plants with low levels of glucosinolates and erucic acid or Rf hybrids with low levels of glucosinolates and erucic acid or plants produced according to the method as defined above for food applications.
  • the Brassica rapeseed plants have an interest in the production of oil which is sought for its food but also industrial applications, especially in the automobile.
  • the plants according to the present invention also allow the production of cakes which is a source of protein of interest in animal feed (livestock, pigs and poultry).
  • the restorative plants according to the invention designated R7631 are derived from a cross between F50731 and Zenith. It has been possible to establish a line of restorative plants according to the invention through the implementation of an ambitious breeding program of male restorers with more than 200 crossings per year with 50 lines per crossing.
  • the line of restorative plants according to the invention was obtained after 7 years of selection essentially focused on obtaining a shorter radish introgression and maintaining a high level of agronomic quality (low levels of glucosinolates and of acid erucic, good yield component, high oil content and good level of disease resistance).
  • Example 1 Cultivation of plants according to the invention
  • the exemplified lines were sown at the conventional seeder with a density of 55 grains per m 2 .
  • Table 1 lists, according to the genotypes of the plants tested; the measured data concerning the level of glucosinolates in the seeds, the level of oil in the plant according to the invention or in another restorative line (R2864-BSD) or a non-restorative reference line (Billy).
  • R7631 produces siliques whose length without the end is larger. Length of the siliques with their end
  • Mean Sq Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
  • R7631 produces siliques whose length with their end is greater. Number of seeds
  • Mean Sq Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
  • R7631 produces a larger number of seeds.
  • Table 2 lists the results of the agronomic data tested on the R7631 plants according to the invention and on the Billy reference plants.
  • Table 3 lists the results of the agronomic data tested on the hybrids according to the invention. This also allows to see the impact of the male and / or the female on the agronomic qualities.
  • Mean Sq Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
  • Mean Sq Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
  • Mean Sq Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
  • the DNA was extracted from tissue crushed with liquid nitrogen using a CTAB extraction protocol following the protocol given in Doyle and Doyle, 1990 (Doyle and Doyle, 1990, Isolation Focus, vol 12 ppl3-15).
  • SEQ ID NO: 9 + SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 12 were added to the amplification mix at the concentration of 5pmol each.
  • PCR is standard using the INVITROGEN® Taq Platinum.
  • the amplification conditions are as follows:
  • the amplification products were separated on a 2% agarose gel.
  • the radish allele with this marker is not amplified in the line according to the invention whereas it is in restorer lines tested in the prior art.
  • the restorative lines of the invention have the markers OPC2 and OPF10 corresponding to an amplified fragment of the radish allele associated with fertility.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

This invention relates to a Brassica plant having low glucosinolate and erucic acid contents, the genome of which includes a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male-sterility, and the genome of which does not have the radish allele of the E33M47 marker defined by the pair of nucleotide primers consisting of the sequence SEQ ID No. 1 and/or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, as well as of the sequence SEQ ID No. 2 and/or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2. The invention relates to a hybrid plant obtained by crossbreeding a plant described herein as the male parent and another plant, Brassica Ogura CMS, as the female parent, as well to the method for producing such a plant. The invention also relates to the seeds and offspring of all the above-mentioned plants, as well as to the use of the above-mentioned plants for use in food, preferably in the production of oil and/or in the production of oil-cakes.

Description

PLANTE BRASSICA RESTAURATRICE DE FERTILITE DANS UN SYSTEME BRASSICA PLANT RESTAURANT OF FERTILITY IN A SYSTEM
DE STERILITE MÂLE CYTOPLASMIQUE OGURA, PROCEDE DE OGURA CYTOPLASMIC MALE STERILITY SYSTEM
PRODUCTION ET UTILISATION DE CETTE PLANTE  PRODUCTION AND USE OF THIS PLANT
Le domaine de l'invention est celui de l'amélioration végétale, et en particulier le développement de nouveaux hybrides du colza, Brassica napus, oleracea et râpa. The field of the invention is that of plant breeding, and in particular the development of new hybrids of rapeseed, Brassica napus, oleracea and râpa.
La culture du colza, aussi appelé canola outre-atlantique, est très répandue sur tous les continents en raison du fait de ses multiples atouts tant dans le domaine alimentaire qu'industriel. En effet, le colza permet une grande production d'huile largement utilisée en tant que produit alimentaire mais également en tant que biocarburant notamment dans l'industrie automobile ou autre. Le colza permet aussi la production de tourteaux qui sont une source de protéines intéressante en alimentation animale (gros bétail, porcins et volaille). Canola cultivation, also called canola across the Atlantic, is widespread on all continents because of its many strengths in both the food and industrial fields. Indeed, rapeseed allows a large production of oil widely used as a food product but also as a biofuel especially in the automotive industry or otherwise. Rapeseed also allows the production of cakes which are an interesting source of protein in animal feed (livestock, pigs and poultry).
Malgré ces atouts, l'utilisation alimentaire de l'huile de colza oléagineux a été longtemps restreinte à cause de sa teneur trop importante en acide érucique. En effet, en fonction des variétés de colza, le taux d'acide érucique pouvait représenter jusqu'à 50% des acides gras totaux de la plante et avoir ainsi un impact néfaste sur la santé humaine. Despite these strengths, the food use of oilseed rape oil has been restricted for a long time because of its high content of erucic acid. Indeed, depending on the varieties of rapeseed, the erucic acid level could represent up to 50% of the total fatty acids of the plant and thus have a detrimental impact on human health.
De même, l'utilisation du colza pour la fabrication de tourteaux a également été longtemps freinée en raison des forts taux de glucosinolates contenus dans les graines. Lors de la formation des tourteaux, le broyage des graines libère l'enzyme myrosinase qui transforme les glucosinolates des graines en divers sous-produits tels que glucoses, thiocyanates, isothiocyanates et nitriles qui peuvent entrainer des troubles du métabolisme chez les mammifères. Le large développement de la culture de colza est principalement du à deux avancées techniques majeures : la diminution du taux d'acide érucique dans l'huile ainsi que la diminution du taux de glucosinolates dans les graines. En effet, aujourd'hui, un net travail d'amélioration des plantes a permis d'obtenir des variétés commerciales dont le taux d'acide érucique est inférieur à 2% des acides gras totaux de la plante de colza. De plus, en Europe, le décret 2294/92 a fixé le taux maximal de glucosinolates acceptable dans les graines à 25 μmol par gramme de graine à 9% d'humidité. Le taux de glucosinolates et le taux d'acide érucique étant deux paramètres intéressants dans la production des produits dérivés du colza, les sélectionneurs ont, par conséquent, cherché à développer des variétés dites "doubles zéros" c'est-à-dire des variétés de colza qui présentent des taux très bas d'acide érucique dans l'huile et des taux très bas de glucosinolates dans les graines. In the same way, the use of rapeseed for the manufacture of oilcakes has also been slowed down for a long time because of the high levels of glucosinolates contained in the seeds. During seed cake formation, seed milling releases the enzyme myrosinase which converts seed glucosinolates into various by-products such as glucoses, thiocyanates, isothiocyanates and nitriles which can lead to metabolic disorders in mammals. The broad development of the rapeseed crop is mainly due to two major technical advances: the reduction of the erucic acid level in the oil as well as the decrease of the glucosinolate level in the seeds. Indeed, today, a net work of improvement of the plants made it possible to obtain commercial varieties whose rate of erucic acid is lower than 2% of the total fatty acids of the rapeseed plant. In addition, in Europe, Decree 2294/92 set the maximum level of acceptable glucosinolates in seeds at 25 μmol per gram of seed at 9% moisture content. Glucosinolates and erucic acid levels being two interesting parameters in the production of rapeseed products, breeders have therefore sought to develop varieties called "double zeros" that is to say varieties rapeseed that have very low levels of erucic acid in the oil and very low levels of glucosinolates in the seeds.
Le colza étant une espèce autogame, ces variétés ont longtemps été uniquement des variétés population et non des plantes hybrides. Cependant, le développement de plantes hybrides de colza présente de multiples intérêts, tant pour l'agriculteur que pour le sélectionneur, puisque cela permet d'obtenir des plantes améliorées, présentant des qualités d'hétérosis (ou vigueur hybride), d'homéostasie (stabilité de la plante dans différents environnements), la possibilité d'introduire et de combiner des gènes de résistance à des insectes, des champignons, des bactéries ou des virus, ou encore l'adaptation à des stress abiotiques. Mais ce développement de plantes hybrides de colza nécessite des moyens efficaces de contrôle de la pollinisation. Pour ce faire, ont été développées des techniques de stérilité mâle cytoplasmique (ou CMS pour Cytoplasmic MaIe Sterility) tels que les systèmes Polima, Kosena et surtout Ogura.  Rapeseed being an autogamous species, these varieties have long been only population varieties and not hybrid plants. However, the development of hybrid rapeseed plants has multiple interests, both for the farmer and the breeder, since this makes it possible to obtain improved plants with qualities of heterosis (or hybrid vigor), of homeostasis ( plant stability in different environments), the ability to introduce and combine resistance genes to insects, fungi, bacteria or viruses, or adaptation to abiotic stresses. But this development of hybrid rape plants requires effective means of controlling pollination. To do this, have been developed cytoplasmic male sterility techniques (or CMS for Cytoplasmic MaIe Sterility) such as Polima systems, Kosena and especially Ogura.
Le système de stérilité mâle cytoplasmique Ogura est basé sur l'utilisation d'un déterminant de stérilité mâle dérivé du cytoplasme du radis (Raphanus sativus), qui a été transférée depuis le radis dans les Brassica napus par croisements inter-spécifïques, sauvetages d'embryons et rétro-croisements (Bannerot et al, 1974). La fusion de protoplastes a été nécessaire pour produire des hybrides cytoplasmiques mâles stériles (Pelletier et al., 1983). Mais la stérilité mâle cytoplasmique CMS Ogura étant dominante, la plante hybride de colza ne produit pas de pollen, et sans pollen, la plante ne produit pas de graines. Pour remédier à cette situation et obtenir une récolte, il est nécessaire que le parent mâle de l'hybride contienne un gène de restauration de la fertilité mâle. Un tel gène de restauration de la fertilité mâle du système Ogura a été identifié chez le radis Raphanus sativus et transféré dans les plantes Brassica porteuses de la stérilité mâle cytoplasmique par l'Institut National de la Recherche Agronomique en 1987 (Pelletier et al, 1987, Proc 7th Int. Rapeseed Conf. Poznan, Poland, 113/119). Le gène de restauration Rf a été décrit dans la demande de brevet WO92/05251 et dans Delourme et al, 1991, Proc 8th Int. Rapeseed Conf. Saskatoon, Canada, 1506/1510. Toutefois, les plantes obtenues porteuses de ce gène Rf de restauration de la fertilité mâle présentent deux inconvénients majeurs : une augmentation importante des taux de glucosinolates dans les graines et une diminution importante des caractéristiques agronomiques de la plante telles qu'une diminution de la quantité de graines produites, une diminution de la résistance aux maladies et une susceptibilité accrue à la verse. Ces inconvénients semblent directement liés au fragment d'introgression porteur notamment du gène Rf de restauration de la fertilité mâle cytoplasmique transféré depuis Raphanus sativus. Cette région chromosomique ne comportant pas que le gène de restauration Rf, elle comprend aussi un ou plusieurs gènes qui entraînent les inconvénients susmentionnés. Afin de remédier à cette situation, divers programmes de recherches ont cherché à obtenir des événements de recombinaisons dans cette région chromosomique, recombinaisons visant à casser la liaison génétique existant entre les segments d'ADN codant pour les différents caractères. Les recherches ont toutefois été rendues difficiles par le fait que la région chromosomique entourant le gène de restauration Rf est très difficilement sujette aux recombinaisons. De plus, des fragments d'introgression trop courts ne sont pas intéressants car certaines fonctions semblent « perdues ». L'hypothèse la plus séduisante, émise par l'INRA, serait d'arriver à une introgression très courte mais pas trop, comportant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle, mais où les segments chromosomiques de Raphanus sativus « délétères » sont remplacés par leurs homologues/homéologues Brassica, restaurant ainsi aussi les qualités agronomiques. La demande de brevet WO97/02737 (Zenco) divulgue un premier événement de recombinaison au sein du fragment chromosomique issu de Raphanus sativus résultant en la création de plantes de Brassica napus combinant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle et des taux de glucosinolates diminués. Ces taux de glucosinolates, même diminués, sont toutefois toujours supérieurs aux minimums requis actuellement. The Ogura cytoplasmic male sterility system is based on the use of a male sterility determinant derived from the radish cytoplasm (Raphanus sativus), which was transferred from radish into Brassica napus by inter-specific crosses, rescues of embryos and backcrossings (Bannerot et al, 1974). Protoplast fusion was required to produce sterile male cytoplasmic hybrids (Pelletier et al., 1983). But CMS Ogura cytoplasmic male sterility being dominant, the hybrid rapeseed plant does not produce pollen, and without pollen, the plant does not produce seeds. To remedy this situation and obtain a harvest, it is necessary for the male parent of the hybrid to contain a gene for restoring male fertility. Such a gene for restoring the male fertility of the Ogura system was identified in Raphanus sativus radish and transferred to Brassica plants carrying cytoplasmic male sterility by the National Institute for Agronomic Research in 1987 (Pelletier et al, 1987, Proc 7th Int.Repeseed Conf Poznan, Poland, 113/119). The Rf recovery gene has been described in patent application WO92 / 05251 and in Delourme et al., 1991, Proc. 8th Int. Rapeseed Conf. Saskatoon, Canada, 1506/1510. However, the plants obtained carrying this Rf gene for restoring male fertility have two major drawbacks: a significant increase in the glucosinolate levels in the seeds and a significant decrease in the agronomic characteristics of the plant such as a decrease in the amount of seeds produced, decreased disease resistance and increased susceptibility to lodging. These disadvantages seem directly related to the introgression fragment carrying the Rf gene for restoring cytoplasmic male fertility transferred from Raphanus sativus. This chromosomal region does not Not including the Rf restoration gene, it also includes one or more genes that cause the aforementioned drawbacks. In order to remedy this situation, various research programs have sought to obtain recombination events in this chromosomal region, recombinations aimed at breaking the genetic linkage existing between the DNA segments coding for the different characters. However, research has been made difficult by the fact that the chromosomal region surrounding the Rf recovery gene is very difficult to recombine. In addition, fragments of introgression that are too short are not interesting because some functions seem "lost". The most attractive hypothesis, issued by INRA, would be to arrive at a very short but not too introgression, with the Rf gene for restoring male fertility, but where the chromosomal segments of Raphanus sativus "deleterious" are replaced by their counterparts / homéologues Brassica, restaurant as well as the agronomic qualities. The patent application WO97 / 02737 (Zenco) discloses a first recombination event within the chromosomal fragment derived from Raphanus sativus resulting in the creation of Brassica napus plants combining the Rf gene for restoring male fertility and decreased glucosinolate levels. . These glucosinolate levels, however decreased, are still higher than the minimums required at present.
