FR2804970A1 - Identification de genes associes a un locus qtl de digestibilite du mais - Google Patents
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Abstract
Cette invention concerne la mise en évidence de la co-localisation entre deux locus QTL de digestibilité du maïs et des gènes impliqués dans la synthèse de la lignine, et les applications dans des méthodes de production de maïs digestibles.
Description
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La présente invention concerne l'identification de gènes associés à des loci QTL de quantité de lignine et de digestibilité du maïs.
De nombreux caractères phénotypiques manifestent une variation continue dans les populations, variation qui peut être quantifiée. Parmi de tels caractères, on peut citer par exemple le nombre de ramifications, la précocité, la résistance à des insectes, le pourcentage de protéines dans le grain, etc. Il est admis que cette distribution continue peut s'expliquer en supposant que plusieurs locus en ségrégation influencent la variation du caractère, à laquelle des effets de milieu peuvent également contribuer (de Vienne et al, 1998).
Depuis le début des années 80, on a coutume d'appeler ces locus, en anglais comme en français, des QTL (pour Quantitative Trait Loci ). Des différences d'effets entre allèles sauvages seraient responsables de la variation des caractères quantitatifs ( Helentjaris 1987, Beavis et al. 1991 ).
Les auteurs de la présente invention se sont intéressés, parmi ces caractères quantitatifs, à la digestibilité du maïs. La qualité nutritive des maïs d'ensilage dépend, en plus du stade de récolte, (évalué par le pourcentage de matière sèche qui doit être compris entre 30 et 35%), des quantités respectives des grains et des tiges et des digestibilité propre à chacune de ces deux parties.
La valeur de digestibilité du maïs est difficile à évaluer. La digestibilité de la tige dépend principalement de la digestibilité des parois des cellules. Les parois des cellules sont constituées principalement de cellulose, d'hémicellulose et de lignine. La lignine contrairement aux autres constituants n'est pas digérée par les animaux polygastriques et elle est donc considérée limitante pour la valeur de digestibilité des fourrages. Des corrélations entre quantité de lignine et digestibilité ont été publiées, mais les résultats sont contradictoires. Une corrélation négative est généralement observée lorsque différents stades de maturité sont comparés alors que la corrélation est moins évidente lorsqu'un seul stade de maturité est considéré (Jung and Allen, 1995).
Ceci témoigne du fait que la lignine n'explique qu'en partie la variation globale de la digestibilité.
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A l'origine, les mesures de digestibilité du maïs ensilage sont réalisées en mesurant le gain énergétique de ruminants nourris à partir de cet ensilage. Ces tests in vivo sont cependant coûteux et nécessitent de grandes quantités de matériel végétal. Aussi, des méthodes indirectes ont donc été développées : - mesure de digestibilité in vitro dans du jus de rumen (Menke et al, 1979) ; - mesure de digestibilité in vitro enzymatique (Aufrere and Demarquilly, 1989). Des mesures chimiques sont également utilisées pour quantifier les constituants de paroi (Van Soest, 1963). Une autre méthode d'évaluation de la digestibilité passe par l'utilisation de spectrométrie dans le proche infra-rouge (Ronsin et Femenias, 1990). Cette technique permet de prédire différents paramètres de digestibilité ou de quantité de constituants de paroi.
Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à établir une co-localisation entre QTL de digestibilité du maïs et certains gènes, connus comme étant impliqués dans les voies de synthèse de la lignine, colocalisation susceptible d'être mise à profit notamment pour produire des maïs plus digestibles.
Pour cela, ils ont mis en #uvre une méthode comprenant : i) la détermination, pour plusieurs individus d'une descendance de maïs en ségrégation, du génotype d'un ensemble de locus marqueurs distribués tout le long du génome ; ii) la mesure de la digestibilité pour chacun des individus étudiés ; iii) la corrélation entre le génotype des locus marqueurs et la digestibilité, permettant la localisation des QTL de digestibilité ; iv) la corrélation entre le QTL de digestibilité ainsi localisé et au moins un gène, ledit gène ayant été préalablement cartographié, sur les mêmes individus ou d'autres individus de la même espèce, dans la région desdits locus marqueurs corrélés audit QTL de digestibilité.
