EP2446460A1 - Functional check and variance compensation in mass spectrometry - Google Patents

Functional check and variance compensation in mass spectrometry

Info

Publication number
EP2446460A1
EP2446460A1 EP10725193A EP10725193A EP2446460A1 EP 2446460 A1 EP2446460 A1 EP 2446460A1 EP 10725193 A EP10725193 A EP 10725193A EP 10725193 A EP10725193 A EP 10725193A EP 2446460 A1 EP2446460 A1 EP 2446460A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mass
target analyte
test method
separation system
chromatographic separation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10725193A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Michael Vogeser
Roland Geyer
Werner Hälg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tecan Trading AG
Original Assignee
Tecan Trading AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tecan Trading AG filed Critical Tecan Trading AG
Publication of EP2446460A1 publication Critical patent/EP2446460A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0009—Calibration of the apparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8665—Signal analysis for calibrating the measuring apparatus
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0036—Step by step routines describing the handling of the data generated during a measurement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • the invention relates according to the preamble of independent claim 1, a method for controlling the function of a mass spectrometer, according to the preamble of independent claim 2, a method for compensating variances in mass spectrometry and according to the preamble of claim 12, a device for performing this function check or this compensation method for mass spectrometers.
  • Chromatographic and in particular chromatographic mass spectrometric analysis methods are of essential importance for the life sciences and especially for medical laboratory diagnostics, food and environmental analysis.
  • LC liquid chromatography
  • HPLC high-pressure or high-efficiency liquid chromatography.
  • the chromatographically fractionated sample is then fed continuously to a mass spectrometric detector.
  • mass spectrometry with atmospheric pressure ionization eg electrospray (ESI) MS / MS
  • the target analytes are ionized for detection.
  • any atmospheric pressure ionization is a highly complex physicochemical event in which a variety of molecular interactions must be assumed. This manifests itself among other things in the phenomenon of "ion suppression” and "ion enhancement".
  • Most unspecified components of the sample matrix which elute with time into the ion source with the respective target analyte, can lead to a reduction but also to an increase in the ion yield of the target analyte.
  • deposits on parts of the ion source and the ion optics (“charging") cause the ionization efficiency of a system to often drift or also vary the detector signal over time, a so-called “undulate” within an analysis series.
  • calibrator samples with known analyte concentrations
  • controls to be quantified. If a drift of the ionization yield with respect to the target analyte within the measurement series occurs in such a series, or if the ionization properties of calibrator samples and unknowns differ, incorrect measurement results of the unknowns are the result.
  • the concentration ratio of target analyte to internal standard for each sample which does not change during sample processing.
  • the signal of target analyte eg collision-induced ion transition in MS / MS technology
  • internal standard is recorded alternately or simultaneously as a mass spectrogram; so two independent mass spectrograms are recorded in the same run.
  • the Internal Standard should be selected to elute at a different time from the target analyte; In this case, two peak areas are determined in a mass spectrogram (analyte or internal standard).
  • the areas (at defined retention times) of the peaks of the internal standard or target analyte are determined.
  • the ratio of the peak area of the target analyte to the peak area of the internal standard is called the response of the single analysis. Calibration and quantification are performed on the basis of this response (ie a peak area ratio).
  • This principle of internal standardization at least partially equalizes variances in the ionization yield from sample to sample; The prerequisite for this, however, is that the ionization behavior of target analyte and internal standard is influenced in a very similar manner by modulating effects ("charging", matrix components, etc.).
  • the method according to Stahnke et al. uses a monitor substance that is not identical to the target analytes. Since the target analyte and the reference substance can differ with regard to their ionization behavior, this approach is fundamentally susceptible to anomaly.
  • the search for a suitable reference substance is demanding, since a substance must be found which under all circumstances experiences a similar modulation of the signal yield as the target analyte. For many target analytes it can be assumed that no suitable substances can be found.
  • a complicated evaluation of periodically recorded reference signal and peak area of the target analyte is required, i. an evaluation and quantification from the primarily recorded mass spectrogram is not directly possible or at least prone to failure.
  • the object of the present invention is to propose devices and methods which enable the verification of the function of a mass spectrometer or the
  • test method for controlling the function of a mass spectrometer.
  • the test method according to the invention is characterized in that it comprises the following steps:
  • step (a) mixing an eluate of a chromatographic separation system and a target analyte solution of known concentration; (b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer comprising at least one signaling detector;
  • the compensation method according to the invention is characterized in that it comprises the following working steps:
  • step (a) mixing an eluate of a chromatographic separation system and a target analyte solution of known concentration; (b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer comprising at least one signaling detector;
  • the device according to the invention is characterized in that it comprises: (a) a pump with pump control for conveying a solution of a target analyte of known concentration; and
  • a T-piece which can be arranged in front of the mass spectrometer, which has a first connection for connecting the T-piece to the mass spectrometer, a second connection for connecting the T-piece to the pump and a third connection for introducing the eluate from a chromatographic
  • Separation system includes, and optionally:
  • the device according to the invention is characterized in that it comprises: (a) a pump with pump control for conveying a solution of a target analyte of known concentration; and (b) a pre-mass spectrometer-settable delivery unit having a first port for connecting the delivery unit to a vacuum chamber upstream of the mass spectrometer, a first injection port having a second port for introducing the eluate from a chromatographic separation system, and a third port for connecting the delivery unit includes the pump, and optionally:
  • the device according to the invention is characterized in that it comprises:
  • a pump with pump control for delivering a solution of a target analyte of known concentration
  • a mixing unit which can be arranged in front of the mass spectrometer, having a first connection for connecting the mixing unit to the mass spectrometer, a first injection channel having a second connection for introducing the electrolyte from a chromatographic separation system and a third connection for connecting the mixing unit to the pump includes, and optionally:
  • step (e) the formation of a quotient A / B, B / A, AB / A or A 2 / B 2 or a difference log (A) - log (B) or a corresponding inversion value is preferred as the mathematical relationship in step (e) , Especially preferred as a mathematical relationship in step (e) is the respective formation of a quotient A / B.
  • PCI permanent postcolumn infusion
  • FIG. 2 shows a second design of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system
  • FIG. 3 shows a third structure of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system and having a reduced-pressure space upstream of the mass spectrometer;
  • PCI PCI
  • 4 shows a fourth structure of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system
  • 5 shows a mass spectrogram for the evaluation according to the described invention, according to which a baseline increase is effected by the continuous addition of a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system;
  • FIG. 6 Calibration function for measuring tacrolimus on the basis of the illustrated technical structure according to FIG. 1 and the described mass spectrographic evaluation method.
  • This system construction can be used as a reference solution for adding the target analyte to the eluate of a chromatographic separation system at a constant rate.
  • the target analyte in isocratic elution chromatographic processes
  • the described configurations ensure that the target analyte is fed to the detector in a continuous rate.
  • a sustained "background” signal is generated, raising the baseline, resulting in a so-called “base line offset", which is subordinate to the actual mass spectrometric analysis.
  • the test method according to the invention is based on a baseline elevation in the mass spectrogram, which can also be used to compensate for variances in the signal generation of the respective detector with respect to the respective target analyte.
  • a check of the function or performance of a mass spectrometer takes place before or after the actual sample analyzes by means of a target analyte solution.
  • particularly preferred is the simultaneous analysis of a mixture of samples with known analytes and / or unknown analytes and a known target analyte so that a current quality statement can be made about each analysis. This is achieved by continuously adding a separate solution of a target analyte to the eluate of the chromatographic separation system so that only this mixture reaches the detector 5 'of the mass spectrometer 5.
  • This admixing of a target analyte to the eluate from a chromatographic separation system 1, 2 can take place via a T-piece 3 by means of a pump 4 (see Fig. 1). If this pump 4 has sufficient storage volume (e.g., in the case of a large cylinder piston pump), no additional reservoir 4b is needed for the target analyte solution. However, if a peristaltic pump is used to deliver the target analyte solution to the T-piece 3 (which has no storage volume), the connection of such a reservoir 4b is unavoidable.
  • a high-precision syringe pump 4 is used for conveying the target analyte solution, it is preferable to connect a three-way valve 4c between the three ports to the tee 3, the reservoir 4b and the syringe pump 4 (see Fig. 2).
  • Pumps suitable for use in function control or variance compensation are preferably selected from a group comprising piezo pumps, syringe pumps, piston pumps (e.g., a per se known LC pump), and peristaltic pumps. Such pumps are well known to those skilled in the art (in the case of piezo pumps, for example, from document EP 0 956 449 B1).
  • a simultaneous injection of the eluate of the chromatographic separation system and of the target analyte solution takes place by means of a double nozzle or feed unit 10 known from US Pat. No. 6,465,776 B1 (see FIG.
  • This feed unit 10 comprises two injection channels 8, 9, which are completely separate from each other, of which one injection channel is connected to the eluate of the chro- Matographischen separation system 1,2 and the other injection channel with the Zielana- lytans from the pump 4 is charged.
  • This method requires a reduced pressure space 12 upstream of the mass spectrometer, located between the feeder unit 10 and the mass spectrometer 5.
  • a quadrupole ion guide (this is not shown here, but known from US 6,465,776 Bl) is arranged between the vacuum chamber 12 and the mass spectrometer 5, with which the individual fluid samples can be brought into a parallel trajectory before they enter the mass spectrometer.
  • a simultaneous injection of the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 and of the target analyte solution takes place by means of a mixing nozzle (compare FIG. 4).
  • this mixing unit 11 comprises two injection channels 8, 9 which are only partially separated from one another, of which one injection channel is charged with the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 and the other injection channel is supplied with the target analyte solution from the pump 4. Both injection channels unite within the mixing unit 11, so that it can be dispensed with a mass spectrometer upstream room with reduced pressure. Again, only the mixture reaches the detector 5 'of the mass spectrometer. 5
  • the admixture of a target analyte to the eluate from a chromatographic separation system 1, 2 via a T-piece 3 or a feed unit 10 or a mixing unit 11 and a separate pump 4 can be used in gradient processes or in isocratic processes.
  • the target analyte may be dissolved in the mobile phase of the analytical chromatographic system 1, 2 without the need for an additional pump 4. This is possible in the case of isocratic chromatographic analyzes. It can also be provided that the functional test is performed only with an analyte solution (without unknowns).
  • a flow detector 13th be arranged with associated control. With the aid of this flow-through detector 13, the continuous sample or the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 is then analyzed continuously.
  • injection of the target analyte into the T-piece 3 or into the feed unit 10 or mixing unit 11 can be started.
  • injection of the target analyte can be stopped thereupon.
  • a time window 14 is thus defined within the running time of the mass spectrogram (see FIG. 5).
  • This time window is preferably so large that it covers just the interesting part of the transit time of the entire mass spectrogram, in which the detector signal is detected, which corresponds to an expected analyte.
  • an apparatus for carrying out the test method or compensation method comprising a flow detector 13 with associated control, wherein the flow detector 13 between the chromatographic separation system 1,2 and the tee 3 or between the chromatographic separation system 1,2 and the feed unit 10 or mixing unit 11 and for the optical analysis of the eluate from the chromatographic separation system 1,2.
  • Specific preferred flow detectors 13 are scanning detectors (eg UV, VIS and NIR detectors), refractive or fluorescence detectors.
  • the continuous feeding of the target analyte at a constant rate during a time window 14, which is shorter than the transit time of the mass spectrogram, can be achieved in all embodiments of the invention shown in FIGS. 1 to 4.
  • this target analyte feed can also be time-controlled. This is particularly advantageous and particularly easy to carry out if a number of similar or identical substances contained in samples to be analyzed in the mass spectrometer.
  • the target analyte preferably reaches the point of mixing with the eluate from the chromatographic separation system 1, 2 shortly before the time at which an interesting event from the chromatographic separation system 1, 2 likewise reaches this location of mixing.
  • this location of mixing can take place inside a T-piece 3 (compare FIGS. 1 and 2), following a feed unit 10 (see sub-pressure chamber 12 in FIG 3), or inside a mixing unit 11 (see Fig. 4).
  • the corresponding inlet leg of the T-piece 3 can be extended or have a labyrinth extending the path (not shown).
  • the target analyte delivery pump 4 may be timed in time.
  • the path extension 15 can be used advantageously.
  • the peak area A of the target analyte (which is generated by the actual mass spectrometric process) is detected by established methods of base point detection and area measurement.
  • the "background”, ie the area B of the quadrilateral is detected below the respective peak (see Fig. 5) .
  • the "response” of the single analysis is preferably calculated as the quotient of the peak area A to the area B of the quadrangle below the peak 7.
  • This Area B is formed by the integration line 6 of the peak 7, the baseline of the mass spectrogram and the solders which are precipitated from the ends of the peak integration line 6 to the baseline (see Figure 5, areas A and B).
  • the ionization efficiency with respect to the target analyte decreases or increases in the period of the elution of the analyte peak 7, there is a reduction or increase in the recorded peak area A.
  • a reduction or increase in the area B of the substrate likewise results under the peak.
  • the quotient of the two surfaces A / B is independent of the instantaneous ion yield.
  • the method is suitable for equalizing variances in ion yield, as well as for distinct internal standard substances added to a sample prior to analysis.
  • the quotient of the two surfaces A / B or another mathematical relationship such as the quotient of the squares of these surfaces A 2 / B 2 or the value of another previously mentioned - A mathematical relationship of the areas A and B a statement on the quality of the analysis.
  • the method described furthermore offers significant and surprising advantages over the prior art, since the possibility is opened up of developing chromatographic and above all mass spectrometric analysis methods, without requiring separate substances for internal standardization: the monitor substance (either added to the mobile phase or added post-column to the flow) is identical in the described method with the respective Zielanalyten. Compared to conventional methods of internal standardization with the addition of the internal standard in the context of sample preparation, labor savings in sample preparation are achieved. In the case of mass spectrometric methods - above all with respect to the method according to Stahnke et al. - results as a further advantage that only a single mass trace per analyte must be recorded for the quantification.
  • the search for a reference substance which is very similar to the target analyte in its signaling properties, has so far been a major challenge in the development of appropriate methods: If no suitable reference substances are found, the development of specific mass spectrometric methods often fails completely.
  • the invention substantially extends the applicability of quantitative chromatographic / mass spectrometric analytical methods in chemical analysis.
  • the functionality of the method is demonstrated by means of an exemplary embodiment by measuring the immunosuppressant tracrolimus from human whole blood samples. For this four calibrator samples were used in the therapeutic concentration range after protein precipitation. These precipitates were analyzed by means of LC-MS / MS (description of the method: Vogeser, Michael et al., 2008 "Instrument-specific matrix effects of calibration materials in the LC-MS / MS analysis of tacrolimus" Clin. Chem. 54: 1406-8).
  • a solution of tacrolimus (100 ⁇ g / l in methanol / water, 1/1) was infused via a T-piece at a rate of 5 ⁇ l / min (according to FIG. 1).
  • FIG. 5 shows a mass spectrometer thus recorded over its entire duration.
  • a mass transfer specific for tacrolimus is detected (parent ion 821.5 m / z, product ion 768.5 m / z).
  • the area A is the peak area; the area Surface B is the background area under the peak generated by the continuous tacro-limbus infusion.
  • the areas A and B can be calculated both from analog and from digital signals or data of the mass spectrometer detector.
  • FIG. 6 shows the calibration function that was created based on this mass spectrographic evaluation.
  • the known analyte concentrations of the calibrator samples were plotted.
  • the Y axis shows the corresponding response as peak area ratio area A / area B. The result is a linear relationship between peak area response and calibrator
  • a differentiated chromatographic analysis method for compensating variances in the signal-generating unit in quantitative chromatographic analyzes is characterized in that the signal-generating unit (the detector) during a series of analyzes continuously and at a constant rate a pure solution of the Zielanalyten the measurement is supplied.
  • such chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the continuous delivery of the target analyte is achieved either by the target analyte being dissolved in the mobile phase of the chromatographic system (in methods with isocratic elution) or by being in the flow distal to the analytical analyte Separating column through a T-piece and a second pumping unit a solution of the target analyte is added as a reference substance continuously and at a constant rate.
  • such chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the baseline increase in the chromatogram thus achieved is used to compensate for variances in the signal generation of the respective detector with respect to the respective target analyte.
  • chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the quadril be evaluated below the integration line of the peak of a Zielanalyten.
  • such chromatographic analysis methods are particularly preferably characterized in that, for quantification of the target analyte, the area found by solder precipitation from the peak integration line below the integrated chromatographic peak of the target analyte in an integrated peak area analysis method above the integration line of the target analyte Purposes of quantifying target analytes.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