La demande de brevet WO98/27806 (Pioneer) se rapporte à la création de plantes Brassica hybrides comprenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle et ayant un taux de glucosinolates inférieur à 30 μmol par gramme de matière sèche et un taux d'acide érucique inférieur à 2% en poids du contenu d'acide gras total. Ces plantes sont obtenues par croisement entre un premier parent choisi entre quatre lignées différentes et un second parent ayant un taux de glucosinolates suffisamment bas pour que l'hybride ait un taux inférieur à 30 μmol. La liaison entre le gène restaurateur Rf et le locus responsable du taux de glucosinolates élevé a été rompue permettant ainsi d'obtenir des hybrides restaurateurs de la fertilité mâle et ayant des taux de glucosinolates faibles. Toutefois, il s'agit ici de la création d'hybrides, non de lignées restauratrices stables. Patent Application WO98 / 27806 (Pioneer) relates to the creation of hybrid Brassica plants comprising the Rf gene for restoring male fertility and having a glucosinolate content of less than 30 μmol per gram of dry matter and an acid level. erucic less than 2% by weight of the total fatty acid content. These plants are obtained by crossing between a first parent selected from four different lines and a second parent having a glucosinolate level sufficiently low for the hybrid to have a level below 30 μmol. The link between the Rf restorative gene and the locus responsible for elevated glucosinolate levels has been broken, thus making it possible to obtain restorer hybrids of male fertility and having low glucosinolate levels. However, this is the creation of hybrids, not stable restorative lines.
La demande de brevet WO 2005/074671 (Syngenta) montre la réalisation d'un événement de recombinaison particulier entre le gène Rf de restauration de la fertilité mâle et le ou les gènes liés aux niveaux élevés de glucosinolates dans les graines. Cet événement est caractérisé à l'aide de marqueurs spécifiques. En particulier, la plante produite contenant cet événement de recombinaison est identifiée par le marqueur E33M47 mais pas par le marqueur OPY 17. Par ailleurs, la demande de brevet est silencieuse quand aux caractéristiques agronomiques de la plante produite, notamment sur le niveau de sa production de graines. Or, si la diminution du taux de glucosinolates dans les graines est une nécessité pour toute plante commercialisée, la diminution de ses qualités agronomiques, en particulier sa production grainière, doit être absolument évitée. La demande de brevet WO 2005/002324 (INRA) concerne la mise au point d'une méthode de production de la lignée Rf restauratrice de la fertilité mâle « double zéro », c'est-à-dire ayant un faible taux d'acide érucique dans l'huile et un faible taux de glucosinolates dans les graines. Afin d'augmenter la fréquence de recombinaison et donc la possibilité de cassure de la liaison génétique entre les séquences génétiques de restauration de la fertilité mâle et celles responsables des niveaux élevés de glucosinolates, les inventeurs ont irradié, avant la méiose, des plantes issues d'un croisement entre des lignées « double zéro » CMS restaurées et la lignée « double zéro » Drakkar. L'analyse des plantes obtenues, par les marqueurs moléculaires, tels que PGIoI, PgIUNT, PgLint, BolJon et CP418, indique qu'une recombinaison semble effectivement avoir eu lieu, remplaçant le gène Pgi2 de Raphanus sativus par celui de Brassica oleracea. La lignée produite par l'INRA est connue aujourd'hui sous la dénomination R2000. Cependant, même si l'utilisation des radiations permet d'augmenter la fréquence de recombinaison, elle est toujours délicate, en particulier sur une région reconnue instable comme l'est celle de l'introgression de Raphanus sativus portant le gène Rf de restauration de la stérilité mâle cytoplasmique. Patent application WO 2005/074671 (Syngenta) shows the realization of a particular recombination event between the Rf gene for restoring male fertility and the gene or genes linked to high levels of glucosinolates in the seeds. This event is characterized by specific markers. In particular, the plant produced containing this recombination event is identified by the marker E33M47 but not by the marker OPY 17. Furthermore, the patent application is silent when the agronomic characteristics of the plant produced, in particular on the level of its seed production. However, if the reduction of the glucosinolate level in the seeds is a necessity for any commercialized plant, the reduction of its agronomic qualities, in particular its grain production, must be absolutely avoided. The patent application WO 2005/002324 (INRA) relates to the development of a method for producing the Rf line restoring male fertility "double zero", that is to say having a low level of acid erucic in the oil and a low level of glucosinolates in the seeds. In order to increase the frequency of recombination and thus the possibility of breaking the genetic link between the genetic sequences for restoring male fertility and those responsible for the high levels of glucosinolates, the inventors irradiated, before meiosis, plants derived from 'a cross between restored' double zero 'CMS lines and the' double zero 'Drakkar line. The analysis of the plants obtained by the molecular markers, such as PGIoI, PgIUNT, PgLint, BolJon and CP418, indicates that a recombination indeed seems to have taken place, replacing the Pgi2 gene of Raphanus sativus by that of Brassica oleracea. The line produced by INRA is known today as R2000. However, even if the use of radiation makes it possible to increase the frequency of recombination, it is always delicate, in particular on a region known to be unstable, as is the introgression of Raphanus sativus carrying the Rf gene of restoration of the cytoplasmic male sterility.
Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention est d'obtenir une lignée Brassica Rf restauratrice de la fertilité mâle palliant tous les inconvénients cités précédemment et en particulier une lignée Rf restauratrice à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ainsi que ses graines et sa descendance. In this context, one of the essential objectives of the invention is to obtain a Brassica Rf line restoring male fertility overcoming all the drawbacks mentioned above and in particular a Rf restoring line with low levels of glucosinolates and erucic acid. as well as his seeds and his descendants.
Un autre objectif de l'invention est d'obtenir des graines et des plantes Brassica hybrides à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique contenant le gène Rf restaurateur de la fertilité mâle pour le système Ogura conservant des qualités agronomiques intéressantes.Another object of the invention is to obtain seeds and hybrid Brassica plants with low glucosinolate and erucic acid levels containing the Rf gene restoring male fertility for the Ogura system retaining valuable agronomic qualities.
Un autre objectif de l'invention est d'obtenir les graines de ladite lignée Rf et desdites plantes hybrides et la descendance de ces plantes. Another object of the invention is to obtain the seeds of said line Rf and said hybrid plants and the progeny of these plants.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un procédé efficace, rapide et économique de production de ces plantes hybrides à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique restauratrices de la fertilité mâle. Another essential objective of the invention is to provide an efficient, fast and economical method for producing these low-glucosinolate and erucic acid hybrid plants that restore male fertility.
Un autre objectif de l'invention est de fournir des plantes restauratrices de la fertilité mâle possédant des qualités agronomiques accrues. DESCRIPTION SUCCINCTE DE L'INVENTION Another object of the invention is to provide male fertility restoring plants with increased agronomic qualities. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Les objectifs susvisés, parmi d'autres, sont ainsi atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord une nouvelle lignée restauratrice Rf à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique et possédant des qualités agronomiques accrues, en particulier une bonne production grainière. Cette lignée a été appelée R7631. Il s'agit plus précisément d'une lignée Brassica restauratrice de la fertilité mâle due au système Ogura de stérilité cytoplasmique mâle (CMS Ogura). Elle présente un profil génétique nouveau avec un fragment d'introgression restaurant la fertilité mâle différent et plus court que ceux divulgués dans l'art antérieur mais pas trop court de manière à obtenir de bonnes qualités agronomiques.  The above-mentioned objectives, among others, are thus achieved by the present invention which firstly concerns a new Rf restoring line with low levels of glucosinolates and erucic acid and having increased agronomic qualities, in particular a good grain production. . This line has been called R7631. It is more specifically a Brassica line restoring male fertility due to the Ogura system of male cytoplasmic sterility (CMS Ogura). It presents a new genetic profile with an introgression fragment restoring male fertility different and shorter than those disclosed in the prior art but not too short so as to obtain good agronomic qualities.
Par ailleurs, suite à l'événement de recombinaison, son profil génétique recouvre un fragment de génome d'origine Brassica homologue à un fragment perdu de l'introgression . Sans vouloir établir une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la perte de fragment d'introgression de radis par recombinaison au profit d'un fragment homologue de Brassica participe à l'amélioration des propriétés agronomiques et à la stabilité du génome de la plante restauratrice.  Moreover, following the recombination event, its genetic profile covers a genome fragment of Brassica origin homologous to a lost fragment of introgression. Without wishing to establish any theory, the inventors believe that the loss of a fragment of radiot introgression by recombination in favor of a homologous Brassica fragment contributes to the improvement of the agronomic properties and the stability of the genome of the restorative plant.
Cette lignée a été conçue et identifiée, après de nombreux croisements, sélections et autres expérimentations faisant notamment appel à la biologie moléculaire et tout particulièrement grâce à des marqueurs moléculaires précis qui ont permis de dresser son profil génétique et ainsi de déterminer son caractère nouveau et plus performant par rapport aux lignées existantes, notamment sur la fertilité.  This line has been designed and identified, after numerous crosses, selections and other experiments using molecular biology and especially thanks to precise molecular markers that allowed to establish its genetic profile and thus to determine its new character and more performant compared to existing lines, especially on fertility.
Cette lignée a également été conçue grâce à des techniques n'utilisant pas d'irradiations avant la méïose. En effet, il est du mérite des inventeurs d'avoir conçu une telle lignée restauratrice non seulement sans avoir recours aux irradiations dans une région chromosomique où les recombinaisons homologues sont particulièrement difficiles mais également d'avoir réussi à établir une lignée alors que la région d'introgression portant le gène de restauration de le fertilité mâle dans le système Ogura est particulièrement instable.  This line was also designed using techniques that did not use irradiation before meiosis. Indeed, it is the merit of the inventors to have designed such a restorative line not only without resorting to irradiation in a chromosomal region where homologous recombinations are particularly difficult but also to have succeeded in establishing a lineage while the Introgression carrying the gene for restoring male fertility in the Ogura system is particularly unstable.
L'invention a également pour objet les plantes hybrides conçues par croisement à partir de ladite lignée restauratrice Rf à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ainsi que leur procédé de production qui consiste, entre autres, à croiser une plante de la lignée restauratrice Rf avec une autre plante, de préférence Brassica. The invention also relates to hybrid plants designed by crossing from said restoring line Rf low glucosinolates and erucic acid and their production process which consists, inter alia, to cross a plant of the restorative line Rf with another plant, preferably Brassica.
L'invention a également pour objet des plantes Brassica restauratrices de la fertilité mâle et possédant des qualités agronomiques très intéressantes. Enfin, l'invention a également pour objet les différentes applications des susdites plantes, notamment dans le domaine alimentaire (production d'huile et/ou de tourteaux). The invention also relates to brassica plants restoring male fertility and having very interesting agronomic qualities. Finally, the invention also relates to the various applications of the above plants, especially in the food field (oil production and / or cake).
DEFINITIONS DEFINITIONS
Afin de mieux comprendre l'invention, il convient tout d'abord de rappeler ou de donner quelques définitions données à titre d'exemples non limitatifs. Au sens de la présente demande : To better understand the invention, it is first necessary to recall or give some definitions given by way of non-limiting examples. For the purposes of this application:
- Par plante, on entend par exemple un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment : embryon, ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte.  By plant is meant for example a plant at any stage of development whatsoever, including: embryo, or any other seedling stage or adult plant.
- Par plante mâle ou parent mâle on entend par exemple une plante utilisée comme donneur de pollen dans un croisement. - By male or male parent is meant for example a plant used as a pollen donor in a cross.
- Par plante femelle ou parent femelle on entend par exemple une plante utilisée comme receveur de pollen, ou donneur d'ovule dans un croisement.  For example, a female or female parent is a plant used as a pollen recipient, or egg donor in a cross.
- Par partie de plante on entend par exemple le pollen, les ovules, les embryons, les feuilles, les anthères, les tiges, les pétioles, les racines, les fruits, les graines, les fleurs, les bourgeons, les protoplastes, les cals, les cellules et tissus cellulaires.  - By plant part is meant, for example, pollen, ova, embryos, leaves, anthers, stems, petioles, roots, fruits, seeds, flowers, buds, protoplasts, calli cells and cell tissues.