Par locus marqueur , on entend un locus identifié par un marqueur polymorphique qui renseigne sur le génotype à ce locus et en partie
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aux locus voisins du fait de la liaison génétique. Parmi les marqueurs courants, on peut citer les marqueurs RFLP ( restriction fragment length polymorphism ) RAPD ( random-amplified polymorphic DNA ), AFLP( amplification fragment length polymorphism ou SSR ( simple séquence repeats ).
Par descendance en ségrégation , on entend une population de plantes génétiquement hétérogènes de même dérivation génétique et étant par conséquent apparentées. Des exemples de descendance en ségrégation incluent des populations obtenues par rétrocroisement, des lignées recombinantes ou des populations de lignées F2.
Les mesures de digestibilité telles que mentionnées à l'étape (ii) ci-dessus ont été réalisées par spectrométrie dans le proche infrarouge (ou NIRS en anglais). Un appareil de type monochromateur (NIRS system 5000 FOSS) a été utilisé. Les teneurs en paroi et en lignine (pourcentage par rapport aux parois) et une mesure de digestibilité enzymatique selon Aufrere (Aufrere et Demarquilly, 1989) ont ainsi été prédites.
La corrélation entre le génotype des locus marqueurs et la digestibilité, qui permet la localisation des QTL de digestibilité comme mentionné à l'étape (iii) ci-dessus, peut être effectuée par des méthodes biométriques connues de l'homme du métier (de Vienne, 1998). Ces méthodes biométriques peuvent s'appuyer sur des analyses marqueur par marqueur (Tanskley et al, 1982) ou en prenant en compte conjointement deux ou plusieurs marqueurs (Landen et Botstein, 1989). Au moyen de cette méthode, décrite plus précisément dans les exemples ci-après, les auteurs de la présente invention sont parvenus à identifier plusieurs régions chromosomiques comme étant des loci QTL de digestibilité du maïs.
La présente invention a plus particulièrement pour objet une région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est délimitée par les marqueurs UMC67 et UMC 128 sur le chromosome 1 du maïs, comme indiqué à la figure 1.
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Ces marqueurs sont connus de l'homme du métier, et sont par exemple accessibles via la "Maize Genome Database" de l'Université du Missouri (http : //www.agron.missouri.edu).
La contribution de cette région chromosomique est de l'ordre de 15 % de la variance phénotypique de la teneur en lignine, et de l'ordre de 15 % également pour la digestibilité enzymatique.
La région chromosomique d'intérêt est plus particulièrement délimitée par les marqueurs UMC 67, ou de préférence UMC 58 à une extrémité et par le marqueur UMC 128 à l'autre extrémité.
En application de l'étape (iv) de la méthode décrite ci-dessus, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence que cette région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, comprenait le gène 4CL2 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 et le gène CCR codant pour l'enzyme Cynnamoyl CoA réductase, localisés entre les marqueurs UMC 58 et UMC 128.
Ces marqueurs peuvent notamment servir pour préparer des amorces pour des réactions d'amplification de type PCR (réaction en chaîne par polymérase), appliquées à de l'ADN de maïs ou pour préparer des sondes pour des hybridations Southern.
L'invention a donc pour objet une région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est comprise entre les marqueurs UMC 67 et UMC 128 sur le chromosome 1 du maïs et qu'elle comprend le gène 4CL2 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 et le gène CCR codant pour l'enzyme Cynnamoyl CoA réductase.
La séquence SEQ ID n 1 annexée correspond à un ADNc de pleine longueur codant pour la 4CL2 de maïs.
La demande de brevet US 866 791 décrit par ailleurs un ADN recombinant codant pour l'enzyme CCR de maïs, également décrit dans l'article de Civardi et al, 1998 et accessible sur la base de données GenBank (n d'accès Y13734).
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Les auteurs de la présente invention ont également mis en évidence une autre région chromosomique, identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs. Cette région est caractérisée en ce qu'elle est délimitée par les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le chromosome 5 du maïs, comme indiqué à la figure 2.
Ces marqueurs sont connus de l'homme du métier, et sont par exemple donnés par le "Maize Genome Database" de l'Université du Missouri.