The invention relates to a test method for checking the function of a mass spectrometer (5) and a method for compensating for ion yield variances in mass spectrometry, characterized in that said method comprises mixing an eluate of a chromatographic separate system (1,2) and a target analyte solution having a known concentration, injecting said mixture into a mass spectrometer (5) having a detector providing a signal, capturing a mass spectrogram based on the detector signal, capturing an integrated mass spectrographic peak area (A) above an integration line (6) and an area (B) below the integrated peak area (A), and forming a mathematical relationship of the areas (A) and (B). The test method thereby further comprises setting a threshold value for said mathematical relationship indicating the limit of the acceptable quality of a mass spectrometric analysis, and accepting or rejecting the mass spectrometric analysis on the basis of a comparison of the mathematical relationship to the set threshold value. The compensation method thereby further comprises evaluating the mass spectrogram for compensating for variances in the ion yield in the detector (5’). The invention further relates to devices for performing said test method or compensation method.

Description

Funktionskontrolle bzw. Varianzenkompensation in der Massenspektrometrie Function control or variance compensation in mass spectrometry
Diese Patentanmeldung beansprucht die Priorität der deutschen Erstanmeldung Nr. DE 10 2009 030 395.2 vom 25. Juni 2009, deren kompletter Inhalt per ausdrücklicher Zitierung und Referenz in diese Patentanmeldung aufgenommen wird.This patent application claims the priority of the German first application no. DE 10 2009 030 395.2 of 25 June 2009, the entire content of which is incorporated by explicit reference and cited in this patent application.
Die Erfindung betrifft gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1 ein Verfahren zum Kontrollieren der Funktion eines Massenspektrometers, gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 2 ein Verfahren zur Kompensation von Varianzen in der Massenspektrometrie und gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 12 eine Vorrichtung zum Durchführen dieser Funktionskontrolle bzw. dieses Kompensationsverfahrens für Massenspektrometer.The invention relates according to the preamble of independent claim 1, a method for controlling the function of a mass spectrometer, according to the preamble of independent claim 2, a method for compensating variances in mass spectrometry and according to the preamble of claim 12, a device for performing this function check or this compensation method for mass spectrometers.
Es handelt sich um eine Erfindung aus dem Gebiet der quantitativen chemischen Analytik. Es wird ein Ausführungsbeispiel aus dem Bereich der biomedizinischen Analytik gegeben.It is an invention in the field of quantitative chemical analysis. An exemplary embodiment from the field of biomedical analysis is given.
Chromatographische und insbesondere chromatographisch-massenspektrometri- sche Analyse verfahren sind von wesentlicher Bedeutung für die Biowissenschaften und speziell für die medizinische Labordiagnostik, die Nahrungsmittel- und Umweltanalytik. Hierbei werden biologische Proben wie Plasma, Serum, Blut oder Urin zunächst aufbereitet (z.B. de-proteiniert) und dann durch Chromatographie (z.B. GC = Gaschromatographie; LC = Flüssigkeitschromatographie; HPLC = Hochdruckbzw. Hocheffizienz- Flüssigkeitschromatographie) aufgetrennt. Die chromatographisch fraktionierte Probe wird dann kontinuierlich einem massenspektrometrischen Detektor zugeführt. Im Falle der Massenspektrometrie mit Atmosphärendruck-Ionisation (z.B. Electro- spray (ESI-) MS/MS) werden die Zielanalyten zur Detektion ionisiert. Diese Ionisation erfasst jedoch nicht nur die jeweiligen Zielanalyten sondern auch eine sehr grosse Zahl anderer Stoffe aus der Probenmatrix. Entsprechend stellt jede Atmo- sphärendruck-Ionisation ein hochkomplexes physiko-chemisches Geschehen dar, in dem eine Vielzahl von molekularen Interaktionen angenommen werden müssen. Dies äussert sich unter anderem im Phänomen von „ion suppression" (Ionenunterdrückung) und „ion enhancement" (Ionenverstärkung). Meist nicht näher spezifizierbare Komponenten der Probenmatrix, die zeitlich mit dem jeweiligen Zielanaly- ten in die Ionenquelle eluieren, können zu einer Verringerung aber auch zu einer Verstärkung der Ionenausbeute des Zielanalyten führen. Ebenso führen Ablagerungen an Teilen der Ionenquelle und der Ionenoptiken („charging") dazu, dass die Ionisierungseffizienz eines Systems häufig einen Drift oder auch ein Variieren des Detektor-Signals über die Zeit, ein sogenanntes „undulate" innerhalb einer Analysen- serie zeigt.Chromatographic and in particular chromatographic mass spectrometric analysis methods are of essential importance for the life sciences and especially for medical laboratory diagnostics, food and environmental analysis. Here, biological samples such as plasma, serum, blood or urine are first prepared (eg de-proteinated) and then separated by chromatography (eg GC = gas chromatography, LC = liquid chromatography, HPLC = high-pressure or high-efficiency liquid chromatography). The chromatographically fractionated sample is then fed continuously to a mass spectrometric detector. In the case of mass spectrometry with atmospheric pressure ionization (eg electrospray (ESI) MS / MS), the target analytes are ionized for detection. However, this ionization not only detects the respective target analytes but also a very large number of other substances from the sample matrix. Accordingly, any atmospheric pressure ionization is a highly complex physicochemical event in which a variety of molecular interactions must be assumed. This manifests itself among other things in the phenomenon of "ion suppression" and "ion enhancement". Most unspecified components of the sample matrix, which elute with time into the ion source with the respective target analyte, can lead to a reduction but also to an increase in the ion yield of the target analyte. Also, deposits on parts of the ion source and the ion optics ("charging") cause the ionization efficiency of a system to often drift or also vary the detector signal over time, a so-called "undulate" within an analysis series.
Üblicherweise werden in einer Analysenserie zunächst Kalibrator-Proben (mit bekannten Analyt-Konzentrationen) analysiert, die von den zu quantifizierenden „unbekannten Proben" oder „unknowns" sowie von Kontrollen gefolgt werden. Tritt in einer solchen Serie ein Drift der Ionisierungsausbeute bezüglich des Zielanalyten innerhalb der Mess-Serie auf, bzw. unterscheiden sich die Ionisationseigenschaften von Kalibrator-Proben und unknowns, sind unrichtige Messergebnisse der unknowns die Folge.Usually, in a series of analyzes, calibrator samples (with known analyte concentrations) are first analyzed, which are followed by the "unknown samples" or "controls" to be quantified. If a drift of the ionization yield with respect to the target analyte within the measurement series occurs in such a series, or if the ionization properties of calibrator samples and unknowns differ, incorrect measurement results of the unknowns are the result.
Zur Kompensation entsprechender Modulationseffekte der Ionenausbeute werden Substanzen verwendet, die als Interne Standards bezeichnet werden. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die in ihrer molekularen Struktur dem jeweiligen Zielanalyten möglichst ähnlich sein müssen. Ideal geeignet sind stabile isotopen-mar- kierte Moleküle des Zielanalyten (z.B. Cortisol-Moleküle, in denen vier Wasserstoff- Atome durch Deuterium ausgetauscht sind) als Interner Standard zur Messung von Cortisol mittels Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS). In einer Analysenserie von Kalibrator- oder Kontroll-Proben und unknowns wird eine genau identische Menge des jeweiligen Internen Standards allen Proben (Kalib- ratoren, Kontrollen und unknowns) ganz zu Beginn der Probenbearbeitung zuge- fügt. Hiermit wird für jede Probe ein Konzentrations-Verhältnis von Zielanalyt zu Internem Standard hergestellt, das sich im Laufe der Probenbearbeitung nicht mehr ändert. Im massenspektrometrischen Analysenlauf wird das Signal von Zielanalyt (z.B. kollisionsinduzierter Ionenübergang bei der MS/MS-Technologie) und Inter- nem Standard alternierend oder simultan als Massenspektrogramm aufgezeichnet; es werden also zwei unabhängige Massenspektrogramme im selben Analysenlauf aufgezeichnet. Bei weniger spezifischen Detektionsverfahren wie der UV-Detektion ist der Interne Standard so auszuwählen, dass er zu einem vom Zielanalyten unterschiedlichen Zeitpunkt eluiert; in diesem Fall werden in einem Massenspektro- gramm zwei Peakflächen bestimmt (Analyt bzw. Interner Standard). Zur quantifizierenden Auswertung werden die Flächen (zu definierten Retentionszeiten) der Peaks von Internem Standard bzw. Zielanalyt bestimmt. Das Verhältnis von Peak- Fläche des Zielanalyten zu Peak-Fläche des Internen Standards wird als Response der Einzelanalyse bezeichnet. Kalibration und Quantifizierung werden an Hand die- ser Response (also einem Peak-Flächen-Verhältnis) vorgenommen. Durch dieses Prinzip der Internen Standardisierung werden Varianzen in der Ionisierungsausbeute von Probe zu Probe zumindest zum Teil egalisiert; Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass das Ionisierungsverhalten von Zielanalyt und Internem Standard in sehr gleichartiger Weise durch modulierende Effekte („Charging", Matrix-Komponenten etc.) beeinflusst wird.To compensate for modulation effects of the ion yield, substances are used which are referred to as internal standards. These are substances whose molecular structure must be as similar as possible to the respective target analyte. Ideal is stable isotope-labeled molecules of the target analyte (eg cortisol molecules in which four hydrogen atoms are exchanged by deuterium) as an internal standard for the measurement of cortisol by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS). In an analysis series of calibrator or control samples and unknowns, an exactly identical amount of the respective internal standard is assigned to all samples (calibrators, controls and unknowns) at the very beginning of the sample processing. added. This produces a concentration ratio of target analyte to internal standard for each sample, which does not change during sample processing. In mass-spectrometric analysis, the signal of target analyte (eg collision-induced ion transition in MS / MS technology) and internal standard is recorded alternately or simultaneously as a mass spectrogram; so two independent mass spectrograms are recorded in the same run. For less specific detection methods, such as UV detection, the Internal Standard should be selected to elute at a different time from the target analyte; In this case, two peak areas are determined in a mass spectrogram (analyte or internal standard). For quantifying evaluation, the areas (at defined retention times) of the peaks of the internal standard or target analyte are determined. The ratio of the peak area of the target analyte to the peak area of the internal standard is called the response of the single analysis. Calibration and quantification are performed on the basis of this response (ie a peak area ratio). This principle of internal standardization at least partially equalizes variances in the ionization yield from sample to sample; The prerequisite for this, however, is that the ionization behavior of target analyte and internal standard is influenced in a very similar manner by modulating effects ("charging", matrix components, etc.).
Einerseits bedeutet das Verwenden von KaI ibrator- Proben für die Quantifizierung einen zusätzlichen Aufwand an Vorbereitungs- und Analysezeit; andererseits erlauben derartige Kalibrator-Proben keine direkten Aussagen über die Qualität der Ana- lyse von Proben mit unbekannter Analyten-Konzentration (unknowns).On the one hand, using calibrator samples for quantification adds an extra amount of preparation and analysis time; On the other hand, such calibrator samples do not allow any direct statements about the quality of the analysis of samples with unknown analyte concentration (unknowns).
