EP2223120A1 - Méthode non-invasive de recueil de données biologiques pour l'établissement d'un diagnostic d'une pathologie cutanée - Google Patents

Méthode non-invasive de recueil de données biologiques pour l'établissement d'un diagnostic d'une pathologie cutanée

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EP2223120A1
EP2223120A1 EP08854335A EP08854335A EP2223120A1 EP 2223120 A1 EP2223120 A1 EP 2223120A1 EP 08854335 A EP08854335 A EP 08854335A EP 08854335 A EP08854335 A EP 08854335A EP 2223120 A1 EP2223120 A1 EP 2223120A1
Authority
EP
European Patent Office
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skin
mass spectrometry
sample
marker
protein
Prior art date
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Ceased
Application number
EP08854335A
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German (de)
English (en)
Inventor
Bruno Mehul
Gilbert LAFFET
Luigi Russo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
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Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2223120A1 publication Critical patent/EP2223120A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
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    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Definitions

  • the invention relates to the use of mass spectrometry from a non-invasive skin sample for the diagnosis, prognosis or therapeutic follow-up of cutaneous pathologies, such as psoriasis.
  • the invention more particularly relates to a method for analyzing a sample of the upper layers of the epidermis. Diagnoses of cutaneous pathologies are usually performed by biopsy or by local examination of skin symptoms, such an examination involving the visual evaluation of areas showing inflammation.
  • a non-invasive method, such as visual examination is more advantageous than biopsies in terms of cost, time and comfort for the patient.
  • diagnostic errors can occur especially when the pathologies in question have only preliminary or poorly developed symptoms.
  • the patient may have to deal with a succession of ineffective treatments, which is of course to be avoided.
  • a succession of ineffective treatments may also result in the abandonment of any treatment by the patient.
  • proteins are not necessarily related to the presence of messenger RNA encoding these proteins but may result from post-translational modifications (glycosylation or deglycosylation, glycation, oxidation, phosphorylation. ..) or be related to the fate of these proteins such as, for example, enzymatic hydrolysis.
  • This hydrolysis by the action of endogenous proteases can lead to the appearance of mature forms or the disappearance of certain markers. These events are particularly important in the epidermal layers. These biochemical changes may sign an epidermal state (disorder) that can only be observed by the detection and identification of proteins including proteomic analysis.
  • Patent application WO2007 / 96846 describes a skin evaluation method by measuring metabolites of skin samples. This method makes it possible to follow the metabolites of the cutaneous surface, which are the consequences and not the actors of the biochemical reactions that have occurred in the skin.
  • the techniques developed in this application are specific to the analysis of the metabolome and are not suitable for proteome analysis.
  • the person skilled in the art can not extrapolate this method of evaluation of the metabolome to the identification of protein markers.
  • the identification of the protein content and its proteomic analysis makes it possible to follow specific markers of a cutaneous pathology and to guide the diagnosis.
  • most of the therapeutic targets are of a protein nature, which reinforces the interest of discovering, identifying and tracking the proteins on the surface of the skin through a method specific to these.
  • the identification of proteins upstream of the metabolome is therefore fundamental for the characterization of the tissue response.
  • the present invention proposes to solve the disadvantages of the state of the art by presenting a new reliable, rapid and non-invasive method of collecting biological data useful for establishing a diagnosis or prognosis of a disease. skin pathology such as psoriasis.
  • One aspect of the invention therefore relates to a non-invasive method of collecting biological data useful for establishing a diagnosis or prognosis of a particular skin pathology in a patient, characterized in that a) is taken a skin sample containing biological material, by applying a layer of adhesive to the skin of said patient, then removing said adhesive, b) detecting by mass spectrometry in the cutaneous sample obtained in a) at least one protein whose presence, absence, or variation in quantity or concentration with respect to a standard value is associated with the presence, evolution, or absence of a particular skin pathology.
  • Mass spectrometry is already used in the identification of complex mixtures of chemical compounds and molecules of biological origin. Unlike tools conventionally used as chips or the ELISA technique, this tool makes it possible to visualize new markers, new proteins not yet identified and this by a method having a better sensitivity.
  • the basic principle of mass spectrometry analysis is the measurement of the mass / charge ratio of ionic species that have been created by ionization of the sample to be analyzed and to which electric and magnetic fields are applied.
  • One of the most frequently used ionization methods for biological samples is electro-fogging, known as "ElectroSpray” (ES), which generates multicharged ions and allows the use of inexpensive conventional analyzers such as quadrupoles.
  • ES Electro-fogging
  • the ionization source for the electrospray can be multiple, and in particular can provide good sensitivity for low flow.
  • Another commonly used ionization method is matrix-assisted laser desorption ionization, known as
  • MALDI-TOF is an ionization method well suited to flight time analyzers (MALDI for "Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization” and TOF for "Time ofFHght").
  • the mass / electric charge ratio is measured in different ways, for example by measuring the standard deviation of ionized species (“Sector MS") or the measurement of flight time (“TOF MS").
  • Sample MS standard deviation of ionized species
  • TOF MS flight time
  • Today the methods of analysis are varied and include, for example, quadrupole or quadrupole mass analyzers (QMS), ion trap quadrupole mass analyzers (QIT), Fourier transform infrared spectrometry (FTICR) analyzers.
  • QMS quadrupole or quadrupole mass analyzers
  • QIT ion trap quadrupole mass analyzers
  • FTICR Fourier transform infrared spectrometry
  • tandem mass spectrometry is the combination of several analyzers that allows the selection of a particular ion then the identification of its fragments by successively inserting mass separation steps with fragmentation steps .
  • a tandem analyzer can isolate a peptide resulting from trypsin hydrolysis, protein fragments or a protein from a complex mixture, and then stabilize it to allow its fragmentation (for example by means of a gas or another known method) and catalog the fragments thus produced.
  • the use of data banks then makes it possible to identify the proteins present in the sample.
  • the method according to the invention uses the tandem mass spectrometry (MS / MS) technique.
  • a first fractionation method makes it possible to separate proteins from each other by two-dimensional electrophoresis in polyacrylamide gel.
