EP2429576A1 - Vaccin meningocoque a base de lipooligosaccharide (los) et de proteine de neisseria meningitidis - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un vaccin à l'encontre des infections à N. meningitidis, qui comprend (i) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne a de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne (a) porte en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions 0-6 et O-7; ou (b) porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6 ou O-7; et (ii) la sous- unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis ou un fragment lipide de cette TbpB.

Description

Vaccin méningocoque à base de lipooligosaccharide (LOS) et de protéine de Neisseria meninsitidis

L'invention s'inscrit dans le domaine des vaccins à l'encontre des infections dues à Neisseria meningitidis et propose notamment une composition vaccinale comprenant du lipooligosaccharide (LOS) en association avec la sous-unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis.

Dans le domaine des vaccins, un des enjeux majeurs des prochaines années sera notamment la mise sur le marché d'un vaccin destiné à prévenir l'ensemble des infections à N. meningitidis sérogroupe B. Cette bactérie est responsable d'un certain nombre de pathologies, parmi lesquelles de façon dominante, les méningites et les méningococcies, mais aussi des arthrites et péricardites. Les méningococcies peuvent se compliquer de purpura fulminons et de choc septique mortel.

D'une manière générale, les méningites sont soit d'origine virale, soit d'origine bactérienne. Dans les pays développés, les bactéries principalement responsables sont : N. meningitidis et Streptococcus pneumoniae, respectivement impliquées dans environ 40 et 50 % des cas de méningites bactériennes. Dans les pays en voie de développement Haemophilus influenzae reste aussi une source importante de méningites.

On dénombre en France, environ 600 à 800 cas par an de méningites à N. meningitidis. Aux Etats-Unis, le nombre de cas s'élève à environ 2 500 à 3 000 par an. L'espèce N. meningitidis est subdivisée en sérogroupes selon la nature des polysaccharides de capsule. Bien qu'il existe une douzaine de sérogroupes, 90 % des cas de méningites sont attribuables aux sérogroupes : A, B, C, Y et Wl 35.

Il existe des vaccins efficaces à base de polysaccharides capsulaires pour prévenir les méningites à N. meningitidis des sérogroupes A, C, Y et Wl 35. Ces polysaccharides tels quels ne sont que peu ou pas immunogènes chez les enfants de moins de 2 ans et n'induisent pas de mémoire immunitaire. Toutefois, ces inconvénients peuvent être surmontés en conjuguant ces polysaccharides à une protéine porteuse.

Par contre, le polysaccharide capsulaire de N. meningitidis sérogroupe B n'est pas ou peu immunogène chez l'homme, qu'il soit sous forme conjuguée ou non (Bruge et al, Vaccine (2004) 22 : 1087). D'autre part, ce polysaccharide est porteur d'un épitope qui peut potentiellement réagir de manière croisée avec des tissus humains. Ainsi, il apparaît hautement souhaitable de rechercher un vaccin à rencontre des méningites induites par N. meningitidis notamment du sérogroupe B autre qu'un vaccin à base de polysaccharide capsulaire.

Le lipopolysaccharide (LPS) est un constituant majeur de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram-négatif. Le LPS est toxique à forte dose pour les mammifères et au regard de cette activité biologique, a été dénommé endotoxine. Il est responsable du choc septique, pathologie mortelle qui se développe suite à une infection aigiie par une bactérie à Gram-négatif.

Néanmoins, le LPS n'est pas seulement toxique, il est aussi immunogène. Chez les mammifères, les anticorps anti-LPS sont générés pendant le portage et l'infection et peuvent être protecteurs. Ainsi, l'usage du LPS a déjà été envisagé dans la prophylaxie des infections dues aux bactéries à Gram-négatif et des maladies associées.

La structure du LPS est constituée d'une partie lipidique, appelée le lipide A, liée de manière covalente à une partie polysaccharidique. Le lipide A est responsable de la toxicité du LPS. Il est fortement hydrophobe et permet d'ancrer le LPS dans la membrane externe de la paroi. Le lipide A est composé d'une structure disaccharidique substituée par des chaînes d'acides gras. Le nombre et la composition des chaînes d'acides gras varient d'une espèce à l'autre.

La partie polysaccharidique est constituée par des chaînes de carbohydrates qui sont responsables de Pantigénicité. On distingue au moins 3 grandes régions dans cette partie polysaccharidique :

(i) un core interne, constitué de monosaccharides [un ou plusieurs KDO (acide 2- céto-3-desoxy-octulosonique) et un ou plusieurs heptose (Hep)] invariants au sein d'une même espèce bactérienne ; (ii) un core externe lié à un heptose et constitué de divers monosaccharides ; et

(iii) une chaîne externe O-spécifique constituée d'un enchaînement d'unités répétitives - unités répétitives elles-mêmes composées de un ou plusieurs monosaccharides différents.

D'une espèce à une autre, la structure du LPS est variable. C'est ainsi que par exemple, chez un certain nombre de bactéries non-entériques à Gram-négatif telles que les

Neisseriae, Bordetellae, Branhamellas, Haemophilus et Moraxellae, la chaîne O- spécifique n'existe pas. La partie saccharidique de LPS de ces bactéries n'est constituée que du core oligosaccharidique. Par conséquent, le LPS de ces bactéries est souvent dénommé lipooligosaccharide (LOS).

La structure du LPS varie non seulement d'une espèce à une autre, mais peut aussi au sein d'une même espèce.

Ainsi, toutes les souches de N. meningitidis ne possède pas un LOS de même structure, bien que tous les LOS du méningoccoque partagent la structure de base qui est schématisée dans la formule développée suivante :

KDO α chain Rl - A β chain

GlcΝAc γ chain

Le core externe (ou chaîne α) est variable en fonction du type d'oligosaccharide (substituant Rl), accroché sur le résidu glucose porté par l'heptose I.

Alors que le lipide A est essentiellement invariant, le core interne, constitué lui aussi de manière invariante, de deux KDO (acide 2-céto, 3-desoxy, octulosonique) et de deux heptoses (HepI et HepII), porte des substitutions diverses au niveau (i) de l'heptose II (substituants R2 et R3) ; et (ii) de la chaîne γ, constituée d'une glucosamine Ν-acétylée (GlcΝAc) qui peut être on non O-acétylée. Dans la littérature, le résidu R2 est communément appelé chaîne β, lorsque R2 est un résidu glucose.

Les souches de N. meningitidis sont classées en plusieurs immunotypes (IT Ll à Ll 3), en fonction de leur réactivité avec une série d'anticorps qui reconnaissent des épitopes variés sur le LOS (Achtman et al, 1992, J. Infect. Dis. 165 : 53-68). La majorité des souches invasives à N. meningitidis sérogroupe B est d'immunotype L3,7 comme cela a été mis en évidence par la réactivité de ces souches avec un anticorps monoclonal dénommé 12,1,9. Cet anticorps monoclonal est capable de reconnaître chacun des immunotypes L3, L7 et L9 (Gu et al, J. Clin. Microbiol. (1992) 30 : 2047 ; Moran et al, Infect. Immun. (1994) 62 (12) : 5290 ; et Scholten et al, J. Med. Microbiol. (1994) 41 : 236). La classification du LOS suit celle des souches. Les différences entre immunotypes proviennent de variations dans la composition et dans la conformation des chaînes oligosaccharidiques. Ceci transparaît dans le tableau ci-dessous, dérivé du tableau 2 de Braun et al, Vaccine (2004) 22 : 898, complété par des données obtenues ultérieurement et relatives aux immunotypes L9 (Choudhury et al, Carbohydr. Res. (2008) 343 : 2771) et LI l (Mistretta et al, (2008) Poster at the 16th International Pathogenic Neisseria Conférence, Rotterdam) :

Tableau I :

n.d. : non déterminé.

Entre autre, on peut noter que certains LOS peuvent être sialylés (présence d'acide N- acétyl neuraminique sur le résidu galactose (GaI) terminal de la chaîne α). Ainsi, les immunotypes L3 et L7 ne diffèrent que par la présence / absence respective de cette sialylation. Par ailleurs, la plupart des LOS sont substitués par un groupement O-acétyle sur le résidu glucosamine (α-GlcNAc) du core interne (Wakarchuk et al. (1998) Eur. J. Biochem. 254 : 626 ; Gamian et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 : 922 ; Kogan et al (1997) Carbohydr. Res. 298 : 191 ; Di Fabio et al. (1990) Can. J. Chem. 68 : 1029 ; Michon et al. (1990) J. Biol. Chem. 275 : 9716 ; Choudhury et al. (supra) ; et Mistretta et al. (supra).

Les autres variations dans la structure du LOS sont dues à différents facteurs génétiques au nombre desquels : (i) la présence / absence de certains gènes impliqués dans la voie de biosynthèse du LOS et aux associations possibles des gènes entre eux ; (ii) la variation de phase à laquelle sont soumis certains gènes ;

(iii) la recombinaison homologue [certains gènes possédant des régions conservées (IgtB, IgtE et igtΑ) et d'autres gènes étant des hybrides (igtZ est l'hybride des gènes igtA et IgtB), des réarrangements peuvent se produire] ; et (iv) les mutations.

Les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse du LOS (à l'exception de deux) sont répartis en trois loci (lgt-1, lgt-2 et lgt-3). La description de ces gènes ainsi que leur fonction est fournie ci-après, illustrée de manière schématique par la figure 1 qui présente la structure du LOS de N. meningitidis, les différents sites où la variabilité s'exprime ainsi que les niveaux d'intervention des gènes.

Les gènes hors locus sont Ipû et loû. Le gène Ipύ code pour une PEA transférase. Cette enzyme a la capacité d'accrocher un résidu phosphoéthanolamine (PEA) en position O-3 de l'heptose II. Le gène loύ code pour une LOS O-acétyltransférase qui possède la capacité de O-acétyler la chaîne γ. Il est soumis à une variation de phase.

Le locus lgt-1 comporte 7 gènes : IgtA, IgtB, igtC, igtD, IgtE, Igtϋ et IgtZ codant chacun pour une glycosyl transférase particulière. Parmi ces gènes, IgtA et igtC sont soumis à une variation de phase. IgtE et igtR présentent une variation allélique : le codon déterminant l'acide aminé en position 153 code soit pour un résidu thréonine (et dans ce cas l'enzyme qui en résulte est une Gal-transférase) ; soit pour un résidu méthionine (et dans ce cas l'enzyme qui en résulte est une Glc-transférase).

Le locus lgt-1 est classé en 8 types génétiques (Zhu et al, Microbiology (2002) 148 : 1833). Le locus /gt-2 comporte 2 gènes : IgtF et igtK codant pour des glycosylases. Le produit du gène IgtF intervient dans la construction de la chaîne α en permettant la fixation du résidu glucose sur l'heptose I et donc n'intervient pas sur la nature de Pimmunotype ; ni le gène IgtK d'ailleurs.

Le locus lgt-3 comporte 2 gènes : /g/G et Iptβ. Le gène igtG code pour une GIc synthétase qui possède la capacité d'accrocher un résidu glucose en position O-3 de l'heptose IL Le gène Iptβ code pour une PEA transférase qui possède la capacité d'accrocher un substituant phosphoéthanolamine (PEA) en position O-6 ou O-7 de l'heptose IL Le gène igtG est soumis à une variation de phase. Lorsqu'il est « On » et accompagné d'un gène Ipβ fonctionnel, l'accrochage du résidu glucose se fait toujours au dépend du PEA (dont l'accrochage est médié par Ipύ).

Le locus lgt-3 est classé en 5 types génétiques (Wright et al, J. Bact. (Oct. 2004) : 6970). Le motif de carbohydrates Galβl-4GlcNAcβl-3Galβl-4Glcβl-4 ou motif lacto-N- néotétraose qui est présent dans la chaîne α de certains immunotypes du LOS de JV. meningitidis, constitue un épitope qui peut potentiellement réagir de manière croisée avec les érythrocytes humains. Ainsi, en vue de fabriquer un vaccin destiné aux humains, il convient de choisir un LOS ne possédant pas ce motif. Il peut donc être particulièrement avantageux d'utiliser un LOS provenant de souches d'immunotype L6 ou L8.

De manière alternative, on peut aussi envisager de partir par exemple d'une souche d'immunotype L2 ou L3 dans laquelle on a inactivé par mutation un gène intervenant dans la biosynthèse de la chaîne α, de manière à obtenir une structure LNnT incomplète. De telles mutations sont proposées dans la demande de brevet WO 04/014417. Le LOS des souches mutées qui en résultent, possèdent une chaîne α de type L6 et un substituant phosphoethanolamine (PEA) en position O-3 de l'heptose IL

On a maintenant trouvé que le LOS d'une souche d'immunotype L8 (LOS d'immunotype L8), en association avec la sous-unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis, pouvait induire une activité bactéricide améliorée par rapport à celle induite par un LOS (en association avec la même TbpB) possédant une chaîne α de type L6, et un substituant phosphoethanolamine (PEA) en position O-3 de l'heptose II.

C'est pourquoi, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique vaccinale à l'encontre des infections à N. meningitidis, qui comprend :

(i) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne (a) porte en position O-3 un substituant phosphoethanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions O-6 et 0-7 ; ou (b) porte un substituant phosphoethanolamine (PEA), en position 0-3 et en position 0-6 ou 0-7 ; et

(ii) la sous-unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis ou un fragment lipide de cette TbpB. Sous un aspect particulier, un vaccin selon l'invention comprend : (i) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions 0-6 et O-7 ;

(ii) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6 ou O-7 ; et (iii) la TbpB de N. meningitidis ou un fragment lipide de cette dernière.

Dans la suite du texte, le terme « ou un fragment lipide de cette dernière » n'apparaît plus, par souci de simplification. Néanmoins il reste sous-entendu chaque fois que le terme « TbpB lipidée » ou « TbpB » apparaît.

Une composition selon l'invention peut (i) prévenir au moins 60 %, avantageusement au moins 70 %, de préférence au moins 80 % des infections dues à N. meningitidis, notamment de sérogroupe B ou (ii) prévenir des infections dues au moins à 60 %, avantageusement au moins 70 %, de préférence au moins 80 % des souches de N. meningitidis notamment de sérogroupe B.

De manière avantageuse, une composition selon l'invention ne contient pas d'OMV (vésicule de membrane externe) de N. meningitidis.

*****

LeLOS

Pour usage dans une composition selon l'invention, le LOS constitué notamment d'un lipide A₅ d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6 ou O-7, peut être celui d'une souche d'immunotype L8 atypique telle que la souche Al (Zhu, Klutch & Tsai, FEMS Microbiology Letters (2001) 203 : 173 ainsi que Gu, Tsai & Karpas, J. Clin. Microbiol. (Aug 1992) 30 (8) : 2047). Selon un mode avantageux, le LOS provient d'une souche de sérogroupe A. On peut aussi fabriquer un vaccin selon l'invention, en utilisant un LOS constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte en position 0-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions O-6 et O-7. De manière typique, un tel LOS provient d'une souche d'immunotype L8, de préférence de sérogroupe A. On propose également d'obtenir un tel LOS à partir d'une souche de N. meningitidis d'immunotype L6 modifiée de telle sorte qu'elle exprime un gène Ipύ et qu'elle n'exprime plus les gènes Iptô et igtA. La souche de départ pouvant être utilisée à des fins de modification peut être la souche C708 déposée le 11 mars 2008, auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris, selon les termes du traité de Budapest. Cette souche porte le numéro d'ordre CNCM I- 3942. Cette souche possède entre autre un gène IgtA actif (gène allumé « ON ») ; un gène igtB - (gène non fonctionnel) ; un gène igtG éteint (« Off») ; un gène Ipβ tronqué ; un gène Iρt6 actif ; un gène lofà actif ; et un gène msbB actif.

