EP2217708A1 - Maïs presentant une tolerance accrue aux maladies fongiques - Google Patents

Maïs presentant une tolerance accrue aux maladies fongiques

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EP2217708A1
EP2217708A1 EP08853030A EP08853030A EP2217708A1 EP 2217708 A1 EP2217708 A1 EP 2217708A1 EP 08853030 A EP08853030 A EP 08853030A EP 08853030 A EP08853030 A EP 08853030A EP 2217708 A1 EP2217708 A1 EP 2217708A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
allele
maize
corn
gene
ncimb
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08853030A
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German (de)
English (en)
Inventor
Alain Murigneux
Jean-Pierre Martinant
Christophe Tatout
Bruno Grezes-Besset
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogemma SAS
Original Assignee
Biogemma SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Biogemma SAS filed Critical Biogemma SAS
Publication of EP2217708A1 publication Critical patent/EP2217708A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/1245—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance
    • A01H1/1255—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
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    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4684—Zea mays [maize]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • the present invention relates to the field of maize improvement, in particular the improvement of maize digestibility, and the tolerance of maize to fungal pathogens and in particular to Fusarium wilt.
  • the present invention more specifically relates to the development of a particular allele of the CCoAOMT2 gene in corn.
  • the presence of this allele results in an improvement of the digestibility (increased digestibility) and the tolerance to Fusarium wilt compared to an isogenic corn that does not have the allele.
  • the amount of lignin present in the plant is also decreased.
  • Lignin is one of the two major components of the plant wall with cellulose.
  • the plant wall consisting mainly of cellulose, hemicellulose and lignin provides the cell a natural barrier against the outside.
  • Many studies have shown that one of the responses to biotic stresses (pathogenic attacks) or abiotic (drought, wind ...) consists of a reinforcement of the plant wall, in particular with a higher lignin content.
  • many agronomic or industrial sectors have their yields directly related to the lignin content and / or composition of the wall, including the paper industry, fuel production (notably biomass for biofuels) or production. silage.
  • the quality of silage corn can be improved by lowering the lignin content or modifying the composition.
  • Corn silage is an interesting feed: the yield in the field is relatively high, harvesting and storage are easy, the nutritional qualities are stable and can easily be supplemented with other feed silages or feedcakes. soy.
  • An experiment conducted by Emile (1995, Annales de zootechnie) shows that feeding livestock with a more digestible corn can increase daily milk production and weight gain compared to a diet with a less digestible corn. Optimizing the qualities of corn silage thus to increase the net energy provided by this type of diet by improving its digestibility and thus by decreasing the lignin content.
  • the selection or obtaining of more digestible maize plants, in particular with modified lignin biosynthesis pathway is one of the preferred axes of improvement of maize.
  • the selected plants should have good yields and be insensitive to the various stresses
  • maize is subject to attack by many pathogens.
  • pathogens we can mention viruses, bacteria, but also fungal pathogens, responsible for many diseases, and sometimes the presence of mycotoxins.
  • maize can be attacked by fungi responsible for fusariosis (due to Fusarium, including F. roseum, F. gramninearum, F. liseola, F. monoliform), coal (common or inflorescences, from to Ustilago zeae, Ustilago maydis), anthracnose (Colletotrichum graminicold), kabatiellosis, helminthosporiosis (Helminthosporium turcicum), rust (Puccinia maydis), late blight.
  • fungal attacks are responsible for drying and / or rotten plants, which are localized differently depending on the pathogen.
  • Mushrooms of the genus Fusarium are responsible for Fusarium wilt.
  • F. graminearum species and F. moniliforme maize pathogens the importance of which varies with climatic conditions and the early maturity of maize varieties.
  • Fusarium head blight can be distinguished from Fusarium wilt, the infectious processes being very different.
  • Some pathogens, however, are common to both types of Fusarium.
  • Several modes of contamination of the plant by the fungus are known, such as the penetration of infective mycelium into the plant by lesions due to insects and birds, or the direct penetration of the bristles of the spike leading to infection. seeds. In the case of Fusarium wilt, contamination can also occur via seeds or, more rarely, roots.
  • Fusarium head blight which causes grain destruction, reduces the yield of corn crops.
  • the pathogens in question are otherwise very damaging because they accumulate in kernels destroyed or not different mycotoxins (Zearalenone, Deoxynivalenol, Fumonisins), which have varying levels of toxicity depending on the animal species and are difficult to eliminate.
  • Fungicide treatments are difficult to use and have only a limited effect against Fusarium.
  • the best way to fight Fusarium head blight is the use of genetic resistance. Few hybrids currently possess such resistance, which, when it exists, is a partial resistance that remains moderate. It is therefore important to identify methods to increase fungal disease tolerance in maize.
  • the present application shows that the presence of the G2092 allele of the CCoAOMT2 corn gene makes it possible to obtain a corn that is both more digestible and has a better tolerance to fungal diseases, and in particular Fusarium wilt. This maize is also resistant to fungal diseases caused by fungal pathogens such as those described above.
  • the G2092 allele is an insertion mutant in the CCoAOMT2 gene of the phenylpropanoid pathway, and more particularly the lignin biosynthesis pathway.
  • This pathway of phenylpropanoids leads, from phenylalanine, to the synthesis of a wide variety of substances such as anthocyanins, isoflavonoids, stilbenes, esters of hydroxycinnamic acids, or lignin.
  • Lignin provides rigidity to cell walls and impermeability to conductive tissue.
  • CCoAOMT Caffeoyl Coenzyme-A O-Methyl Transferase
  • CCoAOMTl gene (GenBank AJ242980), located on chromosome 6
  • CCoAOMT2 gene (GenBank AJ242981, SEQ ID No. 2), located on chromosome 9.
