EP2170935A2 - Variants de hpiv-2, et leurs applications medicales - Google Patents

Variants de hpiv-2, et leurs applications medicales

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Publication number
EP2170935A2
EP2170935A2 EP08831374A EP08831374A EP2170935A2 EP 2170935 A2 EP2170935 A2 EP 2170935A2 EP 08831374 A EP08831374 A EP 08831374A EP 08831374 A EP08831374 A EP 08831374A EP 2170935 A2 EP2170935 A2 EP 2170935A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
protein
sequence
isolates
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08831374A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bruno Lina
Olivier Terrier
Danielle Françoise THOUVENOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Hospices Civils de Lyon HCL
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Hospices Civils de Lyon HCL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Hospices Civils de Lyon HCL filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2170935A2 publication Critical patent/EP2170935A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
    • C12N2760/18621—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Definitions

  • the present application relates to human parainfluenza virus type 2 (HPIV-2) variants, and to their medical applications, more particularly to their diagnostic applications.
  • HPIV-2 human parainfluenza virus type 2
  • RNA viruses included in two genera of the subfamily Paramyxovirinae:
  • HPIVs are enveloped viruses. Their genome is about 15 kilobases in size, consisting of single-stranded RNA of negative polarity. The genome encodes six main proteins.
  • the NP, P and L genes encode nucleoprotein, phosphoprotein and polymerase complex (L) respectively. These three proteins form with the viral RNA the nucleocapsid (or holonucleocapsid). The nucleoprotein forms with I 1 RNA a support for the phosphoprotein and the polymerase, allowing transcrition and possibly replication of the genome.
  • the F and HN genes respectively encode the fusion protein F and hemagglutinin-neuraminidase HN, which are the two envelope proteins of the virus and participate in the mechanism of entry of the virus into the host cell.
  • the HN protein is responsible for the attachment of the virus to the cell by binding to cellular sialic acids. Once the virus is attached, the fusion protein F is activated, inserts one of these domains into the cell membrane and follows mechanisms that bring the two membranes together and melt them together.
  • HPIV2 isolate is the Greer isolate, which was isolated in 1955 from a patient.
  • HPIV-2 the detection of HPIV-2 in the hospital setting is currently done by isolation in cell culture (on susceptible LLCMK2 system), or by immunofluorescence and immuno-capture ELISA.
  • the antibodies used in these techniques were obtained from the strain HPI V-2 Gréer.
  • HPIV2 viruses which are sufficiently different from the Greer isolate, and more particularly the Greer, Toshiba and V98 isolates, not to be recognized by the anti-protein antibodies. envelope which, in the prior art, are usually used for the detection of HPIV2.
  • the prior art proposes some techniques for the detection of HPIV-2 by PCR, but the primers are designed with reference to the sequence of the Greer isolate, without taking into account that, as demonstrated by the present inventors, There is in fact a whole family of HPIV-2 viruses that are different from the Greer isolate, and more specifically the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • the inventors have identified a new phylogenetic group varying from HPIV2, and a new phylogenetic subgroup varying from HPIV2.
  • the application relates to HPIV2 viruses that are part of this new variant phylogenetic group, and to HPIV2 viruses that are part of this new phylogenetic variant subgroup of HPIV2.
  • the variant phylogenetic group of the invention is a group of HPIV2 virus which does not include Gréer, Toshiba and V98 isolates.
  • the variant phylogenetic subgroup of the invention is a group of HPIV2 viruses which does not include, in particular, the Greer, Toshiba and V98 isolates, and which furthermore does not comprise the V94 isolate. Five isolates from this group and also from this subgroup were deposited with CN. CM. for the purposes of the Budapest Treaty.
  • the application relates to the proteins, more particularly to the envelope proteins of the viruses of the variant phylogenetic group or subgroup of the invention, in particular to the F and HN proteins of these viruses, as well as to the fragments of these proteins.
  • the application also relates to the nucleic acids encoding these proteins or protein fragments.
  • the application also relates to means for the detection, more particularly the diagnosis of HPIV2.
  • the application relates to particular nucleotide regions of the viruses of the group or subgroup HPIV2 of the invention, which are sufficiently specific to allow their detection, preferably their specific detection, with respect to the isolate Greer, and more particularly compared to isolate Grey and
  • the application thus relates to nucleotide regions which have been specifically selected for the construction and production of real-time PCR systems, comprising at least one pair of primers and a probe, as well as to nucleotide regions which have been specifically selected for the construction and production of probes specially adapted for on-chip implementation.
  • the application also relates to these primers, these probes and to chips comprising at least one probe of the invention.
  • the application also relates to kits and compositions comprising at least one specific region and / or at least one primer and / or at least one probe of the invention.
  • the application also relates to antibodies directed against an envelope protein of at least one of the variant phylogenetic group or subgroup of the invention, and to hybridomas producing such antibodies.
  • FIG. 1 three-dimensional model of the ectodomains of the HN protein of the prototype HPIV-2 Gréer isolate of the prior art (left-hand model), and of an isolate of the invention -for example, HPIV-2 isolate 18620 ( right model).
  • This figure illustrates that isolates of the invention have a different HN protein than that of the HPIV-2 Greer isolate, especially with respect to glycosylation sites.
  • isolates of the invention include an S316N mutation, which creates a glycosylation site that does not present the HN protein of the isolate HPIV-2 Greer.
  • HPIV-2 Gréer isolate of the prior art human parainfluenza virus type 2
  • SV5 virus simian parainfluenza simian type 5 virus
  • FIG. 3 Phylogenetic analysis of F proteins (top tree) and HN (bottom tree) of the following isolates:
  • the other sequences were obtained from the Genbank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • Genbank database http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • the phylogenetic trees were constructed by the nearest neighbor method.
  • the scale indicates the number of amino acid substitutions per site, and the length of the horizontal branches is proportional to the indicated scale.
  • Branch reliability was evaluated by the "bootstrap" method (1000 replications) and the percentages resulting from this procedure are shown.
  • Figure 4 Schematic presentation of the structural domains of the HPIV-2 F protein, and presentation of amino acid sequence alignment of the F protein for five HPIV-2 isolates of the invention (isolates 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), for the HPIV-2 Greer isolate, and for the HPIV-2 V94 and V98 isolates (Vanderbilt / 1994 and Vanderbilt / 1998, respectively).
  • the F protein of the isolates of the invention differs from that of the Greer isolate in particular because of the following sequence elements: the sequence of the cleavage site (CS), which is KPRRER ( SEQ ID NO:
  • NCBI National Library of Medicine
  • the F protein of the isolates of the invention differs from that of the V98 isolate, in particular because of the same sequence elements as those observed with respect to the Greer isolate (T102P mutations, Q104R at the CS level, V1121 mutation at the of FP, D160T mutation at HR1), as well as in that at the level of the HR1 domain sequence of the F1 polypeptide, the isolates of the invention have: o the amino acid R at position 163, instead of of the amino acid K (mutation
  • the F protein of isolates of the invention differs from that of the V94 isolate in particular because of the sequence of the HR1 domain of the F1 polypeptide, which, in isolates of the invention, has the amino acid R in position 175 instead of amino acid H (mutation H175R).
  • the isolates 20283 and 20435 of the invention differ from the isolates 18620, 26056 and 26632 of the present invention. the invention, but also Greer, V94 and V98 isolates, in that their transmembrane domain has amino acid I at position 516 instead of amino acid V (mutation V516I).
  • the positions of the amino acids are here calculated with respect to the sequence of the F protein.
  • FIG. 4 more particularly describes the sequences of the cleavage sites (CS), the fusion peptides (FP) of the HR1, HR2 and TM domains of each of the five HPIV2 isolates of the invention (sequences 101-106, 107-126, 133-177, 451-484 and 487-518, respectively), aligned with the respective sequences of the Greer, V94 and V98 isolates.
  • the corresponding coding sequences can be deduced by the person skilled in the art, following the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code.
  • amino acid other than D in position 160 (HR1 region), preferably amino acid T at position 160 (D160T mutation compared to Greer and V98 isolates), and
  • amino acid other than H at position 175 (HR1 region), preferably amino acid R at position 175 (H175R mutation with respect to isolates V98 and V94).
  • Figure 5 Alignment of nucleotide sequences encoding F (1656 nucleotides) of HPIV-2 Greer strain and HPIV-2 strains of the invention (isolates 18620, 20283, 20435, 26056 and 26632); from top to bottom :
  • Each position that is not marked with the star symbol ( * ) is a position where at least one of the strains presented in alignment contains a nucleotide different from the others at that position.
  • Figure 6 alignment of nucleotide sequences encoding HN (1716 nucleotides) of HPIV-2 Greer strain and HPIV-2 strains of the invention (isolates 18620, 20283, 20435, 26056); from top to bottom :
  • Each position that is not marked with the star symbol ( * ) is a position where at least one of the strains presented in alignment contains a different nucleotide at that position.
  • Figure 7 F amino acid sequence alignment (551 aa) of HPIV-2 Greer strain and HPIV-2 strains of the invention (isolates 18620, 20283, 20435, 26056 and 26632); from top to bottom: - sequence F of the 18620 isolate of the invention (SEQ ID NO: 24),
  • sequence F of isolate 26632 of the invention (SEQ ID NO: 44).
  • sequence F of isolate 20283 of the invention (SEQ ID NO: 29),
  • sequence F of isolate 20435 of the invention (SEQ ID NO: 34),
  • sequence F of the isolate 26056 of the invention (SEQ ID NO: 39), - sequence F of the Greer isolate NC_003443 (SEQ ID NO: 49).
  • Each position that is not marked with the star symbol ( * ) is a position where at least one of the strains presented in alignment contains an amino acid different from the others at that position. It is thus easy to identify the positions and natures of the changes that each of the isolates presents with respect to one or more of the other strains presented in alignment, and more particularly with respect to the Gréer strain. It can thus be noted that, with respect to the Gréer strain, the isolates of the invention exhibit changes which are common to them at the level of the F sequence, in particular at the following amino acid positions: position 32 (acid) amine I for the Gréer strain, amino acid V for the isolates of the invention, that is to say an I32V substitution,
  • position 104 amino acid Q for the Gréer strain, amino acid P for the isolates of the invention, that is to say a substitution Q104P
  • position 112 amino acid V for the Gréer strain, amino acid I for the isolates of the invention, i.e. a V112I substitution
  • position 390 amino acid R for the Gréer strain, amino acid K for the isolates of the invention, that is to say a R390K substitution
  • position 524 amino acid S for the Gréer strain, amino acid A for isolates of the invention, i.e. S524A substitution
  • CDS coding nucleotide sequence
  • Figure 8 amino acid sequence alignment of HN (571 aa) of HPIV-2 Greer strain and HPIV-2 strains of the invention (isolates 18620, 20283, 20435, 26056); from top to bottom :
  • Each position that is not marked with the star symbol ( * ) is a position where at least one of the strains presented in alignment contains an amino acid different from the others at that position.
  • position 139 amino acid K for the Gréer strain, amino acid E for the isolates of the invention, that is to say a K139E substitution
  • position 186 amino acid M for the Gréer strain, amino acid I for the isolates of the invention, i.e., a M186I substitution
  • position 344 amino acid E for the Gréer strain, amino acid K for the isolates of the invention, that is to say an E344K substitution
  • position 348 amino acid A for the Gréer strain, amino acid I for the isolates of the invention, that is to say a substitution A348I
  • position 378 (amino acid A for the Gréer strain, amino acid E for the isolates of the invention, that is to say a substitution A378E), position 379 (amino acid R for the Gréer strain, amino acid E for the isolates of the invention, that is to say a substitution R379E),
  • CDS coding nucleotide sequence
  • the present application relates to a new phylogenetic group and subgroup of HPIV2 virus, and to medical applications that can be made from the teaching that is presently provided by the inventors, namely the existence of this new group and phylogenetic subgroup.
  • the present application relates more particularly to means for the detection, and more particularly the diagnosis, of HPIV2 viruses belonging to this group and / or this subgroup.
  • the inventors isolated several strains of HPIV2, which are variant strains with respect to the HPIV2 Gréer isolate, and more particularly with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • the Greer isolate is the reference isolate for the development of the detection tools, and more particularly diagnostic tools, of HPIV2.
  • the inventors show that there is a whole family of HPIV2 viruses which are sufficiently different from the Greer isolate, and more particularly the Greer, Toshiba and V98 isolates, not to be recognized by the anti-envelope protein antibodies. which, in the prior art, are usually used for the detection of HPIV2.
  • HPIV2 isolates forming part of the new phylogenetic group or subgroup of the invention are not recognized by the anti-HN antibody marketed by ARGENE S.A. (South Delta Technology Park 09120 Varilhes, France) under the reference 12E12G9.
  • strain HPIV2 which serves as a reference in the prior art for the development of diagnostic means HPIV2 is a strain which dates from 1955 (Gréer strain).
  • the inventors thus highlight the fact that there is a mismatch between the means currently used for the diagnosis of HPIV2, and the nature of the HPIV2 strains currently observed in patients. As the strains evolve, it is highly likely that this mismatch will increase.
  • the new phylogenetic group of HPIV2 isolates of the invention is characterized by the fact that it does not include the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • Figure 3 gives a representation of the phylogenetic group of the invention, which is based on the F and HN envelope proteins (top tree: protein F, bottom tree: HN protein).
  • the new phylogenetic group of the invention comprises in particular the isolates which, in FIG. 3, are designated by HPIV-2 Lyon / 20283/2001, HPIV-2 Lyon / 20435/2001 HPIV-2 Lyon / 18620/2001 HPIV-2 Lyon / 26632/1997 HPIV-2 Lyon / 26056/1997, that is to say five new isolates which were isolated by the inventors and which were deposited with the CNCM, for the purposes of the Budapest Treaty.
  • This new phylogenetic group also includes HPIV-2 isolate Vanderbilt / 1994 ( ⁇ isolat V94).
  • the new subgroup of the invention comprises especially the HPIV-2 Lyon / 20283/2001, HPIV-2 Lyon / 20435/2001 HPIV-2 Lyon / 18620/2001 HPIV-2 Lyon / 26632/1997 HPIV-2 Lyon isolates / 26056/1997, but does not include HPIV-2 Vanderbilt isolate / 1994 ( ⁇ isolat V94). Indeed, analyzes of F and HN sequences make it possible to distinguish a few differences between the V94 isolate and the subgroup of which the five particular isolates of the invention are part.
  • the HPIV2 isolates that are closest to the new group and the new phylogenetic subgroup of isolates HPIV2 of the invention, but without being part of it, are the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • the new phylogenetic group and the new phylogenetic subgroup of the invention do not comprise microorganisms that would not be Rubulavirus viruses, and more particularly that they do not include microorganisms that would not be HPIV2 viruses. .
  • the isolate which in the prior art is described as the Toshiba isolate, is 99.8% identical to the Geant isolate at the nucleotide level.
  • the sequence of the Toshiba isolate has been reported in the databases, in particular under the numbers Genbank X57559, NC_003443. It will be appreciated that the prior art demonstrates that the differences that the sequence of the Toshiba isolate appears to exhibit with respect to the sequence of the Greer isolate are in fact rather due to cDNA cloning errors, synthesis and / or sequence analysis, only to the situation the natural reality of the isolate in question (see Skiadopoulos et al., 2003, Journal of Virology, 77 (1): 270-279).
  • the Toshiba isolate is therefore in fact considered to be identical to the Greer isolate. In any case, a difference with respect to the Greer isolate is enough to make a difference compared to the Toshiba isolate.
  • the new phylogenetic group of the invention may, for simplification, be designated by phylogenetic group of variants HPIV2, or variant phylogenetic group, or group of the invention.
  • the new phylogenic subgroup of the invention may be referred to as phylogenic subgroup of variants HPIV2 variant phylogenetic subgroup, or subgroup of the invention.
  • the new group of the invention is defined by the fact that the viruses of this group comprise:
  • viruses of the group of the invention comprise a protein F and a protein HN different from the proteins F and HN, respectively, of the isolate Greer.
  • viruses of the group of the invention may comprise:
  • the viruses of the group of the invention exhibit a protein F different from the F proteins of the Greer and V98 isolates, and a HN protein different from the HN proteins of the Greer and V98 isolates.
  • This or these protein differences may in particular be one or more amino acid sequence differences.
  • a virus of the group of the invention therefore has: a protein F which, when its amino acid sequence is aligned with that of the Greer isolate, comprises at least one amino acid different from that presented by the sequence of the F protein of the 'isolate Gréer at the same position, and / or (preferably, and)
  • an HN protein which, when its amino acid sequence is aligned with that of the Greer isolate, comprises at least one amino acid different from that presented by the sequence of the HN protein of the Greer isolate at the same position.
  • a virus of the group of the invention may therefore have: an F protein which, when its amino acid sequence is aligned with those of the Greer and V98 isolates, comprises at least one amino acid different from that presented by the sequence of the F protein of the isolate Grate at the same position and at least one amino acid different from that exhibited by the V98 isolate F protein sequence at the same position, and / or (preferably, and)
  • a HN protein which, when its amino acid sequence is aligned with that of the Greer and V98 isolates, comprises at least one amino acid different from that presented by the sequence of the HN protein of the Greer isolate at the same position and at least one amino acid different from that presented by the sequence of the HN protein of isolate V98 at the same position.
  • Said at least one different amino acid with respect to the Greer isolate and said at least one different amino acid from the V98 isolate may be at different positions.
  • the virus of the group of the invention has at least two types of differences (on its protein F and / or its HN protein), namely at least one difference at a given position with respect to the Greer isolate, and at least one difference at another position with respect to isolate V98.
  • said at least one different amino acid with respect to the Greer isolate may be in the same position as said at least one different amino acid with respect to isolate V98.
  • the F protein of the virus of the group of the invention comprises, in its amino acid sequence, at least one position where the amino acid present therein is different from that presented at the same position in the sequence of the Greer and V98 isolates, and / or (preferably, and), the HN protein of the virus of the group of the invention comprises, in its amino acid sequence, at least one position where the amino acid that it presents there is different from that presented at the same position in the sequence of isolates Greer and V98.
  • the expression “at least one” includes in its meaning all the higher integer values, up to the maximum possible value in the set considered.
  • at least one amino acid includes in its meaning “at least two amino acids”, “at least three amino acids”, etc., up to the maximum number of amino acid changes contained in the considered whole.
  • in at least one position includes in its meaning “in at least two positions", “in at least three positions", etc., up to the maximum number of positions contained in the set considered.
  • viruses of the variant phylogenetic group of the invention can be defined by the fact that they present an F protein and / or a HN protein. (envelope proteins) of particular sequence (s). More particularly:
  • the amino acid sequence of their F protein has an identity of greater than 99.3%, preferably at least 99.4%, more preferably at least 99.5% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (F protein of isolates 18620, 20283, 20435, 26056 , 26632, respectively), and / or that
  • the amino acid sequence of their HN protein has an identity of more than 98.6%, preferably at least 98.7%, more preferably at least 98.8% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates 18620, 20283, 20435, 26056, respectively).
  • the identity percentages shown above, as well as, unless otherwise indicated, in the remainder of the request, are global identity values, i.e., an identity calculated over the entire length of the sequence.
  • the viruses of the variant phylogenetic group of the invention have the percentages indicated above with each of the SEQ IDs indicated.
  • An alternative or complementary means for defining the differences that the viruses of the phylogenetic variant group of the invention have with respect to the Greer isolate, and more particularly with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates, is the fact that the viruses of the group
  • the phylogenic variant of the invention may have at least one change in the amino acid sequence of the F protein relative to the Greer isolate, and more particularly with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • a virus of the group of the invention may have an F protein whose amino acid sequence differs from that of the Greer isolate in at least one of the following positions (positions of the amino acids in the F protein sequence): positions 32, 102 , 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524.
  • a virus of the group of the invention may have at least one of the following differences: a) in position 32, an amino acid other than I, preferably amino acid C (amino acid I for the Gréer strain, amino acid V for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution I32V), and / or b) in position 102, an amino acid other that T, preferably the amino acid P (amino acid T for the Gréer strain, amino acid P for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution T102P), and / or c) in position 104, an amino acid other than Q, preferably the amino acid P (amino acid Q for the Gréer strain, P-amino acid for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution Q104P), and or d) in position 112, an amino acid other than V, preferably amino acid I (amino acid V for the Gré strain).