La souche C708 comporte un gène IpB tronqué. Pour la modifier de telle sorte que le LOS soit porteur d'un substituant PEA en position 03, on peut restaurer la fonctionnalité du gène Ipt3, notamment par recombinaison homologue faisant usage d'un gène Ipfà complet (full-length). Lorsque cette souche est utilisée dans le procédé selon l'invention, il convient en plus de désactiver les gènes iptA et Iptd pour obtenir une souche qui n'exprime plus ces gènes. La désactivation de ces gènes peut être notamment réalisée par délétion totale ou partielle des gènes IptA et Iptβ ou bien encore par insertion intra- génique d'une séquence non pertinente, par exemple d'un gène de résistance à un antibiotique.

Le sérogroupe de N. meningitidis contre lequel il est impératif de proposer un vaccin en priorité est le sérogroupe B (des vaccins contre les autres sérogroupes prévalents A, C, Y et Wl 35 sont déjà disponibles). Or la purification du LOS à partir d'une souche de sérogroupe B peut conduire à un produit contenant des quantités résiduelles de polysaccharide de capsule, indésirables dans le vaccin. Pour pallier ces difficultés, on a maintenant trouvé qu'un LOS adhoc issu d'une souche de sérogroupe A pouvait remplir les besoins en matière de vaccination contre le sérogroupe B. De manière avantageuse, un LOS pour usage dans une composition selon l'invention, possède une chaîne γ qui est O-acétylée, au moins de manière partielle. Aux fins de la présente invention, le LOS peut être obtenu par des moyens conventionnels : en particulier, il peut être extrait à partir d'une culture bactérienne ; puis purifié selon des méthodes classiques. De nombreux procédés d'obtention sont décrits dans la littérature. A titre d'exemple, on cite La., Westphal & Jann, (1965) Meth. Carbohydr. Chem. 5 : 83 ; Gu & Tsaï, 1993, Infect. Immun. 61 (5) : 1873 ; Wu et al, 1987, Anal. Biochem. 160 : 281 and US 6,531,131. Une préparation de LOS peut être quantifiée selon des procédures bien connues. Le dosage du KDO par chromatographie d'échange d'anions à haute performance (HPAEC-PAD) est une méthode qui convient tout particulièrement. Détoxification du LOS

Pour incorporation dans un vaccin, le LOS se doit d'être détoxifié. La toxicité du LOS est due à son lipide A. Néanmoins, il n'est pas impératif de retirer le lipide A dans son intégralité ; ni de le modifier par exemple par mutation (e.g. mutation msbB minus). En effet, la toxicité étant plus particulièrement liée à une conformation supra moléculaire conférée par la totalité des chaînes d'acides gras portées par le noyau disaccharidique du lipide, selon un mode avantageux, il suffit d'agir au niveau de ces chaînes.

La détoxification peut être obtenue selon des approches diverses : chimique, enzymatique, génétique ou bien encore par complexation avec un peptide analogue de la polymixine B ou bien encore par incorporation / formulation en liposomes. Le niveau de détoxification du LOS, peut être apprécié La. selon l'un des deux tests standard suivants :

Le test pyrogène chez le lapin. Ce test, les calculs et leur lecture et ont été réalisés selon les principes énoncés par la Pharmacopée Européenne (Edition 6.0, paragraphe 2.6.8.). - Le test LAL (Limulus Amebocyte Lysate) réalisé selon les principes énoncés par la Pharmacopée Européenne (Edition 6.0, paragraphe 2.6.14.).

Détoxification par voie chimique

L'approche chimique consiste à traiter le LOS par un agent chimique. Selon un mode particulier, le LOS est soumis à une hydrolyse acide douce avec de l'acide acétique qui élimine le lipide A ainsi que les ou les KDO en ramification quand celui-ci (ceux-ci) est

(sont) présent(s) dans la structure du LOS. Un tel traitement est par exemple décrit dans Gu & Tsai Infect. Immun. (1993) 61 : 1873. Selon un mode alternatif et préféré, le LOS est soumis à une dé-O-acylation, de préférence primaire, la. par traitement à l'hydrazine qui hydrolyse les chaînes d'acides gras primaires estérifiées du lipide A. Un tel traitement est par exemple décrit dans USP 6,531,131, Gupta et al, Infect. Immun. (1992) 60 (8) : 3201 et Gu et al, Infect. Immun. (1996) 64 (10) : 4047.

Détoxification par voie enzymatique

L'approche enzymatique consiste à mettre le LOS en présence de lipases capables de digérer les chaînes d'acides gras estérifiées du lipide A. De telles lipases sont produites par l'amibe Dictyostelium discoideum. Selon un mode particulièrement avantageux, on cultive ensemble (co-culture) l'amibe et une bactérie à Gram-négatif pouvant être phagocytée par l'amibe, telle que N. meningitidis. Puis on récupère le surnageant et on extrait le LOS du surnageant qui est alors dépourvu des chaînes d'acides gras. Ce peut être également une acyloxyacyl hydrolase produite par certaines cellules humaines (brevet WO 87/07297 Munford R.) ou par Salmonella typhimurium (Trent et al 2001 J. Biol. Chem. 276 : 9083-9092 ; Reynolds et al. 2006 J. Biol. Chem. 281 : 21974-21987) (enzyme codée par les gènes PagL ou LpxR dans ce dernier cas).

Détoxification par voie génétique

L'approche génétique consiste à utiliser un LOS produit par une souche bactérienne dont le génotype est tel que l'entité du LOS normalement responsable de sa toxicité (le lipide A et plus particulièrement les queues lipidiques du lipide A) présente un degré de toxicité largement réduit ou même inexistant. Une telle souche bactérienne peut être commodément obtenue par mutation. A partir d'une souche sauvage (c'est-à-dire produisant un LOS toxique), il s'agit alors d'inactiver par mutation certains gènes intervenant dans la biosynthèse des chaînes d'acides gras ou dans leur accrochage sur le noyau disaccharidique du lipide A. Ainsi, on peut prévoir d'inactiver les gènes ipxlΛ ou ipxLl (aussi appelés htrBl I JιtrB2) de N. meningitidis ou leur équivalents dans d'autres espèces (par exemple, les équivalent des gènes IpxLl et lpxL2 du méningoccoque sont appelés respectivement appelés msbB ou ipxM et htrB ou ipxL chez E. coll). Une mutation inactivant l'un de ces gènes conduit à un LOS dépourvu d'une ou de deux chaînes acyles secondaires. Des mutants IpxLl ou L2 de N. meningitidis ou d'Haemophilus influenzae sont en particulier décrits dans les demandes de brevet WO 00/26384, US 2004/0171133 et WO 97/019688. Chez N. meningitidis le gène endogène ipxA peut être aussi remplacé par le gène homologue en provenance d'E. coli ou Pseudomonas aeruginosa. Les chaînes d'acides gras en sont modifiées, avec pour conséquence un lipide A moins toxique (Steeghs et al, CeIl. Microbiol. (2002) 4 (9) : 599). L'approche génétique est privilégiée lorsque le LOS est purifié sous forme d'OMVs.

LOS détoxifiépar complexation avec unpeptide analogue de lapolymixine B

Une quatrième approche consiste à complexer le LOS avec un peptide analogue de la polymixine B, comme cela est par exemple décrit dans la demande de brevet WO 06/108586. Le LOS complexé et par conséquent, détoxifîé est appelé endotoxoïde. L'analogue de la polymixine B entrant dans la composition d'un endotoxoïde utile aux fins de la présente invention peut être n'importe quel peptide capable de détoxifier le LOS par simple complexation. De tels peptides sont notamment décrits dans les brevets ou demandes de brevet US 6,951,652, EP 976 402 et WO 06/ 06/108586.

Ainsi un peptide avantageux peut être le peptide de formule (I) NH₂-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH, dans laquelle :

A est un peptide de 2 à 5, de préférence 3 ou 4 résidus d'acide aminé, dans lesquels au moins 2 résidus d'acide aminé, sont indépendamment choisis parmi Lys, HyI (hydroxylysine), Arg et His ;

B est un peptide de 3 à 7, de préférence 4 ou 5 résidus d'acide aminé, qui comporte au moins deux, de préférence trois résidus d'acide aminé choisis parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; et

C est facultatif (cette position peut être vide ou pas) et est un résidu d'acide aminé ou un peptide constitué de 2 à 3 résidus d'acide aminé ; à condition que rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe dans le peptide de formule I soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2 ou 1.5, de préférence de 0.6 à 1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple de 0.75.

De préférence dans le peptide de formule (I) la position C est une position vide.

Des exemples particuliers du peptide de formule (I) sont les peptides suivants : NH₂-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys2-COOH (peptide SAEP2) ; NH₂-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH (peptide SAEP2-L2) ;. NH₂-Lys-Arg-His-Hyl-Cysl-Lys-Arg-Ile-Val-Leu-Cys2-COOH ; NH₂-LyS- Arg-His-Cysl-Val-Leu-Ile-Trp-Tyr-Phe-Cys2-COOH ; NH₂-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH ; et NH₂-Hyl-Arg-His-Lys-Cysl-Phe-Tyr-Trp-Val-Ile-Leu-Cys2-COOH.

Les peptides de formule (I) peuvent être sous forme de monomère ou de préférence sous forme de dimère, parallèle ou anti-parallèle. D'une manière générale, on peut aussi employer un peptide dimérique de formule (II) NH₂-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH

I I

NH₂-A' -Cysl-B'-Cys2-C'-C00H dans laquelle les deux résidus de Cysl sont liés ensemble par un pont disulfure et les deux résidus Cys2 sont liés ensemble par un pont disulfure ; ou de formule (III)

NH₂-A-Cysl-B-Cys2-C-COOH

I I

COOH-C'-Cys2-B'-Cysl-A'-NH₂ dans laquelle les résidus Cysl sont liés aux résidus Cys2 par des ponts disulfure interchaîne peptidique ; formules (II) et (III) dans lesquelles :

A et A' sont de manière indépendante un peptide de 2 à 5, de préférence 3 ou 4 résidus d'acide aminé, dans lesquels au moins 2 résidus d'acide aminé, sont indépendamment choisis parmi Lys, HyI (hydroxylysine), Arg et His ;

B et B' sont de manière indépendante un peptide de 3 à 7, de préférence 4 ou 5 résidus d'acide aminé, qui comportent au moins deux, de préférence trois résidus d'acide aminé ont indépendamment choisi parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; et

C et C sont facultatifs (ces positions peuvent être vides ou pas) et sont de manière indépendante un résidu d'acide aminé ou un peptide de 2 à 3 résidus d'acide aminé ; à condition que le rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe dans le dimère de formule (II) ou (III), soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2 ou 1.5, de préférence de 0.6 à 1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple. 0.75. Avantageusement, A et A' sont de manière indépendante un peptide de 2 à 5, de préférence 3 ou 4 résidus d'acide aminé, dans lesquels au moins un, de préférence 2 résidus d'acide aminé, sont choisis de manière indépendante parmi Lys, HyI, Arg et His ; et le cas échéant, ceux qui ne sont pas choisis parmi Lys, HyI, Arg et His (« les résidus restants d'acide aminé »), étant choisis dans le groupe des résidus d'acide aminé non- chargés, polaires ou non-polaires ; de préférence Thr, Ser et GIy ; de manière tout particulièrement préférée Thr.

Quand A et A' comportent 3 résidus d'acide aminé, chacun d'entre eux peut être un résidu cationique ; ou alternativement, deux sur trois résidus sont les acides aminés cationiques, tandis que le résidu restant est choisi dans le groupe des résidus d'acide aminé non-chargés, polaires ou non-polaires ; de préférence Thr, Ser et GIy ; de manière tout particulièrement préférée Thr.

Quand A et A' comportent 4 résidus d'acide aminé, on préfère que deux ou trois sur quatre résidus soient choisis parmi les groupes de résidus d'acide aminé cationiques comme défini ci-dessus, tandis que le résidu restant (s) est (sont) choisi(s) dans le groupe des résidus des résidus d'acide aminés non-chargés polaires ou non polaires comme défini ci-dessus.

Quand A et A' comportent 5 résidus d'acide aminé, on préfère que trois ou quatre sur cinq résidus soient choisis parmi les groupes de résidus cationiques d'acide aminé comme défini ci-dessus, tandis que le résidu restant (s) est (sont) choisi(s) dans le groupe des résidus des résidus d'acide aminés non-chargés polaires ou non polaires comme défini ci-dessus.

Avantageusement, B et B' sont de manière indépendante un peptide de 3 à 7, de préférence 4 ou 5 résidus d'acide aminé, qui comporte au moins deux, de préférence trois résidus d'acide aminé indépendamment choisis parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; de préférence Leu, Ile et Phe ; et le cas échéant, ceux qui ne sont pas choisis parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp (« les résidus restants d'acide aminé »), étant indépendamment choisis dans le groupe constitué de Lys, HyI, Arg et His. Comme on peut facilement le comprendre, B et B' peuvent comporter jusqu'à 7 résidus d'acide aminé choisis de manière indépendante parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp.

Avantageusement, B et B' comportent la séquence - Xl - X2 - X3 -, dans lequel Xl et X2 ; X2 et X3 ; ou Xl, X2 et X3 sont indépendamment choisis parmi Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; de préférence parmi Leu, Ile et Phe. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence - X1 - X2 - X3 - comporte le motif Phe-Leu. Les modes de réalisation particuliers de B et B' incluent : (i) la séquence - X1 - X2 - X3 - dans laquelle : Xl est Lys, HyI, His ou Arg, de préférence Lys ou Arg ; de préférence Lys ; X2 est Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp ou Val ; de préférence Phe ou Leu ; de manière plus particulièrement préférée Phe ; et

X3 est Phe, Leu, Ile, Tyr, Trp ou Val ; de préférence Phe ou Leu ; de manière plus particulièrement préférée Leu ; et (ii) le cas échéant, les résidus d'acide aminé, chacun étant indépendamment choisi dans le groupe constitué par Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, HyI, Arg et His ; de préférence Val, Leu, Ile, Phe, Tyr et Trp ; de manière plus particulièrement préférée Leu, Ile et Phe.

Quand B et B' comportent plus de 4 résidus non polaires d'acide aminé, A et A comportent de préférence au moins 3 résidus d'acide aminé chargés de manière positive. Dans C et C, les résidus d'acide aminé peuvent être n'importe quel résidu d'acide aminé à condition que le rapport de résidus d'acide aminé cationique / résidus d'acide aminé hydrophobe demeure dans la gamme indiquée. Avantageusement, ils sont indépendamment choisis parmi les résidus d'acide aminé non-chargés, polaires ou non- polaires, ces derniers étant préférés. Cependant, d'une façon préférée, les positions C et C sont des positions vides.

Par conséquent, une classe préférée des dimères sont de formule (IV) NH₂-A-Cysl-B-Cys2-COOH

I I

NH₂-A'-Cysl~B'-Cys2-COOH dans laquelle les deux résidus de Cysl sont liés ensemble par un pont disulfure et les deux résidus Cys2 sont liés ensemble par un pont disulfure ; ou de formule (V)

NH₂-A-Cysl-B-Cys2-COOH

I I HOOC-Cys2-B'-Cysl-A'-NH₂ dans laquelle les résidus Cysl sont liés aux résidus Cys2 par des ponts disulfure inter- chaîne peptidique ; formules (IV) et (V) dans lesquelles A, A', B et B' sont comme décrit ci-dessus ; à condition que le rapport acide aminé cationique / acide aminé hydrophobe dans le dimère de formule (IV) ou (V), soit de 0.4 à 2, avantageusement de 0.5 à 1.2 ou 1.5, de préférence de 0.6 à 1 ; mieux de 0.6 à 0.8 ; par exemple. 0.75.

