EP2181350A2 - Verfahren und vorrichtung zur beleuchtung einer probe in einem lasermikroskop - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur beleuchtung einer probe in einem lasermikroskop

Info

Publication number
EP2181350A2
EP2181350A2 EP08787083A EP08787083A EP2181350A2 EP 2181350 A2 EP2181350 A2 EP 2181350A2 EP 08787083 A EP08787083 A EP 08787083A EP 08787083 A EP08787083 A EP 08787083A EP 2181350 A2 EP2181350 A2 EP 2181350A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
laser light
light source
laser
amplifier
source
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP08787083A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker Seyfried
Hilmar Gugel
Carsten L. Thomsen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of EP2181350A2 publication Critical patent/EP2181350A2/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers

Definitions

  • the invention relates to a method for illuminating or irradiating an object, a sample or the like for the purpose of image acquisition or analysis, in particular for use in a laser microscope, preferably in a confocal microscope, with a laser light source emitting the illumination light, wherein the laser light directly or via a fiber is coupled into an illumination beam path. Furthermore, the invention relates to a corresponding device.
  • the invention generally relates to a method and a device for illuminating or irradiating an object, a sample or the like, which in concrete terms may be the application in confocal microscopy.
  • Confocal microscopes with conventional gas, solid-state, semiconductor or fiber lasers, in particular with white-light lasers are known, for example, from DE 101 15 589 A1 or from DE 101 15 509 A1.
  • it is already known to produce a so-called supercontinuum in white-light lasers namely with the aid of a photonic glass fiber, a photonic bandgap fiber, a tapered fiber, a Holy fiber, a doped fiber, etc.
  • each laser ages in operation, for example by gas degradation.
  • the optics, the resonator, active media, etc. age due to thermal stress.
  • the photonic glass fiber degenerates, which is manifested by a gradual decrease in the output power over the operating period.
  • the laser illumination light is only used for a fraction of the time while the laser is constantly operating is on or remains on. So you need the laser light regularly only for the actual image capture and not in the usually long pauses between shots.
  • the present invention is therefore based on the object, a method and an apparatus for illuminating or irradiating an object, a sample or the like. indicate for the purpose of image acquisition or analysis, according to which in particular the components which are sensitive with respect to the laser lifetime are spared in particular when the laser is to be ready for operation, but the laser light is temporarily not required.
  • the generic method is characterized in that the laser light source on a
  • the generic device is achieved in that the laser light source in response to a trigger signal immediately before the actual need, for example, immediately before the image acquisition, is switched on very quickly.
  • the laser light source is switched on extremely quickly in response to a trigger signal. So that is guaranteed ⁇ ensure that the laser is actually only switched on if, for example, receives the con ⁇ fokalmikroskop images. If the laser light is not needed, the laser light source can be switched off manually, or preferably automatically after a certain time delay.
  • the trigger signal used to turn on the laser light source can be triggered manually or automatically by hardware or software. If the device using the laser light source is a microscope, the triggering signal required for switching on is then directed to the laser light source when the user starts or starts the preparations for image acquisition before the actual image acquisition. Due to the trigger signal, the laser light source is turned on.
  • the switching on of the laser light source is preferably carried out in less than 1/10 second, so that the user does not perceive the switch-on or the time until trouble-free and stable operation of the laser light source as disturbing.
  • the laser light source is switched on via a pump source of the laser light source, which is preferably designed as a pump diode. This pump source is energized, whereby the laser or the laser light source is activated.
  • a control device with a control loop which regulates the current of the pump source as a function of the output power of the laser light source is used.
  • the control device comprises a photodiode serving for detecting the output power of the laser light source, preferably a so-called monitor photodiode. The signal detected there is evaluated and serves as a controlled variable for the control loop.
  • a permanently operated or energized seed laser with at least one downstream laser amplifier is provided in a further advantageous manner.
  • the laser light source comprises the permanently operated seed laser and the laser amplifier to be switched on as needed. Permanent energization of the seed laser achieves stable conditions in the generation of the laser radiation.
  • the rapid switching of the radiation takes place by switching on or energizing the pump source for the laser amplifier.
  • a trigger or a trigger signal indicates that laser light is required, as a result of which the pump source, which is advantageously a pump diode or pump diodes, is switched on for the amplifier unit.
  • a fast regulation of Output power for this interval operation is again generated by a Montitor photodiode.
  • the laser amplifier is constructed in two or more stages, namely, the laser amplifier comprises at least one preamplifier and at least one power amplifier.
  • the laser amplifier or downstream laser amplifiers are activated by switching on or energizing the respective pump source while the seed laser is constantly operating.
  • the first stage of the amplifier unit is also operated permanently or energized.
  • a control device is provided with a control circuit, according to which the current of the pump source of the amplifier unit is controlled in dependence on the output power of the laser light source.
  • a photodiode preferably a monitor photodiode, is also provided here.
  • the control device can be the same control device that is required to control the pump light source of the seed laser.
  • a single control device can serve both to control the energization of the pump source of the seed laser and the pump sources of preamplifier and power amplifier.
