EP2451825A1 - Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf - Google Patents

Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf

Info

Publication number
EP2451825A1
EP2451825A1 EP10754354A EP10754354A EP2451825A1 EP 2451825 A1 EP2451825 A1 EP 2451825A1 EP 10754354 A EP10754354 A EP 10754354A EP 10754354 A EP10754354 A EP 10754354A EP 2451825 A1 EP2451825 A1 EP 2451825A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lysozyme
avidin
product
basic
support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP10754354A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Françoise NAU
Catherine Guerin-Dubiard
Thomas Croguennec
Maryvonne Pasco
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agro
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage (agro Camus Ouest)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage (agro Camus Ouest) filed Critical Institut Superieur Des Sciences Agronomiques Agroalimentaires Horticoles Et Du Paysage (agro Camus Ouest)
Publication of EP2451825A1 publication Critical patent/EP2451825A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds

Definitions

  • the present invention relates to the field of obtaining proteins, and in particular the extraction and purification of proteins.
  • the invention relates more specifically to the use of a product derived from egg white, for obtaining, advantageously by extraction and purification, basic proteins of egg white, in particular avidin.
  • Egg white, or albumen is a naturally occurring blend that typically comprises about 88% by weight water and a dry matter content of about 12% by weight.
  • the dry matter consists mainly of proteins (more than 90% by weight, relative to the total weight of dry matter).
  • lysozyme (whose pi is of the order of 10.7) and avidin (whose pi is of the order of 10) can be cited, which are the subject of numerous studies and a exploitation on an industrial scale.
  • the egg white has an avidin content close to 0.05 g per liter, and a lysozyme content close to 3.5 and 4 g per liter.
  • the mass ratio of the "lysozyme plus avidin" group, relative to the total egg-white proteins, is about 0.04.
  • Lysozyme is a natural enzyme that was discovered and characterized in the 1920s.
  • Lysozyme is used in the pharmaceutical industry for its antibacterial activity against gram-positive bacteria. It alters the cell wall of gram-positive bacteria, resulting in cell lysis and death. Lysozyme is effective against a number of bacteria that cause infections in the human body.
  • lysozyme The anti-bacterial activities of lysozyme are also used to reduce or block the deterioration of certain foods.
  • One of the most important commercial applications of lysozyme is the ripening of certain cheeses, for example cooked pressed dough cheeses. Lysozyme inhibits the growth of Clost ⁇ dium tyrobutyricum, a bacterium that can contaminate milk. The presence of this bacteria in the cheese in formation in particular, the production of butyric acid, which causes an abnormal flavor, and the generation of an excessive concentration of hydrogen and gas in the mass of the cheese paste causing cracks and cracks in said mass.
  • Lysozyme is also used today to replace sulphites in winemaking processes. Lysozyme inhibits lactic acid bacteria and controls malolactic fermentation. It improves the organoleptic properties (color and taste) of the final wine. In addition, the final wine that is free of sulfite is better tolerated by consumers.
  • Avidin which is also found in egg white, is known primarily for its ability to form a complex with biotin. This avidin-biotin complex has been widely used in biotechnology applications, especially for medical diagnosis.
  • avidin purification methods based on cation exchange chromatography techniques are known for the extraction and purification of avidin from egg white.
  • the Canadian patent document No. 0 CA- 1283072 discloses a process for the isolation and separation by chromatography, lysozyme and avidin from egg white.
  • This method comprises repeating a cycle comprising up to twenty times the steps of (i) contacting the egg white with a weakly acidic cation exchange resin so that lysozyme and avidin are adsorbed on said resin then (ii) contacting the resin with a low ionic strength elution buffer, which elutes the lysozyme from the resin while the avidin remains adsorbed.
  • This process ends with the contacting of the resin containing avidin, with a high ionic strength elution buffer eluting this accumulated avidin by adsorption.
  • One of the disadvantages of the above method is that it requires the treatment of a large volume of egg white, and that it involves the implementation of a large number of steps (corresponding to the repetition cycles of loading the egg white on the resin), to obtain a significant amount of protein of interest.
  • the degree of purity of the avidin thus produced is not very high.
  • Patent Document No. CA-2 431 773 also discloses a process for the preparation of avidin from egg white.
  • This process comprises (i) a step of lyophilizing an egg white homogenized with a buffer followed by (ii) a step of solubilizing the lyophilized egg white in a buffer followed by (iii) a step incubating the solubilized lyophilized product with a cation exchange resin material, then (iv) a filtration step to separate the resin material from the incubation medium, and (v) a step of selectively eluting the avidin using a colored molecule for which avidin has a high affinity.
  • the above method which comprises a large number of steps, requires the implementation of a final step of removal of the added dye for the production of the purified avidin. elution stage.
  • egg white as a starting material for obtaining certain basic proteins such as avidin results in the implementation of numerous, complex and / or expensive steps.
  • New methods are provided according to the invention for obtaining purified egg-white proteins, including purified basic egg-white proteins, such as purified avidin, which are advantageous over known methods.
  • the subject of the present invention is in particular the use of a co-product for extracting lysozyme from egg white, for obtaining (more preferably for the extraction and purification) basic proteins of egg white, which coproduct is a solution (advantageously in the form of a brine) obtained at the end of a step of extraction of the lysozyme previously crystallized at basic pH from an eluate containing the egg white protein fraction retained on a cation exchange chromatography support.
  • this coproduct consists of a filtrate obtained at the end of a filtration step of the eluate containing the egg white protein fraction retained on cation exchange chromatography support, said filtration step being adapted to purify in the filtration retentate, the lysozyme previously crystallized at basic pH.
  • the present invention also relates to the use of the co-product in concentrated and desalted / demineralized form, which verifies the following characteristics:
  • Another subject of the present invention relates to the process for purifying at least one basic egg-white protein, comprising an operation for extracting and purifying said basic protein from a coproduct resulting from a process extraction of lysozyme from egg white, which coproduct is a solution obtained at the end of a step of extraction of lysozyme previously crystallized at basic pH from an eluate containing the protein fraction of white d egg retained on a cation exchange chromatography support.
  • the coproduct is advantageously a filtrate obtained at the end of a filtration step of an eluate containing the egg white protein fraction retained on a cation exchange chromatography support, said filtration step being adapted to purify the lysozyme previously crystallized at basic pH in the filtration retentate.
  • step (b) eluting the lysozyme-enriched protein fraction retained on said chromatographic support during step (a), using a brine solution,
  • step (c) recovering the lysozyme enriched eluate from step (b), (d) crystallization at basic pH of the lysozyme contained in said eluate obtained in step (c),
  • step (f) recovering the filtrate from step (e), forming the co-product of interest.
  • this co-product has the following characteristics:
  • an avidine / lysozyme mass ratio greater than 0.1.
  • the coproduct used in the process is in a concentrated and desalted / demineralized form.
  • the concentrated and demineralized coproduct advantageously satisfies the following characteristics:
  • an avidine / lysozyme mass ratio greater than 0.1.
  • the present invention also provides a composition for the extraction and purification of at least one basic egg-white protein, consisting of a co-product from a lysozyme extraction process in a concentrated and desalted form, which co-product is a filtrate obtained at the end of a process for extracting lysozyme, in a concentrated and desalted form, which co-product is a solution obtained at the end of a step of extraction of the lysozyme previously crystallized at pH base from an eluate containing the egg white protein fraction retained on a cation exchange chromatography support.
  • This coproduct advantageously consists of a filtrate obtained at the end of a filtration step of an eluate containing the egg white protein fraction retained on a cation exchange chromatography support, said filtration step being adapted to purify the lysozyme previously crystallized at basic pH in the filtration retentate.
  • the present invention also relates to a process for the purification of avidin, comprising an operation for extracting and purifying avidin from a composition containing, in particular, avidin and lysozyme (advantageously egg white or a product derived from egg white), which operation for extracting and purifying avidin comprising the following steps:
  • step (a) a first pass on a cation exchange chromatography support with said composition, the loading of said support being effected beyond its fixing capacities so, on the one hand, to retain the lysozyme (advantageously all or at least minus approximately all lysozyme), and on the other hand, to recover the excluded fraction enriched in avidin and devoid of lysozyme, (b) a second passage on a cation exchange chromatography support with said excluded fraction obtained at the end of step (a), the loading of said support taking place in such a way that its attachment sites are occupied by the avidin (advantageously all these sites),
  • step (c) eluting and collecting the purified avidin-containing eluate fraction retained on said support in step (b).
  • FIG. 1 shows the gel filtration HPLC profile (chromatogram with value of the optical density at 280 nm depending on the time in minutes), to evaluate the degree of purity of the avidin extracted by the process according to the invention.
  • FIG. 2 shows electrophoretic profiles distributed over five tracks, to evaluate the degree of purity of the avidin extracted by the process according to the invention: (1) co-product resulting from a process for extracting lysozyme in a form concentrated and desalted, (2) lysozyme standard, (3) avidin purified by the method according to the invention, (4) avidin standard, (5) lysozyme standard.
  • the bands designated by marks A to D correspond respectively to: (A) ovotransferrin, (B) ovalbumin, (C) avidin and (D) lysozyme.
  • the Applicant has endeavored to find new processes for obtaining basic proteins of egg white, advantageously purified, the cost of which is moderate.
  • the Applicant has shown that a product derived from egg white, which is likely to be obtained as a co-product devoid of market value and which is generated during protein purification processes from white d egg, can be used in industrial processes for obtaining, and especially the extraction and purification, basic protein egg white.
  • one of the co-products or by-products resulting from a process for extracting lysozyme from egg white can constitute a starting product that can be used for obtaining (advantageously by extraction and purification ) basic egg white proteins, mainly avidin or an avidin / lysozyme mixture.
  • a starting material having a great interest for obtaining at least one basic protein of egg white, mainly avidin or a mixture avidin / lysozyme.
  • This starting material of interest consists of a by-product or co-product that is generated during the implementation of a process for extracting lysozyme from liquid egg white, said process for extracting lysozyme comprising:
  • said by-product or coproduct corresponding to the product of interest which has been identified according to the invention as a starting product for obtaining a basic protein, advantageously purified, of egg white.
  • the co-product of interest which is used according to the invention as a starting product in a process for obtaining a basic protein derived from egg white, is in the form of a solution obtained at the end of step (iii) above extraction of lysozyme crystallized at basic pH from an eluate containing the egg white protein fraction retained on a cation exchange chromatography support.
  • the co-product of interest advantageously consists of a solution of brine (an aqueous solution of a salt) having a basic pH, whose protein composition is different from that of egg white: it is a solution enriched in basic proteins, other than lysozyme, retained on chromatographic support cation exchanger.
  • this coproduct nowadays not recovered and considered as waste, is particularly rich in certain basic proteins of egg white, and especially in avidin. It has been shown according to the invention that this co-product is a very attractive starting material for the extraction and purification of these proteins of interest.