Dans les formules (II) à (V), A et A' sont de préférence identiques. De même en ce qui concerne B et B' d'une part ; et C et C d'autre part. Un dimère de formule (II) à (V), dans lesquelles A et A' ; B et B' ; et C et C sont deux à deux identiques, est désigné sous le nom de dimère homologue.

Pour ces derniers, on cite à titre d'exemple, les dimères parallèle et antiparallèle formés à partir du peptide S AEP2-L2 : NH₂-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH

I I

NH₂-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH ; et

NH₂-Lys-Thr-Lys-Cys 1 -Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH HOOC-Cys2-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Cysl-Lys-Thr-Lys-NH₂.

L'endotoxoïde utile aux fins de la présente invention peut être avantageusement caractérisé par un rapport molaire LOS : peptide de 1 : 1.5 à 1 : 0.5, de préférence de 1 : 1.2 à 1 : 0.8, de manière tout particulièrement préférée de 1 : 1.1 à 1 : 0.9, e.g. de 1 : 1.

LOS détoxifié en liposomes Lorsque le LOS est formulé en liposomes, il n'apparaît pas forcément nécessaire de le détoxifier au préalable. En effet, le LOS en liposomes - c'est-à-dire associé à la bicouche lipidique formant les liposomes — peut voir sa toxicité décroître de manière très substantielle. L'ampleur de cette décroissance pouvant aller jusqu'à une perte substantielle, est en partie fonction de la nature des composants formant le liposome. Ainsi, lorsque l'on utilise des composants chargés positivement (composants de nature cationique), la perte de toxicité peut être plus importante qu'avec des composants non- chargés (neutre) ou anioniques.

Par « liposomes », on entend une entité synthétique, de préférence une vésicule synthétique, formée d'au moins une membrane (ou matrice) lipidique bi-couche refermée sur un compartiment aqueux. Aux fins de la présente invention, les liposomes peuvent être unilamellaires (une seule membrane bi-couche) ou plurilamellaires (plusieurs membranes disposées en oignon). Les lipides constituant la membrane bi- couche comportent une région non-polaire qui de manière typique est faite de chaîne(s) d'acides gras ou de cholestérol, et d'une région polaire, typiquement faite d'un groupement phosphate et/ou de sels d'ammonium tertiaires ou quaternaires. En fonction de sa composition, la région polaire peut, notamment à pH physiologique (pH ≈ 7), être porteuse d'une charge de surface nette (globale) soit négative (lipide anionique), soit positive (lipide cationique) ou ne pas porter de charge nette (lipide neutre). Aux fins de détoxification du LOS, les liposomes peuvent être n'importe quel type de liposomes ; en particulier, ils peuvent être constitués de n'importe quel lipide connu pour son utilité dans la fabrication des liposomes. Le ou les lipides entrant dans la composition des liposomes peuvent être des lipides neutres, anioniques ou cationiques ; ces derniers étant préférés. Ces lipides peuvent être d'origine naturelle (produits d'extraction de plante ou d'oeuf, par exemple) ou synthétique ; ces derniers étant préférés. Les liposomes peuvent être aussi constitués d'un mélange de ces lipides ; par exemple d'un lipide cationique ou anionique et d'un lipide neutre, en mélange. Dans ces deux derniers cas, le lipide neutre est souvent désigné sous le terme de co-lipide. Selon un mode de mélange avantageux, le rapport molaire lipide chargé (cationique ou anionique) : lipide neutre est compris entre 10 : 1 et 1 : 10, avantageusement entre 4 : 1 et 1 : 4, de préférence entre 3 : 1 à 1 : 3, bornes incluses.

En ce qui concerne les lipides neutres, on cite à titre d'exemple : (i) le cholestérol ; (ii) les phosphatidylcholines comme par exemple les l,2-diacyl-5n-glycéro-3-phospho- cholines e.g., la l,2-dioleoyl-.y«-glycéro-3-phosphocholme (DOPC), ainsi que les 1-acyl- 2-acyl-sn-glycéro-3-ρhosphocholines dont les chaînes acyles sont différentes entres elles (chaînes acyles mixtes) ; et (iii) les phosphatidyléthanolamines comme par exemple les l,2-diacyl-s«-glycéro-3-phosphoéthanolamines e.g., la l,2-dioleoyl-sn-glycéro-3- phosphoéthanolamine (DOPE), ainsi que les l-acyl-2-acyl-5n-glycéro-3- phosphoéthanolamine portant des chaînes acyles mixtes.

En ce qui concerne les lipides anioniques, on cite à titre d'exemple (i) l'hémisuccinate de cholestérol (CHEMS) ; (ii) les phosphatidylsérines telles que les l,2-diacyl-,s«- glycéro-3-[phospho-L-sérine] e.g., la l^-dioleoyl-src-glycéro-S-tphospho-L-sérine] (DOPS), et les l-acyl-2-acyl-s«-glycéro-3-[phospho-L-sérine] portant des chaînes acyles mixtes ; (iii) les phosphatidylglycérols tels que les l,2-diacyl-5«-glycéro-3-[phospho- rae-(l-glycérol)] e.g., la l,2-dioleoyl-5»-glycéro-3-[phospho-rαc-(l-glycérol)] (DOPG), et les l-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-[phospho-rac-(l-glycérol)] portant des chaînes acyles mixtes ; (iv) les acides phosphatidiques tels que les l,2-diacyl-sn-glycéro-3 -phosphate e.g., le l,2-dioleoyl-s«-glycéro-3 -phosphate (DOPA), et les l-acyl-2-acyl-5'«-glycéro-3- phosphate portant des chaînes acyles mixtes ; et (v) les phosphatidylinositols tels que les l,2-diacyl-sn-glycéro-3-(phospho-inositol) e.g., le l,2-dioleoyl-5n-glycéro-3-(phospho- inositol) (DOPI) et les l-acyl-2-acyl-,s«-glycéro-3-(phospho-inositol) portant des chaînes acyles mixtes. En ce qui concerne les lipides cationiques, on cite à titre d'exemple :

(i) les aminés lipophiles ou alkylamines comme par exemple le diméthyldioctadécylammonium (DDA), le triméthyldioactadecylammonium (DTA) ou les homologues structuraux du DDA et du DTA [ces alkylamines sont avantageusement utilisées sous forme de sel ; on cite par exemple le bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB)] ;

(ii) roctadécenoyloxy(éthyl-2-heptadécenyl-3-hydroxyéthyl) imidazolinium (DOTIM) et ses homologues structuraux ;

(iii) les lipospermines telles que la N~palmitoyl-D-erythrospingosyl-l-O-carbamoyl spermine (CCS) et la dioctadecylamidoglycylspermine (DOGS, Transfectam) ;

(iv) les lipides incorporant une structure éthylphosphocholine tels les dérivés cationiques des phospholipides, en particulier les dérivés ester phosphoriques de la phosphatidylcholine, par exemple ceux décrits dans la demande de brevet WO 05/049080 et incluant notamment : - la l,2-dimyristoyl-,s7î-glycéro-3 -éthylphosphocholine, la l,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3 -éthylphosphocholine, la l,2-palmitoyl-oleoyl-sn-glycéro-3 -éthylphosphocholine, la l,2-distearoyl-sn-glycéro-3 -éthylphosphocholine (DSPC), la l,2-dioleyl-5«-glycéro-3-éthylρhosphocholine (DOEPC ou EDOPC ou ethyl-DOPC ou ethyl PC), ainsi que leurs homologues structuraux ;

(v) les lipides incorporant une structure triméthyl ammonium tels que le N-(I -[2,3- dioleyloxy]propyl)-N,N,N-trimethylammonium (DOTMA) et ses homologues structuraux et ceux incorporant une structure triméthylammonium propane, tels que le l,2-dioleyl-3 -triméthylammonium propane (DOTAP) et ses homologues structuraux ; ainsi que les lipides incorporant une structure diméthylammonium tels que le 1,2- dioleyl-3-diméthylammonium propane (DODAP) et ses homologues structuraux ; et

(vi) les dérivés cationiques du cholestérol tels que le 3β-[Ν-(Ν',Ν'- dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol) ou d'autres dérivés cationiques du cholestérol comme ceux décrits dans le brevet US 5 283 185 et notamment l'iodure de cholestéryl-3β-carboxamidoéthylènetriméthylammonium, la cholestéryl-3β-carboxyamidoéthylènamine, l'iodure de cholestéryl-3β-oxysuccinamido- éthylènetriméthylammonium et le 3β-[N-(polyéthylènimine)-carbamoyl]-cholestérol.

Par « homologues structuraux », on signifie les lipides qui possèdent la structure caractéristique du lipide de référence tout en s'en différentiant par des modifications secondaires, notamment au niveau de la région non-polaire, en particulier du nombre d'atomes de carbone et des doubles liaisons des chaînes d'acides gras.

Ces acides gras, que l'ont trouve aussi dans les phospholipides neutres et anioniques, sont par exemple l'acide dodécanoique ou laurique (C12 :0), l'acide tétradécanoique ou myristique (C14 :0), l'acide hexadécanoique ou palmitique (C16 :0), l'acide cis-9- hexadécanoique ou palmitoleique (C 16 :1), l'acide octadécanoique ou stéarique (C18 :0), l'acide cis-9-octadécanoique ou oleique (C18 :l) , l'acide cis,cis-9,12- octadécadiénoiquec ou linoléique (C 18 :2), l'acide cis-cis-6,9-octadécadiénoique (C18 :2), l'acide ail cis-9,12,15-octadécatriénoique ou α-linolénique (C18 :3), l'acide ail cis-6,9,12-octadécatriénoique ou γ-linolénique (Cl 8 :3), l'acide eicosanoique ou arachidique (C20 :0), l'acide cis-9-eicosénoique ou gadoleique (C20 :1), l'acide ail cis- 8,11,14-eicosatrienoique (C20 :3), l'acide ail cis-5,8,l l,14-eicosatetraenoique ou arachidonique (C20 :4), l'acide ail cis-5,8,ll,14,17-eicosapentaneoique (C20 :5), l'acide docosanoique ou behenique (C22 :0), l'acide ail cis-7,10,13,16,19-docosapentaenoique (C22 :5), l'acide ail cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoique (C22 :6) et l'acide tétracosanoique ou lignocérique (C24 .O).

Selon un mode particulier, on utilise un mélange de lipide cationique et de lipide neutre. A titre d'exemple, on cite : un mélange de DC-chol et de DOPE, notamment dans un rapport molaire DC- chol : DOPE allant de 10 : 1 à 1 : 10, avantageusement de 4 : 1 à 1 : 4, de préférence d'environ 3 : 1 à 1 : 3; un mélange d'ethyl-DOPC et de cholestérol, notamment dans un rapport molaire ethyl-DOPC : cholestérol allant de 10 : 1 à 1 : 10, avantageusement de 4 : 1 à 1 : 4, de préférence d'environ 3 : 1 à 1 : 3; et un mélange d'ethyl-DOPC et de DOPE, notamment dans un rapport molaire ethyl-DOPC : DOPE allant de 10 : 1 à 1 : 10, avantageusement de 4 : 1 à 1 : 4 de préférence d'environ de 3 : 1 à 1 : 3. Selon un mode de préparation avantageux, on réalise dans un premier temps, un film lipidique sec avec tous les composés entrant dans la composition des liposomes. Puis on reconstitue le film lipidique en milieu aqueux, en présence de LOS, par exemple dans un rapport molaire lipides : LOS de 100 à 500, de manière avantageuse de 100 à 400 ; de préférence de 200 à 300 ; de manière tout particulièrement préférée, de 250 environ. D'une manière générale, on estime que ce même rapport molaire ne devrait pas varier de manière substantielle en final du procédé de préparation des liposomes LOS.

De manière générale, l'étape de reconstitution en milieu aqueux conduit à la formation spontanée de vésicules multi-lamellaires dont la taille est ensuite homogénéisée par diminution progressive du nombre de lamelles par extrusion, par exemple à l'aide d'un extrudeur par passages de la suspension lipidique sous pression d'azote, à travers des membranes en polycarbonates ayant des diamètres de pores de plus en plus réduits (0.8, 0.4, 0.2 μm). On peut aussi remplacer le procédé d' extrusion par un autre procédé mettant en œuvre un détergent (tensio-actif) qui disperse les lipides. Ce détergent est ensuite éliminé par dialyse ou par adsorption sur des microbilles de polystyrène poreuses particulièrement affines de détergent (BioBeads). Quand le tensio-actif se retire de la dispersion lipidique, les lipides se réorganisent en double couche.

A l'issue de l'incorporation du LOS en liposomes, on peut communément obtenir un mélange constitué de liposomes adhoc et de LOS forme libre. Avantageusement, les liposomes sont alors purifiés afin de se débarrasser du LOS non-détoxifié sous forme libre.

Conjugaison du LOS

Dans un vaccin selon l'invention, le LOS est avantageusement sous forme de conjugué LOS-polypeptide porteur, notamment quand il n'est pas sous forme d'OMVs ni de liposomes.

Le polypeptide porteur peut être n'importe quel polypeptide, oligopeptide ou protéine porteuse en usage dans le domaine des vaccins conjugués ; et notamment l'anatoxine pertussis, diphtérique ou tétanique, le mutant de la toxine diphtérique dénommé CRMl 97, une OMP bactérienne, un complexe bactérien de protéine [par exemple POMPC (outer-membrane protein C) de N. meningitidis], l'exotoxine A de Pseudomonas, la lipoprotéine D â'Haemophilus influenzae, la pneumolysine de Streptococcus pneumoniae, l'hémagglutinine filamenteuse de Bordetella pertussis et la sous-unité B lipidée du récepteur de la transferrine humaine de N. meningitidis.

De nombreuses méthodes de conjugaison existent dans le domaine technique. Certaines sont répertoriées par exemple dans les demandes de brevet EP 941 738 et WO 98/31393. D'une manière générale, les groupements réactifs du LOS mis en jeu lors de la conjugaison sont ceux du core interne (inner core) ou du lipide A. Il peut s'agir entre autre de la fonction acide du KDO ou bien d'un aldéhyde généré suite à un traitement approprié sur le disaccharide du lipide A. Par exemple, un traitement à la phosphatase génère un aldéhyde sur la structure de la deuxième glucosamine du lipide A de N. meningitidis (Brade H. (2002) J. Endotoxin Res. 8 (4) : 295 Mieszala et al, (2003) Carbohydrate Res. 338 : 167 et Cox et al, (2005) Vaccine 23 (5) : 5054).

De manière avantageuse, le procédé de conjugaison fait usage (i) d'un agent de liaison bifonctionnel (linker) ou (ii) d'un espaceur et d'un linker.

Par exemple, dans le premier cas, on active le LOS avec un agent de couplage bifonctionnel (linker) de formule Rl - A - R2 de telle sorte que le radical R2 réagisse avec un groupement réactif du KDO ou du lipide A afin d'obtenir un LOS activé ; puis on conjugue le LOS activé avec le polypeptide de telle sorte que le substituant Rl réagisse avec un groupement fonctionnel porté par le polypeptide afin d'obtenir un conjugué. Par exemple, dans le deuxième cas, on dérive le LOS avec un espaceur de formule R3 - B - R4 de telle sorte que le radical R3 réagisse avec un groupement réactif du KDO ou du lipide A afin d'obtenir un LOS dérivé ; puis on active le LOS dérivé avec un agent de couplage bifonctionnel (linker) de formule Rl - A - R2 de telle sorte que le radical R2 réagisse avec le radical R4 afin d'obtenir un LOS dérivé et activé ; enfin on conjugue le LOS dérivé et activé avec le polypeptide de telle sorte que le radical Rl réagisse avec un groupement fonctionnel porté par le polypeptide afin d'obtenir un conjugué.