  • the splitting of the laser light source or of the laser system is advantageous in particular because the components which are sensitive with regard to the laser lifetime are in the laser amplifiers or the laser amplifier are downstream. These critical components are operated according to the invention only if they are actually needed. Accordingly, synchronization of the switch-on processes or the current application of the respective pump sources takes place, for example synchronized with the scanning process of the confocal scanning microscope.
  • nonlinear optical elements such as frequency doublers or frequency multipliers, frequency mixers, frequency converters (OPOs, etc.) or spectrally broadening elements such as self-phase modulation or cross-phase modulation materials, photonic crystals, photonic crystal fibers, supercontinuum-producing fibers (photonic, microstructured, suitably doped or with natural negative group velocity dispersion) are arranged.
  • nonlinear optical elements such as frequency doublers or frequency multipliers, frequency mixers, frequency converters (OPOs, etc.) or spectrally broadening elements such as self-phase modulation or cross-phase modulation materials, photonic crystals, photonic crystal fibers, supercontinuum-producing fibers (photonic, microstructured, suitably doped or with natural negative group velocity dispersion) are arranged.
  • OPOs frequency converters
  • spectrally broadening elements such as self-phase modulation or cross-phase modulation materials, photonic crystals, photonic crystal fibers, supercontinuum-producing fibers (photonic
  • the laser light source for use in confocal microscopy wherein the laser light source is a so-called supercontinuum laser is used in the picosecond pulses considerable energy (15 to 20 W cw power at 80 mHz repetition rate) in a photonic crystal fiber for white light generation are coupled.
  • both the amplifier units of the laser and the supercontinuum fiber age relatively quickly.
  • the laser light source is split up into a permanently operated seed laser and downstream into a two-stage amplifier unit.
  • the seed laser is controlled by its own monitor photodiodes.
  • the first stage of the amplifier unit is continuously operated in accordance with the above statements, while the second amplifier stage, namely the actual power level, is energized and regulated via the pump diodes, for example when pressing a scan button of the confocal microscope.
  • both the lifetime of the power amplifier and the optical fiber, in particular a supercontinuum can be increased considerably, since usually the actual scan time in a conventional confocal microscope in the range of less than 5% to a maximum of 20% of the total period of use.
  • sufficiently stable operation is possible even after less than 1/10 second, so that the user of the confocal microscope does not perceive the "Lifetime Save Mode" realized here, or at least not disturbing it.
  • the method and the device according to the invention are not only used in confocal microscopes, but generally in systems which, in comparison to the
  • FIG. 1 shows a schematic view of the arrangement and the beam path in a laser scanning microscope, in which the device according to the invention uses the method according to the invention and
  • Fig. 2 is a schematic view of the basic structure of a device according to the invention for use of the method according to the invention in
  • Beam path of a laser scanning microscope. 1 shows the example of a laser scanning microscope 1, the use of a device according to the invention and the application of a method according to the invention.
  • Illumination light is emitted by a laser light source 2 and passes through a beam converter 3 into the illumination beam path 4 of the laser scanning microscope 1.
  • the illumination light passes focused through a lens 7 to the sample 8.
  • the light returning from the sample 8 (predominantly
  • Detection light passes through the lens 7 and passes through the scanning device 6 and the beam splitter 5 and passes through a lens assembly 9 and through an aperture 10 to the detector 11th
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment of a device according to the invention for illuminating or irradiating the sample 8 in the case of the laser scanning microscope 1 shown in FIG. 1.
  • the laser light source 2 is switched to a trigger signal immediately before the actual need, i. immediately before the image acquisition, quickly turned on.
  • the laser light source 2 comprises a seed laser 12 which is permanent operated or energized.
  • the actual laser amplifier is constructed in two stages, namely comprises a preamplifier 14 and a power amplifier 15. Both the preamplifier 14 and the power amplifier 15 is a pump source 16, 17 assigned to namely the preamplifier 14 and the power amplifier 15 to energize or fast to activate ,
  • the preamplifier 14 and the seed laser 12 are operated permanently. This means that the pump sources 13 and 16 permanently energize the seed laser 12 and the preamplifier 14.
  • the pump sources 13, 16 and 17 are controlled or acted upon by a control device 18.
  • the control device 18 comprises a control loop which regulates the current of the respective pump source 13, 16 and 17 as a function of the output power of the laser light source 2.
  • a photodiode 19 or an array of corresponding photodiodes is provided which is preferably designed as a monitor photodiode (s) is (are).
  • FIG. 2 further shows that the laser light source 2 is utilized by suitable means 20 as supercontinuum laser.
  • This means 20 the photodiode 19 is arranged downstream for power measurement. Determined performance data are supplied to the control device 18.
  • the laser light is selected via an AOTF 21 in the wavelength and coupled into the beam path of the laser scanning microscope 1 ⁇ . From there, a trigger line 22 leads to the control device 18, which in turn acts on the pump sources 13, 16 and 17.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung einer Probe (8) zum Zweck der Bildaufnahme oder Analyse, insbesondere zur Anwendung in einem Lasermikroskop (1), vorzugsweise in einem Konfokalmikroskop, mit einer das Beleuchtungslicht aussendenden Laserlichtquelle (2), wobei das Laserlicht unmittelbar oder über eine Glasfaser in einen Beleuchtungsstrahlengang (4) eingekoppelt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtquelle (2) auf ein Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme, schnell eingeschaltet wird.