  • amino acid I amino acid I for the five particular isolates of the invention, i.e., a V1121 substitution), and / or e) in position 160, an amino acid other than D, preferably amino acid T (amino acid D for the Gréer strain, amino acid T for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution D160T), and / or f) at position 247, an amino acid other than N, preferably amino acid K (amino acid N for the Gréer strain, amino acid K for the five particular isolates of the invention is that is to say a substitution N247K), and / or g) at position 538, an amino acid other than F, preferably amino acid V (amino acid F for the Gréer strain, amino acid V for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution F538V), and / or h) in position 96, an amino acid other than T, preferably amino acid A (amino acid T for the Gréer strain, amino acid A for
  • positions of differences with respect to the F protein of the Greer isolate may also be positions of difference (s) with respect to the V98 isolate. This is particularly the case for positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
  • the present application thus relates to any HPIV2 virus, the F protein of which comprises an amino acid different from that presented by the F protein of the Greer isolate and that presented by the F protein of the V98 isolate in at least one of the amino acid positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, preferably at least two of these positions, preferably at least three of these positions, more preferably at least four of these positions, still more preferably at least at least five of these positions, most preferably in at least six of these positions, and more particularly in all of these seven positions.
  • a virus of the group of the invention may have at least one of the amino acid sequence differences F a) to g) above mentioned.
  • the present application thus relates to any HPIV2 virus, the protein F of which has at least one of the seven differences of sequence a) to g) mentioned above, preferably at least two of these differences, preferably at least three of these differences, more preferably at least four of these differences, still more preferably at least five of these differences, most preferably at least six of these differences, and more particularly all of these seven differences.
  • positions 102, 104, 112 and 160 of the F protein sequence are particularly notable, and more particularly the amino acid sequence differences F b), c), d) and e) above. Indeed, these particular positions are located at sites characteristic of HPIV2:
  • the positions 102 and / or 104 are located at the site of cleavage of the F protein (CS in FIG. 4),
  • position 112 is located at the level of the fusion peptide (FP in FIG. 4),
  • position 160 is located at the HR1 domain of the F protein.
  • the present application is thus relative to any HPIV2 virus
  • the protein F comprises an amino acid different from that presented by the F protein of the Greer isolate and that presented by the F protein of the V98 isolate in at least one of the amino acid positions 102, 104, 112, 160, preferably at least two of these positions, preferably at least three of these positions, more preferably at all of these four positions.
  • Such a virus may furthermore have an F protein:
  • amino acid sequence comprises an amino acid different from that presented by the F protein of the Greer isolate and that presented by the protein F of isolate V98 at at least one of amino acid positions 32, 247, 538, and / or
  • amino acid sequence comprises an amino acid different from that presented by the F protein of the Greer isolate in at least one of the amino acid positions 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538.
  • the present application relates to any HPIV2 virus, the F protein of which has at least one of the four particular differences of F protein mentioned above (protein sequence differences F b), c), d), e)), preferably at least two of these differences, preferably at least three of these differences, more preferably all of these four differences.
  • a virus HPIV2 can of course also have:
  • An alternative or complementary means for defining the differences that the viruses of the phylogenetic variant group of the invention have with respect to the Greer isolate, and more particularly with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates, is the fact that the viruses of the group
  • the phylogenetic variant of the invention may exhibit changes in the amino acid sequence of the HN protein.
  • a virus of the group of the invention may comprise a HN protein whose amino acid sequence differs from that of the Greer isolate in at least one of the following positions (positions of the amino acids in the sequence of the HN protein): positions 57, 114 , 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
  • a virus of the group of the invention may have at least one of the following differences: a) in position 57, an amino acid other than D, preferably amino acid E (amino acid D for the Gréer strain, amino acid E for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution D57E), and / or b) at position 1-14, an amino acid other than T, preferably amino acid A (amino acid T for the Gréer strain, amino acid A for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution T1 14A), and / or c) in position 139, an amino acid other than K, preferably amino acid E (amino acid K for the Gréer strain, amino acid E for the five particular isolates of the invention, that is to say a substitution K139E), and / or d) in position 195, an amino acid other than T, preferentially amino acid A (amino acid T for the Gréer strain, amino acid
  • positions of difference with respect to the HN protein of the Greer isolate may also be positions of difference (s) with respect to isolate V98. This is particularly the case for the positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
  • the present application thus relates to any HPIV2 virus, whose HN protein comprises an amino acid which is different from that presented by the HN protein of the Greer isolate, and which is also different from that presented by the HN protein of the isolate V98 at at least one of the amino acid positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, preferably at least two of these positions, preferably at least three. of these positions, more preferably in at least four of these positions, still more preferably in at least five of these positions, most preferably in at least six of these positions, and more particularly in all of these twelve positions.
  • the HN protein of said virus may further comprise an amino acid different from that presented by the HN protein of the Greer isolate in at least one of the aminocidal positions 100, 186, 316, 323, 479 , 497, 513, 514.
  • a virus of the group of the invention may have at least one of the amino acid sequence differences HN a) to I) above mentioned.
  • the present application thus relates to any HPIV2 virus, the F protein of which has at least one of the twelve differences of sequence a) to I) above, preferably at least two of these differences, preferably at least three of these differences, more preferably at least four of these differences, still more preferably at least five of these differences, most preferably at least six of these differences, and more particularly all of these twelve differences.
  • the HN protein of said virus may further have at least one of the above-mentioned differences m) to t).
  • the positions 316, 513 and 514 of the HN protein sequence are particularly notable, and more particularly the amino acid sequence differences HN o) s) and t) mentioned above. .
  • the Greer isolate has the amino acid S at position 316 of their HN protein.
  • the Greer isolate does not have a glycosylation site at this position.
  • the viruses of the phylogenetic variant group of the invention may have an amino acid other than S, and more particularly an amino acid other than S which creates a glycosylation site, preferably the amino acid N (asparagine).
  • the viruses of the variant phylogenetic group of the invention may therefore have a new glycosylation site, with respect to the Greer isolate.
  • the viruses of the phylogenetic group of the invention may, alternatively or complementarily, be distinguished by the fact that the viruses of the variant phylogenetic group of the invention have, at positions 512-515, the protein HN Tertiary structure different from that observed in HPIV2 Greer virus.
  • FIG. 1 presents the predicted tertiary structure of the variant HN protein of the variant phylogenetic group of the invention.
  • the arrow A indicates a loop which, in the Gréer strain (left model), is oriented towards the interior of the HN protein, whereas in the isolates of the variant phylogenetic group of the invention (right model ) this loop, indicated by an arrow A 'is not oriented towards the inside of the protein, but is oriented towards the outside of the HN protein.
  • This mouth corresponds to positions 512-515 of the HN protein, and more particularly to the 513-514 positions of the HN protein of the isolates of the invention.
  • amino acids that are in positions 513 and 514 of the HN protein sequence are, for the Greer isolate, S and A, respectively, while they are N and S, respectively, for the five particular isolates of the invention.
  • the presence of an amino acid other than S, preferably amino acid N, at position 513 of the HN protein, and of an amino acid other than A, preferably amino acid S, at position 514 of the HN protein is a means of defining viruses belonging to the phylogenic group of variants of the invention.
  • the present application thus relates to any HPIV2 virus, the HN protein of which comprises:
  • an amino acid different from that presented by the HN protein of the Greer isolate in at least one of the amino acid positions 316, 513, 514, preferably in position 316 or in positions 513 and 514, preferably in positions 36, 513 and 514 .
  • the present application relates to any HPIV2 virus, the HN protein of which has: at least one of the above-mentioned HN protein sequence differences from I) (differences commonly presented with respect to isolate Greer and isolate V98), preferably at least two of these differences, preferably at least three of these differences, more preferably at least four of these differences, still more preferably at least five of these differences, very preferably the together these twelve differences, and
  • an HPIV2 virus belonging to the variant phylogenetic group of the invention can be defined by the fact that: i. the amino acid sequence of its F protein has an identity of greater than 99.3%, preferably at least 99.4%, more preferably at least 99.5% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the five particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (F protein of isolates 18620, 20283, 20435, 26056 , 26632, respectively), and preferably with each of these SEQ ID NO:, and / or in that ii.
  • the amino acid sequence of its HN protein has an identity of more than 98.6%, preferably at least 98.7%, more preferably at least 98.8% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates 18620,20283, 20435, 26056, respectively), and preferably with each of these SEQ ID NO:, and / or in that iii.
  • the amino acid sequence of its F protein differs from that of the Greer isolate in at least one of the following amino acid positions: 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524 (amino acid positions at the sequence of the protein F); and / or by the fact that iv. the amino acid sequence of its protein F has at least one of the eleven differences of sequence F a) to k), as mentioned above, and / or in that v.
  • the amino acid sequence of its F protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following amino acid positions: 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538 (amino acid positions at the sequence of the protein F); and / or by the fact that vi. the amino acid sequence of its protein F exhibits at least one of the seven differences of sequence F a) to g), as mentioned above, and / or in that vii. the amino acid sequence of its F protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following amino acid positions: 102, 104, 112, 160 (positions of the amino acids in the sequence of protein F), as mentioned above; and / or by the fact that viii.
  • the amino acid sequence of their F protein has at least one of the four differences of sequence F b) to e), as mentioned above, and / or in that ix.
  • the amino acid sequence of its F protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following amino acid positions: 102, 104, 112, 160 (positions of the amino acids within the sequence of the protein F), and furthermore differs from: that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the amino acid positions 32, 247, 538, and / or o that of the Greer isolate at least one of the amino acid positions 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538; and / or by the fact x.
  • the amino acid sequence of their F protein exhibits at least one of the four differences of sequence F b) to e), as mentioned above, and furthermore presents: at least one of the three differences of sequence F a ), f) g), as mentioned above, and / or o at least one of the sequence differences F a), f) to k) above; and / or by the fact that xi. the amino acid sequence of its HN protein differs from that of the Greer isolate in at least one of the following aminocyclic positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513,
  • amino acid sequence of its HN protein exhibits at least one of the twenty HN sequence differences a) to t), as mentioned above, and / or in that xiii. the amino acid sequence of its HN protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following amino acid positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482; and / or by the fact that xiv.
  • the amino acid sequence of its HN protein has at least one of the twelve sequence differences HN a) to I), as mentioned above, and / or in that xv.
  • the amino acid sequence of its HN protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following amino acid positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, and furthermore differs from that of the Greer isolate in at least one of amino acid positions 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514; and / or by the fact that xvi.
  • the amino acid sequence of its HN protein has at least one of the twelve HN sequence differences a) to I), as mentioned above, and furthermore has at least one of the sequence differences HN m) at t ), as above mentioned; and / or by the fact that xvii. the amino acid sequence of its HN protein differs from that of the Greer isolate and that of the V98 isolate in at least one of the following aminocyclic positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, and differs further from that of the Greer isolate in at least one of the amino acid positions 316, 513, 514; and / or by the fact that xviii. the amino acid sequence of its HN protein exhibits at least one of the twelve HN sequence differences a) to I), as mentioned above, and also has at least one of the sequence differences HN o) s) t), as mentioned above.
  • a virus of the group of the invention is defined by at least one of the characteristics listed above under i, ii, v. at x., xiii. at xviii, preferably by at least one of the features listed above under i., ii., vii., xiii.
  • a virus of the group of the invention is defined by:
  • the variant phylogenetic group of the invention also comprises the V94 isolate.
  • V94 isolate would present envelope proteins, and more particularly F and / or HN proteins, which are sufficiently different from those of the Greer isolate, to consider that a means which makes it possible to detect the Greer isolate via the detection of its envelope proteins does not necessarily make it possible to detect the V94 isolate.
  • the viruses of the variant phylogenetic subgroup of the invention can be defined by the fact that they are not recognized by certain anti-inflammatory antibodies.
  • -HPIV2 of the prior art and more particularly by antibodies of the prior art which are directed against the HN envelope protein of HPIV2 virus.
  • anti-HN antibodies of the prior art have in fact been produced or constructed from epitope (s) of the HN protein of strain HPIV2 which was used as reference in the prior art, namely the HPIV2 Gréer strain.
  • the inventors show that the HN protein of the viruses of the variant phylogenetic subgroup of the invention does not comprise the same epitopes as the HN protein of the Greer isolate. More particularly, certain epitopes that are present in the HN protein of the Greer isolate are not present in the HN protein of the variant phylogenetic group viruses of the invention. As a result, the viruses of the variant phylogenetic group of the invention are not recognized by certain anti-HN antibodies of the prior art.
  • An example of such anti-HN antibodies of the prior art is the antibody marketed by ARGENE S.A. (South Delta Technology Park 09120 Varilhes, France) under the reference 12E12G9. This prior art antibody recognizes an epitope on the HN protein of the Greer isolate, which is not present in the viruses of the variant phylogenetic subgroup of the invention.
  • viruses of the variant phylogenetic subgroup of the invention may be defined as having in common the substitution of the amino acid which is at position 175 within the sequence of the F protein, and or a substitution of the amino acid which is position 186 of the HN protein sequence.
  • the 175 position of the F protein lies in the HR1 domain of the Ft polypeptide.
  • the V94 isolate has the amino acid H (histidine).
  • the position 186 of the HN protein is very close to the catalytic site of the protein, and the nature of the amino acid present at this position is therefore likely to have an influence on the activity of the protein.
  • isolate V94 has amino acid M (and it can be noted that the Gréer isolate also has amino acid M at position 186).
  • a virus belonging to the phylogenic subgroup of variants of the invention can therefore be defined by the fact that: it belongs to the phylogenic group of the invention as defined above, for example by means of one or more of the above-mentioned group characteristics (such as percent protein identity F and / or HN, sequence difference (s) F and / or HN, tertiary structure of different HN), and furthermore, by the fact that:
  • anti-HN monoclonal antibodies of the prior art which, such as the antibody marketed by Argene under the reference 12E12G9, were constructed and / or obtained from the Hn protein of the isolate Rig, and / or
  • the amino acid at position 175 of the F protein sequence of a virus belonging to the phylogenic subgroup of variants of the invention is the amino acid R (asparagine).
  • the amino acid at position 186 of the HN protein sequence of a virus belonging to the phylogenetic subgroup of variants of the invention is amino acid I (isoleucine).
  • an HPIV2 virus that is part of the phylogenetic subgroup of HPIV2 variants of the invention can be defined: by the fact that it has at least one of the characteristics of group i., ii., v. at x., xiii. at xviii. above listed, and
  • viruses of the phylogenetic subgroup of the invention one or more eighteen characteristics i. at xviii. can be used, as indicated above in the definition of the variant phylogenetic group of the invention. All combinations of features are explicitly covered by this application.
  • HPIV2 virus that is part of the phylogenetic subgroup of HPIV2 variants of the invention can be defined:
  • anti-HN monoclonal antibodies of the prior art which, such as the antibody marketed by Argene under the reference 12E12G9, were constructed and / or obtained from the HN protein of the isolate Rig.
  • HPIV2 viruses which are part of a phylogenetic subgroup of variants HPIV2 which does not include the isolates HPIV2 Greer, Toshiba, V98 and V94, which can be defined by the fact that:
  • the amino acid sequence of their F protein has an identity of more than 99.85%, preferably at least 99.90%, more preferably at least 99.95% with the amino acid sequence of the F protein, at least one of the particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (F protein of isolates 18620, 20283, 20435, 26056 , 26632, respectively), and preferably with each of these sequences, and / or the amino acid sequence of their HN protein has an identity of more than 99.15%, preferably of at least 99.20%, more preferably at least 99.30% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins of the particular isolates of the invention, that is to say with at least one of the sequences of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates 18620, 20283, 20435, 26056, respectively), and preferably with each of these sequences, and furthermore by the fact that:
  • amino acid other than M preferably amino acid I (isoleucine).
  • HPIV2 viruses which are part of a phylogenetic subgroup of HPIV2 variants which does not include the HPIV2 Greer, Toshiba, V98 and V94 isolates, and which can be defined by the fact that: the amino acid sequence of their F protein has an identity of more than
  • the amino acid sequence of their HN protein has an identity of more than 99.15%, preferably at least 99.20%, more preferably at least 99.30% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins of the particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates 18620, 20283, 20435, 26056, respectively), and preferably with each of these sequences, ⁇ and furthermore by the fact that:
  • An alternative or complementary means for defining the viruses of the phylogenetic subgroup of the invention, without necessarily using at least one of the group characteristics mentioned above, is the% identity that the amino acid sequence of their F and / or HN proteins.
  • viruses of the phylogenic subgroup of the invention can be defined in that: the amino acid sequence of their protein F preferably has an identity of more than 99.85%, preferably at least 99, 90%, more preferably at least 99.95% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the particular isolates of the invention, that is to say with at least one of the sequences of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (F protein of isolates 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectively), and preferably with each of these sequences, and / or
  • the amino acid sequence of their HN protein has an identity of greater than 99.15%, preferably at least 99.20%, more preferably at least 99.30% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates 18620,20283, 20435, 26056, respectively), and preferably with each of these sequences.
  • HPIV2 viruses that meet these identity criteria are part of the phylogenetic subgroup of the invention, without necessarily having to use one of the group i characteristics. at xviii. above mentioned.
  • the present application therefore relates to any HPIV2 virus: i. that meets at least group characteristics i. at xviii., as mentioned above, and at least one of the subgroup characteristics, as above mentioned (amino acid other than H in position 175 of its F protein, preferentially the R amino acid).
  • amino acid other than M at position 186 of its HN protein preferentially the amino acid I, the unrecognized virus of the anti-HN monoclonal antibodies of the prior art
  • / or ii. whose amino acid sequence of its protein F has an identity of more than 99.85%, preferably at least 99.90%, more preferably at least 99.95% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the particular isolates of the invention, i.e.
  • SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 F protein isolates 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectively
  • each of these sequences and / or iii. whose amino acid sequence of its HN protein has an identity of more than 99.15%, preferably at least 99.20%, more preferably at least 99.30% with at least one of the amino acid sequences of the HN proteins particular isolates of the invention, that is to say with at least one of the sequences of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolates
  • An HPIV2 virus belonging to the phylogenetic subgroup of the invention has at least one of these characteristics i. to iii. above, for example one, two, or all of these characters.
  • the request focuses on five particular viruses. These five particular viruses are those which were deposited with the CNCM on May 10, 2007, under the filing numbers 1-3761 (isolate 26056), I-3762 (isolate 26632), I-3763 (isolate 18620), I- 3764 (isolate 20283), I-3765 (isolate 20435). They are part of the phylogenetic group of the invention, and also the phylogenetic subgroup of the invention.
  • the present application relates to any HPIV-2 virus whose protein F has a value of molecular mass and / or isoelectric point and / or aliphatic index identical to that (s) of the protein F of at least the one of the particular viruses of the invention, and / or whose HN protein has a value of molecular mass and / or isoelectric point and / or aliphatic index identical to that (s) of the HN protein of at least l one of the particular viruses of the invention.
  • the present application relates more particularly to any HPIV-2 virus whose protein F has an isoelectric point value identical to that of the protein F of at least one of the particular viruses of the invention, and / or whose HN protein has an isoelectric point value identical to that of the HN protein of at least one of the particular viruses of the invention.
  • an HPIV-2 virus of the invention has an F protein which has at least two parameters among the molecular weight and / or isoelectric point and / or aliphatic index parameters, the values of which are identical respectively to those parameters of at least one of the particular viruses of the invention, and / or of which a HN protein which has at least two parameters among the molecular weight and / or isoelectric point and / or aliphatic index parameters, whose values are respectively identical to those of the parameters of at least one of the particular viruses of the invention.
  • said at least two parameters comprise the isoelectric point parameter.
  • the application also relates to the nucleic acids, the sequence sequence of which comprises or consists of (the nucleic acid sequence of an HPIV2 virus of the invention, and more particularly): a) the sequence of the RNA genomic HPIV2 virus of the group or subgroup of the invention, or b) the sequence of a cDNA (single-strand or double-strand) obtainable by reverse transcription (or reverse transcription and polymerase) of such a genomic RNA, or c) the sequence which is complementary to one of the sequences referred to under a) and b) above, over the entire length of this sequence a) or b).
  • the present application relates to any protein which is that of a virus which is part of the group, or optionally the subgroup, phylogenetic variant of the invention.
  • protein includes in its scope non-glycosylated proteins, as well as glycoproteins.
  • viruses that are part of the group or, where appropriate, the phylogenetic variant subgroup of the invention has a viral envelope different from that usually observed in the prior art, more particularly different from that of the Greer isolate, preferentially different from the Greer, Toshiba and V98 isolates.
  • the envelope of the viruses that are part of the phylogenetic subgroup of the invention is furthermore different from that of the V94 isolate.
  • the present application therefore relates to any envelope protein of a virus that is part of the group, or optionally the subgroup, phylogenetic variant of the invention.
  • This envelope protein may be, or include, the F protein of such a virus and / or the HN protein of such a virus.
  • the present application relates more particularly to the envelope proteins which are specific for the viruses of the subgroup of the invention, preferably of the five particular isolates of the invention which have been deposited with the CNCM under the numbers 1-3761 to I-3765.
  • Said protein F has a number of differences (s) with respect to a F protein of the Greer isolate, more particularly with respect to the F proteins of the Greer, Toshiba and V98 isolates, preferentially with respect to the F proteins of the Greer, Toshiba isolates. , V98 and V94.