  • the co-product of interest which is used according to the invention as a starting product for obtaining (and in particular purification) basic proteins of egg white, can be obtained by a process of lysozyme extraction comprising the following succession of steps:
  • step (b) eluting the lysozyme-enriched protein fraction retained on said chromatographic support during step (a), using a brine solution, (c) recovering the lysozyme enriched eluate from step (b),
  • step (d) crystallization at basic pH of the lysozyme contained in said eluate obtained in step (c),
  • step (f) recovering the solution from step (e), forming the co-product of interest.
  • the protein fraction enriched in lysozyme which is recovered in the eluate in step (c) also comprises other egg white proteins, and in particular avidin. It has also been shown that the co-product of interest recovered in step (f), which is depleted of lysozyme, has not been simultaneously depleted of other egg-white proteins. In particular, said co-product of interest was not simultaneously depleted in avidin.
  • the starting material of the lysozyme extraction process described above is egg white, still commonly referred to as albumen.
  • the egg white preferably comes from a bird's egg, preferably from a bird's egg selected from the chicken, the turkey, the guinea fowl, the goose, the duck, the quail, the pheasant, the pigeon and ostrich.
  • the egg white used as starting material of the above process is preferably from a chicken egg.
  • the cation exchange chromatography support is selected from a weak acid type cation exchange support and a strong acid cation exchange support.
  • the cation exchange step is carried out on a chromatographic support consisting of a rigid or semi-rigid gel based on hydrophilic polymers, such as a crosslinked or non-crosslinked agarose gel. crosslinked, a hydrophilic vinyl polymer gel, or a silica gel coated with a hydrophilic polymer, or a polystyrene support divinyl benzene, on which (s) hydrophilic polymer (s) are grafted groups thereof ( their) conferring properties of cation exchanger (s).
  • hydrophilic polymers such as a crosslinked or non-crosslinked agarose gel. crosslinked, a hydrophilic vinyl polymer gel, or a silica gel coated with a hydrophilic polymer, or a polystyrene support divinyl benzene, on which (s) hydrophilic polymer (s) are grafted groups thereof ( their) conferring properties of cation exchanger (s).
  • the functional groups that may be used for the grafting of the polymer (s) mention may be made of (i) the carboxymethyl groups of the CM-polysaccharide type for a weak cation exchange coating, and (ii) the sulfonate groups. or SP-polysaccharide methyl sulfonate (S) or sulfopropyl (SP) for a strong cation exchange coating, which is capable of adsorbing weakly ionized molecules.
  • the cation exchange chromatography support used in the above lysozyme extraction process is advantageously packaged in a container equipped with at least one starting egg white feed means, at least one means for discharging liquids and at least one means for agitating the chromatographic support particles in the liquid to be treated. This is a "batch" packaging of the chromatographic medium.
  • the container in which the cation exchange chromatography support is arranged may also be equipped with one or more means for supplying buffer solution, in washing solution, or else in solution to regenerate the chromatographic support.
  • the liquid egg white is adjusted to a pH value of between 7 and 10, and preferably of the order of 8.5.
  • the cation exchange chromatography support is advantageously equilibrated at the same or approximately the same pH value as the adjusted pH value of the egg white.
  • step (a) the lysozyme contained in the starting liquid egg white is retained on the cation exchange chromatography support, and the excluded fraction (not retained on the support) which is depleted in lysozyme is removed. container or chromatography column.
  • the cation exchange chromatography support is subjected to one or more washing steps, preferably with demineralized water, in order to remove the protein or non-protein components of egg white not specifically retained on the chromatographic medium.
  • the brine solution used in step (b) advantageously consists of an elution solution containing at least one counter-ion selected from the following monovalent cations Na or NH 4 , and / or the following bivalent cations Mg or Ca.
  • the salt concentration of this brine solution is advantageously adjusted so as to obtain a conductivity of between 70 and 80 mS / cm; it is for example adjusted to 5% NaCl.
  • step (d) the crystallization of lysozyme is selective. It can be carried out by adding sodium hydroxide (NaOH), with stirring, until adjustment to a pH value of between 8 and 11, and preferably of the order of 10.
  • NaOH sodium hydroxide
  • This step can be implemented in a reactor or "tank" of crystallization, well known to those skilled in the art.
  • the separation between (i) the crystallized lysozyme and (ii) the co-product of interest is carried out by filtration of the eluate resulting from step (c). ): the crystallized lysozyme is found in the retentate (also called “lysozyme paste"), and the filtrate from step (e) is the co-product of interest depleted in lysozyme and enriched in avidin (also referred to as "brine out filter "in the present description).
  • the above filtration operation for carrying out steps (e) and (f) of the lysozyme extraction process above, is for example carried out by means of a filter press.
  • the filter press consists of a pressure band press filter whose membrane is advantageously a microfiltration membrane with a pore size of between 0.1 and 10 ⁇ m.
  • a pressure band press filter whose membrane is advantageously a microfiltration membrane with a pore size of between 0.1 and 10 ⁇ m.
  • Other methods and techniques known to those skilled in the art can still be envisaged for effecting the separation between the crystallized lysozyme and the other components of the eluate obtained at the end of step (c) of the process described above. above.
  • the co-product of interest constitutes the supernatant or centrifugate; the crystallized lysozyme is collected in the centrifugation pellet.
  • step (f) of the above process the lysozyme extraction coproduct is obtained, which is useful for the processes for obtaining (advantageously for extraction and purification) basic proteins of egg white according to US Pat. invention, said co-product of interest advantageously having the following characteristics:
  • a mass ratio (lysozyme + avidin) / total protein greater than 0.1 (generally between 0.1 and 2), and
  • an avidine / lysozyme mass ratio greater than 0.1 (generally between 2 and 25).
  • Basic egg-white proteins which are obtained by performing said method of obtaining a basic egg-white protein described hereinafter, may be used as such in any suitable industrial applications.
  • obtaining at least one basic egg-white protein is meant primarily a purification process, and still mainly:
  • the purification of at least one basic egg-white protein may include, in addition to the separation between the basic protein of interest and the other protein constituents of said co-product of interest, also the separation between the basic protein of interest and non-protein components of said co-product, such as sugars, mineral salts, amino acids, vitamins, etc.
  • the purification of at least one basic egg-white protein is said to be "selective" because one advantageously (i) is recovered a purified mixture of one or more basic egg-white proteins of interest, (ii) or a basic egg white protein of interest in purified form.
  • purified avidin or purified lysozyme or a purified mixture of avidin and lysozyme is preferably recovered "selectively".
  • obtaining at least one basic egg-white protein is also denoted in particular a so-called “enrichment” method for obtaining at least one basic protein of egg white in an enriched form.
  • this method aims at modifying the ratio of at least one basic protein of interest contained in said co-product of interest, with respect to its other constituents.
  • the enrichment of at least one basic egg-white protein makes it possible in particular to recover the coproduct enriched in one or more basic proteins, in comparison with said coproduct before enrichment.
  • Any suitable protocol can be used for this purpose, according to methods used individually or in combination, such as fractionation by precipitation and / or filtration, chromatography methods, immunoaffinity techniques using monoclonal antibodies or specific polyclonal, etc.
  • the lysozyme extraction coproduct is advantageously used in a concentrated and desalted / demineralized form, to obtain a product enriched in proteins. basics of interest.
  • This concentrated and desalted coproduct can be obtained by a process comprising the following steps:
  • step (b) adjusting the pH of said co-product with a mineral or organic acid, (c) concentration of the acidified coproduct in step (b), preferably by filtration (for example by ultrafiltration, nanofiltration or reverse osmosis), until a concentrated coproduct advantageously containing at least 1 g / L of avidin is obtained,
  • step (d) demineralization / desalting of the concentrated coproduct from step (c), so as to obtain a concentrated coproduct whose salt content is reduced to a conductivity preferably less than 50 mS / cm.
  • step (b) the pH is adjusted to a value less than 7.5, preferably to a value ranging from 7.5 to 2.5.
  • the pH value is advantageously adjusted in step (b), so as to reach a value close to neutral (more preferably between 6.5 and 7.5), before being concentrated. by the filtration step (c).
  • the Applicant has furthermore shown that the acidic pH adjustment of the lysozyme extraction coproduct in step (b) of the process, preferably at a pH value ranging from 2.5 to 4.5 (preferably from the order of 3), makes it possible to significantly optimize the efficiency of the avidin concentration step (c) in the concentrated coproduct, in particular in the case of a filtration technique, and more preferably in the context of an ultrafiltration technique; and this makes it possible to obtain high concentration levels of avidin.
  • the pH value is advantageously adjusted in step (b), to a pH value ranging from 2.5 to 4.5 (advantageously of the order of 3), before be concentrated by the filtration step (c).
  • the ultrafiltration membrane preferably has a cut-off threshold greater than 10,000 Da.
  • the Applicant has discovered that a membrane whose cut-off point is 100 000 Da makes it possible to increase the avidin / lysozyme ratio of the retentate fraction by a factor of 10 to 50.
  • the adjustment of the avidin / lysozyme ratio advantageously depends on the protein of interest to be obtained subsequently.
  • the demineralization / desalting step (d) may be carried out using any technique known to those skilled in the art, for example by nanofiltration or ultrafiltration with diafiltration, using nanofiltration or ultrafiltration membranes.
  • the demineralization / desalting step (d) may also be carried out by electrodialysis or by passage over an ion exchange resin.
  • the concentrated and demineralized / desalinated coproduct obtained in step (d) advantageously satisfies the following characteristics:
  • an avidin concentration greater than 1 g / l (and preferably from 3 to 15 g / l), a mass ratio (lysozyme + avidin) / total proteins greater than 0.1 (and preferably greater than 1), and
  • an avidine / lysozyme mass ratio greater than 0.1 (and preferably greater than 2).
  • the conductivity value is preferably measured using a conductivity meter.
  • the concentration of avidin is preferably determined by the colorimetric method with HABA (4-Hydroxyazobenzene-2-Carboxylic Acid) according to Green et al (Biochem J, 94: 23-24, 1965) modified by Durance et al (J Food Sci, 56 (3): 707-709, 1991).
  • Avidin is advantageously detected either by the HABA test or by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS.
  • Lysozyme is for example detected either by filtration gel HPLC according to the method of Thapon et al (Sci ANm 2: 251-260, 1982), or by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS.
  • the concentration of lysozyme is determined, for example, by measuring its lytic activity on Micrococcus lysodeikticus cells according to the Litwack method (Proc Soc Exp Biol & Med, 89: 104, 1955) and Prockop et al (New Eng J Med, 240 : 269, 1964).
  • the total protein concentration is determined, for example, by the Kjeldhal method.
  • the mass ratio (lysozyme + avidin) / total protein is calculated from the analytical data described above.
  • step (d) advantageously depends on its avidin / lysozyme ratio.
  • the fractions whose mass ratio avidin / lysozyme is high (that is to say preferably greater than 5), will be preferred for the purification and subsequent extraction of avidin.
  • the fractions whose avid / lysozyme mass ratio is lower (that is to say advantageously less than 5), will advantageously be used for the subsequent exploitation of the properties of the mixture enriched in avidin / lysozyme. .
  • the concentrated and desalted product obtained at the end of step (d) can also be treated in such a way as to allow its conservation over time.