Alternativ zum eben beschriebenen Zugeben einer definierten Menge eines Internen Standards zur Probe selbst (Generieren von zwei massenspektrometrischen Peaks bei der Massenspektrometrie-Analyse entweder in derselben Aufzeichnung oder in simultan aufgezeichneten unabhängigen Aufzeichnungen) ist unlängst ein Verfahren beschrieben worden, bei dem eine Referenzlösung kontinuierlich in das Eluat der chromatographischen Einheit beigemischt wird, um so eine Kompensation von Schwankungen in der Ionenausbeute zu erlauben (Stahnke H, Reemtsma T, Alder L „Compensation of matrix effects by postcolumn infusion of a monitor substance in multiresidue analyses with LC-MS/MS" Anal. Chem. 2009, 81 : 2185-92). Dabei wird periodisch (alternierend zur Massenübergangsspur des Zielanalyten) ein Signalniveau der Referenzsubstanz aufgezeichnet. Dieses Referenzsignal wird mit Hilfe eines aufwändigen Datenverarbeitungsverfahrens zur Messwertkompensation hin- sichtlich Faktoren genutzt, die die Signalgeneration beeinflussen können.As an alternative to just adding a defined amount of an internal standard to the sample itself (generating two mass spectrometric peaks in mass spectrometry analysis either in the same recording or in simultaneously recorded independent recordings), a method has been described recently in which a reference solution is continuously added to the sample Eluate is added to the chromatographic unit so as to allow for compensation of variations in ion yield (Stahnke H, Reemtsma T, Alder L Compensation of matrix effects by postcolumn infusion of a monitor substance in multiresidue analyzes with LC-MS / MS "Anal. Chem., 2009, 81: 2185-92), in which a signal level of the reference substance is recorded periodically (alternating with the mass transfer trace of the target analyte). clearly used factors that can influence the signal generation.
Das Verfahren nach Stahnke et al. verwendet eine Monitor-Substanz, die nicht mit den Zielanalyten identisch ist. Da sich Zielanalyt und Referenzsubstanz hinsichtlich ihres Ionisationsverhaltens unterscheiden können, ist dieser Ansatz prinzipiell ana- lytisch störanfällig. Die Suche nach einer geeigneten Referenzsubstanz ist anspruchsvoll, da eine Substanz gefunden werden muss, die unter allen Umständen eine gleichartige Modulation der Signalausbeute erfährt wie der Zielanalyt. Für viele Zielanalyten ist anzunehmen, dass keine hierfür geeigneten Substanzen gefunden werden können. Ausserdem ist eine komplizierte Auswertung von periodisch aufge- zeichnetem Referenz-Signal und Peak-Fläche des Zielanalyten erforderlich, d.h. eine Auswertung und Quantifizierung aus dem primär aufgezeichneten Massenspek- trogramm ist nicht direkt möglich oder zumindest störanfällig.The method according to Stahnke et al. uses a monitor substance that is not identical to the target analytes. Since the target analyte and the reference substance can differ with regard to their ionization behavior, this approach is fundamentally susceptible to anomaly. The search for a suitable reference substance is demanding, since a substance must be found which under all circumstances experiences a similar modulation of the signal yield as the target analyte. For many target analytes it can be assumed that no suitable substances can be found. In addition, a complicated evaluation of periodically recorded reference signal and peak area of the target analyte is required, i. an evaluation and quantification from the primarily recorded mass spectrogram is not directly possible or at least prone to failure.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Vorrichtungen und Verfahren vorzuschla- gen, welche die Überprüfung der Funktion eines Massenspektrometers oder derThe object of the present invention is to propose devices and methods which enable the verification of the function of a mass spectrometer or the
Qualität der massenspektrometrischen Analyse ermöglichen bzw. eine Kompensation von Schwankungen in der Ionenausbeute erlauben.Enable quality of the mass spectrometric analysis or allow compensation of fluctuations in the ion yield.
Diese Aufgabe wird gemäss einem ersten Aspekt dadurch gelöst, dass ein Testver- fahren zum Kontrollieren der Funktion eines Massenspektrometers vorgeschlagen wird. Das erfindungsgemässe Testverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Arbeitsschritte umfasst:This object is achieved according to a first aspect by proposing a test method for controlling the function of a mass spectrometer. The test method according to the invention is characterized in that it comprises the following steps:
(a) Mischen eines Eluats eines chromatographischen Trennsystems und einer Ziel- analytlösung mit bekannter Konzentration; (b) Einspritzen des in Schritt (a) erstellten Gemisches in ein Massenspektrometer, das mindestens einen signalgebenden Detektor umfasst;(a) mixing an eluate of a chromatographic separation system and a target analyte solution of known concentration; (b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer comprising at least one signaling detector;
(c) Erfassen eines auf dem Detektorsignal basierenden Massenspektrogramms, das eine Integrationslinie und einen massenspektrographischen Peak des Zielanalyten umfasst; (d) Auswerten des Massenspektrogramms durch das Erfassen einer integrierten massenspektrographischen Peakfläche A oberhalb der Integrationslinie des Zielanalyten sowie einer Fläche B, die durch Lotfällung von der Peak-Integra- tionslinie unter der integrierten Peakfläche A des Zielanalyten gefunden wird; (e) Bilden einer mathematischen Beziehung aus den ermittelten massenspektrographischen Flächen A und B;(c) detecting a detector signal-based mass spectrogram comprising an integration line and a mass spectrographic peak of the target analyte; (d) evaluating the mass spectrogram by detecting an integrated mass spectrographic peak area A above the integration line of the target analyte and an area B found by solder precipitation from the peak integration line below the integrated peak area A of the target analyte; (e) forming a mathematical relationship from the determined mass spectrographic surfaces A and B;
(f) Festsetzen eines Schwellenwerts für die mathematische Beziehung, der die obere oder untere Grenze der akzeptablen Qualität einer massenspektrometri- schen Analyse bezeichnet; und (g) Akzeptieren oder Ablehnen der massenspektrometrischen Analyse auf Grund eines Vergleichs der mathematischen Beziehung mit zumindest einem der festgesetzten Schwellenwerte.(f) establishing a threshold for the mathematical relationship that indicates the upper or lower bound of the acceptable quality of a mass spectrometric analysis; and (g) accepting or rejecting the mass spectrometric analysis based on a comparison of the mathematical relationship with at least one of the established thresholds.
Diese Aufgabe wird gemäss einem zweiten Aspekt dadurch gelöst, dass ein Verfah- ren zur Kompensation von Ionenausbeute-Varianzen in der Massenspektrometrie vorgeschlagen wird. Das erfindungsgemässe Kompensationsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Arbeitsschritte umfasst:This object is achieved according to a second aspect in that a method for compensating ion yield variances in mass spectrometry is proposed. The compensation method according to the invention is characterized in that it comprises the following working steps:
(a) Mischen eines Eluats eines chromatographischen Trennsystems und einer Zie- lanalytlösung mit bekannter Konzentration; (b) Einspritzen des in Schritt (a) erstellten Gemisches in ein Massenspektrometer, das mindestens einen signalgebenden Detektor umfasst;(a) mixing an eluate of a chromatographic separation system and a target analyte solution of known concentration; (b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer comprising at least one signaling detector;
(c) Erfassen eines auf dem Detektorsignal basierenden Massenspektrogramms, das eine Integrationslinie und einen massenspektrographischen Peak des Zielanalyten umfasst; (d) Auswerten des Massenspektrogramms durch das Erfassen einer integrierten massenspektrographischen Peakfläche A oberhalb der Integrationslinie des Zielanalyten sowie einer Fläche B, die durch Lotfällung von der Peak-Integra- tionslinie unter der integrierten Peakfläche A des Zielanalyten gefunden wird;(c) detecting a detector signal-based mass spectrogram comprising an integration line and a mass spectrographic peak of the target analyte; (d) evaluating the mass spectrogram by detecting an integrated mass spectrographic peak area A above the integration line of the target analyte and an area B found by solder precipitation from the peak integration line below the integrated peak area A of the target analyte;
(e) Bilden einer mathematischen Beziehung aus den ermittelten massenspektro- graphischen Flächen A und B; und(e) forming a mathematical relationship from the determined mass spectroscopic areas A and B; and
(f) Auswerten des Massenspektrogramms zur Kompensation von Varianzen in der Ionenausbeute im Detektor. Diese Aufgabe wird gemäss einem weiteren Aspekt dadurch gelöst, dass eine Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens bzw. des Kompensationsverfahrens vorgeschlagen wird. Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) eine Pumpe mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanaly- ten mit bekannter Konzentration; und(f) evaluating the mass spectrogram to compensate for variances in ion yield in the detector. This object is achieved according to a further aspect in that a device for carrying out the test method or the compensation method is proposed. The device according to the invention is characterized in that it comprises: (a) a pump with pump control for conveying a solution of a target analyte of known concentration; and
(b) ein vor dem Massenspektrometer anordenbares T-Stück, das einen ersten An- schluss zum Verbinden des T-Stücks mit dem Massenspektrometer, einen zweiten Anschluss zum Verbinden des T-Stücks mit der Pumpe und einen drit- ten Anschluss zum Einleiten des Eluats aus einem chromatographischen(b) a T-piece which can be arranged in front of the mass spectrometer, which has a first connection for connecting the T-piece to the mass spectrometer, a second connection for connecting the T-piece to the pump and a third connection for introducing the eluate from a chromatographic
Trennsystem umfasst, und optional :Separation system includes, and optionally:
(c) einen Durchfluss-Detektor.(c) a flow detector.
Diese Aufgabe wird gemäss einem weiteren Aspekt dadurch gelöst, dass eine Vor- richtung zur Durchführung des Testverfahrens bzw. des Kompensationsverfahrens vorgeschlagen wird. Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: (a) eine Pumpe mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanaly- ten mit bekannter Konzentration; und (b) eine vor dem Massenspektrometer anordenbare Zuführeinheit, die einen ersten Anschluss zum Verbinden der Zuführeinheit mit einer dem Massenspektrometer vorgeschalteten Unterdruckkammer, einen ersten Einspritzkanal mit einem zweiten Anschluss zum Einleiten des Eluats aus einem chromatographischen Trennsystem und einen dritten Anschluss zum Verbinden der Zuführeinheit mit der Pumpe umfasst, und optional :This object is achieved according to a further aspect in that a device for carrying out the test method or the compensation method is proposed. The device according to the invention is characterized in that it comprises: (a) a pump with pump control for conveying a solution of a target analyte of known concentration; and (b) a pre-mass spectrometer-settable delivery unit having a first port for connecting the delivery unit to a vacuum chamber upstream of the mass spectrometer, a first injection port having a second port for introducing the eluate from a chromatographic separation system, and a third port for connecting the delivery unit includes the pump, and optionally:
(c) einen Durchfluss-Detektor.(c) a flow detector.
Diese Aufgabe wird gemäss einem weiteren Aspekt dadurch gelöst, dass eine Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens bzw. des Kompensationsverfahrens vorgeschlagen wird. Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst:This object is achieved according to a further aspect in that a device for carrying out the test method or the compensation method is proposed. The device according to the invention is characterized in that it comprises:
(a) eine Pumpe mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanaly- ten mit bekannter Konzentration; und (b) eine vor dem Massenspektrometer anordenbare Mischeinheit, die einen ersten Anschluss zum Verbinden der Mischeinheit mit dem Massenspektrometer, einen ersten Einspritzkanal mit einem zweiten Anschluss zum Einleiten des EIu- ats aus einem chromatographischen Trennsystem und einen dritten Anschluss zum Verbinden der Mischeinheit mit der Pumpe umfasst, und optional :(a) a pump with pump control for delivering a solution of a target analyte of known concentration; and (b) a mixing unit, which can be arranged in front of the mass spectrometer, having a first connection for connecting the mixing unit to the mass spectrometer, a first injection channel having a second connection for introducing the electrolyte from a chromatographic separation system and a third connection for connecting the mixing unit to the pump includes, and optionally:
(c) einen Durchfluss-Detektor.(c) a flow detector.
Zusätzliche bevorzugte bzw. erfinderische Merkmale ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Dabei wird als mathematische Beziehung in Schritt (e) jeweils das Bilden eines Quotienten A/B, B/A, A-B/A oder A2/B2 bzw. einer Differenz log(A)- log(B) oder eines entsprechenden Umkehrwertes bevorzugt. Speziell bevorzugt ist als mathematische Beziehung in Schritt (e) das jeweilige Bilden eines Quotienten A/B.Additional preferred or inventive features will be apparent from the dependent claims. In this case, the formation of a quotient A / B, B / A, AB / A or A 2 / B 2 or a difference log (A) - log (B) or a corresponding inversion value is preferred as the mathematical relationship in step (e) , Especially preferred as a mathematical relationship in step (e) is the respective formation of a quotient A / B.