  • a second method is to use Liquid Chromatography (LC) to separate the proteins before being subjected to enzymatic hydrolysis (usually trypsin). The peptides (hydrolyzate) are then introduced into the mass spectrometer. These two techniques can advantageously be combined.
  • Liquid chromatography used in combination with a mass spectrometer differs from High Performance Liquid Chromatography (HPLC for
  • Performance Liquid Chromatography more generally used, mainly by the dimensions of the columns used and therefore by their flow rates.
  • the diameter of the columns used is usually lmm (in contrast with average diameters of 4.6 mm for HPLC columns). More recently diameters of 300 .mu.m and even capillary type columns of diameters of 75 microns have become predominant.
  • a particularly used source according to the invention is a "nanospray” source such as that marketed under the name Nanospray TM by the company Applied Biosystems, using Picotip emitter TM needles, SilicaTip, and coupled to an LC / mass spectrometer.
  • MS / MS such as that marketed under the trademark Qstar XL TM T by Applied Biosystems.
  • the mass spectrometry analysis used according to the invention comprises a separation step by liquid chromatography associated with tandem mass spectrometry (MS / MS).
  • spots obtained by two-dimensional electrophoresis generally correspond to a single protein.
  • the gel containing the stain is excised and subjected to enzymatic proteolysis.
  • the most frequently used enzyme is trypsin.
  • the peptide mass fingerprinting technique is used by which the masses of the peptides obtained are compared to a reference list on databanks which contains the list of the masses of the peptides. resulting from the digestion of known proteins. If the experimental data correspond to a given list, there is a high probability that the protein is present in the starting sample.
  • Tandem analysis is particularly recommended in order to obtain information on the peptide sequence and thus to evaluate the relevance of the prior identification of the protein (validation). Tandem analysis involves isolating and then fragmenting the peptide ions in a collision chamber. In this method, the site of fragmentation is particularly localized to the peptide bonds. After fragmentation, the resulting mass spectra are compared by software to reference information contained in databases for protein identification.
  • the peptides may be previously concentrated on a precolumn in an acid medium (C 18, pepMap 100, 5 ⁇ m, 100 ⁇ , 300 ⁇ m i.d.x 5 mm), mounted on a LC packing nano-chromatography chain (Dionex company).
  • the peptides are then chromatographed on a C18 column, 3 ⁇ m, 75 ⁇ 150 mm, Atlantis TM (Waters company), the progressive elution of the peptides being carried out using a gradient (acetonitrile / water) coupled directly to the source of the spectrometer.
  • massive. MS / MS analysis is particularly recommended for the identification of proteins from complex mixtures.
  • biological marker denotes a biological molecule associated with the presence or absence of a particular pathological state, it is more particularly a protein.
  • standard value is meant the average amount or concentration of biomarker present in healthy individuals.
  • the method according to the invention can have various applications. Not only can it be useful for establishing a diagnosis or a prognosis but it can also be useful for the study or observation of the evolution of cutaneous pathologies or the effect of particular treatments as well as to make it possible to make a prognosis on the effectiveness of this or that treatment.
  • this method is used to determine the existence of a positive response to the administration of a treatment. particular by identifying a significant variation in the presence of a particular marker. Such use makes it possible to more quickly determine the effectiveness of a particular treatment than to wait to visually observe a change in symptoms. It also reduces the costs associated with therapeutic studies of new drugs.
  • the skin disease, or skin pathology, concerned by the method of the invention may be any cutaneous pathology. This is preferably an inflammatory and / or autoimmune or allergic disease.
  • the cutaneous pathology is psoriasis and the marker to be identified is advantageously a marker of cutaneous psoriatic lesions.
  • Psoriasis is a skin disease of poorly known origin, partly genetic that affects 2% of the population.
  • the epidermis is renewed too quickly, in only four to six days, instead of the usual three weeks which generates localized inflammations.
  • Epidermal cells accumulate on the surface of the skin and form a layer of white dandruff called scales. Perfectly harmless, they have the disadvantage of being unsightly.
  • Psoriasis In its mild form, psoriasis is limited to the scalp, nails, knees, elbows, feet, hands and sometimes to the genitals. In severe cases, it extends and can gain the whole body. Psoriasis includes various symptomatic forms such as plaque psoriasis, psoriasis guttate, pustular psoriasis, reverse psoriasis, erythrodermic psoriasis and psoriatic arthritis. However, it is possible to control psoriasis, reduce the extent of the lesions and improve the lives of patients with certain treatments.
  • the psoriasis marker that is detected or measured is selected from the group consisting of proteins having biological functions related to cell proliferation and differentiation.
  • the laminin the skin-specific calmodulin-related protein (CLSP), the psoriasis-associated fatty acid binding protein, desmoplakin; psoriasin (SlOO A7) and alpha enolase, carcinoma cell antigen 1 and 2 (SCCA1, SCCA2).
  • the psoriasis marker which is detected or measured is chosen as an example from the group consisting of markers having biological functions related to the response to stress and the immune and inflammatory response. .
  • the heat shock proteins 27 (beta 1)
  • the step of detecting a protein as a biological marker comprises identifying or determining the presence or absence of at least one protein.
  • This step may also include determining the amount or concentration, relative or not, of said marker, and / or the variation of these values with respect to a given or standard value, as well as the evolution over time of these values.
  • At least one skin sample for example a single sample, in particular of the upper layer of the epidermis (cornified stratum) is taken from a patient.
  • the sample is taken at a location showing clinical signs of skin pathology, such as inflammation.
  • the skin sample is taken from an inflamed part, it is preferred that the sample take place in the center of the plate so as to optimize the sampling.
  • different areas of the lesion can be removed to determine certain characteristics (evolutionary zone, highly scaly zone, zone with strong erythema, treated or untreated zone).
  • the sample is taken by affixing an adhesive to the patient's skin and then removing said adhesive to which a sample of stratum corneum adheres.
  • This adhesive is chosen so that a sufficient skin sample is taken.
  • This adhesive may advantageously consist of a translucent flexible plastic strip or not.