- Par descendance de la plante, on entend par exemple un embryon de plante, une plante, les graines et les semences de la plante parente.  - By progeny of the plant is meant for example a plant embryo, a plant, seeds and seeds of the parent plant.
- Par plante hybride, on entend par exemple une plante issue du croisement entre deux parents génétiquement différents. Pour une plante de la première génération d'un croisement entre deux parents homozygotes génétiquement distincts, par exemple deux variétés distinctes, on parlera d'hybride Fl.  By hybrid plant is meant, for example, a plant derived from the cross between two genetically different parents. For a plant of the first generation of a cross between two genetically distinct homozygous parents, for example two distinct varieties, we speak of hybrid F1.
- Par introgression, on entend par exemple un fragment d'ADN d'une espèce introduit dans le génome d'une plante d'une autre espèce. En l'occurrence, l' introgression selon l'invention provient du radis (Raphanus sativus) et a été transférée chez une Brassica, de préférence une Brassica oleracea.  Introgression means, for example, a fragment of DNA of one species introduced into the genome of a plant of another species. In this case, the introgression according to the invention comes from radish (Raphanus sativus) and was transferred to a Brassica, preferably a Brassica oleracea.
- Par événement de recombinaison, on entend par exemple un fragment d'ADN introduit par recombinaison génétique qui consiste en un échange d'information génétique entre deux génomes différents ou bien entre deux chromosomes.  By recombination event is meant for example a DNA fragment introduced by genetic recombination which consists of an exchange of genetic information between two different genomes or between two chromosomes.
- Par gène Rf, on entend par exemple le gène restaurateur de la fertilité mâle provenant du radis et ceci dans le système de stérilité cytoplasmique mâle Ogura. By Rf gene is meant, for example, the gene for restoring male fertility derived from radish and this in the Ogura male cytoplasmic sterility system.
- Par lignée Rf, on entend par exemple une lignée Brassica ou plante Brassica dont le génome comprend le gène Rf de restauration de la fertilité mâle provenant du radis et ceci dans le système de stérilité cytoplasmique mâle Ogura.  - By Rf line, for example means a Brassica line or Brassica plant whose genome includes the Rf gene for restoring male fertility from radish and this in the Ogura male cytoplasmic sterility system.
- Par plante restauratrice, on entend une plante porteuse du gène Rf restaurateur de la fertilité mâle dans le système de stérilité cytoplasmique mâle Ogura. - Par plante à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique, on entend par exemple une plante présentant à la fois un taux d'acide érucique inférieur ou égal à 2% des acides gras totaux contenus dans la plante, de préférence inférieur ou égal à 0,5% et plus préférentiellement encore à 0,1% et un taux de glucosinolates dans ses graines inférieur ou égal à 25 μmol par gramme de graines, de préférence situé entre 10 et 16 μmol par grammes de graines, à 9% d'humidité dans les graines. Par extension dans la présente demande par bas taux de glucosinolates ou taux bas de glucosinolates, on entend le taux limite sus-mentionné. Il en va de même respectivement pour l'acide érucique. - By restorative plant is meant a plant carrying the Rf gene restoring male fertility in the Ogura male cytoplasmic sterility system. - By plant low glucosinolates and erucic acid, for example means a plant having both a level of erucic acid less than or equal to 2% of the total fatty acids contained in the plant, preferably less than or equal to at 0.5% and more preferably at 0.1% and a level of glucosinolates in its seeds less than or equal to 25 μmol per gram of seed, preferably between 10 and 16 μmol per gram of seeds, at 9% of moisture in the seeds. By extension in the present application by low glucosinolate level or low glucosinolate level is meant the above-mentioned limit rate. The same goes for erucic acid.
- Par plante CMS O aura, on entend par exemple une plante Brassica portant un déterminant de stérilité mâle Ogura tel que défini dans Bonhomme et al (1991) Curr. By plant CMS O aura, is meant for example a Brassica plant carrying a male Ogura sterility determinant as defined in Bonhomme et al (1991) Curr.
Genêt., vol.19, pp.121-127 ; et Bonhomme et al (1992) Mol.Gen.Genet., vol/235, pp.340-Genet., Vol.19, pp.121-127; and Bonhomme et al (1992) Mol.Gen.Genet., vol / 235, pp.340-
348. 348.
-Par plante récurrente ou lignée récurrente ou lignée receveuse, on entend une plante -By recurrent plant or recurrent line or recipient line, we mean a plant
Brassica de l'espèce napus ou oleracea qui ne contient pas le caractère de restauration de la fertilité ou gène Rf et qui le reçoit par croisement avec la plante Brassica napus dite donneuse déposée sous le n°NCIMB 41646. Brassica of the napus or oleracea species which does not contain the fertility restoration trait or Rf gene and which receives it by crossing with the so-called donor Brassica napus plant deposited under No. NCIMB 41646.
-Par rétrocroisement on entend le croisement des descendants issus du premier croisement entre la lignée donneuse et la lignée récurrente, avec la lignée récurrente et ainsi de suite jusqu'à ce que le génome de la lignée donneuse soit remplacé par celui de la lignée récurrente à l'exception de la région introgressée comprenant le gène Rf.  -Backcrossing is the crossing of descendants from the first cross between the donor line and the recurrent line, with the recurrent lineage and so on until the genome of the donor line is replaced by that of the recurrent lineage. except for the introgressed region including the Rf gene.
- Par marqueur moléculaire, on entend par exemple un fragment spécifique d'une séquence d'ADN pouvant être identifiée au sein du génome d'un individu et pouvant être notamment utilisée pour localiser un gène d'intérêt, vérifier si un individu a hérité d'une caractéristique particulière d'un parent ou différencier des individus. Il peut s'agir ou non d'une séquence codante. Le marqueur peut être dominant, co-dominant. La détection du marqueur moléculaire, ou sa non-détection, permet de sélectionner les individus présentant le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière, ou au contraire, de ne pas sélectionner les individus ne présentant pas le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière. Dans la présente invention, les marqueurs moléculaires permettent de tester rapidement les plantes issues de croisements donnés, les graines desdites plantes ou les parties de plantes et d'identifier les plantes à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ayant le gène restaurateur de la fertilité mâle.  Molecular marker means, for example, a specific fragment of a DNA sequence that can be identified within the genome of an individual and that can be used in particular to locate a gene of interest, to verify whether an individual has inherited a particular characteristic of a parent or differentiate individuals. It may or may not be a coding sequence. The marker may be dominant, co-dominant. The detection of the molecular marker, or its non-detection, makes it possible to select the individuals presenting the gene of interest or the particular characteristic, or on the contrary, not to select the individuals that do not have the gene of interest or the particular characteristic . In the present invention, the molecular markers make it possible to quickly test the plants resulting from given crosses, the seeds of said plants or parts of plants and to identify the plants with low levels of glucosinolates and erucic acid having the restoring gene of the plant. male fertility.
Un marqueur moléculaire spécifique selon la présente invention est un marqueur moléculaire identifiant spécifiquement la présence ou non du gène Rf restaurateur de la fertilité mâle et l'utilisation combinée de plusieurs marqueurs choisis permettra de différencier la plante restaurée comprenant le gène Rf des plantes non restaurées ne comprenant pas le gène Rf ou des autres plantes produites dans l'art antérieur. - Par amorce nucléotidique ou primer, on entend par exemple une séquence artificielle d'ADN, courte (d'au moins 12 à 30 paires de bases ou nucléotides) complémentaire d'un des brins du fragment d'ADN que l'on souhaite amplifier par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou que l'on souhaite séquencer. En l'occurrence, on choisit des amorces spécifiques du marqueur à tester. Les amorces sont désignées sur la séquence de la région à amplifier et il est vérifié que l'amplicon est monolocus et qu'il coségrège avec le gène Rf.A specific molecular marker according to the present invention is a molecular marker specifically identifying the presence or absence of the Rf gene restoring male fertility and the combined use of several selected markers will make it possible to differentiate the restored plant comprising the Rf gene from unrestored plants. not including the Rf gene or other plants produced in the prior art. By nucleotide primer or primer is meant for example an artificial DNA sequence, short (of at least 12 to 30 base pairs or nucleotides) complementary to one of the strands of the DNA fragment that is to be amplified. by polymerase chain reaction (PCR) or that it is desired to sequence. In this case, specific primers of the marker to be tested are chosen. The primers are designated on the sequence of the region to be amplified and it is verified that the amplicon is monolocus and co-generated with the Rf gene.
- Par allèle, on entend selon la présente invention les diverses versions d'une séquence d'ADN donnée située à un locus (emplacement sur un chromosome) chromosomique donné, en l'occurrence dans la région chromosomique du gène Rf. By allele is meant according to the present invention the various versions of a given DNA sequence located at a given chromosomal location (location on a chromosome), in this case in the chromosomal region of the Rf gene.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Bien que les recombinaisons génétiques homologues soient difficiles à obtenir dans la région chromosomique du gène Rf de restauration de la fertilité mâle et que la région d'introgression soit très instable dans la zone de recombinaison, les inventeurs ont réussi, suite à de nombreuses expérimentations et croisements, à obtenir une nouvelle lignée Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique restauratrice de la fertilité mâle due au système CMS Ogura. Although the homologous genetic recombinations are difficult to obtain in the chromosomal region of the male fertility restoration Rf gene and the introgression region is very unstable in the recombination zone, the inventors have succeeded, following numerous experiments and crosses, to obtain a new Brassica line with low levels of glucosinolates and erucic acid restoring male fertility due to the CMS Ogura system.
Grâce à des analyses de biologie moléculaire, la lignée Rf, nommée aussi R7631 , a pu être identifiée comme présentant un profil génétique particulier et nouveau avec un fragment d'introgression original vis-à-vis des plantes restauratrices connues jusqu'à présent. Le premier objet de la présente invention porte sur une plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que ledit génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2. Thanks to molecular biology analyzes, the Rf line, also called R7631, could be identified as presenting a particular and novel genetic profile with an original introgression fragment vis-à-vis the restorative plants known hitherto. The first subject of the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for the restoration of male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that said genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
En utilisant le marqueur E33M47 tel que défini ci-dessus, aucune amplification d'allèle radis ou brassica n'est obtenue en PCR, ce qui conduit à dire que le génome de la plante selon l'invention ne présente pas le marqueur E33M47. De préférence, la présente lignée Rf selon l'invention comprend le gène Rf et est caractérisée en ce que son génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et, d'autre part, par la séquence SEQ ID N °2. By using the marker E33M47 as defined above, no amplification of radish or brassica allele is obtained in PCR, which leads to say that the genome of the plant according to the invention does not have the marker E33M47. Preferably, the present Rf line according to the invention comprises the Rf gene and is characterized in that its genome does not exhibit the E33M47 marker defined by the a pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 2.
Dans un variante de réalisation, la présente invention concerne une plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que: In an alternative embodiment, the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, characterized in that:
" ledit génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2, et  said genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers consisting, on the one hand, of the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2, and
" ledit génome de la plante présente l'allèle Brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea, du marqueur OPY said genome of the plant has the Brassica allele, preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea, of the OPY marker
17 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°3 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°4 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°4. 17 defined by the pair of nucleotide primers constituted firstly by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly by the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 4.
Dans une forme préférée de réalisation de l'invention, la présente lignée Rf selon l'invention comprend le gène Rf et est caractérisée en ce que son génome ne présente pas le marqueur E33M47 (pas d'allèle radis amplifié) défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et, d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et en ce que ledit génome présente le marqueur OPY 17 (allèle Brassica amplifié, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea) défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué par SEQ ID N°3, d'une part, et SEQ ID N°4 d'autre part. In a preferred embodiment of the invention, the present Rf line according to the invention comprises the Rf gene and is characterized in that its genome does not have the E33M47 marker (no amplified radish allele) defined by the pair of genes. nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and on the other hand by the sequence SEQ ID No. 2 and in that said genome has the marker OPY 17 (amplified Brassica allele, of preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea) defined by the pair of nucleotide primers consisting of SEQ ID No. 3, on the one hand, and SEQ ID No. 4 on the other hand.
Dans une autre variante de réalisation, la présente invention concerne une plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que : In another embodiment, the present invention relates to a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility. characterized in that
" ledit génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2, said genome does not show the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID N 1, and secondly, by the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2,
" ledit génome de la plante présente au moins un marqueur parmi les marqueurs suivants :  said genome of the plant has at least one marker among the following markers:
- un allèle Brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea, du marqueur OPY 17 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°3 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°4 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°4,  a Brassica allele, preferably napus, oleracea or raspa, more preferably napus or oleracea, of the OPY 17 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least a sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID N 4,
un allèle radis du marqueur OPC2 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°5 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°5, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°6 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°6, un allèle radis du marqueur OPFlO défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°7 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°7, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°8 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°8, sans allèle Brassica napus dudit marqueur OPF 10 tel que défini ci-dessus, un allèle brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea, du marqueur OPN20 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N0IO et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N0IO, sans allèle radis dudit marqueur OPN 20 tel que défini ci-dessus. a radic allele of the OPC2 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 5 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 5, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 6 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 6, a radish allele of the OPF10 tag defined by the pair of nucleotide primers. consisting on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 7 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 7, and on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 8 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 8, without Brassica napus allele of said OPF 10 marker as defined above, a brassica allele, preferably napus, oleracea or raspa, plus preferentially napus or oleracea, of the marker OPN20 defined by the nucleotide primer pair consisting on the one hand of the sequence SEQ ID No. 9 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 9, and on the other hand, by the sequence SEQ ID NO : 10 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID NO : 10, without any radish allele of said OPN 20 marker as defined above.