La contribution de cette région chromosomique par rapport à la teneur en lignine est de l'ordre de 10 % de la variance phénotypique.
La région chromosomique d'intérêt est plus particulièrement délimitée par le marqueur UMC 27a à une extrémité et par le marqueur bnl 7. 71 à l'autre extrémité.
En application de l'étape (iv) de la méthode décrite ci-dessus, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence que cette région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, comprenait le gène 4CL1 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 1, le gène CAD codant pour l'enzyme cinnamyl alcool deshydrogénase et le gène F5H codant pour l'enzyme ferulate 5-hydroxylase localisés entre les marqueurs UMC 27a et bnl 7. 71.
Ces marqueurs peuvent notamment servir pour préparer des amorces pour des réactions d'amplification de type PCR (réaction en chaîne par polymérase), appliquées à de l'ADN de maïs ou pour préparer des sondes pour des hybridations (Southern).
L'invention a donc pour objet une région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est comprise entre les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le chromosome 5 du maïs et qu'elle comprend le gène 4CL1 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 1, le gène CAD codant pour l'enzyme cinnamyl alcool deshydrogénase, et le gène F5H codant pour une ferulate-5hydroxylase.
La séquence d'ADNc de pleine longueur codant pour l'enzyme 4CL1 est présentée dans la liste de séquences annexée, SEQ ID n 2.
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L'enzyme CAD et son gène sont décrits dans Civardi et al, 1998 et sur la base de données Genbank (N d'accès Y13733)
La séquence SEQ ID n 3 annexée correspond à l'ADNc codant pour la F5H de maïs.
La séquence SEQ ID n 3 annexée correspond à l'ADNc codant pour la F5H de maïs.
L'identification de QTL de digestibilité et la mise en évidence des marqueurs et des gènes associés à ces QTL conformément à l'invention ouvre la voie à un certain nombre d'applications.
Des sondes nucléiques ou des amorces permettant une amplification par PCR peuvent être construites à partir de tout ou partie des régions chromosomiques décrites plus haut ou bordant celles-ci. Il peut notamment s'agir de sondes obtenues à partir des séquences codant pour les enzymes CCR, 4CL2, CAD et/ou 4CL1 et F5H.
Des programmes de sélection assistée par marqueurs peuvent être mis en oeuvre en utilisant ces sondes comme marqueurs, de manière à introgresser des segments chromosomiques dans des variétés de maïs pour augmenter la valeur de digestibilité de ces variétés. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins une sonde ou une amorce nucléique obtenue à partir de tout ou partie des régions chromosomiques telles que définies précédemment ou bordant celles-ci, pour le suivi de l'introgression du QTL de digestibilité du maïs, dans un programme de sélection de maïs assistée par marqueurs.
Par exemple ces sondes peuvent être marquées selon les techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple par un isotope radioactif et utilisées pour repérer les QTL de digestibilité chez le maïs grâce à la technique du Southern par exemple. Pour cela, au moins une sonde marquée est mise en contact avec de l'ADN génomique d'un maïs, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions d'hybridation appropriées, puis on détermine la taille du fragment de restriction qui hybride avec la sonde. Des amorces construites à partir de tout ou partie des régions chromosomiques décrites plus haut ou bordant ces régions peuvent également être utilisées pour caractériser ces régions, selon des techniques de type PCR classique (à l'aide de deux amorces flanquantes), ou
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de PCR quantitative (à l'aide de deux amorces Manquantes et d'une amorce spécifique de l'allèle favorable), ou encore au moyen d'une technique n'utilisant pas la PCR, comme celle décrite et commercialisée par Third Wave Technology (Madison, Wl 53719. 1256, USA), dénommée InvaderTM.
La présente invention a également pour objet une méthode de sélection de maïs ayant un degré de digestibilité élevé, comprenant : le génotypage d'individus au moyen de sondes ou d'amorces nucléiques obtenues à partir de tout ou partie d'une région chromosomique telle que définie précédemment ou bordant celle-ci ; la sélection parmi ces individus des plantes qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la digestibilité.