Die vorliegende Erfindung wird an Hand von schematischen Zeichnungen und Mess- Resultaten näher erläutert, wobei die dargestellten Ausführungsformen lediglich als Beispiele zu verstehen sind und den Umfang der Erfindung nicht beschränken sollen. Es zeigen :The present invention will be explained in more detail with reference to schematic drawings and measurement results, wherein the illustrated embodiments are to be understood as examples only and not to limit the scope of the invention. Show it :
Fig. 1 einen ersten Aufbau eines (PCI)-Systems (PCI = permanent post co- lumn infusion) zum Zumischen eines Zielanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems;1 shows a first structure of a (PCI) system (PCI = permanent postcolumn infusion) for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system;
Fig. 2 einen zweiten Aufbau eines (PCI)-Systems zum Zumischen eines Zie- lanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems;2 shows a second design of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system;
Fig. 3 einen dritten Aufbau eines (PCI)-Systems zum Zumischen eines Zielanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems und mit einem dem Massenspektrometer vorgeschalteten Raum mit reduzier- tem Druck;3 shows a third structure of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system and having a reduced-pressure space upstream of the mass spectrometer;
Fig. 4 einen vierten Aufbau eines (PCI)-Systems zum Zumischen eines Zielanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems; Fig. 5 Massenspektrogramm zur Auswertung gemäss der beschriebenen Erfindung, gemäss welcher eine Basislinien-Anhebung durch die kontinuierliche Zugabe eines Zielanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems erfolgt;4 shows a fourth structure of a (PCI) system for admixing a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system; 5 shows a mass spectrogram for the evaluation according to the described invention, according to which a baseline increase is effected by the continuous addition of a target analyte to the eluate of a chromatographic separation system;
Fig. 6 Kalibrationsfunktion zur Messung von Tacrolimus auf Basis des dargestellten technischen Aufbaus gemäss Fig. 1 und der beschriebenen massenspektrographischen Auswertemethode.FIG. 6 Calibration function for measuring tacrolimus on the basis of the illustrated technical structure according to FIG. 1 and the described mass spectrographic evaluation method.
Es wurde eine Kombination eines System-Aufbaus und eine massenspektrographi- sche Auswertungsmethode gefunden, die es ermöglicht, eine interne Standardisierung von massenspektrometrischen Methoden allein unter Verwendung einer Lösung eines Zielanalyten vorzunehmen.A combination of a system design and a mass spectrographic evaluation method was found, which makes it possible to carry out an internal standardization of mass spectrometric methods using only a solution of a target analyte.
Dieser System-Aufbau, wie er in den Figuren 1 bis 4 dargestellt ist, kann zur Zumischung des Zielanalyten zum Eluat eines chromatographischen Trennsystems als Referenzlösung in konstanter Rate genutzt werden. Alternativ kann der Zielanalyt (bei chromatographischen Verfahren mit isokratischer Elution) in der mobilen Phase des chromatographischen Systems gelöst vorliegen.This system construction, as shown in FIGS. 1 to 4, can be used as a reference solution for adding the target analyte to the eluate of a chromatographic separation system at a constant rate. Alternatively, the target analyte (in isocratic elution chromatographic processes) may be dissolved in the mobile phase of the chromatographic system.
Durch die beschriebenen Konfigurationen wird erreicht, dass der Zielanalyt in kontinuierlicher Rate dem Detektor zugeführt wird. Im Massenspektrometer wird so ein anhaltendes „Hintergrund"-Signal erzeugt; dabei wir die Basislinie angehoben, es erfolgt ein sogenannter „base line offset", das der eigentlichen massenspektro- metrischen Analyse unterlagert ist.The described configurations ensure that the target analyte is fed to the detector in a continuous rate. In the mass spectrometer, a sustained "background" signal is generated, raising the baseline, resulting in a so-called "base line offset", which is subordinate to the actual mass spectrometric analysis.
Das erfindungsgemässe Testverfahren kann dazu benutzt werden, die Funktion oder Leistung (= Performance oder Response) eines Massenspektrometers zu überprüfen. Das erfindungsgemässe Testverfahren beruht auf einer Basislinien-Anhe- bung im Massenspektrogramm, die auch zur Kompensation von Varianzen der Signalerzeugung des jeweiligen Detektors bezüglich des jeweiligen Zielanalyten genutzt werden kann. Vorzugsweise erfolgt eine Überprüfung der Funktion oder Leistung eines Mas- senspektrometers vorgängig oder nachgängig zu den eigentlichen Probenanalysen an Hand einer Zielanalytlösung. Besonders bevorzugt ist jedoch das simultane bzw. gleichzeitige Analysieren eines Gemisches von Proben mit bekannten Analyten und/oder unbekannten Analyten und einem bekannten Zielanalyten, so dass über jede Analyse eine aktuelle Qualitätsaussage gemacht werden kann. Dies wird erreicht, indem eine separate Lösung eines Zielanalyten dem Eluat des chromatographischen Trennsystems kontinuierlich zugemischt wird, sodass erst diese Mischung den Detektor 5' des Massenspektrometers 5 erreicht.The test method according to the invention can be used to check the function or performance (= performance or response) of a mass spectrometer. The test method according to the invention is based on a baseline elevation in the mass spectrogram, which can also be used to compensate for variances in the signal generation of the respective detector with respect to the respective target analyte. Preferably, a check of the function or performance of a mass spectrometer takes place before or after the actual sample analyzes by means of a target analyte solution. However, particularly preferred is the simultaneous analysis of a mixture of samples with known analytes and / or unknown analytes and a known target analyte so that a current quality statement can be made about each analysis. This is achieved by continuously adding a separate solution of a target analyte to the eluate of the chromatographic separation system so that only this mixture reaches the detector 5 'of the mass spectrometer 5.
Im Folgenden werden unterschiedliche Möglichkeiten dieses Zumischens erläutert:In the following, different possibilities of this admixing are explained:
Dieses Zumischen eines Zielanalyten zum Eluat aus einem chromatographischen Trennsystem 1,2 kann über ein T-Stück 3 mittels einer Pumpe 4 erfolgen (vgl. Fig. 1). Falls diese Pumpe 4 genügend Speichervolumen aufweist (z.B. im Fall einer Kolbenpumpe mit grossem Zylindervolumen), wird kein zusätzliches Reservoir 4b für die Zielanalytlösung benötigt. Wird jedoch eine Peristaltikpumpe zur Förderung der Zielanalytlösung zum T-Stück 3 eingesetzt (die kein Speichervolumen aufweist), so ist das Anschliessen eines solchen Reservoirs 4b unumgänglich.This admixing of a target analyte to the eluate from a chromatographic separation system 1, 2 can take place via a T-piece 3 by means of a pump 4 (see Fig. 1). If this pump 4 has sufficient storage volume (e.g., in the case of a large cylinder piston pump), no additional reservoir 4b is needed for the target analyte solution. However, if a peristaltic pump is used to deliver the target analyte solution to the T-piece 3 (which has no storage volume), the connection of such a reservoir 4b is unavoidable.
Falls eine hochpräzise Spritzenpumpe 4 zum Fördern der Zielanalytlösung verwendet wird, so wird bevorzugt ein Dreiwegventil 4c zwischen die drei Anschlüsse an das T-Stück 3, das Reservoir 4b und die Spritzenpumpe 4 geschaltet (vgl. Fig. 2). Zur Verwendung bei der Funktionskontrolle bzw. Varianzenkompensation geeignete Pumpen sind vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, die Piezopumpen, Spritzenpumpen, Kolbenpumpen (z.B. eine an sich bekannte LC-Pumpe) und Peristaltik- pumpen umfasst. Derartige Pumpen sind dem Fachmann (im Fall von Piezopumpen beispielsweise aus dem Dokument EP 0 956 449 Bl) bestens bekannt.If a high-precision syringe pump 4 is used for conveying the target analyte solution, it is preferable to connect a three-way valve 4c between the three ports to the tee 3, the reservoir 4b and the syringe pump 4 (see Fig. 2). Pumps suitable for use in function control or variance compensation are preferably selected from a group comprising piezo pumps, syringe pumps, piston pumps (e.g., a per se known LC pump), and peristaltic pumps. Such pumps are well known to those skilled in the art (in the case of piezo pumps, for example, from document EP 0 956 449 B1).
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt ein simultanes Einspritzen des Eluats des chromatographischen Trennsystems und der Zielanalytlösung mittels einer aus US 6,465,776 Bl bekannten Doppeldüse oder Zuführeinheit 10 (vgl. Fig. 3). Diese Zuführeinheit 10 umfasst zwei vollständig voneinander getrennte Einspritzkanäle 8,9, von denen ein Einspritzkanal mit dem Eluat des chro- matographischen Trennsystems 1,2 und der andere Einspritzkanal mit der Zielana- lytlösung aus der Pumpe 4 beschickt wird. Dieses Verfahren verlangt einen dem Massenspektrometer vorgeschalteten Raum 12 mit reduziertem Druck, der zwischen der Zuführeinheit 10 und dem Massenspektrometer 5 angeordnet ist. Erst in dieser vorgeschalteten Unterdruckkammer 12 erfolgt die Vermischung des Zielana- lyten mit dem Eluat des chromatographischen Trennsystems 1,2 (symbolisiert durch einen Doppelpfeil). Auch hier erreicht somit erst die Mischung den Detektor 5' des Massenspektrometers 5. Vorzugsweise wird zwischen der Unterdruckkammer 12 und dem Massenspektrometer 5 eine Quadrupol-Ionenführung (diese ist hier nicht gezeigt, aber aus US 6,465,776 Bl bekannt) angeordnet, mit welcher die individuellen Fluidproben in eine parallele Flugbahn gebracht werden können, bevor sie in das Massenspektrometer gelangen.According to a further embodiment of the invention, a simultaneous injection of the eluate of the chromatographic separation system and of the target analyte solution takes place by means of a double nozzle or feed unit 10 known from US Pat. No. 6,465,776 B1 (see FIG. This feed unit 10 comprises two injection channels 8, 9, which are completely separate from each other, of which one injection channel is connected to the eluate of the chro- Matographischen separation system 1,2 and the other injection channel with the Zielana- lytlösung from the pump 4 is charged. This method requires a reduced pressure space 12 upstream of the mass spectrometer, located between the feeder unit 10 and the mass spectrometer 5. Only in this upstream vacuum chamber 12 does the mixing of the target analyte with the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 take place (symbolized by a double arrow). Here too, therefore, only the mixture reaches the detector 5 'of the mass spectrometer 5. Preferably, a quadrupole ion guide (this is not shown here, but known from US 6,465,776 Bl) is arranged between the vacuum chamber 12 and the mass spectrometer 5, with which the individual fluid samples can be brought into a parallel trajectory before they enter the mass spectrometer.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt ein simultanes Ein- spritzen des Eluats des chromatographischen Trennsystems 1,2 und der Zielanalyt- lösung mittels einer Mischdüse (vgl. Fig. 4). Im Unterschied zu Fig. 3 umfasst diese Mischeinheit 11 zwei nur teilweise voneinander getrennte Einspritzkanäle 8,9, von denen ein Einspritzkanal mit dem Eluat des chromatographischen Trennsystems 1,2 und der andere Einspritzkanal mit der Zielanalytlösung aus der Pumpe 4 beschickt wird. Beide Einspritzkanäle vereinigen sich innerhalb der Mischeinheit 11, so dass auf einen dem Massenspektrometer vorgeschalteten Raum mit reduziertem Druck verzichtet werden kann. Auch hier erreicht erst die Mischung den Detektor 5' des Massenspektrometers 5.According to a further embodiment of the invention, a simultaneous injection of the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 and of the target analyte solution takes place by means of a mixing nozzle (compare FIG. 4). In contrast to FIG. 3, this mixing unit 11 comprises two injection channels 8, 9 which are only partially separated from one another, of which one injection channel is charged with the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 and the other injection channel is supplied with the target analyte solution from the pump 4. Both injection channels unite within the mixing unit 11, so that it can be dispensed with a mass spectrometer upstream room with reduced pressure. Again, only the mixture reaches the detector 5 'of the mass spectrometer. 5