Description

„Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe oder dgl. ΛΛ
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe oder dgl. zum Zweck der Bildaufnahme oder Analyse, insbesondere zur Anwendung in einem Lasermikroskop, vorzugsweise in einem Konfokalmikroskop, mit einer das Beleuchtungslicht aussendenden Laserlichtquelle, wobei das Laserlicht unmittelbar oder über eine Glasfaser in einen Beleuchtungsstrahlengang eingekoppelt wird. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine entsprechende Vorrichtung.
Die Erfindung bezieht sich ganz allgemein auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe oder dgl., wobei es sich dabei im Konkreten um die Anwendung bei der Konfokalmikroskopie handeln kann. Konfokalmikroskope mit herkömmlichen Gas-, Festkörper-, Halbleiter- oder Faserlasern, insbesondere auch mit Weißlichtlasern, sind beispielsweise aus der DE 101 15 589 Al oder aus der DE 101 15 509 Al bekannt. Aus der Praxis ist es auch bereits bekannt, bei Weißlichtlasern ein sogenanntes Superkontinuum zu erzeugen, nämlich mit Hilfe einer photonischen Glasfaser, einer Photonic-Bandgap-Faser, einer Tapered-Faser, einer Holy-Faser, einer dotierten Faser, etc.
Außerdem sind aus der Praxis triggerbare Pulslaser bekannt, zum Beispiel TiSa-Laser oder Laser mit SESAM-Technik (SESAM = Semiconductor Saturable Absorber Mirror, sättigbarer Absorberspiegel aus Halbleitermaterial) .
Beim Einsatz der meist teuren Laserbeleuchtungen ist problematisch, dass jeder Laser im Betrieb altert, beispielsweise durch Gas-Degradation. Außerdem altern die Optiken, der Resonator, aktive Medien, etc. aufgrund der thermischen Belastung. Wird das Laserlicht in eine Glasfaser eingekoppelt, beispielsweise beim Weißlichtlaser unter Lichtbelastung, degeneriert die photonische Glasfaser, was sich durch eine allmähliche Abnahme der Ausgangsleistung über die Betriebsdauer hinweg bemerkbar macht.
In Bezug auf das Altern des Lasers oder das Erblinden einer Glasfaser über deren Lebensdauer hinweg ist bemerkenswert, dass bei den meisten Anwendungen von Laserlicht, so insbesondere bei der Laserscanmikroskopie, das Laser-Beleuchtungslicht nur für einen Bruchteil der Zeit verwendet wird, während der Laser ständig eingeschaltet ist bzw. bleibt. So benötigt man das Laserlicht regelmäßig nur zur eigentlichen Bildaufnahme und nicht etwa in den meist langen Pausen zwischen den Aufnahmen. Aus der Praxis ist es bereits bekannt, die Laserlichtquelle kontinuierlich zu betreiben, jedoch die Lichtleitfaser und/oder im Beleuchtungsstrahlengang befindliche optische Bauteile, die einem Alterungsprozess unterliegen, zu schützen. Dies erfolgt bei kontinuierlich betriebener Laserlichtquelle über Shutter, EOM, AOM, AOTF, etc., womit das Laserlicht in der Zeit geblockt wird, in der es zur Bildaufnahme nicht benötigt wird. Der Laser bleibt dabei bei voller Leistung eingeschaltet.
Ein Abschalten der Laserlichtquelle macht zur Verringerung des Verschleißes der Laserlichtquelle keinen Sinn, da nämlich eine ganz erhebliche Zeit erforderlich ist, damit der Laser nach dem Einschalten wieder betriebsbereit ist und dabei stabil arbeitet .
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe oder dgl . zum Zweck der Bildaufnahme oder Analyse anzugeben, wonach insbesondere die hinsichtlich der Laser-Lebensdauer empfindlichen Komponenten insbesondere dann geschont werden, wenn der Laser betriebsbereit sein soll, jedoch das Laserlicht, zeitweise, nicht benötigt wird.
Die voranstehende Aufgabe ist durch die Merkmale der nebengeordneten Patentansprüche 1 und 13 gelöst.
Danach ist das gattungsbildende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtquelle auf ein
Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen
Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme, sehr schnell eingeschaltet wird. Entsprechend ist die gattungsbildende Vorrichtung dadurch gelöst, dass die Laserlichtquelle auf ein Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme, sehr schnell einschaltbar ist.
Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass es möglich ist, die Laserlichtquelle unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme oder vor der durchzuführenden Analyse, schnellstmöglich einzuschalten. Das Einschalten der Laserlichtquelle erfolgt äußerst schnell auf ein Triggersignal hin. Damit ist gewähr¬ leistet, dass der Laser tatsächlich nur dann eingeschaltet ist, wenn beispielsweise das Kon¬ fokalmikroskop Bilder aufnimmt. Wird das Laserlicht nicht benötigt, kann die Laserlichtquelle manuell, oder vorzugsweise nach einer gewissen Zeitverzögerung automatisch abgeschaltet werden.
Das zum Einschalten der Laserlichtquelle dienende Triggersignal kann manuell oder automatisch durch Hardware oder Software ausgelöst werden. Handelt es sich bei dem die Laserlichtquelle nutzenden Gerät um ein Mikroskop, wird das zum Einschalten erforderliche Triggersignal an die Laserlichtquelle dann geleitet, wenn der Benutzer vor der eigentlichen Bildaufnahme die Vorbereitungen zur Bildaufnahme startet oder gestartet hat. Aufgrund des Triggersignals wird die Laserlichtquelle eingeschaltet. Das Einschalten der Laserlichtquelle erfolgt vorzugsweise in weniger als 1/10 Sekunde, so dass der Benutzer den Einschaltvorgang bzw. die Zeit bis zum störungsfreien und stabilen Betrieb der Laserlichtquelle nicht als störend wahrnimmt. Das Einschalten der Laserlichtquelle erfolgt über eine vorzugsweise als Pumpdiode ausgeführte Pumpquelle der Laserlichtquelle. Diese Pumpquelle wird bestromt, wodurch der Laser bzw. die Laserlichtquelle aktiviert wird.
In ganz besonders vorteilhafter Weise dient zur Realisierung des schnellen Einschaltvorgangs eine Regeleinrichtung mit einem Regelkreis, der den Strom der Pumpquelle in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle regelt. Dazu umfasst die Regeleinrichtung eine zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle dienende Photodiode, vorzugsweise eine sogenannte Monitor- Photodiode. Das dort detektierte Signal wird ausgewertet und dient als Regelgröße für den Regelkreis .
Zur Gewährleistung eines äußerst schnellen Einschaltvorgangs und zur gleichzeitigen Vermeidung langer Einschwing- oder Stabilisierungsprozesse der Laserlichtquelle ist in weiter vorteilhafter Weise ein dauerhaft betriebener bzw. bestromter Seedlaser mit mindestens einem nachgeordneten Laserverstärker vorgesehen. Insoweit umfasst die Laserlichtquelle den dauerhaft betriebenen Seedlaser sowie den nach Bedarf zuzuschaltenden Laserverstärker. Durch dauerhaftes Bestromen des Seedlasers werden stabile Verhältnisse bei der Erzeugung der Laserstrahlung erreicht. Das schnelle Schalten der Strahlung erfolgt durch Einschalten bzw. Bestromen der Pumpquelle für den Laserverstärker. Durch einen Trigger bzw. ein Triggersignal wird signalisiert, dass Laserlicht benötigt wird, wodurch die Pumpquelle, bei der es sich in vorteilhafter Weise um eine Pumpdiode bzw. um Pumpdioden handelt, für die Verstärkereinheit eingeschaltet wird. Eine schnelle Regelung der Ausgangsleistung für diesen Intervallbetrieb wird abermals über eine Montitor-Photodiode generiert.
In ganz besonders vorteilhafter Weise ist der Laserverstärker zwei- oder mehrstufig aufgebaut, umfasst nämlich der Laserverstärker mindestens einen Vorverstärker und mindestens einen Leistungsverstärker. Im Falle einer solchen Realisierung ist es von weiterem Vorteil, wenn der oder die dem Seedlaser nachgeordneten Laserverstärker durch Einschalten bzw. Bestromen der jeweiligen Pumpquelle aktiviert werden, während der Seedlaser ständig arbeitet.
Außerdem ist es denkbar, dass die erste Stufe der Verstärkereinheit ebenfalls dauerhaft betrieben bzw. bestromt wird. Auch hier ist eine Regeleinrichtung mit einem Regelkreis vorgesehen, wonach der Strom der Pumpquelle der Verstärkereinheit in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle geregelt wird. Zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle ist auch hier eine Photodiode, vorzugsweise eine Monitor-Photodiode, vorgesehen. Dabei sei angemerkt, dass es sich bei der Regeleinrichtung um die gleiche Regeleinrichtung handeln kann, die zur Regelung der Pumplichtquelle des Seedlasers erforderlich ist. Eine einzige Regeleinrichtung kann sowohl zur Regelung der Bestromung der Pumpquelle des Seedlasers als auch der Pumpquellen von Vorverstärker und Leistungsverstärker dienen .
