JP6352047B2 - Simultaneous analysis of samples containing compounds with different polarities - Google Patents
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Description
本発明は、移動相として超臨界流体を使用した超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)に関するものであり、さらに具体的には超臨界流体クロマトグラフィーよりも広い移動相組成範囲を含むクロマトグラフィー、いわゆる統一クロマトグラフィー(Unified Chromatograpy)に関するものである。 The present invention relates to supercritical fluid chromatography (SFC) using a supercritical fluid as a mobile phase, and more specifically, chromatography including a wider mobile phase composition range than supercritical fluid chromatography, so-called unification. It relates to chromatography (Unified Chromatograpy).
クロマトグラフィーでは、通常、液体、気体又は超臨界流体といった単一状態の移動相が使用され、目的に応じていずれかの移動相が選択される。しかし、標的化合物の化学的性質が広範囲にわたる場合には、移動相の異なる複数のクロマトグラフィーが組み合させる。 In chromatography, a single-phase mobile phase such as liquid, gas, or supercritical fluid is usually used, and any mobile phase is selected according to the purpose. However, if the target compound chemistry is extensive, multiple chromatographies with different mobile phases are combined.
超臨界流体クロマトグラフィーは、ガスクロマトグラフィー(GC)と液体クロマトグラフィー(LC)に対する相補的な分離技術であり、移動相として超臨界二酸化炭素(SCCO2)又は亜臨界二酸化炭素を用いる。超臨界は臨界温度及び臨界圧力を超えた状態であり、亜臨界は臨界点よりも低い近傍の領域にある状態である。 Supercritical fluid chromatography is a complementary separation technique for gas chromatography (GC) and liquid chromatography (LC), and uses supercritical carbon dioxide (SCCO 2 ) or subcritical carbon dioxide as the mobile phase. Supercritical is a state where the critical temperature and critical pressure are exceeded, and subcritical is a state in the vicinity of a region lower than the critical point.
臨界温度および/または臨界圧力の近く又はそれを越えた状態にある二酸化炭素(CO2)からなる流体である超臨界二酸化炭素は、臨界圧力が7.38MPaであり、臨界温度が31.1℃と比較的常温に近く、引火性や化学反応性がなく、純度の高いものが安価に手に入ることなどから、超臨界流体クロマトグラフィーで最もよく利用されている。超臨界二酸化炭素は低粘度と高拡散性というクロマトグラフィーとして好ましい性質をもち、超臨界二酸化炭素クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーと比べると、より高速で、かつより良好な分離を得ることができる。 Supercritical carbon dioxide, which is a fluid composed of carbon dioxide (CO 2 ) near or beyond the critical temperature and / or critical pressure, has a critical pressure of 7.38 MPa and a critical temperature of 31.1 ° C. It is most commonly used in supercritical fluid chromatography because it is relatively close to room temperature, has no flammability or chemical reactivity, and has high purity at low cost. Supercritical carbon dioxide has favorable properties as chromatography with low viscosity and high diffusivity, and supercritical carbon dioxide chromatography can obtain faster and better separation than liquid chromatography.
超臨界流体クロマトグラフィーの移動相の主な流体である超臨界流体二酸化炭素は、非極性でn−ヘキサンに類似していることから、超臨界流体クロマトグラフィーは順相クロマトグラフィーであり、非極性化合物の分析に適したものと考えられてきた。しかし、非極性の超臨界流体二酸化炭素は、メタノールやエタノールといった極性をもつ有機溶媒に対して相溶性をもつことから、これらの極性有機溶媒をモディファイアとして添加することにより移動相に極性をもたせることが行われている。モディファイアはその添加割合が時間とともに徐々に増加させられていき、一般には30−40%まで増加させられる。 Supercritical fluid carbon dioxide, the main fluid of the mobile phase of supercritical fluid chromatography, is nonpolar and similar to n-hexane, so supercritical fluid chromatography is normal phase chromatography and nonpolar It has been considered suitable for the analysis of compounds. However, since nonpolar supercritical fluid carbon dioxide is compatible with polar organic solvents such as methanol and ethanol, adding these polar organic solvents as modifiers makes the mobile phase polar. Things have been done. The modifier is added gradually over time and is generally increased to 30-40%.
超臨界流体クロマトグラフィーでは、非極性化合物だけでなく、モディファイアを添加することにより極性化合物も分析できる可能性がある。そのようにして極性化合物と非極性化合物の同時分析に超臨界流体クロマトグラフィーを活用したという報告(非特許文献1、2参照。)があるが、その数は非常にすくない。 In supercritical fluid chromatography, not only non-polar compounds but also polar compounds may be analyzed by adding modifiers. There is a report (see Non-Patent Documents 1 and 2) that supercritical fluid chromatography is used for simultaneous analysis of polar compounds and nonpolar compounds in that way, but the number is very low.
本発明は、極性化合物と非極性化合物の同時分析、又は親水性化合物と疎水性化合物の同時分析といった異なる極性をもつ化合物を含む試料の一斉分析方法を対象にする。後述の実施の形態では、そのような化合物の一例としてビタミンをとりあげる。ビタミンは人間と動物にとって不可欠な栄養素であり、正常な成長、身体の維持と機能発揮のために必要である。また、ビタミンが欠乏したり取り過ぎたりすると特有の病気になる。それ故、食品中または体内のビタミンを測定する研究が精力的に行われてきた。ビタミンは、それらの溶解度に応じて2つのグループに分類される。すなわち、脂溶性ビタミン(FSV)と水溶性ビタミン(WSV)である。水溶性に関して2つのグループ間には大きな差異がある。その差異は、表1に示すように、logPで表して−2.11から10.12に及ぶ。 The present invention is directed to a method for simultaneous analysis of samples containing compounds having different polarities, such as simultaneous analysis of polar compounds and nonpolar compounds, or simultaneous analysis of hydrophilic compounds and hydrophobic compounds. In the embodiments described below, vitamins are taken as an example of such compounds. Vitamins are essential nutrients for humans and animals and are necessary for normal growth, body maintenance and functioning. Also, when vitamins are deficient or taken too much, it becomes a specific disease. Therefore, intensive research has been conducted to measure vitamins in food or in the body. Vitamins are divided into two groups according to their solubility. That is, fat-soluble vitamins (FSV) and water-soluble vitamins (WSV). There are significant differences between the two groups with respect to water solubility. As shown in Table 1, the difference ranges from −2.11 to 10.12.
表1中の1−8番は脂溶性ビタミン、9−17番は水溶性ビタミンである。脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンは酸塩基としての挙動も異なっているので、それらを同時に分析することは、従来のクロマトグラフィーでは困難である。 In Table 1, Nos. 1-8 are fat-soluble vitamins and Nos. 9-17 are water-soluble vitamins. Since fat-soluble vitamins and water-soluble vitamins also behave differently as acid bases, it is difficult to analyze them simultaneously by conventional chromatography.
本発明は、超臨界流体クロマトグラフィーを発展させて、異なる極性をもつ化合物を含む試料を同時に分析する方法を提供することを目的とするものである。 An object of the present invention is to provide a method for analyzing samples containing compounds having different polarities simultaneously by developing supercritical fluid chromatography.
本発明は、移動相送液部、前記移動相送液部からの分析流路に配置された分離カラム、前記移動相送液部と前記分離カラムとの間の分析流路に試料を注入する試料注入部、前記分離カラムから溶出した試料成分を検出する検出器、及び前記分析流路の移動相の流れに対して前記分離カラムの下流に配置された背圧弁を備えたクロマトグラフを用いた分析方法であり、以下のステップ(A)から(C)のステップを含んでいる。
(A)前記移動相送液部から送液する移動相における超臨界流体とモディファイアの組成を、移動相が超臨界状態となる超臨界流体過剰の状態から移動相が液体状態となるモディファイア過剰の状態までの範囲にわたって、その移動相における超臨界流体に対するモディファイアの割合を時間的に変化させるステップ、
(B)前記試料注入部から試料を注入するステップ、及び
(C)前記分離カラムから溶出した試料成分を前記検出器により検出するステップ。
The present invention injects a sample into a mobile phase liquid feeding section, a separation column disposed in an analysis flow path from the mobile phase liquid feeding section, and an analysis flow path between the mobile phase liquid feeding section and the separation column. A chromatograph provided with a sample injection part, a detector for detecting a sample component eluted from the separation column, and a back pressure valve arranged downstream of the separation column with respect to the flow of the mobile phase in the analysis flow path was used. This analysis method includes the following steps (A) to (C).