Allgemein gilt: Die Zumischung eines Zielanalyten zum Eluat aus einem chromatographischen Trennsystem 1,2 über ein T-Stück 3 bzw. eine Zuführeinheit 10 oder eine Mischeinheit 11 und eine separate Pumpe 4 kann bei Gradientenverfahren oder bei isokratischen Verfahren verwendet werden.In general, the admixture of a target analyte to the eluate from a chromatographic separation system 1, 2 via a T-piece 3 or a feed unit 10 or a mixing unit 11 and a separate pump 4 can be used in gradient processes or in isocratic processes.
Gemäss einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Zielanalyt in der mobilen Phase des analytischen chromatographischen Systems 1,2 gelöst sein, ohne dass eine zusätzliche Pumpe 4 notwendig ist. Dies ist im Falle von isokratischen chromatographischen Analysen möglich. Es kann auch vorgesehen sein, dass der Funktionstest nur mit einer Analytlösung (ohne unknowns) durchgeführt wird.According to an alternative embodiment of the present invention, the target analyte may be dissolved in the mobile phase of the analytical chromatographic system 1, 2 without the need for an additional pump 4. This is possible in the case of isocratic chromatographic analyzes. It can also be provided that the functional test is performed only with an analyte solution (without unknowns).
Des Weiteren kann zwischen der Trennsäule 2 und dem T-Stück 3 (vgl. Fig. 1 und 2) bzw. zwischen der Trennsäule 2 und der Zuführeinheit 10 bzw. Mischeinheit 11 (vgl. Fig. 3 und 4) ein Durchfluss-Detektor 13 mit zugehöriger Steuerung angeordnet werden. Mit Hilfe dieses Durchfluss-Detektors 13 wird dann die durchlaufende Probe bzw. das Eluat des chromatographischen Trennsystems 1,2 kontinuierlich analysiert. Damit kann beim Feststellen der Ankunft von interessierenden Proben im Durchfluss-Detektor 13 mit dem Einspritzen des Zielanalyten in das T-Stück 3 bzw. in die Zuführeinheit 10 oder Mischeinheit 11 begonnen werden. Beim Feststellen des Endes der interessierenden Proben kann darauf das Einspritzen des Zielanalyten gestoppt werden. Durch den Beginn und das Ende des Einspritzens des Zielanalyten wird somit ein Zeitfenster 14 innerhalb der Laufzeit des Mas- senspektrogramms definiert (vgl. Fig. 5). Dieses Zeitfenster ist vorzugsweise so gross, dass es gerade den interessierenden Teil der Laufzeit des ganzen Mas- senspektrogramms abdeckt, in welchem das Detektorsignal erfasst wird, das einem erwarteten Analyten entspricht.Furthermore, between the separation column 2 and the T-piece 3 (see Figures 1 and 2) or between the separation column 2 and the feed unit 10 or mixing unit 11 (see Fig. 3 and 4), a flow detector 13th be arranged with associated control. With the aid of this flow-through detector 13, the continuous sample or the eluate of the chromatographic separation system 1, 2 is then analyzed continuously. Thus, upon detecting the arrival of samples of interest in the flow detector 13, injection of the target analyte into the T-piece 3 or into the feed unit 10 or mixing unit 11 can be started. Upon detection of the end of the samples of interest, injection of the target analyte can be stopped thereupon. By the beginning and the end of the injection of the target analyte, a time window 14 is thus defined within the running time of the mass spectrogram (see FIG. 5). This time window is preferably so large that it covers just the interesting part of the transit time of the entire mass spectrogram, in which the detector signal is detected, which corresponds to an expected analyte.
Auf diese Weise der detektorgesteuerten Zuführung des Zielanalyten kann die Menge an sehr oft kostspieligen Zielanalyten, die zum Durchführen des erfindungsge- mässen Test- oder Kompensationsverfahrens notwenig ist, erheblich reduziert werden. Bevorzugt ist deshalb eine Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens oder Kompensationsverfahrens, die einen Durchfluss-Detektor 13 mit zugehöriger Steuerung umfasst, wobei der Durchfluss-Detektor 13 zwischen dem chromatographischen Trennsystem 1,2 und dem T-Stück 3 oder zwischen dem chromatographischen Trennsystem 1,2 und der Zuführeinheit 10 oder Mischeinheit 11 und zur optischen Analyse des Eluats aus dem chromatographischen Trennsystem 1,2 ausgebildet ist. Spezielle bevorzugte Durchfluss-Detektoren 13 sind Scanning- Detektoren (z.B. UV-, VIS- und NIR-Detektoren), Brechungs- oder Fluoreszenz- Detektoren. Das kontinuierliche Zuführen des Zielanalyten in gleichbleibender Rate während eines Zeitfensters 14, das kürzer ist als die Laufzeit des Massenspektro- gramms, kann in allen in den Figuren 1 bis 4 gezeigten Ausführungsformen der er- findungsgemässen Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens oder Kompensationsverfahrens erfolgen.In this way, the detector-controlled delivery of the Zielanalyten the amount of very expensive target analyte, which is necessary for carrying out the inventive test or compensation method, can be significantly reduced. Preference is therefore given to an apparatus for carrying out the test method or compensation method comprising a flow detector 13 with associated control, wherein the flow detector 13 between the chromatographic separation system 1,2 and the tee 3 or between the chromatographic separation system 1,2 and the feed unit 10 or mixing unit 11 and for the optical analysis of the eluate from the chromatographic separation system 1,2. Specific preferred flow detectors 13 are scanning detectors (eg UV, VIS and NIR detectors), refractive or fluorescence detectors. The continuous feeding of the target analyte at a constant rate during a time window 14, which is shorter than the transit time of the mass spectrogram, can be achieved in all embodiments of the invention shown in FIGS. 1 to 4. Inventive device for carrying out the test method or compensation method carried out.
Alternativ zu oder in Kombination mit der eben beschriebenen, detektorgesteuerten Zuführung des Zielanalyten kann diese Zielanalyt-Zuführung auch zeitgesteuert erfolgen. Dies ist besonders dann von Vorteil und besonders einfach ausführbar, wenn eine Reihe ähnlicher oder gleicher in Proben enthaltener Substanzen im Mas- senspektrometer analysiert werden soll.As an alternative to or in combination with the detector-controlled feed of the target analyte just described, this target analyte feed can also be time-controlled. This is particularly advantageous and particularly easy to carry out if a number of similar or identical substances contained in samples to be analyzed in the mass spectrometer.
Vorzugsweise erreicht der Zielanalyt bei der Zielanalyt-Zuführung den Ort des Mi- schens mit dem Eluat aus dem chromatographischen Trennsystem 1,2 kurz vor dem Zeitpunkt, bei dem ein interessantes Ereignis aus dem chromatographischen Trennsystem 1,2 ebenfalls diesen Ort des Mischens erreicht. Dieser Ort des Mi- schens kann sich je nach der gewählten Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens oder Kompensationsverfahrens im Inneren eines T-Stücks 3 (vgl. Fig. 1 und 2), im Anschluss an eine Zuführeinheit 10 (siehe Unterduckkammer 12 in Fig. 3), oder im Inneren einer Mischeinheit 11 (vgl. Fig. 4) befinden. Damit für die Zielanalyt-Zuführung unter diesen Voraussetzungen genügend Zeit zur Verfügung steht, wird vorzugsweise die Zeit verlängert, die das Eluat aus dem chromatographischen Trennsystem 1,2 benötigt, um vom Durchfluss-Detektor 13 zum gewählten Ort des Mischens zu gelangen. Bei gleichbleibendem Fluss im System stellt eine Verlängerung des Weges zwischen dem Durchfluss-Detektor 13 und dem Ort des Mischens im Inneren eines T-Stücks 3, im Anschluss an eine Zuführeinheit 10, oder im Inneren einer Mischeinheit 11 eine einfache Lösung dieser Vorschrift dar. Eine solche Wegverlängerung 15 wird beispielsweise mit einer Kapillare (ähnlich einer HPLC-Kapillare) erzielt, die beispielsweise zwischen dem Durchfluss-Detektor 13 und dem T-Stück 3 platziert wird. Falls eine grossere Wegverlängerung 15 erforderlich ist, kann die Kapillare aufgewickelt sein (vgl. Fig. 1). Alternativ und/oder zusätzlich kann der entsprechende Einlassschenkel des T-Stücks 3 verlängert sein bzw. ein den Weg verlängerndes Labyrinth aufweisen (nicht gezeigt). Bei einer derartigen Vorrichtung kann beim Detektieren eines interessierenden Ereignisses im Durchfluss-Detektor 13 die Pumpe 4 für die Zielanalyt-Zuführung rechtzeitig in Gang gesetzt werden. Auch bei einer zeitgesteuerten Zielanalyt- Zuführung kann die Wegverlängerung 15 vorteilhaft eingesetzt werden. Im Folgenden wird die Auswertung der erhaltenen Massenspektrogramme erläutert:In the case of the target analyte feed, the target analyte preferably reaches the point of mixing with the eluate from the chromatographic separation system 1, 2 shortly before the time at which an interesting event from the chromatographic separation system 1, 2 likewise reaches this location of mixing. Depending on the selected embodiment of the device for carrying out the test method or compensation method, this location of mixing can take place inside a T-piece 3 (compare FIGS. 1 and 2), following a feed unit 10 (see sub-pressure chamber 12 in FIG 3), or inside a mixing unit 11 (see Fig. 4). In order for sufficient time to be available for the target analyte feed under these conditions, it is preferable to extend the time taken for the eluate from the chromatographic separation system 1, 2 to pass from the flow detector 13 to the chosen location of mixing. With constant flow in the system, an extension of the path between the flow detector 13 and the location of mixing inside a T-piece 3, following a feed unit 10, or inside a mixing unit 11 is a simple solution to this requirement Such path extension 15 is achieved, for example, with a capillary (similar to an HPLC capillary), which is placed, for example, between the flow detector 13 and the T-piece 3. If a larger travel extension 15 is required, the capillary can be wound up (see Fig. 1). Alternatively and / or additionally, the corresponding inlet leg of the T-piece 3 can be extended or have a labyrinth extending the path (not shown). In such a device, upon detection of an event of interest in the flow detector 13, the target analyte delivery pump 4 may be timed in time. Even with a time-controlled Zielanalyt- supply the path extension 15 can be used advantageously. The following is an explanation of the evaluation of the mass spectrograms obtained:
In der Auswertung dieser Massenspektrogramme wird zum einen die Peakfläche A des Zielanalyten (die durch den eigentlichen massenspektrometrischen Prozess ge- neriert wird) durch etablierte Verfahren der Fusspunkt-Erkennung und Flächenmessung erfasst. Zusätzlich wird der „Untergrund" d.h. die Fläche B des Vierecks unter dem jeweiligen Peak erfasst (vgl. Fig. 5). Die „Response" der Einzelanalyse wird vorzugsweise berechnet als Quotient der Peakfläche A zur Fläche B des Vierecks unterhalb des Peaks 7. Diese Fläche B wird gebildet durch die Integrationslinie 6 des Peaks 7, die Basislinie des Massenspektrogramms sowie den Loten, die von den Enden der Peak-Integrationslinie 6 auf die Basislinie gefällt werden (vgl. Fig. 5; Flächen A und B).In the evaluation of these mass spectrograms, on the one hand, the peak area A of the target analyte (which is generated by the actual mass spectrometric process) is detected by established methods of base point detection and area measurement. In addition, the "background", ie the area B of the quadrilateral, is detected below the respective peak (see Fig. 5) .The "response" of the single analysis is preferably calculated as the quotient of the peak area A to the area B of the quadrangle below the peak 7. This Area B is formed by the integration line 6 of the peak 7, the baseline of the mass spectrogram and the solders which are precipitated from the ends of the peak integration line 6 to the baseline (see Figure 5, areas A and B).
Verringert oder erhöht sich im Zeitraum der Elution des Analyt-Peaks 7 die Ionisie- rungs-Effizienz hinsichtlich des Zielanalyten, so ergibt sich eine Verringerung bzw. Zunahme der aufgezeichneten Peakfläche A. Ebenso ergibt sich jedoch eine Verringerung bzw. Zunahme der Fläche B des Untergrundes unter dem Peak. Hierdurch wird der Quotient der beiden Flächen A/B unabhängig von der momentanen Ionenausbeute. Mithin ist das Verfahren dazu geeignet, Varianzen in der Ionenausbeute zu egalisieren, ebenso wie dies für distinkte Interne Standard-Substanzen gilt, die einer Probe vor Analyse zugesetzt werden. Sind die Konzentrationen des Analyten in der Probe und in der Elutionslösung bekannt, so ermöglicht der Quotient der beiden Flächen A/B oder eine andere mathematische Beziehung wie z.B. der Quotient der Quadrate dieser Flächen A2/B2 bzw. der Wert einer anderen vorgängig genann- ten mathematischen Beziehung der Flächen A und B eine Aussage zur Qualität der Analyse.If the ionization efficiency with respect to the target analyte decreases or increases in the period of the elution of the analyte peak 7, there is a reduction or increase in the recorded peak area A. However, a reduction or increase in the area B of the substrate likewise results under the peak. As a result, the quotient of the two surfaces A / B is independent of the instantaneous ion yield. Thus, the method is suitable for equalizing variances in ion yield, as well as for distinct internal standard substances added to a sample prior to analysis. If the concentrations of the analyte in the sample and in the elution solution are known, then the quotient of the two surfaces A / B or another mathematical relationship such as the quotient of the squares of these surfaces A 2 / B 2 or the value of another previously mentioned - A mathematical relationship of the areas A and B a statement on the quality of the analysis.