Weiter sei angemerkt, dass die Aufspaltung der Laserlichtquelle bzw. des Lasersystems insbesondere deshalb vorteilhaft ist, da sich die hinsichtlich der Laser-Lebensdauer empfindlichen Komponenten in den Laserverstärkern oder dem Laserverstärker nachgeschaltet befinden. Diese kritischen Komponenten werden in erfindungsgemäßer Weise nur dann betrieben, wenn sie auch tatsächlich benötigt werden. Entsprechend findet eine Synchronisierung der Einschaltvorgänge bzw. der Strombeaufschlagung der jeweiligen Pumpquellen statt, beispielsweise synchronisiert mit dem Scanvorgang des konfokalen Scanmikroskops .
Besonders vorteilhaft lassen sich das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung einsetzen, wenn nach der Laserlicht- Erzeugung nichtlineare optische Elemente wie Frequenzverdoppler oder Frequenzvervielfacher, Frequenzmischer, Frequenzkonvertierer (OPOs, etc.) oder spektral verbreiternde Elemente wie Materialien zur Selbstphasenmodulation oder Kreuzphasenmodulation, photonische Kristalle, photonische Kristallfasern, Superkontinuum erzeugende Fasern (photonisch, mikrostrukturiert, geeignet dotiert oder mit natürlicher negativer Gruppengeschwindigkeitsdispersion) angeordnet sind. Typisch für alle diese zuvor genannten Elemente ist, dass man relativ starke Laserlichtquellen, vorzugsweise mit sehr kurz gepulster Strahlung, benötigt. Folglich ist nicht nur die Alterung der Laserlichtquelle selbst, sondern insbesondere auch die Alterung dieser der eigentlichen Laserlichtquelle nachgeordneten Elemente erheblich .
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführung dient die Laserlichtquelle zum Einsatz in der Konfokalmikroskopie, wobei es sich bei der Laserlichtquelle um einen sogenannten Superkontinuumlaser handelt, bei dem Pikosekundenpulse erhebliche Energie (15 bis 20 W cw- Leistung bei 80 mHz Repetitionsrate) in eine photonische Kristallfaser zur Weißlichterzeugung eingekoppelt werden. Bei solchen Pulsenergien und Durchschnittsleistungen altern sowohl die Verstärkereinheiten des Lasers als auch die Superkontinuumfaser relativ schnell. Entsprechend ist es hier von Vorteil, wenn die Laserlichtquelle in einen dauerhaft betriebenen Seedlaser und nachgeordnet in eine zweistufig aufgebaute Verstärkereinheit aufgespalten sind. Der Seedlaser wird dabei mit eigenen Monitor-Photodioden geregelt. Die erste Stufe der Verstärkereinheit wird entsprechend den voranstehenden Ausführungen kontinuierlich betrieben, während die zweite Verstärkerstufe, nämlich die eigentliche Leistungs- stufe, über deren Pumpdioden beispielsweise beim Betätigen eines Scanknopfes des Konfokalmikroskops bestromt und geregelt wird.
Nach der erfindungsgemäßen Lehre lässt sich sowohl die Lebensdauer des Leistungsverstärkers als auch die der Lichtleitfaser insbesondere einer Superkontinuumfaser, erheblich steigern, da üblicherweise die eigentliche Scanzeit bei einem üblichen Konfokalmikroskop im Bereich von weniger als 5 % bis maximal 20 % der gesamten Benutzungsdauer ausmacht. Trotz des Erfordernisses des Einschaltens der Leistungsstufe ist ein ausreichend stabiler Betrieb schon nach weniger als 1/10 Sekunde möglich, so dass der Benutzer des Konfokalmikroskops den hier realisierten „Lifetime Save Mode " gar nicht oder zumindest nicht störend wahrnimmt.
Des Weiteren sei angemerkt, dass ein erfindungsgemäßes Ausschalten des Lasers zwischen einzelnen Frames oder einzelnen Zeilen der Bildaufnahme denkbar ist. So lässt sich abermals zur Alterung beitragende Zeit reduzieren. Weiter sei angemerkt, dass das erfindungsgemäße
Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht nur bei Konfokalmikroskopen Anwendung finden, sondern generell bei Systemen, die eine im Vergleich zur
Benutzungsdauer kleine Betriebszeit der
Laserbeleuchtung haben. Dies gilt insbesondere bei solchen Systemen, bei denen nicht vorhersehbar ist, wann die Laserbeleuchtung tatsächlich benötigt wird, zumal man hier lange Standby-Zeiten vermeiden kann.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die den Patentansprüchen 1 und 13 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