(A) The composition of the supercritical fluid and the modifier in the mobile phase fed from the mobile phase feeding section is changed from the supercritical fluid excess state in which the mobile phase is in the supercritical state to the liquid phase in the mobile phase. Varying the ratio of modifier to supercritical fluid in the mobile phase over time, up to the excess state;
(B) A step of injecting a sample from the sample injection unit, and (C) a step of detecting a sample component eluted from the separation column by the detector.
クロマトグラフィー技術は、移動相の物理的な状態が気体であればガスクロマトグラフィー、超臨界流体であれば超臨界流体クロマトグラフィー、液体であれば液体クロマトグラフィーというように分類されるのが一般的である。そのため、本発明の方法は、一般的な分類方法の観点からみると、超臨界流体クロマトグラフィーと呼ぶのは正確ではない。というのは、本発明の方法を通して観察される移動相の状態は超臨界状態だけではないからである。 Chromatographic techniques are generally classified as gas chromatography if the physical state of the mobile phase is gas, supercritical fluid chromatography if it is a supercritical fluid, and liquid chromatography if it is a liquid. It is. For this reason, the method of the present invention is not exactly called supercritical fluid chromatography from the viewpoint of a general classification method. This is because the state of the mobile phase observed through the method of the present invention is not limited to the supercritical state.
2以上の移動相状態を使用する分離技術は、統一クロマトグラフィーと呼ばれる。本発明の方法は、二酸化炭素の相状態に関して、超臨界状態、亜臨界状態及び液体状態の3つの状態を使用するので、統一クロマトグラフィーに属し、移動相及び分析条件を時間とともに変化させることにより、1つのクロマトグラフィーの中で超臨界流体クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーをともに実現するものである。その詳しい方法については実施の形態で説明するが、一例として、移動相の状態を超臨界から亜臨界を経て液体へと連続的に変化させる。そのために、移動相として二酸化炭素にモディファイアの添加割合を増加させていくグラジエント法を採用し、超臨界状態、例えば100%に近い超臨界二酸化炭素の状態で分析を開始し、移動相が液体状態になるまでモディファイアの割合を100%近くまで徐々に増やしていく。 A separation technique that uses two or more mobile phase states is called unified chromatography. Since the method of the present invention uses three states, ie, a supercritical state, a subcritical state, and a liquid state, regarding the phase state of carbon dioxide, it belongs to unified chromatography, and by changing the mobile phase and analysis conditions with time. In one chromatography, both supercritical fluid chromatography and liquid chromatography are realized. Although the detailed method will be described in the embodiment, as an example, the state of the mobile phase is continuously changed from supercritical to subcritical to liquid. For this purpose, a gradient method in which the modifier is added to carbon dioxide as the mobile phase is adopted, and the analysis is started in a supercritical state, for example, supercritical carbon dioxide near 100%. Gradually increase the modifier ratio to near 100% until it reaches a state.
本発明の統一クロマトグラフィーにおける重要な点は、二酸化炭素の相状態が変化しても移動相において不連続な遷移がみられないことである。温度又は圧力を制御することによって、移動相はガスから超臨界へ、又は超臨界から液体へと連続して変化させることができる。その際、一連の分析を通して二酸化炭素は常に又はほぼ常に存在している。分析開始時は二酸化炭素の相状態は超臨界であるが、モディファイアの割合を増していくにつれて亜臨界から液体へと変化していくものと考えられる。しかしそれだけではない。本発明では、移動相は液体状態となるまで二酸化炭素がモディファイアで置換されるまで組成が変化させられるので、本発明の方法は超臨界流体クロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーに比べて、さらにはモディファイアの割合を30−40%までしか増やさない従来の統一クロマトグラフィーに比べて、移動相の溶媒和力を高めることができる。すなわち、広い極性範囲の多様な化合物を分析できる可能性を与えることができる。さらに、超臨界流体クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーの間の境界をなくし、2つのクロマトグラフィー技術を一体化するものでもある。 An important point in the unified chromatography of the present invention is that no discontinuous transition is observed in the mobile phase even when the phase state of carbon dioxide changes. By controlling the temperature or pressure, the mobile phase can be continuously changed from gas to supercritical or from supercritical to liquid. In so doing, carbon dioxide is always or almost always present through a series of analyses. At the start of analysis, the phase state of carbon dioxide is supercritical, but it is thought that it changes from subcritical to liquid as the proportion of modifiers increases. But that is not all. In the present invention, since the composition of the mobile phase is changed until the carbon dioxide is replaced by the modifier until it is in a liquid state, the method of the present invention is further modified in comparison with supercritical fluid chromatography and liquid chromatography. The solvating power of the mobile phase can be increased as compared with the conventional unified chromatography in which the proportion of a is increased only to 30-40%. That is, the possibility of analyzing various compounds in a wide polar range can be provided. It also eliminates the boundary between supercritical fluid chromatography and liquid chromatography, and integrates the two chromatographic techniques.
本発明の統一クロマトグラフィーを達成するためには、重要な事柄がある。それは適切なカラムを選択することである。それにより多様な化合物の同時分析の可能性が高まる。移動相の二酸化炭素をモディファイアで置き換えていくことによって移動相の極性の多様性を高めるだけでなく、カラムを選択して多様な化合物を分離できるようにすることは実用的な面で重要である。 There are important things to achieve the unified chromatography of the present invention. It is to select an appropriate column. This increases the possibility of simultaneous analysis of various compounds. In addition to increasing the polarity diversity of the mobile phase by replacing the carbon dioxide in the mobile phase with a modifier, it is important in practical terms to select a column so that various compounds can be separated. is there.
そこで、本発明の好ましい実施形態では、分離カラムとしてシリカにオクタデシル炭素鎖が結合した充填材を固定相としたもの、シリカにプロピルフルオロフェニル基が結合した充填材を固定相としたもの、又はシリカにオクタデシルシリル基が結合した充填材を固定相としたもの(BEH:Ethylene Bridged Hybrid)を使用し、モディファイアとしてメタノール又はメタノールに水を含む溶液を使用する。そのようにカラムの特性と移動相溶媒とを選択することにより、統一クロマトグラフィーが多様な化合物の分析に有用なものとなる。 Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, as a separation column, a packing material in which octadecyl carbon chains are bonded to silica is used as a stationary phase, a packing material in which silica is bonded to a propylfluorophenyl group is used as a stationary phase, or silica. In this case, a solid phase (BEH: Ethylene Bridged Hybrid) having a filler bonded with octadecylsilyl group is used, and methanol or a solution containing water in methanol is used as a modifier. By so selecting column characteristics and mobile phase solvent, unified chromatography becomes useful for the analysis of a variety of compounds.
超臨界流体二酸化炭素は酸、塩基及び水に対しても相溶性をもつので、モディファイアのほかにそれらの物質を添加剤として添加することにより、同時に分析できる化合物の範囲をさらに広げることもできる。そこで、本発明のさらに他の実施形態ては、移動相はモディファイアのほかにさらにアンモニウムイオンを含む添加剤を含んでいてもよい。 Since supercritical fluid carbon dioxide is compatible with acids, bases, and water, the range of compounds that can be analyzed simultaneously can be further expanded by adding these substances as additives in addition to the modifier. . Therefore, in still another embodiment of the present invention, the mobile phase may further contain an additive containing ammonium ions in addition to the modifier.