  • the sequence of this protein F can have a number of substitution (s) of amino acid (s), with respect to the sequence of the F protein of the Greer isolate, more particularly with respect to F proteins from Greer, Toshiba and V98 isolates, preferentially compared to the F proteins of Greer, Toshiba, V98 and V94 isolates.
  • the F and HN proteins can be defined by a combination of at least one group characteristic (at least one difference with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates) and at least one subgroup characteristic (at least one difference from V94 isolate).
  • an amino acid other than T (threonine), preferentially the amino acid P (proline), and / or in position 104, an amino acid other than Q (glutamine), preferentially the amino acid R (arginine).
  • said protein F comprises both amino acid P at position 102 and amino acid R at position 104.
  • isolates Greer, Toshiba and V98 have the amino acid T (threonine), and not the amino acid P.
  • said protein F has the amino acid E at position 105.
  • the sequence of this cleavage site is KPRRER (SEQ ID NO: 14).
  • an amino acid other than V (valine), preferentially amino acid I (isoleucine), and / or
  • an amino acid other than D amino acid
  • amino acid T amino acid
  • Position 1 12 is in the fusion peptide (FP); position 160 is in the HR1 domain of the F1 polypeptide.
  • isolates Greer and V98 have the amino acid V (valine). In position 160, isolates Greer and V98 have amino acid D (aspartic acid).
  • an amino acid other than I isoleucine
  • preferentially amino acid V amino acid V
  • an amino acid in position 247, an amino acid has N, preferably amino acid K,
  • the said virus F protein belonging to the variant phylogenetic group of the invention may have one, two, three or more, if not all, of the above-mentioned differences. Any combination of these differences is explicitly targeted by the application.
  • the F protein of the virus belonging to the variant phylogenetic subgroup of the invention may, in addition to the difference (s) mentioned above, present one or more differences with respect to the protein.
  • F of isolate V94 the F protein of a virus belonging to the phylogenetic subgroup of the invention has an amino acid other than H in position 175, preferably amino acid R (H175R mutation).
  • an amino acid other than L preferably the P-amino acid, and / or
  • an amino acid other than N preferably amino acid T, and / or
  • amino acid other than V preferably amino acid I (isoleucine).
  • the isolate 20283 of the invention has the L4P substitution and the V516I substitution, with respect to the V94 isolate, and also with respect to the Greer isolate,
  • the isolate 26056 of the invention has the substitution N403T, with respect to the isolate V94,
  • the isolate 20435 has the substitution V516I with respect to the isolate V94, and also with respect to the isolate Greer.
  • the said virus protein F belonging to the variant phylogenetic subgroup of the invention may have one, two or three of the above-mentioned differences, in addition to at least one difference in sequence F with respect to the Greer isolates. Toshiba and V98. Any combination of these differences is explicitly targeted by the application.
  • HPIV2 viruses belonging to the group or, where appropriate, the variant phylogenetic subgroup of the invention may therefore be variants which present the mutation (s) V112I and / or D160T within the F protein by compared to the Greer, Toshiba and V98 isolates and the H175R mutation within the F protein compared to the V94 isolate.
  • the present application relates more particularly to any F protein, whose amino acid sequence has an identity of more than 99.85%, preferably at least 99.90%, more preferably at least 99.95% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the particular isolates of the invention, i.e. with at least one of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (F protein isolates 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectively), and preferably with each of these sequences.
  • the present application and more particularly relates to proteins, and more particularly to envelope proteins, which comprise at least one protein whose sequence is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (cf. Table 5).
  • An envelope protein of the invention may be, or include, the HN protein of a virus belonging to the group, or optionally the variant, plylogenic subgroup of the invention.
  • This HN protein may have at least one of the following elements, preferably at least two of these elements, more preferably all of the following elements (elements of difference with respect to the HN proteins of the Greer, Toshiba and V98 isolates): in position 57, an amino acid other than D, preferably amino acid E,
  • an amino acid other than T preferably amino acid A
  • an amino acid other than K preferably amino acid E
  • an amino acid other than T in position 195, an amino acid other than T, preferentially amino acid A, in position 201, an amino acid other than A, preferably amino acid S,
  • an amino acid other than P preferably amino acid T
  • an amino acid other than E preferably amino acid K
  • an amino acid other than A preferably amino acid I (isoleucine)
  • an amino acid other than A preferably amino acid E
  • an amino acid other than R preferably the amino acid E
  • an amino acid other than T preferably amino acid M
  • an amino acid other than Q preferably amino acid R.
  • a HN protein of a virus belonging to the phylogenetic subgroup of the invention further has at least one difference from the HN protein of the V94 isolate.
  • this HN protein has an amino acid other than M, preferably amino acid I (isoleucine) at position 186.
  • the V94 isolate has amino acid M at position 186.
  • the Geant isolate also has the amino acid M in position 186.
  • the five particular isolates of the invention which have been deposited with the CNCM, have the amino acid I (isoleucine) at position 186.
  • the present application therefore relates to any HN protein which has at least one one of the elements of differences listed above, with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates, and which has an amino acid other than M at position 186.
  • the present application relates more particularly to any HN protein, whose amino acid sequence has an identity of more than 99.15%, preferably at least 99.20%, more preferably at least 99.30% with the amino acid sequence of the F protein of at least one of the particular isolates of the invention, that is to say with at least one of the sequences of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (HN protein of isolates 18620 , 20283, 20435, 26056, 26632, respectively), and preferably with each of these sequences.
  • the present application and more particularly relates to proteins, and more particularly to envelope proteins, which comprise at least one protein whose sequence is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (see Table 5). ).
  • the present application also relates to the fragments of the envelope proteins of the viruses of the variant phylogenetic group, or of the variant phylogenetic subgroup of the invention, and more particularly to the fragments of the F and HN proteins of the viruses of the phylogenic variant group, or of the variant phylogenetic subgroup of the invention.
  • those targeted at protein fragments which are specific for the viruses of the phylogenetic subgroup of the invention, and more particularly for the five particular isolates of the invention, which have been deposited with the CNCM under the nuemros 1- 3761 to I-3765.
  • fragments of F proteins of viruses of the phylogenetic variant group, or of the variant phylogenetic subgroup of the invention are more particularly relative to those fragments which comprise, or consist of, at least one fragment chosen from :
  • FIG. 4 gives a schematic presentation of such fragments. These fragments extend from the following positions, calculated from the sequence of complete F proteins:
  • the complete F protein sequences of the five particular isolates of the invention are the sequences of SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (isolates 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectively).
  • the present application relates to any protein, polypeptide, peptide (glycosylated or not), which comprises at least (or which is constitutée of) the sequence of the cleavage site of the F proteins of the viruses of the invention, that is to say say the sequence KPRRER (SEQ ID NO: 14).
  • Such a protein, or, where appropriate, such a polypeptide or peptide may be of viral origin, more particularly derived from the envelope of a virus, preferably an HPIV-2 virus.
  • the present application is directed in particular to any F protein, preferably any F protein of HPIV2, which comprises the sequence of the cleavage site of SEQ ID NO: 14.
  • the present application is more particularly relative to those fragments whose sequence of this fragment comprises at least 10 amino acids. , and has retained at least one amino acid (preferably at least two amino acids) which, in the F protein whose fragment is derived, was (were) at one of the following positions: positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
  • the size of said fragment is at least 10 amino acids. Preferably, this size is at least an integer selected from 1 to 550. More preferably, this size is at least 14, even more preferably at least 19.
  • this fragment has retained the ability to be recognized by an antibody that specifically binds to viruses of the variant phylogenetic group of the invention, or the variant phylogenetic subgroup of the invention. Very preferably, this fragment has retained the ability to induce the production of antibodies when it is injected into a mammal, preferably a non-human mammal, preferably in the presence of alum.
  • a fragment of at least 10 amino acids of F protein of the invention furthermore retains the amino acid which, in the F protein whose fragment is derived, was at position 175 (amino acid other than H).
  • a fragment of at least 10 amino acids of protein F of the invention has retained the amino acid which, in the F protein whose fragment is derived, was at position 160 (amino acid other than D, such as T ), and further retained the amino acid which, in the F protein whose fragment derives, was at position 175 (amino acid other than H, such as R).
  • the present application is more particularly relative to those fragments which comprise, or consist of of at least one fragment selected from fragments of at least 10 amino acids, and has conserved at least one amino acid (preferably at least two amino acids) which, in the HN protein from which the fragment derives, was (were) at one of the following positions: 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
  • Such fragments may have furthermore preserved at least one, preferably at least two, more preferably the three amino acid (s) among those which, in the complete sequence of the HN protein from which the fragment derives, were:
  • such a fragment has retained at least the amino acid that was at position 316.
  • such a fragment has retained at least the amino acid that was at position 513, and at least the amino acid that was at position 514.
  • such a fragment has retained at least the amino acid that was at position 316, at least the amino acid that was at position 513, and at least the amino acid that was at position 514.
  • the protein fragments of the invention are in particular candidates of interest for the production of antibodies specific for the viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention, and / or for the identification of the epitopes of such antibodies.
  • the size of said HN protein fragment is at least 10 amino acids. Preferably, this size is at least an integer selected from 11 to 570. More preferably, this size is at least 14, even more preferably at least 19.
  • this fragment has retained the ability to be recognized by an antibody that specifically binds to viruses of the variant phylogenetic group of the invention, or the variant phylogenetic subgroup of the invention.
  • this fragment has retained the ability to induce the production of antibodies when it is injected into a mammal, preferably a non-human mammal, preferably in the presence of alum.
  • a fragment of at least 10 amino acids of HN protein of the invention furthermore retains the amino acid which, in the HN protein from which the fragment derives, was at position 186 (amino acid other than M).
  • the present application also relates to nucleic acids, the sequence of which encodes at least one envelope protein according to the invention, or at least one envelope protein fragment according to the invention, taking into account the degeneracy of the genetic code. universal.
  • These nucleic acids may be DNA or I 1 I 1 RNA.
  • Said envelope protein may be an F and / or HN protein of the invention.
  • nucleic acids encode an envelope protein, or envelope protein fragment, of at least one of the variant phylogenetic group or subgroup viruses of the invention.
  • nucleic acids of the invention which are those of viruses belonging to the variant phylogenetic group of the invention have one or more differences with respect to the Greer, toshiba and V98 isolates, and more particularly with respect to the Greer isolate.
  • the nucleic acids of the invention which encode an F protein and / or a HN protein may have the nucleotide difference (s), which correspond to the amino acid difference (s) identified above for the proteins and protein fragment of the invention, following the universal genetic code, and taking into account the degeneracy of this code.
  • nucleic acids of the invention which encode an F protein have at least one, preferably at least two, more preferentially all of the following differences:
  • a codon encoding an amino acid other than I 1 preferably a codon encoding amino acid V
  • a codon encoding an amino acid other than T preferentially a codon encoding the amino acid P, in positions 310-312, a codon encoding an amino acid other than Q, preferably a codon encoding the amino acid R,
  • a codon encoding an amino acid other than V preferably a codon encoding amino acid I, in positions 478-480, a codon coding for an amino acid other than D, preferably a codon coding for amino acid T,
  • a codon encoding an amino acid other than N preferably a codon encoding amino acid K
  • a codon encoding an amino acid other than F preferentially a codon encoding amino acid V.
  • nucleic acids are nucleic acids of viruses belonging to the variant phylogenetic group of the invention.
  • the nucleic acids of the invention which encode an HN protein have at least one, preferably at least two, more preferably all the following differences: in positions 169-171, a codon encoding an amino acid other than D, preferably a codon encoding the amino acid E,
  • a codon coding for an amino acid other than T preferentially a codon encoding amino acid A
  • a codon encoding an amino acid other than K preferably a codon encoding amino acid E
  • a codon encoding an amino acid other than T preferably a codon encoding amino acid A
  • a codon encoding an amino acid other than A 1 preferably a codon encoding amino acid S, in positions 955-957, a codon coding for an amino acid other than P, preferably a codon coding for amino acid T,
  • a codon encoding an amino acid other than E 1 preferably a codon encoding amino acid K
  • a codon coding for an amino acid other than A preferably a codon encoding amino acid I
  • a codon encoding an amino acid other than A preferably a codon encoding amino acid E, in positions 1135-1137, a codon coding for an amino acid other than R, preferably a codon coding for amino acid E,
  • a codon encoding an amino acid other than T preferentially a codon encoding amino acid M,
  • a codon encoding an amino acid other than Q preferably a codon encoding amino acid R.
  • nucleic acids are nucleic acids of viruses starting from the variant phylogenetic group of the invention.
  • nucleic acids of the invention which are those of viruses belonging to the variant phylogenetic subgroup of the invention have at least one of the above differences with respect to the Greer, Toshiba and V98 isolates, and more particularly with respect to the isolate Greer, and furthermore at least one difference from isolate V94.
  • nucleic acids of the invention which code for a virus protein F of the phylogenetic subgroup of the invention have at least one, preferably at least two, more preferably all of the following differences: :
  • a nucleotide other than T for example, codon 31 -33 of isolate V94 is ATT, whereas in the five particular isolates of the invention, this codon is ATC
  • this codon is ATC
  • in position 525 a nucleotide other than A, preferentially nucleotide G (for example, codon 524-526 of isolate V94 is CAC, coding amino acid H at position 175 of the protein, whereas, in the five particular isolates of the invention, this codon is CGC, encoding amino acid R at position 175)
  • a nucleotide other than C preferentially nucleotide A (for example, codon 1479-1481 of isolate V94 is ATC, whereas, in the five particular isolates of the invention, this codon is ATA) .
  • nucleic acids of the invention which encode an F protein have at least the above-mentioned difference for position 525.
  • These nucleic acids are nucleic acids of viruses from the variant phylogenetic subgroup of the invention. .
  • nucleic acids of the invention which encode a virus HN protein of the phylogenetic subgroup of the invention have at least the following difference:
  • nucleotide other than G preferably A (for example, codon 556-558 is ATG in isolate V94, coding for amino acid M in position
  • this codon is ATA, encoding the amino acid I-isoleucine- in position 186).
  • nucleic acids are nucleic acids of viruses starting from the variant phylogenetic subgroup of the invention.
  • the present application relates more particularly to the nucleic acids which encode the F and / or HN proteins of the five particular isolates of the invention, that is to say the nucleic acids whose sequence comprises, or consists of, a sequence among the sequences of SEQ ID NO: 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40 (see Table 5).
  • the inventors propose new means for detecting HPIV2, and more particularly new means for the diagnosis of HPIV2.
  • HPIV2 of the invention make it possible to detect all the viruses of the variant phylogenetic group of the invention.
  • the invention notably proposes means that allow their detection and / or their diagnosis in a specific manner, that is to say without detecting isolates.
  • the invention further provides means for detecting and / or diagnosing viruses that are part of the phylogenetic subgroup of the invention specifically, i.e., without detection of HPIV2 Greer, Toshiba isolates. and V98, and without detection of isolate V94.
  • Immunological means :
  • the present application also relates to antibodies which bind to the HPIV2 virus envelope.
  • antibody fragment notably comprises the Fab, F (ab) '2, Fv, CDR1, CDR2, CDR3 fragments, as well as the constructions derived from such fragments such as scFvs or humanized antibodies.
  • bind is used here in its usual sense in the context of antibody-antigen binding.
  • the present application relates more particularly to such antibodies or antibody fragments, which bind to the envelope of at least one variant of the phylogenetic group of the invention, preferably at least one of the five particular viruses deposited by the inventors with the CNCM, preferably at least two, three or four, more preferably of these five viruses.
  • the present application relates more particularly to such antibodies or antibody fragments which do not bind to the envelope of the HPIV2 Greer isolate (the sequence of the Greer isolate is available from Genbank under the accession number NC_003443, and is reproduced in the present application, after the "Examples" part, point B.2.), And more particularly without binding to an envelope protein of isolates HPIV2 Greer, Toshiba and V98.
  • this antibody does not bind to any microorganism that would not be an HPIV2 virus.
  • an antibody or antibody fragment of the invention is an antibody specific for viruses belonging to the variant phylogenetic group of the invention.
  • said envelope protein of at least one HPIV2 virus of the invention comprises, or consists of, a protein F.
  • an antibody or antibody fragment of the invention can bind to an F-protein of the invention and / or a F-protein fragment of the invention.
  • the characteristics described above to define the F proteins and F protein fragments of the invention naturally apply to the definition of F proteins and F protein fragments which are the epitope targets of the antibodies and antibody fragment of the invention.
  • said antibody or antibody binds to said protein fragment F in at least one epitope comprising at least one amino acid selected from the amino acids in the sequence of said protein F, is located at positions 32, 96 , 102, 104, 112, 160, 247, 248, 390, 524, 538, more particularly in positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
  • said envelope protein of at least one HPIV2 virus of the invention comprises, or consists of, an HN protein.
  • An antibody or antibody fragment of the invention may bind to an HN protein of the invention and / or an HN protein fragment of the invention.
  • the above described characteristics for defining the HN proteins of the invention naturally apply to the definition of the HN proteins and HN protein fragments of the invention which are the epitopic targets of the antibodies and the antibody fragment of the invention.
  • said antibody or antibody fragment binds to said HN protein in at least one epitope which comprises:
  • an HN protein epitope comprises the amino acids which, in the sequence of the HN protein, which is in positions 513-514, or 512-515
  • an HN protein epitope comprises the amino acids which, in the sequence of the HN protein, which is in positions 513-514, or 512-515
  • the application relates to antibodies or antibody fragments, which are specific for viruses belonging to the variant phylogenetic subgroup of the invention. Such antibodies therefore do not bind to isolate HPIV2 V94.
  • Such an antibody or antibody fragment may in particular bind to a protein F of at least one of the phylogenetic sub-group viruses varying in at least one epitope which comprises at least one amino acid chosen from amino acids which, in the sequence of said protein F, is in position 175.
  • An antibody or antibody fragment of the invention can naturally carry a label to facilitate its detection, such as fluorescent or enzymatic labeling.
  • the presence of interest also relates to hybridomas producing such antibodies or antibody fragments.
  • the present application also relates to transfected, infested or transformed cells which produce such antibodies or antibody fragments.
  • the present application also relates to any composition which comprises at least one antibody, antibody fragment, hybridoma, transfected, infected or transformed cell of the invention, with possibly at least one acceptable pharmaceutical vehicle.
  • the present application also relates to any kit, more particularly any diagnostic kit, which comprises at least one antibody, antibody fragment, hybridoma, transfected, infected or transformed cell of the invention.
  • a diagnostic kit may further comprise means for the detection of other microorganisms, and in particular:
  • HPIV2 that are not part of the phylogenetic variant group or subgroup, of the invention, such as HPIV2 Greer, Toshiba, V98, and / or
  • HPIV other than HPIV2 means for detecting HPIV other than HPIV2, such as HPIV1, HPIV3, HPIV4, and / or
  • the present application also relates to a method for producing an antibody capable of binding at least one virus of the group, or if appropriate, of the variant phylogenetic subgroup, of the invention, and more particularly to at least one one of the five particular isolates deposited by the inventors with the CNCM, and preferably with these five particular isolates.
  • the antibodies thus produced are antibodies specific for these viruses.
  • This method may comprise administering to a mammal (preferably a non-human mammal) at least one of the five particular isolates of the invention, preferably the five particular isolates of the invention, and optionally also the V94 isolate, and / or at least one envelope protein or at least one envelope protein fragment of the invention, such as for example a HN protein fragment which has retained the amino acid which, in the HN protein sequence, was in position 316 and / or both amino acids which, in the HN protein sequence, were in positions 513 and 514.
  • a mammal preferably a non-human mammal
  • the administration is carried out so that the virus (s), protein (s), protein fragment (s) administered (s) induce the production of antibodies by the mammal that (s) receives (s).
  • This administration may be made with an adjuvant capable of increasing the immunogenicity such as alum.
  • the antibodies produced are then recollected, and preferably isolated.
  • Monoclonal antibodies can be produced according to techniques known to those skilled in the art.
  • the inventors have selected nucleic acids which are specially adapted for the specific detection of at least one of the isolates of the invention, preferably all of the isolates of the invention.
  • the nucleic acids which are specially adapted for the specific detection of all the isolates of the invention make it possible to detect all the isolates likely to be part of the variant phylogenetic group.
  • the present application relates to nucleic acids which are specific for one or more viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention, which do not include the HPIV2 Gréer, Toshiba and V98 isolates, and which are specially adapted to the specific detection of one or more viruses of this phylogenetic group or subgroup and / or the construction and production of probes and / or primers for such specific detection.
  • nucleic acids are fragments of at least one virus belonging to the group or, where appropriate, the phylogenetic subgroup of the invention, including the five particular isolates that have been deposited by the inventors. These nucleic acids hybridize with one or more viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention under conditions of high stringency.
  • Conditions of high stringency are conditions known to those skilled in the art, for example hybridization conditions on DNA bound to a fliter in
  • SSC 5X sodium dodecyl sulfate (SDS) 2%, 100 micrograms / mL of single-stranded DNA, at 55-65 0 C for 8 hours, and wash in 0.2X SSC and 0.2% SDS at
  • nucleic acids do not hybridize to any microorganism other than HPIV2 under conditions of high stringency.