Fig. 1 in einer schematischen Ansicht die Anordnung und den Strahlengang in einem Laserscanmikroskop, bei dem die erfindungsgemäße Vorrichtung das erfindungsgemäße Verfahren nutzt und
Fig. 2 in einer schematischen Ansicht den grundsätzlichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens im
Strahlengang eines Laserscanmikroskops. Fig. 1 zeigt am Beispiel eines Laserscanmikroskops 1 den Einsatz einer erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie die Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens . Beleuchtungslicht wird von einer Laserlichtquelle 2 ausgesandt und gelangt über einen Strahlumformer 3 in den Beleuchtungsstrahlengang 4 des Laserscanmikroskops 1.
Über einen Strahlteiler 5 und eine Scaneinrichtung 6 gelangt das Beleuchtungslicht durch ein Objektiv 7 fokussiert zur Probe 8. Das von der Probe 8 zurückkehrende Licht (ganz überwiegend
Detektionslicht ) gelangt durch das Objektiv 7 und passiert die Scaneinrichtung 6 und den Strahlteiler 5 und gelangt über eine Linsenanordnung 9 und durch eine Blende 10 zum Detektor 11.
Da bei herkömmlichen Laserscanmikroskopen die eigentliche Scanzeit meist weniger als 5 % der gesamten Benutzungsdauer beträgt, altern sowohl die Laserlichtquelle 2 als auch nachgeschaltete optische Elemente, vor allem aber auch zum An- bzw. Einkoppeln dienende Lichtleitfasern erheblich.
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung der Probe 8 bei dem in Fig. 1 gezeigten Laserscanmikroskop 1.
Erfindungsgemäß wird die Laserlichtquelle 2 auf ein Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, d.h. unmittelbar vor der Bildaufnahme, schnell eingeschaltet.
Bei dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Laserlichtquelle 2 einen Seedlaser 12, der dauerhaft betrieben bzw. bestromt ist. Die Bestromung des Seedlasers 12 erfolgt über eine eigens dem Seedlaser 12 zugeordnete Pumpquelle 13.
Der eigentliche Laserverstärker ist zweistufig aufgebaut, umfasst nämlich einen Vorverstärker 14 und einen Leistungsverstärker 15. Sowohl dem Vorverstärker 14 als auch dem Leistungsverstärker 15 ist eine Pumpquelle 16, 17 zugeordnet, um nämlich den Vorverstärker 14 und den Leistungsverstärker 15 zu bestromen bzw. schnell zu aktivieren.
Bei dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel werden der Vorverstärker 14 und der Seedlaser 12 dauerhaft betrieben. Dies bedeutet, dass die Pumpquellen 13 und 16 den Seedlaser 12 und den Vorverstärker 14 dauerhaft bestromen.
Die Pumpquellen 13, 16 und 17 werden über eine Regeleinrichtung 18 angesteuert bzw. beaufschlagt. Die Regeleinrichtung 18 umfasst einen Regelkreis, der den Strom der jeweiligen Pumpquelle 13, 16 und 17 in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle 2 regelt. Zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle 2 ist eine Photodiode 19 oder eine Anordnung entsprechender Photodioden vorgesehen, die vorzugsweise als Monitor- Photodiode (n) ausgeführt ist (sind) .
In Fig. 2 ist des Weiteren dargestellt, dass die Laserlichtquelle 2 durch geeignete Mittel 20 als Superkontinuumlaser genutzt wird. Diesen Mittel 20 ist die Photodiode 19 zur Leistungsmessung nachgeordnet. Ermittelte Leistungsdaten werden der Regeleinrichtung 18 zugeführt. Das Laserlicht wird über ein AOTF 21 in der Wellenlänge selektiert und in den Strahlengang des Laserscanmikroskops 1 einge¬ koppelt. Von dort aus führt eine Triggerleitung 22 zur Regeleinrichtung 18, die wiederum die Pumpquellen 13, 16 und 17 beaufschlagt.
Schließlich angemerkt, dass das voranstehend erörterte Ausführungsbeispiel lediglich der beispielhaften Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt .
B e z u g s z e i c h e n l i s t e
1 Laserscanmikroskop,
Lasermikroskop
2 LaserIi chtquelle
3 Strahlumformer
4 Be leuchtungs strahlengang
5 Strahlteiler
6 Scaneinrichtung
7 Objektiv
8 Probe
9 Linsenanordnung
10 Blende
11 Detektor
12 Seedlaser
13 Pumpquelle (von 12)
14 Vorverstärker
15 Le istungsVerstärker
16 Pumpquelle (von 14)
17 Pumpquelle (von 15)
18 Regeleinrichtung
19 Photodiode
20 Mittel zur Erzeugung eines
Superkontinuumlasers
21 AOTF
22 Triggerleitung