  • the adhesive is preferably disposed on a support, such as a flexible support and preferably foldable so as to be able to best adapt to the contours and the elasticity of the part of the body on which it is applied, which makes it possible to obtain a skin sample, and more particularly a stratum corneum, also complete as possible.
  • a support may consist for example of a plastic film.
  • this adhesive may be pellets of D-squames TM (Monaderm), Sebutape type.
  • Blenderm TM or ScotchTape TM (3M Company, St. Paul, Minn.), Or hydrogels such as those of the Hypan TM type (Hymedix International, Inc., Dayton, NJ.) , or any other type of material having adhesive properties such as glues, gums and resins.
  • the adhesive is applied repeatedly to the skin until it becomes tacky.
  • step a it is preferable to proceed on the cutaneous sample obtained in step a) to a step a ') of extraction of biological material.
  • This extraction step can be carried out by any extraction protocol, especially protein extraction, which are well known to those skilled in the art.
  • the invention thus particularly relates to a non-invasive method of collecting biological data useful for establishing a diagnosis or prognosis of a particular skin pathology in a patient, as previously described, in which the sample obtained in the sampling step a) is subjected to a biological material extraction step a '), then the detection step b) is performed on the extract thus obtained.
  • the skin sample may advantageously be subjected to an enzymatic digestion step prior to analysis by mass spectrometry.
  • This digestion step may advantageously be carried out by the use of trypsin.
  • more this digestion step can be advantageously carried out in situ directly on the support of the adhesive which allows to increase the speed of analysis and reduce the amount of sample needed and thus allow to reduce the sampling area and / or to make more accurate sampling.
  • the invention therefore particularly relates to a non-invasive method of collecting biological data useful for establishing a diagnosis or prognosis of a particular skin pathology in a patient as described above, in which the biological material contained in the cutaneous sample taken in step a) or obtained in step a ') is subjected to a step of enzymatic digestion a ") prior to analysis by mass spectrometry (step b)).
  • the mass spectrometric analysis methods described above may be used, in particular spectral analysis in tandem MS / MS or spectrometry MALDI-TOF.
  • the samples are placed in a tube (Eppendorf type) of 2 ml in the presence of a buffer solution (preferably ammonium bicarbonate pH 8.3) containing a reducing agent (preferably dithiothreitol) and a detergent compatible with the mass spectrometry analysis (preferably Rapigest TM, (Waters company)) for solubilizing the proteins and then an alkylating agent (preferably iodoacetamide) is added (step a ')).
  • a buffer solution preferably ammonium bicarbonate pH 8.3
  • a reducing agent preferably dithiothreitol
  • a detergent compatible with the mass spectrometry analysis preferably Rapigest TM, (Waters company)
  • an alkylating agent preferably iodoacetamide
  • the peptides are directly loaded onto a pre-concentration (C 18) LC Packing column coupled to the mass spectrometer (step b).
  • concentration is preferably carried out by a continuous gradient of water: acetonitrile mixture
  • the peptides are separated in a column (Atlantis TM) and then ionized at the column outlet in the "nanospray" source for analysis in the mass spectrometer.
  • the analysis of the mass spectra obtained is performed by a software allowing the interpretation of the mass spectra.
  • Such software is, for example, MASCOT software (Matrix Science) Spectrum MiIl (Agilent company), Phenyx (Genebio company), ProID (Applied Biosystems company). These programs can be linked to databases such as UNIPROT, SWISSPROT or alternatively TrEMBL.
  • step c) for separating the peptides before separation by nano-chromatography (step b) in order to better separate the peptides resulting from the enzymatic digestion.
  • This step is particularly recommended for complex mixtures and for the search for proteins present in small quantities.
  • This preliminary step may advantageously consist of a liquid chromatography (ion exchange) step.
  • the peptides derived from an enzymatic digestion with trypsin are thus absorbed at acidic pH on an ion exchange column (anionic) and then eluted by a continuous gradient of salt of increasing concentration or by a succession of solutions containing increasing amounts of salt.
  • Step The peptides thus eluted are directly (in line) absorbed on the pre-concentration column (C 18) and then chromatographed as described previously.
  • the preliminary separation step c) may advantageously comprise a step of iso-focusing (or iso-electro-focusing) of the peptides on a gel comprising a immobiline gradient immobilized on the support (gel).
  • This step is similar to the first protein separation step performed for two-dimensional protein analysis. The application of an electric current makes it possible to separate the peptides of different charges. The peptides after extraction of the gel are then directly chromatographed as indicated previously (nano-chromatography).
  • the proteomic analysis is performed from a sample taken from the skin by applying a D-Squames TM type adhesive (Monaderm company).
  • This product includes a flexible translucent polymer carrier and an adhesive.
  • the application is repeated on the skin of the patient, preferably until the loss of adhesion.
  • the sample obtained relates only to the content of the outermost layers of the epidermis (ie the
  • the samples thus obtained are stored at -30 ° C. or -80 ° C. if storage for a longer period is desired.
  • the sample obtained is incubated for 60 min in a 2 ml Eppendorf tube with constant stirring (at 1400 rpm) at 60 ° C. in 200 ⁇ l of a buffer solution of ammonium bicarbonate of pH 8.5 containing 0.1% RapiGest TM detergent (1 mg in 1000 ⁇ l) and 5 ⁇ M DTT (dithiothreitol). 15mM of iodoacetamine (IAA) (6 ⁇ l of a 0.5M solution) are then added and the mixture is incubated for 1h30 at room temperature in the dark.
  • IAA iodoacetamine
  • the sample is incubated with shaking (400 rpm) for 18 hours at 37 ° C. with 1 ⁇ l of a trypsin solution of porcine origin (1 mg / ml), then is acidified with 2% formic acid.
  • the digestion product is filtered using 0.22 ⁇ m and 30 kDa filters under centrifugation (12000 rpm). The filtrate is used directly for analysis by liquid chromatography coupled with Qstar-XL mass spectrometry analytical mode (LC / MS / MS).
  • Example 2 Determination of the presence of psoriasis markers that can be identified by non-invasive sampling of Stratum Corneum.