Dans le deuxième cas on peut aussi procéder de la manière suivante : On dérive le polypeptide avec un espaceur de formule R3 - B - R4 de telle sorte que le radical R4 réagisse avec un groupement fonctionnel porté par le polypeptide ; on active le LOS avec un agent bifonctionnel (linker) de formule Rl - A - R2 de telle sorte que le radical R2 réagissent avec un groupement réactif du KDO ou du lipide A afin d'obtenir un LOS activé ; puis, on conjugué le LOS activé avec le polypeptide dérivé de telle sorte que le radical Rl du LOS activé réagisse avec le radical R3 du polypeptide dérivé afin d'obtenir un conjugué.

Dans la formule de l'espaceur, B peut être une chaîne carbone, de préférence carbonyl, alkyl ou alkylène, par exemple en Cl à C 12. R3 et R4 peuvent être de manière indépendante un groupe thiol ou aminé ou un résidu le portant, par exemple un groupe hydrazide Le., NH₂-NH-CO-. Des composés pouvant être utilisés comme espaceur sont par exemple de formule NH₂ - B - NH2, ou de préférence NH₂ - B - SH et NH₂ - B - S

- S - B' - NH₂. A titre d'exemple particulier on cite : la cystéamine, la cystéine les diamines e.g., le diaminohexane, l'acide adipique dihydrazide (ADH) l'urée et la cystamine.

Dans la formule du linker, A peut être une chaîne aromatique ou de préférence aliphatique substituée ou non, qui de manière avantageuse, comprend de 1 à 12 atomes de carbone ; de préférence 3 à 8 atomes de carbone. Par exemple A peut être un C2 à C8 alkylène, un phénylène, un C7 à C 12 aralkylène, un C2 à C8 alkyle, un phényle, un C7 à C12 aralkyle, C6 alkanoyloxy ou un benzylcarbonyloxy, substitué ou non.

Le radical R2 est le groupement fonctionnel du linker qui crée le lien au LOS ou au LOS dérivé. Ainsi, R2 est un groupement fonctionnel qui peut réagir avec un groupe carboxyle, hydroxyle, aldéhyde ou aminé. Si le linker doit réagir avec un groupe hydroxyle carboxyle ou aldéhyde, R2 est de préférence un groupe aminé ou un résidu le portant, par exemple un groupe hydrazide Le., NH₂-NH-CO-. Si le linker doit réagir avec un groupe aminé, R2 est de préférence un groupe carboxyl, succinimidyl (e.g., N- hydroxy succinimidyl) ou sulfosuccinimidyl (e.g., N-hydroxy sulfosuccinimidyl).

Ainsi, des composés pouvant être utilisés comme linker peuvent être choisis parmi l'acide adipique dihydrazide (ADH) ; le sulfosuccinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio] propionamido)-hexanoate (Sulfo-LC-SPDP) ; le succinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio] propionamido)-hexanoate (LC-SPDP) ; le N-succinimidyl-S-acetyl thioacetate (SATA) ; le N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl dithio) propionate (SPDP), succinimidyl acetyl thiopiopionate (SATP) ; le succinimidyl-4-(N-maleimido methyl) cyclohexane-1- carboxylate (SMCC) ; le maleimido benzoyl-N-hydroxy succinimide ester (MBS) ; le N- succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB) ; le succinimidyl 4-(p- maleimidophenyl) butyrate (SMPB) ; le bromoacétique acide -N-hydroxy succinimide (BANS) ester ; le dithiobis (succinimidyl propionate) (DTSSP) ; le H-(γ-maléimido butyryloxy) succinimide ester (GMBS) ; le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate ; le N-succinimidyl-4-(4-maléimidophényl) butyrate ; le N- [β-maleimidocaproic acid] hydrazide (BMCH) ; le N-succinimidyl-4-maléimido- butyrate ; et le N-succinimidyl-3-maléiimido-benzoate. A titre d'exemple, on propose d'utiliser la fonction acide du KDO pour dériver le LOS avec de l'ADH en présence d'un carbodiimide [e.g., 3-diméthylaminopropyl)-3-ethyle carbodiimide hydrochloride (EDAC)]. Puis on fait réagir la fonction aminé ainsi introduite avec les fonctions carboxyles du polypeptide, en présence d'EDAC, après avoir protégé les fonctions aminés de ce dernier (Wu et al (2005) Vaccine 23 : 5177) ou les avoir transformées en fonctions acide (Succinylation de la protéine ; Pavliakova et al, Infect. Immun. (1999) 67 (10) : 5526).

De manière alternative, on propose d'utiliser la fonction acide du KDO pour dériver le LOS avec de la cystéamine ou de la cystéine en présence d'EDAC. Puis on fait réagir la fonction thiol ainsi introduite avec la fonction maléimide d'un linker homobifonctionnel, tel que le bis maleimido hexane ; ou hétérobifonctionnel, tel que le GMBS. Dans le premier cas, on fait alors réagir la fonction maléimide ainsi introduite avec les fonctions thiols du polypeptide. Dans le deuxième cas, on fait réagir la fonction succinimidyle du LOS dérivé et activé avec les fonctions aminés du polypeptide.

En fonction du mode de conjugaison retenu, le LOS et le polypeptide peuvent être conjugués l'un à l'autre dans un rapport molaire LOS : polypeptide de 10^"1 à 10², de manière avantageuse de 1 à 10², de préférence de 1 à 50 ; de manière tout particulièrement préférée de 20 environ.

La TbpB de N. meningitidis La TbpB de N meningitidis telle que naturellement produite par N. meningitidis, est une lipoprotéine. Néanmoins, elle peut être avantageusement produite par voie recombinante dans un système d'expression qui permet notamment d'assurer la lipidation du polypeptide au sein même de l'organisme chargé de l'expression. Selon un mode préféré, la TbpB lipidée est une TbpB recombinante - c'est-à-dire produit par voie recombinante, e.g. dans un système d'expression hétérologue. Un système d'expression met typiquement en œuvre une cassette d'expression et une cellule hôte procaryote ou eucaryote (levure). La cassette d'expression code pour un précurseur de la TbpB (aussi appelé pro-TbpB). Ce précurseur est constitué d'une séquence signal caractéristique d'une lipoprotéine et de la séquence de la protéine mature ayant un résidu Cystéine en position N-terminale. Les trois acides aminés en position C-terminale de la séquence signal ainsi que le résidu Cystéine en position N- terminale de la séquence mature constitue le site de clivage (aussi appelé lipobox) : Cette lipobox a typiquement pour séquence : Leu - Ser/Ala - Ala/Gly - Cys. Une séquence signal typique est celle de la lipoprotéine Lpp d'E. coli : Met - Lys - AIa - Thr - Lys - Leu - Val - Leu - GIy - AIa - Val - Ile - Leu - GIy - Ser - Thr - Leu - Leu - AIa - GIy. Ainsi, dans la cassette d'expression, la séquence de polynucléotide codant pour la séquence d'acides aminés de la TbpB est fusionnée en 5' à une séquence signal appropriée.

La TbpB de N. meningitidis est comme toute protéine, définie par une séquence d'acides aminés. A l'intérieur de l'espèce, cette séquence d'acides aminés peut présenter un certain degré de variabilité sans que cela porte atteinte à la fonction biologique de la lipoprotéine. On parle alors de « variant allélique ». A une TbpB de N. meningitidis, correspondent une multiplicité de séquences présentant entre elles un certain degré d'identité, chacune des séquences provenant d'une souche particulière, l'une étant le variant allélique de l'autre.

Ainsi, on comprendra aisément que la présente invention ne se limite pas à l'emploi d'une TbpB particulière, définie par une séquence d'acides aminés particulière. Toute référence à une séquence d'acides aminés est faite à titre illustratif, non-limitatif.

La présente invention ne se limite pas non plus à une TbpB lipidée de forme sauvage. En effet, il peut s'agir non seulement d'une forme sauvage, mais aussi d'une forme mutée par addition, substitution ou délétion d'un ou plusieurs acides aminés.

Pour usage dans la présente invention, un fragment lipide de la TbpB de N. meningitidis, est avantageusement le fragment N-terminal lipide de la TbpB. La partie « polypeptide » du fragment peut avantageusement comporter un ou des épitopes T-helper - c'est-à-dire des épitopes capables d'être reconnus par les cellules-T helper - et de les activer. Avantageusement, il s'agit d'épitopes T-helper caractéristiques de l'organisme auquel le vaccin à base de LOS est destiné (un mammifère, notamment un humain) - c'est-à-dire d'épitopes capables d'être reconnus par les cellules-T helper de l'organisme receveur et de les activer.

Le cadre de lecture ouvert (ORF) codant pour la TbpB (tbpB) de plusieurs souches de N. meningitidis a déjà été identifié par sa séquence ; et la séquence d'acides aminés de la protéine correspondante déduite. Ainsi les séquences tbpB et TbpB des souches de N. meningitidis de serogroupe B, M982 et B16B6, sont divulguées dans la demande de brevet EP 586 266. Celles des souches de méningoccoque MC58 (serogroupe B), Z2491

(serogroupe A) et FAMl 8 (serogroupe C) sont respectivement divulguées dans Tettelin et al, Science, March 2000, 287 : 1809 ou WO 00/66791; Parkhill et al, Nature (March 2000) 404 : 502 ; et Bentley et al, PLoS Genêt., 3, e23 (2007).

L'identification de ces dernières séquences ayant été faite dans le cadre du séquençage complet des génomes, un numéro d'ordre leur a été attribué. Ainsi, dans Tettelin et al (supra) ou WO 00/66791, les séquences tpbB I TbpB de la souche MC58 sont désignées sous la référence NMB 0460. Dans la suite du texte, on pourra désigner les protéines de N. meningitidis sans que cela fasse référence de manière limitative aux séquences de la souche MC58.

Chez N. meningitidis, on a documenté à ce jour deux grandes familles de TbpB : l'isotype I caractérisé par un gène tbpB de 1.8 kb et l'isotype II caractérisé par un gène tbpB de 2.1 kb (EP 560 969 et EP 586 266). L'isotype I s'exprime dans le complexe clonal ST-I l et le II dans les complexes clonaux ST-8, ST-18, ST-32, ST-41/44 (Harrison et al, BMC Microbiol. 2008, 8 : 66). Les souches B16B6 (serogroupe B) et FAMl 8 (serogroupe C) sont des représentants de l'isotype I ; les souches M982, BZ83 et 8680 sont des représentants de l'isotype IL

Pour usage aux fins de la présente invention, la TbpB lipidée est celle d'une souche de N. meningitidis d'isotype I ou d'isotype II, de préférence d'isotype II. Selon une mise en œuvre particulière, une composition selon l'invention comprend la TbpB lipidée d'une souche d'isotype I et d'une souche d'isotype IL La TbpB lipidée d'une souche de N. meningitidis d'isotype I peut être celle de la souche B16B6 ; et la TbpB lipidée d'une souche de N. meningitidis d'isotype II peut être celle de la souche M982. En raison de sa queue lipidique, on s'attend à ce que, sous forme purifiée, la TbpB lipidée et purifiée présente un certain degré d'insolubilité en condition purement aqueuse. En conséquence, il convient de la placer dans des conditions favorisant sa solubilité. L'homme de l'art maîtrise les techniques visant à rendre soluble une lipoprotéine. Il est par exemple possible d'utiliser un détergent lors de la purification de la lipoprotéine, afin d'obtenir une préparation d'une lipoprotéine purifié soluble en présence de détergent. La quantité de détergent restant dans la préparation finale sera contrôlée de manière à ce qu'elle soit juste nécessaire au maintien sous forme soluble, de la lipoprotéine purifiée. De manière alternative, il est possible d'enlever complètement le détergent utilisé lors de la purification puis de rajouter un autre produit ayant aussi la capacité de maintenir sous forme soluble, la lipoprotéine purifiée.

Lorsque le LOS est formulé en liposomes, la ou les TbpBs peuvent être incorporées avec le LOS en liposomes ou bien être en simple mélange avec des liposomes LOS (LOS formulé en liposomes : ce dernier mode de réalisation étant toutefois préféré.

Lorsque l'on incorpore ensemble en liposomes (protéoliposomes) le LOS et la TbpB lipidée, les liposomes utiles à cette fin sont les mêmes que ceux précédemment décrits pour la formulation du seul LOS. Un moyen de mener à bien cette formulation consiste à formuler ensemble en liposomes, le LOS et la TbpB lipidée, par exemple en reconstituant un film lipidique en milieu aqueux en présence de LOS et de TbpB lipidée, notamment dans : un rapport molaire lipides : LOS de 100 à 500, de manière avantageuse de 100 à 400 ; de préférence de 200 à 300 ; de manière tout particulièrement préférée, de 250 environ ; et / ou un rapport molaire LOS : TbpB lipidée de 10^'2 à 10³, de manière avantageuse de 10^"1 à 10² ; de préférence de 1 à 50 ; de manière tout particulièrement préférée, de 15 à 30, e.g., de 20 environ.

A l'issue de l'incorporation en liposomes, du LOS et de la TbpB lipidée, on peut communément obtenir un mélange constitué de liposomes adhoc (protéoliposomes), de

LOS et/ou de TbpB lipidée sous forme libre. Avantageusement, les liposomes sont alors purifiés afin de se débarrasser du LOS sous forme libre. Une fois le LOS libre éliminé, on peut utiliser le mélange tel quel à des fins vaccinales ou bien les liposomes peuvent être purifiés plus encore afin de se débarrasser de la Tbpb lipidée libre. Une fois les liposomes complètement purifiés, on peut prévoir de rajouter de la Tbpb lipidée libre, notamment en quantité définie.

***** Une composition vaccinale / pharmaceutique selon l'invention est notamment utile pour traiter ou prévenir une infection à N. meningitidis, telles que les méningites à N. meningitidis, les méningococcémies et les complications qui peuvent en dériver telles que le purpura fulminans et le choc septique ; ainsi que les arthrites et péricardites à N. meningitidis.

Elle peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité efficace d'un point de vue thérapeutique ou prophylactique des constituants essentiels du vaccin, LOS et TbpB, à un support ou à un diluant acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Avantageusement, elle peut en outre comprendre un adjuvant acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Pour usage dans une composition selon l'invention, le (les) LOS est (sont) avantageusement formulé(s) en liposomes.

Les quantités de LOS et de rTbpB par dose de vaccin qui sont efficaces d'un point de vue immunogène, prophylactique ou thérapeutique, dépendent de certains paramètres incluant l'individu traité (adulte, adolescent, enfant ou nourrisson), la voie d'administration et de sa fréquence.

Ainsi, la quantité de LOS par dose peut être comprise entre 5 et 500 μg, avantageusement entre 10 et 200 μg, de préférence entre 20 et 100 μg, de manière tout à fait préférée entre 20 et 80 μg ou entre 20 et 60 μg, bornes incluses. La quantité de TbpB lipidée par dose peut être comprise entre 5 et 500 μg, avantageusement entre 10 et 200 μg, de préférence entre 20 et 100 μg, de manière tout à fait préférée entre 20 et 80 μg ou entre 20 et 60 μg, bornes incluses.