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe (8) oder dgl . zum Zweck der
Bildaufnahme oder Analyse, insbesondere zur Anwendung in einem Lasermikroskop (1), vorzugsweise in einem Konfokalmikroskop, mit einer das Beleuchtungslicht aussendenden Laserlichtquelle (2), wobei das Laser- licht unmittelbar oder über eine Glasfaser in einen Beleuchtungsstrahlengang (4) eingekoppelt wird, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die Laserlichtquelle (2) auf ein Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme, schnell eingeschaltet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Triggersignal automatisch durch Hardware oder Software ausgelöst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Triggersignal durch Drücken eines Scanknopfes des Mikroskops ausgelöst wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Einschalten der Laserlichtquelle (2) in weniger als 1/10 Sekunde erfolgt .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zum Einschalten der Laserlichtquelle (2) eine vorzugsweise als Pumpdiode ausgeführte Pumpquelle (13, 16, 17) der Laserlichtquelle (2) bestromt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Regeleinrichtung (18) mit einem Regelkreis den Strom der Pumpquelle (13, 16, 17) in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) regelt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Regeleinrichtung (18) zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) eine Photodiode (19), vorzugsweise eine Monitor- Photodiode, umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtquelle (2) einen dauerhaft betriebenen bzw. bestromten Seedlaser (12) und mindestens einen nachgeordneten Laserverstärker (14, 15) umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserverstärker (14, 15) zweistufig aufgebaut ist, nämlich mindestens einen Vorverstärker (14) und mindestens einen Leistungsverstärker (15) umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die dem Seedlaser (12) nachgeordneten Laserverstärker (14, 15) durch Einschalten bzw. Bestromen der jeweiligen Pumpquelle (16, 17) aktiviert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Stufe (14) der Verstärkereinheit dauerhaft betrieben bzw. bestromt wird .
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Regeleinrichtung (18) mit einem Regelkreis den Strom der Pumpquelle (16, 17) der Verstärkereinheit (14, 15) in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) regelt und dass zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) eine Photodiode (19), vorzugsweise eine Monitor-Photodiode, vorgesehen ist.
13. Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. Bestrahlung eines Objekts, einer Probe (8) oder dgl . zum Zweck der Bildaufnahme oder Analyse, insbesondere zur An¬ wendung in einem Lasermikroskop (1), vorzugsweise in einem Konfokalmikroskop, mit einer das Beleuchtungslicht aussendenden Laserlichtquelle (2), wobei das Laserlicht unmittelbar oder über eine Glasfaser in einen Beleuchtungsstrahlengang (4) ein- koppelbar ist, insbesondere zur Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die Laserlichtquelle (2) auf ein Triggersignal hin unmittelbar vor dem eigentlichen Bedarf, beispielsweise unmittelbar vor der Bildaufnahme, schnell einschaltbar ist .
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Triggersignal automatisch durch Hardware oder Software ausgelöst wird.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Triggersignal beim Drücken eines Scankopfes des Mikroskops ausgelöst wird.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Einschalten der Laserlichtquelle (2) in einer Zeit weniger als 1/10 Sekunde erfolgt.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Einschalten der Laserlichtquelle (2) durch Bestromen der Pumpquelle
(13, 16, 17) der Laserlichtquelle (2) erfolgt.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpquelle (13, 16, 17) als Pumpdiode ausgeführt ist .
19. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine Regeleinrichtung (18) mit einem Regelkreis vorgesehen ist, der den Strom der Pumpquelle (13, 16, 17) in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) regelt.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Regeleinrichtung (18) zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle
(2) eine Photodiode (19), vorzugsweise eine Monitor- Photodiode, umfasst.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtquelle (2) einen dauerhaft betriebenen bzw. bestromten Seedlaser (12) und mindestens einen nachgeordneten Laserverstärker (14, 15) umfasst.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Laserverstärker (14, 15) zweistufig aufgebaut ist, nämlich mindestens einen Vorverstärker (14) und mindestens einen Leistungsverstärker (15) umfasst.
23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die dem Seedlaser (12) nachgeordneten Laserverstärker (14, 15) durch Ein- schalten bzw. Bestromen der jeweiligen Pumpquelle (16, 17) aktivierbar sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine Regeleinrichtung (18) mit einem Regelkreis vorgesehen ist, der den Strom der Pumpquelle (16, 17) in Abhängigkeit von der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) regelt, wobei zur Detektion der Ausgangsleistung der Laserlichtquelle (2) eine Photodiode (19), vorzugsweise eine Monitor-Photodiode, vorgesehen ist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Stufe (14) der Verstärkereinheit dauerhaft betrieben bzw. bestromt wird.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (4), d.h. nach der Laserlichterzeugung, nichtlineare optische Elemente, beispielsweise Frequenzverdoppler, Frequenzverviel¬ facher, Frequenzmischer, Frequenzkonvertierer, etc. angeordnet sind.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang (4), d.h. nach der Laserlichterzeugung, spektral verbreiternde Elemente, beispielsweise Materialien zur Selbstphasen- oder
Kreuzphasenmodulation, photonische Kristalle oder
Kristallfasern, Superkontinuum erzeugende Fasern
(photonisch, mikrostrukturiert, geeignet dotiert oder mit natürlicher negativer Gruppengeschwindigkeitsdispersion) angeordnet sind.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass als Laserlichtquelle (2) ein Superkontinuumslaser, vorzugsweise mit energiereichen Pikosekundenpulsen, verwendet wird und dass das Laserlicht in eine photonische Kristallfaser zur Weißlichterzeugung einkoppelbar ist.
EP08787083A 2007-08-21 2008-08-11 Verfahren und vorrichtung zur beleuchtung einer probe in einem lasermikroskop Ceased EP2181350A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007039498.7A DE102007039498B4 (de) 2007-08-21 2007-08-21 Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung und/oder Bestrahlung eines Objekts oder einer Probe
PCT/EP2008/060508 WO2009024490A2 (de) 2007-08-21 2008-08-11 Verfahren und vorrichtung zur beleuchtung einer probe in einem lasermikroskop