  • such nucleic acids do not hybridize to HPIV2 isolates that are not part of the group, or optionally the phylogenetic subgroup of the invention, such as the Greer isolates. ,
  • nucleic acids are then nucleic acids which specifically hybridize to one, preferably several, more preferably all, viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention.
  • nucleic acid can be characterized in that the sequence of this nucleic acid comprises, or consists of: a fragment of at least 132 nucleotides of a sequence encoding the F protein and / or the HN protein of at least one of the HPIV2 viruses according to claim 1, or
  • said fragment is a fragment of at least 133, 134, 135, 136, 137 nucleotides (for example fragments of 137, 180, 208, 210 nucleotides, or fragments of 137, 208, 210 nucleotides, or fragments of 180 nucleotides). More preferably, said fragment is a fragment of at least 170, 175, 180 nucleotides (for example, 180, 208, 210 or 180, or 208, 210 nucleotides). For example, said fragment is a fragment of at least 240 nucleotides.
  • said fragment is a fragment of at most 400 nucleotides.
  • said sequence encoding the F protein is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 23, 28, 33, 38, 43, and / or in that said HN coding sequence is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 25 , 30, 35, 40, and / or said sequence encoding the F and HN proteins is selected from the sequences of SEQ ID NO: 22, 27, 32, 37, 42.
  • the sequence of such a nucleic acid comprises or consists of at least one of SEQ ID NO: 57 to 86.
  • the application relates in particular to a nucleic acid, which is specially adapted for the construction and production of probes or primers specific for the phylogenetic group or subgroup of HPIV2 variants of the invention, which does not include HPIV2 isolates.
  • Greer, Toshiba and V98 characterized in that this nucleic acid comprises, or consists of: a) at least one sequence selected from the sequences of SEQ ID NO: 57 to 86, or b) a conservative fragment of at least l one of the sequences referred to under a), said conservative fragment comprising or consisting of at least one sequence chosen from:
  • sequences which extend from the positions 234 to 443 of the HN coding sequences of the viruses of the group or subgroup of the invention the sequences which extend from the positions 241 to 420 of the HN coding sequences of the viruses of the group or subgroup of the invention,
  • the present application relates more particularly to a nucleic acid, which is especially adapted to the construction and the production of at least one pair of primers and at least one probe which are especially adapted to an implementation in amplification. real time for the specific detection of one or more viruses of said phylogenetic group or subgroup of HPIV2 variants.
  • nucleic acids may, in the present application, be designated by the term "real-time nucleic acids" for the sake of simplification.
  • nucleic acid may be defined in that its sequence comprises, or consists of: a fragment of the F coding sequence or of the HN coding sequence of a virus of the phylogenetic group or subgroup of the invention, or
  • said fragment extending from positions 259 to 395 of the F coding sequence consists of one of the sequences of SEQ ID NO: 62 to 66, and / or said fragment extending from positions 234 to 443 of the HN coding sequence consists of one of the sequences of SEQ ID NO: 67 to 70, and / or said fragment extending from positions 1466 to 1673 of the HN coding sequence is consisting of one of the sequences of SEQ ID NO: 83 to 86.
  • sequence of said sequence nucleic acid may then comprise, or consist of one of the following sequences: the sequences of SEQ ID NO: 62 to 66, 67 to 70 , 83 to 86, and the sequences which are complementary to these sequences of number SEQ ID determined over the entire length of these sequences of SEQ ID number determined.
  • the present application also relates to nucleic acids, which are specially adapted for the construction and production of probes which are specially adapted for implementation on a chip, for the specific detection of one or more viruses of the group or under phylogenic group of the invention.
  • nucleic acids may, in the present application, be designated by the term "nucleic acid chips" for the sake of simplicity.
  • sequence of such a nucleic acid advantageously comprises, or consists of: a fragment of the F coding sequence and / or the HN coding sequence of a virus of the phylogenetic group or subgroup of the invention, or
  • the present application therefore relates to nucleic acids, which are specially adapted for the construction and production of at least one probe which is capable of hybridizing to a nucleic acid of one or more viruses of said group or subunits. variant phylogenetic group, without hybridizing to a nucleic acid isolates HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
  • the sequence of such a nucleic acid comprises, or consists of one of the following sequences: the sequences of SEQ ID NO: 57 to 61, 71 to 74, 75 to 78, 79 to 82, and the sequences which are complementary to these SEQ ID number sequences determined over the entire length of these sequences SEQ ID number determined.
  • the sequence of such a nucleic acid consists of one of the sequences SEQ ID NO: 57 to 61, 71 to 74, 75 to 78, 79 to 82.
  • the present application also relates to pairs of primers and probes that can be associated with them for a real-time amplification implementation, preferably in real-time PCR.
  • the present application relates to a pair of primers which is capable of amplifying a nucleic acid of at least one virus of the variant phylogenetic group or subgroup of the invention without amplifying a nucleic acid of the HPIV Gréer, Toshiba isolates. , and V98.
  • a pair of primers of the invention may be defined in particular by the fact that the sequences of each of the primers of this pair are such that they allow the amplification of a nucleic acid of at least one virus of the group or under phylogenic group of the invention, without amplifying a nucleic acid of HPIV2 Greer, Toshiba and V98 viruses, when this pair of primers is placed in contact with the RNA material of said at least one of the five viruses of claim 1, and on the other hand with the RNA material of each of said Greer, Toshiba and V98 viruses, for example in four separate tubes, in the presence of the appropriate RT-PCR reagents, such as for example:
  • TaqMan® EZ 5X buffer 250 mM bicine-N, N-bis (2-hydroxyethyl glycine), 575 mM potassium acetate, 0.05 mM EDTA, 40% glycerol, pH 8.2: for a final concentration of 1 X,
  • dATP, dCTP, dGTP for a final concentration of 300 ⁇ M each
  • - dUTP for a final concentration of 600 ⁇ M
  • AmpErase UNG uracyl N-glycosylase enzyme, EC 3.2.2
  • annealing and extension at a temperature which is preferably from 15 ° C. to 5 ° C. lower than the actual value of the melting temperature (Tm) of the pair of primers tested and which is preferably greater than 55 ° C., for example at a temperature of 55 ° C. to 70 ° C., for example 60 ° C., for 1 min.
  • Tm melting temperature
  • reaction mixture marketed by Applied Biosystems under the designation "Taqman® EZ RT-PCR kit” is an example of a kit providing a suitable reaction medium.
  • a simple way which does not require the production of a detection probe, may include electrophoresis of nucleic acids (eg, on 1% agarose gel) in the presence of ethidium bromide and visual analysis. or densitometry of the resulting bands after ultraviolet irradiation.
  • primer pairs are those:
  • each of the two primers succeeds in hybridizing to a target on the nucleotide material of at least one of the five viruses of the invention, preferably of each of the five viruses of the invention, so as to allow the amplification of the region bounded by each of these two primers, and
  • At least one of the two primers does not find a target on the nucleotide material of each of the Gree, Toshiba and V98 isolates, which would allow the amplification of a region of the nucleotide material of each of the Gree, Toshiba and V98 isolates.
  • Candidate pairs of primers can thus be chosen from those in which at least one of the two primers has a target on the nucleotide material of at least one of the five viruses of the invention, and preferably on each of the five viruses of the invention. invention, which is not found in the identical nucleotide material of the Greer, Toshiba and V98 isolates (at least one nucleotide difference).
  • Primer pairs will preferably be chosen:
  • the content of G + C is 20 to 80%, the melting temperature (Tm) of which is 58 ° C. to 60 ° C. for each primer, and
  • each primer do not comprise more than two G and / or C bases.
  • primer pairs are a technique known to those skilled in the art. Automated means are also available for this purpose, such as the software "Primer Express” version 3 or higher, marketed by Applied Biosystems.
  • the sequences of the appropriate primer pairs may be that of a 5 'fragment of the sequence amplified from at least one of the five viruses of the invention, and that of a 5' fragment of the complementary sequence of this amplified sequence (5 'fragments including the very first nucleotide at the 5' end).
  • the sequences of the appropriate primer pairs are that of a fragment of the sequence of at least one of the five viruses of the invention, and that of a fragment of the sequence complementary to this viral sequence.
  • sequences of the appropriate primer pairs can also be variant sequences of such fragments, obtainable by substitution and / or addition and / or deletion of at least one nucleotide of the sequence of these fragments, and which have retained the ability to amplify at least one of the five viruses of the invention, without amplifying Toshiba, Greer and V98.
  • such variant sequences have retained at least one nucleotide difference with respect to all of their potential targets in each of the Greer isolates,
  • RNA sample may be treated with extraction buffer containing 4M guanidium thiocyanate, 0.5% N-lauryl sarcosine, 1mM dithiothreitol, 25mM sodium citrate, and glycogen. 0.1 mg per mL followed by precipitation with isopropanol and 70% ethanol.
  • said pair of primers amplifies a nucleic acid of each of the five particular viruses deposited by the inventors with the CNCM under the numbers 1-3761 to I-3765.
  • a pair of primers of the invention is such that:
  • the sequence of one of the primers of said pair is that of a 5 'fragment of 14 to 30 nucleotides of a real temsp nucleic acid of the invention, and in that the sequence of the other primer of said pair is that of a 5 'fragment of 14 to 30 nucleotides of the sequence which is complementary to the same real-time nucleic acid over the entire length of this nucleic acid, said fragments 5' being fragments which comprise the first nucleotide at the 5 'end of the sequence of which they are the fragment.
  • a pair of primers of the invention is capable of amplifying a nucleic acid of each of the five particular viruses deposited by the inventors, without amplifying a nucleic acid of the HPIV Gréer, Toshiba, and V98 isolates.
  • each of said 5 'fragments is (independently of one another) comprised of (14 to 30 nucleotides, preferably 18 to 23 nucleotides.
  • a pair of primers of the invention is constituted (see Tables 8 and 9 below):
  • the present application also relates to any set of primers which comprises at least one pair of primers according to the invention.
  • the present application also relates to any primer, which is as selected within a pair of primers of the invention.
  • the present application also relates to a probe that can be implemented in real-time amplification with a pair of primers according to the invention, for the specific detection of at least one virus of the phylogenetic group or subgroup of the invention. .
  • such a "real time” probe has a (hybridization) sequence which is:
  • nucleic acid fragment consists of 14 to 30 nucleotides, preferably 23 to 28 nucleotides.
  • such a "real-time" probe is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 89, 90, 93, 94, 97, 98 (see Tables 8 and 9 below).
  • a marking for example to facilitate its detection, such as a radioactive, fluorescent or enzymatic marking.
  • Such a probe may advantageously carry a fluorescent marking and a quencher, so as to be suitable for use as a Taqman® type probe or beacon or Scorpion® type. Such a probe may then include arms that do not hybridize to HPIV2 viruses, and which are intended to form beacon arms.
  • the present application also relates to a set of oligonucleotides, which comprises at least one pair of "real time” primers according to the invention and at least one "real time” probe according to the invention.
  • a set comprises at least the pair of primers of
  • such a set comprises at least the pair of primers of
  • such an assembly comprises at least the primer pair of SEQ ID NO: 95-96, and the probe of SEQ ID NO: 87 or 98.
  • An assembly according to the invention may for example comprise at least one pair of primers according to the invention, and at least two "real time” probes according to the invention.
  • such an assembly comprises at least the primer pair of SEQ ID NO: 87-88, the probe of SEQ ID NO: 89 and the probe of SEQ ID NO: 90.
  • such a set comprises at least the pair of primers of
  • such an assembly comprises at least the pair of primers of
  • the present application also relates to a kit for the diagnosis of a respiratory condition or infection, which comprises at least one pair of primers according to the invention and / or at least one probe according to the invention.
  • the present application also relates to an amplification system, which is specially adapted for real-time amplification, which comprises at least one pair of primers of the invention and at least one probe according to the invention, and more particularly to less a pair of primers according to the invention and at least one probe according to the invention which is capable of hybridizing to the amplicon produced by this pair of primers from the nucleic acid of a group virus , or subgroup, phylogenetic variant of the invention.
  • the present application also relates to any composition and more particularly to any pharmaceutical or biological composition, which comprises at least one pair of primers and / or at least one probe and / or at least one "real time" system of the invention .
  • the present application also relates to a kit which is specially adapted to the detection of HPIV2, more particularly to its diagnosis, which comprises at least one pair of primers and / or at least one probe and / or at least one system
  • Such a diagnostic kit can furthermore comprise means for the detection of other microorganisms, and in particular: means for the detection of HPIV2 which are not part of the group, or, where appropriate, phylogenetic subgroup which varies from 1 such as HPIV2
  • HPIV other than HPIV2 such as HPIV1, HPIV3,
  • HPIV4 and / or - means for the detection of microorganisms that are not HPIV, such as microorganisms, and more particularly, viruses involved in respiratory diseases or infections (lower and / or higher respiratory systems), such as pneumonia, bronchiolitis, influenza.
  • the present application also relates to a method for the detection, more particularly for the diagnosis, of HPIV2 which comprises contacting a sample which may contain at least one HPIV2 virus, with at least one pair of primers and at least one less a probe of the invention, under conditions adapted to a real-time amplification, for example real-time PCR.
  • the detection of the presence of an amplicon produced by this pair of primers and detected by this probe is indicative of the presence of a HPIV2 virus belonging to the phylogenetic group or, where appropriate, subgroup of the invention.
  • the present application also relates to any amplicon obtainable by amplification using a pair of primers of the invention of a nucleic acid of a virus of the group, or if appropriate of the subclass. group, phylogenetic variant of the invention.
  • Probes specially adapted for on-chip implementation:
  • nucleic acid chips above.
  • the present application therefore relates to a probe which is specially adapted to an implementation on a chip, and which is capable of hybridizing to a nucleic acid of one or more viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention , without hybridizing to a nucleic acid isolates HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
  • such a probe is a nucleic acid which hydrides under conditions of high stringency to a nucleic acid of one or more viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention, without hybridizing to a nucleic acid of the isolates HPIV2 Greer, Toshiba, V98, under the same conditions of high stringency.
  • Conditions of high stringency are known to those skilled in the art, and an example of such conditions has been described above.
  • such a probe is such that its sequence is that of a fragment of a nucleic acid chip of the invention, or that of the sequence which is complementary to this fragment over the entire length of this fragment.
  • the present application relates more particularly to probes capable of hybridizing to at least one of the viruses of the phylogenetic group or subgroup of the invention, without hybridizing to the HPIV2 virus of the Gréer strain, characterized in that its sequence is that of a sub-fragment (from 14 to 30, preferably from 18 to 23 nucleotides) of the following fragments: fragments 241-420 of coding sequences F,
  • such a probe is chosen from the sequences of SEQ ID NO: 99 to 117 (see Table 11 below).
  • the present application also relates to any solid support adapted to the flow of a microfluidic flow, such as a chip, which comprises at least one such probe.
  • this probe is fixed on the supportd of this chip.
  • This chip can be in frozen form, or freeze-dried.
  • Table 6 virus region sequences of the invention, specially adapted for the construction and production of probes and / or primers specific for at least one of the five isolates of the invention
  • HPIV2 isolates that are not part of the variant phylogenetic group of the invention, such as HPIV2 Greer, Toshiba, V98 isolates
  • sequences encoding F and those encoding HN are presented in part "sequence description" below, and in Figures 5 and 6.
  • Table 7 virus region sequences of the invention, specially adapted for the construction and production of primers and specific probes, said primers and probes being specially adapted for use in the context of amplification in accordance with FIG. real time for the detection of at least one of the isolates of the invention
  • HPIV2 isolates that are not part of the variant phylogenetic group of the invention, such as HPIV2 Greer, Toshiba, V98 isolates
  • Table 8 Examples of specific primer sequences and probes, which are specially adapted for real-time implementation for the detection of all five isolates of the invention (specific detection with respect to HPIV2 isolates which do not not part of the variant phylogenetic group of the invention, such as isolates HPIV2 Greer, Toshiba, V98)
  • Table 10 Sequences of virus regions of the invention, specially adapted for the construction and production of probes which are specific for at least one isolate of the invention, and which are specially adapted for implementation on a chip (Specific detection with respect to HPIV2 isolates that are not part of the variant phylogenetic group of the invention, such as HPIV2 Greer, Toshiba, V98 isolates)
  • Table 11 Examples of specific probes, specially adapted to an on-chip implementation for the specific detection of all five isolates of the invention (specific detection with respect to isolates that are not part of the group
  • the term “comprising”, with which "including” or “containing” is synonymous, is an open term, and does not exclude the presence of one or more element (s), ingredient (s) or additional method step (s) that would not be explicitly stated, while the term “consistent” or “constituted” is a closed term, which excludes the presence of any additional element, step , or ingredient that would not be explicitly exposed.
  • the term “substantially consisting of” or “essentially consisting of” is a partially open term, which does not exclude the presence of one or more element (s), ingredient (s) or additional step (s) in the to the extent that such element (s), ingredient (s) or additional step (s) do not materially affect the basic properties of the invention.
  • HPIV-2 isolates Five “atypical” HPIV-2 isolates were isolated from LLC-MK2 cells from respiratory specimens, nasal aspirate or bronchoalveolar lavage collected from four hospitalized patients (see Table 1 below). These patients (one child and three adults) were admitted for hospitalization because of respiratory infections.
  • the strain HPI V-2 Gréer (ATCC number VR-1381) was isolated in 1955 (USA) on an 11-month-old child. All tests were carried from a stock frozen at -80 0 C (1O 7 '5 ICTD 50/50 uL). Viral culture
  • LLC-MK2 cells monkey kidney cells, ATCC CCL-7 were cultured in cylindrical sample vials ("shell-vials", 24-well plates). The cells were maintained on Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with strypsin (2 (g / ml).) After inoculation, the plates were centrifuged (400 g for 30 min at 34 ° C.), the culture media were renewed, and the plates were then incubated at 34 ° C. under 5% CO 2 The cytopathic effect of the virus was monitored regularly for 10 days.
  • the IF tests were performed with monoclonal antibodies specific for each of the four types of HPIV (monoclonal anti-HIPV1 antibody, anti-HPIV2 monoclonal antibody, anti-HPIV3 monoclonal antibody and anti-HPIV4 monoclonal antibody).
  • monoclonal antibodies specific for each of the four types of HPIV can be produced by those skilled in the art, or are commercially available.
  • a monoclonal antibody Specific HPIV4 type is available from Chemicon (Temecula, California, USA) under the reference "mAb 8780".
  • IF tests were performed with monoclonal antibodies specific for HPIV-2.
  • the anti-HPIV2 monoclonal antibodies used recognize HN or a structural protein (internal proteins). Such antibodies can be produced by those skilled in the art, or are commercially available.
  • an anti-HPIV2 monoclonal antibody, which targets the HN protein of HPIV2 is available from ARGENE S.A. (South Delta Technology Park 09120 Varilhes, France) under the reference 12E12G9.
  • the viral RNA was extracted from 100 ⁇ l of LLC-MK-2 cell culture supernatant with the kit "Absolutely RNA Micropep" (Stratagene, USA) following the manufacturer's instructions. Reverse transcription was performed using random pd (N) 6 rhexamer (Amersham Biosciences, UK).
  • RNA suspensions were incubated with 1 ⁇ l of pd (N) 6 (1 (g / ⁇ l).
  • the amplification was carried out by adding 5 ⁇ l of cDNA previously synthesized in a tube containing 45 ⁇ l of the following PCR mixture: 24.5 ⁇ l of sterile water, 5 ⁇ l of PCR buffer (15 mM MgCl 2) ) (Applied Biosystems, Roche, USA), 5 ⁇ l of dNTP (20 mM), 5 ⁇ l of each primer (sense and antisense) (20 ⁇ M) (Eurogentec, Belgium) and 0.5 ⁇ l of Taq DNA polymerase (5 ⁇ l). U / ⁇ L) (Applied Biosystems, Roche, USA).
  • the HPIV-2 prototype strain and sterile water were used as positive and negative controls, respectively.
  • the amplification was carried out according to the following protocol: 95 ° C. for 5 minutes, followed by 40 cycles (95 ° C. for 30 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds) and final elongation step of 10 minutes at 72 ° C.
  • Sequencing The PCR products were purified using the GFX purification kit (Amersham Biosciences, UK) following the manufacturer's instructions. A quantity of 20 ng / 100 bp of each product was sent for sequencing to MWG Biotech Company (Ebersberg, Germany).
  • the isolates all gave a positive HPIV-2 result, when they were tested by HPIV-specific RT-PCR.
  • the five isolates therefore appear as "atypical" HPIV-2 isolates, compared to the HPIV-2 Greer reference strain.
  • the complete consensus nucleotide sequences of the F and HN genes were established for the HPI isolates V-2 Greer, 18620, 20283, 20435, 26056 and SV5, and the complete consensus nucleotide sequence of the F gene was established. for the isolate HPIV-2 26632.