また、さらに他の実施形態ては、ステップ(A)において、移動相が液体状態となるモディファイア過剰の状態とするために、ステップ(A)では移動相における超臨界流体に対するモディファイアの割合を70%以上、好ましくは85%以上まで高めてもよく、さらに、100%まで高めてもよい。 In yet another embodiment, in step (A), the ratio of modifier to supercritical fluid in the mobile phase is set in step (A) so that the mobile phase is in an excessive modifier state in which the mobile phase is in a liquid state. It may be increased to 70% or more, preferably 85% or more, and may further be increased to 100%.
好ましい一実施形態では、極性の異なる脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンを含む混合溶液を試料として分離分析する。これは、本発明方法を特定の化合物の分析に限定するのではなく、統一クロマトグラフィーの1回の分析で化合物の範囲をどこまで広げられるかをみる上で、脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンを含むビタミン類の同時分析は実用的で直接的な指標となりうるからである。 In a preferred embodiment, a mixed solution containing a fat-soluble vitamin and a water-soluble vitamin having different polarities is separated and analyzed as a sample. This does not limit the method of the present invention to the analysis of specific compounds, but includes fat-soluble vitamins and water-soluble vitamins to see how far the range of compounds can be expanded with a single analysis of unified chromatography. This is because simultaneous analysis of vitamins can be a practical and direct indicator.
本発明の統一クロマトグラフィーによれば、移動相における超臨界流体とモディファイアの組成を、移動相が超臨界状態となる超臨界流体過剰の状態から移動相が液体状態となるモディファイア過剰の状態までの範囲にわたって時間的に変化させるので、1回の分析で移動相の極性範囲を広げることができ、例えば、実施例に示すように、脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンを含むlogPで2.11から10.12にわたるような広い範囲にある17種類のビタミンの同時分析が可能になる。しかもその分析を従来の超臨界流体クロマトグラフィーに比べて短時間で実行できるようになる。 According to the unified chromatography of the present invention, the composition of the supercritical fluid and the modifier in the mobile phase is changed from the supercritical fluid excess state in which the mobile phase is in the supercritical state to the modifier excess state in which the mobile phase is in the liquid state. Since the time range is changed over time, the polar range of the mobile phase can be expanded by one analysis. For example, as shown in the Examples, the logP containing fat-soluble vitamin and water-soluble vitamin is 2.11. Allows simultaneous analysis of 17 different vitamins in a wide range from 1 to 10.12. In addition, the analysis can be performed in a shorter time than conventional supercritical fluid chromatography.
本発明方法が実施されるクロマトグラフの一例を図1に示す。ボンベ2に収容された超臨界流体をSFCポンプ4により送液する送液流路6と、モディファイア溶液8をモディファイアポンプ10により送液するモディファイア送液流路12がミキサ14に接続されている。ポンプ4,10及びミキサ14を含む流路が移動相送液部である。超臨界流体としては超臨界二酸化炭素を使用する。 An example of a chromatograph in which the method of the present invention is carried out is shown in FIG. A liquid feed flow path 6 for feeding the supercritical fluid stored in the cylinder 2 by the SFC pump 4 and a modifier liquid feed flow path 12 for feeding the modifier solution 8 by the modifier pump 10 are connected to the mixer 14. ing. A flow path including the pumps 4 and 10 and the mixer 14 is a mobile phase liquid feeding unit. Supercritical carbon dioxide is used as the supercritical fluid.
ミキサ14から移動相が送られる流路が分析流路16である。分析流路16上には、移動相の流れに対する上流側から、この分析流路16に試料を注入する試料注入部18、分離カラム20、背圧弁22及び検出器24が配置されている。分離カラム20はカラムオーブン21内に収容されて一定温度に保たれる。試料注入部18は例えばオートサンプラである。背圧弁22は分析流路16内の移動相の状態を維持するために、分析流路16内を所定の圧力に保つためのものである。 The flow path through which the mobile phase is sent from the mixer 14 is the analysis flow path 16. On the analysis channel 16, a sample injection unit 18, a separation column 20, a back pressure valve 22, and a detector 24 for injecting a sample into the analysis channel 16 are arranged from the upstream side with respect to the flow of the mobile phase. The separation column 20 is accommodated in a column oven 21 and kept at a constant temperature. The sample injection unit 18 is, for example, an autosampler. The back pressure valve 22 is for maintaining the analysis channel 16 at a predetermined pressure in order to maintain the state of the mobile phase in the analysis channel 16.
検出器24としては、特に限定されるものではないが、この実施例では質量分析計、例えばタンデム四重極質量分析計を使用する。検出器24としての質量分析計は、ESI(エレクトロスプレーイオン化)源を備えている。背圧弁22の上流側の分析流路16内では移動相は超臨界状態、亜臨界状態又は液体状態であるが、背圧弁22の下流側では移動相は大気圧下に放出されるため、カラム20で分離されて溶出した試料成分は背圧弁22の下流側で移動相とともに霧状になって放出される。移動相の放出口と質量分析計のイオン化室の間に電圧(エレクトロスプレー電圧)を印加することにより、溶出した試料成分がイオン化され、質量分析計により分析される。 The detector 24 is not particularly limited, but a mass spectrometer such as a tandem quadrupole mass spectrometer is used in this embodiment. The mass spectrometer as the detector 24 includes an ESI (electrospray ionization) source. In the analysis flow path 16 upstream of the back pressure valve 22, the mobile phase is in a supercritical state, a subcritical state, or a liquid state. However, since the mobile phase is released under atmospheric pressure on the downstream side of the back pressure valve 22, the column The sample component separated and eluted at 20 is released in the form of a mist together with the mobile phase on the downstream side of the back pressure valve 22. By applying a voltage (electrospray voltage) between the mobile phase outlet and the ionization chamber of the mass spectrometer, the eluted sample components are ionized and analyzed by the mass spectrometer.
検出器24として質量分析計を使用する場合は、質量分析計のイオン化室での試料成分のイオン化を促進するために、移動相にギ酸やアンモニア等のイオン化促進剤を添加しておいてもよい。また、カラム20と背圧弁22との間の分析流路に、イオン化補助剤となるメイクアップ溶液をポンプにより供給するようにしてもよい。そのメイクアップ溶液としては、例えばメタノールなどの有機溶媒又は水に、ギ酸やアンモニア等のイオン化促進剤を含む溶液を使用することができる。 When a mass spectrometer is used as the detector 24, an ionization accelerator such as formic acid or ammonia may be added to the mobile phase in order to promote ionization of sample components in the ionization chamber of the mass spectrometer. . Further, a makeup solution serving as an ionization aid may be supplied to the analysis flow path between the column 20 and the back pressure valve 22 by a pump. As the makeup solution, for example, a solution containing an ionization accelerator such as formic acid or ammonia in an organic solvent such as methanol or water can be used.