Das beschriebene Verfahren bietet des Weiteren wesentliche und überraschende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik, da die Möglichkeit eröffnet wird, chro- matographische und vor allem massenspektrometrische Analysemethoden zu entwickeln, ohne dass hierfür separate Substanzen zur internen Standardisierung benötigt werden : Die Monitor-Substanz (entweder der mobilen Phase zugegeben oder post-column dem Fluss zugemischt) ist im beschriebenen Verfahren identisch mit dem jeweiligen Zielanalyten. Gegenüber konventionellen Verfahren der internen Standardisierung mit Zugabe des Internen Standards im Rahmen der Probenvorbereitung wird eine Arbeitsersparnis in der Probenvorbereitung erzielt. Im Falle massenspektrometrischer Methoden - vor allem auch gegenüber der Methode nach Stahnke et al. - ergibt sich als weiterer Vorteil, dass nur eine einzige Massenspur pro Analyt für die Quantifizierung aufgezeichnet werden muss.The method described furthermore offers significant and surprising advantages over the prior art, since the possibility is opened up of developing chromatographic and above all mass spectrometric analysis methods, without requiring separate substances for internal standardization: the monitor substance (either added to the mobile phase or added post-column to the flow) is identical in the described method with the respective Zielanalyten. Compared to conventional methods of internal standardization with the addition of the internal standard in the context of sample preparation, labor savings in sample preparation are achieved. In the case of mass spectrometric methods - above all with respect to the method according to Stahnke et al. - results as a further advantage that only a single mass trace per analyte must be recorded for the quantification.
Wird die System-Konfiguration verwendet, bei der der Zielanalyt in der mobilen Phase gelöst ist (wie hier beschrieben), ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber der Methode nach Stahnke et al., dass keine zusätzlichen Ausrüstungsgegenstände benötigt werden.Using the system configuration in which the target analyte is dissolved in the mobile phase (as described herein), a significant advantage over the Stahnke et al. Method is that no additional equipment is needed.
Die Suche nach einer Referenzsubstanz, die in ihren Signalgebungseigenschaften dem Zielanalyt sehr ähnlich ist, stellte bisher eine wesentliche Herausforderung bei der Entwicklung entsprechender Methoden dar: Werden keine geeigneten Referenzsubstanzen gefunden, so scheitert die Entwicklung spezifischer massenspektrometrischer Methoden nicht selten gänzlich. Mithin erweitert die Erfindung die Anwendbarkeit quantitativer chromatographischer/massenspektrometrischer Analysenmethoden in der chemischen Analytik wesentlich.The search for a reference substance, which is very similar to the target analyte in its signaling properties, has so far been a major challenge in the development of appropriate methods: If no suitable reference substances are found, the development of specific mass spectrometric methods often fails completely. Thus, the invention substantially extends the applicability of quantitative chromatographic / mass spectrometric analytical methods in chemical analysis.
Die Funktionstüchtigkeit des Verfahrens wird an Hand eines Ausführungsbeispiels durch die Messung des Immunsuppressivums Tracrolimus aus humanen Vollblutproben demonstriert. Hierfür wurden vier Kalibrator-Proben im therapeutischen Konzentrationsbereich nach Proteinfällung verwendet. Diese Präzipitate wurden mit- tels LC-MS/MS analysiert (Beschreibung der Methode: Vogeser, Michael et al. 2008 "Instrument-specific matrix effects of calibration materials in the LC-MS/MS analy- sis of tacrolimus" Clin. Chem. 54: 1406-8). In den Flüssigkeitsstrom zwischen analytischer Säule und Massenspektrometrie-System wurde eine Lösung von Tacrolimus (100 μg/l in Methanol/Wasser, 1/1) mit einer Rate von 5 μl/min über ein T- Stück infundiert (gemäss Figur 1).The functionality of the method is demonstrated by means of an exemplary embodiment by measuring the immunosuppressant tracrolimus from human whole blood samples. For this four calibrator samples were used in the therapeutic concentration range after protein precipitation. These precipitates were analyzed by means of LC-MS / MS (description of the method: Vogeser, Michael et al., 2008 "Instrument-specific matrix effects of calibration materials in the LC-MS / MS analysis of tacrolimus" Clin. Chem. 54: 1406-8). Into the liquid stream between the analytical column and the mass spectrometry system, a solution of tacrolimus (100 μg / l in methanol / water, 1/1) was infused via a T-piece at a rate of 5 μl / min (according to FIG. 1).
Figur 5 zeigt ein so über seine ganze Laufzeit aufgezeichnetes Massenspektro- gramm. Erfasst wird dabei ein für Tacrolimus spezifischer Massenübergang (Mutter- Ion 821.5 m/z; Produkt-Ion 768.5 m/z). Die Fläche A ist die Peak-Fläche; die Flä- che B ist die Untergrundfläche unter dem Peak, die durch die kontinuierliche Tacro- limus-Infusion generiert wird. Die Flächen A und B können sowohl aus analogen als auch aus digitalen Signalen bzw. Daten des Massenspektrometer-Detektors berechnet werden.FIG. 5 shows a mass spectrometer thus recorded over its entire duration. In this case, a mass transfer specific for tacrolimus is detected (parent ion 821.5 m / z, product ion 768.5 m / z). The area A is the peak area; the area Surface B is the background area under the peak generated by the continuous tacro-limbus infusion. The areas A and B can be calculated both from analog and from digital signals or data of the mass spectrometer detector.
Die Figur 6 zeigt die Kalibrierfunktion, die basierend auf dieser massenspektrogra- phischen Auswertung erstellt wunde. Auf der X-Achse wurden die bekannten Ana- lyt-Konzentrationen der Kalibrator-Proben aufgetragen. Die Y-Achse zeigt die entsprechenden Response als Peakflächen-Verhältnis Fläche A / Fläche B. Es ergibt sich eine lineare Beziehung zwischen Peak-Flächen-Response und Kalibrator-FIG. 6 shows the calibration function that was created based on this mass spectrographic evaluation. On the X-axis, the known analyte concentrations of the calibrator samples were plotted. The Y axis shows the corresponding response as peak area ratio area A / area B. The result is a linear relationship between peak area response and calibrator
Konzentrationen. Eine in dieser Serie an Hand des dargestellten Prinzips analysierte Qualitätskontrollprobe wurde mit einer Konzentration von 5.2 μg/l innerhalb des vom Hersteller spezifizierten Zielbereichs gefunden.Concentrations. A quality control sample analyzed in this series using the illustrated principle was found at a concentration of 5.2 μg / L within the manufacturer's specified target range.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens zur Kompensation von Ionenausbeute-Varianzen in der Massenspektrometrie umfassen die folgenden Merkmale:Particularly preferred embodiments of the method for compensating ion yield variances in mass spectrometry include the following features:
Ein differenziertes chromatographisches Analysenverfahren zur Kompensation von Varianzen in der signalerzeugenden Einheit bei quantifizierenden chromatographischen Analysen ist dadurch gekennzeichnet, dass der signalerzeugenden Einheit (dem Detektor) während einer Analysenserie kontinuierlich und in gleichbleibender Rate eine Reinlösung des Zielanalyten der Messung zugeführt wird.A differentiated chromatographic analysis method for compensating variances in the signal-generating unit in quantitative chromatographic analyzes is characterized in that the signal-generating unit (the detector) during a series of analyzes continuously and at a constant rate a pure solution of the Zielanalyten the measurement is supplied.
Des Weiteren ist ein solches chromatographisches Analyseverfahren vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass auf diese Weise im Chromatogramm ein Hintergrund-Signal erzeugt wird ( = Basislinien-Anhebung, Offset).Furthermore, such a chromatographic analysis method is preferably characterized in that in this way a background signal is generated in the chromatogram (= baseline elevation, offset).
Zudem sind derartige chromatographische Analyse verfahren bevorzugt dadurch ge- kennzeichnet, dass die kontinuierliche Zuführung des Zielanalyten entweder dadurch erzielt wird, dass der Zielanalyt in der mobilen Phase des chromatographischen Systems gelöst ist (bei Methoden mit isokratischer Elution) oder dass in den Fluss distal der analytischen Trennsäule durch ein T-Stück und eine zweite Pump- einheit eine Lösung des Zielanalyten als Referenzsubstanz kontinuierlich und in gleichbleibender Rate zugemischt wird.Moreover, such chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the continuous delivery of the target analyte is achieved either by the target analyte being dissolved in the mobile phase of the chromatographic system (in methods with isocratic elution) or by being in the flow distal to the analytical analyte Separating column through a T-piece and a second pumping unit a solution of the target analyte is added as a reference substance continuously and at a constant rate.
Ausserdem sind derartige chromatographische Analyseverfahren vorzugsweise da- durch gekennzeichnet, dass die so erreichte Basislinien-Anhebung im Chroma- togramm zur Kompensation von Varianzen der Signalerzeugung des jeweiligen Detektors bezüglich des jeweiligen Zielanalyten genutzt wird.Moreover, such chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the baseline increase in the chromatogram thus achieved is used to compensate for variances in the signal generation of the respective detector with respect to the respective target analyte.
Weiters sind derartige chromatographische Analyseverfahren bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass das Viereck unterhalb der Integrationslinie des Peaks eines Zielanalyten bewertet wird.Furthermore, such chromatographic analysis methods are preferably characterized in that the quadril be evaluated below the integration line of the peak of a Zielanalyten.
Endlich sind solche chromatographische Analyse verfahren besonders bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung des Zielanalyten die Fläche, die durch Lotfällung von der Peak-Integrationslinie unter dem integrierten chromatographischen Peak des Zielanalyten gefunden wird, in einem Auswertungsverfahren mit der integrierten Peakfläche oberhalb der Integrationslinie des Zielanalyten zum Zwecke der Quantifizierung von Zielanalyten in Beziehung gesetzt wird.Finally, such chromatographic analysis methods are particularly preferably characterized in that, for quantification of the target analyte, the area found by solder precipitation from the peak integration line below the integrated chromatographic peak of the target analyte in an integrated peak area analysis method above the integration line of the target analyte Purposes of quantifying target analytes.
Sinnvolle Kombinationen der gezeigten bzw. beschriebenen Ausführungsformen gehören zum Umfang der vorliegenden Erfindung. Useful combinations of the illustrated and described embodiments are within the scope of the present invention.
Bezugszeichen :Reference number:
I H PLC- Pumpe 2 Trenn-Säule _J~-~ chromatographisches TrennsystemIH PLC pump 2 Separation column _J ~ - ~ chromatographic separation system
3 T-Stück3 tees
4 Pumpe4 pump
4 b Reservoir4 b reservoir
4c Dreiwegventil 5 Massenspektrometer4c three-way valve 5 mass spectrometer
5' signalgebender Detektor von 55 'signaling detector of 5
6 Integrationslinie von 76 integration line of 7
7 massenspektrographischer Peak7 mass spectrographic peak
8 erster separater Einspritzkanal 9 zweiter separater Einspritzkanal8 first separate injection channel 9 second separate injection channel
10 Zuführeinheit10 feed unit
I I MischeinheitI I mixing unit
12 Unterdruckkammer12 vacuum chamber
13 Durchfluss-Detektor 14 Zeitfenster13 flow detector 14 time window
15 Wegverlängerung15 way extension
A Peak-Fläche des Zielanalyten (oberhalb der Integrationslinie 6) B Fläche unterhalb der Integrationslinie von 7 durch Lotfällung (als Basislinien- Anhebung) A peak area of the target analyte (above integration line 6) B area below the integration line of 7 by lot precipitation (as baseline elevation)