Dans le vaccin selon l'invention, le rapport molaire LOS : TbpB lipidée est de 10^" à 10 , de manière avantageuse de 10^"1 à 10² ; de préférence de 1 à 50 ; de manière tout particulièrement préférée, de 15 à 30 ou de 20 environ. A titre d'exemple, on indique que le rapport molaire LOS : TbpB lipidée peut être typiquement de 20 ou de 25 environ, selon que l 'isotype de la TbpB est I ou IL

Le terme « dose » employé ci-dessus doit être entendu comme désignant un volume de vaccin administré à un individu en une seule fois - c'est-à-dire à un temps T. Des doses conventionnelles sont de l'ordre du millilitre, par exemple 0.5, 1 ou 1.5 ml ; le choix définitif dépendant de certains paramètres et notamment de l'âge et du statut du receveur. Un individu peut recevoir une dose répartie en plusieurs sites d'injection le même jour. La dose peut être unique ou si nécessaire, l'individu peut aussi recevoir plusieurs doses à un certain délai d'intervalle - délai d'intervalle pouvant être déterminé par l'homme de l'art. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine de l'art, e.g. dans le domaine des vaccins, notamment par voie entérale ou parentérale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée avec un certain délai d'intervalle. La voie d'administration varie en fonction de divers paramètres par exemple de l'individu traité (condition, âge, etc.). Enfin l'invention a également pour objet :

Une méthode pour induire chez un mammifère, par exemple un humain, une réponse immune à rencontre de N. meningitidis, selon laquelle on administre au mammifère une quantité efficace d'un point de vue immunogénique d'une composition selon l'invention pour induire une réponse immune, en particulier une réponse immune protectrice à l 'encontre de N. meningitidis ; et

Une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection induite par JV. meningitidis, selon laquelle on administre une quantité efficace d'un point de vue prophylactique ou thérapeutique d'une composition selon l'invention à un individu ayant besoin d'un tel traitement.

DONNEES EXPERIMENTALES

A Données expérimentales relatives aux souches dérivées de JV. meningitidis C708

1. Matériel & Méthodes 1.1 Transformation de la souche C708

La souche C708 est cultivée en milieu agar BHI (Brain Heart Infusion) à 37°C sous une atmosphère à 10 % CO₂. La nappe bactérienne est récoltée en milieu liquide BHI complémenté en MgCl₂ 5 mM pour obtenir une suspension bactérienne à 10⁹ cfu/mL (cfu : colony-forming-unit ou colonie formant unité). A 900 μL du milieu liquide BHI + MgCl₂5 mM, on ajoute 10 μg d'ADN nécessaire à la transformation (plasmide linéarisé) ; puis 100 μl de la suspension bactérienne (10⁸ germes). Le milieu de transformation est incubé 30 min à 37°C, 10 % CO₂.

Cinq cent μL de cette préparation (soit environ 5.10⁷ cfu) servent à ensemencer 4,5 mL de BHI + MgCl₂ 5 mM. On laisse les bactéries se régénérer 2 hrs à 37°C, 10 % CO₂. Puis, à partir de cette suspension, on réalise des dilutions en BHI + MgCl₂ 5 mM. 300 μL d'une dilution contenant environ 30 000 cfu sont étalés sur boîte BHI agar 140 mm. Les boîtes sont placées à 37°C, 10 % CO₂ pendant au moins 20 hrs.

1.2. Buvardage des colonies de transformants Les colonies sont transférées sur membrane Hybond-XL 137 mm (GE Healthcare; #RPN 137S ). Les germes déposés sur membrane sont lysés en tampon de dénaturation (NaOH 0.5 M, NaCl 1,5 M). Les membranes sont lavées en tampon de neutralisation (Tris 0,5 M, NaCl 1,5 M, pH 7.5) ; transférées en milieu SSC 2X ; puis séchées. L'ADN est fixé par incubation 2 hrs à 80°C. 1.3. Détection des transformants par hybridation avec une sonde marquée au ³³P dCTP

Le marquage de la sonde est obtenu par amplification PCR en utilisant le kit Ready-to- Go PCR Beads (GE Healthcare) ; puis la sonde marquée est purifiée sur colonne ProbeQuant G50 Microcolumn (GE Healthcare). Les membranes à hybrider sont placées par trois dans 50 ml de tampon Rapid Hyb (GE Healthcare), 15 min à 65°C, sous agitation lente, pour pré-hybridation. La sonde marquée et dénaturée au préalable 2 min à 95⁰C, est ajoutée aux membranes. En final, la concentration de la sonde est de 5 ng/ml. On laisse l'hybridation se poursuivre 2 hrs à 65°C, sous agitation lente. Les membranes sont ensuite soumises à des lavages successifs en procédant comme suit :

En tampon de faible stringence (2 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 15 min à température ambiante sous agitation lente ;

En tampon de moyenne stringence (1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 20 min à 65°C sous agitation lente ; et En tampon de faible stringence (0.1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 45 min à 65 °C sous agitation lente.

Une fois séchées, les membranes sont révélées par autoradiographie (film Biomax MR).

1.4. Détection des transformants par hybridation avec un oligonucléotide marqué au [γ³²P] ATP

On réalise le marquage de l'extrémité 5' de Poligonucléotide dans le milieu réactionnel suivant (les quantités indiquées sont celles correspondant à l'hybridation d'une quantité d'oligonucléotide nécessaire à l'hybridation de 3 membranes dans une boîte) :

Oligonucléotide 5'-OH libre 3 μl maxi soit lO pmoles

Tampon de phosphorylation 10 X l μl soit 1 X

[γ-³²P] ATP 10 mCi/ml 5 μl soit 50 μCi

T4 kinase (10 U/μl) l μl soit 10 U

H₂O qsp 10 μl

Le milieu réactionnel est incubé 30 min à 37⁰C. Puis la T4 kinase est inactivée par chauffage 10 min à 70⁰C.

Les membranes à hybrider sont placées par trois dans 60 mL de tampon Rapid Hyb (GE Healthcare), 15 min à 48°C, sous agitation lente, pour pré-hybridation. Le tampon de pré-hybridation est éliminé, remplacé par 50 mL du tampon d'hybridation suivant : 5 X SSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5 % de SDS (poids/vol.) et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 10 mg/ml soniqué et dénaturé 5 min à 100⁰C.

L'oligonucléotide marqué (10 μl) est ajouté aux membranes. On laisse l'hybridation se poursuivre une nuit à une température inférieure de 5°C au Tm de l'oligonucléotide, sous agitation lente.

Les membranes sont ensuite soumises à des lavages successifs en procédant dans l'ordre comme suit :

En tampon de faible stringence (2 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 5 min à

Tm de l'oligonucléotide - 5°C, sous agitation lente ;

En tampon de moyenne stringence (1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 15 min à Tm de l'oligonucléotide - 5°C, sous agitation lente ; et - En tampon de faible stringence (0.1 X SSC, 0.1 % SDS (poids / vol) 10 min à

Tm de l'oligonucléotide - 5°C, sous agitation lente. Une fois séchées, les membranes sont révélées par autoradiographie (film Biomax MR).

2. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont la chaîne α est celle d'un LOS d'immunotype L6 et comportant dans chacune des positions O3 et O6 du résidu heptose II (hep II) du core interne, un substituant phosphoéthanolamine (PEA)

On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 de sérogroupe A et d'immunotype L6 possédant entre autres les caractéristiques suivantes :

Un gène igtA actif (gène allumé « ON ») ;

Un gène igtB - (gène non fonctionnel) ; - Un gène igtG éteint (« OFF ») ;

Un gène Ipû tronqué ;

Un gène Iptβ actif ; et

Un gène loû actif.

La souche C708 a été déposée le 11 mars 2008, auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganisme, 25 rue du Dr Roux 75015 Paris, selon les termes du traité de Budapest. Cette souche porte le numéro d'ordre CNCM 1-3942.

La souche C708 comporte un gène Ipû tronqué. Pour la modifier de telle sorte que le LOS soit porteur d'un substituant PEA en position 03, on choisit de remplacer par recombinaison homologue, le gène Ipû tronqué par le gène Ipû complet (full-length) de la souche de N. meningitidis FAMl 8 sérogroupeC (souche mise à disposition dans les laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale). La souche qui en résulte sera dénommée plus commodément C708 Ipû FL.

2.1. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène Ipt3 complet (FL = full-length) de la souche de N. meningitidis FAM18 Cent ng d'ADN génomique de la souche FAMl 8 ont été utilisés pour amplification avec la Platinum® Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).

Le couple d'amorces est le suivant (couple n°l) :

CG GAATTC GCC GTC TCA A ATG AAA AAA TCC CTT TTC GTT CTC (Tm = 55,9°C) ; et AA CTGCAG TCA TTG CGG ATA AAC ATA TTC CG (Tm = 57,1⁰C). (sont respectivement soulignés les sites EcoRÏ et Ps tî). Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :

Composant Volume Concentration finale

Tampon 1 OX High Fidelity PCR 5 μl IX

Mélange 10 mM dNTP 1 μl 0.2 mM de chaque MgSO₄ 5O mM 2 μl 2 mM

Mélange d'amorces (10 μM chacune) 1 μl 0.2 μM de chaque

ADN génomique x μl 100 ng

Platinum® Taq High Fidelity 0.2 μl 1.0 unit Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl final Ne s'applique pas Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94⁰C pendant 30 secondes

30 cycles de : Dénaturation : 94°C pendant 30 secondes Hybridation : 55°C pendant 30 secondes Extension : 68°C pendant 1 minute / kb de produit PCR. Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification. 2.2. Construction d'un vecteur de transformation

Le produit PCR d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont été soumis à une double digestion par EcoRI et PstI pendant 2 hrs à 37°C. On a utilisé 10 unités de chaque enzyme par μg d'ADN dans le tampon RΕact2 (Invitrogen). Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC19 linéarisé. Les ligations ont été réalisées sous un volume final de 20 μl avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) et 1 μl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16°C. La ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65⁰C.

Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d'électroporation dans une souche d'E. coli XLl blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro compétentes. Les paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants : Capacitance : 500 μFD ; Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.

La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB ampicilline

100 μg/ml. L'authentification de 10 des 50 clones positifs a été réalisée par amplification PCR. 100 % des clones présentaient le profil attendu. Finalement, le gène lpt2 dans un plasmide d'un de ces clones (plasmide pM1222) a été vérifié par séquençage.

2.3. Transformation de la souche C708 et détection de l'événement de recombinaison homologue 2.3.1. Transformation

40 μg de pM1222 ont été digérés par 400 U d'EcoRI et 10 μg ont été utilisés pour transformer la souche C708 selon la méthode décrite dans la section A.1.1.

Après transformation, les bactéries ont été étalées sur 17 boîtes de Pétri de 140 mm à une concentration théorique de 30 000 cfu par boîte ; soit 510 000 cfu (colonies- forming-units), puis ont été placées une nuit à 37°C. Les boîtes ont ensuite été placées 30 min à +4°C.

Après 24 heures à 37°C, la numération des boîtes contrôle a permis d'estimer le nombre de cfu à 27 000 par boîte pour le mutant.

2.3.2. Sélection des clones L'événement de recombinaison, c'est-à-dire le remplacement du gène lpt2 TR (tronqué) par le gène Ipt3 FL (complet), a été détecté après transfert des clones sur membrane d'hybridation et hybridation avec une sonde marquée au ³P dCTP selon les méthodes décrites dans les sections A.1.2. et A.1.3.

La sélection des clones positifs s'est faite par hybridation de l' ADN fixé sur les membranes avec une sonde ADN marquée au ³³P dCTP correspondant à la partie tronquée du gène Ipt3, donc présente uniquement chez les clones recombinants.

Préparation de la sonde

Afin d'obtenir la sonde lpt2 de 270 pb, 10 ng du plasmide pUC/^të ont été utilisés pour amplification par PCR avec la Platinum® Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).

Le couple d'amorces est le suivant (couple n°2) :

CGC CGA ATA CTT TAT CTT GAG GC (Tm = 60,6°C) ; et

CTC GCC AAA GAG CAG GGC (Tm - 60,5⁰C).

Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé : Composants Volume Concentration finale Tampon 10X High Fidelity PCR 5 μl IX

Mélange 10 mM dNTP 1 μl 0.2 mM de chaque

MgSO₄ 50 mM 2 μl 2 mM

Mélange d'amorces (10 μM chacune) 1 μl 0.2 μM de chaque Plasmide pUC x μl 100 ng

Platinum® Taq High Fidelity 0.2 μl 1.0 unit Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl final Ne s'applique pas

Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94⁰C pendant 30 secondes 30 cycles de : Dénaturation : 94°C pendant 30 secondes

Hybridation : 55°C pendant 30 secondes Extension : 68⁰C pendant 45 secondes.

Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour s'assurer de la spécificité de Pamplicon, puis le fragment PCR a été purifié en utilisant le kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, #28104).

Hybridation et révélation

Les étapes de marquage de la sonde, d'hybridation, de lavages et de révélation ont été réalisées selon ce qui est décrit dans la section A.l .3.

Environ 460 000 cfu ont été testées. Après mise en exposition avec les films BioMax MR, les autoradiographies ont révélé 5 spots positifs (C708 contenant un gène Ipβ FL) chacun sur une membrane différente.

Criblage et authentification des clones positifs

Après repérage sur la boîte de Pétri, une partie de la zone prélevée autour des clones positifs a été conservée en milieu de congélation (milieu Ml 99, sérum de veau fœtal 20 %, glycérol 10 %) et l'autre partie a été utilisée pour l' authentification par PCR.

Pour ce faire, chacun des prélèvements a d'abord été repris par 80 μl de bouillon BHI, de façon à étaler 30 μl de cette suspension, en mini nappe sur une boîte BHI.

Le volume restant a été centrifugé 5 min à 6000 rpm, puis le culot a été repris par 50 μl d'eau dépourvue de nucléase. Les germes ont été lysés 5 min à 95°C et le surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation. Pour chaque prélèvement correspondant à un spot positif ainsi que les témoins, une amplification PCR avec le couple d'amorces ayant servi à l'amplification de la sonde C708 iptZ de 270 pb (couple n°2) a été réalisée avec le kit Expand Long Template PCR (Roche) comme décrit ci-dessous. Composants Volume Concentration Finale

Tampon 1OX ELT PCR 5 μl IX

Mélange de dNTP (10 mM de chaque) 2 μl 0.4 mM de chaque

Mélange d'amorces (10 μM de chaque) 1,5 μl 0.3 μM de chaque

Matrice d'ADN 40 μl Ne s'applique pas Polymerase ELT 0.75 μl 3.75 unités

Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl Ne s'applique pas

Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94⁰C pendant 2 min

10 cycles de : Dénaturation : 94°C pendant 10 secondes Hybridation : 54°C pendant 30 secondes

Extension : 68⁰C pendant 45 secondes

20 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 15 secondes

Hybridation : 54°C pendant 30 secondes

Extension : 68°C pendant 45 secondes + 20 sec/cycle Elongation finale : 68°C pendant 7 min

Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification. Quatre des 5 clones présentaient le profil attendu. La fréquence d'obtention d'un clone positif vrai était de 1/ 115 000 cru testées.

L'étape suivante a consisté à isoler un clone pur. Pour cela, un des clones positifs hétérogènes a été étalé en cfu isolées et plusieurs de ces cfu (40) ont été analysées en PCR, avec les couples d'amorces 1 ou 2.

Chaque cfu a été resuspendue dans 100 μl d'eau dépourvue de nucléase, 30 μl ont été déposés sur une boîte BHI et les 70 μl restant ont été lysés 5 min à 95°C et le surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation. Les PCR ont été réalisées avec la Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) comme déjà décrit pour l'amplification de la sonde lpt1. La température d'hybridation était de 54°C. Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification. Cinq des 40 clones se sont révélés être des clones purs.