このクロマトグラフにおいて、背圧弁22の圧力、移動相での超臨界二酸化炭素とモディファイアの割合、分離カラム20の温度、及び試料注入部18からの試料注入は制御部(図示略)により管理されている。分析動作を開始すると、超臨界流体とモディファイア溶液がポンプ4,10により送られ、ミキサ14で混合され、移動相として分析流路16に導入される。グラジエント分析を行うために、超臨界流体とメタノールの割合が時間とともに変化するように、同制御部に保持されたプログラムに従ってポンプ4,10の流量が調節される。分析流路16は背圧弁22によって内圧が所定の圧力に制御されており、分析流路16に導入された移動相は超臨界から亜臨界、液体へと相状態が変化する。試料注入部18により注入された試料は移動相によって分離カラム20に搬送されて成分ごとに分離され、分離カラム20から背圧弁22を経て検出器24の質量分析計に導入されて検出される。 In this chromatograph, the pressure of the back pressure valve 22, the ratio of supercritical carbon dioxide and modifier in the mobile phase, the temperature of the separation column 20, and the sample injection from the sample injection unit 18 are managed by a control unit (not shown). ing. When the analysis operation is started, the supercritical fluid and the modifier solution are sent by the pumps 4 and 10, mixed by the mixer 14, and introduced into the analysis flow path 16 as a mobile phase. In order to perform the gradient analysis, the flow rates of the pumps 4 and 10 are adjusted according to the program held in the control unit so that the ratio of the supercritical fluid and methanol changes with time. The analysis channel 16 is controlled to have a predetermined internal pressure by the back pressure valve 22, and the phase of the mobile phase introduced into the analysis channel 16 changes from supercritical to subcritical and liquid. The sample injected by the sample injection unit 18 is conveyed to the separation column 20 by the mobile phase and separated for each component, and is introduced from the separation column 20 through the back pressure valve 22 to the mass spectrometer of the detector 24 and detected.
(実施例1)
実施例1では、移動相としてモディファイアの割合を60%まで増加させるグラジエント法を実施し、最適なモディファイアとカラムの組合せを検討し、さらに添加剤の有効性を検討した。グラジエント条件は表2の通りである。背圧弁の圧力は1800psiとした。
Example 1
In Example 1, a gradient method in which the proportion of the modifier as a mobile phase was increased to 60% was carried out, the optimum combination of the modifier and the column was examined, and the effectiveness of the additive was further examined. The gradient conditions are as shown in Table 2. The pressure of the back pressure valve was 1800 psi.
(移動相)超臨界二酸化炭素とモディファイア
モディファイアとして以下の4種類を検討した。
(1)2−プロパノール(IPA)、
(2)アセトニトリル(ACN)、
(3)メタノール(MeOH)、
(4)メタノール/水(95/5、v/v)(95%MeOH)。
移動相は質量分析の際のイオン化促進剤として0.1%(v/v)のギ酸を含む。
(Mobile phase) Supercritical carbon dioxide and modifier The following four types were examined as modifiers.
(1) 2-propanol (IPA),
(2) Acetonitrile (ACN),
(3) methanol (MeOH),
(4) Methanol / water (95/5, v / v) (95% MeOH).
The mobile phase contains 0.1% (v / v) formic acid as an ionization accelerator during mass spectrometry.
移動相流量:1.0mL/分
試料注入量:1μL
カラム温度:35℃
試料温度:6℃
背圧(ABPR):14.2 MPa
Mobile phase flow rate: 1.0 mL / min Sample injection volume: 1 μL
Column temperature: 35 ° C
Sample temperature: 6 ° C
Back pressure (ABPR): 14.2 MPa
(カラム)
カラムとして以下の6種類を検討した。
(1)ACQUITY UPC2 BEH(BEH)
(2)ACQUITY UPC2 2−Ethylpyridine(2−EP)
(3)ACQUITY UPC2 CSH Fluoro−Phenyl(FP)
(4)ACQUITY UPC2 HSS C18 SB(C18SB)
(5)ACQUITY HSS Cyano(Cyano)
(6)ACQUITY CSH Phenyl−Hexyl(PH)
(いずれもWaters社の製品、サイズは内径3.0mm、長さ100mm、充填材のサイズは2μm)
(column)
The following six types of columns were examined.
(1) ACQUITY UPC 2 BEH (BEH)
(2) ACQUITY UPC 2 2-Ethylpyridine (2-EP)
(3) ACQUITY UPC 2 CSH Fluoro-Phenyl (FP)
(4) ACQUITY UPC 2 HSS C18 SB (C18SB)
(5) ACQUITY HSS Cyano (Cyano)
(6) ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl (PH)
(All are Waters products, the size is 3.0 mm in inner diameter, 100 mm in length, and the size of the filler is 2 μm)
質量分析時の装置パラメータ:
キャピラリー電圧:0.8KV
脱溶媒和温度:600℃
円錐ガス流量:50L/時間
脱溶媒和ガス流速:1200L/時間
Instrument parameters for mass spectrometry:
Capillary voltage: 0.8KV
Desolvation temperature: 600 ° C
Conical gas flow rate: 50 L / hour Desolvation gas flow rate: 1200 L / hour
17種のビタミンを質量分析計により検出し、そのときのクロマトグラムピークを検出するためのMRM(Multiple Reaction Monitoring)パラメータは表3のように設定した。 17 kinds of vitamins were detected by a mass spectrometer, and MRM (Multiple Reaction Monitoring) parameters for detecting a chromatogram peak at that time were set as shown in Table 3.
イオン化は大気圧イオン化法の一つであるエレクトロスプレーイオン化法を採用した。超臨界流体クロマトグラフから試料溶液を供給するキャピラリーと対向電極の間に高電圧(キャピラリー電圧)を印加するとともに霧化ガスを噴霧させる。これにより、キャピラリー先端に円錐状の液体コーン(テイラーコーン)が形成され、その先端には高度に帯電した液滴が生成する。さらに、帯電した液滴はヒートブロックを通った脱溶媒和ガスの噴霧と脱溶媒管での脱溶媒和温度にて溶媒が気化され、最終的にプロトン付加による正イオン(表3でのSelected Ion [M+H])やプロトン脱離による負イオンが生成される。生成したイオンが表3での「Precursor Ion」である。その後、質量分析計内部でArガスを用いた衝突活性化解離(CID)(表3でのCollision Energy)によって特定のイオンに開裂され、生じたフラグメントイオンの中で選択したイオン(表3でのProduct Ion)を検出器にて測定する。それぞれのビタミンについて選択したイオン(Product Ion)の検出信号強度を時間に対して表示したのが図2−図7に示したMRMクロマトグラムである。表3中の「Span」はMRMでモニタリングするm/zの幅、「Cone Voltage」はサンプリングコーンの電圧値で、インターフェースで生じたイオンを質量分析計に導入するために加える電圧である。なお、上記の装置パラメータはエレクトロスプレーイオン化質量分析計において汎用的な数値を一例として示したものであり、そのような装置パラメータに限定されるものではない。 For the ionization, an electrospray ionization method which is one of the atmospheric pressure ionization methods was adopted. A high voltage (capillary voltage) is applied between the capillary for supplying the sample solution from the supercritical fluid chromatograph and the counter electrode, and the atomized gas is sprayed. As a result, a conical liquid cone (Taylor cone) is formed at the capillary tip, and highly charged droplets are generated at the tip. Further, the charged droplets are vaporized by spraying the desolvation gas through the heat block and the desolvation temperature in the desolvation tube, and finally the positive ions by proton addition (Selected Ion in Table 3). [M + H]) and negative ions are generated by proton elimination. The generated ions are “Precursor Ion” in Table 3. Thereafter, the ions were cleaved into specific ions by collision activated dissociation (CID) using Ar gas (Collision Energy in Table 3) inside the mass spectrometer, and selected ions among the generated fragment ions (in Table 3) Product Ion) is measured with a detector. The MRM chromatograms shown in FIGS. 2 to 7 show the detection signal intensity of ions (Product Ion) selected for each vitamin with respect to time. In Table 3, “Span” is the width of m / z monitored by MRM, “Cone Voltage” is the voltage value of the sampling cone, and is the voltage applied to introduce ions generated at the interface into the mass spectrometer. In addition, said apparatus parameter has shown the general-purpose numerical value as an example in an electrospray ionization mass spectrometer, and is not limited to such an apparatus parameter.
(試料調製)
各ビタミンを希釈剤に溶解して標準溶液を調製した。希釈剤は以下の通りである。
脂溶性ビタミン用の希釈剤:クロロホルム:メタノール=50:50
水溶性ビタミン用の希釈剤:メタノール:水=50:50
ビタミンVC用の希釈剤:水100%
それらの標準溶液をさらにメタノールで希釈して最終混合標準溶液とした。
(Sample preparation)
Each vitamin was dissolved in a diluent to prepare a standard solution. Diluents are as follows.