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2181350A2 true EP2181350A2 (de) 2010-05-05

Family

ID=39791128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP08787083A Ceased EP2181350A2 (de) 2007-08-21 2008-08-11 Verfahren und vorrichtung zur beleuchtung einer probe in einem lasermikroskop

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8913317B2 (de)
EP (1) EP2181350A2 (de)
DE (1) DE102007039498B4 (de)
WO (1) WO2009024490A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012016410B9 (de) 2012-08-21 2020-01-09 Toptica Photonics Ag Konfokalmikroskop
JP6378869B2 (ja) * 2013-10-24 2018-08-22 株式会社キーエンス 顕微鏡、顕微鏡システム、制御方法およびプログラム
CN107678104A (zh) * 2016-08-02 2018-02-09 南京理工大学 一种指示激光器耦合装置及其调整方法
CN118983685B (zh) * 2024-08-01 2025-12-05 上海科技大学 一种x射线自由电子激光和飞秒激光的时空耦合系统及方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3782823A (en) * 1972-03-23 1974-01-01 American Optical Corp Laser microprobe
US4555620A (en) * 1983-01-11 1985-11-26 Bausch & Lomb Incorporated Automatic illumination control for multi-objective optical instruments such as microscopes
YU208988A (en) * 1988-11-10 1990-12-31 Inst Jozef Stefan Device for rasters making
DE69028687T2 (de) 1989-12-15 1997-04-10 Canon Kk Vorrichtung zur optischen Messung einer Probe
CA2062106C (en) 1991-12-23 2002-08-20 Gregg Marwin Object sensing system for bar code laser scanners
GB2290411A (en) * 1994-06-15 1995-12-20 Zeiss Stiftung Laser and adapter for mounting it on a surgical microscope
US5757831A (en) * 1996-07-12 1998-05-26 Lightwave Electronics Corp. Electronic suppression of optical feedback instabilities in a solid-state laser
DE10115486A1 (de) * 2000-06-17 2001-12-20 Leica Microsystems Verschränkte-Photonen-Mikroskop
JP4576112B2 (ja) * 2003-11-19 2010-11-04 オリンパス株式会社 共焦点レーザ顕微鏡
DE102004051548A1 (de) * 2004-10-20 2006-05-04 Carl Zeiss Jena Gmbh Beleuchtungseinrichtung für Mikroskope
TWI261959B (en) * 2005-06-24 2006-09-11 Leadlight Technology Inc Power control device of laser module and method thereof
US7391561B2 (en) * 2005-07-29 2008-06-24 Aculight Corporation Fiber- or rod-based optical source featuring a large-core, rare-earth-doped photonic-crystal device for generation of high-power pulsed radiation and method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2009024490A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
US8913317B2 (en) 2014-12-16
DE102007039498A1 (de) 2009-02-26
WO2009024490A2 (de) 2009-02-26
DE102007039498B4 (de) 2017-08-03
US20110279890A1 (en) 2011-11-17
WO2009024490A3 (de) 2009-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19622359B4 (de) Vorrichtung zur Einkopplung der Strahlung von Kurzpulslasern in einem mikroskopischen Strahlengang
DE102008018476B4 (de) Mikroskopievorrichtung
EP1186882B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von Fluoreszenzlicht bei der konfokalen Rastermikroskopie
EP1108227B1 (de) Verfahren zum betrieb eines konfokalen laser scanning mikroskops
DE10235914B4 (de) Lichtquelle zur Beleuchtung mikroskopischer Objekte und Scanmikroskopsystem
EP2761276B1 (de) Auswerteschaltung für einen optoelektronischen detektor und verfahren zum aufzeichnen von fluoreszenzereignissen
EP2535756A1 (de) Mikroskop und Verfahren zur bildgebenden Fluoreszenzmikroskopie
DE102004009068B4 (de) Faseroptische Verstärkung von Lichtimpulsen
DE102011122230B4 (de) Optikanordnung und Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts
DE102007039498B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung und/oder Bestrahlung eines Objekts oder einer Probe
DE102004017956A1 (de) Mikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe
DE10139754B4 (de) Beleuchtungsverfahren für ein Scanmikroskop und Scanmikroskop
DE10029167B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Temperaturstabilisierung optischer Bauteile
DE10033269B4 (de) Vorrichtung zum Einkoppeln von Licht mindestens einer Wellenlänge einer Laserlichtquelle in ein konfokales Rastermikroskop
DE102011086230A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Beleuchtung und Detektion in der RESOLFT-Mikroskopie
WO2014095392A2 (de) Kurzpulslasersystem
WO2008086996A1 (de) Beleuchtungsvorrichtung mit nichtlinearen optischen elementen zur erzeugung von laserlicht in einem breiten spektralbereich mit homogener spektraler leistungsdichte
DE102014010185A1 (de) Verfahren zum Betrieb eines Laser-Scanning-Mikroskops
DE102008005337B4 (de) Laser-Scanning-Mikroskop mit variabler Lichtintensität und Steuerverfahren für ein solches
DE102007009659B4 (de) Verwendung eines diodengepumpten Festkörperlasers und Laser-Scanning-Mikroskop mit einem UV-Beleuchtungsstrahlengang
DE202013006817U1 (de) Gepulste Laserlichtquelle für die Fluoreszenzanregung
DE102009021993B4 (de) Scanmikroskop und zugehörige Verfahren
DE10313138A1 (de) Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts
DE10220871A1 (de) Optisch-Parametrischer Oszillator und Verstärker
DE19820575B4 (de) Verfahren zum Betrieb einer pulsierenden Laserlichtquelle

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20100318

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA MK RS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20100705

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R003

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN REFUSED

18R Application refused

Effective date: 20120117