  • Such markers can be advantageously used in a method according to the invention.

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Abstract

L'invention se rapporte à une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que: a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif, b) on détecte par spectrométrie de masse dans ledit échantillon au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière. Une telle méthode est particulièrement adaptée pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic du psoriasis.

Description

Méthode non-invasive de recueil de données biologiques pour l'établissement d'un diagnostic d'une pathologie cutanée
L'invention a trait à l'utilisation de la spectrométrie de masse à partir d'un prélèvement cutané non invasif pour l'aide au diagnostic, au pronostic ou au suivi-thérapeutique des pathologies cutanées, telle que le psoriasis. L'invention concerne plus particulièrement une méthode d'analyse d'un échantillon des couches supérieures de l'épiderme. Les diagnostics des pathologies cutanées sont généralement pratiqués par biopsie ou par un examen local des symptômes cutanés, un tel examen impliquant l'évaluation visuelle des zones montrant une inflammation. Bien évidemment une méthode non-invasive, telle que l'examen visuel, est plus avantageuse que des biopsies en termes de coûts, de temps ainsi que de confort pour le patient. Cependant dans certains cas il est difficile de distinguer effectivement par simple examen visuel entre certaines pathologies de la peau, particulièrement certains désordres cutanés s 'accompagnant d'une hyper kératinisation (présence de squames abondants). Ainsi, des erreurs de diagnostic peuvent avoir lieu en particulier lorsque les pathologies en question ne présentent que des symptômes préliminaires ou peu développés. En cas d'erreur de diagnostic, le patient peut devoir faire face à une succession de traitements inefficaces, ce qui est bien sûr à éviter. Par ailleurs une succession de traitements inefficaces peut également avoir pour résultat l'abandon de tout traitement par le patient.
De plus, en matière de pathologie cutanée et en particulier de psoriasis, différents patients peuvent répondre de manière différente à un même traitement même si le diagnostic est correct. Généralement pour des pathologies cutanées, et en particulier le psoriasis, une période minimale d'environ deux semaines est nécessaire pour observer si le traitement montre des effets positifs. Ainsi il existe un besoin pour une méthode efficace, rapide et non-invasive permettant de déterminer la réponse d'un patient à un traitement particulier. Une telle méthode serait également d'un intérêt particulier lors d'études cliniques en permettant d'identifier rapidement la présence d'une réponse à un traitement donné et donc de réduire les coûts ainsi que de réduire l'implication de patients dans des traitements inefficaces.
Les méthodes utilisées à ce jour permettent d'identifier la présence, l'absence ou la variation de certains marqueurs sanguins ou cutanés mais ces méthodes se sont révélées à l'usage, peu efficaces ou difficiles à mettre en pratique. Ainsi la demande de brevet publiée sous le No. US2005/0221334A décrit une méthode utilisant des prélèvements cutanés effectués par l'utilisation d'un adhésif appliqué sur la peau. Cette méthode décrit ensuite le diagnostic de pathologies cutanées telles que l'eczéma ou le psoriasis par identification de l'ARN messager de certains marqueurs sur les échantillons prélevés. L'identification de l'ARN messager est effectuée par RT-PCR et « micro-array » (jeu ordonné d'échantillons). Cette procédure est longue et délicate à mettre en pratique particulièrement pour permettre l'identification de marqueurs. De plus, la présence ou l'absence de protéines (marqueurs) n'est pas nécessairement liée à la présence d'ARN messager codant pour ces protéines mais peut résulter de modifications post- traductionnelles (glycosylation ou déglycosylation, glycation, oxydation, phosphorylation...) ou être liée au devenir de ces protéines tel que par exemple l'hydrolyse enzymatique. Cette hydrolyse par l'action de protéases endogènes peut conduire à l'apparition de formes matures ou à la disparition de certains marqueurs. Ces événements sont particulièrement importants dans les couches épidermiques. Ces modifications biochimiques peuvent signer un état épidermique (désordre) qui ne peut être observé que par la détection et l'identification des protéines par notamment l'analyse protéomique.
La demande de brevet WO2007/96846 décrit une méthode d'évaluation de la peau par mesure des métabolites d'échantillons de peau. Cette méthode permet de suivre les métabolites de la surface cutanée, qui sont les conséquences et non pas les acteurs des réactions biochimiques survenues au niveau de la peau. Les techniques développées dans cette demande sont spécifiques à l'analyse du métabolome et ne sont pas adaptée à l'analyse du protéome. L'homme du métier ne peut extrapoler cette méthode d'évaluation du métabolome à l'identification de marqueurs protéiques. L'identification du contenu protéique et son analyse protéomique permet de suivre des marqueurs spécifiques d'une pathologie cutanée et d'orienter le diagnostic. De plus, la plupart des cibles thérapeutiques sont de nature protéique, ce qui renforce l'intérêt de découvrir, d'identifier et de suivre les protéines à la surface de la peau grâce à une méthode spécifique à celles-ci. L'identification de protéines en amont du métabolome est donc fondamentale pour la caractérisation de la réponse tissulaire.
Il existe donc un besoin d'une méthode permettant de déterminer de manière rapide, non- invasive et peu coûteuse la présence, l'absence ou la variation de certains marqueurs protéomiques, indétectables par des technologies comme la RT-PCR, indiquant la présence de pathologies cutanées particulières. Si diverses méthodes pour identifier des marqueurs de pathologies cutanées existent dans l'art antérieur, ces méthodes sont soit longues et coûteuses soit d'une sensibilité insuffisante ou encore requièrent d'effectuer une opération d'ordre invasive telle qu'un prélèvement sanguin ou une biopsie cutanée ce qui est souvent douloureux et traumatique pour le patient.
La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant une nouvelle méthode fiable, rapide et non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée telle que le psoriasis.
Un aspect de l'invention concerne donc une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif, b) on détecte par spectrométrie de masse dans l'échantillon cutané obtenu en a) au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière.