  • the complete consensus nucleotide sequence obtained for the prototype strain was compared to the equivalent sequence available on the basis of GenBank / EMBL data. Both sequences have a homology percentage of 99.9%. Homology is complete for F and HN proteins.
  • HN Attachment Protein The analysis of potential glycosylation sites (NXS / T) in the HN gene shows that all 5 HPI V-2 variants have in common an S316N substitution responsible for the appearance of a new site. glycosylation that is absent in the prototype strain.
  • the V94 and V98 fusion peptide is similar to the fusion peptide of the "atypical" HPIV-2 viruses and the fusion peptide of the HPIV-2 prototype strain, respectively ( Figures 2 and 4).
  • the alignments of other structurally significant domains (HR1 and 2, TM and CS, Figure 4) of the HPIV-2 isolates show no significant differences, except for the CS and HR1 domains.
  • the cleavage site is KTRQER (SEQ ID NO: 13) or KTRQKR (SEQ ID NO: 118), in place of KPRRER (SEQ ID NO: 14) for other isolates.
  • the objective of this study is to characterize clinical HPIV-2 isolates that exhibit atypical antigen reactivity to monoclonal antibodies used for diagnosis.
  • HPIV-2 viruses a few rare studies, already old, have demonstrated an antigenic variation between the isolates (Numazaki Y et al 1968, Proc.Soc.Expl Biol.Med 127: 992-996 Ray et al., 1992, Virus Res., 24: 107-113). But the link between antigenic variation and genetic variation had not been analyzed.
  • the F and HN proteins of the "atypical" HPIV-2 viruses show a marked percentage of substitutions with respect to the prototype strain: 2% for the F gene and 3.8% for the HN gene.
  • a variant HPIV-3 described in 1995, had at the HN protein level only 4 amino acid substitutions, 2 at known antigenic sites (0.7% substitution). The position of the antigenic sites has not yet been determined for HPIV-2, but it would be surprising that none of the 22 amino acid substitutions observed on the HN gene of the "atypical" HPIV-2 viruses are localized in sites antigenic. Hémaqqlutinine-neuraminidase
  • the substitution S316N is at the origin of a new potential site of glycosylation which is absent in the HN protein of the HPIV-2 prototype strain.
  • the three-dimensional models of the HN protein show that this site is located in a loop that is directed to the outside of the protein, that is, an exposed area that could correspond to an antigenic site. Glycosylation is likely to mask an epitope and could explain the lack of reaction with certain antibodies. Other potential sites of glycosylation remain unchanged.
  • the differences observed in the primary structure of the HN protein of the atypical isolates potentially have consequences on the secondary structure in the carboxy-terminal portion of the protein.
  • the results presented, which are for the moment only predictions, show no significant structural change, especially at the surface of the protein or at the catalytic site. However, these minor structural changes without disturbance of function could be responsible for the disappearance of conformational epitopes.
  • the analysis of the fusion peptides of the "atypical" HPIV-2 isolates shows the existence of a difference of an amino acid with respect to the protein F of the prototype strain.
  • the hydrophobic domain constituted by the fusion peptide is presented as being the most conserved area of the F protein within the Paramyxoviridae family. This suggests that its structure and function are subject to more intense selection pressure than other domains of the protein.
  • the analysis of conservative and non-conservative specific changes that have been performed for SV5 and NDV has shown that the peptide sequence is important for fusion activity (Horvath CM 1992, Sergel TA et al., 2001).
  • HPIV-2 variant isolates have a more basic cleavage site than the prototype strain. This could also explain the difference in terms of fusion activity.
  • NDV F gene
  • Influenza HA gene
  • the importance of the cleavage site for viral virulence and pathogenicity was studied. Strains that have multibasic residues at the cleavage site are virulent and readily disseminate within the host. In some non-pathogenic influenza strains, Arginine or Lysine substitutions at the HA gene cleavage site at positions 5 or 6 have been shown to lead to the acquisition of pathogenicity.
  • HPIV-2 Laboratory diagnosis of HPIV is commonly performed by conventional isolation in cell culture, culture centrifugation in cylindrical vials, and immunofluorescence staining (direct staining of nasopharyngeal specimens).
  • the sequencing data clearly demonstrate the presence of new HPIV-2 strains not yet described. It is not yet known whether these variants that we have just isolated are predominant in the patient population. Sequencing studies are underway to analyze the variations of the F and HN genes in other HPIV-2 clinical isolates available in our laboratory, particularly to determine if variants of HPIV-2 have just emerged,
  • Continuous viral surveillance is important for monitoring antigenic changes that may occur in nature, particularly with respect to the selection of strains for vaccine development as well as for performing updated diagnostic assays.

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Abstract

La présente demande est relative à un groupe phylogénique variant de HPIV2, plus particulièrement à un sous-groupe phylogénique variant de HPIV2. La demande propose des moyens pour le diagnostic de HPIV2, qui tiennent compte de ce groupe et de ce sous-groupe.

Description

TITRE
Variants de HPIV-2, et leurs applications médicales
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente demande est relative à des virus parainfluenza humains de type 2 (HPIV-2) variants, et à leurs applications médicales, plus particulièrement à leurs applications diagnostiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Au sein de la famille des Paramyxoviridae, les virus parainfluenza humains (HPIV) sont des virus à ARN compris dans deux genres de la sous-famille des Paramyxovirinae :
- les Respirovirus pour les virus parainfluenza de type 1 et 3 (HPIV-1 , -3)
- les Rubulavirus pour les virus parainfluenza de type 2 et 4 (HPIV-2, -4).
Les HPIV sont des virus enveloppés. Leur génome est d'une taille d'environ 15 kilobases, constitué d'ARN simple brin de polarité négative. Le génome code six protéines principales.
Les gènes NP, P et L codent respectivement la nucléoprotéine, la phosphoprotéine et la polymérase (L pour large polymerase complex). Ces trois protéines forment avec l'ARN viral la nucléocapside (ou holonucléocapside). La nucléoprotéine forme avec I1ARN un support pour la phosphoprotéine et la polymérase, permettant la transcrition et éventuellement la réplication du génome.
Les gènes F et HN codent respectivement la protéine de fusion F et l'hémagglutinine-neuraminidase HN, qui sont les deux protéines d'enveloppe du virus et qui participent au mécanisme d'entrée du virus dans la cellule hôte. La protéine HN est responsable de l'attachement du virus à la cellule, en se liant aux acides sialiques cellulaires. Une fois le virus attaché, la protéine de fusion F est activée, insère un de ces domaines dans la membrane cellulaire et s'ensuivent des mécanismes rapprochant les deux membranes et les fusionnant.
Parmi les HPIV, différents virus HPIV2 ont été décrits dans l'art antérieur. L'isolât HPIV2 de référence est l'isolât Gréer, qui a été isolé en 1955 à partir d'un patient.
Les moyens de diagnostic qui comprennent la détection de HPIV-2 sont tous actuellement construits à partir de la structure de cet isolât de référence.
Par exemple, la détection de HPIV-2 dans le cadre hospitalier se fait actuellement par isolement en culture cellulaire (sur système sensible LLCMK2), ou par immunofluorescence et immuno-capture ELISA. Les anticorps mis en œuvre dans ces techniques ont été obtenus à partir de la souche HPI V-2 Gréer.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe en fait toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de l'isolât Gréer, et plus particulièrement des isolats Gréer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
De même, l'art antérieur propose quelques techniques de détection de HPIV-2 par PCR, mais les amorces sont conçues par référence à la séquence de l'isolât Gréer, sans tenir compte du fait que, comme le démontrent les présents inventeurs, il existe en fait toute une famille de virus HPIV-2 qui sont différents de l'isolât Gréer, et plus particulièrement des isolats Gréer, Toshiba et V98.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont identifié un nouveau groupe phylogénique variant de HPIV2, et un nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
La demande est relative à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau groupe phylogénique variant, et à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau sous- groupe phylogénique variant de HPIV2. Le groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus HPIV2 qui ne comprend notamment pas les isolats Gréer, Toshiba et V98. Le sous-groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus HPIV2 qui ne comprend notamment pas les isolats Gréer, Toshiba et V98, et qui ne comprend en outre pas l'isolât V94. Cinq isolats faisant partie de ce groupe et également de ce sous-groupe ont été déposés auprès de la CN. CM. aux fins du Traité de Budapest. La demande est relative aux protéines, plus particulièrement aux protéines d'enveloppe des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, notamment aux protéines F et HN de ces virus, ainsi qu'aux fragments de ces protéines.
La demande est également relative aux acides nucléiques codant ces protéines ou fragments de protéine.
La demande est également relative à des moyens pour la détection, plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
La demande est relative à des régions nucléotidiques particulières des virus du groupe ou sous-groupe HPIV2 de l'invention, qui leur sont suffisamment spécifiques pour permettre leur détection, de préférence leur détection spécifique, par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer et
V98.
La demande est ainsi relative à des régions nucléotidiques qui ont été spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de systèmes de type PCR temps réel, comprenant au moins une paire d'amorces et une sonde, ainsi qu'à des régions nucléotidiques qui ont été spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de sondes spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce.
La demande est également relative à ces amorces, ces sondes et à des puces comprenant au moins une sonde de l'invention.
La demande est en outre relative à des kits et compositions comprenant au moins une région spécifique et/ou au moins une amorce et/ou au moins une sonde de l'invention.
La demande est également relative à des anticorps dirigés contre une protéine d'enveloppe d'au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et à des hybridomes produisant de tels anticorps. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La demande fait référence aux figures suivantes :
Figure 1 : modèle tridimensionnel des ectodomaines de la protéine HN de l'isolât prototype HPIV-2 Gréer de l'art antérieur (modèle de gauche), et d'un isolât de l'invention -par exemple, isolât HPIV-2 18620 (modèle de droite). Cette figure illustre le fait que des isolats de l'invention présentent une protéine HN différente de celle de l'isolât HPIV-2 Gréer, notamment en ce qui concerne les sites de glycosylation. Comme illustré sur la figure, des isolats de l'invention comprennent notamment une mutation S316N, qui crée un site de glycosylation que ne présente pas la protéine HN de l'isolât HPIV-2 Gréer.
Figure 2 : alignement des séquences aminoacides du peptide de fusion (FP ; fragment 107-126 de la protéine de fusion F) de : - cinq isolats HPI V-2 de l'invention (virus parainfluenza humains de type 2 ; isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), sur celles de
- l'isolât HPIV-2 Gréer de l'art antérieur (virus parainfluenza humain de type 2) et du virus SV5 (virus simien parainfluenza simien de type 5).
Figure 3 : Analyse phylogénétique des protéines F (arbre du haut) et HN (arbre du bas) des isolats suivants :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolât HPIV-2 Lyon/20283/2001 = isolât 20283 ; isolât HPIV-2 Lyon/20435/2001 = isolât 20435 ; isolât HPIV-2 Lyon/18620/2001 = isolât 18620 ; isolât HPIV-2 Lyon/26632/1997 = isolât 26632 ; isolât HPI V-2 Lyon/26056/1997 = isolât 26056),
- isolât HPIV-2 Vanderbilt/1994 (= isolât HPIV-2 V94),
- isolât HPIV-2 Vanderbilt/1998 (= isolât HPIV-2 V98),
- isolât HPIV-2 Greer/1955 (= isolât HIPV-2 Gréer),
- virus SV5 (virus parainfluenza simien de type 5), - HPIV-4A,
- HPIV-4B,
- HPIV-3, et
- HPIV-1 . Les séquences déterminées par les inventeurs sont signalées par une flèche (isolats 20283, 20435, 18620, 26632, 26056).
Les autres séquences ont été obtenues à partir de la base de données Genbank (http///www.ncbi. nlm.nih.gov). Les arbres phylogénétiques ont été construits par la méthode du voisin le plus proche (« nθighbour-joining »). L'échelle indique le nombre de substitutions d'acides aminés par site, et la longueur des branches horizontales est proportionnelle à l'échelle indiquée. La fiabilité des embranchements a été évaluée par la méthode des "bootstraps" (1000 réplications) et les pourcentages résultant de cette procédure sont indiqués.
Figure 4 : présentation schématique des domaines structurels de la protéine F de HPIV-2, et présentation de l'alignement des séquences aminoacides de la protéine F pour cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), pour l'isolât HPIV-2 Gréer, et pour les isolats HPIV-2 V94 et V98 (Vanderbilt/1994 et Vanderbilt/1998, respectivement).
Cette figure illustre le fait que certains acides aminés de la protéine F des isolats de l'invention sont différents de ceux observés dans les autres isolats HPIV-2 (isolats Gréer, V94 et V98). Par exemple, on voit que : - la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolât Gréer notamment du fait des éléments de séquence suivants : o la séquence du site de clivage (CS), qui est KPRRER (SEQ ID NO :
14), au lieu de la séquence KTRQER (SEQ ID NO : 13) observée chez l'isolât Gréer tel que séquence par les inventeurs (mutations T102P et CM 04R), et au lieu de la séquence KTRQRK (SEQ ID NO :
118) telle que cela apparaît dans la séquence Gréer disponible sur la base de données NCBI (NLM, National Library of Medicine) sous le numéro d'accession NC_003443 (mêmes mutations T102P et
CM 04R), o la séquence du peptide de fusion (FP) qui présente l'acide aminé I en position 112, au lieu de l'acide aminé V (mutation V1121), o la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1 , qui présente l'acide aminé T en position 160, au lieu de l'acide aminé D (mutation D 160T) ; - la protéine F des isolats de l'invention diffère de celle de l'isolât V98 notamment du fait des mêmes éléments de séquence que ceux observés par rapport à l'isoîat Gréer (mutations T102P, Q104R au niveau du CS ; mutation V1121 au niveau de FP ; mutation D160T au niveau de HR1 ), ainsi que par le fait qu'au niveau de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1 , les isolats de l'invention présentent : o l'acide aminé R en position 163, au lieu de l'acide aminé K (mutation
K163R), et o l'acide aminé R en position 175, au lieu de l'acide aminé H (mutation
H175R) ;
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolât V94 notamment du fait de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1 , qui, dans des isolats de l'invention, présente l'acide aminé R en position 175 au lieu de l'acide aminé H (mutation H175R).
On voit également que certains isolats de l'invention présentent d'autres mutations, notamment dans le domaine transmembranaire (TM) de la protéine F. Par exemple, les isolats 20283 et 20435 de l'invention diffèrent des isolats 18620, 26056 et 26632 de l'invention, mais aussi des isolats Gréer, V94 et V98, par le fait que leur domaine transmembranaire présente l'acide aminé I en position 516 au lieu de l'acide aminé V (mutation V516I).
Les positions des acides aminés sont ici calculées par rapport à la séquence de la protéine F.
La figure 4 décrit plus particulièrement les séquences des sites de clivage (CS), des peptides de fusion (FP) des domaines HR1 , HR2 et TM de chacun des cinq isolats HPIV2 de l'invention (séquences 101-106, 107-126, 133-177, 451 -484 et 487-518, respectivement), alignées sur les séquences respectives des isolats Gréer, V94 et V98. Les séquences codantes correspondantes peuvent être déduites par la personne du métier, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
TM = partie transmembranaire
On peut observer que, par rapport aux isolats Gréer, V98 et V94, les cinq isolats particuliers de l'invention se distinguent par le fait qu'ils présentent à la fois :
- un acide aminé autre que D en position 160 (région HR1 ), préférablement l'acide aminé T en position 160 (mutation D160T par rapport aux isolats Gréer et V98), et
- un acide aminé autre que H en position 175 (région HR1 ), préférablement l'acide aminé R en position 175 (mutation H175R par rapport aux isolats V98 et V94).
Figure 5 : alignement des séquences nucléotidiques codant F (1656 nucléotides) de la souche HPIV-2 Gréer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence codant F de l'isolât Gréer NC_003443 (SEQ ID NO : 48),
- séquence codant F de l'isolât 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 23),
- séquence codant F de l'isolât 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 28), - séquence codant F de l'isolât 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 33),
- séquence codant F de l'isolât 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 38),
- séquence codant F de l'isolât 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 43). Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats particuliers de l'invention, par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Gréer.
Figure 6 : alignement des séquences nucléotidiques codant HN (1716 nucléotides) de la souche HPIV-2 Gréer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de.haut en bas :
- séquence codant HN de l'isolât Gréer NC_003443 (SEQ ID NO : 50), - séquence codant HN de l'isolât 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 25),
- séquence codant HN de l'isolât 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 30),
- séquence codant HN de l'isolât 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 35),
- séquence codant HN de l'isolât 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 40). Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Gréer.
Figure 7 : alignement des séquences aminoacides de F (551 aa) de la souche HPIV-2 Gréer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas : - séquence F de l'isolât 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 24),
- séquence F de l'isolât 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 44).
- séquence F de l'isolât 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 29),
- séquence F de l'isolât 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 34),
- séquence F de l'isolât 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 39), - séquence F de l'isolât Gréer NC_003443 (SEQ ID NO : 49).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé différent des autres à cette position. On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Gréer. On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Gréer, les isolats de l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de F, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes : - position 32 (acide aminé I pour la souche Gréer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution I32V),
- position 96 (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), - position 102 (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P),
- position 104 (acide aminé Q pour la souche Gréer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), - position 112 (acide aminé V pour la souche Gréer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution V112I),
- position 160 (acide aminé D pour la souche Gréer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T),
- position 247 (acide aminé N pour la souche Gréer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K),
- position 248 (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L),
- position 390 (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), - position 524 (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A),
- position 538 (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V).
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolât Gréer, on peut notamment remarquer les substitutions T102P et Q104R que les isolats de l'invention présentent au niveau du site de clivage (CS en Figure 4), la substitution V1121 que les isolats de l'invention présentent au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4), la substitution D160T que les isolats de l'invention présentent au niveau du domaine HR1.
CDS = séquence nucléotidique codante.
Figure 8 : alignement des séquences aminoacides de HN (571 aa) de la souche HPIV-2 Gréer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de haut en bas :
- séquence HN de l'isolât 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 26),
- séquence HN de l'isolât 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 31 ),
- séquence HN de l'isolât 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 36), - séquence HN de l'isolât 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 41 ).
- séquence HN de l'isolât Gréer NC_003443 (SEQ ID NO : 51 ).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Gréer. On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Gréer, les isolats de l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de HN, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 57 (acide aminé D pour la souche Gréer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E),
- position 100 (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L),
- position 114 (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A),
- position 139 (acide aminé K pour la souche Gréer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), - position 186 (acide aminé M pour la souche Gréer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution M186I),
- position 195 (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A),
- position 201 (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201 S),
- position 316 (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N),
- position 319 (acide aminé P pour la souche Gréer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), - position 323 (acide aminé K pour la souche Gréer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E),
- position 344 (acide aminé E pour la souche Gréer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), - position 348 (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A348I),
- position 378 (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), - position 379 (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E),
- position 479 (acide aminé P pour la souche Gréer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L),
- position 480 (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé M pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M),
- position 482 (acide aminé Q pour la souche Gréer, acide aminé R pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R),
- position 497 (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), - position 513 (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N),
- position 514 (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
CDS = séquence nucléotidique codante.
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolât Gréer, on peut notamment remarquer la substitution N316S qui introduit un nouveau site de glycosylation dans les isolats de l'invention par rapport à la souche Gréer. On peut également remarquer les acides aminés en positions 512, 513, 514 et 515 de la protéine HN, et plus particulièrement les acides aminés en position 513 et 514.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente demande est relative à un nouveau groupe et à un nouveau sous- groupe phylogéniques de virus HPIV2, et aux applications médicales qui peuvent être faites à partir de l'enseignement qui est présentement apporté par les inventeurs, à savoir l'existence de ce nouveau groupe et sous-groupe phylogéniques.
La présente demande est plus particulièrement relative à des moyens pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic, de virus HPIV2 faisant partie de ce groupe et/ou de ce sous-groupe.
Les inventeurs ont isolé plusieurs souches de HPIV2, qui sont des souches variantes par rapport à l'isolât HPIV2 Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98. Dans l'art antérieur, l'isolât Gréer est l'isolât de référence pour la mise au point des outils de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2. Or, les inventeurs montrent qu'il existe toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de l'isolât Gréer, et plus particulièrement des isolats Gréer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
Plus particulièrement, les isolats HPIV2 faisant partie du nouveau groupe ou sous- groupe phylogénique de l'invention ne sont pas reconnus par l'anticorps anti-HN commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Or, ces isolats variants de l'invention ont récemment été observés chez plusieurs patients atteints d'affections respiratoires.
Par contre, la souche HPIV2 qui sert de référence dans l'art antérieur pour la mise au point de moyen de diagnostic HPIV2 est une souche qui date de 1955 (souche Gréer).