Les marqueurs moléculaires testés permettent de détecter la présence du gène restaurateur Rf dans les plantes testées. Ils permettent de déterminer le génotype des plantes obtenues avant leur floraison, ce qui fait gagner du temps aux sélectionneurs mais également de l'espace car les plantes aux génotypes inadaptés sont éliminées. The molecular markers tested make it possible to detect the presence of the Rf restorer gene in the tested plants. They make it possible to determine the genotype of the plants obtained before their flowering, which saves breeders time but also space because plants with inappropriate genotypes are eliminated.
De plus, ces analyses moléculaires permettent de déterminer de façon grossière la taille du fragment d'introgression par comparaison avec les lignées restauratrices connues. Les analyses des croisements avec les marqueurs moléculaires ont permis d'affirmer que la lignée restauratrice a un profil génétique nouveau et un fragment d'introgression différent et probablement plus court que celui des lignées restauratrices décrites dans l'art antérieur. Les marqueurs moléculaires permettent également de déterminer si les plantes testées sont homozygotes ou hétérozygotes pour le gène de restauration Rf, entre autres.  In addition, these molecular analyzes make it possible to roughly determine the size of the introgression fragment in comparison with known restorative lines. Analyzes of the crosses with the molecular markers made it possible to affirm that the restorative line has a new genetic profile and a fragment of introgression which is different and probably shorter than that of the restorative lines described in the prior art. Molecular markers also make it possible to determine whether the tested plants are homozygous or heterozygous for the Rf restoration gene, among others.
Les différents marqueurs moléculaires ont été testés par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des couples d'amorces spécifiques et définis de façon adaptée. The different molecular markers were tested by polymerase chain reaction (PCR) with specific and appropriately defined pairs of primers.
Le fragment d'introgression selon l'invention pourrait être détecté par d'autres techniques de biologie moléculaire connues telles que l'utilisation de sondes radiomarquées. Lesdites amorces spécifiques desdits marqueurs moléculaires ont été générées par des méthodes classiques connues de l'homme du métier. The introgression fragment according to the invention could be detected by other known molecular biology techniques such as the use of radiolabeled probes. Said specific primers of said molecular markers have been generated by standard methods known to those skilled in the art.
Les séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 sont spécifiques du marqueur moléculaire E33M47 et ont pour séquences : The sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 are specific for the molecular marker E33M47 and have the following sequences:
Amorce sens SEQ ID N° 1 : TAA CAA AAT AGA GGG AGA GGA TG Primer meaning SEQ ID NO. 1: TAA CAA AAT AGA GGG AGA GGA TG
Amorce anti-sens SEQ ID N°2 : CAA GAT TAT AGC TAC CTA ACA GG  SEQ ID No. 2 primer: CAA GAT TAT AGC CTA TAC CTA GG
Le marqueur E33M47 lorsqu'il est défini par le couple d'amorces SEQ ID N°1/SEQ ID N°2 ci-dessus permet une amplification par PCR, dans les lignées restauratrices de l'art antérieur, d'un fragment d'environ 135 paires de bases provenant du génome radis mais aucun marquage n'a été détecté dans la lignée Rf de la présente invention. Ceci signifie par conséquent que la lignée Rf selon l'invention ne possède plus la région provenant du radis détectée dans les lignées de l'art antérieur. Cette lignée Rf selon l'invention est donc différente de l'art antérieur. Les séquences SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 sont spécifiques du marqueur moléculaire OPY 17 et ont pour séquences : The marker E33M47 when defined by the pair of primers SEQ ID No. 1 / SEQ ID No. 2 above allows amplification by PCR, in the restorative lines of the prior art, of a fragment of about 135 base pairs from the radish genome but no labeling was detected in the Rf line of the present invention. This therefore means that the Rf line according to the invention no longer has the region from the radish detected in the lines of the prior art. This line Rf according to the invention is therefore different from the prior art. The sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 are specific for the molecular marker OPY 17 and have the following sequences:
Amorce sens SEQ ID N°3 : ACG TGG TGA GGA CAT GCC CTT TCT G  Primer SEQ ID NO: 3: ACG TGG TGA CAT GGA GGA CTT TCT G
Amorce anti-sens SEQ ID N°4 : CTG GTG TAT TCT ACC TCA TCA TTA AA Le marqueur OPY 17 selon la présente invention lorsqu'il est défini par le couple d'amorces SEQ ID N°3/SEQ ID N°4 ci-dessus correspond par exemple à un fragment d'environ 885 paires de bases provenant du génome de Brassica napus (allèle brassica napus). Les mêmes amorces SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4 définissant le marqueur OPY 17 permettent d'amplifier par PCR un fragment d'environ 305 paires de bases provenant du génome de radis et non de Brassica napus. Antisense Primer SEQ ID No. 4: GTG CTG TAT TCT ACC TCA TCA TTA AA The OPY 17 marker according to the present invention when it is defined by the pair of primers SEQ ID No. 3 / SEQ ID No. 4 ci above, for example, corresponds to a fragment of approximately 885 base pairs originating from the genome of Brassica napus (brassica napus allele). The same primers SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 defining the marker OPY 17 allow to amplify by PCR a fragment of about 305 base pairs from the genome of radish and not Brassica napus.
Les différents fragments amplifiés par PCR ont été observé par électrophorèse capillaire. En d'autres termes, le fragment d'ADN de la plante selon l'invention qui comprend ce marqueur OPY 17 est avantageusement issu d'une recombinaison homologue entre le fragment d'ADN issu du radis et le génome Brassica, en particulier pour la région du gène Rf. L'allèle de 885 paires de bases correspond à l'allèle Rf provenant de Brassica et non du radis qui lui correspond à un allèle de 305 paires de bases. Les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 sont spécifiques du marqueur moléculaire OPC2 et ont pour séquences :  The different fragments amplified by PCR were observed by capillary electrophoresis. In other words, the DNA fragment of the plant according to the invention which comprises this marker OPY 17 is advantageously derived from a homologous recombination between the DNA fragment derived from the radish and the Brassica genome, in particular for the Rf gene region. The 885 base pair allele corresponds to the Rf allele from Brassica and not the radish which corresponds to a 305 base pair allele. The sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 are specific for the molecular marker OPC2 and have the following sequences:
Amorce sens SEQ ID N°5 : GGG GAA GGA AGG AAG GAC TC  Primer meaning SEQ ID NO: 5 GGG GAA GGA AGG AAG GAC TC
Amorce anti-sens SEQ ID N°6 : TCA GGT TCA CAC AGC AGC ATA Les séquences SEQ ID N°7 et SEQ ID N°8 sont spécifiques du marqueur moléculaire OPFlO et ont pour séquences : Antisense Primer SEQ ID No. 6: TCA GGT TCA CAC AGC AGC ATA The sequences SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 are specific for the molecular marker OPF10 and have the following sequences:
Amorce sens SEQ ID N°7 : CTG ATG AAT CTC GGT GAG AC  Sequence primer SEQ ID No. 7: CTG ATG AAT CTC GGT GAG AC
Amorce anti-sens SEQ ID N°8 : CCG TAT GCC TTG GTT ATC TC Les séquences SEQ ID N°9 et SEQ ID N0IO sont spécifiques du marqueur moléculaire OPN20 et ont pour séquences : Antisense primer SEQ ID NO: 8: CGC GTT TAT GCC TTG ATC TC sequences SEQ ID NO 9 and SEQ ID N 0 IO are specific for the molecular marker and to OPN20 sequences:
Amorce sens SEQ ID N°9 : ATA GGT TCC TGG CAG AGA TG  Sequential primer SEQ ID No. 9: ATA GGT TCC TGG AGC AG TG TG
Amorce anti-sens SEQ ID N0IO : ATA GCA GTC AGA AAC CGC TC Les séquences SEQ ID N0I l et SEQ ID N°12 sont spécifiques du marqueur moléculaire OPH 15 et ont pour séquences : Antisense primer SEQ ID N 0 IO: ATA GTC GCA AGA AAC CGC TC sequences SEQ ID N 0 I l and SEQ ID NO: 12 are specific to the DPO 15 and molecular marker for sequences:
Amorce sens SEQ ID N° 11 : TCT GTA AAT CCT TTC CAC CC  Primer meaning SEQ ID NO: 11: TCT GTA AAT CCT TTC CAC CC
Amorce anti-sens SEQ ID N°12 : AAA AAA GCA CCC GAG AAT CT Plus de détails concernant les séquences SEQ ID N°l à 12 sus-mentionnées sont donnés ci- dessous dans les exemples. Antisense Primer SEQ ID No. 12: AAA AAA GCA CCC GAG AAT CT More details concerning the above-mentioned SEQ ID No. 1 to 12 sequences are given below in the examples.
De manière préférentielle la plante Brassica telle que définie ci-dessus est choisie parmi les Brassica napus, oleracea et râpa. De manière très préférentielle, on choisit une plante Brassica napus ou Brassica oleracea, et de manière encore plus préférentielle, on choisit une plante Brassica napus. Preferably, the Brassica plant as defined above is chosen from Brassica napus, oleracea and râpa. Very preferably, a Brassica napus or Brassica oleracea plant is chosen, and even more preferably, a Brassica napus plant is chosen.
Par ailleurs, la présente invention concerne également les graines issues de la plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique telle que définie ci-dessus. Ces graines présentent de préférence un taux de glucosinolates inférieur ou égal à 25 μmol par gramme de graines à 9% d'humidité dans les graines, de préférence de préférence situé entre 10 et 16 μmol par grammes de graines, et renferment dans leur génome au moins le gène Rf restaurateur. De plus, ces graines présentent également un taux d'acide érucique inférieur ou égal à 2% des acides gras totaux contenus dans la graine, de préférence inférieur ou égal à 0,5% et plus préférentiellement encore à 0,1%. Ces taux d'acide érucique peuvent être obtenus par des analyses de spectroscopie proche infra-rouge. Furthermore, the present invention also relates to seeds derived from the Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid as defined above. These seeds preferably have a level of glucosinolates less than or equal to 25 μmol per gram of seed at 9% moisture in the seeds, preferably preferably between 10 and 16 μmol per gram of seeds, and contain in their genome at least the Rf restorer gene. In addition, these seeds also have a level of erucic acid less than or equal to 2% of the total fatty acids contained in the seed, preferably less than or equal to 0.5% and more preferably still 0.1%. These levels of erucic acid can be obtained by near infra-red spectroscopy analyzes.
Ces graines ont une forte valeur commerciale. These seeds have a high commercial value.
L'invention porte également sur la descendance de la plante Brassica, de préférence Brassica napus ou oleracea ou râpa, telle que définie ci-dessus. La descendance couvre les graines, les semences, les plantes et toute partie de plantes. The invention also relates to the progeny of the Brassica plant, preferably Brassica napus or oleracea or raspa, as defined above. The offspring covers seeds, seeds, plants and any part of plants.
La présente invention concerne également une plante Brassica napus à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique issue d'une graine déposée sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646 dont le génome comporte un fragment d'ADN issu d'un événement de recombinaison contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que son génome ne présente pas d'allèle radis du marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2. The present invention also relates to a Brassica napus plant with low levels of glucosinolates and erucic acid derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646 whose genome comprises a DNA fragment resulting from a recombination event containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that its genome does not show any radish allele of the E33M47 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
De préférence, la présente plante Brassica napus restauratrice à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique est caractérisée en ce que son génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et, d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2. Preferably, the present Brassica napus restorer plant with low levels of glucosinolates and erucic acid is characterized in that its genome does not exhibit the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, secondly, by the sequence SEQ ID No. 2.
Sa descendance, qui est également un objet de l'invention, présente également les critères de faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique selon l'invention et restaurateur en fonction de la ségrégation génotypique et phénotypique. Its progeny, which is also an object of the invention, also has the criteria of low levels of glucosinolates and erucic acid according to the invention and restorer according to the genotypic and phenotypic segregation.
Dans une variante de réalisation, la présente invention concerne une plante Brassica napus à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique issue d'une graine déposée sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646 dont le génome comporte un fragment d'ADN issu d'un événement de recombinaison contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que : In an alternative embodiment, the present invention relates to a Brassica napus plant with low levels of glucosinolates and erucic acid derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646 whose genome comprises a DNA fragment derived from a recombination event containing the Rf gene for the restoration of male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, characterized in that:
" ledit génome de la plante ne présente pas d'allèle radis du marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2, et said genome of the plant does not have any radish allele of the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2, and
" ledit génome de la plante présente l'allèle Brassica napus du marqueur OPY 17 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°3 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°4 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°4.  said genome of the plant has the Brassica napus allele of the marker OPY 17 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least one sequence comprising at least 12 nucleotides consecutive sequences of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly, by the sequence SEQ ID No. 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 4.
De préférence, la présente plante Brassica napus restauratrice à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique est caractérisée en ce que son génome ne présente pas le marqueur E33M47 (allèle radis non amplifié) défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et, d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et en ce que son génome présente le marqueur OPY 17 (allèle brassica napus amplifié) défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué, d'une part, par SEQ ID N°3 et, d'autre part, par SEQ ID N°4. Sa descendance, qui est également un objet de l'invention, présente également les critères de faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ainsi que le caractère restaurateur en fonction de la ségrégation génotypique et phénotypique. Preferably, the present Brassica napus restorer plant with low levels of glucosinolates and erucic acid is characterized in that its genome does not exhibit the marker E33M47 (non-amplified radish allele) defined by the pair of nucleotide primers consisting of on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 1 and, on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 2 and in that its genome has the marker OPY 17 (amplified brassica napus allele) defined by the pair of primers nucleotides constituted, on the one hand, by SEQ ID No. 3 and, on the other hand, by SEQ ID No. 4. Its offspring, which is also an object of the invention, also has the criteria of low levels of glucosinolates and erucic acid and the restorative nature as a function of genotypic and phenotypic segregation.