L'invention porte en outre sur une méthode d'obtention de maïs génétiquement transformé ayant une digestibilité élevée, ladite méthode comprenant : (i) la transformation d'une cellule de plant de maïs avec au moins deux séquences nucléotidiques codant pour des enzymes différentes l'une de l'autre, lesdites séquences étant choisies parmi une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la CCR, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la 4CL2, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée pour la 4CL1, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la CAD, et une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la F5H, lesdites séquences étant portées par un ou plusieurs acides nucléiques ; et (ii) la régénération d'une plante transgénique à partir de la cellule ainsi transformée.
La présente invention s'étend par ailleurs à un acide nucléique codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 (4CL2), comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID n 1.
L'invention couvre également un acide nucléique codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase (4CL1), comprenant la séquence SEQ ID n 2.
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L'invention concerne également un vecteur comprenant l'un au moins des acides nucléiques cités ci-dessus, en association avec des séquences opérantes permettant son expression. Est en outre comprise dans l'invention une méthode d'obtention d'un maïs génétiquement modifié, comprenant la transformation d'une cellule de plant de maïs par cet acide nucléique ou ce vecteur et la régénération d'une plante transgénique à partir de la cellule ainsi transformée. L'invention concerne enfin une plante de maïs transgénique ou partie de cette plante, telle que graine, feuille, cellule, ou autres, susceptible d'être obtenue par ladite méthode.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée d'une quelconque manière.
LEGENDE DES FIGURES:
La figure 1 représente la carte consensus des marqueurs SSR du chromosome 1 du maïs, accessible sur le site de l'Internet (http://www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgw~mdb/mdb3/Map/145822).
La figure 1 représente la carte consensus des marqueurs SSR du chromosome 1 du maïs, accessible sur le site de l'Internet (http://www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgw~mdb/mdb3/Map/145822).
La figure 2 représente le consensus des marqueurs SSR du chromosome 5 du maïs, accessible sur le site de l'Internet (http://www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgw mdb/mdb3/Map/145826).
EXEMPLES :
Exemple 1 :
Localisation des QTL de digestibilité :
A. Mesure de la digestibilité :
Le matériel végétal utilisé se compose de deux populations de maïs F2 (de 220 et 140 individus respectivement) obtenus par croisement entre lignées cornées pour l'une et lignées dentées pour l'autre. Les lignées
Exemple 1 :
Localisation des QTL de digestibilité :
A. Mesure de la digestibilité :
Le matériel végétal utilisé se compose de deux populations de maïs F2 (de 220 et 140 individus respectivement) obtenus par croisement entre lignées cornées pour l'une et lignées dentées pour l'autre. Les lignées
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parentales propres à un même croisement ont été choisies pour leur différence de digestibilité de paroi et de teneur en paroi. Les familles F3 ont été évaluées par NIR ( Near Infrared Reflectance ) sur deux lieux de culture pour différents paramètres de digestibilité (teneur en paroi, en lignine, et digestibilité enzymatique de la matière organique totale).
B. Etudes biométriques :
La liaison entre le génotype des locus marqueurs et les variables quantitatives de digestibilité a été réalisée par la méthode basée sur un algorithme de recherche de QTL par "interval mapping" (logiciel Mapmaker/QTL version 1.1, Lincoln et al, 1993). Un QTL a été déclaré significatif lorsque le Lod score était supérieur à 2. 5. Un intervalle de confiance a été défini pour chaque QTL en prenant pour chaque extrémité le Lod Score maximum - 1. 5.
La liaison entre le génotype des locus marqueurs et les variables quantitatives de digestibilité a été réalisée par la méthode basée sur un algorithme de recherche de QTL par "interval mapping" (logiciel Mapmaker/QTL version 1.1, Lincoln et al, 1993). Un QTL a été déclaré significatif lorsque le Lod score était supérieur à 2. 5. Un intervalle de confiance a été défini pour chaque QTL en prenant pour chaque extrémité le Lod Score maximum - 1. 5.