  • Patent applications WO9910498 and WOO134817 relate, inter alia, to the corn CCoAOMT1 gene.
  • the purpose of the present application is to provide a skilled artisan with corn that does have improved digestibility and increased tolerance to fungal pathogens by developing a favorable allele of CCoAOMT2 (referred to as G2092). insertion of a transposon having been carried out after nucleotide 1186 in the gene represented by SEQ ID No. 1, which corresponds to the genomic DNA for this enzyme.
  • the application also describes a method for obtaining a corn having increased tolerance to a fungal pathogen, comprising introgressing the G2092 allele thus identified in said corn.
  • the sequence of a cDNA (GenBank AJ24981) is represented by SEQ ID NO: 2, the coding portion extending from nucleotides 70 to 865 for this sequence. It is clear that these sequences are given only as examples, and that the skilled person is able to identify himself the genomic and / or mRNA sequences of CCoAOMT2 for different varieties of corn. , especially in the GenBank database (sequences AY279004 to AY279035) or in Guillet-Claude et al (2004, op.cit.)
  • GenBank database sequences AY279004 to AY279035
  • the corn according to the invention has a quantitative and / or qualitative alteration of lignin synthesis, as well as a better tolerance to fungal pathogens.
  • Quantitative alteration of the lignin synthesis is meant a decrease in the amount of lignin in the modified maize according to the invention compared to a normal maize (unmodified control according to the invention), evaluated, for example by measuring Klason lignin or lignin obtained by acid detergent (lignin detergent acid) according to methods well known in the art (see for example Jung et al., J. Agric Food Chem., 1999 May; 47 (5): 2005-8 Jung et al., J. Dairy Sci., 1997 Aug; 80 (8): 1622-8).
  • lignin synthesis is meant a modification in the composition of the lignin of the plant modified according to the invention with respect to a control plant (not modified according to the invention), for example a variation of ratio of subunits S / G, or a change in the quality of ferulic acid.
  • Methods for qualitative analysis of lignin are also known in the art. We can notably mention the NMR.
  • Fusarium preferentially selected from F. graminearum, F. liseola, F. rosum and
  • F. monoliform. Maize also has a tolerance to the other fungal pathogens mentioned above, and in particular to pathogens of the genus
  • the invention particularly relates to a corn plant, or a corn kernel having said G2092 allele.
  • the invention also relates to a maize or maize grain having both the G2092 allele and an allele of the CCR1 gene, designated ⁇ 3318, said ⁇ 3318 allele being present in a representative sample of seeds deposited at NCIMB under the number NCIMB 41236 on 23 July 2004, in accordance with the provisions of the Treaty of Budapest.
  • This ⁇ 3318 allele is described in application WO 2006/035045.
  • the invention also relates to a maize or maize grain having both the G2092 allele and an allele of the C4H gene, designated D1938, said D1938 allele being present in a representative sample of seeds deposited at NCIMB under the number NCIMB 41507 on 15 October 2007, in accordance with the provisions of the Treaty of
  • the invention also relates to a maize or maize grain having both the G2092 allele, the CCR1 gene allele designated ⁇ 3318 and the C4H gene allele designated D1938.
  • the corn according to the invention is an "elite" corn.
  • elite maize is corn intended to produce hybrids intended to be marketed by crossing with another elite maize.
  • An elite maize is defined as such in relation to the territory envisaged for marketing, as well as the agronomic character (s) sought for hybrid offspring. This includes a corn that can be included in a reference catalog.
  • the offspring is intended for human or animal consumption, for example a grain yield or a yield per hectare and a good digestibility, respectively, when the "elite maize" nature is evaluated.
  • hybrids obtained from it are compared to commercial reference hybrids (sold for the same purpose in the same region), field trials, survey surveys, and control measures. agronomic traits appropriate to the objective sought.
  • a corn is defined as elite if the results obtained parameters studied for a hybrid obtained by crossing said maize are greater than 90% to the results recorded for the same parameters of the reference hybrids.
  • an elite maize is a corn gathering the maximum of agronomic characteristics necessary for an economic penetration of the target market.
  • character evaluation Maize elite is also achieved by the ability of the maize to combine / produce hybrids.
  • the present invention relates preferentially to an elite corn intended for the marketing of hybrids for animal feed and silage, presenting the G2092 allele.
  • This elite maize is homozygous for Palland G2092.
  • the invention in another embodiment, relates to a hybrid maize obtained by crossing two homozygous parent lines, said hybrid maize having a G2092 allele.
  • This hybrid maize can be homozygous (if each homozygous parent has the G2092 allele) or heterozygous for the G2092 allele.
  • the invention also relates to corn or maize grain containing one or more transgenes in addition to the G2092 allele. Mention may be made of transgenes conferring male sterility, male fertility, resistance to a herbicide (in particular glyphosate, glufosinate, imidazolinone, sulfonylurea, L-phosphinotricin, triazine, benzonitrile), insect resistance (especially a transgene encoding a Bacillus thu ⁇ ngiensis toxin), tolerance to water stress. These maize can be obtained by crossing a corn containing the G2092 allele with a corn containing said transgene.
  • glyphosate glyphosate, glufosinate, imidazolinone, sulfonylurea, L-phosphinotricin, triazine, benzonitrile
  • insect resistance especially a transgene encoding a Bacillus thu ⁇ ngiensis to
  • the present invention also provides those skilled in the art with the means to select corn plants having improved fungal pathogen tolerance characteristics. It suffices to carry out a PCR, or a Southern blot (genomic DNA hybridization on membrane) to monitor the presence of the insertion in the last exon of the gene coding for CCoAOMT2. Those skilled in the art can easily determine the primers and probes for identifying the presence of the G2092 allele.