Le fait que le colza (Brassica napus) soit une espèce allogame, la production d'hybrides de colza nécessite des systèmes de contrôle tels que les sytèmes Ogura, Kosena...et l'obtention de cette lignée Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique, restauratrice de la fertilité mâle dans le système Ogura est particulièrement intéressante car elle offre la possibilité de développer de façon contrôlée et orientée de nombreux hybrides restaurés à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique. Cette lignée Rf consiste alors en un outil précieux pour la réalisation de nouvelles plantes dont les qualités agronomiques et génétiques sont améliorées (hétérosis, homéostasie, résistances à divers pathogènes). The fact that rapeseed (Brassica napus) is an allogamous species, the production of rapeseed hybrids requires control systems such as Ogura, Kosena ... and obtaining this line Brassica low glucosinolates and Erucic acid, restoring male fertility in the Ogura system is particularly interesting because it offers the possibility of developing in a controlled and oriented way many hybrids restored to low levels of glucosinolates and erucic acid. This line Rf then consists of a valuable tool for the realization of new plants whose agronomic and genetic qualities are improved (heterosis, homeostasis, resistance to various pathogens).
Les plantes selon la présente invention peuvent également être caractérisées avec des marqueurs moléculaires autres que E33M47. Ces marqueurs sont par exemple, OPC2, OPFlO, OPN20, OPY17 et OPH15 et sont définis par les amorces données ci-dessus ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs des séquences respectivement données ci-dessus (SEQ ID N°3 à 12). Les plantes selon l'invention, d'une part, ne présentent systématiquement pas de marquage avec E33M47 (pas d'allèle radis ou brassica amplifié, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea) et d'autre part, ont par exemple un marquage avec au moins un des marqueurs suivants : The plants according to the present invention can also be characterized with molecular markers other than E33M47. These markers are, for example, OPC2, OPF10, OPN20, OPY17 and OPH15 and are defined by the primers given above or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequences respectively given above (SEQ ID NO: 3 to 12). The plants according to the invention, on the one hand, do not systematically show any labeling with E33M47 (no radish allele or amplified brassica, preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea) and secondly, have for example a labeling with at least one of the following markers:
OPY 17 (un allèle Brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea) ,  OPY 17 (a Brassica allele, preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea),
- 0PC2 (un allèle radis),  - 0PC2 (a radish allele),
- OPFlO (un allèle radis),  OPF10 (a radish allele),
OPN20 (un allèle Brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea),  OPN20 (a Brassica allele, preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea),
- OPH 15 (un allèle radis)  - OPH 15 (a radish allele)
Les résultats de ces marquages sont donnés dans les exemples, en particulier dans l'exemple 4 ci-dessous.  The results of these markings are given in the examples, in particular in Example 4 below.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'obtention d'une plante Brassica telle que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Mettre en œuvre une plante mâle Brassica napus issue d'une graine déposée sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646, et comportant un fragment de génome de radis comportant le gène de fertilité Rf, et de préférence comportant un cytoplasme CMS Ogura, Another subject of the present invention relates to a process for obtaining a Brassica plant as defined above, characterized in that it comprises the following stages: a) Implementing a Brassica napus male plant resulting from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, and comprising a fragment of radish genome comprising the fertility gene Rf, and preferably comprising an Ogura CMS cytoplasm,
b) Mettre en œuvre une plante femelle récurrente Brassica CMS Ogura ne présentant pas ledit fragment de génome de radis,  b) implement a Brassica CMS Ogura recurrent female plant not exhibiting said fragment of radish genome,
c) Croiser les plantes de l'étape a) avec les plantes de l'étape b),  c) Cross the plants of step a) with the plants of step b),
d) Obtenir des plantes hybrides,  d) To obtain hybrid plants,
e) Réaliser des rétrocroisements avec la plante de l'étape b) pour obtenir l'introgression du fragment d'ADN de radis comportant le gène Rf présent dans le génome des graines de plante Brassica napus déposées sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646, dans le génome de ladite plante récurrente. f) Sélectionner les plantes fertiles.  e) Backcrossing with the plant of step b) to obtain the introgression of the radish DNA fragment containing the Rf gene present in the genome of Brassica napus plant seeds deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, in the genome of said recurrent plant. f) Select fertile plants.
g) Croiser entre elles les plantes de l'étape f) pour obtenir des plantes homozygotes.  g) Cross the plants of step f) together to obtain homozygous plants.
La femelle de l'étape b) peut être une femelle Brassica napus. De préférence il s'agit d'une femelle d'une plante d'une autre variété que la plante issue de la graine déposée dans la collection sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646 ou d'une Brassica d'une autre espèce que Brassica napus, telle que Brassica oleracea. The female of step b) can be a Brassica napus female. Preferably it is a female of a plant of another variety than the plant derived from the seed deposited in the collection under the name Brassica napus NCIMB 41646 or a Brassica of a species other than Brassica napus , such as Brassica oleracea.
Une sélection des plantes fertiles peut être faite à l'issue de l'étape d) et l'étape f). Elle se fait grâce à des critères morphologiques, comme la présence de fleurs. Une telle sélection est bien connue de l'homme du métier. Les rétrocroisements effectués visent à accroître le pourcentage de génome de la plante récurrente femelle et ainsi diminuer la quantité du génome de Brassica napus dans la plante obtenue à l'issue des croisements. A selection of fertile plants can be made at the end of step d) and step f). It is done through morphological criteria, such as the presence of flowers. Such a selection is well known to those skilled in the art. Backcrossing is done to increase the percentage of the genome of the female recurrent plant and thus reduce the amount of Brassica napus genome in the plant obtained after crossing.
Le nombre de rétrocroisements effectués est répété autant de fois pour obtenir un pourcentage d'au moins 80% du génome de la plante femelle utilisée dans le croisement, de préférence au moins 98%. Ces pratiques sont largement connues de l'homme du métier. The number of backcrosses performed is repeated as many times to obtain a percentage of at least 80% of the genome of the female plant used in the cross, preferably at least 98%. These practices are widely known to those skilled in the art.
En l'occurrence, de préférence la plante femelle récurrente est une plante Brassica oleracea. A chaque génération lors des rétrocroisements, il convient de vérifier la présence ou l'absence du gène de fertilité Rf. Ceci se fait grâce à des marqueurs visuels, morphologiques comme la présence de fleurs fertiles ou à l'aide des marqueurs moléculaires tels que définis dans la présente demande. In this case, preferably the recurrent female plant is a Brassica oleracea plant. At each generation during backcrossing, the presence or absence of the fertility gene Rf should be verified. This is done through visual markers, morphological such as the presence of fertile flowers or using molecular markers as defined in the present application.
Le procédé décrit ci-dessus peut comprendre une étape supplémentaire dans l'étape e). Il est caractérisé en ce que l'étape e) comprend une étape supplémentaire e') de mise en œuvre du marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 et de sélection des plantes ne comprenant pas ce marqueur E33M47. The method described above may comprise an additional step in step e). It is characterized in that step e) comprises an additional step e ') of implementing the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2 and plant selection not including this marker E33M47.
La présente invention couvre les plantes Brassica obtenues à l'issue de l'un ou l'autre des procédés décrits ci-dessus. The present invention covers Brassica plants obtained at the end of one or the other of the processes described above.
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne une plante hybride à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique comprenant un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par croisement entre une plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique, de préférence Brassica napus, oleracea et râpa, de préférence Brassica napus, ou une plante Brassica issue de la graine déposée NCIMB 41646 telles que définies précédemment en tant que parent mâle et une autre planteThus, another subject of the invention relates to a hybrid plant with low levels of glucosinolates and erucic acid comprising a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that It is obtained by crossing a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid, preferably Brassica napus, oleracea and râpa, preferably Brassica napus, or a Brassica plant derived from the seed deposited NCIMB 41646 as defined above. as a male parent and another plant
Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ayant une stérilité mâle cytoplasmique (CMS Ogura) en tant que parent femelle. Brassica with low levels of glucosinolates and erucic acid having cytoplasmic male sterility (CMS Ogura) as a female parent.
Un autre objet de l'invention porte sur les graines hybrides issues de la plante hybride telle que définie ci-dessus ainsi que la descendance de ladite plante hybride. Another subject of the invention relates to the hybrid seeds derived from the hybrid plant as defined above as well as the progeny of said hybrid plant.
Dans les plantes selon l'invention, outre les taux améliorés d'acide érucique et de glucosinolate, d'autres caractères agronomiques très intéressants ont pu être décelés. En effet, différents caractères agronomiques, tels que la longueur des siliques, le nombre de siliques par ampe ou par plantes, le nombre de graines par siliques ont été mesurés et il s'avère que ces plantes selon l'invention donnent des résultats agronomiques nettement accrus par rapport aux données sur les plantes de l'art antérieur. Ainsi, le fragment d'introgression présent dans les plantes selon l'invention aurait un effet sur le comportement agronomique desdites plantes. Cet effet a pu être observé par comparaison de la lignée Rf selon l'invention avec d'autres lignées de référence connues telles que Billy (variété conventionnelle non restauratrice du système CMS Ogura, commercialisée et inscrite par la société DSV) ou la lignée R2864-BSD (variété restauratrice du système CMS Ogura, commercialisée et inscrite par Limagrain). In the plants according to the invention, in addition to the improved levels of erucic acid and glucosinolate, other very interesting agronomic characters have been detected. In Indeed, different agronomic traits, such as the length of the siliques, the number of siliques per ampe or plants, the number of seeds per silique were measured and it turns out that these plants according to the invention give significantly increased agronomic results. compared to the plant data of the prior art. Thus, the introgression fragment present in the plants according to the invention would have an effect on the agronomic behavior of said plants. This effect could be observed by comparison of the Rf line according to the invention with other known reference lines such as Billy (conventional non-restorative variety of the Ogura CMS system, marketed and registered by the company DSV) or the R2864-line. BSD (restorative variety of the CMS Ogura system, marketed and registered by Limagrain).
Différents tests statistiques (Anova) ont été mis en œuvre suivant les critères testés (nombre de siliques par ampe, nombre de graines...) et ont permis de quantifier les différences phénotypiques des plantes de la lignée Rf et de déterminer l'origine de ces qualités.  Various statistical tests (Anova) were implemented according to the tested criteria (number of siliques per ampe, number of seeds ...) and made it possible to quantify the phenotypic differences of the plants of the line Rf and to determine the origin of these qualities.
Ainsi, un nouvel objet de la présente demande concerne une plante Brassica, de préférence Brassica napus, oleracea et râpa, éventuellement obtenue à partir de la graine déposée NCIMB 41646, dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, présentant des qualités agronomiques accrues, caractérisée en ce qu'elle répond à au moins l'un des critères agronomiques suivants : Thus, a new subject of the present application relates to a Brassica plant, preferably Brassica napus, oleracea and râpa, optionally obtained from NCIMB filed seed 41646, whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for the restoration of male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, showing increased agronomic qualities, characterized in that it meets at least one of the following agronomic criteria:
" le nombre de graines produites par plante est augmenté d'au moins 25%, de préférence 30% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données,  the number of seeds produced per plant is increased by at least 25%, preferably 30%, relative to the reference plant Billy produced under given conditions,
" le nombre de siliques par ampe est augmenté d'au moins 8%, de préférence "the number of siliques per ampe is increased by at least 8%, preferably
10% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données, 10% compared to the reference plant Billy produced under given conditions,
" la longueur des siliques est augmentée d'au moins 10%, de préférence 12% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données.  the length of the siliques is increased by at least 10%, preferably 12%, relative to the Billy reference plant produced under given conditions.
Par comparaison avec d'autres lignées restauratrices, il a été observé en outre que le taux de glucosinolates contenu dans les graines desdites plantes Brassica selon l'invention telles que définies ci-dessus et dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour le système CMS Ogura, est de préférence diminué d'au moins 20%, de préférence 30% par rapport aux graines des plantes Brassica issues d'une autre lignée restauratrice telle que la lignée restauratrice R2864-BSD. Ceci est également le cas dans les graines des plantes Brassica napus selon l'invention et les graines éventuellement obtenue à partir de la graine déposée NCIMB 41646, et dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour le système CMS Ogura. In comparison with other restorative lines, it has been further observed that the level of glucosinolates contained in the seeds of said Brassica plants according to the invention as defined above and whose genome comprises a DNA fragment containing the gene Restoration Rf of the male fertility for the CMS Ogura system, is preferably decreased by at least 20%, preferably 30% relative to the seeds of Brassica plants from another restorative line such as the restorative line R2864-BSD . This is also the case in the seeds of the Brassica napus plants according to the invention and the seeds optionally obtained from NCIMB filed seed 41646, and whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for the Ogura CMS system.