Après cartographie des familles F3, des QTL ont été obtenus notamment sur les chromosomes 1 et 5. L'intervalle de confiance (=Lod score maximum - 1. 5) du QTL sur le chromosome 1 est compris entre les marqueurs UMC 67 et UMC 128 et ce QTL présente pour la teneur en lignine un Lod score de 6. 3 pour une population et un lieu de culture et de 2. 8 pour l'autre population sur le même lieu de culture. Les coefficients de détermination (R2) donnés par le logiciel mapmaker/ QTL sont de 20 % et 10 % respectivement de la variance phénotypique totale. Avec le même intervalle de confiance un QTL de digestibilité enzymatique de la matière organique est montré pour un lieu de culture et une population. Ce QTL présente un Lod score de 4. 5 et un R2de 13 % de la variance phénotypique totale.
Le QTL obtenu sur le chromosome 5 présente un intervalle de confiance compris entre les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609. Ce QTL est retrouvé pour les deux lieux de culture d'une des deux populations avec un Lod score de 3,1 et 2,8 et un R2de 12% et 10% respectivement suivant le lieu de culture.
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Exemple 2 :
Colocalisation des gènes 4CL2 et CCR :
Deux ADNc codant l'un pour la 4CL2, l'autre pour la CCR ont été cartographiés à partir d'une population en ségrégation, et une distance de 1,7 % de recombinaison a été observée entre ces deux ADNc (1 individu recombiné sur 60). Cette région est située sur le chromosome 1 entre les marqueurs UMC 58 et UMC 128.
Colocalisation des gènes 4CL2 et CCR :
Deux ADNc codant l'un pour la 4CL2, l'autre pour la CCR ont été cartographiés à partir d'une population en ségrégation, et une distance de 1,7 % de recombinaison a été observée entre ces deux ADNc (1 individu recombiné sur 60). Cette région est située sur le chromosome 1 entre les marqueurs UMC 58 et UMC 128.
Les ADNc correspondants à ces gènes sont cartographiés par hybridation sur des transferts ("blots") d'ADN de population d'individus en ségrégation, digéré par des enzymes de restriction. Les cartes génétiques de ces populations sont saturées avec au moins un marqueur en moyenne tous les 4 cM. Le logiciel Mapmaker/Exp version 3. 0 est utilisé pour cartographier les ADNc par rapport aux marqueurs ancres de ces cartes génétiques.
Exemple 3 :
Colocalisation des gènes CAD, 4CL1 et F5H :
Le protocole est similaire à celui suivi pour la co-localisation des gènes 4CL2 et CCR. La région où se cartographient CAD, 4CL1 et F5H se situe sur le chromosome 5 entre les marqueurs UMC 27a et bnl 7. 71.
Colocalisation des gènes CAD, 4CL1 et F5H :
Le protocole est similaire à celui suivi pour la co-localisation des gènes 4CL2 et CCR. La région où se cartographient CAD, 4CL1 et F5H se situe sur le chromosome 5 entre les marqueurs UMC 27a et bnl 7. 71.
Exemple 4 :
Obtention de lignées plus digestibles
A. Par sélection assistée par marqueurs :
De multiples utilisations des marqueurs en sélection sont envisageables : on peut citer l'évaluation et la gestion des ressources génétiques (Song. et al., 1988), le transfert de gènes par rétrocroisement (Young et tanksley, 1989) et la construction de nouveaux génotypes (LefortBuson et al., 1990).
Obtention de lignées plus digestibles
A. Par sélection assistée par marqueurs :
De multiples utilisations des marqueurs en sélection sont envisageables : on peut citer l'évaluation et la gestion des ressources génétiques (Song. et al., 1988), le transfert de gènes par rétrocroisement (Young et tanksley, 1989) et la construction de nouveaux génotypes (LefortBuson et al., 1990).
De manière générale, les marqueurs génétiques bordant la région chromosomique ou compris dans la région chromosomique caractérisée selon l'invention peuvent ainsi être utilisés dans un programme de sélection assistée par marqueurs pour prédire le génotype au locus du trait de caractère en vertu
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de la liaison entre le locus marqueur génétique et le locus QTL de digestibilité maïs d'une part et de la co-localisation mise en évidence entre ce locus QTL et les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la lignine d'autre part. On peut donc également utiliser comme marqueurs, des séquences comprises dans ces régions chromosomiques comprenant tout ou partie des séquences 4CL1 et 2, CCR, CAD, F5H.