Diluent for fat-soluble vitamins: chloroform: methanol = 50: 50
Diluent for water-soluble vitamins: methanol: water = 50:50
Diluent for vitamin VC: 100% water
These standard solutions were further diluted with methanol to obtain a final mixed standard solution.
カラムの検討:
上述のBEH、2−EP、FP、C18SB、Cyano及びPHの6種類のカラムと、上述の2−プロパノール、アセトニトリル、メタノール、メタノール/水(95/5(v/v))の4種類のモディファイアの組合せについて検討した。モディファイアは質量分析計による検出の際のイオン化を促進するために、0.1%(v/v)のギ酸を含んでいる。
その結果を表4に示す。
Column considerations:
Six columns of BEH, 2-EP, FP, C18SB, Cyano and PH described above, and four types of modifiers of 2-propanol, acetonitrile, methanol, methanol / water (95/5 (v / v)) described above. The combination of a was examined. The modifier contains 0.1% (v / v) formic acid to facilitate ionization upon detection by the mass spectrometer.
The results are shown in Table 4.
表4の符号A−Fは脂溶性ビタミン、符号G−Nは水溶性ビタミン(WSV)である。表4の結果に基づき、ピーク形状と検出されたピークの数に応じて、カラムとモディファイアの好ましい組合せとして以下の3つを選択した。
(1)C18SBカラムとメタノールの組合せ
(2)C18SBカラムとメタノール/水(95/5(v/v))の組合せ
(3)FPカラムとメタノールの組合せ
The code | symbol AF of Table 4 is a fat-soluble vitamin, and code | symbol GN is a water-soluble vitamin (WSV). Based on the results of Table 4, the following three were selected as preferred combinations of columns and modifiers depending on the peak shape and the number of detected peaks.
(1) Combination of C18SB column and methanol (2) Combination of C18SB column and methanol / water (95/5 (v / v)) (3) Combination of FP column and methanol
FPカラムは、シリカに配位子としてプロピルフルオロフェニル(propyl fluorophenyl)基が結合した充填材を固定相としたものであり、モディファイアとしてメタノールをした場合はすべてのビタミンを溶出している。しかし、FPカラムはC18SBカラムに比べて脂溶性ビタミン(FSV)に対する保持力が弱く、保持時間が短い。 The FP column uses a packing material in which a propyl fluorophenyl group as a ligand is bonded to silica as a stationary phase. When methanol is used as a modifier, all vitamins are eluted. However, the FP column has a lower retention time for fat-soluble vitamins (FSV) and a shorter retention time than the C18SB column.
C18SBカラムは、シリカに配位子としてオクタデシル炭素鎖(octadecyl carbon chain)が結合した充填材を固定相としたものであり、検討したカラムの中では化合物に対して疎水性相互作用をする傾向が最も強い。C18SBカラムが脂溶性ビタミンを非常によく保持するのはそのためである。一方、C18SBカラムは、エンドキャップされていない(non-endcapping)固定相上の残留シラノール基による親水性相互作用により親水性化合物を保持することもできる。C18SBカラムにおけるオクタデシル炭素鎖とシラノール基の反対の性質が脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンの両方に重要な保持挙動を与えていると考えられる。すなわち、オクタデシル炭素鎖が水溶性ビタミンの保持に寄与し、固定相上のシラノール基が水溶性ビタミンの保持に寄与している。その結果、単一のカラムであっても、広範囲の極性の化合物に適用することができる。 The C18SB column uses a filler in which octadecyl carbon chain as a ligand is bound to silica as a stationary phase, and in the studied column, there is a tendency to have a hydrophobic interaction with the compound. Strongest. This is why the C18SB column retains fat-soluble vitamins very well. On the other hand, C18SB columns can also retain hydrophilic compounds due to hydrophilic interactions due to residual silanol groups on the non-endcapping stationary phase. It is thought that the opposite properties of the octadecyl carbon chain and the silanol group in the C18SB column give important retention behavior to both fat-soluble and water-soluble vitamins. That is, the octadecyl carbon chain contributes to retention of the water-soluble vitamin, and the silanol group on the stationary phase contributes to retention of the water-soluble vitamin. As a result, even a single column can be applied to a wide range of polar compounds.
C18SBカラムに関しては、モディファイアとしてのメタノールとメタノール/水は、検出されたピークの数に関しては有意の差がなかった。しかし、観察されたピーク形状はモディファイアとしてメタノールを用いた方がメタノール/水を用いた場合よりもわずかに良好であった。
以上の検討結果に基づいて、以下の分析では、カラムとしてC18SBカラムを使用する。
For the C18SB column, the modifier methanol and methanol / water were not significantly different with respect to the number of peaks detected. However, the observed peak shape was slightly better with methanol as the modifier than with methanol / water.
Based on the above examination results, the following analysis uses a C18SB column as the column.
(添加剤の検討)
カラムとしてC18SBカラムを使用し、モディファイアとしてメタノールを使用すると脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンの両方を保持できるが、クロマトグラムに関して改善の余地がある。一つは表4の結果ではチアミン(符号L)のピークが欠けていることであり、他の一つはピリドキシン(符号I)とビタミンVC(符号N)のピーク形状がテーリングをもっている点である。
(Examination of additives)
If a C18SB column is used as the column and methanol is used as the modifier, both fat-soluble vitamins and water-soluble vitamins can be retained, but there is room for improvement with respect to the chromatogram. One is that the peak of thiamine (symbol L) is missing in the results of Table 4, and the other is that the peak shape of pyridoxine (symbol I) and vitamin VC (symbol N) has tailing. .
表4のデータは測定時間を10分間に設定したときのものであり、測定時間をさらに長くするとチアミンのピークが観察されたが、チアミンの保持時間が長すぎる点は問題である。 The data in Table 4 was obtained when the measurement time was set to 10 minutes. When the measurement time was further increased, a thiamine peak was observed, but the problem was that the thiamine retention time was too long.
ピリドキシンとビタミンVCのピークにはピークテーリングが観察された。ピリドキシンについては、ピリドキシンは複素環式のアミン環をもっているので、それがカラム内のシラノール基と相互作用するのがテーリングの原因であると考えられる。テーリングに関しては、移動相に塩基性添加剤を添加することにより塩基性化合物のピーク形状が改善するという報告がある(非特許文献3参照。)。また、超臨界流体クロマトグラフの移動相中に水酸化アンモニウムが存在すると塩基性化合物のピーク形状が改善するという報告もある(非特許文献4参照。)。 Peak tailing was observed at the pyridoxine and vitamin VC peaks. With respect to pyridoxine, pyridoxine has a heterocyclic amine ring, and the interaction with the silanol group in the column is considered to cause tailing. Regarding tailing, there is a report that the peak shape of a basic compound is improved by adding a basic additive to the mobile phase (see Non-Patent Document 3). There is also a report that the peak shape of a basic compound is improved when ammonium hydroxide is present in the mobile phase of a supercritical fluid chromatograph (see Non-Patent Document 4).
そこで、ピリドキシンのピークテーリングに関し、添加物としての塩基の影響を検討した結果のMRMクロマトグラムを図2に示す。図2中の符号1−13は次の13種類のビタミンを示している。1はA acetateとA palmitate、2はα-Tocopherol、3はK2、4はK1、5はβ-Carotene、5はNicotinamide、7はNicotinic acid、8はPyridoxine、9はd-Pantothenic acid、10はBiotin、11はThiamine、12はRiboflavin、13はVCである。A−Cは移動相に添加した塩基の種類と濃度を示しており、Aは0.1%(v/v)ギ酸、Bは0.2%(v/v)ギ酸、Cは0.1%(v/v)水酸化アンモニウムである。 Therefore, FIG. 2 shows an MRM chromatogram as a result of examining the effect of a base as an additive on the peak tailing of pyridoxine. The code | symbol 1-13 in FIG. 2 has shown the following 13 types of vitamins. 1 is A acetate and A palmitate, 2 is α-Tocopherol, 3 is K2, 4 is K1, 5 is β-Carotene, 5 is Nicotinamide, 7 is Nicotinic acid, 8 is Pyridoxine, 9 is d-Pantothenic acid, 10 is Biotin, 11 is Thiamine, 12 is Riboflavin, and 13 is VC. A to C indicate the type and concentration of the base added to the mobile phase, A is 0.1% (v / v) formic acid, B is 0.2% (v / v) formic acid, and C is 0.1. % (V / v) ammonium hydroxide.