Claims

Patentansprüche claims
1. Testverfahren zum Kontrollieren der Funktion eines Massenspektrometers (5), dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Arbeitsschritte umfasst:A test method for controlling the function of a mass spectrometer (5), characterized in that it comprises the following steps:
(a) Mischen eines Eluats eines chromatographischen Trennsystems (1,2) und einer Zielanalytlösung mit bekannter Konzentration;(a) mixing an eluate of a chromatographic separation system (1,2) and a target analyte solution of known concentration;
(b) Einspritzen des in Schritt (a) erstellten Gemisches in ein Massenspektro- meter (5), das mindestens einen signalgebenden Detektor (5') umfasst;(b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer (5) comprising at least one signal-emitting detector (5 ');
(c) Erfassen eines auf dem Detektorsignal basierenden Massenspektro- gramms, das eine Integrationslinie (6) und einen massenspektrographi- schen Peak (7) des Zielanalyten umfasst;(c) detecting a detector signal based mass spectrometry comprising an integration line (6) and a mass spectrographic peak (7) of the target analyte;
(d) Auswerten des Massenspektrogramms durch das Erfassen einer integrier- ten massenspektrographischen Peakfläche (A) oberhalb der Integrationslinie (6) des Zielanalyten sowie einer Fläche (B), die durch Lotfällung von der Peak-Integrationslinie (6) unter der integrierten Peakfläche (A) des Zielanalyten gefunden wird;(d) evaluating the mass spectrogram by detecting an integrated mass spectrographic peak area (A) above the integration line (6) of the target analyte and a surface (B) obtained by plumbing from the peak integration line (6) below the integrated peak area (A ) of the target analyte is found;
(e) Bilden einer mathematischen Beziehung aus den ermittelten mas- senspektrographischen Flächen (A) und (B);(e) forming a mathematical relationship from the determined mass spectrographic surfaces (A) and (B);
(f) Festsetzen zumindest eines Schwellenwerts für die in Schritt (e) gebildete mathematischen Beziehung, der die Grenze der akzeptablen Qualität einer massenspektrometrischen Analyse bezeichnet; und(f) establishing at least one threshold for the mathematical relationship formed in step (e), which denotes the limit of acceptable quality of a mass spectrometric analysis; and
(g) Akzeptieren oder Ablehnen der massenspektrometrischen Analyse einer Probe auf Grund eines Vergleichs der mathematischen Beziehung mit dem festgesetzten Schwellenwert.(g) Accepting or rejecting the mass spectrometric analysis of a sample based on a comparison of the mathematical relationship with the established threshold.
2. Verfahren zur Kompensation von Ionenausbeute-Varianzen in der Massenspek- trometrie, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Arbeitsschritte um- fasst:2. Method for compensating ion yield variances in mass spectrometry, characterized in that it comprises the following working steps:
(a) Mischen eines Eluats eines chromatographischen Trennsystems (1,2) und einer Zielanalytlösung mit bekannter Konzentration;(a) mixing an eluate of a chromatographic separation system (1,2) and a target analyte solution of known concentration;
(b) Einspritzen des in Schritt (a) erstellten Gemisches in ein Massenspektro- meter (5), das mindestens einen signalgebenden Detektor (5') umfasst; (c) Erfassen eines auf dem Detektorsignal basierenden Massenspektro- gramms, das eine Integrationslinie (6) und einen massenspektrographi- schen Peak (7) des Zielanalyten umfasst;(b) injecting the mixture prepared in step (a) into a mass spectrometer (5) comprising at least one signal-emitting detector (5 '); (c) detecting a detector signal based mass spectrometry comprising an integration line (6) and a mass spectrographic peak (7) of the target analyte;
(d) Auswerten des Massenspektrogramms durch das Erfassen einer integrier- ten massenspektrographischen Peakfläche (A) oberhalb der Integrationslinie (6) des Zielanalyten sowie einer Fläche (B), die durch Lotfällung von der Peak-Integrationslinie (6) unter der integrierten Peakfläche (A) des Zielanalyten gefunden wird;(d) evaluating the mass spectrogram by detecting an integrated mass spectrographic peak area (A) above the integration line (6) of the target analyte and a surface (B) obtained by plumbing from the peak integration line (6) below the integrated peak area (A ) of the target analyte is found;
(e) Bilden einer mathematischen Beziehung aus den ermittelten mas- senspektrographischen Flächen (A) und (B); und(e) forming a mathematical relationship from the determined mass spectrographic surfaces (A) and (B); and
(f) Auswerten des Massenspektrogramms zur Kompensation von Varianzen in der Ionenausbeute im Detektor (5')-(f) evaluating the mass spectrogram to compensate for variances in the ion yield in the detector (5 ') -
3. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mathematische Beziehung ausgewählt ist aus einer Gruppe, welche die Quotienten (A/B), (B/A), (A-B/A) und (A2/B2) sowie die Differenz [log(A)-log(B)] und deren entsprechende Umkehrwerte umfasst.3. Test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that the mathematical relationship is selected from a group which the quotients (A / B), (B / A), (AB / A) and (A 2 / B 2 ) and the difference [log (A) -log (B)] and their corresponding inversion values.
4. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mathematische Beziehung durch den Quotienten (A/B) definiert ist.4. Test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that the mathematical relationship by the quotient (A / B) is defined.
5. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate Lösung eines Zielanalyten dem Eluat des chromatographischen Trennsystems (1,2) während der mas- senspektrometrischen Analyse kontinuierlich und in gleichbleibender Rate zugemischt wird.5. The test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that a separate solution of a target analyte is added to the eluate of the chromatographic separation system (1,2) during the mass spectrometric analysis continuously and at a constant rate.
6. Testverfahren oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Zuführung des Zielanalyten in gleichbleibender Rate während eines Zeitfensters (14) erfolgt, das kürzer ist als die Laufzeit des Massenspektrogramms. A test method or compensation method according to claim 5, characterized in that the continuous delivery of the target analyte is carried out at a constant rate during a time window (14) which is shorter than the run time of the mass spectrogram.
7. Testverfahren oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Zuführung des Zielanalyten über eine mit einem vor dem Massenspektrometer (5) angeordneten T-Stück (3) in Wirkverbindung stehende Pumpe (4) erfolgt.7. Test method or compensation method according to claim 5 or 6, characterized in that the continuous supply of Zielanalyten via a with a front of the mass spectrometer (5) arranged T-piece (3) operatively connected pump (4).
8. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zielanalyt in der mobilen Phase des chromatographischen Trennsystems (1,2) gelöst ist.8. Test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that a target analyte is dissolved in the mobile phase of the chromatographic separation system (1,2).
9. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate Lösung eines Zielanalyten und das Eluat des chromatographischen Trennsystems (1,2) während der massenspektrometrischen Analyse kontinuierlich und in gleichbleibender Rate über separate Einspritzkanäle (8,9) einer Zuführeinheit (10), einer Unter- druckkammer (12) und dann der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden.9. Test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that a separate solution of a Zielanalyten and the eluate of the chromatographic separation system (1,2) during the mass spectrometric analysis continuously and at a constant rate via separate injection channels (8,9) of a Feed unit (10), a vacuum chamber (12) and then the mass spectrometric analysis are supplied.
10. Testverfahren nach Anspruch 1 oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate Lösung eines Zielanalyten und das Eluat des chromatographischen Trennsystems während der massenspektrometrischen Analyse kontinuierlich und in gleichbleibender Rate über konvergierende Einspritzkanäle (8,9) einer Mischeinheit (11) zugeführt, in dieser Mischeinheit miteinander vermischt und dann der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden.10. The test method according to claim 1 or compensation method according to claim 2, characterized in that a separate solution of a Zielanalyten and the eluate of the chromatographic separation system during the mass spectrometric analysis continuously and at a constant rate via converging injection channels (8,9) fed to a mixing unit (11) , are mixed together in this mixing unit and then fed to the mass spectrometric analysis.
11. Testverfahren oder Kompensationsverfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche Zuführung des Zielanalyten in gleichbleibender Rate während eines Zeitfensters (14) erfolgt, das kürzer ist als die Laufzeit des Massenspektrogramms. A test method or compensation method according to claim 9 or 10, characterized in that the continuous supply of the target analyte is carried out at a constant rate during a time window (14) which is shorter than the duration of the mass spectrogram.
12. Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder des Kompensationsverfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst:12. Device for carrying out the test method according to one of claims 1 to 7 or the compensation method according to one of claims 2 to 7, characterized in that it comprises:
(a) eine Pumpe (4) mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanalyten mit bekannter Konzentration; und(a) a pump (4) with pump control for delivering a solution of a target analyte of known concentration; and
(b) ein vor dem Massenspektrometer (5) anordenbares T-Stück (3), das einen ersten Anschluss zum Verbinden des T-Stücks (3) mit dem Massenspektrometer (5), einen zweiten Anschluss zum Verbinden des T- Stücks mit der Pumpe (4) und einen dritten Anschluss zum Einleiten des Eluats aus einem chromatographischen Trennsystem (1,2) umfasst, und optional :(b) a T-piece (3) which can be arranged in front of the mass spectrometer (5) and which has a first connection for connecting the T-piece (3) to the mass spectrometer (5), a second connection for connecting the T-piece to the pump (4) and a third port for introducing the eluate from a chromatographic separation system (1,2), and optionally:
(c) einen Durchfluss-Detektor (13).(c) a flow detector (13).
13. Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens oder Kompensationsverfah- rens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst:13. Device for carrying out the test method or compensation method according to claim 9, characterized in that it comprises:
(a) eine Pumpe (4) mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanalyten mit bekannter Konzentration; und(a) a pump (4) with pump control for delivering a solution of a target analyte of known concentration; and
(b) eine vor dem Massenspektrometer (5) anordenbare Zuführeinheit (10), die einen ersten Anschluss zum Verbinden der Zuführeinheit (10) mit ei- ner dem Massenspektrometer (5) vorgeschalteten Unterdruckkammer(b) a supply unit (10) which can be arranged in front of the mass spectrometer (5) and which has a first connection for connecting the supply unit (10) to a vacuum chamber upstream of the mass spectrometer (5)
(12), einen ersten Einspritzkanal (8) mit einem zweiten Anschluss zum Einleiten des Eluats aus einem chromatographischen Trennsystem (1,2) und einen dritten Anschluss zum Verbinden der Zuführeinheit (10) mit der Pumpe (4) umfasst, und optional : (c) einen Durchfluss-Detektor (13).(12), a first injection channel (8) having a second port for introducing the eluate from a chromatographic separation system (1,2) and a third port for connecting the delivery unit (10) to the pump (4), and optionally: ( c) a flow detector (13).
14. Vorrichtung zur Durchführung des Testverfahrens oder Kompensationsverfahrens nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst:14. Apparatus for carrying out the test method or compensation method according to claim 10, characterized in that it comprises:
(a) eine Pumpe (4) mit Pumpensteuerung zum Fördern einer Lösung eines Zielanalyten mit bekannter Konzentration; und(a) a pump (4) with pump control for delivering a solution of a target analyte of known concentration; and
(b) eine vor dem Massenspektrometer (5) anordenbare Mischeinheit (11), die einen ersten Anschluss zum Verbinden der Mischeinheit (11) mit dem Massenspektrometer (5), einen ersten Einspritzkanal (8) mit einem zweiten Anschluss zum Einleiten des Eluats aus einem chromatographischen Trennsystem (1,2) und einen dritten Anschluss zum Verbinden der Mischeinheit (11) mit der Pumpe (4) umfasst, und optional : (c) einen Durchfluss-Detektor (13).(b) a mixing unit (11) which can be arranged in front of the mass spectrometer (5) and which has a first connection for connecting the mixing unit (11) to the mass spectrometer (5), a first injection channel (8) having a second connection for introducing the eluate from a chromatographic Separating system (1,2) and a third connection for connecting the mixing unit (11) with the pump (4), and optionally: (c) a flow detector (13).
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie zudem ein Reservoir (4b) für die Lösung des Zielanalyten umfasst.15. Device according to one of claims 12 to 14, characterized in that it further comprises a reservoir (4b) for the solution of the Zielanalyten.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie zudem ein Dreiwegventil (4c) umfasst, das zwischen der Pumpe (4) und dem Reser- voir (4b) sowie dem T-Stück (3) oder der Zuführeinheit (10) bzw. Mischeinheit16. The device according to claim 15, characterized in that it also comprises a three-way valve (4c), the between the pump (4) and the reservoir (4b) and the T-piece (3) or the feed unit (10) or Mixing unit
(11) angeordnet ist.(11) is arranged.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpe ausgewählt ist aus einer Gruppe, die Piezopumpen, Spritzen- pumpen, Kolbenpumpen und Peristaltikpumpen umfasst.17. Device according to one of claims 12 to 16, characterized in that the pump is selected from a group comprising piezo pumps, syringe pumps, piston pumps and peristaltic pumps.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Durchfluss-Detektor (13) mit zugehöriger Steuerung umfasst, wobei der Durchfluss-Detektor (13) zwischen dem chromatographischen Trennsystem (1,2) und dem T-Stück (3), oder zwischen dem chromatographischen Trennsystem (1,2) und der Zuführeinheit (10), oder zwischen dem chromatographischen Trennsystem (1,2) und der Mischeinheit (11) angeordnet und zur optischen Analyse des Eluats aus dem chromatographischen Trennsystem (1,2) ausgebildet ist. 18. Device according to one of claims 12 to 17, characterized in that it comprises a flow detector (13) with associated control, wherein the flow detector (13) between the chromatographic separation system (1,2) and the T-piece (3), or between the chromatographic separation system (1,2) and the feed unit (10), or between the chromatographic separation system (1,2) and the mixing unit (11) and for the optical analysis of the eluate from the chromatographic separation system (1 , 2) is formed.
EP10725193A 2009-06-25 2010-06-18 Functional check and variance compensation in mass spectrometry Withdrawn EP2446460A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009030395A DE102009030395A1 (en) 2009-06-25 2009-06-25 Differentiated chromatographic analysis method for compensating variances in the signal-generating unit in quantitative chromatographic analyzes
PCT/EP2010/058665 WO2010149595A1 (en) 2009-06-25 2010-06-18 Functional check and variance compensation in mass spectrometry