Les inventeurs mettent donc en évidence le fait qu'il existe une inadéquation entre les moyens actuellement utilisés pour le diagnostic de HPIV2, et la nature des souches HPIV2 actuellement observées chez des patients. Au fil de l'évolution des souches, il est hautement probable que cette inadéquation va aller en s'accentuant. Le nouveau groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention est caractérisé par le fait qu'il ne comprend pas les isolats Gréer, Toshiba et V98. La figure 3 donne une représentation du groupe phylogénique de l'invention, qui est basée sur les protéines d'enveloppe F et HN (arbre du haut : protéine F ; arbre du bas : protéine HN).
Le nouveau groupe phylogénique de l'invention comprend notamment les isolats qui, en figure 3, sont désignés par HPIV-2 Lyon/20283/2001 , HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, c'est-à-dire cinq nouveaux isolats qui ont été isolés par les inventeurs et qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., aux fins du Traité de Budapest. Ce nouveau groupe phylogénique comprend également l'isolât HPIV-2 Vanderbilt/1994 (≈isolat V94).
Le nouveau sous-groupe de l'invention comprend notamment les isolats HPIV-2 Lyon/20283/2001 , HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, mais ne comprend pas l'isolât HPIV-2 Vanderbilt/1994 (≈isolat V94). Des analyses de séquences F et HN permettent en effet de distinguer quelques différences entre l'isolât V94 et le sous-groupe dont font partie les cinq isolats particuliers de l'invention. Comme la représentation phylogénique de la Figure 3 le fait apparaître à la personne du métier, les isolats HPIV2 qui sont les plus proches du nouveau groupe et du nouveau sous-groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention, mais sans en faire partie, sont les isolats Gréer, Toshiba et V98. Ceci implique également que le nouveau groupe phylogénique et le nouveau sous- groupe phylogénique de l'invention ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus Rubulavirus, et plus particulièrement qu'ils ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus HPIV2.
L'isolât qui, dans l'art antérieur, est décrit sous le nom d'isolat Toshiba, est identique à 99,8% à l'isolât Gréer au niveau nucléotidiqυe. La séquence de l'isolât Toshiba a été rapportée dans les bases de données, notamment sous les numéros Genbank X57559, NC_003443. On tiendra compte du fait que l'art antérieur démontre que les différences que la séquence de l'isolât Toshiba semble présenter par rapport à la séquence de l'isolât Gréer sont en fait plutôt dues à des erreurs de clonage d'ADNc, de synthèse et/ou d'analyse de séquences, qu'à la situation réelle naturelle de l'isolât en question (cf. Skiadopoulos et al. 2003, Journal of Virology, 77(1 ) : 270-279).
Dans la présente demande, l'isolât Toshiba est donc en fait considéré comme étant identique à l'isolât Gréer. En tout état de cause, une différence par rapport à l'isolât Gréer suffit à constituer une différence par rapport à l'isolât Toshiba.
Les séquences des isolats Gréer, Toshiba et V98 sont disponibles sur Genbank sous les numéros d'accession NC_003443 (isolât Gréer), X57559 (isolât Toshiba), (isolât V98).
Dans la présente demande, le nouveau groupe phylogénique de l'invention pourra, par simplification, être désigné par groupe phylogénique de variants HPIV2, ou groupe phylogénique variant, ou groupe de l'invention. De même, le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention pourra être désigné par sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, sous-groupe phylogénique variant, ou sous-groupe de l'invention.
Le nouveau groupe de l'invention est défini par le fait que les virus de ce groupe comprennent :
- une protéine F différente de celle de l'isolât, Gréer et/ou
- une protéine HN différente de celle de l'isolât Gréer.
De préférence, les virus du groupe de l'invention comprennent une protéine F et une protéine HN différentes des protéines F et HN, respectivement, de l'isolât Gréer.
Plus particulièrement, les virus du groupe de l'invention peuvent comprendre :
- une protéine F différente des protéines F des isolats Gréer et V98, et/ou
- une protéine HN différente des protéines HN des isolats Gréer et V98. De préférence, les virus du groupe de l'invention présentent une protéine F différente des protéines F des isolats Gréer et V98, et une protéine HN différente des protéines HN des isolats Gréer et V98. Cette ou ces différences protéiques peuvent notamment être une ou des différences de séquences aminacides.
Un virus du groupe de l'invention a donc : - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle de l'isolât Gréer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolât Gréer à la même position, et/ou (de préférence, et)
- une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle de l'isolât Gréer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolât Gréer à la même position.
Plus particulièrement, un virus du groupe de l'invention peut donc avoir : - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celles des isolats Gréer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolât Gréer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolât V98 à la même position, et/ou (de préférence, et)
- une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle des isolats Gréer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolât Gréer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolât V98 à la même position.
Ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolât Gréer et ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolât V98 peuvent se trouver à des positions différentes. Dans ce cas, le virus du groupe de l'invention présente au moins deux types de différences (sur sa protéine F et/ou sa protéine HN), à savoir au moins une différence à une position donnée par rapport à l'isolât Gréer, et au moins une différence à une autre position par rapport à l'isolât V98. Alternativement, ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolât Gréer peut se trouver à la même position que ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolât V98. Dans ce cas, la protéine F du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Gréer et V98, et/ou (de préférence, et), la protéine HN du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Gréer et V98.
Dans la présente demande, l'expression « au moins un(e) » comprend dans sa signification toutes les valeurs supérieures de nombre entier, jusqu'à la valeur maximale possible dans l'ensemble considéré. Par exemple, l'expression « au moins un acide aminé » comprend dans sa signification « au moins deux acides aminés », « au moins trois acides aminés », etc., jusqu'au nombre maximal de changements d'acides aminés contenus dans l'ensemble considéré. De même, l'expression « en au moins une position » comprend dans sa signification « en au moins deux positions », « en au moins trois positions », etc., jusqu'au nombre maximal de positions contenues dans l'ensemble considéré.
Par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils présentent une protéine F et/ou une protéine HN (protéines d'enveloppe) de séquence(s) particulière(s). Plus particulièrement :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et/ou par le fait que
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement). Les pourcentages d'identité indiqués ci-dessus, tout comme, sauf indication contraire, dans le reste de la demande, sont des valeurs d'identité globale, c'est-à- dire une identité calculée sur toute la longueur de la séquence. De préférence, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent les % indiqués ci-dessus avec chacune des SEQ ID indiquées.
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter au moins un changement au niveau de la séquence aminoacide de la protéine F par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98.
Un virus du groupe de l'invention peut présenter une protéine F dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolât Gréer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine F) : positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolât Gréer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes : a) en position 32, un acide aminé autre que I, préférentiellement l'acide aminé C (acide aminé I pour la souche Gréer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution I32V), et/ou b) en position 102, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P), et/ou c) en position 104, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé Q pour la souche Gréer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), et/ou d) en position 112, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I (acide aminé V pour la souche Gréer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121), et/ou e) en position 160, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé D pour la souche Gréer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T), et/ou f) en position 247, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé N pour la souche Gréer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K), et/ou g) en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V), et/ou h) en position 96, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), et/ou i) en position 248, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L), et/ou j) en position 390, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), et/ou k) en position 524, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A).
Parmi les positions de différences par rapport à la protéine F de l'isolât Gréer, ci- dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolât V98. C'est notamment le cas des positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolât Gréer et de celui présenté par la protéine F de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces sept positions.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolât Gréer et par rapport à la protéine F de l'isolât V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide F a) à g) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence a) à g) ci- dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces sept différences.
Parmi ces différences communément présentées par rapport à l'isolât Gréer et à l'isolât V98, les positions 102, 104, 112 et 160 de la séquence de protéine F sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide F b), c), d) et e) ci-dessus mentionnées. En effet, ces positions particulières se trouvent situées à des sites caractéristiques des HPIV2 :
- les positions 102 et/ou 104 se situent au niveau du site de clivage de la protéine F (CS en Figure 4),
- la position 112 se situe au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4),
- la position 160 se situe au niveau du domaine HR1 de la protéine F.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolât Gréer et de celui présenté par la protéine F de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides 102, 104, 112, 160, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en l'ensemble de ces quatre positions. Un tel virus peut en outre présenter une protéine F :
- dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolât Gréer et de celui présenté par la protéine F de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou
- dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolât Gréer en au moins une des positions aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des quatre différences particulières de protéine F ci-dessus mentionnées (différences de séquence de protéine F b), c), d), e)), de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement l'ensemble de ces quatre différences. Un tel virus HPIV2 peut bien sûr en outre présenter :
- par rapport aux isolats Gréer et V98, au moins une des trois autres différences de séquence de protéine F a) f) g) mentionnées ci-avant, de préférence au moins deux de ces différences a), f), g), préférentiellement l'ensemble de ces trois différences a), f), g) ; et/ou
- par rapport à l'isolât Gréer, au moins une des différences de séquence de protéine F a), f) à k) mentionnées ci-avant, de préférence au moins deux de ces différences a), f) à k), préférentiellement l'ensemble de ces sept différences a), f) à k).
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter des changements au niveau de la séquence aminoacide de la protéine HN.
Un virus du groupe de l'invention peut comprendre une protéine HN dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolât Gréer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine HN) : positions 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine Hn de l'isolât Gréer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes : a) en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé D pour la souche Gréer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), et/ou b) en position 1 14, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T1 14A), et/ou c) en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Gréer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), et/ou d) en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A), e) en position 201 , un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé S pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201 S), et/ou f) en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé P pour la souche Gréer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), et/ou g) en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé E pour la souche Gréer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), et/ou h) en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A348I), et/ou i) en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), et/ou j) en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E), et/ou k) en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M (acide aminé T pour la souche Gréer, acide aminé M pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M), et/ou I) en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R (acide aminé Q pour la souche Gréer, acide aminé R pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R), et/ou m) en position 100, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Gréer, acide aminé L pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L), et/ou n) en position 186, un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (acide aminé M pour la souche Gréer, acide aminé isoleucine pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861), et/ou o) en position 316, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé N pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N), et/ou p) en position 323, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Gréer, acide aminé E pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E), et/ou q) en position 479, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé P pour la souche Gréer, acide aminé L pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L), et/ou r) en position 497, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Gréer, acide aminé K pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), et/ou s) en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Gréer, acide aminé N pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N), et/ou t) en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Gréer, acide aminé S pour les cinq isoiats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
Parmi les positions de différence par rapport à la protéine HN de l'isolât Gréer, ci- dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolât V98. C'est notamment le cas des positions : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN comprend un acide aminé qui est différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât Gréer, et qui est également différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât V98, en au moins-une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces douze positions. En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre comprendre un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât Gréer en au moins une des positions aminocides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine HN de l'isolât Gréer et par rapport à la protéine HN de l'isolât V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide HN a) à I) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des douze différences de séquence a) à I) ci- dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces douze différences.
En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre présenter au moins une des différences m) à t) ci-dessus mentionnées.
Parmi les différences présentées par rapport à l'isolât Gréer, les positions 316, 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide HN o) s) et t) ci-dessus mentionnées.
L'isolât Gréer présente l'acide aminé S en position 316 de leur protéine HN. L'isolât Gréer ne présente pas de site de glycosylation à cette position. A cette position, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter un acide aminé autre que S, et plus particulièrement un acide aminé autre que S qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N (asparagine). Les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc présenter un nouveau site de glycosylation, par rapport à l'isolât Gréer.
Par rapport à l'isolât Gréer, les virus du groupe phylogénique de l'invention peuvent, alternativement ou complémentairement, se distinguer par le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent en positions 512- 515 de la protéine HN une structure tertiaire différente de celle observée chez le virus HPIV2 Gréer.
Cette différence structurale est notamment illustrée par la Figure 1 , qui présente la structure tertiaire prédite de la protéine HN de virus du groupe phylogénique variant de l'invention. En Figure 1 , la flèche A signale une boucle qui, chez la souche Gréer (modèle de gauche), est orientée vers l'intérieur de la protéine HN, alors que chez les isolats du groupe phylogénique variant de l'invention (modèle de droite) cette boucle, signalée par une flèche A' n'est pas orientée vers l'intérieur de la protéine, mais est orientée vers l'extérieur de la protéine HN. Cette bouche correspond aux positions 512-515 de la protéine HN, et plus particulièrement aux positions 513-514 de la protéine HN des isolats de l'invention. En terme de séquence aminoacide, les acides aminés qui sont en positions 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont, pour l'isolât Gréer, S et A, respectivement, alors qu'ils sont N et S, respectivement, pour les cinq isolats particuliers de l'invention. La présence d'un acide aminé autre que S, préférentiellement de l'acide aminé N, en position 513 de la protéine HN, et d'un acide aminé autre que A, préférentiellement de l'acide aminé S, en position 514 de la protéine HN est un moyen de définir les virus faisant partie du groupe phylogénique de variants de l'invention.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN comprend :
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât Gréer et qui est aussi différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolât Gréer en au moins une des positions aminoacides 316, 513, 514, de préférence en position 316 ou en positions 513 et 514, préférentiellement en positions 36, 513 et 514.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN présente : - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN a) à I) ci- dessus mentionnées (différences communément présentées par rapport à l'isolât Gréer et à l'isolât V98), de préférence au moins deux de ces différences, préférentiellement au moins trois de ces différences, plus préférentiellement au moins quatre de ces différences, encore plus préférentiellement au moins cinq de ces différences, très préférentiellement l'ensemble de ces douze différences, et
- au moins l'une des différences de séquence de protéine HN o) s) t) ci- dessus mentionnées, de préférence la différence o) et/ou les différences s) et t), préférentiellement au moins deux de ces différences, plus préférentiellement au moins les différences s) et t), encore plus préférentiellement les différences o) s) et t).
En résumé, un virus HPIV2 faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut être défini par le fait que : i. la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID NO :, et/ou par le fait que ii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID NO :, et/ou par le fait que iii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolât Gréer en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que iv. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des onze différences de séquence F a) à k), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que v. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que vi. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence F a) à g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que vii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que viii. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que ix. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sein de la séquence de la protéine F), et diffère en outre : o de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou o de celle de l'isolât Gréer en au moins une des positions aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538 ; et/ou par le fait que x. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre : o au moins l'une des trois différences de séquence F a), f) g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou o au moins l'une des différences de séquence F a), f) à k) ci-dessus mentionnées ; et/ou par le fait que xi. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolât Gréer en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513,
514 (positions des acides aminés au sein de la protéine HN) ; et/ou par le fait que xii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des vingt différences de séquence HN a) à t), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xiii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ; et/ou par le fait que xiv. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xv. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolât Gréer en au moins l'une des positions aminoacides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514 ; et/ou par le fait que xvi. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN m) à t), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que xvii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolât Gréer en au moins l'une des positions aminoacides 316, 513, 514 ; et/ou par le fait que xviii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN o) s) t), tel que ci-dessus mentionné.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par au moins l'un des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., v. à x., xiii. à xviii, préférentiellement par au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., vii., xiii. De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par :
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., vii., et/ou par
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous ii., xiii., par exemple par au moins les caractéristiques i. et ii., et/ou i. et xiii., et/ou vii. et ii., et/ou vii. et xiii.
Cinq isolats qui font partie du groupe phylogénique variant de l'invention, et qui ont été identifiés par les inventeurs, ont été déposés auprès de la C. N. C. M. aux fins du
Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; C.N.C.M. ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ;
France).
Leurs numéros de dépôt sont : 1-3761 (isolât 26056), I-3762 (isolât 26632), I-3763
(isolât 18620), I-3764 (isolât 20283), I-3765 (isolât 20435).
Ils ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le : 10 mai 2007. Ces isolats ont été isolés à partir d'aspirats nasaux ou de lavages bronchoalvéolaires de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le groupe phylogénique variant de l'invention comprend également l'isolât V94.
L'enseignement de l'art antérieur relatif à V94 incitait clairement la personne du métier à considérer que l'isolât V94 était un isolât très proche de l'isolât Gréer, et qu'il ne comportait pas de différence technique significative par rapport à l'isolât Gréer, à tout le moins aucune différence technique significative pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic de HPIV2. Par exemple, l'article Skiadopoulos et al. 2003 (Journal of Virology, vol. 77, No. 1 , pp. 270-279) fait état du séquençage complet de l'isolât V94, et rapporte des analyses comparatives de sa séquence avec celles des isolats Gréer et V98. Chacune des informations rapportées dans cet article présente l'isolât V94 comme un isolât qui est très proche de l'isolât Gréer.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolât V94 présenterait des différences structurales par rapport à l'isolât Gréer, qui seraient suffisamment significatives pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolât Gréer ne permet pas nécessairement de détecter l'isolât V94.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolât V94 présenterait des protéines d'enveloppe, et plus particulièrement des protéines F et/ou HN, suffisamment différentes de celles de l'isolât Gréer, pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolât Gréer via la détection de ses protéines d'enveloppe ne permet pas nécessairement de détecter l'isolât V94.
En outre, à la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne fait état du fait que, ou n'incite la personne du métier à considérer que, l'isolât V94 n'est pas un cas isolé appartenant au passé (l'isolât V94 a été isolé en 1994), mais qu'il fait en fait partie d'un groupe phylogénique particulier, qui est distinct du groupe de HPIV2 dont fait partie l'isolât Gréer, et dont des membres peuvent être actuellement isolés sur des patients.
A la connaissance des inventeurs, l'art antérieur ne suggère pas que l'isolât V94, qui a été isolé en 1994, était susceptible d'être phylogénétiquement lié à d'autres virus HPIV2 susceptibles d'être isolés postérieurement, notamment dans les années 2000, à partir de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le concept général de l'existence d'un groupe phylogénique variant de HPIV2, qui comprend plusieurs virus qui ont en commun de présenter une variation au niveau de l'enveloppe telle qu'ils pourraient ne pas être détectés par les moyens traditionnels de diagnostic de HPIV2, n'a donc, à la connaissance des inventeurs, été ni divulgué ni suggéré dans l'art antérieur.
Le fait que les isolats faisant partie de ce groupe phylogénique variant sont trouvés sur des patients actuels, alors que la souche Gréer de référence a été isolée en 1955, souligne encore l'intérêt de la présente invention. Au sein du groupe phylogénique variant de l'invention, un sous-groupe phylogénique peut être distingué. Ce sous-groupe comprend l'ensemble des cinq isolats particuliers de l'invention, et ne comprend pas l'isolât V94. Ce sous-groupe phylogénique de l'invention comprend des virus HPIV2, qui sont extrêmement proches les uns des autres.
Par rapport à l'isolât Gréer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils ne sont pas reconnus par certains anticorps anti-HPIV2 de l'art antérieur, et plus particulièrement par des anticorps de l'art antérieur qui sont dirigés contre la protéine d'enveloppe HN de virus HPIV2. Ces anticorps anti-HN de l'art antérieur ont en effet été produits ou construits à partir d'épitope(s) de la protéine HN de la souche HPIV2 qui servait de référence dans l'art antérieur, à savoir la souche HPIV2 Gréer. Or, les inventeurs montrent que la protéine HN des virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention ne comprend pas les mêmes épitopes que la protéine HN de l'isolât Gréer. Plus particulièrement, certains épitopes qui sont présents dans la protéine HN de l'isolât Gréer ne sont pas présents dans la protéine HN des virus du groupe phylogénique variant de l'invention. De ce fait, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention ne sont pas reconnus par certains anticorps anti-HN de l'art antérieur. Un exemple de tels anticorps anti-HN de l'art antérieur est l'anticorps commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9. Cet anticorps de l'art antérieur reconnaît un épitope sur la protéine HN de l'isolât Gréer, qui n'est pas présent dans les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Alternativement, ou en complément, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis comme ayant en commun de présenter une substitution de l'acide aminé qui est en position 175 au sein de la séquence de la protéine F, et/ou une substitution de l'acide aminé qui est position 186 de la séquence de la protéine HN.
La position 175 de la protéine F se situe dans le domaine HR1 du polypeptide Ft r En position 175, l'isolât V94 présente l'acide aminé H (histidine). La position 186 de la protéine HN est très proche du site catalytique de la protéine, et la nature de l'acide aminé présent à cette position est donc susceptible d'avoir une influence sur l'activité de la protéine.
En position 186 de la protéine HN, l'isolât V94 présente l'acide aminé M (et l'on peut incidemment noter que l'isolât Gréer présente également l'acide aminé M en position 186).
Un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention peut donc être défini par le fait que : - il fait partie du groupe phylogénique de l'invention tel que ci-dessus défini, par exemple à l'aide d'une ou plusieurs des caractéristiques de groupe ci- dessus mentionnées (telles que pourcentage d'identité de la protéine F et/ou HN, différence(s) de séquence(s) F et/ou HN, structure tertiaire de HN différente), et en outre par le fait que:
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine Hn de l'isolât Gréer, et/ou
- il présente un acide aminé autre que H en position 175 de la protéine F et/ou (de préférence, et) un acide aminé autre que M en position 186 de la protéine
HN.