図2の結果によれば、ピリドキシン(符号8)のピーク形状は、移動相に水酸化アンモニウムを添加するとよく改善されているが、ギ酸を添加しても改善されていない。 According to the results of FIG. 2, the peak shape of pyridoxine (symbol 8) is often improved when ammonium hydroxide is added to the mobile phase, but is not improved even when formic acid is added.
さらに、移動相にギ酸アンモニウムを添加した場合のチアミンとピリドキシンのピーク形状を図3に示す。Aは0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムを添加した場合であり、Bの0.1%(v/v)ギ酸と0.1%(v/v)水酸化アンモニウムを添加した場合と同様にテーリングが改善されている。この結果から、ピーク形状の改善をもたらすのは水酸イオンではなくアンモニウムイオンであり、アンモニウムイオンがC18SBカラム上でのシラノール残基とピリドキシン内のアミンとの間の相互作用を切断することによってピークテーリングを短くするように作用するものと考えられる。 Furthermore, the peak shapes of thiamine and pyridoxine when ammonium formate is added to the mobile phase are shown in FIG. A is when 0.1% (w / v) ammonium formate is added, and B is when 0.1% (v / v) formic acid and 0.1% (v / v) ammonium hydroxide are added. Similarly, tailing is improved. From this result, it is the ammonium ion, not the hydroxide ion, that leads to improved peak shape, and the ammonium ion peaks by cleaving the interaction between the silanol residue and the amine in pyridoxine on the C18SB column. It is thought that it acts to shorten tailing.
次にチアミンの保持時間が長すぎる点と、ビタミンVCのピークテーリングの問題を検討する。添加物のさらなる検討の前に、カラムの長さを短くすることを検討した。つまり、カラムの長さが短くなるとシラノール基が減少することによって保持時間とピークテーリングの問題が解決するかもしれないと考えられるからである。その結果を図4に示す。Aはカラム長さが5cm、Bはカラム長さが10cmの場合である。符号1−12はビタミンの種類を表し、1はA acetateとA palmitate、2はα-Tocopherol、3はK2、4はK1、5はβ-Carotene、6はNicotinamide、7はNicotinic acid、8はPyridoxine、9はD-Pantothenic acid、10はBiotin、11はThiamine、12はVCである。カラム長さを10cmから5cmに短くすると、チアミンは保持時間が短くなって7分以内に溶出し、しかもピーク形状もよくなっている。ピリドキシンもピーク形状がよくなっている。しかし、ビタミンVCのピーク形状は改善されていない。 Next, the point that the retention time of thiamine is too long and the problem of peak tailing of vitamin VC will be examined. Prior to further study of the additive, it was considered to shorten the column length. That is, when the column length is shortened, it is considered that the problem of retention time and peak tailing may be solved by reducing silanol groups. The result is shown in FIG. A is when the column length is 5 cm, and B is when the column length is 10 cm. 1-12 represents the type of vitamin, 1 is A acetate and A palmitate, 2 is α-Tocopherol, 3 is K2, 4 is K1, 5 is β-Carotene, 6 is Nicotinamide, 7 is Nicotinic acid, 8 is Pyridoxine, 9 is D-Pantothenic acid, 10 is Biotin, 11 is Thiamine, and 12 is VC. When the column length is shortened from 10 cm to 5 cm, the thiamine is eluted within 7 minutes with a shorter retention time, and the peak shape is improved. Pyridoxine also has a better peak shape. However, the peak shape of vitamin VC has not been improved.
試料が塩基性化合物と酸性化合物を含んでいる場合、モディファイアとともに移動相に添加する添加剤として、酸だけでなく塩基も添加するとピーク形状が改善されるという報告がある(非特許文献5参照。)。また、超臨界流体クロマトグラフィーにおいて、酸性溶質のピーク形状の改善には溶質よりも強い酸の添加が有効であり、カルボン酸のピークテーリングに対しては酸を添加して溶質のイオン化を抑えることが非常に重要であるという報告もある(非特許文献3、6参照。)。強酸の使用はビタミンVCのピーク形状を改善することができるものの、検出器として質量分析計を使用する場合には、例えばトリフルオロ酢酸のような強酸を使用するとバックグラウンドノイズをもたらす問題がある。 When the sample contains a basic compound and an acidic compound, there is a report that the peak shape is improved by adding not only an acid but also a base as an additive to be added to the mobile phase together with the modifier (see Non-Patent Document 5). .) In supercritical fluid chromatography, the addition of an acid stronger than the solute is effective for improving the peak shape of the acidic solute, and for the peak tailing of the carboxylic acid, an acid is added to suppress the ionization of the solute. Is also very important (see Non-Patent Documents 3 and 6). Although the use of a strong acid can improve the peak shape of vitamin VC, the use of a strong acid such as trifluoroacetic acid has the problem of causing background noise when using a mass spectrometer as a detector.
そこで、弱酸を用いてビタミンVCのピーク形状の改善が達成できるかどうかをみるために、ギ酸を添加してその効果を検討した。その結果のMRMクロマトグラムを図5に示す。AはビタミンB12、BはビタミンVC、Cはピリドキシン、Dはチアミンである。符号1−4は添加した弱酸を表している。符号1は0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムのみ、符号2は0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムと0.2%ギ酸、符号3は0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムと0.4%ギ酸、符号4は0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムと0.6%ギ酸である。モディファイアはメタノールである。 Therefore, in order to see whether or not improvement of the peak shape of vitamin VC can be achieved using weak acid, formic acid was added and the effect was examined. The resulting MRM chromatogram is shown in FIG. A is vitamin B12, B is vitamin VC, C is pyridoxine, and D is thiamine. Reference numeral 1-4 represents the weak acid added. Reference numeral 1 is 0.1% (w / v) ammonium formate only, reference numeral 2 is 0.1% (w / v) ammonium formate and 0.2% formic acid, reference numeral 3 is 0.1% (w / v) formic acid. Ammonium and 0.4% formic acid, code 4 is 0.1% (w / v) ammonium formate and 0.6% formic acid. The modifier is methanol.
図5に示されるように、ギ酸濃度を増加させるとビタミンVC(符号B)のピーク形状が改善されていくことがわかる。ピリドキシン(符号C)ではピーク形状が歪んでいく。また、ビタミンB12(符号A)では感度が低下していき、それはギ酸の添加によってビタミンB12のイオン化が妨げられていくことを示している(非特許文献7参照。)。 As shown in FIG. 5, it is understood that the peak shape of vitamin VC (symbol B) is improved when the formic acid concentration is increased. In pyridoxine (symbol C), the peak shape is distorted. In addition, the sensitivity of vitamin B12 (symbol A) decreases, which indicates that the addition of formic acid prevents the ionization of vitamin B12 (see Non-Patent Document 7).