La mini nappe des clones purs a été reprise en milieu de congélation, aliquotée sous 100 μl et conservée à -70⁰C. La pureté et l'identité de ce congelât ont été validées. 3. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont la chaîne α est celle d'un LOS d'immunotype L6 et comportant uniquement en position O3 du résidu heptose II (hep II) du core interne, un substituant phosphoéthanolamine (PEA)

On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 lpt2) FL obtenue comme précédemment décrit. L'objectif est d'inactiver le gène Iptβ de cette souche par délétion d'une partie centrale du gène.

3.1. Amplification par FCR (polymerase chain reaction) du gène Ipt6 complet (full-length) de la souche de N. meningitidis Z2491 de sérogroupe A (gène NMA 0408) Cent ng d'ADN génomique de la souche Z2491 (souche mise à disposition dans les laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale) ont été utilisés pour amplification avec la Platinum® Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).

Le couple d'amorces est le suivant (couple n°3) :

CG GAATTC GCC GTC TCA A GGT TGC CTA TGT TTT CCT GTT TTT G (Tm = 59,7⁰C) ; et

AA CTGCAG CTA ACG GGC AAT TTT CAA AAC GTC (Tm = 59,3°C). (sont respectivement soulignés les sites EcoRI et Pstï).

Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :

Composants Volume Concentration finale Tampon 10X High Fidelity PCR 5 μl IX

Mélange 10 mM dNTP 1 μl 0.2 mM de chaque

MgSO₄ 50 mM 2 μl 2 mM

Mélange d'amorces (10 μM chacune) 1 μl 0.2 μM de chaque

ADN génomique x μl 100 ng Platinum® Taq High Fidelity 0.2 μl 1.0 unit

Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl final Ne s'applique pas Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94°C pendant 30 secondes

30 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 30 secondes Hybridation : 55⁰C pendant 30 secondes Extension : 68°C pendant 1 minute / kb de produit PCR.

Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification.

3.2. Construction du vecteur pM1223 (pUC19 Iptβ FL)

Le produit PCR d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont été soumis à une double digestion par EcoRI et PstI pendant 2 hrs à 37°C. On a utilisé 10 unités de chaque enzyme par μg d'ADN dans le tampon RΕact2 (Invitrogen).

Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC19 linéarisé. Les ligations ont été réalisées sous un volume final de 20 μl avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) et 1 μl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16°C. La ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65°C. Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d'électroporation dans une souche d'E. coli XLl blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro compétente. Les paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants : Capacitance : 500 μFD ; Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.

La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB ampicilline 100 μg/ml. L'authentification des clones positifs (présence d'un gène Iptβ FL) a été réalisée par digestion enzymatique Ndel après extraction de l' ADN par miniprep. Sur 20 clones analysés, 6 présentaient le profil attendu. Le plasmide recombinant du clone sélectionné a été nommé pM1223.

3.3. Délétion de la partie centrale du gène Iptβ provenant de la souche Z2491 Construction d'un vecteur de transformation

Avec le kit Εxpand Long Template PCR (Roche), on a réalisé une PCR inverse à partir du plasmide pM1223 à l'aide du couple d'amorces suivant (couple n°4) : CG GGATCC CAT CGA CAC GAA CGC CGC (Tm = 60,5); et CG GGATCC CCG CGC TTA ACG ACT ACA TC (Tm ≈ 59,4) ; (sont soulignés les sites BamRÏ). Ceci permet de réamplifier le plasmide en délétant la partie que l'on souhaite retirer (808 bp).

Pour amplification le mélange suivant a été réalisé : Composants Volume Concentration Finale

Tampon 1 OX ELT PCR 5 μl IX

Mélange de dNTP (1O mM de chaque) 2 μl 0.4 mM de chaque Mélange d'amorces (10 μM de chaque) 1,5 μl 0.3 μM de chaque Matrice d'ADN (pM1223) 40 μl Ne s'applique pas

Polymérase ELT 0.75 μl 3.75 unités

Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl Ne s'applique pas

Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94⁰C pendant 2 min

10 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 10 secondes Hybridation : 54°C pendant 30 secondes Extension : 68⁰C pendant 3 min

20 cycles de : Dénaturation : 94°C pendant 15 secondes Hybridation : 54°C pendant 30 secondes Extension : 68°C pendant 3 min + 20 sec/cycle

Elongation finale : 68⁰C pendant 7 min

Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose.

Après purification sur colonne QiaQuick, le produit PCR a été digéré par BamHI à raison de 10 U d'enzyme par μg d'ADN. Une fois digéré, il a été purifié par électroélution puis extraction phénol-chloroforme.

La ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée sous un volume final de 20 μl avec 0,5 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) et 1 μl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16°C. La ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65⁰C.

La dernière étape a consisté à transférer le vecteur ainsi ligué dans une souche d'Escherichia coli comme décrit pour le pM1222. L'authentification de clones positifs a été réalisée par digestion enzymatique Ndel-Pstl après extraction de l'ADN par miniprep. Sur les 4 clones analysés 100 % présentent le profil attendu. Le plasmide recombinant du clone positif sélectionné a été renommé pM1224 et ce clone a été conservé en glycérol à -7O⁰C. La présence dans le plasmide pM1224 d'un gène Igtô délété de sa partie centrale a été vérifiée par séquençage.

3.4. Transformation de la souche C708 lpt2 FL et détection de l'événement de recombinaison homologue

Transformation

Dix μg de plasmide pM1224 ont été linéarisés par EcoRl à raison de 10 unités d'enzyme par μg de plasmide à digérer dans le tampon approprié pendant 2 heures à 37°C.

La transformation dans la souche C708 a été faite en suivant la technique décrite dans la section A.1.1.

Après transformation, les bactéries ont été étalées sur 16 boîtes de Pétri de 140 mm à une concentration théorique de 50 000 cfu par boîte ; soit 800 000 cfu. Les boîtes ont été placées une nuit à 37°C puis ensuite été placées 30 min à +4°C.

Sélection des clones : Préparation de la sonde, hybridation et révélation L'événement de recombinaison a été détecté après colony blot et hybridation avec un oligonucléotide marquée au γ³²P dATP.

L'événement de recombinaison, c'est-à-dire le remplacement du gène Iptβ FL par le gène Iptβ TR, a été détecté après transfert des clones sur membrane et hybridation avec une sonde marquée selon les méthodes décrites dans les sections A.1.2. et A.1.4. Les clones transférés sur membranes sont soumis à des étapes de lyse et de lavage. L' ADN est fixé sur les membranes en plaçant ces dernières 2 heures à 80°C.

La sélection des clones positifs s'est faite par hybridation de l'ADN fixé sur membranes Hybond N+ avec un oligonucléotide radioactif dont la séquence est chevauchante sur les deux extrémités recombigéniques. Il s'agit de l' oligonucléotide suivant : GTC GAT GGG ATC CCC GCG CTT AAC G (Tm = 69.5°C).

Environ 840 000 cfu ont été testées. Après mise en exposition avec les films BioMax MR, les autoradiographies ont révélé 16 spots positifs (C708 contenant un gène Iptβ TR) répartis sur 9 membranes différentes.

Criblage et authentification des clones positifs Pour chacun des 16 spots positifs, après repérage sur la boîte de Pétri, une partie de la zone prélevée autour des clones positifs a été conservée en milieu de congélation (Ml 99, SVF 20 %, glycérol 10 %) et l'autre partie a été utilisée pour l'authentification par PCR.

Pour ce faire les prélèvements ont d'abord été repris par 80 μl de bouillon BHI, de façon à étaler, en mini nappe sur une boîte BHI, 30 μl de chaque suspension.

Le volume restant a été centrifugé 5 min à 6000 rpm, puis le culot a été repris par 50 μl d'eau dépourvue de nucléase. Les germes ont été lysés 5 min à 95°C et le surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation.

Pour chaque prélèvement correspondant à un spot positif, une amplification PCR a été réalisée avec la Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) et le couple d'amorces suivant

(couple n°5)

CCG ACT GGC GGA ATT GGG (TM ≈ 60,5⁰C) ; et

CCCATTTCTTCC TGA CGG AC (Tm≈ 59,4⁰C).

Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé : Composants Volume Concentration finale

Tampon 1 OX High Fidelity PCR 5 μl IX

Mélange 10 mM dNTP 1 μl 0.2 mM de chaque

MgSO4 50 mM 2 μl 2 mM

Mélange d'amorces (10 μM chacune) 1 μl 0.2 μM de chaque Matrice d'ADN x μl 100 ng

Platinum® Taq High Fidelity 0.2 μl 1.0 unit

Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl final Ne s'applique pas

Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94⁰C pendant 1 min

30 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 30 secondes Hybridation : 55°C pendant 30 secondes Extension : 68⁰C pendant 50 secondes.

Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose, pour vérification. Deux candidats sur 16 se sont révélés être de vrais positifs : soit une fréquence d'obtention d'un clone positif vrai pour 425 000 cfu testées. L'étape suivante a consisté à isoler un clone pur. Pour cela, un des 2 clones positifs hétérogènes a été étalé en cfu isolées et plusieurs de ces cfu (24) ont été analysées en PCR, avec le couple d'amorces n°5.

Chaque cfu a été resuspendue dans 50 μl d'eau dépourvue de nucléase, 20 μl ont été déposés sur une boîte BHI et les 30 μl restant ont été lysés 5 min à 95°C et le surnageant, qui sert de matrice à la réaction PCR, a été prélevé après centrifugation.

Les PCR ont été réalisées avec la Platinum® Taq High Fidelity (Invitrogen) comme déjà décrit pour le criblage des prélèvements des spots positifs.

Après la réaction, 1/5 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification. Seul un clone sur 24 s'est révélé être un positif vrai.

La mini nappe du clone positif pur a été reprise en milieu de congélation, aliquotée sous 100 μl et conservée à -7O⁰C. La pureté et identité de ce congelât ont été validées.

4. Construction d'une souche de N. meningitidis exprimant un LOS dont Ia chaîne α est celle d'un LOS d'immunotype L8 et comportant uniquement en position O3 du résidu heptose II (hep II) du core interne, un substituant phosphoéthanolamine (PEA)

On utilise pour souche de départ, la souche de N. meningitidis C708 lpt2) FL Iptβ TR obtenue comme précédemment décrit dans la section A.3. L'objectif est d'inactiver le gène igtA de cette souche par délétion d'une partie centrale du gène. 4.1. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène lgt A complet (full-length) de la souche de iV. meningitidis MC58 de sérogroupe B (gène NMB 1929)

Cent ng d'ADN génomique de la souche MC58 (souche mise à disposition dans les laboratoires de recherche, à l'échelle mondiale) ont été utilisés pour amplification avec la Platinum® Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen, #11304-011).

Le couple d'amorces est le suivant :

CG GAATTC GCC GTCTCAAATG CCGTCT GAA GCC TTCAG(Tm= 59,4°C) ; et

AA CTGCAG AAC GGT TTT TCA GCA ATC GGT GC (Tm = 60,6°C). (sont respectivement soulignés les sites EcoRI et Pstl). Pour amplification le mélange suivant a été réalisé :

Composants Volume Concentration finale

Tampon 1 OX High Fidelity PCR 5 μl IX

Mélange 10 mM dNTP 1 μl 0.2 mM de chaque MgSO₄ 5O mM 2 μl 2 mM

Mélange d'amorces (10 μM chacune) 1 μl 0.2 μM de chaque

ADN génomique x μl 100 ng

Platinum® Taq High Fidelity 0.2 μl 1.0 unit Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl final Ne s'applique pas Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94°C pendant 30 secondes

30 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 30 secondes Hybridation : 55°C pendant 30 secondes Extension : 68°C pendant 1 minute / kb de produit PCR. Après la réaction, 1/10 du produit PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification. 4.2. Construction du vecteur pUC19 lgtA FL

Le produit PCR obtenu en 4.1. d'une part et le plasmide pUC19 d'autre part ont été soumis à une double digestion par EcoRI et Pstl pendant 2 hrs à 37°C. On a utilisé 10 unités de chaque enzyme par μg d'ADN dans le tampon REact2 (Invitrogen). Le fragment PCR a été ensuite inséré dans le vecteur pUC19 linéarisé. Les ligations ont été réalisées sous un volume final de 20 μl avec 50 ng de vecteur, 0,5 U de T4 DNA ligase (Invitrogen) et 1 μl d'ATP 10 mM (Invitrogen) pendant 16 heures à 16⁰C. La ligase a ensuite été inactivée par chauffage 10 min à 65°C.

Le vecteur ainsi obtenu a été transféré par la technique d'électroporation dans la souche d'E. coli XLl blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro-compétente. Les paramètres suivis pour l'électroporation sont les suivants : Capacitance : 500 μFD ; Résistance : 200 ohms ; Voltage : 1700 volts.

La sélection des clones transformés a été faite par étalement sur boîtes LB ampicilline 100 μg/ml. L'authentification des clones positifs (présence d'un gène lgtA FL) a été réalisée par digestion enzymatique après extraction de l'ADN par miniprep. 1/5 des clones analysés présentaient le profil de digestion enzymatique attendu. 4.3. Amplification par PCR (polymerase chain reaction) du gène de résistance à l'érythromycine (erm)

L'amplification par PCR de la cassette érythromycine (erm) au départ du pMGCIO a été faite avec des amorces permettant d'intégrer les sites de restriction BamΑl-Xbàl. Le couple d'amorces utilisé est le suivant :

CG GGATCC GGA AGG CCC GAG CGC AGA AGT (Tm : 65,7⁰C) ; et GC TCTAGA CAA CTT ACT TCT GAC AAC GAT CGG (Tm : 61°C)

Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé :

Composants Volume Concentration finale Tampon PfU turbo 1 OX 5 μl IX

1O mM dNTP mixture 0.4 μl 0.2 mM de chaque

Mélange d'amorces (10 μM chacun îee)) 11 μμll 0.2 pMGCIO x μl 10 ng

Pfu turbo (Stratagène) 1 μl 2.5 units Nuclease free water to 50 μl Pas applicable

Le programme du thermocycleur a été le suivant: Initial denaturation: 95⁰C for 2 mn 30 cycles of:

Dénature: 95⁰C for 30 seconds Anneal: 55⁰C for 30 seconds

Extend: 72⁰C for 1 minute Final elongation: 72⁰C for 10 mn

Après la réaction 1/10 des produits PCR sont déposés sur gel d'agarose.

4.4. Construction du plasmide pUC19 IgtA TR (délétion de la partie centrale du gène IgtA par PCR inverse)

Avec le kit Expand Long Template PCR (Roche), on a réalisé une PCR inverse à partir du plasmide pUC19 IgtA FL, obtenu en A.4.2., dans le double but d'enlever la partie centrale du gène et de créer deux sites de restriction aux extrémités (BamΗI et Xbaï). Le couple d'amorces suivant a été utilisé : CG GGATCC GCCAAT TCA TCC AGC CCGATG (Tm = 61,8°C); et CG TCTAGA CCC GGT TCG ACA GCC TTG (Tm= 60,5⁰C) ; Ceci permet de réamplifier le plasmide en délétant la partie que l'on souhaite retirer.

Pour amplification, le mélange suivant a été réalisé : Composants Volume Concentration Finale

Tampon 1 OX ELT PCR 5 μl IX Mélange de dNTP (10 mM de chaque) 2 μl 0.4 mM de chaque

Mélange d'amorces (10 μM de chaque) 1,5 μl 0.3 μM de chaque Matrice d'ADN (10 ng de pUC19 IgtA FL) Ne s'applique pas Polymérase ELT 0.75 μl 3.75 unités

Eau dépourvue de nucléase pour 50 μl Ne s'applique pas Le programme du thermocycleur est le suivant :

Dénaturation initiale : 94°C pendant 2 min

10 cycles de : Dénaturation : 94⁰C pendant 10 secondes

Hybridation : 55°C pendant 30 secondes

Extension : 68°C pendant 1 min par kbs 20 cycles de : Dénaturation : 94°C pendant 15 secondes

Hybridation : 55°C pendant 30 secondes

Extension : 68°C pendant 1 min par kbs + 20 sec/cycle

Elongation finale : 68⁰C pendant 7 min

Après la réaction, 1/10 des produits PCR a été déposé sur gel d'agarose pour vérification de la taille (3.2.kbs). Le produit PCR a été purifié sur colonne QiaQuick.