  • the invention thus also relates to a method for monitoring the G2092 allele, by molecular biology techniques, and in particular via PCR using the primers mentioned in the examples.
  • the invention is also the subject of a process for obtaining corn plants having a tolerance to fungal pathogens improved with Pallele G2092.
  • the invention also relates to a method for obtaining a corn line with a better tolerance to fungal diseases, including the step of introgression of the G2092 allele, in a reference line, having a quality agronomic character.
  • the introgression of the character is notably carried out by selection, according to methods known in the art (crosses and selfing). Plants are selected in particular using molecular markers.
  • a series of backcrosses is performed between the elite line and the line carrying the G2092 allele.
  • individuals carrying the G2092 allele can be selected, and recombining the smallest fragment of the donor line around this allele. Indeed, thanks to the molecular markers, one selects the individuals having for the markers close to the gene, the genotype of the elite line.
  • a method for obtaining a maize with a tolerance to fungal pathogens comprising: a) crossing a first maize line having the G2092 allele; with a second corn line not having said allele, b) genotyping the obtained offspring and selecting the progeny with the G2092 allele having the best genome ratio for said second line, c) backcrossing said descendants with said second corn line, d) repeating steps b) and c) if necessary until an isogenic line of said second corn line, having the G2092 allele, e) is obtained.
  • perform a self-fertilization to obtain a homozygous plant for the G2092 allele.
  • the invention in another embodiment, relates to a method for obtaining corn having increased digestibility, comprising introgressing the G2092 allele in said maize, comprising the steps of: a) crossing a first line of maize having the G2092 allele with a second maize not having said allele, b) genotyping the obtained progeny and selecting the progeny with the G2092 allele, and having the best genome ratio for said second maize, c ) backcrossing said descendants with said second elite corn line usable for the production of hybrids, d) repeating if necessary steps b) and c) until obtaining an isogenic line of said second maize, having the G2092 allele, e) optionally, perform a self-fertilization to obtain a homozygous plant for the G2092 allele.
  • step b) is preferably carried out using molecular markers (microsatellite markers for example), making it possible to define the share of each of the two parents in the offspring.
  • molecular markers microsatellite markers for example
  • Maize which has the appropriate genetic character with respect to the G2092 allele, conventionally selected by molecular biology methods (such as PCR or Southern Blot) is also selected in the offspring.
  • the increased tolerance and / or digestibility of maize according to the present invention are relative to a quasi-isogenic corn not including the G2092 allele.
  • the invention also relates to a method in which the ⁇ 3318 allele is also introgressed in maize in which the G2092 allele is introgressed. Introgression of ⁇ 3318 is in particular carried out according to the teachings of WO 2006/035045, using in particular the primers described in the examples of this application.
  • the introgression of the D 1938 allele can also be considered in parallel with the introgression of the G2092 allele or both G2092 and D 1938 alleles. Moreover, the agronomic results observed after multiple backcrossings (5 backcrosses and 2 self-fertilization) show no difference between the isogenic lines with the mutation and the control plants.
  • the invention relates to the use of a maize according to the invention, for the preparation of a composition intended for animal feed, to a method for the preparation of a composition intended for animal feed comprising the ensilage of a corn according to the invention, as well as the composition intended for animal feed, thus obtained.
  • said corn is particularly useful for feeding livestock.
  • Figure 1 Schematic representation of the insertion of the transposable element
  • Example 1 Identification of a corn having an insertion in the gene
  • a corn line having an insertion of a transposable element at position 1186 of the reference sequence SEQ ID No. 1 is isolated (FIG. 1).
  • the allele thus obtained is called G2092.
  • the insertion of the transposable element is in the TGA triplet (coding for the stop codon of the CCoAOMT2 protein) in the last exon of the CCoAOMT2 gene (FIG. 1). This insertion may affect the conformation and / or stability of the mRNA.
  • a pair of primers has been defined: CCoA2-intsscher-21 sense primer of sequence SEQ ID No. 3: GACCTCGTGGCGGACAAG and an antisense primer CCoA2_16 of sequence SEQ ID No. 4: CCAAGAAAGAGCCAGAGCCG.
  • OMuA primer SEQ ID No. 5: CTTCGTCCATAATGGCAATTATCTC specific endogenous transposable element is used. This primer is directed towards the end of the transposon.
  • a homozygous mutant plant and a wild-type homozygous control are available for each insertion event. Given the advanced stages of introgression of the mutation, the mutant and the wild can be considered to differ only in the presence or absence of the mutation.
  • the experiment is carried out according to the following protocol: • 2 places • 3 repetitions per place
  • Example 3 Phenotypic analysis of the mutant G2092 for digestibility In order to study more precisely the effect of the insertion observed in the CCoAOMT2 gene in an elite maize, successive backcrosses are carried out with an elite line of maize.
  • the introgression of the G2092 allele makes it possible to obtain a decrease in the amount of lignin (Lignin Acid Detergent) after wall isolation (Neutral Detergent Fibers), according to the methods known to those skilled in the art.
  • the G2092 allele is used in varietal selection.
  • the genetic mixing between the resistant variety and varieties with other agronomic qualities such as high yields, high protein content, resistance to standing germination, allows selection of new varieties including all desired characters.
  • the G2092 allele conferring resistance to Fusarium wilt is followed by molecular labeling during this varietal selection process.