  • the preservation treatment can be of the drying, freeze-drying type or conditioning and stabilization by refrigeration (temperature ranging from -5 ° C. to + 40 ° C.) or freezing (temperature below -5 ° C. more preferably below -20 ° C., advantageously below -80 ° C.).
  • the present invention also relates to a method for the purification of at least one basic egg-white protein, which is particularly suitable for the use of the lysozyme extraction coproduct described above as a starting material, said co-product of lysozyme extraction being advantageously in concentrated and demineralized form.
  • the Applicant has in particular developed a method for extracting a basic protein from egg white in which a so-called "front-end" chromatography technique is used.
  • front-end chromatography is meant a method of separating a compound of interest by chromatography according to which:
  • said chromatography column is fed with a continuous stream of a solution containing a compound of interest to be extracted or purified, so that said solution is brought into continuous contact with the conditioned chromatography medium in the column; said solution having been in contact with the chromatographic medium being discharged from the column also continuously, and feeding the chromatography column with said solution being continued until the molecules of said compound of interest saturate said support chromatography and that said compound of interest is detected in the output stream of the column.
  • the chromatographic medium Since the chromatographic medium is saturated and once a molecule begins to elute from the support, it is continuously present in the excluded fraction. Molecules with little or no affinity for the chromatographic support are recovered in the excluded fraction before the molecules having greater ability to be retained by the chromatographic support.
  • the Applicant has in particular developed a method of chromatography, in the frontal mode, making it possible to achieve very high levels of avidin purity (advantageously greater than 99%) in only two stages, and with satisfactory yields (advantageously 30 to 30%).
  • 60% of the avidin present in the concentrated / demineralised coproduct in particular the function of its avidin / lysozyme mass ratio: the higher the avidin / lysozyme ratio, the higher the extraction efficiency).
  • the method for extracting or purifying a basic protein from the egg white according to the invention consists of a three-step process in which two successive stages of chromatography are carried out, said extraction method comprising the following steps: (a) in a first step, loading a chromatographic support beyond its binding (or adsorption) capacity with a continuous stream of lysozyme extraction coproduct described above, so that the lysozyme retained on said support prevents the retention of avidin, which allows to obtain an excluded fraction depleted, or even deprived, of lysozyme ("délysozymée") and containing most or all of the avidin initially present in the volume of co-product put into contact with the chromatographic medium, and
  • step (b) in a second step, loading a chromatographic support with the excluded fraction délysozymée obtained in step (a), where appropriate beyond the capacity of fixation (or adsorption) of said chromatographic medium, so that the binding sites (or adsorption) are occupied by avidin,
  • step (c) eluting the avidin retained on the chromatographic support in step (b).
  • step (b) a second pass on a cation exchange chromatography support with said excluded fraction portion obtained at the end of step (a), the loading of said support being effected in such a way that its attachment sites (the case all sites) are occupied by avidin,
  • step (c) eluting and collecting the eluate fraction containing the purified avidin retained on said support in step (b).
  • the cation exchange chromatographic support used in step (a) and in step (b) is chosen from a weak type cation exchange chromatographic support or a strong type cation exchange chromatographic support.
  • the cation exchange step is carried out on a chromatographic support consisting of a rigid gel, or semi-rigid, based on hydrophilic polymers, such as an optionally crosslinked agarose gel, a gel of hydrophilic vinyl polymer, or a silica gel coated with a hydrophilic polymer, or a polystyrene divinyl benzene support, on which hydrophilic polymer are grafted groups conferring on said polymer and said gel cation exchange properties.
  • hydrophilic polymers such as an optionally crosslinked agarose gel, a gel of hydrophilic vinyl polymer, or a silica gel coated with a hydrophilic polymer, or a polystyrene divinyl benzene support, on which hydrophilic polymer are grafted groups conferring on said polymer and said gel cation exchange properties.
  • the functional groups that may be used for the grafting of the polymer (s) mention may be made of (i) the carboxymethyl groups of the CM-polysaccharide type for a weak cation exchange coating, and (ii) the sulfonate groups. or SP-polysaccharide methyl sulfonate (S) or sulfopropyl (SP) for a strong cation exchange coating, which is capable of adsorbing weakly ionized molecules.
  • the cation exchange chromatographic support is selected from the following group: S Hyper DF, S Ceramic Hyper DF, SP Spherodex LS, Streamline SPXL, CM Hyper DF, CM Sepharose, Biorex 70, Duolite C464, Amberlite IRC 50, CG -50, DP-1, IRC-72 and 64, Rexyn 102, Merck IV, Zeocarb 226, Diaion WK 10 and WK 11, IMAC Z-5, CP-3050, and Wofafit CP300.
  • the cation exchange chromatography support used in step (a) is identical to that used in step (b); it suffices, for example, to regenerate the support between steps (a) and (b).
  • the concentrated and desalted coproduct is adjusted, on the one hand, to a conductivity value of between 5 and 60 mS / cm, preferably between 5 and 10 mS / cm, and on the other hand, at a pH value of between 7 and 10, and more preferably of the order of 8.5.
  • This operation makes it possible to maximize the fixing capacity of the support and to favor the adsorption of the basic proteins, and in particular the lysozyme, and to exclude the other proteins contained in the concentrated and desalted coproduct.
  • the chromatography medium is balanced to conductivity and pH values that are identical or at least close to the conductivity and pH values of the product applied.
  • the concentrated and desalted coproduct is advantageously subjected to a decantation, centrifugation or filtration step, in order to eliminate any insoluble constituents that may hinder the following chromatography steps.
  • Avidin and / or lysozyme are detected and / or quantified in the chromatographic output fluid.
  • This operation can be implemented by any technique known to those skilled in the art, and mentioned above.
  • step (a) avidin and lysozyme are detected and / or quantified in the chromatographic output fluid (according to for example a technique described above, directly or in an excluded fraction) , so as to exclusively recover the excluded fraction containing avidin (and possibly other basic egg-white proteins) and lacking lysozyme (taking into account the sensitivity of the detection / quantification test).
  • the excluded fractions recovered are those containing no trace of detectable lysozyme. These excluded recovered fractions are pooled to form the excluded fraction enriched in avidin and devoid of lysozyme.
  • step (b) prior to step (b), the fraction excluded and collected at the end of step (a), which is enriched in avidin, is adjusted to a pH value of between 7 and 10, and preferably of the order of 8.5.
  • This operation makes it possible to maximize the fixing capacity of the support and to favor the adsorption of avidin, and to promote the exclusion of the other proteins contained in the medium.
  • the chromatography support is balanced to conductivity and pH values that are identical or at least similar to those of the product applied.
  • the avidin is advantageously detected and / or quantified in the chromatographic output fluid (directly or in an excluded fraction), so as to interrupt or stop the passage as soon as a certain concentration of avidin is detected (corresponding to the saturation of the sites of attachment of the chromatography medium by avidin).
  • step (b) the passage of the fraction excluded in step (b) is stopped when avidin is detected at the outlet of the chromatographic column.
  • the chromatographic support Before step (c) of eluting and collecting the eluate fraction comprising the purified avidin, the chromatographic support can be rinsed, for example by means of water or a buffer (for example a buffer acetate).
  • a buffer for example a buffer acetate
  • the step (c) of eluting and collecting the eluate fraction comprising the purified avidin is carried out according to a technique known to those skilled in the art, advantageously by increasing the pH to values close to 10 with a glycine-NaOH or carbonate-bicarbonate buffer for example, or by increasing the ionic strength of the elution buffer with a saline solution (for example 0.5 M NaCl).
  • the solution used advantageously consists of an elution solution containing at least one counterion chosen from the following monovalent Na or NH 4 cations, and or the following divalent cations Mg or Ca.
  • the solution used for elution may consist of a 0.5M solution of NaCl or KCl salt.
  • the use of the lysozyme extraction coproduct identified by the applicant (and described with its method of obtaining previously in the present description), as raw material starting in the present method of extraction in the front-end mode according to the present invention, is in practice of great industrial interest, because it allows to obtain a large amount of avidin, high purity (preferably greater than 99 % purity, according to a gel filtration chromatography technique).
  • the overall yield of the above avidin extraction process and the material loss is not a critical aspect of the process, since the lysozyme-extractive coproduct that is used as the starting raw material was lacking, until present invention, of market value.
  • step (a) of "front-end” chromatography also makes it possible to avoid the problems of change of scale which are conventionally encountered for chromatographic processes, since there is no elution gradient here that it would be necessary to optimize.
  • step (a), and where appropriate also of step (b), according to a "front-end" chromatography technique also makes it possible to work with reduced volumes of chromatography medium.
  • up to about 25 to 30 g of purified avidin can be obtained using one liter of chromatographic support.
  • the two-step front chromatographic method can also be used to extract and purify the residual lysozyme contained in the extraction coproduct of the concentrated and desalted lysozyme.
  • washing the chromatographic support on which the lysozyme is retained with a suitable washing solution such as a 20 mM sodium phosphate buffer at pH 8.5
  • step (d) collecting the eluate fraction containing the purified lysozyme, retained on said support during the first pass according to step (a) of the desalted and concentrated lysozyme extraction coproduct.
  • this two-stage frontal chromatography method can be implemented from any other solution containing a mixture of avidin and lysozyme, namely in particular egg white or any other product derived from white of egg.
  • This solution advantageously contains an avidin / lysozyme ratio greater than 1.5.
  • the starting material of the avidin extraction process according to the invention is also any recombinant solution originating from a bacterial or eukaryotic system.
  • the coproduct obtained is first acidified with a 5M hydrochloric acid solution, until its pH is adjusted to a value of the order of 3.15.
  • the acidified coproduct is then concentrated by ultrafiltration, using a membrane with a cutoff of 10 kDa ("Molecular Weight Cut Off” or "MWCO” 10 kDa), and the surface is 2.5 m 2 .
  • MWCO Molecular Weight Cut Off
  • This ultrafiltration operation is carried out with a retentate flow rate of 965 L / h, an inlet pressure of 1.85 bar and an average permeate flow rate of 20 L / h.
  • the acidified and concentrated coproduct is then subjected to an ultrafiltration membrane diafiltration operation, with an average permeate flow rate of the order of 40 L / h.
  • the retentate obtained, enriched in basic proteins has a weight of 11.84 kg and has the following characteristics:
  • the first chromatography was carried out on 200 ml of a S Ceramic Hyper DF resin column equilibrated at pH 8.43.
  • This excluded fraction contains 4.38 g / L of avidin, ie 4.71 g of avidin in total.
  • the avidin extraction yield of this first chromatography is 32%.
  • This avidin-enriched fraction is then further loaded onto 200 ml of S Ceramic Hyper DF resin, now equilibrated to pH 8.
  • the resin is rinsed with a 20 mM acetate buffer of pH 5.
  • the avidin retained on the chromatographic support is then eluted with a 0.5M NaCl solution.
  • the volume of the eluted fraction enriched with avidin is 473 ml. Its avidin concentration is 9.1 g / L, or 4.31 g of avidin in total. The yield of this second chromatography is 91.6%.
  • the overall extraction yield of the process is 28.7%.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf. Ce coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'oeuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. La présente invention concerne également un procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'oeuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir dudit coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'oeuf.