La spectrométrie de masse (MS pour « Mass Spectrography ») est déjà utilisée dans l'identification de mélanges complexes de composés chimiques et de molécules d'origine biologique. Contrairement aux outils classiquement utilisés comme les puces ou la technique ELISA, cet outil permet de visualiser de nouveaux marqueurs, de nouvelles protéines non encore identifiées et ceci par une méthode ayant une meilleure sensibilité.
Brièvement, le principe de base de l'analyse par spectrométrie de masse est la mesure du rapport masse/charge électrique d'espèces ioniques qui ont été créées par ionisation de l'échantillon à analyser et sur lesquelles sont appliqués des champs électriques et magnétiques. Une des méthodes d'ionisation le plus fréquemment utilisées dans le cas d'échantillons d'origine biologique est l'électro- nébulisation, connue sous le nom d' « ElectroSpray » (ES), qui génère des ions multichargés et permet l'utilisation d'analyseurs conventionnels peu onéreux comme les quadripôles. La source d'ionisation pour l'electrospray peut être multiple, et en particulier permet d'offrir une bonne sensibilité pour un faible débit. Une autre méthode d'ionisation fréquemment utilisée est la désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice, connue sous le nom de
MALDI-TOF qui est une méthode d'ionisation bien adaptée aux analyseurs par temps de vol (MALDI pour « Matrix Assisted Laser Désorption and Ionisation » et TOF pour « Time ofFHght »).
Le rapport masse/charge électrique se mesure de différentes manières, comme par exemple par la mesure de la déviation standard des espèces ionisées (« Sector MS ») ou la mesure du temps de vol (« TOF MS »). Aujourd'hui les méthodes d'analyse sont variées et comprennent par exemple des analyseurs de masse quadripolaire ou quadripôle (QMS), des analyseurs de masse quadripolaire à piège ionique (QIT), des analyseurs par spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier (FTICR). De tels analyseurs ainsi que leurs méthodes d'utilisation sont bien connues.
La méthode appelée spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) est l'association de plusieurs analyseurs qui permet la sélection d'un ion particulier puis l'identification de ses fragments en intercalant successivement des étapes de séparation de masses avec des étapes de fragmentation. Ainsi un analyseur en tandem peut isoler un peptide résultant de l'hydrolyse par la trypsine, des fragments de protéines ou une protéine d'un mélange complexe, puis le stabiliser pour permettre sa fragmentation (par exemple au moyen d'un gaz ou d'une autre méthode connue) et cataloguer les fragments ainsi produits. L'utilisation de banques de données permet alors l'identification des protéines présentes dans l'échantillon.
De façon préférentielle, la méthode selon l'invention utilise la technique de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Si l'on désire procéder à l'identification d'un mélange complexe de protéines, il est avantageux de procéder tout d'abord à une étape de fractionnement. Une première méthode de fractionnement permet de séparer des protéines entre elles par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide. Une deuxième méthode consiste à utiliser la chromatographie en phase liquide (LC pour « Liquid Chromatography »), pour séparer les protéines avant de leur faire subir une hydrolyse enzymatique (en général par la trypsine). Les peptides (hydrolysât) sont ensuite introduits dans le spectromètre de masse. Ces deux techniques peuvent avantageusement être combinées. La chromatographie en phase liquide utilisée en combinaison avec un spectromètre de masse diffère de la chromatographie en Phase Liquide à Haute Performance (HPLC pour « High
Performance Liquid Chromatography »), plus généralement utilisée, principalement par les dimensions des colonnes utilisées et donc par leurs débits. Ainsi le diamètre des colonnes utilisées est le plus souvent de lmm (en contraste avec des diamètres moyens de 4.6mm pour des colonnes HPLC). Plus récemment des diamètres de 300μm et même des colonnes de type capillaires de diamètres de 75 μm sont devenus prépondérantes.
Dans le cas de ces colonnes, les débits sont proches de lOOnL/min. Ces colonnes sont généralement utilisées avec des sources d'ionisation nanospray qui offre une meilleure sensibilité. Une source particulièrement utilisée selon l'invention est une source « nanospray » telle que celle commercialisée sous le nom de Nanospray™ par la société Applied Biosystems, utilisant des aiguilles Picotip emitter™, SilicaTip, et couplée à un spectromètre de masse de type LC/MS/MS tel que celui commercialisé sous la marque de Qstar XL™ T par la société Applied Biosystems.
En particulier, l'analyse par spectrométrie de masse utilisée selon l'invention comprend une étape de séparation par chromatographie en phase liquide associée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Les taches obtenues par électrophorèse bidimensionnelle correspondent généralement à une seule protéine. Pour identifier celle-ci le gel contenant la tache est excisé et soumis à une protéolyse enzymatique. L'enzyme la plus fréquemment utilisée est la trypsine.
Pour procéder à l'identification des protéines isolées, on utilise la technique de cartographie peptidique (« peptide mass fingerprinting ») par laquelle on compare les masses des peptides obtenus à une liste de référence sur banques de données qui contient la liste des masses des peptides résultant de la digestion de protéines connues. Si les données expérimentales correspondent à une liste donnée, il existe une grande probabilité que la protéine soit présente dans l'échantillon de départ.
L'analyse en mode MS/MS (tandem) est particulièrement recommandée afin d'obtenir une information sur la séquence peptidique et ainsi évaluer la pertinence de l'identification préalable de la protéine (validation). L'analyse en tandem consiste à isoler puis fragmenter les ions peptidiques dans une chambre de collision. Dans cette méthode, le lieu de fragmentation est particulièrement localisé aux liaisons peptidiques. Après fragmentation, les spectres de masse résultants sont comparés par des logiciels à des informations de référence contenues dans des banques de données pour identification des protéines.
Alternativement et préférentiellement, il est également possible d'effectuer directement la protéolyse enzymatique du mélange de protéines puis de séparer les peptides obtenus par digestion enzymatique ou les peptides endogènes par nanochromatograhie avant l'analyse par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
Ainsi à titre d'exemple les peptides peuvent être préalablement concentrés sur une précolonne en milieu acide (C 18, pepMap 100, 5μm, 100 A, 300μm i.d.x 5mm), montée sur une chaîne nano chromatographie « LC packing » (société Dionex). Les peptides sont ensuite chromatographiés sur une colonne de C18, 3μm, 75xl50mm, Atlantis™ (société Waters), l'élution progressive des peptides étant réalisée à l'aide d'un gradient (acétonitrile/eau) couplé directement à la source du spectromètre de masse. L'analyse en mode SM/SM est particulièrement recommandée pour l'identification de protéines à partir de mélanges complexes.