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2446460A1 true EP2446460A1 (en) 2012-05-02

Family

ID=42331054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP10725193A Withdrawn EP2446460A1 (en) 2009-06-25 2010-06-18 Functional check and variance compensation in mass spectrometry

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8829429B2 (en)
EP (1) EP2446460A1 (en)
JP (1) JP5665863B2 (en)
CN (1) CN102484030B (en)
DE (1) DE102009030395A1 (en)
WO (1) WO2010149595A1 (en)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140194304A1 (en) * 2013-01-08 2014-07-10 Battelle Memorial Institute Process for ultra-sensitive quantification of target analytes in complex biological systems
CN103868999B (en) * 2014-04-02 2015-07-08 华中科技大学 Method for identifying samples by utilizing chromatographic feature extraction
CN105223264B (en) * 2015-09-21 2017-12-29 广东联捷生物科技有限公司 A kind of simulation internal standard method, apparatus of mass spectrum quantitative analysis and application
JP7051871B2 (en) * 2016-12-23 2022-04-11 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Methods for Identifying Reagents During Processes in Analytical Systems
JP7046070B2 (en) 2016-12-23 2022-04-01 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Methods for Identifying Reagents During Processes in Analytical Systems
EP3376222A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-19 Biotage AB Baseline correction for liquid chromatography / mass spectroscopy
AU2019282692A1 (en) * 2018-06-08 2020-12-17 Amgen Inc. Systems and methods for reducing lab- to-lab and/or instrument-to-instrument varibility of multi-attribute method (MAM) by run-time signal intensity calibrations
NL2022019B1 (en) 2018-11-16 2020-05-26 Univ Leiden Method for Matrix Effect Correction in Quantitative Mass Spectrometric Analysis of Analytes in Complex Matrices.
JP2022532598A (en) * 2019-05-10 2022-07-15 オルビヌム アクチェンゲゼルシャフト Mass spectrometry to identify and / or confirm a sample
CN112433010A (en) * 2019-08-26 2021-03-02 湖南德米特仪器有限公司 Chromatographic system with detector correction
GB201914451D0 (en) * 2019-10-07 2019-11-20 Micromass Ltd Automatically standardising spectrometers
CN115244397A (en) * 2020-03-16 2022-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 Quality control tool for LC-MS
WO2024013240A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 Roche Diagnostics Gmbh A method for quality check of at least one lc-ms measurement

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017A (en) * 1851-04-01 Splint-machine
JPH0783903A (en) * 1993-09-09 1995-03-31 Yamatake Honeywell Co Ltd Peak area operation method of gaschromatograph
WO1998026179A1 (en) 1996-12-11 1998-06-18 GeSIM Gesellschaft für Silizium-Mikrosysteme mbH Microejection pump
JP3366840B2 (en) * 1997-09-05 2003-01-14 分析機器校正協同組合 Apparatus quality control method and device
US6465776B1 (en) 2000-06-02 2002-10-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Mass spectrometer apparatus for analyzing multiple fluid samples concurrently
AU2003262824B2 (en) * 2002-08-22 2007-08-23 Applied Biosystems Inc. Method for characterizing biomolecules utilizing a result driven strategy
CA2621910A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Human Metabolome Technologies, Inc. Method for calibrating detected mass in mass spectrometry system
JP3121568U (en) * 2006-03-01 2006-05-18 株式会社島津製作所 Mass spectrometer
CN101334375A (en) * 2007-06-28 2008-12-31 上海通微分析技术有限公司 Analytical method for mixing water-soluble vitamin
JP5227556B2 (en) * 2007-09-06 2013-07-03 株式会社日立製作所 Analysis equipment
WO2009108538A2 (en) * 2008-02-26 2009-09-03 Phoenix S & T, Inc. Method and apparatus to increase throughput of liquid chromatography-mass spectrometry

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEDCKE D A: "How Counting Statistics Controls Detection Limits and Peak Precision", INTERNET CITATION, 20 July 2001 (2001-07-20), pages 1 - 15, XP007914018, Retrieved from the Internet <URL:http://faculty.fiu.edu/~almirall/countingstats.pdf> [retrieved on 20100720] *
HELEN STAHNKE ET AL: "Compensation of Matrix Effects by Postcolumn Infusion of a Monitor Substance in Multiresidue Analysis with LC-MS/MS", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 81, no. 6, 15 March 2009 (2009-03-15), US, pages 2185 - 2192, XP055483067, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/ac802362s *
K. WINKLER ET AL: "Apolipoprotein A-II Is a Negative Risk Indicator for Cardiovascular and Total Mortality: Findings from the Ludwigshafen Risk and Cardiovascular Health Study", CLINICAL CHEMISTRY., vol. 54, no. 8, 29 May 2008 (2008-05-29), WASHINGTON, DC., pages 1405 - 1406, XP055483086, ISSN: 0009-9147, DOI: 10.1373/clinchem.2008.103929 *
WATSON J T ET AL: "Introduction to Mass Spectrometry, Passage", 1 January 2007, INTRODUCTION TO MASS SPECTROMETRY : INSTRUMENTATION, APPLICATIONS, AND STRATEGIES FOR DATA INTERPRETATION, WILEY, CHICHESTER [U.A], PAGE(S) 131 - 135,618, ISBN: 978-0-470-51634-8, XP002592793 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010149595A1 (en) 2010-12-29
JP5665863B2 (en) 2015-02-04
CN102484030A (en) 2012-05-30
JP2012530918A (en) 2012-12-06
DE102009030395A1 (en) 2011-05-26
US20120187284A1 (en) 2012-07-26
US8829429B2 (en) 2014-09-09
CN102484030B (en) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010149595A1 (en) Functional check and variance compensation in mass spectrometry
CN108254481B (en) Method for rapidly detecting multi-class medicines, personal care products and pesticides in water
Hermo et al. Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC–UV, LC–FD, LC–MS and LC–MS/MS and validation in line with regulation 2002/657/EC
EP1481416B1 (en) Mass spectrometry method for analysing mixtures of substances
CN106526026B (en) The detection method of 25-hydroxy-vitamin D in serum
EP2110663B1 (en) GC-MS analysis device which can be switched between single-dimensional and two-dimensional operating modes
Li et al. Rapid simultaneous determination of dexamethasone and betamethasone in milk by liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution
DE112005002632T5 (en) liquid chromatograph
DE102015117365A1 (en) IMPROVED DETECTION SENSITIVITY IN ELECTROSPRAY IONIZATION MASS SPECTROMETRY USING A COLUMN-ADJUSTED MODIFYER AND MICROFLUIDIC DEVICE
JP6352047B2 (en) Simultaneous analysis of samples containing compounds with different polarities
CN107543876A (en) A kind of method that SPE liquid chromatography tandem mass spectrometry detects 9 kinds of estrogenic chemicalses in water body simultaneously
US10018603B2 (en) Two-dimensional liquid chromatography system for heart-cut method
EP1994403A2 (en) Analysis of substance mixtures
DE602005004968T2 (en) Column with conical intermediate piece
DE102017101427A1 (en) Multidimensional chromatographic system for the analysis of multiple sample components
DE102017011423B4 (en) Method and apparatus for isotope ratio mass spectrometry
Santos-Neto et al. Simultaneous analysis of five antidepressant drugs using direct injection of biofluids in a capillary restricted-access media-liquid chromatography–tandem mass spectrometry system
DE602004011795T2 (en) METHOD FOR INTRODUCING STANDARD GAS INTO A SAMPLING VESSEL
Piešťanský et al. Comparison of hydrodynamically closed isotachophoresis–capillary zone electrophoresis with hydrodynamically open capillary zone electrophoresis hyphenated with tandem mass spectrometry in drug analysis: Pheniramine, its metabolite and phenylephrine in human urine
Piešťanský et al. Enantioselective column coupled electrophoresis employing large bore capillaries hyphenated with tandem mass spectrometry for ultra‐trace determination of chiral compounds in complex real samples
US20160153941A1 (en) Liquid chromatography apparatus for fast measuring
DE112015004216T5 (en) Techniques for the representation and processing of mass spectral data
DE102005004800A1 (en) mass spectrometry
DE112006001012B4 (en) Process for the preparation of biopolymers for mass spectrometry
DE102014108125B4 (en) Gradient HPLC for the simultaneous determination of impurities from an active ingredient mixture of aminoglycoside and glycopeptide

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20111215

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20150721

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20181110