Description

UTILISATION D'UN COPRODUIT ISSU D'UN PROCEDE D'EXTRACTION DU LYSOZYME A
PARTIR DE BLANC D'ŒUF, POUR L'OBTENTION D'AU MOINS
UNE PROTEINE BASIQUE DE BLANC D'ŒUF
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'obtention de protéines, et en particulier de l'extraction et de la purification de protéines.
L'invention concerne plus précisément l'utilisation d'un produit dérivé du blanc d'œuf, pour l'obtention, avantageusement par extraction et par purification, des protéines basiques de blanc d'œuf, en particulier l'avidine.
ART ANTERIEUR
Le blanc d'œuf, ou albumen, est un mélange d'origine naturel qui comprend généralement environ 88 % en poids d'eau et une teneur en matière sèche d'environ 12 % en poids. La matière sèche est constituée majoritairement de protéines (plus de 90 % en poids, par rapport au poids total de matière sèche).
Certaines protéines de blanc d'œuf sont couramment employées en raison de leur activité biologique.
C'est notamment le cas des protéines de blanc d'œuf dites « basiques », présentant un point isoélectrique (ou « pi ») supérieur à 7.
On peut citer en particulier le lysozyme (dont le pi est de l'ordre de 10,7) et l'avidine (dont le pi est de l'ordre de 10), qui font l'objet de nombreuses études et d'une exploitation à l'échelle industrielle.
A titre indicatif, le blanc d'œuf présente une teneur en avidine proche de 0,05 g par litre, et une teneur en lysozyme proche de 3,5 et 4 g par litre. Le rapport massique de l'ensemble « lysozyme plus avidine », par rapport aux protéines totales de blanc d'œuf, est d'environ 0,04.
Le lysozyme est une enzyme naturelle qui a été découverte et caractérisée dans les années 1920.
Le lysozyme est utilisé dans l'industrie pharmaceutique pour son activité antibactérienne contre les bactéries gram-positives. Il altère la paroi cellulaire des bactéries gram-positives, ce qui entraîne la lyse et la mort des cellules. Le lysozyme est efficace contre un certain nombre de bactéries responsables d'infections de l'organisme humain.
Les activités anti-bactériennes du lysozyme sont également utilisées pour réduire ou bloquer la détérioration de certains aliments. L'une des applications commerciales les plus importantes du lysozyme concerne l'affinage de certains fromages, par exemple les fromages de type pâte pressée cuite. Le lysozyme inhibe la croissance de Clostήdium tyrobutyricum, une bactérie qui peut contaminer le lait. La présence de cette bactérie dans le fromage en formation se traduit notamment par, d'une part, la production d'acide butyrique, qui provoque une flaveur anormale, et d'autre part, la génération d'une concentration excessive d'hydrogène et de dioxyde de carbone, qui entraîne des pressions de gaz dans la masse de la pâte de fromage provoquant des fissures et des fendillements dans ladite masse.
On utilise aujourd'hui le lysozyme également pour remplacer les sulfites dans les procédés de vinification. Le lysozyme inhibe les bactéries lactiques et permet de contrôler la fermentation malo-lactique. Il améliore les propriétés organoleptiques (couleur et goût) du vin final. De plus, le vin final qui est exempt de sulfite est mieux toléré par les consommateurs.
L'avidine, qui est également retrouvée dans le blanc d'œuf, est connue principalement pour sa capacité à former un complexe avec la biotine. Ce complexe avidine-biotine a été largement utilisé dans des applications de biotechnologie, notamment pour le diagnostic médical.
Il résulte de ce qui précède que les industriels dans le domaine pharmaceutique et alimentaire ont des besoins croissants en protéines basiques de blanc d'œuf, notamment le lysozyme et l'avidine.
L'accessibilité et la composition du blanc d'œuf, et en particulier celui issu d'œuf de poule, en font une matière première de choix pour la préparation et l'obtention de telles protéines basiques.
Cependant, l'extraction de telles protéines basiques directement à partir du blanc d'œuf présente certaines limites et inconvénients.
C'est en particulier le cas des procédés pour l'extraction et la purification de l'avidine à partir de blanc d'œuf. En effet, cette approche ne permet pas aujourd'hui une production de cette protéine en quantité, qualité ou prix de revient suffisants, pour satisfaire la demande des industriels.
Plus généralement, en partant de blanc d'œuf comme matière première, les procédés de purification d'avidine sont souvent complexes et onéreux à mettre en œuvre, et génèrent des volumes importants de déchets.
A titre d'exemple, on connaît des procédés de purification d'avidine basés sur des techniques de chromatographie d'échange de cations, pour l'extraction et la purification d'avidine à partir de blanc d'œuf.
Le document de brevet canadien n 0 CA- 1 283 072 décrit un procédé pour l'isolement et la séparation, par chromatographie, de lysozyme et d'avidine à partir de blanc d'œuf. Ce procédé consiste à répéter jusqu'à vingt fois un cycle comprenant les étapes de (i) mise en contact du blanc d'œuf avec une résine échangeur de cations faiblement acide, de sorte que le lysozyme et l'avidine soient adsorbés sur ladite résine, puis (ii) de mise en contact de la résine avec un tampon d'élution à faible force ionique, ce qui provoque l'élution du lysozyme à partir de la résine, tandis que l'avidine reste adsorbée. Ce procédé se termine par la mise en contact de la résine comportant l'avidine, avec un tampon d'élution à forte force ionique provoquant l'élution de cette avidine accumulée par adsorption.
L'un des inconvénients du procédé ci-dessus est qu'il nécessite le traitement d'un volume important de blanc d'œuf, et qu'il comprend la mise en œuvre d'un grand nombre d'étapes (correspondant à la répétition des cycles de chargement du blanc d'œuf sur la résine), pour l'obtention d'une quantité significative de protéines d'intérêt.
De plus, le degré de pureté de l'avidine ainsi produite n'est pas très élevé.
Le document de brevet n° CA-2 431 773 décrit également un procédé pour la préparation d'avidine à partir de blanc d'œuf. Ce procédé comprend (i) une étape de lyophilisation d'un blanc d'œuf homogénéisé avec un tampon, suivie (ii) d'une étape de solubilisation du blanc d'œuf lyophilisé dans un tampon, suivie (iii) d'une étape d'incubation du produit lyophilisé re-solubilisé avec un matériau de résine échangeur de cations, puis (iv) une étape de filtration pour séparer le matériau de résine du milieu d'incubation, puis (v) une étape d'élution sélective de l'avidine en utilisant une molécule colorée pour laquelle l'avidine présente une forte affinité.
Pour l'obtention d'une préparation finale d'avidine purifiée, le procédé ci-dessus, qui comprend un grand nombre d'étapes, requiert la mise en œuvre d'une étape finale d'élimination du colorant ajouté pour la réalisation de l'étape d'élution.
Une alternative consiste en l'extraction de l'avidine par chromatographie d'affinité à partir du blanc d'œuf (Heney et Orr, Anal Biochem, 1 14 :92-96, 1981 ; Airenne et al., Gène, 144 : 75- 80, 1997 ; Kusnadi et al., Biotechnol Prog, 14 : 149-155, 1998 ; Hood et al., Adv Exp Med Biol, 464 : 127-147, 1999).
Mais l'extraction d'avidine à grande échelle nécessiterait l'utilisation de grands volumes de support de chromatographie d'affinité ; or ces supports ont un coût très élevé, et cette technique est plutôt utilisée à l'échelle du laboratoire.
Les procédés connus requièrent l'utilisation d'un volume important de blanc d'œuf pour obtenir les quantités désirées de protéines d'intérêt. De plus, l'utilisation de blanc d'œuf génère des volumes importants de déchets dérivés du blanc d'œuf, qu'il serait économiquement important de valoriser.
Ainsi, avec les procédés connus, l'emploi de blanc d'œuf comme matière de départ pour l'obtention de certaines protéines basiques comme l'avidine, entraîne la mise en œuvre d'étapes nombreuses, complexes et/ou onéreuses.
Il existe ainsi un besoin pour de nouveaux procédés d'obtention, notamment par extraction et par purification, de certaines protéines de blanc d'œuf, notamment de protéines basiques comme l'avidine, qui soient alternatifs ou améliorés par rapport aux procédés connus, avantageusement avec un coût de revient plus faible qu'avec les procédés connus. RESUME DE L'INVENTION
II est fourni selon l'invention de nouveaux procédés d'obtention de protéines de blanc d'œuf purifiées, y compris de protéines basiques de blanc d'œuf purifiées, telles que l'avidine purifiée, qui sont avantageux par rapport aux procédés connus.
La présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'un coproduit d'extraction de lysozyme du blanc d'œuf, pour l'obtention (de préférence encore pour l'extraction et la purification) des protéines basiques de blanc d'œuf, lequel coproduit est une solution (avantageusement sous forme d'une saumure) obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
De préférence, ce coproduit consiste en un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration de l'éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant adaptée pour purifier, dans le rétentat de filtration, le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique.
La présente invention concerne aussi l'utilisation du coproduit sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée, qui vérifie les caractéristiques suivantes :
- une conductivité inférieure à 50 mS/cm,
- une concentration d'avidine supérieure à 1g/L,
- un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, supérieure à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1 .
Un autre objet de la présente invention concerne le procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'œuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
Le coproduit est avantageusement un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant adaptée pour purifier le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique dans le rétentat de filtration.
Ce coproduit, employé dans le procédé, est obtenu avantageusement par la succession d'étapes suivantes :
(a) passage du blanc d'œuf sur un support de chromatographie échangeur de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'œuf contenant le lysozyme,
(b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure,
(c) récupération de l'éluat enrichie en lysozyme, issu de l'étape (b), (d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c),
(e) filtration dudit éluat pour purifier dans le rétentat le lysozyme cristallisé, et
(f) récupération du filtrat issu de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt.
De préférence encore, ce coproduit possède les caractéristiques suivantes :
- une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm,
- une concentration en avidine comprise entre 0,05 et 0,8g/L,
- un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.
Encore de préférence, le coproduit utilisé dans le procédé se présente sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée.
Dans ce cas, le coproduit concentré et déminéralisé vérifie avantageusement les caractéristiques suivantes :
- une conductivité inférieure à 50 mS/cm,
- une concentration en avidine supérieure à 1g/L,
- un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.
La présente invention fournit également une composition pour l'extraction et la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, consistant en un coproduit issu d'un procédé d'extraction de lysozyme se présentant sous une forme concentrée et dessalée, lequel coproduit est un filtrat obtenu à l'issue d'un procédé d'extraction du lysozyme, sous une forme concentrée et dessalée, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations. Ce coproduit consiste avantageusement en un filtrat obtenu à l'issue d'une étape de filtration d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations, ladite étape de filtration étant adaptée pour purifier le lysozyme préalablement cristallisé à pH basique dans le rétentat de filtration.
La présente invention concerne également un procédé pour la purification d'avidine, comprenant une opération d'extraction et de purification de l'avidine à partir d'une composition contenant notamment de l'avidine et du lysozyme (avantageusement du blanc d'œuf ou un produit dérivé de blanc d'œuf), laquelle opération d'extraction et de purification de l'avidine comprenant les étapes suivantes :
(a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite composition, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme (avantageusement tout ou au moins approximativement tout le lysozyme), et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme, (b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine (avantageusement tous ces sites),
(c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée, retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 montre le profil HPLC gel filtration (chromatogramme avec valeur de la densité optique à 280nm fonction du temps en minutes), pour évaluer le degré de pureté de l'avidine extrait par le procédé selon l'invention.
La figure 2 montre des profils électrophorétiques répartis sur cinq pistes, pour évaluer le degré de pureté de l'avidine extrait par le procédé selon l'invention : (1 ) coproduit issu d'un procédé d'extraction de lysozyme se présentant sous une forme concentrée et dessalée, (2) lysozyme étalon, (3) avidine purifiée par le procédé selon l'invention, (4) avidine étalon, (5) lysozyme étalon. Les bandes désignées par les repères A a D correspondent respectivement à : (A) ovotransferrine, (B) ovalbumine, (C) avidine et (D) lysozyme.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