Les tests Anova d'analyse de variance comparant les lignées R7631 et R2864-BSD en autopollinisation ont montré que la production de siliques par ampe, la longueur de siliques (avec ou sans leur extrémité) et le nombre de graines produites par silique est lié au nouveau fragment d'ADN, issu d'événement de recombinaison original, présent dans la lignée Rf ou R7631 selon l'invention. Selon un autre mode de réalisation, l'invention porte sur une plante Brassica hybride telle que définie ci-dessus, dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, présentant des qualités agronomiques accrues, caractérisée en ce qu'elle répond à au moins l'un des critères agronomiques suivants : Anova analysis of variance tests comparing the self-pollinated R7631 and R2864-BSD lines showed that siline production per ampe, length of siliques (with or without their end) and number of seeds produced per silique are related to new DNA fragment, derived from an original recombination event, present in the line Rf or R7631 according to the invention. According to another embodiment, the invention relates to a hybrid Brassica plant as defined above, the genome of which comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, presenting increased agronomic qualities, characterized in that it meets at least one of the following agronomic criteria:
" le nombre de graines produites par silique est augmenté d'au moins 7%, de préférence au moins 8%, plus préférentiellement entre 8% et 15% par rapport à la plante de référence hybride R2864-BSD produite dans des conditions données,  the number of seeds produced per silique is increased by at least 7%, preferably at least 8%, more preferably between 8% and 15% relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions,
" le nombre de siliques par ampe est augmenté d'au moins 10% de préférence 20% par rapport à la plante de référence hybride R2864-BSD produite dans des conditions données,  "the number of siliques per ampe is increased by at least 10%, preferably 20%, relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions,
" la longueur des siliques est augmentée d'au moins 2%, de préférence 10% par rapport à la plante de référence hybride R2864-BSD produite dans des conditions données.  the length of the siliques is increased by at least 2%, preferably 10% relative to the hybrid reference plant R2864-BSD produced under given conditions.
L'hybride de référence utilisé est un hybride restaurateur qui est soit un hybride entre R2864-BSD en tant que parent mâle et FBHC215 en tant que parent femelle, soit un hybride entre R2864-BSD (mâle) et F02228 (femelle). Les données agronomiques obtenues avec les hybrides selon l'invention montrent que les valeurs concernant le nombre de graines produites par siliques, le nombre de siliques par ampe et la longueur des siliques sont toujours supérieures à celles de l'hybride de référence, démontrant les bonnes qualités agronomiques d'une plante hybride selon l'invention. The reference hybrid used is a restorative hybrid that is either a hybrid between R2864-BSD as the male parent and FBHC215 as the female parent, a hybrid between R2864-BSD (male) and F02228 (female). The agronomic data obtained with the hybrids according to the invention show that the values concerning the number of seeds produced by siliques, the number of siliques per ampe and the length of the siliques are always greater than those of the reference hybrid, demonstrating the good agronomic qualities of a hybrid plant according to the invention.
De même, des tests Anova d'analyse de variance ont montré que les qualités agronomiques des plantes hybrides étaient largement accrues lorsque le parent mâle de l'hybride est une plante restauratrice Rf selon l'invention. Ceci corrobore la thèse selon laquelle le fragment d'introgression de la lignée Rf selon l'invention est responsable directement de l'amélioration des qualités agronomiques desdites plantes. Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de production de plantes hybrides telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : Similarly, Anova analysis of variance tests have shown that the agronomic qualities of the hybrid plants were greatly increased when the male parent of the hybrid is a Rf restorer plant according to the invention. This corroborates the thesis according to which the introgression fragment of the Rf line according to the invention is directly responsible for improving the agronomic qualities of said plants. Another subject of the present invention relates to a method for producing hybrid plants as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
a) mettre en œuvre une plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique, de préférence Brassica napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement Brassica napus, éventuellement obtenue à partir de la graine déposée NCIMB 41646, dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura telle que définie ci-dessus, et reproduite pour être homozygote, ladite plante étant utilisée en tant que pollinisatrice, b) mettre en œuvre une plante Brassica CMS du système Ogura à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique issue d'une lignée ou variété donnée, en tant que plante femelle,  a) implement a Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid, preferably Brassica napus, oleracea or râpa, more preferably Brassica napus, optionally obtained from the deposited seed NCIMB 41646, the genome of which comprises a fragment of DNA containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility as defined above, and reproduced to be homozygous, said plant being used as a pollinator, b) implementing a Brassica CMS plant Ogura system with low levels of glucosinolates and erucic acid from a given line or variety, as a female plant,
c) effectuer un croisement entre la plante de l'étape a) et la plante de l'étape b), pour obtenir une plante hybride,  c) cross between the plant of step a) and the plant of step b) to obtain a hybrid plant,
d) récolter les graines hybrides à partir de la plante obtenue à l'issue de l'étape c). Pour obtenir une plante homozygote selon l'étape a), l'auto fécondation est répétée entre 6 et 10 générations.  d) harvesting the hybrid seeds from the plant obtained at the end of step c). To obtain a homozygous plant according to step a), self-fertilization is repeated between 6 and 10 generations.
Le croisement de la plante issue de l'étape a) et la plante de l'étape b) est réalisé de façon classique. Enfin, un dernier objet de l'invention couvre l'utilisation des plantes telles que définies ci- dessus, qu'il s'agisse des plantes Brassica Rf à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ou des hybrides Rf à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ou des plantes produites selon le procédé tel que défini ci-dessus pour des applications alimentaires. En effet, comme mentionné ci-dessus, les plantes de colza Brassica ont un intérêt dans la production d'huile qui est recherchée pour ses applications alimentaires mais également industrielles, notamment dans l'automobile. Les plantes selon la présente invention permettent aussi la production de tourteaux qui est une source de protéines intéressante en alimentation animale (gros bétail, porcins et volaille). Les taux d'acide érucique et de glucosinolates sont particulièrement importants et réglementés dans la commercialisation des produits issus de ces plantes car ils peuvent avoir des conséquences sanitaires et médicales importantes. Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre la présente invention et d'appréhender tous ses avantages. The crossing of the plant resulting from step a) and the plant of step b) is carried out in a conventional manner. Finally, a last subject of the invention covers the use of the plants as defined above, whether they are Brassica Rf plants with low levels of glucosinolates and erucic acid or Rf hybrids with low levels of glucosinolates and erucic acid or plants produced according to the method as defined above for food applications. Indeed, as mentioned above, the Brassica rapeseed plants have an interest in the production of oil which is sought for its food but also industrial applications, especially in the automobile. The plants according to the present invention also allow the production of cakes which is a source of protein of interest in animal feed (livestock, pigs and poultry). Levels of erucic acid and glucosinolates are particularly important and regulated in the marketing of products derived from these plants because they can have important health and medical consequences. The examples which follow will make it possible to better understand the present invention and to apprehend all its advantages.
EXEMPLES : EXAMPLES
Les plantes restauratrices selon l'invention désignée par R7631 sont issues d'un croisement entre F50731 et Zénith. Il a été possible d'établir une lignée de plantes restauratrices selon l'invention grâce à la mise en œuvre d'un programme ambitieux de sélection de mâles restaurateurs avec plus de 200 croisements par an avec 50 lignées par croisement. La lignée de plantes restauratrices selon l'invention a été obtenue après 7 ans de sélection essentiellement centrée sur l'obtention d'une introgression radis plus courte et le maintien d'un haut niveau de qualité agronomique (faible taux de glucosinolates et d'acide érucique, bonne composante de rendement, haute teneur en huile et bon niveau de résistance aux maladies). The restorative plants according to the invention designated R7631 are derived from a cross between F50731 and Zenith. It has been possible to establish a line of restorative plants according to the invention through the implementation of an ambitious breeding program of male restorers with more than 200 crossings per year with 50 lines per crossing. The line of restorative plants according to the invention was obtained after 7 years of selection essentially focused on obtaining a shorter radish introgression and maintaining a high level of agronomic quality (low levels of glucosinolates and of acid erucic, good yield component, high oil content and good level of disease resistance).
Exemple 1 : Culture des plantes selon l'invention Example 1: Cultivation of plants according to the invention
Les plantes selon la présente invention ainsi que toutes plantes utilisées comme comparatifs (R2864-BSD, Billy, Ladoga ou toute autre plante) ayant été étudiées quant à leurs données agronomiques ont été cultivées dans les conditions expérimentales suivantes : The plants according to the present invention as well as any plants used as comparatives (R2864-BSD, Billy, Ladoga or any other plant) having been studied for their agronomic data were cultured under the following experimental conditions:
-La parcelle sur laquelle ont été semées les lignées de colza a un précédent blé.  -The plot on which the rapeseed lines were sown has a previous wheat.
-La parcelle a été labourée et hersée avec une herse rotative.  -The plot was plowed and harrowed with a rotary harrow.
-Les lignées exemplifïées ont été semées au semoir classique avec une densité de 55 grains au m2. The exemplified lines were sown at the conventional seeder with a density of 55 grains per m 2 .
-Un désherbage a été effectué au NOVALL®  -A weeding was done at NOVALL®
-Au printemps, un apport azoté sous forme d'engrais chimique a été effectué en 2 fois pour un total de 160 unités à l'hectare.  -In the spring, a nitrogen fertilizer in the form of chemical fertilizer was carried out twice for a total of 160 units per hectare.
-Un insecticide contre les Meligethes a été appliqué avant floraison (MAVRIK FLO®) puis un fongicide contre le sclerotinia. - An insecticide against Meligethes was applied before flowering (MAVRIK FLO®) then a fungicide against sclerotinia.
Exemple 2 : Qualités agronomiques de la lignée Rf selon l'invention (R7631) Example 2: Agronomic Qualities of the Rf Line According to the Invention (R7631)
Afin de déterminer les différentes qualités agronomiques de la lignée Rf (R7631) selon l'invention, différentes mesures ont été pratiquées. La mesure de la teneur en huile et en glucosinolates a été réalisée par spectrométrie dans le proche infra-rouge avec les matériels et conditions suivants: In order to determine the different agronomic qualities of the line Rf (R7631) according to the invention, various measurements have been made. The measurement of the oil and glucosinolate content was carried out by near infra-red spectrometry with the following materials and conditions:
.appareil NIR Marque FOSS 5000  NIR device Brand FOSS 5000
.Logiciel WinISI II ®  .WinISI II ® software
.Température de mesure : 22°C  Measurement temperature: 22 ° C
Le tableau 1 ci-dessous recense, en fonction des génotypes des plantes testées ; les données mesurées concernant le taux de glucosinolates dans les graines, le taux d'huile dans la plante, selon l'invention ou dans une autre lignée restauratrice (R2864-BSD) ou une lignée non restauratrice de référence (Billy). Table 1 below lists, according to the genotypes of the plants tested; the measured data concerning the level of glucosinolates in the seeds, the level of oil in the plant according to the invention or in another restorative line (R2864-BSD) or a non-restorative reference line (Billy).
Tableau 1  Table 1
Ces données montrent que les plantes selon l'invention ont une bonne production oléagineuse et que le taux de glucosinolates contenu dans les graines des plantes selon l'invention est non seulement en conformité avec les taux fixés par le décret 2294/92 mais également nettement inférieur (au moins de 20%) au taux contenu dans la lignée R2864- BSD. Ces données illustrent les qualités agronomiques accrues de la lignée Rf selon l'invention qui s'approchent de celles obtenues avec une lignée non affectée par une introgression, telle que Billy. These data show that the plants according to the invention have a good oleaginous production and that the level of glucosinolates contained in the seeds of the plants according to the invention is not only in conformity with the rates fixed by Decree 2294/92 but also significantly lower. (at least 20%) at the level contained in the R2864-BSD line. These data illustrate the increased agronomic qualities of the Rf line according to the invention which approaches those obtained with a line not affected by introgression, such as Billy.
Exemple 3 : Données agronomiques et tests statistiques Anova Example 3: Agronomic data and Anova statistical tests
1) Données agronomiques et tests statistiques Anova entre R7631 (invention) et R2864-BSD 1) Agronomic data and Anova statistical tests between R7631 (invention) and R2864-BSD
Nombre de siliques par ampe Number of siliques per ampe
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
lignée 1 845.00 845.00 13.705 0.001631  line 1 845.00 845.00 13.705 0.001631
Résidus 18 1109.80 61.66 Où Df=nbre de degré de liberté  Residuals 18 1109.80 61.66 Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les 2 lignées pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. II existe donc bien une différence significative entre le nombre de silique par ampe de R7631 et celui de R2864-BSD : R7631 produit plus de siliques par ampe. Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model Mean Sq = Mean squares of the deviations from the value predicted by the linear model F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained in the 2 lines for the calculated variable are not different at the alpha risk of 5%. There is therefore a significant difference between the number of siliques per ampe of R7631 and that of R2864-BSD: R7631 produces more siliques per ampe.
Nombre d'avortement Number of abortions
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
lignée 1 11.25 11.25 0.2831 0.6012  line 1 11.25 11.25 0.2831 0.6012
Résidus 18 715.30 39.74  Residuals 18 715.30 39.74
Où Df=nbre de degré de liberté Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les 2 lignées pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained in the 2 lines for the calculated variable are not different at the 5% alpha risk.
Au-delà du risque de 5%, on estime qu'il n'y a pas de différences significatives entre R7631 et R2864-BSD quant au nombre d'avortement.  Beyond the 5% risk, it is estimated that there are no significant differences between R7631 and R2864-BSD in the number of abortions.
Longueur des siliques sans l'extrémité Length of the siliques without the end
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
lignée 1 18.8471 18.8471 179.19 8.52e-ll  line 1 18.8471 18.8471 179.19 8.52e-ll
Résidus 18 1.8933 0.1052  Residues 18 1.8933 0.1052
Où Df=nbre de degré de liberté  Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les 2 lignées pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. Mean Sq = Mean squares of the deviations from the value predicted by the linear model F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained in the 2 lines for the calculated variable are not different at the alpha risk of 5%.