  • This varietal selection scheme may also include selection of varieties also comprising the allele of the CCR1 gene, designated ⁇ 3318, said allele being present in a representative sample of seeds deposited at NCIMB under the number NCIMB 41236 and / or, an allele of the gene C4H, designated D1938, said allele being present in a representative sample of seeds deposited at NCIMB under the number NCIMB 41507.

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration de la digestibilité et de la tolérance du maïs aux pathogènes fongiques et notamment à la fusariose par l'introgression de l'allèle G2092.

Description

MAIS PRESENTANT UNE TOLERANCE ACCRUE AUX MALADIES
FONGIQUES
La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration du maïs, en particulier l'amélioration de la digestibilité du maïs, et de la tolérance du maïs aux pathogènes fongiques et notamment à la fusariose.
La présente invention concerne plus précisément la mise au point d'un allèle particulier du gène CCoAOMT2 chez le maïs. La présence de cet allèle a pour conséquence une amélioration de la digestibilité (digestibilité accrue) et de la tolérance à la fusariose par rapport à un maïs isogénique ne possédant pas l'allèle.
La quantité de lignine présente dans la plante est également diminuée.
La lignine est l'un des deux composants majoritaires de la paroi végétale avec la cellulose. La paroi végétale principalement constituée de cellulose, hémicellulose et de lignine offre à la cellule une barrière naturelle contre l'extérieur. De nombreuses études ont démontré que l'une des réponses aux stress biotiques (attaques pathogènes) ou abiotiques (sécheresse, vent...) consiste en un renforcement de la paroi végétale en particulier en une teneur supérieure en lignines. Par ailleurs, de nombreux secteurs agronomiques ou industriels voient leurs rendements directement liés à la teneur et/ou à la composition en lignine de la paroi, notamment l'industrie papetière, la production de combustibles (notamment la biomasse destinée aux biocarburants) ou la production d'ensilage.
Par exemple, on peut améliorer la qualité du maïs d'ensilage en diminuant la teneur en lignine ou en en modifiant la composition. L'ensilage de maïs est un aliment intéressant : le rendement au champ est relativement élevé, la récolte et le stockage sont aisés, les qualités nutritionnelles sont stables et peuvent aisément être complémentées en protéines par d'autres ensilages de fourrage ou par des tourteaux de soja. Une expérimentation menée par Emile (1995, Annales de zootechnie) démontre qu'alimenter du bétail avec un maïs plus digestible permet d'augmenter la production laitière jour et la prise de poids par rapport à une alimentation avec un maïs moins digestible. L'optimisation des qualités de l'ensilage de maïs consiste ainsi à augmenter l'énergie nette fournie par ce type d'alimentation en améliorant sa digestibilité et donc en diminuant la teneur en lignine.
Ainsi, la sélection ou l'obtention de plantes de maïs plus digestibles, notamment dont la voie de biosynthèse des lignines est modifiée est un des axes privilégiés d'amélioration du maïs. Il convient toutefois que les plantes sélectionnées possèdent de bons rendements et soient peu sensibles aux divers stress
(mécanique, hydrique...).
Par ailleurs, les maïs sont soumis aux attaques de nombreux pathogènes. Parmi ceux-ci, on peut citer les virus, bactéries, mais aussi les pathogènes fongiques, responsables de nombreuses maladies, et parfois de la présence de mycotoxines.
Ainsi, le maïs peut être attaqué par des champignons responsables de fusarioses (due aux Fusarium, dont F. roseum, F. gramninearum, F. liseola, F. monoliformé), de charbon (commun ou des inflorescences, du à Ustilago zeae, Ustilago maydis), d'anthracnose (Colletotrichum graminicold), de kabatiellose, d'helminthosporiose (Helminthosporium turcicum), de rouille (Puccinia maydis), de mildiou. D'une façon générale, les attaques fongiques sont responsables de dessèchement et/ou de pourriture des plantes, qui sont localisées différemment selon le pathogène. Les champignons du genre Fusarium sont responsables de la fusariose. On peut citer les espèces F. graminearum, et F. moniliforme pathogènes du maïs et dont l'importance varie suivant les conditions climatiques et la précocité des variétés de maïs. On peut distinguer la fusariose de l'épi de la fusariose de la tige, les processus infectieux étant très différents. Certains agents pathogènes sont cependant communs aux deux types de fusariose. Plusieurs modes de contamination de la plante par le champignon sont connus, comme la pénétration du mycélium infectieux dans la plante par des lésions imputables aux insectes et aux oiseaux, ou bien la pénétration directe au niveau des soies de l'épi aboutissant à l'infection des grains. Dans le cas de la fusariose de la tige, la contamination peut également avoir lieu via les semences ou plus rarement les racines.
La fusariose de l'épi qui entraîne une destruction des grains diminue le rendement des cultures de maïs. Les agents pathogènes en cause sont par ailleurs très dommageables car ils accumulent dans les grains détruits ou non différentes mycotoxines (Zéaralenone, Deoxynivalénol, Fumonisines), qui présentent des niveaux de toxicité variables suivant les espèces animales et sont difficiles à éliminer. Les traitements fongicides sont difficiles d'utilisation et n'ont qu'un effet limité à l'encontre des Fusarium. La meilleure façon de combattre la fusariose de l'épi est l'utilisation de la résistance génétique. Peu d'hybrides possèdent actuellement une telle résistance, qui, quand elle existe, est une résistance partielle qui reste modérée. II apparaît donc important d'identifier des méthodes pour augmenter la tolérance aux maladies fongiques chez le maïs.