La dernière étape a consisté à transférer le vecteur dans la souche d'E. coli XLl blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro compétente. L'authentification de clones positifs (igtA délété de sa partie centrale) a été réalisée par digestion enzymatique après extraction de l' ADN par miniprep. 4.5. Construction du plasmide pUC19 IgtA :: erm

Le produit PCR erm d'une part et le plasmide pUC19 IgtA TR issu de la PCR inverse d'autre part ont été soumis chacun à une double digestion par BamΑl et Xbal dans les conditions suivantes :

2 μg d'ADN ont été en contact avec 20 unités de Xbal en tampon 2 (InVitrogen) sous 60 μl pendant 2 heures à 37°C. Puis Xbal a été inactivée 10 minutes à 65°C. On a alors ajouté 7 μl de NaCl 1 M, 20 unités de Bamiîl et 1 μl de tampon 2. La digestion a été poursuivie 2 hrs à 37°C.

Les produits de digestion ont ensuite été intégralement déposés sur un gel d'agarose 0.8%, et après migration, les bandes ont été découpées pour être électroéluées (celle du plasmide est à 3.2 kbs).

Après purification, le plasmide linéarisé et le produit PCR erm digéré ont été ligués entre eux comme précédemment décrit. Le produit de la ligation a été utilisé pour transformer comme précédemment décrit, la souche E. coli XLl Blue MRF résistante à la kanamycine et rendue électro-compétente. Les clones recombinants ont été analysés par digestion enzymatique. 4/11 des clones analysés présentaient le profil de digestion enzymatique attendu.

4.6. Transformation de Ia souche C708 Ipt3 FL Ipt6 TR et détection de l'événement de recombinaison homologue

Dix μg de plasmide pUC19 igtA :: erm ont été linéarisés par EcoRI à raison de 10 unités d'enzyme par μg de plasmide à digérer dans le tampon approprié pendant 2 heures à

37°C.

La transformation dans la souche C708 Ipύ FL Iptβ TR a été faite en suivant la technique décrite dans la section A.1.1.

Après transformation, 1,24 10 bactéries ont été étalées sur milieu BHI + erythromycine à 2 μg/mL. L'incubation est poursuivie une nuit à 37°C. La fréquence de transformation observée est de 1 / 2,5 10⁶.

B. Données expérimentales relatives aux compositions vaccinales 1. Préparation de la rTbpB lipidée Par souci de simplification langagière, on indiquera simplement par la suite, rTbpB ou TbpB.

1.1. Production

Souches exprimant la TbpB lipidée M982 ou B16B6

Les souches d'expression sont les souches à" E. coli BL21 contenant respectivement le plasmide pTG9219 / pTG9216. Ces plasmides comportent notamment un marqueur de sélection à la kanamycine et le polynucléotide codant pour la rTbpB de la souche de N. meningitidis M982 (pTG9219) ou B16B6 (pTG9216) (les séquences sont telles que décrites dans le brevet EP 586 266), fusionnée à la séquence signal RIpB (Real lipoprotein B) d'E. coli et placée sous le contrôle du promoteur arabinose (αraB). Culture

Trois congelâts de la souche d'E. coli BL21/pTG9219 ou BL21/pTG9216 (1 ml chacun) servent à ensemencer 3 litres de milieu LB (Luria Broth) répartis en erlens. L'incubation est poursuivie 15 à 18 h à 37°C.

Cette pré-culture sert à ensemencer un fermenteur contenant du milieu TGMl 6 (extrait de levure 9g/L, K₂SO₄ 0.795 g/L, K₂HPO₄ 3.15 g/L, NaCl 0.75 g/L, CaCl₂,2H₂O 0.005 g/L, FeCl₃,6H₂O 0.021 g/L, MgSO₄JH₂O 0.69 g/L, hydrolysat acide de caséine sans sel 37.5 g/L) supplémenté avec du glycérol 20 g/L, à raison de 10 % (vol./vol.).

La culture est poursuivie à 37⁰C sous agitation, à une pression de 100 mbar et sous une alimentation d'air de 1 L/min/L de culture, en réajustant au cours du temps la concentration de glycérol à 20 g/L (e.g. à DO_60O de 15 + 2). Lorsque la D0₆oo est comprise entre 21 et 27, on induit l'expression de la rTbpB par addition d'arabinose pour obtenir une concentration finale de 10 g/L. Après une heure d'induction, la culture est arrêtée en refroidissant aux alentours de 10⁰C.

Les culots bactériens sont récupérés par centrifugation et stockés au froid. 1.2. Purification

Extraction des membranes renfermant la rTbpB LOS extraction

Un culot bactérien équivalent à un litre de culture (environ 72 g de germes, poids humide) est décongelé à une température de 2O⁰C +/-5⁰C. Les germes décongelés (ou partiellement décongelés) sont remis en suspension par 800 ml d'une solution à température ambiante de Tris HCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0. On ajoute aussitôt 9 pastilles d'inhibiteur de protéases (7 pastilles de Complète Mini, EDTA free ; ROCHE réf. 11836170001 + deux pastilles de Complète, EDTA free ; ROCHE réf. 11836170001). Une partie des germes se lysant spontanément, 4 μl de benzonase (1 UI d'activité DΝAse/ml en final ; Merck réf K32475095) sont ajoutés également. L'incubation est poursuivie à +4⁰C durant 45 minutes sous agitation magnétique après homogénéisation par Turrax (15 sec).

Puis on ajoute 4 ml de MgCl₂ 1 M afin d'être à 5 mM final. L'agitation magnétique est portée à 10 minutes. Une centrifugation à 15,000 g durant 45 minutes permet de récolter le culot (culot Cl ; vs Surnageant Sl) contenant la protéine rTbpB.

Une deuxième extraction est réalisée : homogénéisation par Turrax dans 800 ml du tampon Tris HCl 50 mM, EDTA 5 mM pH 8,0 et agitation pendant 30 min. On ajoute du MgCl₂ (8 ml d'une solution molaire). L'incubation est poursuivie pendant 10 minutes. La suspension est centrifugée 15,000 g durant 1 hr 30. Lyse bactérienne

Le culot est remis en suspension par 1400 ml de Tris HCl 50 mM additionné de 4 pastilles d'inhibiteur de protéases et de 8 μl de Benzonase. La solution est homogénéisée au Turrax 15 secondes. La lyse est réalisée à +4°C durant 30 minutes grâce à l'ajout de 14 ml (10 mg/ml en final) de lysozyme à 100 mg/ml en acétate de Na 25 mM, glycérol 50 %.

La suspension est centrifugée à 30,000 g durant 30 minutes (Culot C2 contenant la protéine ; vs surnageant S2 contenant les contaminants de rTbpB). Le culot contenant les membranes peut être congelé à ce stade.

Lavage des fragments de membranes Le culot de lyse C2 est repris en Tris HCl 50 mM (1100 ml). Après homogénéisation, (Turrax 15 secondes), il est lavé durant une heure à +4°C. On opère comme précédemment à une centrifugation à 30,000 g durant 30 minutes, Le culot (C3 ; vs surnageant S3) est congelé à -45°C. Le tampon Tris HCl 50 mM permet d'éliminer une petite quantité de protéine (surnageant S3) et ne solubilise que très peu de rTbpB. Le culot C3 est repris en tampon Tris HCl 50 mM, urée 8 M pH 8,0 (800 ml). Ce tampon permet d'éliminer une partie des protéines contaminantes sans solubiliser les membranes contenant la rTbpB. Après homogénéisation (sans Turrax), la solution est alors agitée durant une heure à +4⁰C. On procède comme précédemment à une centrifugation à 30,000 g durant 30 minutes qui permet d'obtenir un culot de membranes qui peut être congelé.

Solubilisation des membranes Le culot de membrane décongelé est solubilisé par 780 ml de tampon Tris HCl 50 mM EDTA 6 mM Urée 2 M Elugent 4 % à pH 7,5. La présence du détergent à 4 % et de l'urée 2 M permet de réaliser la solύbilisation du culot. La solution est agitée à +4°C une nuit (16h minimum). La centrifugation à 30,000 g (1 heure à +4°C) de la solution ne laisse qu'un petit culot (C4) contenant quelques impuretés. Le surnageant S4 contenant la protéine rTbpB est récupéré pour dépôt sur une première colonne échangeuse de cations (QS I).

Purification par chromatographie échangeuse d'anions sur Q Sepharose àpH 7,5

Deux chromatographies successives sont réalisées, le produit de la première chromatographie est collecté puis déposé ensuite après une étape de dialyse sur une deuxième colonne de chromatographie qui utilise des conditions différentes (absence d'EDTA).

I^{e te} Chromatographie, en présence d'EDTA (Chromatographie QS I)

Une colonne de 600 ml (K50, diamètre 20 cm2) de gel Q Sepharose Fast Flow (réf 17- 0510-01 GE Healthcare) est montée, tassée en tampon d'équilibration Tris HCl 50 mM EDTA 6 mM, Urée 2 M, Elugent 1 %, à pH 7,5 au débit de 8 ml/minute.

Le surnageant S4 (environ 845 ml) est déposé au débit de 6 ml/minute. L'éluât direct (partie qui ne s'accroche pas sur la colonne lors du dépôt de l'échantillon) contient la protéine d'intérêt rTbpB. Cet éluât (1150 mL) est prélevé, puis dialyse à +4°C (durant 6 jours) contre 6 litres de tampon Tris HCl 50 mM, Urée 2 M, Elugent 1 %, pH 7,5 afin d'abaisser à 1 mM la concentration en EDTA et d'éliminer le NaCl.

2^έme chromatographie (QSII), sans EDTA

Une colonne K50 de 490 ml de gel neuf Q Sepharose Fast Flow est équilibrée en tampon Tris HCl 50 mM, Urée 2 M, Elugent 1 % pH 7,5. La solution dialysée (1080 ml) est déposée sur la colonne (débit 6 ml/minute) ; puis 5 paliers d'élution salins dans ce même tampon sont réalisés: 20 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM et 1 M NaCl (débit de travail 6 ml/minute). La protéine rTbpB est éluée de la colonne à deux concentrations en sel (50 mM et 100 mM). La fraction d'élution 50 mM est la fraction d'intérêt, la protéine rTbpB y étant la plus pure et en plus importante quantité (2,6 fois plus de protéine que dans la fraction 100 mM de NaCl) Le pH de la fraction correspondant au pic d'élution 50 mM NaCl est abaissé sous agitation magnétique à pH 5,5 par un ajout d'acide acétique 1,7 N. La solution (860 ml) est placée en dialyse contre 5 litres de tampon acétate de sodium 10 mM, Urée 1 M, Elugent 0,2 %, pH 5,5 (24 hrs à +4⁰C) puis contre 4 litres de tampon acétate de sodium 10 mM, Urée 1 M, Elugent 0,2 %, pH 5,5 (17 hrs à +4°C).

Purification par chromatographie échangeuse de cations sur SP Sepharose (SPI) à pH

5,5

Une colonne K50 de 100 ml de gel neuf SP Sepharose Fast Flow (Ge Healthcare, réf 17- 0729-01) est équilibrée en tampon acétate de sodium 10 mM, Urée 1 M, Elugent 0,2 %, pH 5,5.

La solution de protéine dialysée (850 ml) est déposée sur la colonne (débit 6 ml/minute). Puis, cinq paliers salins d'élution sont réalisés: 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM et 1 M NaCl, en tampon cité ci-dessus.

La protéine rTbpB est éluée exclusivement dans la fraction 250 mM NaCl et les contaminants de faible poids moléculaire sont éliminés essentiellement dans l'éluât direct (40 %). On obtient ainsi environ 35 mg de rTbpB M982 purifiée et un peu moins pour ce qui concerne la rTbpB B16B6.

Dialyse et concentration du produit de SPI (fractions 250 mM)

Les fractions correspondant au pic d'élution 250 mM de la colonne SPI sont rassemblés (volume 274 ml). Le pH de la solution est remonté à pH 7,3 par ajout sous agitation d'environ 800 μl de NaOH 0,5 N. La solution est placée en dialyse à +4⁰C (Spectra Por 1 : seuil de coupure 6-8000 D) contre deux bains de 10 litres de PBS Elugent 0,2 % pH 7,1 (66 hrs et 22 hrs).

Le dialysat est concentré jusqu'à un volume de 21,1 ml par diafiltration concentration frontale sur membrane Amicon 30 kD en PBS (réf PBTK06510).

Puis le concentré obtenu est remis en dialyse contre 2 litres de PBS Elugent 0,2 % pH 7,1 (Slide A Lyser réf 66810: seuil de coupure 10 kD).

La solution est ensuite filtrée de façon aseptique sur filtre Millex 0,22 μm en Durapore (réf Millipore SLGV 033RS). Le lot de protéine rTbpB purifiée obtenu est congelé à - 80⁰C. La concentration en protéine est de 1642 μg/ml. 1.3. Préparation de la rTbpB pour injection

La solution de rTbpB obtenue en section B.1.2. est traitée par adsorption sur des Bio- Beads™ SM-2 pour éliminer l'excès du détergent Elugent™ (tensio-actif constitué d'alkyl glucosides) qui pourrait déstabiliser les liposomes LOS. Activation des Bio-Beads™

On ajoute environ 2.5 mL de méthanol à 500 mg de Bio-Beads™ et on homogénéise par intermittence durant 15 min. à température ambiante. Après un temps de décantation, le surnageant est éliminé. Cette opération de lavage est renouvelée deux fois.

On ajoute alors environ 5 mL d'eau stérile ultrafiltrée et on homogénéise par intermittence durant 15 min. à température ambiante. Après un temps de décantation, le surnageant est éliminé. Cette opération de lavage est renouvelée deux fois.

On ajoute alors environ 5 mL de PBS et on homogénéise par intermittence durant 15 min. à température ambiante. On conserve à 5⁰C et on utilise le jour même.

En final, le poids des Bio-Beads™ s'est accru d'un facteur R (égal à environ 1.2). Elimination du détergent par adsorption sur Bio-Beads™

La solution de rTbpB obtenue à la section 1.2. contient 2 mg/mL d'Elugent™. La quantité de Bio-Beads™ devant être utilisée est déterminée en fonction de la quantité d'Elugent™ à éliminer.

Pour un mL de la solution de rTbpB obtenue à la section B.1.2., on ajoute 29 X R mg de Bio-Beads™ activées. On agite vivement pendant une heure à température ambiante. Puis on récupère le maximum de liquide auquel on ajoute du merthiolate 0.001 % final. Le tout est réalisé en condition stérile.

2. Préparation du LOS purifié

Culture Huit mL de congelât de la souche de N. meningitidis C708, sérogroupe A, Ipt3 FL Ipt6 TR igtA : : erm précédemment obtenue en A.4.6. ou de la souche Al de N. meningitidis sérogroupe A connue pour exprimer de manière exclusive du LOS d'immunotype L8 et dont le LOS porte 2 PEAs, l'un en position 3, l'autre en position 6 de l'heptose II, servent à ensemencer 800 mL de milieu Mueller Hinton (Merck) supplémentés avec 4 niL d'une solution de glucose à 500 g/L et répartis en erlens. La culture est poursuivie sous agitation à 36 ± 1°C pendant environ 10 heures.