次に、ギ酸アンモニウム濃度を変化させた場合の結果を図6に示す。Aは0.2%(w/v)ギ酸アンモニウムの場合、Bは0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムの場合である。モディファイアはメタノール/水(95/5(v/v))である。符号1−15はビタミンの種類を表している。1はA acetate、2はA palmitate、3はα-Tocopherol、4はK2、5はK1、6はβ-Carotene、7はNicotinamide、8はNicotinic acid、9はPyridoxine、10はd-Pantothenic acid、11はBiotin、12はThiamine、13はRiboflavin、14はVC、15はB12である。ビタミンVC(符号14)についてはギ酸アンモニウム濃度が0.1%から0.2%に増加するとピーク幅が狭くなるように改善されている。ギ酸アンモニウム濃度が増加しても他のビタミンのピーク形状は悪化していない。 Next, the results when the ammonium formate concentration is changed are shown in FIG. A is for 0.2% (w / v) ammonium formate and B is for 0.1% (w / v) ammonium formate. The modifier is methanol / water (95/5 (v / v)). The code | symbol 1-15 represents the kind of vitamin. 1 is A acetate, 2 is A palmitate, 3 is α-Tocopherol, 4 is K2, 5 is K1, 6 is β-Carotene, 7 is Nicotinamide, 8 is Nicotinic acid, 9 is Pyridoxine, 10 is d-Pantothenic acid, 11 is Biotin, 12 is Thiamine, 13 is Riboflavin, 14 is VC, and 15 is B12. Vitamin VC (symbol 14) is improved so that the peak width becomes narrower when the ammonium formate concentration increases from 0.1% to 0.2%. The peak shape of the other vitamins has not deteriorated with increasing ammonium formate concentration.
図5、図6の結果は、統一クロマトグラフィーでの分離におけるビタミンVCのピーク形状の改善には添加剤の濃度が他の重要な要因であることを示している。図6の結果を得るための分析では、統一クロマトグラフィーでのギ酸アンモニウムの析出をできるだけ抑えるためにメタノールに水を加えているが、そのことによって何等の悪影響も現れていない。 The results of FIGS. 5 and 6 show that the additive concentration is another important factor in improving the peak shape of vitamin VC in the unified chromatographic separation. In the analysis for obtaining the result of FIG. 6, water was added to methanol in order to suppress precipitation of ammonium formate by unified chromatography as much as possible, but this did not cause any adverse effects.
ビタミンB12に関し、図5の符号1(モディファイアがメタノールで、それに0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムを添加したもの)のピーク形状と、図6のBの符号15(モディファイアがメタノール/水(95/5(v/v)で、それに0.1%(w/v)ギ酸アンモニウムを添加したもの)のピーク形状とを比較すると、水を添加することによってテーリングが改善されている。 Regarding vitamin B12, the peak shape of reference numeral 1 in FIG. 5 (the modifier is methanol and 0.1% (w / v) ammonium formate added thereto) and the reference numeral 15 in FIG. 6 (the modifier is methanol) Of water / water (95/5 (v / v) with 0.1% (w / v) ammonium formate added), tailing is improved by adding water .
(実施例2)
モディファイア組成の検討:
統一クロマトグラフィーの分離において、ピーク形状は添加剤を添加することによりある程度改善できることが分かった。しかし、十分とはいえない。特にビタミンVCとビタミンB12に関してはまだ改良の余地がある。経験則として、超臨界流体クロマトグラフィーにおける好ましい分析対象は、メタノールに対して少なくとも1mg/mLの溶解度をもつものである(非特許文献8参照。)。実際、ビタミンVCはメタノールに対する溶解度がその基準値とされる1mg/mLより低いので、超臨界流体クロマトグラフィーの延長線上にある統一クロマトグラフィーでの測定にふさわしい化合物とはいえない。ビタミンB12に関しては、ビタミンB12はメタノールに対して1mg/mLの溶解度をもっているが、ビタミンB12はリン酸基をもち、それが親水性をもたらす。そのため、移動相の溶媒和力はビタミンVCとビタミンB12を溶出するには十分な強さではないと考えられる。この考えに基づいて、より良好なピーク形状をもって化合物を溶出させるために移動相の極性をさらに増加させることを試みた。
(Example 2)
Study of modifier composition:
In the unified chromatographic separation, it was found that the peak shape can be improved to some extent by adding additives. However, it is not enough. In particular, there is still room for improvement regarding vitamin VC and vitamin B12. As a rule of thumb, a preferred analyte in supercritical fluid chromatography has a solubility of at least 1 mg / mL in methanol (see Non-Patent Document 8). In fact, vitamin VC has a solubility in methanol lower than the standard value of 1 mg / mL, so it cannot be said that it is a suitable compound for measurement by unified chromatography on the extended line of supercritical fluid chromatography. With respect to vitamin B12, vitamin B12 has a solubility of 1 mg / mL in methanol, but vitamin B12 has a phosphate group, which provides hydrophilicity. Therefore, it is considered that the solvating power of the mobile phase is not strong enough to elute vitamin VC and vitamin B12. Based on this idea, an attempt was made to further increase the polarity of the mobile phase in order to elute the compound with a better peak shape.
モディファイアに極性をもたせる最も簡単な方法は水を加えることである。実施例1では水を5%添加した場合についてすでに検討した。さらに水を加えるとなると、二酸化炭素に対する混和性の問題からシステム圧力が不安定になるおそれがある。 The simplest way to make the modifier polar is to add water. In Example 1, the case where 5% of water was added was already examined. If water is further added, the system pressure may become unstable due to miscibility with carbon dioxide.
そこで、別の方法としてグラジエントにおけるモディファイアの組成をさらに増加させることを検討した。従来の統一クロマトグラフィーではモディファイアの組成は30−40%まで増加させるのが普通であり、実施例1では60%まで増加させた。この実施例では、それをさらに70%まで又は100%まで増加させた。 Therefore, as another method, we investigated further increasing the composition of the modifier in the gradient. In conventional unified chromatography, the modifier composition is usually increased to 30-40%, and in Example 1 it was increased to 60%. In this example, it was further increased to 70% or 100%.
この実施例では、カラムとしてACQUITY UPC2 BEH(BEH)(Waters社の製品、サイズは内径3.0mm、長さ50mm、充填材のサイズは1.7μm)を使用した。このカラムはシリカにオクタデシルシリル基が結合した充填材を固定相としたものである。移動相は以下の溶媒Aと溶媒Bを用い、モディファイアの組成を100%まで増加させる場合はその組成を表5のグラジエント条件に基づいて時間により変化させた。溶媒Aは二酸化炭素、溶媒Bはモディファイアとしてのメタノール/水(95/5(v/v))(0.2%のギ酸アンモニウムを含む)である。カラム温度を40℃とした。 In this example, ACQUITY UPC 2 BEH (BEH) (product of Waters, size 3.0 mm, length 50 mm, packing size 1.7 μm) was used as the column. This column uses a packing material in which octadecylsilyl groups are bonded to silica as a stationary phase. As the mobile phase, the following solvent A and solvent B were used. When the modifier composition was increased to 100%, the composition was changed with time based on the gradient conditions in Table 5. Solvent A is carbon dioxide, and solvent B is methanol / water (95/5 (v / v)) as a modifier (containing 0.2% ammonium formate). The column temperature was 40 ° C.