La présente demande montre que la présence de l'allèle G2092 du gène CCoAOMT2 de maïs permet d'obtenir un maïs à la fois plus digestible et présentant une meilleure tolérance aux maladies fongiques, et notamment à la fusariose. Ce maïs présente également une résistance aux maladies fongiques causées par des pathogènes fongiques tels que ceux décrits ci-avant.
L'allèle G2092 est un mutant d'insertion dans le gène CCoAOMT2 de la voie des phénylpropanoïdes, et plus particulièrement la voie de biosynthèse de la lignine. Cette voie des phénylpropanoïdes conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des ester d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. La lignine assure rigidité aux parois cellulaires et imperméabilité aux tissus conducteurs.
La Caffeoyl Coenzyme-A O-Méthyl Transférase (CCoAOMT) est une enzyme importante de la voie de bio synthèse des monolignols et plus particulièrement des sous-unités G. La CCoAOMT semble intervenir au cours de plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des lignines. Ainsi, elle serait impliquée dans une voie alternative de méthylation de la biosynthèse des lignines chez les zinnia, et la voie de méthylation médiée par la CCoAOMT serait probablement une des voies générales de la biosynthèse des lignines pendant la croissance et le développement de la plante.
Chez le maïs, deux gènes codent pour la CCoAOMT : le gène CCoAOMTl (GenBank AJ242980), situé sur le chromosome 6 et le gène CCoAOMT2 (GenBank AJ242981, SEQ ID N° 2), situé sur le chromosome 9.
Les demandes de brevet WO9910498 et WOO 134817 concernent entre autres, le gène de la CCoAOMTl de maïs.
Dans la demande WO 03/054229, les inventeurs ont mis en évidence la colocalisation du gène CCoAOMT2, situé sur le chromosome 9, avec un QTL de digestibilité et un QTL de teneur en lignine des parois. Ils ont en outre identifié des mutations du gène CCoAOMT2 créant des allèles polymorphes associés à la digestibilité du maïs. L'utilisation de la variation allélique de CCoAOMT2 pour contrôler la digestibilité de maïs ensilage est également décrite dans Guillet-Claude et al. (Theor Appl Genêt. 2004 Dec;l 10(1): 126-35).
La présente demande a pour objet de fournir à l'homme du métier un maïs qui possède effectivement une digestibilité améliorée et une tolérance accrue aux pathogènes fongiques, par la mise au point d'un allèle favorable de la CCoAOMT2 (appelé G2092), l'insertion d'un transposon ayant été effectuée après le nucléotide 1186 dans le gène représenté par SEQ ID N° 1, qui correspond à l'ADN génomique pour cette enzyme. La demande décrit également une méthode pour obtenir un maïs ayant une tolérance accrue à un pathogène fongique, comprenant l'introgression de l'allèle G2092 ainsi identifié dans ledit maïs.
La séquence d'un ADNc (GenBank AJ24981) est représentée par SEQ ID N° 2, la partie codante s'étendant des nucléotides 70 à 865 pour cette séquence. Il est clair que ces séquences ne sont données qu'à titre d'exemples, et que l'homme du métier est à même d'identifier lui-même les séquences génomique et/ou d'ARNm de la CCoAOMT2 pour différentes variétés de maïs, notamment dans la base de données GenBank (séquences AY279004 à AY279035) ou dans Guillet- Claude et al (2004, op. cit.) Le maïs selon l'invention présente une altération quantitative et/ou qualitative de la synthèse de la lignine, ainsi qu'une meilleure tolérance aux pathogènes fongiques.
Par « altération quantitative de la synthèse de lignine », on entend désigner une diminution de la quantité de lignine dans le maïs modifié selon l'invention par rapport à un maïs normal (témoin non modifié selon l'invention), évalué, par exemple par mesure de la lignine de Klason ou de la lignine obtenue par détergent acid (acid détergent lignin) selon des méthodes bien connues dans l'art (voir par exemple Jung et al., J Agric Food Chem. 1999 May;47(5):2005-8 ; Jung et al, J Dairy Sci. 1997 Aug;80(8): 1622-8).
Par « altération qualitative de la synthèse de lignine », on entend désigner une modification dans la composition de la lignine de la plante modifiée selon l'invention par rapport à une plante témoin (non modifiée selon l'invention), par exemple une variation du rapport des sous unités S/G, ou une modification de la qualité d'acide férulique. Les méthodes d'analyse qualitative de la lignine sont également connues dans l'art. On peut notamment citer la RMN.
Parmi les pathogènes fongiques, on peut citer en particulier le genre
Fusarium, préférentiellement choisi parmi F. graminearum, F. liseola, F. rosβum et
F. monoliforme. Le maïs présente également une tolérance aux autres pathogènes fongiques cités plus avant et notamment aux pathogènes du genre
Helminthosporium, en particulier H. turcicum.
Des graines possédant l'allèle G2092 ont été déposées au NCIMB Limited, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, UK, le 14 novembre 2007, selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro NCIMB 41518.
L'invention concerne notamment une plante de maïs, ou un grain de maïs possédant ledit allèle G2092.
L'invention se rapporte également à un maïs ou un grain de maïs possédant à la fois l'allèle G2092 et un allèle du gène CCRl, appelé Δ3318, ledit allèle Δ3318 étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41236 le 23 juillet 2004, selon les dispositions du traité de Budapest. Cet allèle Δ3318 est décrit dans la demande WO 2006/035045.
L'invention se rapporte également à un maïs ou un grain de maïs possédant à la fois l' allèle G2092 et un allèle du gène C4H, appelé D1938, ledit allèle D1938 étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41507 le 15 octobre 2007, selon les dispositions du traité de
Budapest.