De préférence, l'acide aminé en position 175 de la séquence de la protéine F d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acide aminé R (asparagine). De préférence, l'acide aminé en position 186 de la séquence de la protéine HN d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acide aminé I (isoleucine).
Toutes les combinaisons de caractéristique(s) de groupe et de caractéristique(s) de sous-groupe sont explicitement incluses dans la présente demande.
Par exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini : - par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i., ii., v. à x., xiii. à xviii. ci-dessus listées, et
- par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes : - en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M1 préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), et/ou
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
Pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, une ou plusieurs dix-huit caractéristiques i. à xviii. peuvent être utilisées, comme indiqué ci-dessus au chapitre de la définition du groupe phylogénique variant de l'invention. Toutes les combinaisons de caractéristiques sont explicitement visées par la présente demande.
Par exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i. à xviii. ci-dessus listées, et - par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M1 préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), et/ou - en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, et/ou
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine HN de l'isolât Gréer.
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et en outre par le fait que :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, ils présentent un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine).
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que : - la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de
99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, ~ et en outre par le fait que :
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, ils présentent un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
A titre récapitulatif ou illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 13 :
Tableau 13 (suite et fin)
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans faire nécessairement appel à au moins une des caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées, est le % d'identité que présente la séquence aminoacide de leurs protéines F et/ou HN.
En effet, les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention peuvent être définis par le fait que : - la séquence aminoacide de leur protéine F présente préférentiellement une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou
- la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Les virus HPIV2 qui répondent à ces critères d'identité font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans qu'il y ait nécessairement à faire appel à une des caractéristiques de groupe i. à xviii. ci-dessus mentionnées.
La présente demande est donc relative à tout virus HPIV2 : i. qui répond à au moins des caractéristiques de groupe i. à xviii., tel que ci- dessus mentionné, et à au moins une des caractéristiques de sous-groupe, tel que ci-dessus mentionné (acide aminé autre que H en position 175 de sa protéine F, préférentiellement, l'acide aminé R ; acide aminé autre que M en position 186 de sa protéine HN, préférentiellement, l'acide aminé I ; virus non reconnu des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur), et/ou ii. dont la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou iii. dont la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats
18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Un virus HPIV2 faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente au moins l'une des ces caractéristiques i. à iii. ci-dessus, par exemple une, deux, ou l'ensemble de ces caractériques.
La demande vise plus particulièrement cinq virus particuliers. Ces cinq virus particuliers sont ceux qui ont été déposés auprès de la C. N. C. M. le 10 mai 2007, sous les numéros de dépôt 1-3761 (isolât 26056), I-3762 (isolât 26632), I-3763 (isolât 18620), I-3764 (isolât 20283), I-3765 (isolât 20435). Ils font partie du groupe phylogénique de l'invention, et également du sous-groupe phylogénique de l'invention.
Les paramètres physico-chimiques des protéines F et HN de ces virus particuliers sont prtésentés en tableaux 14 et 15 ci-dessous (paramètres calculés à l'aide du logiciel CLC Free WorkBench version 3.2).
La présente demande est relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à celle(s) de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à celle(s) de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
La présente demande est plus particulièrement relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, un virus HPIV-2 de l'invention a une protéine F qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont une protéine HN qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention. De préférence, lesdits au moins deux paramètres comprennent le paramètre de point isoélectrique.
Tableau 14 :
Tableau 15 :
La demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence séquence comprend, ou est constituée de (la séquence d'un acide nucléique d'un virus HPIV2 de l'invention; et plus particulièrement) : a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 du groupe ou sous- groupe de l'invention, ou b) la séquence d'un ADNc (simple-brin ou double-brin) susceptible d'être obtenu par transcription inverse (ou transcription inverse et polymérase) d'un tel ARN génomique, ou c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus, sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
Protéines :
La présente demande est relative à toute protéine qui est celle d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Dans la présente demande, le terme protéine comprend dans sa portée les protéines non glycosylées, tout comme les glycoprotéines.
Les virus qui font partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention présente une enveloppe virale différente de celle habituellement observée dans l'art antérieur, plus particulièrement différente de celle de l'isolât Gréer, préférentiellement différente de celles des isolats Gréer, Toshiba et V98.
L'enveloppe des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention est en outre différente de celle de l'isolât V94.
La présente demande est donc relative à tout protéine d'enveloppe d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Cette protéine d'enveloppe peut être, ou comprendre, la protéine F d'un tel virus et/ou la protéine HN d'un tel virus. La présente demande est plus particulièrement relative aux protéines d'enveloppe qui sont spécifiques des virus du sous-groupe de l'invention, préférentiellement des cinq isolats particuliers de l'invention qui ont été déposés auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à I-3765.
Ladite protéine F présente un certain nombre de différence(s) par rapport à une protéine F de l'isolât Gréer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Gréer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F des isolats Gréer, Toshiba, V98 et V94. Par exemple, la séquence de cette protéine F peut présenter un certain nombre de substitution(s) d'acide(s) aminé(s), par rapport à la séquence de la protéine F de l'isolât Gréer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Gréer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F des isolats Gréer, Toshiba, V98 et V94.
Chacune des définitions des protéines F et HN ci-dessus présentées au chapitre de la définition des virus selon l'invention s'appliquent naturellement aux protéines F et HN en tant que telles.
Ainsi, comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, les protéines F et HN peuvent être définies par une combinaison d'au moins une caractéristique de groupe (au moins une différence par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98) et au moins une caractéristique de sous-groupe (au moins une différence par rapport à l'isolât V94).
Par exemple, parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolât de l'invention, par rapport à l'isolât Gréer, plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, peuvent notamment être citées les différences suivantes, qui sont relatives au site de clivage de la protéine F (positions 102 à 106 de la séquence complète de la protéine F ; cf. CS en Figure 4) :
- en position 102, un acide aminé autre que T (thréonine), préférentiellement l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, un acide aminé autre que Q (glutamine), préférentiellement l'acide aminé R (arginine).
De préférence, ladite protéine F comprend à la fois l'acide aminé P en position 102 et l'acide aminé R en position 104. En position 102, les isolats Gréer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé T (thréonine), et non l'acide aminé P.
En position 104, les isolats Gréer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé Q (glutamine), et non l'acide aminé R.
De préférence, ladite protéine F présente l'acide aminé E en position 105. Avantageusement, la séquence de ce site de clivage est KPRRER (SEQ ID NO : 14).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolât de l'invention, par rapport à l'isolât Gréer, plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 112, un acide aminé autre que V (valine), préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), et/ou
- en position 160, un acide aminé autre que D (acide aspartique), préférentiellement l'acide aminé T (théonine).
La position 1 12 se situe dans le peptide de fusion (FP) ; la position 160 se situe dans le domaine HR1 du polypeptide F1.
En position 112, les isolats Gréer et V98 présentent l'acide aminé V (valine). En position 160, les isolats Gréer et V98 présentent l'acide aminé D (acide aspartique).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolât de l'invention, par rapport à l'isolât Gréer, plus particulièrement par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 32, un acide aminé autre que I (isoleucine), préférentiellement l'acide aminé V,
- en position 247, un acide aminé aùîre que N, préférentiellement l'acide aminé K,
- en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V, La dite protéine F de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, ou plus, voire l'ensemble des différences ci-dessus mentionnées. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande.
La protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut, en sus de la ou des différence(s) ci-dessus mentionnée(s), présenter une ou des différence(s) par rapport à la protéine F de l'isolât V94. Avantageusement, la protéine F d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente un acide aminé autre que H en position 175, préférentiellement l'acide aminé R (mutation H175R).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F par rapport à l'isolât V94, peuvent notamment être citées les différences particulières suivantes : - en position 4, un acide aminé autre que L, préférentiellement l'acide aminé P, et/ou
- en position 403, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé T, et/ou
- en position 516, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine).
Par exemple :
- l'isolât 20283 de l'invention présente la substitution L4P et la substitution V516I, par rapport à l'isolât V94, et également par rapport à l'isolât Gréer,
- l'isolât 26056 de l'invention présente la substitution N403T, par rapport à l'isolât V94,
- l'isolât 20435 présente la substitution V516I par rapport à l'isolât V94, et également par rapport à l'isolât Gréer.
La dite protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, des différences ci-dessus mentionnées, en sus d'au moins une différence de séquence F par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande. Des virus HPIV2 faisant partie du groupe ou, le cas échéant, du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc être des variants qui présentent la(les) mutation(s) V112I et/ou D160T au sein de la protéine F par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98 et la mutation H175R au sein de la protéine F par rapport à l'isolât V94.
Comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, des différences au niveau des protéines F permettent de distinguer une protéine F d'un virus du sous-groupe de l'invention, sans avoir nécessairement à combiner cette différence avec une différence de groupe. Il s'agit donc de différences spécifiques particulières, qui distinguent les protéines F des virus du sous-groupe de l'invention, tels que les cinq isolats particuliers déposés auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à I- 3765, des isolats Gréer, Toshiba, V98 et V94. La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine F, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (cf. tableau 5).
Une protéine d'enveloppe de l'invention peut être, ou comprendre, la protéine HN d'un virus faisant partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, plylogénique variant de l'invention.
Cette protéine HN peut présenter au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants (éléments de différence par rapport aux protéines HN des isolats Gréer, Toshiba et V98) : - en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A,
- en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 201 , un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S,
- en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T,
- en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K,
- en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M,
- en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
Une protéine HN d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente en outre au moins une différence par rapport à la protéine HN de l'isolât V94.
Préférentiellement, cette protéine HN présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine) en position 186. L'isolât V94 présente l'acide aminé M en position 186. L'isolât Gréer présente également l'acide aminé M en position 186.
Les cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., présentent quant à eux l'acide aminé I (isoleucine) en position 186. La présente demande est donc relative à toute protéine HN qui présente au moins l'un des éléments de différences listés ci-dessus, par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, et qui présente un acide aminé autre que M en position 186.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine HN, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (protéine HN des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences. La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (cf. tableau 5).
Fragments de protéines :
La présente demande est également relative aux fragments des protéines d'enveloppe des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement aux fragments des protéines F et HN des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Sont plus particulièrement visés ceux des fragments de protéine, qui sont spécifiques des virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, et plus particulièrement des cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été déposés auprès de la CNCM sous les nuémros 1-3761 à I-3765.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi :
- le fragment partie extracellulaire, - le fragment polypeptide F2,
- le fragment site de clivage (CS),
- le fragment peptide de fusion (FP),
- le fragment domaine HR1 ,
- le fragment domaine HR2, - le fragment polypeptide F1 ,
- le fragment partie transmembranaire,
- le fragment partie intracytoplasmique de ces protéines F.
La Figure 4 donne une présentation schématique de tels fragments. Ces fragments s'étendent des positions suivantes, calculées à partir de la séquence des protéines F complètes :
Tableau 12 : position des~fragments dans la séquence complète de la protéine F
Les séquences des protéines F complètes des cinq isolats particuliers de l'invention sont les séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement).
La présente demande est relative à toute protéine, polypeptide, peptide (glycosylé ou non), qui comprend au moins (ou qui est constitutée de) la séquence du site de clivage des protéines F des virus de l'invention, c'est-à-dire la séquence KPRRER (SEQ ID NO : 14).
Une telle protéine, ou le cas échéant un tel polypeptide ou peptide peut être d'origine virale, plus particulièrement issu de l'enveloppe d'un virus, de préférence d'un virus HPIV-2. La présente demande vise notamment toute protéine F, de préférence toute protéine F de HPIV2, qui comprend la séquence du site de clivage de SEQ ID NO : 14.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est par ailleurs plus particulièrement relative à ceux des fragments dont la séquence de ce fragment comprend au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était (étaient) à l'une des positions suivantes : positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La taille dudit fragment est d'au moins 10 acides aminés. Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 1 1 et 550. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention. Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non- humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H).
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 160 (acide aminé autre que D, tel que T), et a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H, tel que R).
Parmi les fragments de protéines HN de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi les fragments d'au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était (étaient) à l'une des positions suivantes : 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
De tels fragments peuvent avoir en outre conservé au moins un, de préférence au moins deux, plus préférentiellement les trois, acide(s) aminé(s) parmi ceux qui, dans la séquence complète de la protéine HN dont le fragment dérive, étaient :
- à la position 316 (acide aminé autre que S), - à la position 513 (acide aminé autre que S),
- à la position 514 (acide aminé autre que A).
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à la position 316.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à la position 316, au moins l'acide aminé qui était à la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
Les fragments de protéine de l'invention sont notamment des candidats d'intérêt pour la production d'anticorps spécifiques des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, et/ou pour l'identification des épitopes de tels anticorps. La taille dudit fragment de protéine HN est d'au moins 10 acides aminés. Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 570. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non- humain, de préférence en présence d'alun. Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine HN de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était à la position 186 (acide aminé autre que M).
Acides nucléiques codant protéines et petits fragments :
La présente demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence code au moins une protéine d'enveloppe selon l'invention, ou au moins un fragment de protéine d'enveloppe selon l'invention, en tenant compte de la dégénérescence du code génétique universel.
Ces acides nucléiques peuvent être de I1ADN ou de I1ARN.
Ladite protéine d'enveloppe peut être une protéine F et/ou HN de l'invention.
Ces acides nucléiques codent une protéine d'enveloppe, ou un fragment de protéine d'enveloppe, d'au moins l'un des virus du group ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention présentent une ou des différences par rapport aux isolats Gréer, toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à l'isolât Gréer.
Par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F et/ou une protéine HN peuvent présenter la(les) différence(s) nucléotidique(s), qui correspondent à la (aux) différence(s) aminoacide(s) identifiées ci-dessus pour les protéines et fragment de protéine de l'invention, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
Par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 94-96, un codon codant un acide aminé autre que I1 préférentiellement un codon codant l'acide aminé V,
- en positions 304-306, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé P, - en positions 310-312, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R,
- en positions 334-336, un codon codant un acide aminé autre que V, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I, - en positions 478-480, un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T,
- en positions 739-741 , un codon codant un acide aminé autre que N, préférentiellement un codon codant l'acide aminé K,
- en positions 1612-1614, un codon codant un acide aminé autre que F, préférentiellement un codon codant l'acide aminé V.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes : - en positions 169-171 , un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 340-342, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A,
- en positions 415-417, un codon codant un acide aminé autre que K, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 583-585, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A,
- en positions 601 -603, un codon codant un acide aminé autre que A1 préférentiellement un codon codant l'acide aminé S, - en positions 955-957, un codon codant un acide aminé autre que P, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T,
- en positions 1030-1032, un codon codant un acide aminé autre que E1 préférentiellement un codon codant l'acide aminé K, - en positions 1042-1044, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I,
- en positions 1132-1134, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 1135-1137, un codon codant un acide aminé autre que R, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E,
- en positions 1438-1440, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé M,
- en positions 1444-1446, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du sous- groupe phylogénique variant de l'invention présentent au moins une des différences ci-dessus par rapport aux isolats Gréer, Toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à l'isolât Gréer, et en outre au moins une différence par rapport à l'isolât V94.
Par rapport à l'isolât V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en position 33, un nucléotide autre que T, préférentiellement le nucléotide C (par exemple, le codon 31 -33 de l'isolât V94 est ATT, alors que dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATC), - en position 525, un nucléotide autre que A, préférentiellement le nucléotide G (par exemple, le codon 524-526 de l'isolât V94 est CAC, codant l'acide aminé H en position 175 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est CGC, codant l'acide aminé R en position 175), - en position 1479, un nucléotide autre que C, préférentiellement le nucléotide A (par exemple, le codon 1479-1481 de l'isolât V94 est ATC, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
De préférence, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F présentent au moins la différence ci-dessus mentionnée pour la position 525. Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous- groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport à l'isolât V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins la différence suivante :
- en position 558, un nucléotide autre que G, préférentiellement A (par exemple, le codon 556-558 est ATG dans l'isolât V94, codant pour l'acide aminé M en position
186 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA, codant l'acide aminé I -isoleucine- en position 186).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous- groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de différences nucléotidiques sont explicitement visées par la présente demande.
A titre récapitulatif et illustratif, le tableau suivant peut être présenté : Tableau 16 :
La présente demande vise plus particulièrement les acides nucléiques qui codent les protéines F et/ou HN des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire les acides nucléiques dont la séquence comprend, ou est constituée, d'une séquence parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40 (cf. tableau 5).
Applications pour la détection de HPIV2, et plus particulièrement pour son diagnostic (moyens immunoloqiques ou moléculaires) :
Partant de l'identification, de la description et de la caractérisation du groupe phylogénique variant et du sous-groupe phylogénique variant, les inventeurs proposent de nouveaux moyens de détection de HPIV2, et plus particulièrement de nouveaux moyens pour le diagnostic de HPIV2.
Les nouveaux moyens de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de
HPIV2 de l'invention permettent de détecter l'ensemble des virus du groupe phylogénique variant de l'invention. L'invention propose notamment des moyens qui permettent leur détection et/ou leur diagnostic de manière spécifique, c'est-à-dire sans détection des isolats
HPIV2 Gréer, Toshiba et V98.
L'invention propose en outre des moyens qui permettent la détection et/ou le diagnostic des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention de manière spécifique, c'est-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba et V98, et sans détection de l'isolât V94. Moyens immunologiques :
La présente demande est également relative à des anticorps, qui se lient à l'enveloppe de virus HPIV2.
La présente demande est également relative à des fragments de tels anticorps qui ont conservé la capacité de se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2. Le terme « fragment d'anticorps » comprend notamment les fragment Fab, F(ab)'2, Fv, les CDR1 , CDR2, CDR3, ainsi que les constructions dérivant de tels fragments tels que des scFv ou des anticorps humanisés.
L'expression « se lier » est ici utilisée dans son sens habituel dans le contexte des liaisons anticorps-antigène.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps, qui se lient à l'enveloppe d'au moins un virus du groupe phylogénique variant de l'invention, de préférence d'au moins l'un des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C. N. C. M., de préférence d'au moins deux, trois ou quatre, plus préférentiellement de ces cinq virus.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps qui ne se lient pas à l'enveloppe de l'isolât HPIV2 Gréer (la séquence de l'isolât Gréer est disponible auprès de Genbank sous le numéro d'accès NC_003443, et est reproduite dans la présente demande, après la partie « exemples », point B.2.), et plus particulièrement sans se lier à une protéine d'enveloppe des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba et V98.
De préférence, cet anticorps ne se lie à aucun microorganisme qui ne serait pas un virus HPIV2.
De préférence, un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention est un anticorps spécifique des virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée d'une protéine F.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine-F de l'invention et/ou à un fragment de protéine F de l'invention. Les caractéristiques ci- dessus décrites pour définir les protéines F et les fragments de protéines F de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines F et des fragments de protéines F qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention." Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine F en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 96, 102, 104, 112, 160, 247, 248, 390, 524, 538, plus particulièrement en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée, d'une protéine HN. Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine HN de l'invention et/ou à un fragment de protéine HN de l'invention. Les caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines HN de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines HN et des fragments de protéines HN de l'invention qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention. Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend :
- au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situent en positions 316, 513, 514 (par exemple, un épitope de protéine HN comprend les acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, qui se situe en positions 513-514, ou 512-515), et/ou - au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 100, 1 14, 139, 186, 195, 201 , 319, 323, 344, 348, 378, 379, 479, 480, 482, 497, plus particulièrement en positions 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
Plus particulièrement encore, la demande est relative à des anticorps ou fragments d'anticorps, qui sont spécifiques des virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention. De tels anticorps ne se lient donc pas à l'isolât HPIV2 V94. Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut notamment se lier à une protéine F d'au moins l'un des virus du sous-groupe phylogénique variant en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en position 175.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut naturellement porter un marquage pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage fluorsecent ou enzymatique.
La présence demande est également relative à des hybridomes produisant de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à des cellules transfectées, infestées ou transformées, qui produisent de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à toute composition qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention, avec éventuellement au moins un véhicule pharmaceutique acceptable.
La présente demande est également relative à tout kit, plus particulier tout kit de diagnostic, qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention. Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment :
- des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les HPIV2 Gréer, Toshiba, V98, et/ou
- des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1 , HPIV3, HPIV4, et/ou
- des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe. La présente demande est également relative à une méthode pour produire un anticorps capable de se lier à au moins un virus du groupe, ou le cas échéant, du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement à au moins l'un des cinq isolats particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., et de préférence à ces cinq isolats particuliers. De préférence, les anticorps ainsi produits sont des anticorps spécifiques de ces virus.
Cette méthode peut comprendre l'administration à un mammifère (de préférence, un mammifère non-humain) d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, de préférence les cinq isolats particuliers de l'invention, et éventuellement également l'isolât V94, et/ou d'au moins une protéine d'enveloppe ou d'au moins un fragment de protéine d'enveloppe de l'invention, tel que par exemple un fragment de protéine HN qui a conservé l'acide aminé qui, dans la séquence de la protéine HN, était en position 316 et/ou les deux acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, était en positions 513 et 514.