Dans une première étape, l'effet sur la digestibilité de l'allèle au QTL doit être évalué en relation avec les allèles des marqueurs moléculaires de la zone chromosomique comprenant un des deux QTL ci-dessus décrits.
Ainsi une population de variétés de maïs ou d'hybrides peut être génotypée à partir d'un jeu de marqueurs cartographiés au préalable sur une des zones chromosomiques ci-dessus décrites. Pour chaque jeu de marqueurs, chaque combinaison d'allèles de marqueurs est associée à un allèle au QTL et une évaluation de l'effet de l'allèle sur la digestibilité peut être réalisée par analyse de variance de la valeur de digestibilité des variétés en utilisant comme modalité du facteur l'allèle au QTL.
L'autre possibilité pour évaluer l'effet des allèles au QTL est l'approche par croisement : - par croisement entre deux lignées ou variétés; - soit par utilisation d'une série de croisements apparentés ou diallèle. Le principe est toutefois le même pour ces deux types de croisements puisque l'effet de l'allèle au QTL est évalué par comparaison de la valeur de digestibilité des descendants des croisements.
Dans une deuxième étape, deux variétés (ou deux individus issus de descendance), ayant respectivement un allèle favorable à une bonne valeur de digestibilité pour le QTL du chromosome 1 et pour le QTL du chromosome 5, sont croisées en vue d'obtenir un individu issu de la descendance de ce nouveau croisement qui contienne ces deux allèles. Des marqueurs moléculaires appartenant à ces deux zones chromosomiques sont alors utilisés pour identifier cet individu. Cet individu peut alors être fixé par autofécondations successives en s'assurant de ne pas perdre les deux allèles grâce aux marqueurs moléculaires. A partir de cet individu ou à partir des lignées parentales de cet individu, les deux allèles peuvent également être introgressés dans une lignée ou variété présentant une bonne valeur
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agronomique, et cette introgression est suivie par des marqueurs moléculaires bordant la zone des QTL que l'on veut introgresser.
B. Par transgénèse :
On peut également obtenir des plantes plus digestibles par voie de transgénèse, en jouant sur le niveau d'expression des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la lignine (surexpression de la F5H et sous-expression des autres par exemple) ou en introduisant une ou plusieurs séquences de gènes intervenant dans la biosynthèse de la lignine, séquences qui correspondront à des allèles associés à des valeurs de digestibilité fortes. Des cassettes d'expression sont construites à partir des séquences localisées dans les régions chromosomiques définies selon la présente invention, liées génétiquement à des séquences régulatrices de type promotrices (promoteurs forts ou spécifiques de tissus à forte lignification) et terminatrices (poly A nos par exemple). Ces cassettes sont ensuite intégrées dans des vecteurs d'expression contenant également des marqueurs de sélection pour la transformation, suivant les techniques standards décrites par exemple dans Sambrook et al. (1989). Ces vecteurs sont enfin utilisés pour transformer les cellules végétales selon les techniques connues de l'homme du métier. On peut citer notamment la transformation par canon à particules et la transformation par Agrobacterium, décrites ci-dessous.
On peut également obtenir des plantes plus digestibles par voie de transgénèse, en jouant sur le niveau d'expression des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la lignine (surexpression de la F5H et sous-expression des autres par exemple) ou en introduisant une ou plusieurs séquences de gènes intervenant dans la biosynthèse de la lignine, séquences qui correspondront à des allèles associés à des valeurs de digestibilité fortes. Des cassettes d'expression sont construites à partir des séquences localisées dans les régions chromosomiques définies selon la présente invention, liées génétiquement à des séquences régulatrices de type promotrices (promoteurs forts ou spécifiques de tissus à forte lignification) et terminatrices (poly A nos par exemple). Ces cassettes sont ensuite intégrées dans des vecteurs d'expression contenant également des marqueurs de sélection pour la transformation, suivant les techniques standards décrites par exemple dans Sambrook et al. (1989). Ces vecteurs sont enfin utilisés pour transformer les cellules végétales selon les techniques connues de l'homme du métier. On peut citer notamment la transformation par canon à particules et la transformation par Agrobacterium, décrites ci-dessous.