Il existe donc bien une différence significative entre la longueur des siliques sans l'extrémité de R7631 et celles de R2864-BSD : R7631 produit des siliques dont la longueur sans l'extrémité est plus importante. Longueur des siliques avec leur extrémité There is therefore a significant difference between the length of the siliques without the end of R7631 and those of R2864-BSD: R7631 produces siliques whose length without the end is larger. Length of the siliques with their end
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
lignée 1 22.7058 22.7058 192.32 4.756e-ll  line 1 22.7058 22.7058 192.32 4.756e-ll
Résidus 18 2.1251 0.1181  Residue 18 2.1251 0.1181
Où Df=nbre de degré de liberté  Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les 2 lignées pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%.  F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained in the 2 lines for the calculated variable are not different at the 5% alpha risk.
Il existe donc bien une différence significative entre la longueur des siliques avec leur extrémité de R7631 et celles de R2864-BSD : R7631 produit des siliques dont la longueur avec leur extrémité est plus importante. Nombre de graines There is therefore a significant difference between the length of the siliques with their end of R7631 and those of R2864-BSD: R7631 produces siliques whose length with their end is greater. Number of seeds
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
lignée 1 273.430 273.430 51.048 1.179e-06  line 1 273.430 273.430 51.048 1.179e-06
Résidus 18 96.414 5.356  Residuals 18 96,414 5,356
Où Df=nbre de degré de liberté  Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les 2 lignées pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%.  F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained in the 2 lines for the calculated variable are not different at the 5% alpha risk.
Il existe donc bien une différence significative entre le nombre de graines produites par plante R7631 et celui de R2864-BSD : R7631 produit un nombre plus important de graines.  There is therefore a significant difference between the number of seeds produced per plant R7631 and that of R2864-BSD: R7631 produces a larger number of seeds.
L'ensemble de ces données illustrent les qualités agronomiques accrues des plantes de la lignée R76031 par rapport aux plantes de la lignée R2864-BSD. 2) Données agronomiques comparatives entre R7631 (invention) et Billy (plante de référence) All of these data illustrate the increased agronomic qualities of the plants of the R76031 line compared to plants of the R2864-BSD line. 2) Comparative agronomic data between R7631 (invention) and Billy (reference plant)
Le tableau 2 recense les résultats des données agronomiques testées sur les plantes R7631 selon l'invention et sur les plantes de référence Billy. Table 2 lists the results of the agronomic data tested on the R7631 plants according to the invention and on the Billy reference plants.
Tableau 2 Les résultats illustrent le fait que R7631 possèdent des qualités agronomiques accrues par rapport à Billy. En effet, le nombre de siliques moyen par ampe est augmenté d'environ 22% chez R7631, la longueur des siliques sans leur extrémité est augmentée d'environ 16% chez R7631, la longueur des siliques avec leur extrémité est augmentée d'environ 12% et le nombre de graines produites par plantes est augmenté d'environ 31%. Table 2 The results illustrate that R7631 has increased agronomic qualities compared to Billy. In fact, the average number of siliques per ampe is increased by about 22% in R7631, the length of the siliques without their end is increased by about 16% in R7631, the length of the siliques with their end is increased by about 12%. % and the number of seeds produced by plants is increased by about 31%.
Toutes ces données témoignent d'une amélioration des qualités agronomiques de R7631 selon l'invention par rapport à une lignée de référence qu'est Billy.  All these data show an improvement of the agronomic qualities of R7631 according to the invention compared to a reference line that is Billy.
3) Données agronomiques et tests statistiques Anova sur les hybrides 3) Agronomic data and Anova statistical tests on hybrids
Le tableau 3 ci-dessous recense les résultats des données agronomiques testées sur les hybrides selon l'invention. Ceci permet également de voir l'impact du mâle et/ou de la femelle sur les qualités agronomiques. Table 3 below lists the results of the agronomic data tested on the hybrids according to the invention. This also allows to see the impact of the male and / or the female on the agronomic qualities.
Tableau 3  Table 3
Ces résultats illustrent que lorsque le pollinisateur est une plante selon l'invention (R7631) et que la plante femelle est de type X ou Y, les données agronomiques des hybrides (2 et 4) sont meilleures que lorsque le pollinisateur est R2864-BSD sur les même femelles. L'effet agronomique est manifestement du au mâle parent de l'hybride. These results illustrate that when the pollinator is a plant according to the invention (R7631) and that the female plant is of type X or Y, the agronomic data of the hybrids (2 and 4) are better than when the pollinator is R2864-BSD on the same females. The agronomic effect is clearly due to the parent male of the hybrid.
Ces résultats sont renforcés par les analyses des tests statistiques ci-après : Nombre de siliques par ampe These results are reinforced by the analyzes of the statistical tests below: Number of siliques per ampe
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
femelle 1 444.1 444.1 2.4783 0.12213  female 1 444.1 444.1 2.4783 0.12213
maie 1 1150.1 1150.1 6.4182 0.01469 *  maie 1 1150.1 1150.1 6.4182 0.01469 *
Résidus 47 8421.9 179.2 Où Df=nbre de degré de liberté Residuals 47 8421.9 179.2 Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les maies et les femelles pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained for maize and females for the calculated variable are not different from the alpha risk of 5%.
Il existe donc bien une différence significative sur le nombre de silique par ampe et ceci est lié au mâle restaurateur testé selon l'invention (résultats agronomiques meilleurs) et non à la femelle. There is therefore a significant difference in the number of siliques per ampe and this is related to the restorative male tested according to the invention (better agronomic results) and not to the female.
Longueur des siliques Length of the siliques
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
femelle 1 71.25 71.25 2.7171 0.10595 female 1 71.25 71.25 2.7171 0.10595
maie 1 119.68 119.68 4.5640 0.03789 * maie 1 119.68 119.68 4.5640 0.03789 *
Résidus 47 1232.45 26.22  Residuals 47 1232.45 26.22
Où Df=nbre de degré de liberté  Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les maies et les femelles pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained for maize and females for the calculated variable are not different from the alpha risk of 5%.
Il existe donc bien une différence significative sur la longueur des siliques et ceci est lié au mâle restaurateur testé. There is therefore a significant difference in the length of the siliques and this is related to the restorative male tested.
Nombre de graines Number of seeds
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (> F)
femelle 1 6.25 6.25 0.6834 0.41261 female 1 6.25 6.25 0.6834 0.41261
maie 1 54.50 54.50 5.9597 0.01846 * maie 1 54.50 54.50 5.9597 0.01846 *
Résidus 47 429.84 9.15  Residuals 47 429.84 9.15
Où Df=nbre de degré de liberté  Where Df = number of degrees of freedom
Sum Sq=Somme des carré des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Sum Sq = Sum of the squared deviations to the value predicted by the linear model
Mean Sq=Moyenne des carrés des écarts à la valeur prédite par le modèle linéaire  Mean Sq = Average of the squares of the deviations to the value predicted by the linear model
F value et Pr(>F)= probabilité que les moyennes obtenues chez les maies et les femelles pour la variable calculée ne soient pas différentes au risque alpha de 5%. II existe donc bien une différence significative sur le nombre de graines produites par siliques et ceci est lié au mâle restaurateur testé. F value and Pr (> F) = probability that the averages obtained for maize and females for the calculated variable are not different from the alpha risk of 5%. There is therefore a significant difference in the number of seeds produced by siliques and this is related to the restorative male tested.
Exemple 4 : Marquages moléculaires sur la lignée Rf selon l'invention (R7631) Example 4 Molecular Markings on the Rf Line According to the Invention (R7631)
Afin de caractériser au mieux le fragment d'introgression selon l'invention et la lignée restauratrice Rf portant ce fragment d'introgression, des analyses de marqueurs moléculaires connus ont été effectuées. Ces marquages ont été comparés aux marquages obtenus sur les lignées restauratrices connues de l'art antérieur. In order to best characterize the introgression fragment according to the invention and the Rf-restoring line carrying this introgression fragment, analyzes of known molecular markers were carried out. These markings were compared with the markings obtained on restoring lines known from the prior art.
Ces marquages ont été réalisé à l'aide d'amorces spécifiques telles que SEQ ID N°l, 2, 3, These markings were carried out using specific primers such as SEQ ID No. 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et/ou 12. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and / or 12.
Pour tester la présence ou non des marqueurs spécifiques, une extraction de l'ADN est nécessaire et se déroule comme suit :  To test for the presence or absence of specific markers, a DNA extraction is necessary and proceeds as follows:
Pour chaque échantillon de plantes testé, l'ADN a été extrait à partir de tissu broyés à l'azote liquide en utilisant un protocole d'extraction au CTAB suivant le protocole donné dans Doyle and Doyle, 1990 (Doyle and Doyle, 1990, Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, vol 12 ppl3-15). For each sample of plants tested, the DNA was extracted from tissue crushed with liquid nitrogen using a CTAB extraction protocol following the protocol given in Doyle and Doyle, 1990 (Doyle and Doyle, 1990, Isolation Focus, vol 12 ppl3-15).
Les amorces ou primers des marqueurs SCAR corespondants au SEQ ID N°l + SEQ ID N°2, SEQ ID N°3+ SEQ ID N°4, SEQ ID N°5+ SEQ ID N°6, SEQ ID N°7+ SEQ ID N°8, The primers or primers of the SCAR markers corresponding to SEQ ID No. 1 + SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 + SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 + SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 + SEQ ID No. 8,
SEQ ID N°9+ SEQ ID N°10 et/ou SEQ ID N°l 1+ SEQ ID N°12 ont été ajoutées au mix d'amplification à la concentration de 5pmol chacun. La composition du mix de réactionSEQ ID NO: 9 + SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 12 were added to the amplification mix at the concentration of 5pmol each. The composition of the reaction mix
PCR est standard en utilisant la Taq Platinum d'INVITROGEN®. PCR is standard using the INVITROGEN® Taq Platinum.
Les conditions d'amplification sont les suivantes :  The amplification conditions are as follows:
5 minutes de dénaturation à 94°C, 5 minutes of denaturation at 94 ° C,
suivi de 35 cycles de 30 secondes à 94°C, followed by 35 cycles of 30 seconds at 94 ° C,
30 secondes à 57°C,  30 seconds at 57 ° C,
30 secondes à 72°C.  30 seconds at 72 ° C.
Les produits d'amplification ont été séparés sur un gel d'agarose à 2%.  The amplification products were separated on a 2% agarose gel.
Le tableau 4 ci-dessous récapitule les résultats obtenus sur les lignées selon l'invention et sur d'autres lignées restauratrices (R2864-BSD, GAMIN, NK KARIBI, R2000) ou sur des lignées non restauratrices de référence (Billy ou Ladoga). Table 4 below summarizes the results obtained on the lines according to the invention and on other restorative lines (R2864-BSD, GAMIN, NK KARIBI, R2000) or non-restorative lines of reference (Billy or Ladoga).
Tableau 4 II apparait nettement que les lignées restauratrices selon l'invention ne présentent pas de marquage avec E33M47. En effet, aucune amplification avec les amorces SEQ ID N°l et SEQ ID N°2 n'a été obtenu en PCR, ceci signifie que la lignée selon l'invention a une région de radis délétée par rapport aux autres lignées restauratrices testées. La lignée selon l'invention présente un marquage avec OPY17 (885 paires de base) correspondant à une bande amplifiée de l'allèle Brassica napus du gène Rf et une amplification uniquement de l'allèle Brassica napus avec le marqueur OPN 20 défini par les amorces SEQ ID N°9 et SEQID N0IO, l'allèle radis avec ce marqueur n'étant pas amplifié dans la lignée selon l'invention alors qu'il l'est dans les lignées restauratrices testées de l'art antérieur. Les lignées restauratrices de l'invention présentent les marqueurs OPC2 et OPFlO correspondant à un fragment amplifié de l'allèle radis associé à la fertilité. Ces caractéristiques illustrent bien le fait que la lignée selon l'invention a un profil génétique original et différent des autres lignées testées. Aucunes des plantes testées ne présente un marquage similaire à celui des plantes selon l'invention. Ceci prouve que les plantes selon l'invention contiennent un événement de recombinaison différent et nouveau. Table 4 It is clear that the restorative lines according to the invention do not show any labeling with E33M47. Indeed, no amplification with the primers SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 was obtained in PCR, this means that the line according to the invention has a deleted radish region compared to the other restorative lines tested. The line according to the invention has a labeling with OPY17 (885 base pairs) corresponding to an amplified band of the Brassica napus allele of the Rf gene and an amplification only of the Brassica napus allele with the OPN 20 marker defined by the primers. SEQ ID No. 9 and SEQ ID N 0 IO, the radish allele with this marker is not amplified in the line according to the invention whereas it is in restorer lines tested in the prior art. The restorative lines of the invention have the markers OPC2 and OPF10 corresponding to an amplified fragment of the radish allele associated with fertility. These characteristics well illustrate the fact that the line according to the invention has an original genetic profile and different from the other lines tested. None of the plants tested showed a marking similar to that of the plants according to the invention. This proves that the plants according to the invention contain a different and novel recombination event.

Claims

REVENDICATIONS
1- Plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que ledit génome ne présente pas le marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2. A Brassica plant with low levels of glucosinolates and erucic acid whose genome comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, characterized in that said genome does not exhibit the E33M47 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted firstly by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and other on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
2- Plante Brassica selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit génome de la plante présente en outre l'allèle Brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea, du marqueur OPY 17 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°3 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°3, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°4 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°4. 2- Brassica plant according to claim 1, characterized in that said genome of the plant furthermore has the Brassica allele, preferably napus, oleracea or râpa, more preferably napus or oleracea, of the OPY 17 marker defined by the pair of nucleotide primers consisting firstly of the sequence SEQ ID No. 3 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 3, and secondly, by the sequence SEQ ID N ° 4 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 4.