Au sens de la présente invention le terme « marqueur biologique» désigne une molécule biologique associée à la présence ou à l'absence d'un état pathologique particulier, il s'agit plus particulièrement d'une protéine. Par « valeur standard », on entend la quantité ou la concentration moyenne de marqueur biologique présente chez les individus sains.
La méthode selon l'invention peut avoir diverses applications. Non seulement elle peut être utile pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic mais elle peut également être utile pour l'étude ou l'observation de l'évolution de pathologies cutanées ou de l'effet de traitements particuliers ainsi que pour permettre de réaliser un pronostic sur l'efficacité de tel ou tel traitement.
Selon un aspect préférentiel de la méthode selon l'invention, cette méthode est utilisée pour déterminer l'existence d'une réponse positive à l'administration d'un traitement particulier en identifiant une variation significative de la présence d'un marqueur particulier. Une telle utilisation permet de déterminer plus rapidement l'efficacité d'un traitement particulier qu'en attendant d'observer visuellement une évolution des symptômes. Elle permet également de réduire ainsi les coûts associés à des études thérapeutiques de nouveaux médicaments.
La maladie de la peau, ou pathologie cutanée, concernée par la méthode de l'invention peut être toute pathologie cutanée. Celle-ci est de préférence une maladie de type inflammatoire et/ou auto immune ou allergique.
Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention la pathologie cutanée est le psoriasis et le marqueur à identifier est avantageusement un marqueur des lésions psoriasiques cutanées.
Le psoriasis est une maladie de la peau d'origine mal connue, en partie génétique qui touche 2% de la population. L'épiderme se renouvelle trop rapidement, en seulement quatre à six jours, au lieu des trois semaines habituelles ce qui génère des inflammations localisées. Les cellules épidermiques s'accumulent à la surface de la peau et forment une couche de pellicules blanches appelées squames. Parfaitement inoffensives, celles-ci ont pourtant le désavantage d'être inesthétiques.
Dans sa forme bénigne, le psoriasis se limite au cuir chevelu, aux ongles, aux genoux, aux coudes, aux pieds, aux mains et, parfois, aux organes génitaux. Dans les cas graves, il s'étend et peut gagner la totalité du corps. Le psoriasis comprend diverses formes symptomatiques telles que le psoriasis en plaque, la guttate psoriasis, le psoriasis pustulaire, le psoriasis inverse, le psoriasis érythrodermique et l'arthrite psoriatique. Il est toutefois possible de maîtriser le psoriasis, de diminuer l'étendue des lésions et d'améliorer la vie des patients par certains traitements.
De préférence selon l'invention, le marqueur de psoriasis qui est détecté ou mesuré est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la prolifération et la différentiation cellulaires. On peut notamment citer la stratifine, la protéine apparentée a la calmoduline spécifique de l'épiderme 5 (CLSP), la protéine liant les acide gras associée au psoriasis, la desmoplakine ; la psoriasine (SlOO A7) et l'alpha enolase, l'antigène 1 et 2 de cellule de carcinome (SCCAl, SCCA2). Selon un autre mode préféré de l'invention, le marqueur de psoriasis qui est détecté ou mesuré est choisi à titre d'exemple dans le groupe constitué par des marqueurs ayant des fonctions biologiques liées à la réponse au stress et à la réponse immune et inflammatoire. On peut notamment citer les protéines de choc thermique 27 (beta 1),
70.1, et 90, la Calgranuline A et B.
Selon la méthode de l'invention, l'étape de détection d'une protéine comme marqueur biologique, comprend l'identification ou la détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une protéine. Cette étape peut éventuellement également comprendre la détermination de la quantité ou de la concentration, relative ou non, dudit marqueur, et/ou de la variation de ces valeurs par rapport à une valeur donnée ou standard ainsi que l'évolution dans le temps de ces valeurs. Bien qu'il soit présentement considéré plus avantageux pour des raisons de simplicité de mise en pratique de simplement déterminer la présence d'un marqueur particulier, l'invention s'étend également à la détermination de quantités, relatives ou non, de marqueurs particuliers ainsi qu'à l'étude de l'évolution de la concentration de plusieurs marqueurs.
Selon la méthode de l'invention, au moins un échantillon de peau, par exemple un seul échantillon, en particulier de la couche supérieure de l'épiderme (le stratum corneuni) est prélevé sur un patient. De préférence l'échantillon est prélevé à un endroit montrant des signes cliniques d'une pathologie cutanée, telle qu'une inflammation. Cependant il peut être avantageux de prélever également un échantillon sur de la peau apparemment non atteinte, particulièrement pour des études comparatives et/ou pour confirmer les résultats de l'analyse. Lorsque l'échantillon cutané est prélevé sur une partie inflammée, il est préféré que le prélèvement ait lieu au centre de la plaque de manière à optimiser le prélèvement. Cependant, différentes zones de la lésion peuvent être prélevées afin de déterminer certaines caractéristiques (zone évolutive, zone fortement squameuse, zone présentant un fort érythème, zone traitée ou non traitée).
Avantageusement le prélèvement est effectué par l'apposition d'un adhésif sur la peau de patient puis par le retrait dudit adhésif auquel un échantillon de stratum corneum adhère. Cet adhésif est choisi de manière qu'un échantillon de peau suffisant soit prélevé. Cet adhésif peut être avantageusement constitué d'une bande de plastique souple translucide ou non. L'adhésif est préférablement disposé sur un support, tel qu'un support souple et de préférence pliable de manière à pouvoir s'adapter au mieux aux contours et à l'élasticité de la partie du corps sur laquelle il est appliqué ce qui favorise l'obtention d'un échantillon de peau, et plus particulièrement de stratum corneum, aussi complet que possible. Un tel support peut être constitué par exemple d'un film de plastique. Par exemple cet adhésif peut être des pastilles de type D-squames™ (Monaderm), Sebutape
™ (CuDerm Corporation, Dallas, Tex.), Blenderm™ ou ScotchTape ™ (3M Company, St. Paul, Minn.), ou bien des hydrogels comme ceux de type Hypan TM (Hymedix International, Inc., Dayton, NJ.), ou tout autre types de matériaux ayant des propriétés adhésives comme les colles les gommes et les résines.