La demanderesse s'est attachée à la recherche de nouveaux procédés d'obtention de protéines basiques de blanc d'œuf, avantageusement purifiées, dont le coût de revient est modéré.
Dans ce contexte, la demanderesse a montré qu'un produit dérivé du blanc d'œuf, qui est susceptible d'être obtenu en tant que coproduit dépourvu de valeur marchande et qui est généré au cours de procédés de purification protéique à partir de blanc d'œuf, peut être employé dans des procédés industriels pour l'obtention, et notamment l'extraction et la purification, de protéines basiques de blanc d'œuf.
La demanderesse a en effet montré qu'un des coproduits ou sous-produits issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'œuf, peut constituer un produit de départ utilisable pour l'obtention (avantageusement par extraction et purification) des protéines basiques de blanc d'œuf, principalement l'avidine ou un mélange avidine / lysozyme.
On a ainsi identifié selon l'invention un produit de départ ayant un grand intérêt pour l'obtention (avantageusement l'obtention par extraction et purification) d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, principalement l'avidine ou un mélange avidine / lysozyme.
Seront successivement détaillés ci-dessous (i) le procédé d'obtention du coproduit d'extraction du lysozyme qui est utilisé comme produit de départ pour l'obtention de protéines de blanc d'œuf, puis (ii) le procédé d'obtention de protéines de blanc d'œuf, en particulier l'avidine, dans lequel on utilise le coproduit ci-dessus comme produit de départ. Procédé d'obtention du coproduit utilisé comme produit de départ
Ce produit de départ d'intérêt consiste en un sous-produit ou un coproduit qui est généré lors de la mise en œuvre d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'œuf liquide, ledit procédé d'extraction du lysozyme comprenant :
(i) l'utilisation de blanc d'œuf qui est soumis à une étape de chromatographie d'échange de cations au cours de laquelle une fraction protéique enrichie en lysozyme est retenue sur le support chromatographique,
(ii) une étape d'élution (avantageusement au moyen d'une solution de saumure) et de récupération de la fraction protéique enrichie en lysozyme, et
(iii) une étape d'extraction du lysozyme par cristallisation à pH basique, entraînant en parallèle la production d'un sous-produit ou coproduit appauvri en lysozyme,
ledit sous-produit ou coproduit correspondant au produit d'intérêt qui a été identifié selon l'invention comme produit de départ pour l'obtention d'une protéine basique, avantageusement purifiée, de blanc d'œuf.
Le coproduit d'intérêt, qui est utilisé selon l'invention comme produit de départ dans un procédé d'obtention d'une protéine basique provenant de blanc d'œuf, se présente sous la forme d'une solution obtenue à l'issue de l'étape (iii) ci-dessus d'extraction du lysozyme cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
Le coproduit d'intérêt consiste avantageusement en une solution de saumure (une solution aqueuse d'un sel) présentant un pH basique, dont la composition protéique est différente de celle du blanc d'œuf : il s'agit d'une solution enrichie en protéines basiques, autre que le lysozyme, retenues sur support chromatographique échangeur de cations.
La demanderesse a constaté que ce coproduit, aujourd'hui non valorisé et considéré comme un déchet, est particulièrement riche en certaines protéines basiques de blanc d'œuf, et tout particulièrement en avidine. On a montré selon l'invention que ce coproduit constitue une matière première de départ très intéressante pour l'extraction et la purification de ces protéines d'intérêt.
Plus précisément, le coproduit d'intérêt, qui est utilisé selon l'invention comme produit de départ pour l'obtention (et en particulier la purification) de protéines basiques de blanc d'œuf, est susceptible d'être obtenu par un procédé d'extraction de lysozyme comprenant la succession d'étapes suivantes :
(a) passage du blanc d'œuf liquide sur un support de chromatographie échangeur de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'œuf contenant le lysozyme (et aussi l'avidine),
(b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure, (c) récupération de l'éluat enrichi en lysozyme, issu de l'étape (b),
(d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c),
(e) extraction du lysozyme cristallisé à partir dudit éluat, et
(f) récupération de la solution issue de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt.
On a constaté selon l'invention que la fraction protéique enrichie en lysozyme qui est récupérée dans l'éluat à l'étape (c) comprend aussi d'autres protéines de blanc d'œuf, et notamment de l'avidine. On a aussi montré que le coproduit d'intérêt récupéré à l'étape (f), qui est appauvri en lysozyme, n'a pas été simultanément appauvri en autres protéines de blanc d'œuf. En particulier, ledit coproduit d'intérêt n'a pas été simultanément appauvri en avidine.
Le produit de départ du procédé d'extraction du lysozyme décrit ci-dessus est le blanc d'œuf, encore couramment dénommé albumen.
Le blanc d'œuf provient préférentiellement d'un œuf d'oiseau, avantageusement d'un œuf d'oiseau choisi parmi la poule, la dinde, la pintade, l'oie, la cane, la caille, la faisane, le pigeon et l'autruche.
Le blanc d'œuf utilisé comme produit de départ du procédé ci-dessus est de préférence issu d'un œuf de poule.
Pour la mise en œuvre du procédé d'extraction du lysozyme ci-dessus, le support de chromatographie échangeur de cations est choisi parmi un support échangeur de cations du type acide faible et un support échangeur de cations de type acide fort.
Selon un mode de réalisation préféré, on effectue l'étape d'échange de cations sur un support chromatographique constitué d'un gel rigide, ou semi-rigide, à base de polymères hydrophiles, tels qu'un gel d'agarose réticulé ou non réticulé, un gel de polymère vinylique hydrophile, ou un gel de silice enrobée avec un polymère hydrophile, ou un support polystyrène divinyl benzène, sur le(s)quel(s) polymère(s) hydrophile(s) sont greffés des groupements lui(leur) conférant des propriétés d'échangeur(s) de cations.
Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le greffage du(des) polymère(s), on peut citer (i) les groupements carboxyméthyl du type CM-polyoside pour un revêtement échangeur de cations faible, et (ii) les groupements sulfonate ou méthyl sulfonate (S) ou sulfopropyl (SP) du type SP-polyoside pour un revêtement échangeur de cations fort, qui est apte à adsorber des molécules faiblement ionisées.
Le support de chromatographie d'échange de cations utilisé dans le procédé d'extraction de lysozyme ci-dessus est avantageusement conditionné dans un conteneur équipé d'au moins un moyen d'alimentation en blanc d'œuf de départ, d'au moins un moyen d'évacuation des liquides et d'au moins un moyen pour agiter les particules de support chromatographique dans le liquide à traiter. Il s'agit d'un conditionnement « par lot » (« batch ») du support chromatographique. Le conteneur dans lequel est disposé le support de chromatographie d'échange de cations peut aussi être équipé d'un ou plusieurs moyen(s) d'alimentation en solution tampon, en solution de lavage, ou bien encore en solution pour régénérer le support chromatographique.
De façon préférentielle, préalablement à l'étape (a) de passage sur support de chromatographie, le blanc d'œuf liquide est ajusté à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence de l'ordre de 8,5.
Le support de chromatographie d'échange de cations est avantageusement équilibré à une valeur de pH identique, ou approximativement identique, à la valeur ajustée de pH du blanc d'œuf.
A l'étape (a), le lysozyme contenu dans le blanc d'œuf liquide départ est retenu sur le support de chromatographie d'échange de cations, et la fraction exclue (non retenue sur le support) qui est appauvrie en lysozyme est évacuée du conteneur ou de la colonne de chromatographie.
Après l'étape (a), et préalablement à l'étape (b) d'élution, le support de chromatographie d'échange de cations est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage, préférentiellement avec de l'eau déminéralisée, afin d'éliminer les composants protéiques ou non protéiques de blanc d'œuf non retenus spécifiquement sur le support chromatographique.
La solution de saumure utilisée à l'étape (b) consiste avantageusement en une solution d'élution contenant au moins un contre-ion choisi parmi les cations monovalents suivants Na ou NH4, et/ou les cations bivalents suivants Mg ou Ca.
La concentration en sel de cette solution de saumure est avantageusement ajustée de sorte à obtenir une conductivité comprise entre 70 et 80 mS/cm ; elle est par exemple ajustée à 5 % en NaCI.
A l'étape (d), la cristallisation du lysozyme est sélective. Elle peut être réalisée par ajout de soude (NaOH), sous agitation, jusqu'à ajustement à une valeur de pH comprise entre 8 et 1 1 , et de préférence de l'ordre de 10.
Cette étape peut être mise en œuvre dans un réacteur ou « tank » de cristallisation, bien connu de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation préférentiel des étapes (e) et (f), la séparation entre (i) le lysozyme cristallisé et (ii) le coproduit d'intérêt, est réalisée par filtration de l'éluat issu de l'étape (c) : le lysozyme cristallisé est retrouvé dans le rétentat (dénommé encore « pâte de lysozyme »), et le filtrat issu de l'étape (e) constitue le coproduit d'intérêt appauvri en lysozyme et enrichi en avidine (aussi désigné « saumure sortie de filtre » dans la présente description).
L'opération de filtration ci-dessus, pour la réalisation des étapes (e) et (f) du procédé d'extraction de lysozyme ci-dessus, est par exemple mise en œuvre au moyen d'un filtre presse.
Préférentiellement, le filtre-presse consiste en un filtre presse à bande pressante dont la membrane est avantageusement une membrane de microfiltration avec une taille des pores comprise entre 0,1 et 10 μm. D'autres méthodes et techniques connues de l'homme du métier, peuvent encore être envisagées pour réaliser la séparation entre le lysozyme cristallisé et les autres composants de l'éluat obtenu à l'issue de l'étape (c) du procédé ci-dessus.
On peut par exemple citer une méthode classique de séparation par centrifugation. Dans ce mode de réalisation des étapes (e) et (f) du procédé ci-dessus, le coproduit d'intérêt constitue le surnageant ou centrifugat ; le lysozyme cristallisé est collecté dans le culot de centrifugation.
A l'étape (f) du procédé ci-dessus, on obtient le coproduit d'extraction du lysozyme, utile pour les procédés d'obtention (avantageusement d'extraction et de purification) de protéines basiques de blanc d'œuf selon l'invention, ledit coproduit d'intérêt possédant avantageusement les caractéristiques suivantes :
- une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm,
- une concentration d'avidine comprise entre 0,05 et 0,8 g/L (cette concentration en avidine dépend principalement du nombre de recyclages de la solution de saumure au niveau de l'étape (b) d'élution du lysozyme),
- un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 , (généralement entre 0,1 et 2), et
- un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1 (généralement entre 2 et 25).
Procédé d'obtention d'une protéine basique provenant de blanc d'œuf
En utilisant ledit coproduit, qui est enrichi en particulier en avidine, comme matière première de départ, on peut obtenir (et avantageusement extraire et purifier) au moins une protéine basique de blanc d'œuf par un procédé adapté, qui peut aussi être désigné « procédé d'obtention (avantageusement de purification) d'une protéine basique de blanc d'œuf », est détaillé ci-après dans la présente description.
Les protéines basiques de blanc d'œuf, qui sont obtenues en réalisant ledit procédé d'obtention d'une protéine basique de blanc d'œuf décrit ci-après, peuvent être utilisées en tant que telles dans toutes applications industrielles appropriées.
Par « obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf », on désigne principalement un procédé de purification, et encore principalement :
(i) la séparation entre un mélange de lysozyme et d'avidine, et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ;
(ii) la séparation entre l'avidine et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ;
(iii) la séparation entre le lysozyme et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ; et
(iv) la séparation entre une protéine basique de blanc d'œuf, autre que l'avidine ou le lysozyme, et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt. La purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf peut englober, outre la séparation entre la protéine basique d'intérêt et les autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt, également la séparation entre la protéine basique d'intérêt et des constituants non protéiques dudit coproduit, tels que des sucres, des sels minéraux, des acides aminés, des vitamines, etc.
La purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf est dite « sélective » parce qu'on récupère avantageusement (i) soit un mélange purifié d'une ou plusieurs protéines basiques de blanc d'œuf d'intérêt, (ii) soit une protéine basique de blanc d'œuf d'intérêt sous forme purifiée. Dans la pratique, on récupère « sélectivement » de préférence soit l'avidine purifiée, soit le lysozyme purifié, soit un mélange purifié d'avidine et de lysozyme.
Par « obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf », on désigne encore notamment un procédé dit « d'enrichissement » pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf sous une forme enrichie. Ce procédé vise en particulier à modifier le ratio d'au moins une protéine basique d'intérêt contenue dans ledit coproduit d'intérêt, par rapport à ses autres constituants.
Dans ce cas, on désigne principalement :
(i) l'enrichissement en lysozyme et en avidine, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ;
(ii) l'enrichissement en avidine, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt ;
(iii) l'enrichissement en une protéine basique de blanc d'œuf, autre que l'avidine ou le lysozyme, par rapport aux autres constituants protéiques dudit coproduit d'intérêt.
L'enrichissement en au moins une protéine basique de blanc d'œuf permet en particulier de récupérer le coproduit enrichi en une ou plusieurs protéines basiques, en comparaison audit coproduit avant enrichissement.
Tout protocole adapté peut être utilisé à cet effet, selon des méthodes employées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement par précipitation et/ou filtration, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
Pour l'obtention des protéines basiques de blanc d'œuf, et en particulier pour l'extraction et la purification, le coproduit d'extraction du lysozyme est avantageusement utilisé sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée, pour obtenir un produit enrichi en protéines basiques d'intérêt.
Ce coproduit concentré et dessalé est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) éventuelle débactérisation préalable du coproduit d'extraction du lysozyme, avantageusement par microfiltration,
(b) ajustement du pH dudit coproduit, au moyen d'un acide minéral ou organique, (c) concentration du coproduit acidifié à l'étape (b), de préférence par filtration (par exemple par ultrafiltration, nanofiltration ou osmose inverse), jusqu'à obtenir un coproduit concentré contenant avantageusement au moins 1 g/L d'avidine,
(d) déminéralisation/dessalage du coproduit concentré issu de l'étape (c), de façon à obtenir un coproduit concentré dont la teneur en sel est réduite à une conductivité préférentiellement inférieure à 50 mS/cm.
A l'étape (b), le pH est ajusté à une valeur inférieure à 7,5, de préférence à une valeur allant de 7,5 à 2,5.
Dans certains modes de réalisation, la valeur du pH est avantageusement ajustée à l'étape (b), de sorte à atteindre une valeur proche de la neutralité (de préférence encore entre 6,5 et 7,5), avant d'être concentré par l'étape de filtration (c).
La demanderesse a par ailleurs montré que l'ajustement à pH acide du coproduit d'extraction du lysozyme, à l'étape (b) du procédé, de préférence à une valeur de pH allant de 2,5 à 4,5 (avantageusement de l'ordre de 3), permet d'optimiser significativement l'efficacité de l'étape (c) de concentration en avidine dans le coproduit concentré, en particulier dans le cas d'une technique de filtration, et de préférence encore dans le cadre d'une technique d'ultrafiltration ; et cela permet d'obtenir des niveaux de concentration élevés en avidine.
Ainsi, dans certains modes de réalisation, la valeur du pH est avantageusement ajustée à l'étape (b), à une valeur de pH allant de 2,5 à 4,5 (avantageusement de l'ordre de 3), avant d'être concentré par l'étape de filtration (c).
A l'étape (c) lorsque la concentration du coproduit acidifié est réalisée par ultrafiltration, la membrane d'ultrafiltration possède préférentiellement un seuil de coupure supérieur à 10 000 Da.
La demanderesse a découvert qu'une membrane dont le seuil de coupure est de 100 000 Da, permet d'augmenter d'un facteur 10 à 50 le ratio avidine/lysozyme de la fraction rétentat.
Comme cela est décrit ci-après, l'ajustement du rapport avidine/lysozyme dépend avantageusement de la protéine d'intérêt à obtenir ensuite.
L'étape (d) de déminéralisation/dessalage peut être effectuée par toute technique connue de l'homme de l'art, par exemple par nanofiltration ou ultrafiltration avec diafiltration, en utilisant des membranes de nanofiltration ou ultrafiltration. L'étape (d) de déminéralisation/dessalage peut encore être effectuée par électrodialyse ou par passage sur une résine échangeuse d'ions.
De manière à optimiser les opérations suivantes d'extraction et de purification, le coproduit concentré et déminéralisé/dessalé qui est obtenu à l'étape (d) vérifie avantageusement les caractéristiques suivantes :
- une conductivité inférieure à 50 mS/cm (et de préférence 2 à 15 mS/cm),
- une concentration d'avidine supérieure à 1 g/L (et de préférence de 3 à 15 g/L), - un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales supérieur à 0,1 (et de préférence supérieur à 1 ), et
- un rapport massique avidine/lysozyme supérieur à 0,1 (et de préférence supérieur à 2).
La valeur de conductivité est mesurée préférentiellement à l'aide d'un conductimètre.
La concentration en avidine est de préférence déterminée par la méthode colorimétrique au HABA (4-Hydroxyazobenzene-2-Carboxylic Acid) selon Green et al (Biochem J, 94: 23-24, 1965) modifiée par Durance et al (J Food Sci, 56(3): 707-709, 1991 ).
L'avidine est détectée avantageusement soit par le test HABA, soit par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
Le lysozyme est par exemple détecté soit par HPLC en gel de filtration selon la méthode de Thapon et al (Sci ANm 2 : 251 -260, 1982), soit par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
La concentration en lysozyme est déterminée par exemple par mesure de son activité lytique sur des cellules de Micrococcus lysodeikticus selon la méthode de Litwack (Proc Soc Exp Biol & Med, 89 : 104, 1955) et Prockop et al (New Eng J Med, 240 : 269,1964).
La concentration en protéines totales est déterminée, à titre d'exemple, par la méthode de Kjeldhal.
Le rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales est calculé à partir des données analytiques décrites ci-dessus.
L'utilisation ultérieure du coproduit concentré et dessalé/déminéralisé obtenu à la fin de l'étape (d) dépend avantageusement de son ratio avidine/lysozyme.
En pratique, les fractions dont le ratio massique avidine/lysozyme est élevé (c'est-à-dire de préférence supérieure à 5), seront privilégiées pour la purification et l'extraction ultérieure de l'avidine.
A l'inverse, les fractions dont le ratio massique avidine/lysozyme est plus faible (c'est-à- dire avantageusement inférieur à 5), seront avantageusement utilisées en vue de l'exploitation ultérieure des propriétés du mélange enrichi en avidine / lysozyme.
Le produit concentré et dessalé obtenu à la fin de l'étape (d) peut aussi être traité de manière à permettre sa conservation dans le temps.
Le traitement de conservation, connu de l'homme du métier, peut être du type séchage, lyophilisation ou conditionnement et stabilisation par réfrigération (température allant entre -5°C et +40C) ou congélation (température inférieure à -5°C, mieux inférieure à -2O0C, avantageusement inférieure à -8O0C).
La présente invention concerne aussi un procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, qui est particulièrement adapté à l'utilisation du coproduit d'extraction de lysozyme décrit ci-dessus comme produit de départ, ledit coproduit d'extraction de lysozyme étant avantageusement sous forme concentrée et déminéralisée. La demanderesse a en particulier mis au point un procédé d'extraction d'une protéine basique provenant de blanc d'œuf dans lequel on a recours à une technique de chromatographie dite en mode « frontal ».
Par chromatographie en mode « frontal », on entend une méthode de séparation d'un composé d'intérêt par chromatographie selon laquelle :
(i) on fournit un support de chromatographie conditionné dans une colonne comprenant (i) au moins un moyen d'alimentation en continu de ladite colonne en solution de départ contenant ledit composé d'intérêt, destiné à être mis en contact avec ledit support de chromatographie et (ii) au moins un moyen d'évacuation du liquide ayant été mis en contact avec ledit support de chromatographie,
(ii) on alimente ladite colonne de chromatographie avec un flux continu d'une solution contenant un composé d'intérêt à extraire ou purifier, afin que ladite solution soit mise en contact en continu avec le support de chromatographie conditionné dans la colonne, la partie de ladite solution ayant été en contact avec le support de chromatographie étant évacué de la colonne également en continu, et l'alimentation de la colonne de chromatographie avec ladite solution étant poursuivie jusqu'à ce que les molécules dudit composé d'intérêt saturent ledit support de chromatographie et que ledit composé d'intérêt soit détecté dans le flux de sortie de la colonne.
En d'autres termes, lorsqu'on réalise une étape de chromatographie en mode « frontal », on poursuit l'alimentation de la colonne de chromatographie avec la solution contenant le composé d'intérêt à extraire ou purifier, jusqu'à dépasser la capacité de fixation dudit support pour ledit composé d'intérêt.
Le support de chromatographie étant saturé et une fois qu'une molécule commence à être éluée du support, elle est présente continuellement dans la fraction exclue. Les molécules ayant peu ou pas d'affinité pour le support de chromatographie sont récupérées dans la fraction exclue avant les molécules ayant une plus grande aptitude à être retenues par le support de chromatographie.
La demanderesse a en particulier mis au point une méthode de chromatographie, en mode frontal, permettant d'atteindre des niveaux de pureté en avidine très élevés (avantageusement supérieurs à 99 %) en seulement deux étapes, et avec des rendements satisfaisants (avantageusement 30 à 60 % de l'avidine présente dans le coproduit concentré/déminéralisé, fonction en particulier de son ratio massique avidine/lysozyme : plus le ratio avidine/lysozyme est élevé, plus le rendement d'extraction est élevé).
Le procédé d'extraction ou de purification d'une protéine basique provenant du blanc d'œuf selon l'invention consiste en un procédé à trois étapes dans lequel on réalise deux étapes successives de chromatographie, ledit procédé d'extraction comprenant les étapes suivantes : (a) dans une première étape, charger un support chromatographique au-delà de ses capacités de fixation (ou d'adsorption) avec un flux continu de coproduit d'extraction de lysozyme décrit précédemment, de telle sorte que le lysozyme retenu sur ledit support empêche la rétention de l'avidine, ce qui permet d'obtenir une fraction exclue appauvrie, voir dépourvue, en lysozyme (« délysozymée ») et contenant une grande partie ou la totalité de l'avidine initialement présente dans le volume de coproduit mis en contact avec le support chromatographique, et
(b) dans une seconde étape, charger un support chromatographique avec la fraction exclue délysozymée obtenue à l'étape (a), le cas échéant au-delà de la capacité de fixation (ou adsorption) dudit support chromatographique, de telle sorte que les sites de fixation (ou adsorption) soient occupés par l'avidine,
(c) éluer l'avidine retenue sur le support chromatographique à l'étape (b).
On a montré dans les exemples que le procédé d'extraction ci-dessus, qui a été mis au point par la demanderesse, permet l'obtention d'une avidine très pure, et avec un rendement important.
Selon un mode préféré de réalisation du procédé d'extraction ou de purification d'une protéine basique de blanc d'œuf de l'invention, les étapes suivantes peuvent être mises en œuvre :
(a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec le coproduit d'extraction de lysozyme sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la partie de la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme,
(b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite partie de fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation (le cas échéant tous ses sites) soient occupés par l'avidine,
(c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).
Le support chromatographique échangeur de cations utilisé à l'étape (a) et à l'étape (b) est choisi parmi un support chromatographique échangeur de cations du type faible ou un support chromatographique échangeur de cations du type fort.
Selon un mode de réalisation préféré, on effectue l'étape d'échange cationique sur un support chromatographique constitué d'un gel rigide, ou semi-rigide, à base de polymères hydrophiles, tels qu'un gel agarose éventuellement réticulé, un gel de polymère vinylique hydrophile, ou un gel de silice enrobée avec un polymère hydrophile, ou un support polystyrène divinyl benzène, sur lequel polymère hydrophile sont greffés des groupements conférant audit polymère et audit gel des propriétés d'échangeur de cations. Parmi les groupements fonctionnels susceptibles d'être utilisés pour le greffage du(des) polymère(s), on peut citer (i) les groupements carboxyméthyl du type CM-polyoside pour un revêtement échangeur de cations faible, et (ii) les groupements sulfonate ou méthyl sulfonate (S) ou sulfopropyl (SP) du type SP-polyoside pour un revêtement échangeur de cations fort, qui est apte à adsorber des molécules faiblement ionisées.