3- Plante Brassica selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit génome de la plante présente au moins un marqueur parmi les marqueurs suivants : 3. Brassica plant according to claim 1 or 2, characterized in that said genome of the plant has at least one marker among the following markers:
un allèle radis du marqueur OPC2 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°5 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°5, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°6 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°6,  a radic allele of the OPC2 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 5 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 5, and on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 6 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 6,
- un allèle radis du marqueur OPFlO défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°7 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°7, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°8 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°8, sans allèle Brassica dudit marqueur OPF 10 tel que défini ci-dessus,  a radish allele of the OPF10 tag defined by the pair of nucleotide primers constituted, on the one hand, by the sequence SEQ ID No. 7 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 7 and, on the other hand, by the sequence SEQ ID No. 8 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 8, without any Brassica allele of said OPF 10 marker as defined above. ,
un allèle brassica, de préférence napus, oleracea ou râpa, plus préférentiellement napus ou oleracea, du marqueur OPN20 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N0IO et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N0IO, sans allèle radis dudit marqueur OPN 20 tel que défini ci-dessus. a brassica allele, preferably napus, oleracea or raspa, more preferably napus or oleracea, of the OPN20 marker defined by the pair of nucleotide primers consisting on the one hand by the sequence SEQ ID No. 9 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 9, and secondly, with the sequence SEQ ID N 0 IO and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID NO : 10, without any radish allele of said OPN 20 marker as defined above.
4- Plante Brassica selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la plante est une Brassica napus, une Brassica oleracea ou une Brassica râpa, de préférence une Brassica napus. 4. Brassica plant according to one of the preceding claims, characterized in that the plant is a Brassica napus, a Brassica oleracea or a Brassica râpa, preferably a Brassica napus.
5- Graine issue de la plante telle que définie dans l'une des revendications précédentes. 5- Seed from the plant as defined in one of the preceding claims.
6- Plante Brassica napus à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique issue d'une graine déposée sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646, dont le génome comporte un événement de recombinaison contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce que ledit génome ne présente pas d'allèle radis du marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2. 6- Brassica napus plant with low levels of glucosinolates and erucic acid derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, whose genome comprises a recombination event containing the Rf gene for restoring male fertility for infertility Ogura cytoplasmic male, characterized in that said genome does not show any radish allele of the E33M47 marker defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 2.
7- Plante hybride restauratrice à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique comprenant un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par croisement entre une plante telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou 6 en tant que parent mâle et une autre plante Brassica à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique ayant une stérilité mâle cytoplasmique (CMS Ogura) en tant que parent femelle. 7- A low-glucosinolate and erucic acid hybridizing restorative plant comprising a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for Ogura cytoplasmic male sterility, characterized in that it is obtained by crossing between a plant as defined in one of claims 1 to 4 or 6 as a male parent and another low glycosinolate and erucic acid Brassica plant having cytoplasmic male sterility (CMS Ogura) as a female parent.
8- Graine hybride issue de la plante telle que définie dans la revendication 7. 9- Descendance de la plante telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4, 6 et 7. 8-hybrid seed derived from the plant as defined in claim 7. 9- Descendance of the plant as defined in one of claims 1 to 4, 6 and 7.
10- Plante selon l'une des revendications 1 à 4 ou 6, dont le génome comprend un fragment d'ADN contenant le gène Rf de restauration de la fertilité mâle pour la stérilité mâle cytoplasmique Ogura, présentant des qualités agronomiques accrues, caractérisée en ce qu'elle répond à au moins l'un des critères agronomiques suivants : • le nombre de graines produites par silique est augmenté d'au moins 25%, de préférence 30% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données, 10- Plant according to one of claims 1 to 4 or 6, the genome of which comprises a DNA fragment containing the Rf gene for restoring male fertility for cytoplasmic male sterility Ogura, having increased agronomic qualities, characterized in that it meets at least one of the following agronomic criteria: The number of seeds produced per silique is increased by at least 25%, preferably 30% relative to the reference plant Billy produced under given conditions,
" le nombre de siliques par ampe est augmenté d'au moins 8%, de préférence 10% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données,  "the number of siliques per ampe is increased by at least 8%, preferably 10% relative to the reference plant Billy produced under given conditions,
• la longueur des siliques est augmentée d'au moins 10%, de préférence 12% par rapport à la plante de référence Billy produite dans des conditions données. 11- Procédé d'obtention d'une plante Brassica telle que défini dans l'une des revendications 1 à 5,  The length of the siliques is increased by at least 10%, preferably 12%, relative to the Billy reference plant produced under given conditions. 11- Process for obtaining a Brassica plant as defined in one of Claims 1 to 5,
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : characterized in that it comprises the following steps:
a) Mettre en œuvre une plante mâle Brassica napus issue d'une graine déposée sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646, et comportant un fragment de génome de radis comportant le gène de fertilité Rf, et de préférence comportant un cytoplasme CMS Ogura,  a) implement a Brassica napus male plant derived from a seed deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, and comprising a fragment of radish genome comprising the fertility gene Rf, and preferably comprising an Ogura CMS cytoplasm,
b) Mettre en œuvre une plante femelle récurrente Brassica CMS Ogura ne présentant pas ledit fragment de génome de radis,  b) implement a Brassica CMS Ogura recurrent female plant not exhibiting said fragment of radish genome,
c) Croiser les plantes de l'étape a) avec les plantes de l'étape b),  c) Cross the plants of step a) with the plants of step b),
d) Obtenir des plantes hybrides,  d) To obtain hybrid plants,
e) Réaliser des rétrocroisements avec la plante de l'étape b) pour obtenir l'introgression du fragment d'ADN de radis comportant le gène Rf présent dans le génome des graines de plante Brassica napus déposées sous la dénomination Brassica napus NCIMB 41646, dans le génome de ladite plante récurrente,  e) Backcrossing with the plant of step b) to obtain the introgression of the radish DNA fragment containing the Rf gene present in the genome of Brassica napus plant seeds deposited under the name Brassica napus NCIMB 41646, in the genome of said recurrent plant,
f) Sélectionner les plantes fertiles,  f) Select fertile plants,
g) Croiser entre elles les plantes de l'étape f) pour obtenir des plantes homozygotes. 12- Procédé selon la revendication 11 ,  g) Cross the plants of step f) together to obtain homozygous plants. 12- Method according to claim 11,
caractérisé en ce que l'étape e) comprend une étape supplémentaire e') de mise en œuvre du marqueur E33M47 défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°l et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°l, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°2 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°2 et de sélection des plantes ne comprenant pas ce marqueur E33M47. 13- Plante Brassica obtenue selon le procédé tel que défini dans l'une des revendications 11 ou 12. characterized in that step e) comprises an additional step e ') of implementing the marker E33M47 defined by the pair of nucleotide primers constituted on the one hand by the sequence SEQ ID No. 1 and / or at least a sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No. 1, and secondly, with the sequence SEQ ID No. 2 and / or at least one sequence comprising at least 12 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID N ° 2 and plant selection not including this marker E33M47. 13- Brassica plant obtained by the process as defined in one of claims 11 or 12.
14- Procédé de production de plante telle que définie dans la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 14- Plant production process as defined in claim 7, characterized in that it comprises the following steps:
a) mettre en œuvre une plante telle que définie dans l'une des revendications 1 à 4 ou la revendication 6, et reproduite pour être homozygote, ladite plante étant utilisée en tant que pollinisatrice,  a) implement a plant as defined in one of claims 1 to 4 or claim 6, and reproduced to be homozygous, said plant being used as a pollinator,
b) mettre en œuvre une plante Brassica CMS Ogura à faibles taux de glucosinolates et d'acide érucique issue d'une lignée ou variété donnée, en tant que plante femelle,  b) implement a low-glycosinolate and erucic acid-based Brassica CMS Ogura plant from a given strain or variety, as a female plant,
c) effectuer un croisement entre la plante de l'étape a) et la plante de l'étape b), pour obtenir une plante hybride,  c) cross between the plant of step a) and the plant of step b) to obtain a hybrid plant,
d) récolter les graines hybrides à partir de la plante obtenue à l'issue de l'étape c).  d) harvesting the hybrid seeds from the plant obtained at the end of step c).
15- Utilisation des plantes telles que définies dans l'une des revendications 1 à 4, 6, 7, 10, 13 ou produites selon le procédé tel que défini dans l'une des revendications 11 ou 12, pour des applications alimentaires, de préférence la production d'huile et/ou la production de tourteaux. 15- Use of plants as defined in one of claims 1 to 4, 6, 7, 10, 13 or produced according to the method as defined in one of claims 11 or 12, for food applications, preferably oil production and / or cake production.
EP10740621A 2009-08-03 2010-08-03 Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant Withdrawn EP2461666A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0955446A FR2948533A1 (en) 2009-08-03 2009-08-03 OGURA CYTOPLASMIC MALE STERILITE BRASSICA RESTAURANT PLANT, PROCESS FOR PRODUCTION AND USE THEREOF
PCT/EP2010/061311 WO2011020698A1 (en) 2009-08-03 2010-08-03 Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2461666A1 true EP2461666A1 (en) 2012-06-13

Family

ID=42077337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP10740621A Withdrawn EP2461666A1 (en) 2009-08-03 2010-08-03 Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2461666A1 (en)
FR (1) FR2948533A1 (en)
WO (1) WO2011020698A1 (en)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102835306B (en) * 2012-09-26 2014-03-12 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 Breeding method for early-maturing hybrid broccoli in additive selection
CN114350832B (en) * 2017-08-24 2023-09-26 湖南省作物研究所 Exogenous radish fragment specific marker and preparation method and application thereof
CN108642061B (en) * 2018-05-16 2021-10-08 西南大学 Ogura CMS sterility restorer gene RfoB、RfoBPlant expression vector and application thereof
CN110235774B (en) * 2019-03-18 2022-08-19 长沙丰景大地农业科技有限公司 Method for cultivating wax powder-free cabbage type rape bolts
US20240292798A1 (en) 2020-12-21 2024-09-05 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Brassica napus plants comprising an improved fertility restorer
CN114561485B (en) * 2022-03-19 2023-09-29 陕西省杂交油菜研究中心 Molecular marker group for identifying brassica napus cytoplasm three lines, and method and application thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL113119B1 (en) 1978-01-25 1980-11-29 Hutmaszprojekt Equipment arrangement for handling and reloading ingotsfrom dump trucks onto a roller table
FR2667078B1 (en) 1990-09-21 1994-09-16 Agronomique Inst Nat Rech DNA SEQUENCE GIVING MALE CYTOPLASMIC STERILITY, MITOCHONDRIAL, MITOCHONDRIA AND PLANT CONTAINING THE SAME, AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF HYBRIDS.
GB9513881D0 (en) 1995-07-07 1995-09-06 Zeneca Ltd Improved plants
CA2193938A1 (en) 1996-12-24 1998-06-24 David G. Charne Oilseed brassica containing an improved fertility restorer gene for ogura cytoplasmic male sterility
EP1493328A1 (en) 2003-07-04 2005-01-05 Institut National De La Recherche Agronomique Method of producing double low restorer lines of brassica napus having a good agronomic value
GB0402106D0 (en) * 2004-01-30 2004-03-03 Syngenta Participations Ag Improved fertility restoration for ogura cytoplasmic male sterile brassica and method
EP2016821A1 (en) * 2007-06-13 2009-01-21 Syngeta Participations AG New hybrid system for Brassica napus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO2011020698A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011020698A1 (en) 2011-02-24
FR2948533A1 (en) 2011-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6235770B2 (en) Broccoli hybrid PX05181808 and its parent
JP5903208B2 (en) Broccoli hybrid PS05151639
US9756813B2 (en) Sweet corn hybrid SHY6RH1365 and parents thereof
JP6045145B2 (en) Pepper hybrid PS0995434
JP6054026B2 (en) Pepper hybrid PS09967422
US8502025B2 (en) Sweet corn hybrid SEY6RH1264 and parents thereof
AU2008200172B2 (en) Garden bean line ex 15340804
AU2015252093A1 (en) Sweet corn hybrid sv1446sd and parents thereof
JP6313558B2 (en) Spinach hybrid SV3580VC and its parent
JP5788152B2 (en) Tomato hybrid HNX12860544
WO2011020698A1 (en) Brassica plant for restoring fertility in an ogura cytoplasmic male-sterility system, method for producing same, and use of said plant
EP2403950B1 (en) Diplotaxus plant genus carrying cytoplasmatic male sterility
US10813339B2 (en) Tomato hybrids SVTM9011 and SVTM9012 and parents thereof
US20220210996A1 (en) Tomato hybrid svts2208 and parents thereof
JP2016063807A (en) Spinach hybrid sv3653va and parents thereof
US8502024B2 (en) Sweet corn hybrid SEY6RH1263 and parents thereof
AU2018203125A1 (en) Bean variety svgg2053
US20220015323A1 (en) Tomato hybrid svtm9000 and parents thereof
JP7458708B2 (en) Melon hybrid SVMH7844 and its parents
US11191248B2 (en) Tomato hybrid SVTM9016 and parents thereof
KR20230002089A (en) Broccoli hybrid svbl0308
JP2013153746A (en) Broccoli hybrid rx 05900099 and parents thereof
US20230172147A1 (en) Tomato hybrids svtm9014
JP2014057581A (en) Broccoli hybrid rx 05991199 and its parent line
JP2013153745A (en) Broccoli hybrid rx 05900097 and parents thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20120124

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20140401

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: LIMAGRAIN EUROPE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20180208