Selon un aspect préféré de la méthode, l'adhésif est appliqué d'une manière répétée sur la peau jusqu'à perte de son adhésivité. Alternativement il est également envisagé de n'utiliser qu'une seule application de l'adhésif ou d'utiliser plus d'un adhésif pour constituer l'échantillon à analyser. Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, il est cependant possible de ne procéder qu'à une seule application et de n'utiliser qu'un seul adhésif pour obtenir des résultats directement exploitables, c'est à dire contenant suffisamment de matériel biologique.
Il est préférable de procéder sur l'échantillon cutané obtenu à l'étape a) à une étape a') d'extraction de matériel biologique. Cette étape d'extraction peut être réalisée par tout protocole d'extraction, notamment d'extraction de protéines, qui sont bien connues de l'homme du métier.
L'invention concerne donc notamment une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, telle que précédemment décrite, dans laquelle l'échantillon obtenu à l'étape de prélèvement a) est soumis à une étape d'extraction de matériel biologique a'), puis l'étape de détection b) est effectuée sur l'extrait ainsi obtenu.
Alternativement ou de façon additionnelle, l'échantillon de peau peut avantageusement être soumis à une étape a") de digestion enzymatique préalablement à l'analyse par spectrométrie de masse. Cette étape de digestion peut être avantageusement effectuée par l'utilisation de trypsine. De plus cette étape de digestion peut être avantageusement effectuée in situ directement sur le support de l'adhésif ce qui permet d'augmenter la vitesse d'analyse et de réduire la quantité d'échantillon nécessaire et ainsi de permettre de réduire la zone de prélèvement et/ou d'effectuer des prélèvements plus précis. L'invention concerne donc notamment une méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient telle que précédemment décrite, dans laquelle le matériel biologique contenu dans l'échantillon cutané prélevé à l'étape a) ou obtenu à l'étape a') est soumis à une étape de digestion enzymatique a") préalablement à l'analyse par spectrométrie de masse (étape b)).
Pour effectuer l'analyse et déterminer la présence de marqueur(s) biologique(s), les méthodes d'analyses par spectrométrie de masses décrites ci-dessus peuvent être utilisées, en particulier l'analyse spectrométrique en tandem MS/MS ou la spectrométrie MALDI- TOF. Selon un aspect particulier de l'invention il est préféré d'utiliser une étape de chromatographie en phase liquide, et plus particulièrement la nano-chromatographie, associée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) car cette méthode, qui permet une première séparation des mélanges complexes, est particulièrement efficace, rapide et sensible.
De préférence, les échantillons sont placés dans un tube (de type Eppendorf) de 2ml en présence d'une solution tampon (de préférence du bicarbonate d'ammonium pH 8.3) contenant un réducteur (de préférence du dithiothréitol) et un détergent compatible avec l'analyse en spectrométrie de masse (de préférence Rapigest™ , (société Waters)) permettant de solubiliser les protéines puis un agent alkylant (de préférence de l'iodoacétamide) est ajouté (étape a')). La digestion par la trypsine des protéines est de préférence directement effectuée dans le tube contenant l'échantillon, à 37°C, sous agitation (étape a")). Le digeste est ensuite filtré sur 0.22μm puis 30 kDa afin de supprimer les débris cellulaires et les protéines non digérées. Après acidification, les peptides sont directement chargés sur une colonne de pré- concentration (C 18) « LC Packing » couplée au spectromètre de masse (étape b)). L'élution de la colonne de pré- concentration est préférentiellement réalisée par un gradient continu de mélange eau:acétonitrile, les peptides sont séparés dans une colonne (Atlantis™) puis ionisés en sortie de colonne dans la source « nanospray » pour analyse dans le spectromètre de masse. L'analyse des spectres de masse obtenus est effectuée par un logiciel permettant l'interprétation des spectres de masse. De tels logiciels sont par exemple les logiciels MASCOT (société Matrix Science) Spectrum MiIl (société Agilent), Phenyx (société Genebio), ProID (société Applied Biosystems). Ces logiciels peuvent être couplés à des banques de données comme UNIPROT, SWISSPROT ou alternativement TrEMBL.
Il peut être préférable d'ajouter une étape c) de séparation des peptides avant la séparation par nano chromatographie (étape b)) afin de mieux séparer les peptides issus de la digestion enzymatique. Cette étape est particulièrement recommandée pour des mélanges complexes et pour la recherche de protéines présentes en faible quantité. Cette étape préliminaire peut être avantageusement constituée d'une étape de chromatographie en phase liquide (échangeuse d'ion). Les peptides provenant d'une digestion enzymatique par la trypsine sont ainsi absorbés à pH acide sur une colonne échangeuse d'ion (anionique) puis élues par un gradient continu de sel de concentration croissante ou par une succession de solutions contenant des quantités croissantes de sel (« step »). Les peptides ainsi élues sont directement (en ligne) absorbés sur la colonne de pré concentration (C 18) puis chromatographiés comme décrit précédemment.
Alternativement l'étape de séparation préliminaire c) peut avantageusement comprendre une étape d'iso-focalisation (ou iso-électro-focalisation) des peptides sur un gel comprenant un gradient d'immobiline immobilisée sur le support (gel). Cette étape est similaire à la première étape de séparation des protéines réalisée pour l'analyse bidimensionnelle des protéines. L'application d'un courant électrique permet de séparer les peptides de charges différentes. Les peptides après extraction du gel sont ensuite directement chromatographiés comme indiqué précédemment (nano chromatographie).