On ajoute à la pré-culture 400 mL d'une solution de glucose à 500 g/L et 800 mL d'une solution d'acides aminés. Cette préparation sert à ensemencer un fermenteur contenant du milieu Mueller-Hinton, à une D0₆oo_mπ proche de 0.05. La fermentation est poursuivie à 36°C, à pH 6.8, 100 rpm, pθ₂ 30 % sous un flux d'air initial de 0.75 L/min/L de culture.

Après environ 7 hrs (DO_ôoo_nm d'environ 3), on ajoute du milieu Mueller-Hinton à raison de 440 g/hr. Quand la concentration en glucose est inférieure à 5 g/L la fermentation est arrêtée. La DO_ôoo_nm finale est couramment comprise entre 20 et 40. Les cellules sont récoltées par centrifugation et les culots congelés à -35°C.

Purification (méthode adaptée de Westphal & Jann, (1965) Meth. Carbohydr. Chem. 5 : 83)

Les culots sont décongelés et suspendus avec 3 volumes de phénol 4.5 % (vol./vol.) en agitant vigoureusement pendant 4 hrs à environ 5°C. Le LOS est extrait par traitement au phénol.

La suspension bactérienne est chauffée à 65⁰C puis mélangée vol./vol. avec du phénol à 90 % en agitant vigoureusement pendant 50-70 min à 65⁰C. La suspension est ensuite refroidie à température ambiante puis centrifugée pendant 20 min à 11 000 g. La phase aqueuse est prélevée et conservée tandis que la phase phénolique et l'interphase sont récoltées pour être soumises à une deuxième extraction.

La phase phénolique et l'interphase sont chauffées à 65⁰C puis mélangées à un volume d'eau équivalent à celui de la phase aqueuse précédemment prélevée en agitant vigoureusement pendant 50-70 min à 65⁰C. La suspension est ensuite refroidie à température ambiante puis centrifugée pendant 20 min à 11 000 g. La phase aqueuse est prélevée et conservée tandis que la phase phénolique et l'interphase sont récoltées pour être soumises à une troisième extraction identique à la seconde.

Les trois phases aqueuses sont dialysées séparément contre 40 L d'eau chacune. Puis les dialysats sont rassemblés ensemble. A 9 volumes de dialysat on ajoute un volume de Tris 20 mM, MgCl₂2mM. Le pH est ajusté à 8.0 ± 0.2 avec de la soude 4 N. Deux cent cinquante unités internationales de DNAse sont ajoutées par gramme de culot. Le pH est ajusté à 6.8 + 0.2. La préparation est placée à 37°C pendant environ 2 hrs sous agitation magnétique ; puis soumise à une filtration sur membrane de 0.22 μm. Le filtrat purifié par passage sur une colonne de Sephacryl S-300 (5.0 x 90 cm ; Pharmacia™). Les fractions contenant le LOS sont rassemblées ensemble et la concentration en MgCl₂ est élevée à 0.5 M en rajoutant de la poudre de MgCl₂,6H₂O sous agitation.

Tout en poursuivant l'agitation, on ajoute de l'alcool absolu déshydraté pour une concentration finale de 55 % (vol./vol.). L'agitation est poursuivie une nuit à 5 + 2⁰C, puis on centrifuge à 5,000 g pendant 30 min à 5 + 2°C. Les culots sont resuspendus avec au moins 100 mL de MgCl₂ 0.5 M puis soumis à une deuxième précipitation alcoolique identique à la précédente. Les culots sont resuspendus avec au moins 100 mL de MgCl₂ 0.5 M.

La suspension est soumise à une filtration sur gel comme précédemment décrit. Les fractions contenant le LOS sont rassemblées ensemble et stérilisées par filtration (0.8- 0.22 μm) et conservées à 5 ± 2°C.

Ce procédé de purification permet d'obtenir environ 150 mg de LOS par litre de culture. 3. Préparation des liposomes [LOS] par dialyse de détergent 3.1. Préparation des liposomes

Les liposomes LOS sont préparés par dialyse de détergent. En bref, les lipides (EDOPC : DOPE) sont mis sous forme de film lipidique et repris en tampon Tris 10 mM, puis dispersés en présence de 100 mM d'octyl β-D-glucopyranoside (OG) (Sigma- Aldrich ref O8001) et filtrés stérilement. Le LOS en OG 100 mM est ajouté stérilement. Le mélange lipides/LOS/OG est ensuite dialyse contre du tampon Tris 10 mM pour éliminer l'OG et former les liposomes. Protocole

On réalise une préparation lipidique en chloroforme des lipides que l'on va utiliser pour la fabrication des liposomes. Un film sec est obtenu par évaporation complète du chloroforme.

Un film sec de 1,2 dioleyl-OT-glycero-3-ethylρhosphochorine (EDOPC ou ethyl-DOPC) et de l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) dans un rapport molaire EDOPC : DOPE de 3 pour 2 est obtenu en mélangeant 12.633 mL d'une solution de EDOPC (Avanti Polar Lipids ref 890704) à 20 mg/ml en chloroforme et 7.367 mL d'une solution de DOPE (Avanti Polar Lipids ref 850725) à 20 mg/ml en chloroforme et en évaporant le chloroforme jusqu'à disparition complète. Le film sec est repris par 30 mL de tampon Tris 10 mM pH 7.0 pour obtenir une suspension contenant 13.333 mg de lipides /ml (8.42 mg/ml d'EDOPC et 4.91 mg/ml de DOPE). La suspension est agitée 1 hr à température ambiante puis soniquée 5 min dans un bain.

Puis on ajoute toujours sous agitation, 3.333 ml d'une solution stérile d'octyl β-D- glucopyranoside (OG) (Sigma-Aldrich ref O8001) 1 M en tampon Tris 10 mM pH 7.0 pour obtenir une suspension limpide de lipides à 12 mg/ml, OG 100 mM, tampon Tris 10 mM. On poursuit l'agitation 1 hr à température ambiante sur table d'agitation. Puis on filtre stérilement sur Millex HV 0.45 μm.

On prépare dans des conditions stériles, une composition en mettant en présence du LOS et des lipides dans un rapport molaire lipides : LOS de 250 (0.160 mg/mL de LOS, 9.412 mg/mL de lipides et 100 mM d'OG). 40 mL d'une telle composition résulte du mélange des les préparations suivantes :

2.005 mL de tampon Tris 10 mM pH 7.0 ; 0.223 mL d'OG 100 mM en Tris 10 mM ; 31.373 mL de la suspension EDOPC : DOPE de ratio molaire 3 : 2 à 12 mg/ml en OG 100 mM Tris 10 mM ; et 6.4 mL d'une suspension stérile de LOS à 1 mg/ml en OG 100 mM Tris 1O mM.

Après une heure d'agitation à température ambiante, la suspension est transférée stérilement dans 4 cassettes de dialyse stériles de 10 ml. Chaque cassette est dialysée 3 fois (24 hrs - 24 hrs - 72 hrs) contre 200 volumes de Tris 10 mM pH 7.0 soit 2 L. On récupère les liposomes dans des conditions stériles. L'augmentation de volume après dialyse est environ de 30 %.

A cette préparation, on ajoute du merthiolate et du NaCl pour obtenir une préparation de liposomes en Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.0, Merthiolate 0.001 % qui contient in fine environ 110 μg/ml de LOS et 7 mg/ml de lipides dont environ 4.5 mg/ml d'EDOPC et environ 2.5 mg/ml de DOPE (concentrations théoriques).

Les liposomes LOS sont conservés à +5°C. 3.2. Préparation des injectables

Les liposomes sont ajustés à la concentration requise en LOS (notamment pour les tests d'immunogénicité) en Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4. La concentration en merthiolate est maintenue à 0.001 %. 4. Préparation d'un mélange liposomes [LOS] + rTbpB

On mélange de la rTbpB en PBS (section B.1.3.) avec des liposomes [LOS] (section B.3.) dans un rapport poids : poids rTbpB : LOS égal à 1. Puis on ajuste en tampon Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4 pour obtenir une préparation dans laquelle chacun des composants (rTbpB et LOS) est concentré à 80 μg/ml. La concentration en merthiolate est maintenue à 0.001 %.

5. Etude d'immunogénicité chez le lapin

Les différentes formulations testées ont été fabriquées comme décrit dans l'une des précédentes sections.

5.1. Immunisations des lapins Vingt quatre lapines NZ KBL (Charles River Lab.) âgées de 7 semaines sont réparties en 4 groupes test de quatre (groupes A à D) et en 4 groupes de deux (groupes E à H).

Les lapines de chaque groupe reçoivent sous un volume de 0.5 ml reparti en 2 injections intramusculaires concomitantes dans les pattes, à JO, J21 et J42 : Groupe A : 40 μg de liposomes [LOS chaîne α L8, PEA-3, PEA-6] et 40 μg rTbpB M982, en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4 ; Groupe B : 40 μg de liposomes [LOS chaîne α L8, PEA-3, PEA-6] et 40 μg rTbpB

B16B6, en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4 ;

Groupe C : 40 μg de liposomes [LOS chaîne α L8, PEA-3] et 40 μg rTbpB M982, en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4 ;

Groupe D : 40 μg de liposomes [LOS chaîne α L8, PEA-3, PEA-6] en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4 ; Groupe E : 40 μg rTbpB M982 et 40 μg de liposomes sans LOS en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM, Tween 0.5 % pH 7.0 ; Groupe F : 40 μg rTbpB B 16B6 et 40 μg de liposomes sans LOS en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM, Tween 0.5 % pH 7.0 ; Groupe G : 40 μg de liposomes [LOS chaîne α L8, PEA-3] en tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4 ; Groupe H : Tampon Tris 10 mM NaCl 150 mM pH 7.4

Du sang des animaux est prélevé pour analyse à JO, J42 (avant la troisième injection) et à J56.

5.2. Mesure de l'activité bactéricide des IgGs purifiées à l'encontre de souches de JV. meningitidis hétérologues à Ia souche C708

A partir des pools de sérums, les IgGs ont été purifiées par chromatographie d'affinité à l'aide de la colonne HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare / Amersham Biosciences) selon les recommandations du fournisseur.

A partir des IgGs purifiées, on réalise des dilutions sérielles de raison 2 en PBS Dulbecco's gélatine contenant des ions calcium et magnésium. Les dilutions sont réalisées en plaque de 96 puits pour un volume final de 50 μL par puits.

L'activité bactéricide des IgGs purifiées a été testée à l'encontre des souches citées dans le tableau II ci-après.

On réalise une culture des souches de JV. meningitidis en milieu BHI complémenté ou non pendant 2 hrs 30 avec du Desféral 50 μM (agent chélateur du fer sous forme libre, qui permet l'expression de la TbpB).

Vingt cinq μL de la culture en phase exponentielle (4.10³ CFU/mL) ainsi que 25 μL de complément de bébé lapin au 1/1,5 sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est incubée une heure à 37°C, sous agitation.

Cinquante μL du mélange de chaque puits sont ensuite déposés sur des boîtes de gélose Mueller-Hinton bioMérieux et incubées une nuit à 37°C sous 10 % de CO₂. On décompte le nombre de clones. Les témoins sont au nombre de trois :

Bactéries + complément de bébé lapin, sans sérum à tester (témoin « complément ») ;

Bactéries + complément de bébé lapin inactivé, sans sérum à tester (témoin « germes ») ; et

Bactéries + complément de bébé lapin inactivé + sérum à tester (témoin sérum). On exprime le titre bactéricide comme étant l'inverse de la dilution donnant 50 % de mort bactérienne par comparaison avec le témoin « complément ».

5.3. Résultats et Discussion

Test de bactériddie 34 souches de N. meningitidis ont été testées en bactéricidie croisée. Leurs noms apparaissent dans le tableau II ci-dessous.

L'activité bactéricide des IgGs purifiées est exprimée en « fold increase ». Le « fold increase » est le rapport titre bactéricide des IgGs purifiées du groupe d'intérêt : titre bactéricide du groupe contrôle négatif correspondant. Ainsi le taux de séroconversion en « fold increase » mesure l'accroissement du titre bactéricide. On considère que l'activité bactéricide est significative lorsque l'un facteur x 8 est observé entre le groupe d'intérêt et le groupe témoin négatif correspondant (« fold increase » supérieur ou égal à x 8).

Comme attendu, les IgGs purifiées issues du groupe d'immunisation contrôle négatif ne présentent d'activité bactéricide à Pencontre d'aucune des souches (« fold increase » inférieur à x 4).

Les IgGs purifiées issues des groupes d'immunisation D et G (pas d'adjuvantation du LOS avec une TbpB) font preuve d'une bactéricidie croisée de moindre intérêt. On ne présente dans le tableau II ci-après, que les résultats de bactéricidie exprimés en « fold increase » obtenus avec les IgGs purifiées des groupes A, B, C, E et F. Le tableau III présente les résultats de bactéricidie exprimés en « fold increase », des IgGs purifiées issues du groupe A, vis-à-vis de 22 souches cultivées en présence / absence de Desféral.

Le tableau IV présente pour diverses compositions vaccinales, le pourcentage de protection déduit de l'étude de bactéricidie croisée incluant 34 souches cultivées en présence de Desféral. Tableau II (i)

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Tableau II (iï)

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Table II (in)

20

Dans le tableau II ci-dessus :

IT signifie « immunotype »

L6 signifie un LOS possédant une chaîne α de type L6

L8 signifie un LOS possédant une chaîne α de type L8

25 PEA-3 signifie que le LOS possède un seul substituant PEA en position 3 de l'heptose II

PEA-3, -6 signifie que le LOS possède un substituant PEA en position 3 et un substituant PEA en position 6 de l'heptose IL

Tableau III

Tableau IV

Claims

Revendications

1. Un vaccin à rencontre des infections à N. meningitidis, qui comprend :

(iii) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne (a) porte en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine (PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions O-6 et O-7 ; ou (b) porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position O-3 et en position O-6 ou 0-7 ; et (iv) la sous-unité B (TbpB) lipidée du récepteur de la transferrine humaine d'une souche de N. meningitidis ou un fragment lipide de cette TbpB.

2. Un vaccin selon la revendication 1, qui comprend :

(iv) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte en position O-3 un substituant phosphoéthanolamine

(PEA) et ne porte pas de substituant PEA en positions O-6 et O-7 ;

(v) un LOS de N. meningitidis constitué notamment d'un lipide A, d'un core interne, d'une chaîne α de type L8, dans lequel le résidu heptose II du core interne porte un substituant phosphoéthanolamine (PEA), en position

0-3 et en position 0-6 ou O-7 ; et (vi) la TbpB de N. meningitidis ou un fragment lipide de cette dernière.

3. Un vaccin selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la TbpB est la TbpB d'une souche de N. meningitidis d'isotype IL

4. Un vaccin selon la revendication 3, dans lequel la TbpB d'une souche de N. meningitidis d'isotype II est la TbpB de la souche de N. meningitidis M982.

5. Un vaccin selon la revendication 3 ou 4, qui comprend en outre la TbpB d'une souche de N. meningitidis d'isotype I.

6. Un vaccin selon la revendication 5, dans lequel la TbpB de la souche de N. meningitidis d'isotype I est la TbpB de la souche de N. meningitidis B16B6.

7. Un vaccin selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le LOS est formulé en liposomes (liposomes LOS).

8. Un vaccin selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le LOS et la ou les TbpB(s) sont formulés ensemble en liposomes.

9. Un vaccin selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le LOS est formulé en liposomes et dans lequel la ou les TbpB(s) sont mélangées aux liposomes LOS.

10. Un vaccin selon l'une des revendications 1 à 9, qui ne contient pas de vésicule de membrane externe (OMV) de N. meningitidis.