Par exemple, le support chromatographique échangeur de cations est sélectionné parmi le groupe suivant : S Hyper DF, S Ceramic Hyper DF, SP Spherodex LS, Streamline SPXL, CM Hyper DF, CM Sepharose, Biorex 70, Duolite C464, Amberlite IRC 50, CG-50, DP-1 , IRC-72 et 64, Rexyn 102, Merck IV, Zeocarb 226, Diaion WK 10 et WK 1 1 , IMAC Z-5, CP-3050, et Wofafit CP300.
Selon un mode préférentiel de réalisation, le support de chromatographie échangeur de cations utilisé à l'étape (a) est identique à celui utilisé à l'étape (b) ; il suffit par exemple de régénérer le support entre les étapes (a) et (b).
De façon préférentielle, préalablement à l'étape (a), le coproduit concentré et dessalé est ajusté, d'une part, à une valeur de conductivité comprise entre 5 et 60 mS/cm, de préférence entre 5 et 10 mS/cm, et d'autre part, à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence encore de l'ordre de 8,5. Cette opération permet de maximiser la capacité de fixation du support et de privilégier l'adsorption des protéines basiques, et notamment le lysozyme, et d'exclure les autres protéines contenues dans le coproduit concentré et dessalé. De préférence, le support de chromatographie est équilibré à des valeurs de conductivité et de pH identiques, ou au moins proches, aux valeurs de conductivité et de pH du produit appliqué.
A la suite de cette étape d'ajustement de la conductivité et du pH, le coproduit concentré et dessalé est avantageusement soumis à une étape de décantation, centrifugation ou filtration, afin d'éliminer les éventuels constituants insolubles pouvant gêner les étapes de chromatographie suivantes.
L'avidine et/ou le lysozyme sont détectés et/ou quantifiés dans le fluide de sortie de chromatographie.
Cette opération peut être mise en œuvre par toute technique connue de l'homme du métier, et citée précédemment.
Au cours du premier passage selon l'étape (a), l'avidine et le lysozyme sont détectés et/ou quantifiés dans le fluide de sortie de chromatographie (selon par exemple une technique décrite ci-dessus, directement ou dans une fraction exclue), de sorte à récupérer exclusivement la fraction exclue contenant l'avidine (et éventuellement d'autres protéines basiques de blanc d'œuf) et dépourvue de lysozyme (tenant compte de la sensibilité du test de détection / quantification).
De préférence, les fractions exclues récupérées sont celles ne contenant aucune trace de lysozyme détectable. Ces fractions exclues récupérées sont regroupées pour former la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme.
Selon d'autres modes de réalisation préférentiels de réalisation du procédé d'extraction, préalablement à l'étape (b), la fraction exclue et collectée à la fin de l'étape (a), qui est enrichie en avidine, est ajustée à une valeur de pH comprise entre 7 et 10, et de préférence de l'ordre de 8,5.
Cette opération permet de maximiser la capacité de fixation du support et de privilégier l'adsorption de l'avidine, et de favoriser l'exclusion des autres protéines contenues dans le milieu.
Préférentiellement, préalablement à l'étape (b) dudit procédé, le support de chromatographie est équilibré à des valeurs de conductivité et de pH identiques, ou au moins proches, de celles du produit appliqué.
Au cours de l'étape (b), l'avidine est avantageusement détectée et/ou quantifiée dans le fluide de sortie de chromatographie (directement ou dans une fraction exclue), de sorte à interrompre ou arrêter le passage dès qu'une certaine concentration d'avidine est détectée (correspondant à la saturation des sites de fixation du support de chromatographie par l'avidine).
De préférence encore, on procède à l'arrêt du passage de la fraction exclue à l'étape (b), lorsque de l'avidine est détectée en sortie de colonne chromatographique.
Avant l'étape (c) d'élution et de collecte de la fraction d'éluat comprenant l'avidine purifiée, le support de chromatographie peut être rincé, par exemple au moyen d'eau ou d'un tampon (par exemple un tampon acétate).
L'étape (c) d'élution et de collecte de la fraction d'éluat comprenant l'avidine purifiée est mise en œuvre selon une technique connue de l'homme du métier, avantageusement en augmentant le pH vers des valeurs proches de 10 avec un tampon glycine-NaOH ou carbonate- bicarbonate par exemple, ou en augmentant la force ionique du tampon d'élution avec une solution saline (par exemple 0,5 M en NaCI).
Lorsque l'étape (c) d'élution est réalisée par augmentation de la force ionique, la solution utilisée consiste avantageusement en une solution d'élution contenant au moins un contre-ion choisi parmi les cations monovalents suivants Na ou NH4, et/ou les cations bivalents suivants Mg ou Ca.
Par exemple, la solution utilisée pour l'élution peut consister en une solution à 0,5 M d'un sel de NaCI ou KCI.
L'utilisation du coproduit d'extraction du lysozyme identifié par la demanderesse (et décrit avec son procédé d'obtention précédemment dans la présente description), comme matière première de départ dans le présent procédé d'extraction en mode frontal selon la présente invention, s'avère en pratique d'un très grand intérêt industriel, du fait qu'il permet l'obtention d'une grande quantité d'avidine, de haute pureté (avantageusement supérieure à 99 % de pureté, selon une technique de chromatographie de gel filtration). Le rendement global du procédé d'extraction d'avidine ci-dessus et la perte matière ne constituent pas un aspect critique du procédé, puisque le coproduit d'extraction du lysozyme qui est employé comme matière première de départ était dépourvu, jusqu'à la présente invention, de valeur marchande.
Plus généralement, la conduite de l'étape (a) de chromatographie en mode « frontal », et le cas échéant aussi de l'étape (b), permet également d'éviter les problèmes de changement d'échelle qui sont classiquement rencontrés pour les procédés chromatographiques, puisqu'il n'y a pas ici de gradient d'élution qu'il serait nécessaire d'optimiser. On peut donc très simplement passer d'un support chromatographique de quelques millilitres, à un support chromatographique de plusieurs litres, selon les quantités d'avidine à purifier, sans adaptation ou modification substantielle des caractéristiques générales du procédé.
La réalisation de l'étape (a), et le cas échéant aussi de l'étape (b), selon une technique de chromatographie en mode « frontal », permet également de travailler avec des volumes réduits de support de chromatographie. A titre indicatif, on peut obtenir jusqu'à environ 25 à 30 g d'avidine purifiée, en utilisant un litre de support de chromatographie.
On ajoute que le procédé chromatographique frontal en deux étapes peut également être mis en œuvre pour extraire et purifier le lysozyme résiduel contenu dans le coproduit d'extraction du lysozyme concentré et dessalé.
Pour purifier le lysozyme résiduel, on met en œuvre un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) chargement d'un support de chromatographie échangeur de cations avec un coproduit d'extraction de lysozyme sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme,
(b) lavage du support de chromatographie sur lequel est retenu le lysozyme, avec une solution de lavage appropriée, telle qu'un tampon de phosphate de sodium 20 mM à pH 8,5,
(c) élution du lysozyme retenu sur le support de chromatographie au moyen d'une solution d'élution adaptée, par exemple par modification du pH (par exemple par fixation du pH à une valeur comprise entre 10 et 1 1 ) ou modification de la force ionique (par exemple au moyen d'une solution de NaCI 1 M), et
(d) collecte de la fraction d'éluat contenant le lysozyme purifié, retenu sur ledit support au cours du premier passage selon l'étape (a) du coproduit d'extraction du lysozyme concentré et dessalé.
Plus généralement, ce procédé de chromatographie frontal en deux étapes peut être mis en œuvre à partir de toute autre solution contenant un mélange d'avidine et de lysozyme, à savoir en particulier du blanc d'œuf ou tout autre produit dérivé de blanc d'œuf. Cette solution contient avantageusement un rapport avidine/lysozyme supérieur à 1 ,5. On englobe aussi comme produit de départ du procédé d'extraction d'avidine selon l'invention toute solution d'origine recombinante issue d'un système bactérien ou eucaryote.
EXEMPLES
Exemple 1 : procédé de concentration et de déminéralisation d'un coproduit d'extraction du Ivsozvme à partir de blanc d'œuf
Matériau de départ
129,8 kg d'un coproduit d'extraction de lysozyme fourni par la société OVONOR (62232 ANNEZIN, France), présentant les caractéristiques suivantes :
- une conductivité de l'ordre de 67 mS/cm,
- une concentration d'avidine de 0,296 g/L,
- un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 0,1 ,
- un rapport massique avidine/lysozyme de l'ordre de 2,
- une valeur de pH de l'ordre de 10.
Ce coproduit a été obtenu par la succession d'étapes suivantes :
- ajustement d'un blanc d'œuf de poule à une valeur de pH de 8,5,
- passage de ce blanc d'œuf de poule acidifié sur un support de chromatographie d'échange de cations Purolite C106 EP (support acrylique greffé au divinyl benzène et aux groupements fonctionnels COOH), en batch,
- rinçage du support chromatographique avec de l'eau déminéralisée,
- élution au moyen d'une solution de NaCI à 5%,
- cristallisation du lysozyme contenu dans la solution d'élution, au moyen d'une solution de NaOH avec ajustement du pH à une valeur de 10,
- filtration de la solution saline de lysozyme cristallisé sur un filtre presse, utilisant une membrane de microfiltration.
Concentration et déminéralisation du matériau de départ
Le coproduit obtenu est tout d'abord acidifié au moyen d'une solution d'acide chlorhydrique 5 M, jusqu'à ajuster son pH à une valeur de l'ordre de 3,15.
Le coproduit acidifié est ensuite concentré par ultrafiltration, au moyen d'une membrane dont le seuil de coupure est de 10 kDa (« Molecular Weight Cut Off » ou « MWCO » 10 kDa), et la surface est de 2,5 m2.
Cette opération d'ultrafiltration est effectuée avec un débit de rétentat de 965 L/h, une pression d'entrée de 1 ,85 bar et un débit moyen de perméat de 20 L/h.
Le coproduit acidifié et concentré est ensuite soumis à une opération de diafiltration sur membrane d'ultrafiltration, avec un débit moyen de perméat de l'ordre de 40 L/h. Le rétentat obtenu, enrichi en protéines basiques, présente un poids de 1 1 ,84 kg, et comporte les caractéristiques suivantes :
- une conductivité de 7,5 mS/cm,
- une concentration en avidine de 3,24 g/L,
- un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 0,1 , et
- un rapport massique avidine/lysozyme, de l'ordre de 2.
Exemple 2 : Extraction de l'avidine à partir du coproduit concentré et déminéralisé d'extraction du Ivsozyme
Matériau de départ
Le coproduit d'extraction utilisé présente les caractéristiques suivantes :
- un pH initial de 6,55
- une conductivité de 2,54 mS/cm,
- une concentration d'avidine de 7,48 g/L,
- un ratio avidine /lysozyme de 3,
- un rapport massique (lysozyme + avidine)/protéines totales, de l'ordre de 1 .
Procédé d'extraction et de purification de l'avidine
La première chromatographie a été réalisée sur 200 mL d'une colonne de résine S Ceramic Hyper DF équilibré à pH 8,43.
Un volume de 2009 mL de coproduit concentré et dessalé (soit 15,02 g d'avidine) est chargé sur cette colonne de chromatographie.
Les résultats des dosages en avidine et lysozyme sur les fractions exclues, en sortie de colonne, sont représentés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Concentration d'avidine et détection du lysozyme, dans la fraction exclue
En sortie de support, un volume de 1075 mL de la fraction exclue est récupéré, contenant les protéines du coproduit concentré-dessalé, notamment l'avidine, à l'exception du lysozyme.
Cette fraction exclue contient 4,38 g/L d'avidine, soit 4,71 g d'avidine au total. Le rendement d'extraction en avidine de cette première chromatographie est de 32 %.
Cette fraction enrichie en avidine est ensuite encore chargée sur 200 mL de résine S Ceramic Hyper DF, équilibrée maintenant à pH 8.
Après le chargement du support, la résine est rincée avec un tampon acétate 20 mM de pH 5.
L'avidine retenue sur le support de chromatographie est ensuite éluée au moyen d'une solution de NaCI 0,5 M.
Le volume de la fraction éluée enrichie en avidine est de 473 mL. Sa concentration d'avidine est de 9,1 g/L, soit 4,31 g d'avidine au total. Le rendement de cette deuxième chromatographie est de 91 ,6 %.
Le rendement global d'extraction du procédé est de 28,7 %.
Evaluation du degré de pureté de l'avidine Le degré de pureté de l'avidine extraite est évalué par gel filtration HPLC (Colonne TSK
SW XL G3000, tampon phosphate 50 mM + 200 mM de NaCI, pH 7, débit 0,7 mL/min, détection 280 nm). Le degré de pureté mesuré est de 100 % (figure 1 ).
La pureté de l'avidine ainsi produite est également estimée par électrophorèse sur gel polyacrylamide en présence de SDS. On observe alors une unique bande (figure 2, piste 3).