Dans le cas de ces deux alternatives (échangeuse d'ion ou iso-focalisation), l'analyse de l'ensemble des spectres de masse doit être effectuée en une seule étape afin d'identifier les différents peptides présents dans les différentes fractions chromatographiées et pouvant appartenir à une même protéine.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux des exemples qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatifs. Exemple 1 : Analyse protéomique d'un échantillon de Stratum Corneum obtenu par application d'un ruban adhésif.
a) Obtention d'un échantillon
L'analyse protéomique est effectuée à partir d'un échantillon prélevé sur la peau en appliquant un adhésif de type D-Squames™ (société Monaderm). Ce produit comprend un support translucide souple en polymère et un adhésif. L'application est répétée sur la peau du patient, préférentiellement jusqu'à perte de l'adhésion. L'échantillon obtenu ne porte que sur le contenu des couches les plus externes de l'épiderme (c'est à dire le
Stratum Corneum). Les échantillons ainsi obtenus sont stockés à -300C ou à -800C si un stockage pour une période plus longue est désiré.
a') et a") Analyse protéomique: digestion
a') Extraction du matériel biologique :
L'échantillon obtenu est incubé pendant 60min dans un tube Eppendorf de 2ml sous agitation constante (à 1400rpm) à 600C dans 200μl d'une solution tampon de bicarbonate d'ammonium de pH 8.5 contenant 0.1% de détergent RapiGest™ (lmg dans lOOOμl) et 5μM de DTT (dithiothréitol). Puis on ajoute 15mM d'iodoacetamine (IAA) (6μl d'une solution à 0,5M) et on laisse incuber lh30min à température ambiante dans le noir.
a") Digestion enzymatique :
Puis l'échantillon est incubé sous agitation (400 rpm) 18h à 37°C avec lμl d'une solution de trypsine d'origine porcine (lmg/ml), puis est acidifié avec de l'acide formique à 2%
(4μl d'une solution à 10%). Le produit de digestion est filtré par utilisation de filtres de 0,22μm et 3OkDa sous centrifugation (12000rpm). Le filtrat est utilisé directement pour analyse par chromatographie en phase liquide couplé à de la spectrométrie de masse Qstar-XL mode d'analyse (LC/MS/MS).
b) Analyse protéomique : LC/MS/MS
II est préféré d'utiliser la méthode de chromatographie en phase liquide, et plus particulièrement la nano chromatographie, associée à de la spectrométrie de masse en mode tandem (MS/MS). L'analyse des spectres de masse obtenus est effectuée par le programme MASCOT pour l'identification des peptides et des protéines avec les spécifications suivantes :
Recherche en mode MS/MS, Type d'instrument : ESI-QUAD-TOF,
Digestion trypsine,
Modification des protéines apportées : carbamidomethyl (sur les cystéines),
Monoisotope,
Pas de tolérance sur la masse de la protéine, Tolérance sur la masse peptidique de +/- 0.15Da, Tolérance sur la masse des ions fils (fragmentation): +/- 0. IDa,
Absence de clivage toléré de 1 ,
Recherche sur SwissProt, banque de donnée : humaine (Homo Sapiens). Ce programme est un moteur de recherche notamment disponible sur le site Internet www.matrixscience.com.
Exemple 2 : Détermination de la présence de marqueurs de psoriasis pouvant être identifiés par prélèvement non invasif de Stratum Corneum.
(identification par LC/MS/MS)
Par comparaison entre les protéines identifiées présentes seulement dans les squames psoriasiques (ou fortement présentes par rapport aux squames de sujets sains) et les marqueurs biologiques connues de lésions psoriasiques, il apparaît que la présence de marqueurs suivants a été identifiée :
De tels marqueurs peuvent être avantageusement utilisés dans une méthode selon l'invention.

Claims

Revendications
1) Méthode non-invasive de recueil de données biologiques utiles pour l'établissement d'un diagnostic ou d'un pronostic d'une pathologie cutanée particulière chez un patient, caractérisée en ce que: a) on prélève un échantillon cutané contenant du matériel biologique, par application sur la peau dudit patient d'une couche d'adhésif, puis par retrait dudit adhésif, b) on détecte par spectrométrie de masse dans l'échantillon cutané obtenu en a) au moins une protéine dont la présence, l'absence, ou la variation de quantité ou de concentration par rapport à une valeur standard est associée à la présence, à l'évolution ou à l'absence d'une pathologie cutanée particulière.
2) Méthode selon la revendication 1 dans laquelle la pathologie cutanée est le psoriasis.
3) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 dans laquelle l'échantillon cutané obtenu en a) est soumis à une étape a') d'extraction de matériel biologique, puis l'étape de détection b) est effectuée sur l'extrait ainsi obtenu.
4) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans laquelle le matériel biologique contenu dans l'échantillon cutané prélevé à l'étape a) ou extrait à l'étape a') est soumis à une étape a") de digestion enzymatique préalablement à l'étape b).
5) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle la technique de spectrométrie de masse utilisée est la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
6) Méthode selon la revendication 5 dans laquelle l'analyse par spectrométrie de masse comprend une étape de séparation par chromatographie en phase liquide, associée à de la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).
7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle la protéine est un marqueur des lésions psoriasiques cutanées. 8) Méthode selon la revendication 7 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la prolifération et la différentiation cellulaires.
9) Méthode selon la revendication 8 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par la stratifine, la protéine apparentée à la calmoduline spécifique de l'épiderme 5, la protéine liant les acide gras associée au psoriasis, la desmoplakine, la psoriasine, l'alpha enolase, et l'antigène 1 et 2 de cellule de carcinome.
10) Méthode selon la revendication 7 dans laquelle ledit marqueur est choisi dans le groupe constitué par des protéines ayant des fonctions biologiques liées à la réponse au stress et à la réponse immune et inflammatoire.
11) Méthode selon la revendication 10 dans laquelle le marqueur est choisi dans le groupe constitué par les protéines de choc thermique 27 (beta 1), 70.1, et 90, et la Calgranuline A et B.
12) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans laquelle un seul échantillon est prélevé.
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