L'invention se rapporte également à un maïs ou un grain de maïs possédant à la fois l'allèle G2092, l'allèle du gène CCRl appelé Δ3318 et l'allèle du gène C4H appelé D1938.
De façon préférée, le maïs selon l'invention est un maïs « élite ». L'homme du métier connaît bien la définition d'un maïs élite. Par maïs élite, on entend un maïs destiné à générer des hybrides destinés à être commercialisés par croisement avec un autre maïs élite. Un maïs élite est défini comme tel en relation avec le territoire envisagé pour la commercialisation, ainsi que le(s) caractère(s) agronomique(s) recherché(s) pour la descendance hybride. Il s'agit notamment d'un maïs pouvant être inscrit dans un catalogue de référence.
Ainsi, selon que la descendance est destinée à l'alimentation humaine ou animale, on recherchera par exemple respectivement un rendement en grains ou un rendement à l'hectare et une bonne digestibilité, lorsque l'on évalue la nature « élite du maïs ».
Afin de déterminer le caractère élite d'un maïs, on compare des hybrides obtenus à partir de celui-ci aux hybrides commerciaux de référence (vendus pour le même objectif dans la même région), par des essais en champs, par relevé et mesures de caractères agronomiques appropriés à l'objectif recherché. Un maïs est défini comme élite si les résultats obtenus paramètres étudiés pour un hybride obtenu par croisement dudit maïs sont supérieurs à 90 % aux résultats relevés pour les mêmes paramètres des hybrides de référence.
Ainsi, un maïs élite est un maïs rassemblant le maximum de caractéristiques agronomiques nécessaires pour une pénétration économique du marché visé. Le marché du maïs étant aujourd'hui un marché d'hybrides, l'évaluation du caractère élite d'un maïs s'effectue également par l'aptitude dudit maïs à la combinaison/production d'hybrides.
Ainsi, la présente invention se rapporte préférentiellement à un maïs élite destiné à la commercialisation d'hybrides pour l'alimentation animale et l'ensilage, présentant l'allèle G2092. Ce maïs élite est donc homozygote pour Pallèle G2092.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à un maïs hybride obtenu par croisement de deux lignées parentes homozygotes, ledit maïs hybride présentant un allèle G2092. Ce maïs hybride peut être homozygote (si chaque parent homozygote présente l'allèle G2092) ou hétérozygote pour l'allèle G2092.
L'invention se rapporte également à un maïs ou un grain de maïs, contenant un ou plusieurs transgènes en plus de l'allèle G2092. On peut citer des transgènes conférant une stérilité mâle, une fertilité mâle, la résistance à un herbicide (notamment le glyphosate, le glufosinate, Pimidazolinone, la sulfonylurée, la L- phosphinotricine, la triazine, le benzonitrile), la résistance aux insectes (notamment un transgène codant pour une toxine de Bacillus thuήngiensis), la tolérance au stress hydrique. Ces maïs peuvent être obtenus en croisant un maïs contenant l'allèle G2092 avec un maïs contenant ledit transgène. La mise en œuvre de rétrocroisements suivi d'une autofécondation permet d'obtenir un maïs élite homozygote pour l'allèle G2092 et le trangène. Toutefois, un maïs hybride contenant à la fois l'allèle G2092 et le transgène est également compris dans la portée de l'invention.
La présente invention fournit également à l'homme du métier les moyens permettant de sélectionner les plantes de maïs possédant des caractéristiques de tolérance aux pathogènes fongiques améliorées. Il suffit en effet d'effectuer une PCR, ou un Southern Blot (hybridation de l'ADN génomique sur membrane) pour suivre la présence de l'insertion dans le dernier exon du gène codant pour la CCoAOMT2. L'homme du métier peut aisément déterminer les amorces et sondes permettant d'identifier la présence de l'allèle G2092. L'invention se rapporte ainsi également à une méthode de suivi de l'allèle G2092, par des techniques de biologie moléculaires, et notamment via la PCR en utilisant les amorces mentionnées dans les exemples. L'invention fait également l'objet d'un procédé d'obtention de plantes de maïs possédant une tolérance aux pathogènes fongiques améliorée grâce à Pallèle G2092.
L'invention se rapporte également à une méthode pour obtenir une lignée de maïs présentant une meilleure tolérance aux maladies fongiques, comprenant l'étape d'introgression de l'allèle G2092, dans une lignée de référence, présentant un caractère agronomique de qualité. L'introgression du caractère est notamment réalisée par sélection, selon les méthodes connues dans l'art (croisements et autofécondation). On sélectionne notamment les plantes à l'aide de marqueurs moléculaires.
Le principe en est rappelé ci-dessous :
On réalise une série de rétrocroisements (back-cross) entre la lignée élite et la lignée portant l'allèle G2092.
Au cours des rétrocroisements, on peut sélectionner les individus porteurs de l'allèle G2092, et ayant recombiné le plus petit fragment de la lignée donneuse autour de cet allèle. En effet, grâce aux marqueurs moléculaires, on sélectionne les individus ayant pour les marqueurs proches du gène, le génotype de la lignée élite.
De plus, il est également possible d'accélérer le retour vers le parent élite grâce aux marqueurs moléculaires répartis sur l'ensemble du génome. A chaque rétrocroisement, seront choisis les individus ayant le plus de fragments issus du parent élite récurrent.