背圧弁の圧力グラジエント条件は表6の通りである。
以上の条件で分析を10分間実行した。その結果を図7に示す。図7は17種類のビタミンのMRMクロマトグラムであり、符号1から17はビタミンの種類を示している。1はA acetate、2はA palmitate、3はD2、4はα-Tocopherol、5はK2、6はK1、7はα-Tocopherol acetate、8はβ-Carotene、9はNicotinamide、10はNicotinic acid、11はPyridoxine、12はd-Pantothenic acid、13はBiotin、14はThiamine、15はRiboflavin、16はB12、17はVCである。横軸は統一クロマトグラフィーでの保持時間である。図7の結果によれば、モディファイアの最終組成を100%まで増加させたが、モディファイアの組成が85%の状態ですべてのビタミンの溶出が完了している。その結果をみれば、ピーク幅が縮小されてピー形状が改善された。例えばビタミンVC(符号17)とビタミンB12(符号16)のピーク形状をみると、モディファイアの最終組成を70%までとした場合と比べると、ピーク幅がビタミンVCでは0.23分から0.11分に縮小され、ビタミンB12では0.25分から0.10分に縮小された。 The analysis was performed for 10 minutes under the above conditions. The result is shown in FIG. FIG. 7 is an MRM chromatogram of 17 types of vitamins. Reference numerals 1 to 17 indicate the types of vitamins. 1 is A acetate, 2 is A palmitate, 3 is D2, 4 is α-Tocopherol, 5 is K2, 6 is K1, 7 is α-Tocopherol acetate, 8 is β-Carotene, 9 is Nicotinamide, 10 is Nicotinic acid, 11 is Pyridoxine, 12 is d-Pantothenic acid, 13 is Biotin, 14 is Thiamine, 15 is Riboflavin, 16 is B12, and 17 is VC. The horizontal axis is the retention time in unified chromatography. According to the results of FIG. 7, the final composition of the modifier was increased to 100%, but the elution of all vitamins was completed when the composition of the modifier was 85%. As a result, the peak width was reduced and the peak shape was improved. For example, looking at the peak shapes of vitamin VC (symbol 17) and vitamin B12 (symbol 16), the peak width of vitamin VC is from 0.23 minutes to 0.11 compared to the case where the final composition of the modifier is up to 70%. In Vitamin B12, it was reduced from 0.25 minutes to 0.10 minutes.
そして、ピーク幅が縮小されて各ビタミンのピーク間の分離がよくなったことにより、分析を短時間で終了させることができるようになり、図7に示されるように17種類のビタミン17を約4分間で分離することができた。この分離時間は、いままで報告されている超臨界流体クロマトグラフィーの分離時間(非特許文献9−13参照。)よりも短い。 Then, since the peak width is reduced and the separation between the peaks of each vitamin is improved, the analysis can be completed in a short time. As shown in FIG. Separation was possible in 4 minutes. This separation time is shorter than the separation time of supercritical fluid chromatography that has been reported so far (see Non-Patent Documents 9-13).
また、複数回の繰返し測定により、各ビタミンが再現性よく検出されることも確認された。その結果を表5に示す。 It was also confirmed that each vitamin was detected with good reproducibility by repeated measurement. The results are shown in Table 5.
表7には、各ビタミンのピークの保持時間とピーク面積の測定値の平均値(Ave.)と相対標準偏差(%RSD)(=(標準偏差/平均値)×100)が示されている。その結果によれば、保持時間の再現性は0−0.51%RSD、ピーク面積の再現性は1.24−15.63%RSDとなっており、良好な再現性を示している。 Table 7 shows an average value (Ave.) and a relative standard deviation (% RSD) (= (standard deviation / average value) × 100) of peak vitamin retention times and peak area measurements. . According to the result, the reproducibility of the retention time is 0-0.51% RSD, and the reproducibility of the peak area is 1.24-5.63% RSD, indicating a good reproducibility.
本発明は、実施例により具体的に示したように、超臨界流体クロマトグラフィーから液体クロマトグラフィーにまたがる統一クロマトグラフィーを用いて多様な化合物を同時分析できる。実施例ではビタミンを用いた分析例について示したが、本発明はビタミンの分析に限定されるものではない。超臨界流体クロマトグラフィーだけであれば、その移動相の溶媒和力は限られたものであるが、本発明の統一クロマトグラフィーはグラジエントにより移動相の二酸化炭素をメタノールに大きく置換することにより、移動相の極性の多様性を広げることができる。その結果、ビタミンの分析に適用した場合は、移動相中の二酸化炭素に対するメタノールの割合を2%から85%まで変化させる実施例のグラジエント方法により、脂溶性ビタミンと水溶性ビタミンを4分間で同時に分析できた。実施例2の方法は、従来の超臨界流体クロマトグラフィーと比べて分析時間が短い。 The present invention enables simultaneous analysis of various compounds using unified chromatography ranging from supercritical fluid chromatography to liquid chromatography, as specifically shown in the Examples. In the examples, analysis examples using vitamins are shown, but the present invention is not limited to vitamin analysis. If only supercritical fluid chromatography is used, the solvating power of the mobile phase is limited. However, the unified chromatography of the present invention moves the mobile phase by largely replacing carbon dioxide in the mobile phase with methanol. Diversity of phase polarity can be expanded. As a result, when applied to the analysis of vitamins, fat-soluble vitamins and water-soluble vitamins were simultaneously applied in 4 minutes by the gradient method of the example in which the ratio of methanol to carbon dioxide in the mobile phase was changed from 2% to 85%. I was able to analyze. The method of Example 2 has a shorter analysis time than conventional supercritical fluid chromatography.
統一クロマトグラフィーは、二酸化炭素なしでは達成できないので超臨界流体クロマトグラフィーを発展させた手法といえる。本発明は統一クロマトグラフィーに対する新しい手法を与えるものである。すなわち、移動相の物理的状態を制御し、かつ二酸化炭素をメタノールで大きく置き換えることにより、統一クロマトグラフィーが移動相中の溶媒和力を高めることができる。その結果、ビタミンに限らず多様な化学的性質を有する化合物の分析方法として適用できることは明らかであり、広い範囲の極性をもつ多様な化合物のための分離手段となりうることは明らかである。 Unified chromatography cannot be achieved without carbon dioxide, so it can be said that it is a technique developed from supercritical fluid chromatography. The present invention provides a new approach to unified chromatography. That is, unified chromatography can increase the solvating power in the mobile phase by controlling the physical state of the mobile phase and largely replacing carbon dioxide with methanol. As a result, it is apparent that the present invention can be applied as a method for analyzing compounds having various chemical properties, not limited to vitamins, and can be a separation means for various compounds having a wide range of polarities.
4 SFCポンプ
10 モディファイアポンプ
14 ミキサ
16 分析流路
18 試料注入部
20 分離カラム
22 背圧弁
24 検出器
4 SFC pump 10 modifier pump 14 mixer 16 analysis flow path 18 sample injection part 20 separation column 22 back pressure valve 24 detector
Claims (6)
以下のステップ(A)から(C)のステップを含む分析方法。
(A)前記移動相送液部から送液する移動相における超臨界流体とモディファイアの組成を、移動相が超臨界状態となる状態から移動相が液体状態となる状態までの範囲にわたって、その移動相における超臨界流体に対するモディファイアの割合を時間的に増加させるステップ、
(B)前記試料注入部から試料を注入するステップ、及び
(C)前記分離カラムから溶出した試料成分を前記検出器により検出するステップ。 A mobile phase feeding unit, a separation column arranged in an analysis channel from the mobile phase feeding unit, a sample injection unit for injecting a sample into an analysis channel between the mobile phase feeding unit and the separation column, An analysis method using a chromatograph provided with a detector for detecting a sample component eluted from the separation column and a back pressure valve disposed downstream of the separation column with respect to the flow of the mobile phase in the analysis flow path. And
An analysis method comprising the following steps (A) to (C):
(A) the composition of the supercritical fluid and modifier in the mobile phase to feed from the mobile phase liquid feed unit, mobile phase to Do that state the mobile phase is a liquid state from a supercritical state Do that state Increasing in time the ratio of modifier to supercritical fluid in the mobile phase over a range;
(B) A step of injecting a sample from the sample injection unit, and (C) a step of detecting a sample component eluted from the separation column by the detector.
前記モディファイアがメタノール又はメタノールに水を含む溶液である請求項2に記載の分析方法。 As the separation column, a filler having octadecyl carbon chain bonded to silica as a stationary phase, a filler having a propylfluorophenyl group bonded to silica as a stationary phase, or a filler having octadecylsilyl group bonded to silica. Is a stationary phase,
The analysis method according to claim 2, wherein the modifier is methanol or a solution containing water in methanol.
The analysis method according to claim 5, wherein in step (A), the ratio of the modifier to the supercritical fluid in the mobile phase is increased to 100 % .
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