Il est envisageable d'utiliser des promoteurs tissus ou organes spécifiques qui permettent l'expression des transgènes et donc l'amélioration de la digestibilité dans une partie seulement de la plantes. Sachant que l'augmentation de digestibilité liée à la diminution de la quantité de lignine est accompagnées dans certain cas par une augmentation de la sensibilité à la verse (mutant bm3 = mutant du gène CAOMT), il est avantageux d'augmenter la digestibilité par expression des transgènes dans toute la plante sauf dans la tige.
B-1 Canon à particules
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par J. Finer (1992). Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules identique à celui décrit par J. Finer (1992). Les cellules cibles sont des cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la
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régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal embryogène (dit de type Il) de maïs. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Maize Handbook ; 1994 M. Freeling, V. Walbot Eds ; pp.665-671).
Ces fragments des cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'une boîte de Petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Des plasmides porteurs des gènes à introduire, en l'occurrence 4CL1, 4CL2, CAD, CCR et/ou F5H, sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrits par J.
Finer (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'obscurité à 27 C. Le premier repiquage a lieu 24h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boîte bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour l'obtention d'hybrides ou autofécondées.
B-2. Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par Ishida et al (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par Ishida et al (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la
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référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt (en l'occurrence 4CL1, 4CL2, CAD, CCR et/ou F5H), et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25 C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens).
Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25 C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type # (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25 C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type # qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22 C et sous lumière continue.
Les plantules ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22 C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
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Exemple 4 :
Utilisation de la population issue de l'hybride Symphony.
Utilisation de la population issue de l'hybride Symphony.
De façon analogue, l'invention peut être réalisée en utilisant comme matériel végétal de départ une population issue de l'hybride Symphony.
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Claims (8)
1. Région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est délimitée par les marqueurs UMC 67 et UMC 128 sur le chromosome 1 du maïs.
2. Région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est comprise entre les marqueurs UMC 67 et UMC 128 sur le chromosome 1 du maïs et qu'elle comprend le gène 4CL2 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 et le gène CCR codant pour l'enzyme Cynnamoyl CoA réductase.
3. Région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est délimitée par les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le chromosome 5 du maïs.
4. Région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maïs, caractérisée en ce qu'elle est comprise entre les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le chromosome 5 du maïs et qu'elle comprend le gène 4CL1 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 1 et le gène CAD codant pour l'enzyme cinnamyl alcool deshydrogénase et le gène F5H codant pour l'enzyme ferulate 5-hydroxylase.
5. Utilisation d'au moins une sonde ou amorce nucléique obtenue à partir de tout ou partie de la région chromosomique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour l'identification chez un maïs du génotype au moins partiellement responsable d'une digestibilité élevée.
6. Utilisation d'au moins une sonde ou amorce nucléique obtenue à partir de tout ou partie de la région chromosomique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour le suivi de l'introgression
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du QTL de digestibilité du maïs, dans un programme de sélection de maïs assistée par marqueurs.
7. Méthode de sélection de maïs ayant un degré de digestibilité élevé, comprenant : le génotypage d'individus au moyen de sondes ou amorces nucléiques obtenues à partir de tout ou partie de la région chromosomique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou bordant celle-ci, la sélection parmi ces individus des plantes qui comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la digestibilité.
8. Méthode d'obtention de maïs génétiquement transformé ayant une digestibilité élevée, ladite méthode comprenant : (i) la transformation d'une cellule de plant de maïs avec au moins deux séquences nucléotidiques codant pour des enzymes différentes l'une de l'autre, lesdites séquences étant choisies parmi une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la CCR, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la 4CL2, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée pour la 4CL1, une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la CAD, et une séquence d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la F5H, lesdites séquences étant portées par un ou plusieurs acides nucléiques ; et (ii) la régénération d'une plante transgénique à partir de la cellule ainsi transformée.
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| PUIGDOMENECH P ET AL: "Genes involved in lignification and digestibility in cereals.", FASEB JOURNAL, vol. 13, no. 7, 23 April 1999 (1999-04-23), Annual Meeting of the American Societies for Experimental Biology on Biochemistry and Molecular Biology 99;San Francisco, California, USA; May 16-20, 1999, pages A1339, XP002150098, ISSN: 0892-6638 * |
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