Avec une bonne mise en œuvre, dès la quatrième génération, on peut obtenir une lignée quasi isogénique de la lignée élite, c'est-à-dire identique à la lignée élite de départ, mais ayant intégré le locus portant l'allèle G2092. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, pour le maïs, celle-ci se rapporte à une méthode pour obtenir un maïs présentant une tolérance aux pathogènes fongiques, consistant à : a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle G2092 avec une seconde lignée de maïs ne présentant pas ledit allèle, b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle G2092 ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est de ladite seconde lignée, c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs, d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique de ladite seconde lignée de maïs, présentant l'allèle G2092, e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir une plante homozygote pour l'allèle G2092.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à une méthode pour obtenir un maïs présentant une digestibilité accrue, comprenant l'introgression de l'allèle G2092 dans ledit maïs, comprenant les étapes consistant à : a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle G2092 avec un second maïs ne présentant pas ledit allèle, b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle G2092, et ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est dudit second maïs, c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs élite utilisable pour la production d'hybrides, d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique dudit second maïs, présentant l'allèle G2092, e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir une plante homozygote pour l'allèle G2092.
Le génotypage de l'étape b) est effectué préférentiellement en utilisant des marqueurs moléculaires (marqueurs microsatellites par exemple), permettant de définir la part de chacun des deux parents dans la descendance. On sélectionne également, dans la descendance, les maïs qui possèdent le caractère génétique approprié pour ce qui est de l'allèle G2092, de façon classique, par les méthodes de biologie moléculaire (telles que PCR ou Southern Blot).
Les tolérance et/ou digestibilité accrues du maïs selon la présente invention le sont par rapport à un maïs quasi-isogénique ne comprenant pas l'allèle G2092.
De manière surprenante, il a été montré que la répétition des rétrocroisements entre les lignées sélectionnées à l'étape b) et le second maïs permet d'obtenir l'apparition d'un phénotype bien plus marqué au sein dudit second maïs. Par ailleurs, il est surprenant d'observer un tel phénotype alors que l'insertion est située dans le codon stop du gène codant pour la CCoAOMT2, et que la protéine devrait ainsi être produite et opérationnelle.
L'invention se rapporte également à une méthode dans laquelle on introgresse également l'allèle Δ3318 dans le maïs dans lequel on introgresse l'allèle G2092. L'introgression de Δ3318 est notamment effectuée selon les enseignements de WO 2006/035045, en utilisant notamment les amorces décrites dans les exemples de cette demande.
L'introgression de l'allèle D 1938 peut également être envisagée en parallèle avec l'introgression de l'allèle G2092 ou bien des deux allèles G2092 et D 1938. Par ailleurs, les résultats agronomiques observés après de multiples rétrocroisements (5 rétrocroisements et 2 auto-fécondations) ne montrent pas de différence entre les lignées isogéniques présentant la mutation et les plantes témoins.
Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'un maïs selon l'invention, pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation animale, à une méthode pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation animale comprenant l'ensilage d'un maïs selon l'invention, ainsi qu'à la composition destinée à l'alimentation animale, ainsi obtenue. En particulier, ledit maïs est particulièrement utile pour l'alimentation du bétail.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : représentation schématique de l'insertion de l'élément transposable
Mutator dans le dernier exon du gène CCoAOMT2. Les blocs gris correspondent aux exons, les traits correspondent aux introns.
EXEMPLES
Exemple 1. Identification d'un maïs présentant une insertion dans le gène
CCoAOMT2
Une lignée de maïs présentant une insertion d'un élément transposable à la position 1186 de la séquence de référence SEQ ID N°l est isolée (figure 1). L'allèle ainsi obtenu est appelé G2092. L'insertion de l'élément transposable se situe dans le triplet TGA (codant pour le codon stop de la protéine CCoAOMT2) dans le dernier exon du gène CCoAOMT2 (figure 1). Il est possible que cette insertion joue sur la conformation et/ou la stabilité de l'ARNm. Afin de déterminer si l'insertion est sous forme homozygote ou hétérozygote, un couple d'amorces a été défini : amorce sens CCoA2-intspé-21 de séquence SEQ ID N° 3 : GACCTCGTGGCGGACAAG et une amorce antisens CCoA2_16 de séquence SEQ ID N° 4 : CCAAGAAAGAGCCAGAGCCG.
En plus de ces deux amorces l'amorce OMuA (SEQ ID N° 5) : CTTCGTCCATAATGGCAATTATCTC spécifique de l'élément transposable endogène est utilisée. Cette amorce est dirigée vers l'extrémité du transposon.
Ces trois amorces peuvent être utilisées simultanément dans une expérience d'amplification PCR à partir d'ADN génomique (Température d'hybridation = 58°C). Le dépôt sur gel des produits d'amplification révèle : - l'obtention d'une seule bande d'environ 500 pb de long pour des plantes dites sauvages à ce locus (c'est à dire n'ayant pas la mutation) ;
- l'obtention de deux bandes d'environ 200 pb et 400 pb pour des plantes homozygotes mutantes, correspondant aux amplifications obtenues avec les amorces présentes dans le gène et dans le transposon (du fait de l'insertion, l'amplification avec les amorces CCoA2-intspé-21 et CCoA2_16 est impossible car trop longue) ;
- ou l'obtention de l'ensemble des trois bandes pour des plantes hétérozygotes.