Claims

REVENDICATIONS
1.- Utilisation d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'œuf, pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
2.- Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ledit coproduit est obtenu par la succession d'étapes suivantes :
(a) passage du blanc d'œuf sur un support de chromatographie échangeur de cations, pour la rétention d'une fraction protéique de blanc d'œuf contenant le lysozyme,
(b) élution de la fraction protéique enrichie en lysozyme retenue sur ledit support de chromatographie au cours de l'étape (a), au moyen d'une solution de saumure,
(c) récupération de l'éluat enrichie en lysozyme, issu de l'étape (b),
(d) cristallisation à pH basique du lysozyme contenu dans ledit éluat obtenu à l'étape (c),
(e) filtration dudit éluat pour purifier dans le rétentat le lysozyme cristallisé, et
(f) récupération du filtrat issu de l'étape (e), formant le coproduit d'intérêt.
3.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit coproduit possède les caractéristiques suivantes :
- une conductivité comprise entre 60 et 100 mS/cm,
- une concentration en avidine comprise entre 0,05 et 0,8g/L,
- un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.
4.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le coproduit est utilisé sous une forme concentrée et dessalée/déminéralisée.
5.- Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le coproduit concentré et déminéralisé vérifie les caractéristiques suivantes :
- une conductivité inférieure à 50 mS/cm,
- une concentration en avidine supérieure à 1g/L,
- un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.
6.- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le coproduit est utilisé pour l'obtention d'avidine purifiée.
7.- Procédé pour la purification d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, comprenant une opération d'extraction et de purification de ladite protéine basique à partir d'un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme à partir de blanc d'œuf, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
8.- Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, préalablement à l'opération d'extraction et de purification de la protéine basique d'intérêt, ledit coproduit est soumis à une opération de préparation comprenant une étape de concentration et une étape de dessalage/déminéralisation.
9.- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape de concentration est réalisée par ultrafiltration, et en ce que, préalablement à ladite étape de concentration, ledit coproduit est acidifié afin d'ajuster son pH à une valeur inférieure à 7,5, de préférence à une valeur allant de 7,5 à 2,5.
10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'opération d'extraction et de purification permet la purification d'avidine.
1 1.- Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite opération d'extraction et de purification de l'avidine comprend les étapes suivantes :
(a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ledit coproduit sous forme concentrée et dessalée, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme,
(b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine,
(c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).
12.- Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que le support de chromatographie échangeur de cations utilisé à l'étape (a) est identique à celui utilisé à l'étape (b).
13.- Composition pour l'obtention d'au moins une protéine basique de blanc d'œuf, caractérisée en ce qu'elle consiste en un coproduit issu d'un procédé d'extraction du lysozyme, sous une forme concentrée et dessalée, lequel coproduit est une solution obtenue à l'issue d'une étape d'extraction du lysozyme préalablement cristallisé à pH basique à partir d'un éluat contenant la fraction protéique de blanc d'œuf retenue sur un support de chromatographie échangeur de cations.
14.- Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle vérifie les caractéristiques suivantes :
- une conductivité inférieure à 50 mS/cm,
- une concentration en avidine supérieure à 1g/L,
- un rapport massique (lysozyme+avidine)/protéines totales, supérieur à 0,1 et
- un rapport massique avidine/lysozyme, supérieur à 0,1.
15.- Procédé pour la purification d'avidine, comprenant une opération d'extraction et de purification de l'avidine à partir d'une composition contenant de l'avidine et du lysozyme, laquelle opération d'extraction et de purification de l'avidine comprend les étapes suivantes :
(a) un premier passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite composition, le chargement dudit support s'effectuant au-delà de ses capacités de fixation de sorte, d'une part, à retenir le lysozyme, et d'autre part, à récupérer la fraction exclue enrichie en avidine et dépourvue de lysozyme,
(b) un second passage sur un support de chromatographie échangeur de cations avec ladite fraction exclue obtenue à la fin de l'étape (a), le chargement dudit support s'effectuant de telle sorte que ses sites de fixation soient occupés par l'avidine,
(c) l'élution et la collecte de la fraction d'éluat contenant l'avidine purifiée retenue sur ledit support au cours de l'étape (b).
EP10754354A 2009-07-09 2010-07-08 Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf Pending EP2451825A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0954778A FR2947818B1 (fr) 2009-07-09 2009-07-09 Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf
PCT/FR2010/051450 WO2011004129A1 (fr) 2009-07-09 2010-07-08 Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2451825A1 true EP2451825A1 (fr) 2012-05-16

Family

ID=41557654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP10754354A Pending EP2451825A1 (fr) 2009-07-09 2010-07-08 Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2451825A1 (fr)
FR (1) FR2947818B1 (fr)
WO (1) WO2011004129A1 (fr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013045916A1 (fr) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chaînes légères substituts (cls) chimères comprenant vpreb humain
CN102978186B (zh) * 2012-11-28 2015-03-11 华南理工大学 利用咸蛋清制备溶菌酶、呈味基料及蛋黄油的方法
CN117050854B (zh) * 2023-07-14 2024-07-23 江苏天成蛋业有限公司 一种鸡蛋清中溶菌酶提取用制备装置及其使用方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1283072C (fr) 1986-12-01 1991-04-16 Timothy Durance Procede d'isolement et de separation du lysozyme et de l'avidine du blanc d'oeuf
DE3726655A1 (de) * 1987-08-11 1989-02-23 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten
JP2006515559A (ja) * 2002-05-23 2006-06-01 インディアン インスティチュート オブ テクノロジー 糖タンパク質であるアビジンを単離および精製するプロセス
CA2431773A1 (fr) 2002-08-02 2004-02-02 Indian Institute Of Technology Procede pour purifier une glycoproteine avidine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2011004129A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2947818B1 (fr) 2011-07-29
WO2011004129A1 (fr) 2011-01-13
FR2947818A1 (fr) 2011-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0022696B2 (fr) Produit enrichi en alpha-lactalbumine, obtention à partir de lactosérum et applications dudit produit
EP3300610B1 (fr) Procede de fractionnement des solubles de pois
EP0069137B1 (fr) Procede de preparation de boissons naturelles a faible teneur alcoolique, boissons et produits divers obtenus par mise en oeuvre de ce procede
EP1540020B1 (fr) Procede de pre paration de sucre cristallise a partir d'une solution aqueuse sucre e contenant des anions et des cations monovalents et polyvalents
JP2003522539A (ja) 酪農水流の濾過方法
JP3110078B2 (ja) 高純度抗菌性ペプチドの大量製造法
EP2094366B1 (fr) Procede de purification de sialyllactose par chromatographie
FR2562067A1 (fr) Procede pour la separation d'un aminoacide basique de son bouillon de fermentation
CN1871206A (zh) 浓缩天然茶氨酸提取物的方法
Belleville et al. Nanofiltration in the food industry
EP2451825A1 (fr) Utilisation d'un coproduit issu d'un procede d'extraction du lysozyme a partir de blanc d'oeuf, pour l'obtention d'au moins une proteine basique de blanc d'oeuf
EP0178957B1 (fr) Procédé pour l'obtention de lysozyme par microfiltration à partir d'une matière à base de blanc d'oeuf
FR2897238A1 (fr) Procede de purification de la thaumatine
EP1297116A2 (fr) Procede d'isolement et de purification d'une proteine, et proteine obtenue
FR2473523A1 (fr) Procede de separation des proteines du serum sanguin par ultrafiltration a travers une membrane
FR2573757A1 (fr) Procede de separation de l-phenylalanine d'une solution la contenant
Novalin et al. Renewable resources–green biorefinery: separation of valuable substances from fluid–fractions by means of membrane technology
JP3946747B2 (ja) ラクトパーオキシダーゼの製造方法
JP2003092996A (ja) イミダゾールジペプチド類含有組成物の製造方法
EP0284525A1 (fr) Procédé pour extraire des protéines du lactosérum, par adsorption et élution
FR2479834A1 (fr) Procede de purification des glucosaminoglucanes
FR2560188A1 (fr) Procede de separation de la phenylalanine et de l'acide cinnamique
Bru et al. Liquid chromatographic determination of amino acid enantiomers by derivatization with o-phthaldialdehyde and chiral thiols Applications with reference to food science
RU2017428C1 (ru) Способ разделения молочной сыворотки
CN117736265A (zh) 海鲜菇甜味肽及其提取方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20120110

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: CROGUENNEC, THOMAS

Inventor name: GUERIN-DUBIARD, CATHERINE

Inventor name: PASCO, MARYVONNE

Inventor name: NAU, FRANCOISE

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE

Owner name: INSTITUT SUPERIEUR DES SCIENCES AGRONOMIQUES, AGRO

DAX Request for extension of the european patent (deleted)