Exemple 2 : Analyse phénotypique du mutant G2092 pour le caractère de résistance aux maladies fongiques
On dispose d'une plante mutante homozygote et d'un contrôle homozygote sauvage pour chaque événement d'insertion. Etant donné les stades avancés d'introgression de la mutation, on peut considérer que le mutant et le sauvage ne diffèrent que par la présence ou non de la mutation. L'expérimentation est réalisée selon le protocole suivant : • 2 lieux • 3 répétitions par lieu
• Inoculation artificielle de Fusarium monoliforme
• Notation des symptômes observés sur épis (note de 1 à 7). Il s'agit d'une notation visuelle d'intensité d'attaque sur épis : la note d'intensité d'attaque est calculée à partir du pourcentage de la surface de l'épi attaqué par le pathogène (Reid et alAgriculture and Agri-Food Canada, Ottawa, Ont. Technical Bulletin 1996-5E. 40 pp). Les notes correspondent à : 1 = 0% attaqué ; 2 = 1-3% ; 3 = 4-10% ; 4 = 11-25% ; 5 = 26-50% ; 6 = 51-75% ; 7 = 76-100%.
• Eventuellement dosage des mycotoxines (fumonisines)
Dans les exemples ci-dessous, les répétitions « lieux » ont été converties en « répétitions simples » de façon à réaliser une analyse statistique simple. L'analyse statistique a été réalisée sur chaque mutant de façon à savoir s'il existe une différence entre mutant (M) et sauvage ou témoin (S). Les résultats démontrent que l'insertion d'un transposon dans le gène CCoAOMT2, impliqués dans la voie du métabolisme des phénylpropanoïdes et de la lignine augmente la tolérance à une infection par Fusarium monoliforme. Cet effet est reproductible selon les lieux de culture. Mutant G2092 CCoAOMT2
* différence statistiquement significative.
Mutant plus résistant que sauvage ; effet modéré
Exemple 3 : Analyse phénotypique du mutant G2092 pour le caractère digestibilité Afin d'étudier plus précisément l'effet de l'insertion observée dans le gène CCoAOMT2 dans un maïs élite, on effectue des back-cross (rétrocroisements) successifs avec une lignée élite de maïs.
Cette méthode permet très rapidement d'obtenir des lignées quasi isogéniques ne différant que par le locus portant Pallèle modifié, les descendants étant testés pour posséder un ratio génome le plus proche possible de celui du parent élite tout en ayant l'allèle que l'on désire introgresser. Ces tests sont assistés par marqueurs moléculaires (techniques bien connues, microsatellites, AFLP...). Pour essayer d'apprécier l'effet de l'insertion au plus tôt (obtention de plantes homozygotes), des auto fécondations sont réalisées aux différents stades intermédiaires de back cross.
L'introgression de l'allèle G2092 permet d'obtenir une baisse de la quantité de lignine (Acid Détergent Lignin) après isolement des parois (Neutral Détergent Fibers), selon les méthodes connues de l'homme du métier.
Exemple 4 : Utilisation de l'allèle G2092 en sélection variétale
L'allèle G2092 est utilisé en sélection variétale. Le brassage génétique entre la variété résistante et des variétés présentant d'autres qualités agronomiques telles que des rendements élevés, de fort taux en protéines, une aptitude à la résistance à la germination sur pied, permet de sélectionner de nouvelles variétés regroupant l'ensemble des caractères souhaités. L'allèle G2092 conférant la résistance à la fusariose est suivi par marquage moléculaire au cours de ce processus de sélection variétale.
Ce schéma de sélection variétale peut également comprendre la sélection de variétés comprenant également l'allèle du gène CCRl, appelé Δ3318, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41236 et/ou, un allèle du gène C4H, appelé D1938, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41507.

Claims

Revendications
1. Maïs présentant un allèle du gène CCoAOMT2, appelé G2092 comprenant une insertion d'un transposon dans le dernier exon du gène CCoAOMT2, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41518.
2. Maïs selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend également un allèle du gène CCRl , appelé Δ3318, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro
NCIMB 41236 et/ou, un allèle du gène C4H, appelé D 1938, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41507.
3. Grain de maïs présentant un allèle du gène CCoAOMT2, appelé G2092 comprenant une insertion d'un transposon dans le dernier exon dudit gène, ledit allèle étant présent dans les graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41518.
4. Grain de maïs selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend également un allèle du gène CCRl, appelé Δ3318, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41236 et/ou, un allèle du gène C4H, appelé D1938, ledit allèle étant présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41507.
5. Méthode pour obtenir un maïs présentant une tolérance accrue à un pathogène fongique, comprenant l'introgression de l' allèle G2092 du gène CCoAOMT2, présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41518, dans ledit maïs, comprenant les étapes consistant à : a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle G2092 avec un second maïs ne présentant pas ledit allèle, b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle G2092, et ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est dudit second maïs, c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs élite utilisable pour la production d'hybrides, d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique dudit second maïs, présentant l'allèle G2092, e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir une plante homozygote pour l'allèle G2092.
6. Méthode pour obtenir un maïs présentant une digestibilité accrue, comprenant l'introgression de l'allèle G2092 du gène CCoAOMT2, présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41518, dans ledit maïs, comprenant les étapes consistant à : a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle G2092 avec un second maïs ne présentant pas ledit allèle, b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle G2092, et ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est dudit second maïs, c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs élite utilisable pour la production d'hybrides, d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique dudit second maïs, présentant l'allèle G2092, e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir une plante homozygote pour l'allèle G2092.
7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit pathogène fongique est du genre Fusarium.
8. Méthode selon l'une des revendications 5 à 7, comprenant également l'introgression de Pallèle Δ3318 du gène CCRl, présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41236, et/ou de l'allèle D 1938 du gène C4H, présent dans un échantillon représentatif de graines déposées au NCIMB sous le numéro NCIMB 41507, dans ledit maïs.
9. Utilisation d'un maïs selon la revendication 1 ou 2 pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation animale.
10. Méthode pour la préparation d'une composition destinée à l'alimentation animale comprenant l'ensilage d'un maïs selon la revendication 1 ou 2.
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