L'administration est réalisée de telle sorte que le(s) virus, protéine(s), fragment(s) de protéine(s) administré(s) induisent la production d'anticorps par le mammifère qui le(s) reçoit. Cette administration peut être faite avec un adjuvant susceptible d'augmenter l'immunogénicité tel qu'un alun.
Les anticorps produits sont alors recollectés, et de préférence isolés.
Des anticorps monoclonaux peuvent être produits selon les techniques connues de la personne du métier.
Moyens moléculaires :
Acides nucléiques de référence (grands fragments d'acides nucléiques) :
Les inventeurs ont sélectionné des acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'au moins l'un des isolats de l'invention, de préférence de l'ensemble des isolats de l'invention. Les acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique de l'ensemble des isolats de l'invention permettent de détecter l'ensemble des isolats susceptibles de faire partie du groupe phylogénique variant.
La présente demande est relative à des acides nucléiques qui sont spécifiques d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, dont ne font pas partie les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba et V98, et qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce groupe ou sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production de sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique.
Ces acides nucléiques sont des fragments d'au moins un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique de l'invention, dont font partie les cinq isolats particuliers qui ont été déposés par les inventeurs. Ces acides nucléiques s'hybrident avec un ou plusieurs des virus du groupe, ou sous-groupe, phylogénique de l'invention dans des conditions de forte stringence.
Des conditions de forte de stringence sont des conditiosn connues de la personne du métier, par exemple des conditions d'hybridations sur ADN lié à un flitre dans
SSC 5X, dodecyl sulfate de sodium (SDS) 2%, 100 microgrammes/mL d'ADN simple-brin, à 55-650C pendant 8 heures, et lavage dans SSC 02X et SDS 0,2% à
60-650C pendant 30 minutes.
De préférence, de tels acides nucléiques ne s'hybrident à aucun microorganisme autre que HPIV2 dans des conditions de forte stringence.
De préférence, dans des conditions de forte stringence, de tels acides nucléiques ne s'hybrident pas à des isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe phylogénique de l'invention, tels que les isolats Gréer,
Toshiba et V98.
De tels acides nucléiques sont alors des acides nucléiques qui s'hybrident spécificiquement à un, de préférence à plusieurs, plus préférentiellement à l'ensemble, des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Un tel acide nucléique peut être caractérisés par le fait que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de : - un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon la revendication 1 , ou
- la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment. De préférence, ledit fragment est un fragment d'au moins 133, 134, 135, 136, 137 nucléotides (par exemple des fragments de 137, 180, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 137, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 180 nucléotides). Plus préférentiellement, ledit fragment est un fragment d'au moins 170, 175, 180 nucléotides (par exemple, 180, 208, 210 ou 180, ou 208, 210 nucléotides). Par exemple, ledit fragment est un fragment d'au moins 240 nucléotides.
Avantageusement, notamment pour la construction et la production d'amorces et sone(s) adaptées à une mise en œuvre en amplification temps réel, ledit fragment est un fragment d'au plus 400 nucléotides.
De préférence, ladite séquence codant la protéine F est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 23, 28, 33, 38, 43, et/ou en ce que ladite séquence codant HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 25, 30, 35, 40, et/ou ladite séquence codant les protéines F et HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42. De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 86.
La demande est notamment relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production de sondes ou d'amorces spécifiques du groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention, qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba et V98, caractérisé en ce que cet acide nucléique comprend, ou est constituée de: a) au moins une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 57 à 86, ou b) un fragment conservateur d'au moins l'une des séquences visées sous a), ledit fragment conservateur comprenant, ou étant constitué d'au moins une séquence choisie parmi :
- les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant F des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 259 à 395 des séquences codant F des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 234 à 443 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 961 à 1140 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 1381 à 1560 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention,
- les séquences qui s'étendent des positions 1466 à 1673 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou c) la séquence complémentaire de l'une des séquences visées sous a) et b), sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
La présente demande est plus particulièrement relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression « acides nucléiques temps réel », par souci de simplification. Un tel acide nucléique peut être défini par le fait que sa séquence comprend, ou est constituée de : - un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend : - des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
De préférence, ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :62 à 66, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :67 à 70, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :83 à 86. La séquence dudit acide nucléique séquence peut alors comprendre, ou être constituée d'une des séquences suivantes : les séquences de SEQ ID NO : 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
La présente demande est également relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression « acides nucléiques puces », par souci de simplification. La séquence d'un tel acide nucléique avantageusement comprend, ou est constituée de : - un fragment de la séquence codant F et/ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend : - des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
La présente demande est donc relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production d'au moins une sonde qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique variant, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98. Avantageusement, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'une des séquences suivantes : les séquences de SEQ ID NO : 57 à 61 , 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé. De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 61 , 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82.
Amorces et sondes, spécialement dapatées à une amplification en temps réel :
La présente demande est également relatives à des paires d'amorces et des sondes qui peuvent leur être associées pour une en œuvre en amplification temps réel, de préférence en PCR temps réel.
La présente demande est relative à une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Gréer, Toshiba, et V98.
Une paire d'amorces de l'invention peut notamment être définie par le fait que les séquences de chacune des amorces de cette paire sont telles qu'elles permettent l'amplification d'un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des virus HPIV2 Gréer, Toshiba et V98, lorsque cette paire d'amorces est placée en contact avec le matériel ARN dudit au moins un des cinq virus de la revendication 1 , et d'autre part avec le matériel ARN de chacun desdits virus Gréer, Toshiba et V98, par exemple dans quatre tubes distincts, en présence des réactifs de RT-PCR appropriés, tels que par exemple :
- tampon TaqMan® EZ 5X (250 mM bicine -N,N-bis(2-hydroxyéthyle glycine); 575 mM acétate de potassium ; 0,05 mM EDTA ; 40% glycérol; pH 8,2) : pour une concentration finale de 1 X,
- acétate de manganèse (25 mM) : pour une concentration finale de 2 à 5 mM, par exemple une concentration finale de 3 mM,
- dATP, dCTP, dGTP : pour une concentration finale de 300 μM chacun, - dUTP : pour une concentration finale de 600 μM,
- AmpErase UNG : pour une concentration finale de 0,01 U/μL,
- 500 nM de chaque amorce de la paire testée, - 10 pg à 100 ng de l'ARN viral, - polymérase thermostable, présentant une activité transcriptase inverse et une activité de ADN polymérase, telle que la rTth polymérase (disponible par exemple auprès de Applied Biosystems sous la référence produit N808-0192) : pour une concentration finale de 0,1 U/μL,
- H2O déminéralisée et sans ARN, et sous des conditions de RT-PCR appropriées, telles que par exemple les conditions expérimentales suivantes :
- activité de l'AmpErase UNG (enzyme uracyl N-glycosylase ; CE 3.2.2) : 5O0C pendant 2 min,
- réverse transcription (rTth polymérase) à 6O0C pendant 30 min, - désactivation de l'AmpErase UNG : 95°C pendant 10 min,
- PCR : 25 à 40 cycles de
- dénaturation à une température de 95°C à 97°C pendant 15 secondes,
- annelage et extension à une température qui, de préférence, est de 15°C à 5°C inférieure à la valeur réelle de la température de fusion (Tm) de la paire d'amorces testée et qui est, de préférence, supérieure à 550C, par exemple à une température de 55°C à 700C, par exemple 6O0C, pendant 1min.
Le mélange réactionnel commercialisé par Applied Biosystems sous la désignation « Taqman® EZ RT-PCR kit » est une exemple de kit fournissant un milieu réactionnel approprié.
Il convient alors de déterminer si la paire d'amorces testée amplifie bien au moins un des cinq virus de l'invention, sans amplifier les isolats Gréer, Toshiba et V98, c'est-à-dire si la paire d'amorces testée a conduit à la production d'un amplicon à partir du matériel ARN d'au moins un des cinq virus de l'invention, et n'a pas conduit à la production d'un amplicon à partir du matériel ARN de chacun des isolats Gréer, Toshiba et V98.
Tout moyen que la personne du métier trouvera adapté à la détection de la présence ou de l'absence d'un amplicon peut être mis en œuvre. Un moyen simple, qui ne nécessite pas la production d'une sonde de détection, peut comprendre l'électrophorèse des acides nucléiques (par exemple, sur gel d'agarose à 1%) en présence de bromure d'éthidium et l'analyse visuelle ou densitométrique des bandes résultantes après irradiation aux ultra-violets.
Les paires d'amorces appropriées sont celles :
- dont chacune des deux amorces parvient à s'hybrider à une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins l'un des cinq virus de l'invention, de préférence de chacun des cinq virus de l'invention, de telle sorte à permettre l'amplification de la région bornée par chacune de ces deux amorces, et
- dont au moins une des deux amorces ne trouve pas de cible sur le matériel nucléotidique de chacun des isolats Gréer, Toshiba et V98, qui permettrait l'amplification d'une région du matériel nucléotidique de chacun des isolats Gréer, Toshiba et V98.
Des paires d'amorces candidates peuvent donc être choisies parmi celles dont au moins une des deux amorces présente une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins un des cinq virus de l'invention, et de préférence sur chacun des cinq virus de l'invention, qui ne se retrouve pas à l'identique dans le matériel nucléotidique des isolats Gréer, Toshiba et V98 (au moins une différence nucléotidique).
On choisira de préférence des paires d'amorces :
- qui contiennent de 14 à 30 nucléotides,
- dont le contenu en G+C est de 20 à 80%, - dont la température de fusion (Tm) est de 58°C à 600C pour chaque amorce, et
- dont les cinq derniers nucléotides à l'extrémité 3' de chaque amorce ne comprennent pas plus de deux bases G et/ou C.
La construction de paires d'amorces est une technique connue de la personne du métier. Des moyens automatisés sont d'ailleurs disponibles à cette fin, tels que le logiciel « Primer Express » version 3 ou supérieure, commercialisé par Applied Biosystems. Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent être celle d'un fragment 5' de la séquence amplifiée à partir de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment 5' de la séquence complémentaire de cette séquence amplifiée (fragments 5' comprenant le tout premier nucléotide à l'extrémité 5'). Dans ce cas, les séquences des paires d'amorces appropriées sont celle d'un fragment de la séquence de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment de la séquence complémentaire de cette séquence virale.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent également être des séquences variantes de tels fragments, susceptibles d'être obtenues par substitution et/ou addition et/ou délétion d'au moins un nucléotide de la séquence de ces fragments, et qui ont conservé la capacité à amplifier au moins l'un des cinq virus de l'invention, sans amplifier Toshiba, Gréer et V98. De préférence, de telles séquences variantes ont conservé au moins une différence nucléotidique par rapport à l'ensemble de leurs cibles potentielles dans chacun des isolats Gréer,
Toshiba, et V98.
Il est préférable d'extraire l'ARN des virus avant de les mettre en contact avec la paire d'amorces testée, de sorte à rendre cet ARN facilement accessible à cette paire d'amorces. Des moyens permettant d'extraire le matériel ARN de virus sont connus de la personne du métier. Par exemple, un échantillon de virus peut être traité par un tampon d'extraction contenant du thiocyanate de guanidium 4M, de la N-lauryle sarcosine 0,5%, du dithiothréitol 1 mM, du citrate de sodium 25 mM, et du glycogène à 0,1 mg par mL, puis par précipitations à l'isopropanol et à l'éthanol 70%.
De préférence, ladite paire d'amorces amplifie un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à I-3765.
Avantageusement, une paire d'amorces de l'invention est telle que :
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temsp réel de l'invention, et en ce que - la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique temps réel sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est capable d'amplifier un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Gréer, Toshiba, et V98.
Dans une paire d'amorces de l'invention, chacun desdits fragments 5' est (indépendamment l'un de l'autre) constitué de (14 à 30 nucléotides, de préférence de) 18 à 23 nucléotides.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est constituée (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous) :
- d'une amorce de SEQ ID NO : 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou
- d'une amorce de SEQ ID NO : 91 , et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou
- d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
La présente demande est également relative à tout ensemble d'amorces qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention.
La présente demande est également relative à toute amorce, qui est telle que choisie au sein d'une paire d'amorces de l'invention.
La présente demande est également relative à une sonde pouvant être mise en œuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'invention, pour la détection spécifique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Avantageusement, une telle sonde « temps réel » présente une séquence (d'hybridation) qui est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temps réel de l'invention, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment. De préférence, ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 14 à 30 nucléotides, de préférence de 23 à 28 nucléotides.
Avantageusement, une telle sonde « temps réel » est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 89, 90, 93, 94, 97, 98 (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous). Une telle sonde peut porter un marquage, par exemple pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage radioactif, fluorescent ou enzymatique.
Une telle sonde peut avantageusement porter un marquage fluorescent et un quencher, de sorte à être adaptée à une utilisation en tant que sonde type Taqman® ou de type beacon ou de type Scorpion®. Une telle sonde pourra alors comporter des bras qui ne s'hybrident pas aux virus HPIV2, et qui sont destinés à former des bras beacon.
La présente demande est également relative à un ensemble d'oligonucléotides, qui comprend au moins une paire d'amorces « temps réel » selon l'invention et au moins une sonde « temps réel » selon l'invention. Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 87-88, et la sonde de SEQ ID NO : 89 ou 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 91 -92, et la sonde de SEQ ID NO : 83 ou 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 95-96, et la sonde de SEQ ID NO : 87 ou 98.
Un ensemble selon l'invention peut par exemple comprendre au moins une paire d'amorces selon l'invention, et au moins deux sondes « temps réel » selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 87-88, la sonde de SEQ ID NO : 89 et la sonde de SEQ ID NO : 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 91 -92, la sonde de SEQ ID NO : 83 et la sonde de SEQ ID NO : 94. - Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de
SEQ ID NO : 95-96, la sonde de SEQ ID NO : 87 et la sonde de SEQ ID NO : 98. La présente demande est également relative à un kit pour le diagnostic d'une affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention et/ou au moins une sonde selon l'invention.
La présente demande est également relative à un système d'amplification, qui est spécialement adaptée à une amplification temps réel, qui comprend au moins une paire d'amorces de l'invention et au moins une sonde selon l'invention, et plus particulièrement au moins une paire d'amorces selon l'invention et au moins une sonde selon l'invention qui est capable de s'hybrider sur l'amplicon produit par cette paire d'amorces à partir de l'acide nucléique d'un virus du groupe, ou sous- groupe, phylogénique variant de l'invention.
La présente demande est également relative à toute composition et plus particulièrement à toute composition pharmaceutique ou biologique, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système « temps réel » de l'invention.
La présente demande est également relative à un kit qui est spécialement adapté à la détection de HPIV2, plus particulièrement à son diagnostic, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système
« temps réel » de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment : - des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les HPIV2
Gréer, Toshiba, V98, et/ou
- des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1 , HPIV3,
HPIV4, et/ou - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe. La présente demande est également relative à une méthode pour la détection, plus particulièrement pour le diagnostic, de HPIV2 qui comprend la mise en contact d'un échantillon susceptible de contenir au moins un virus HPIV2, avec au moins une paire d'amorces et au moins une sonde de l'invention, dans des conditions adaptées à une amplification temps réel, par exemple une PCR temps réel.
La détection de la présence d'un amplicon produit par cette paire d'amorces et détecté par cette sonde est indicatif de la présence d'un virus HPIV2 faisant partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique de l'invention.
La présente demande est également relative à tout amplicon susceptible d'être obtenu par amplification à l'aide d'une paire d'amorces de l'invention d'un acide nucléique d'un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Sondes, spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce :
La présente demande décrit la sélection d'acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes, qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce (acides nucléiques puces ci-dessus).
La présente demande est donc relative à une sonde qui est spécialement adaptée à une mise en œuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98.
De préférence, une telle sonde est un acide nucléique qui s'hydride en conditions de forte stringence à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98, dans les mêmes conditions de forte stringence. Des conditions de forte stringence sont connues de la personne du métier, et un exemple de telles conditions a été décrit ci-dessus. Avantageusement, une telle sonde est telle que sa séquence est celle d'un fragment d'un acide nucléique puce de l'invention, ou celle de la séquence qui est la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
La présente demande est plus particulièrement relative à des sondes capables de s'hybrider à au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider au virus HPIV2 de souche Gréer, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'un sous-fragment (de 14 à 30, de préférence de 18 à 23 nucléotides) des fragments suivants : - les fragments 241-420 de séquences codant F,
- les fragments 259-395 de séquences codant F,
- les fragments 181 -480 de séquences codant HN,
- les fragments 234-443 de séquences codant HN,
- les fragments 1381-1716 de séquences codant HN, - les fragments 1466-1673 de séquences codant HN,
- les séquences qui sont complémentaires de ces séquences sur toute la longueur de ces séquences.
Avantageusement, une telle sonde est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 99 à 117 (cf. tableau 11 ci-dessous).
La présente demande est également relative à tout support solide adapté à la circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, qui comprend au moins une telle sonde. De préférence, cette sonde est fixée sur le supportd e cette puce. Cette puce peut être sous forme congelée, voire lyophilisée.
Des exemples de puces sont connus de la personne du métier. Des puces sont par exemple décrites dans Korimbocus et al. 2005, Journal of Clinical Microbiology 43(8) : 3779-3787, ou commercialisées par la société Affymetrix (Califormie, USA). Tableau 5 : SEQ ID NO : de séquences de protéines codées par des virus de l'invention, et de séquences codant de telles protéines
Tableau 6 : séquences de régions de virus de l'invention, spécialement adaptées à la construction et à la production de sondes et/ou d'amorces spécifiques d'au moins l'un des cinq isolats de l'invention
(détection spécifique par rapport aux isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe phylogénique variant de l'invention, tels que les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98)
Les séquences codant F et celles codant HN sont présentées en partie « description de séquences » ci-dessous, et en Figures 5 et 6.
Tableau 7 : séquences de régions de virus de l'invention, spécialement adaptées à la construction et à la production d'amorces et de sondes spécifiques, lesdites amorces et sondes étant spécialement adapatées à une mise en œuvre dans le cadre d'une amplification en temps réel pour la détection d'au moins l'un des isolats de l'invention
(détection spécifique par rapport aux isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe phylogénique variant de l'invention, tels que les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98)
Tableau 8 : exemples de séquences d'amorces et de sondes spécifiques, qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre en temps réel pour la détection de l'ensemble des cinq isolats de l'invention (détection spécifique par rapport aux isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe phylogénique variant de l'invention, tels que les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98)
Tableau 9 : information relative aux SEQ ID NO : du tableau 8
Tableau 10 : séquences de régions de virus de l'invention, spécialement adaptées à la construction et à la production de sondes qui sont spécifiques d'au moins un isolât de l'invention, et qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce (détection spécifique par rapport aux isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe phylogénique variant de l'invention, tels que les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98)
Tableau 11 : exemples de sondes spécifiques, spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce pour la détection spécifique l'ensemble des cinq isolats de l'invention (détection spécifique par rapport aux isolats qui ne font pas partie du groupe
Dans la présente demande, le terme "comprenant", avec lequel "incluant" ou "contenant" est synonyme, est un terme ouvert, et n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) de méthode additionnel(s) qui ne serait(seraient) pas explicitement indiqué(s), tandis que le terme "consistant" ou "constitué" est un terme fermé, qui exclut la présence de tout autre élément additionnel, étape, ou ingrédient qui ne serait pas explicitement exposé. Le terme "consistant essentiellement" ou " essentiellement constitué" est un terme partiellement ouvert, qui n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s), dans la mesure où ce(s) élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s) n'affecte(nt) pas matériellement les propriétés de base de l'invention.
Par conséquent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") inclut les termes "consistant", "constitué", aussi bien que les termes "consistant essentiellement" et " essentiellement constitué".
Le contenu des documents et références bibliographiques qui sont cités dans la présente demande est incorporé par référence.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratif, ils ne limitent l'invention en aucune façon.
EXEMPLES
Matériels et Méthodes Isolats variants de HPIV-2
Cinq isolats "atypiques" de HPIV-2 ont été isolés sur des cellules LLC-MK2 à partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés (cf. tableau 1 ci-dessous). Ces patients (un enfant et trois adultes) ont été admis pour hospitalisation du fait d'infections respiratoires.
Cinq isolats ont été référencés sous la désignation isolats Lyon/18620/2001 , Lyon/20283/2001 , Lyon/20435/2001 , Lyon/26056/1997 et Lyon/26632/1997. Dans la présente demande, ces isolats peuvent, par simplification, être également appelés 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement. Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; C.N.C.M. ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ; France).
Tableau 1 :
Souches prototypes
La souche HPI V-2 Gréer (Numéro ATCC VR-1381) a été isolée en 1955 (USA) sur un enfant de 11 mois. Tous les essais ont été réalisés à partir d'un stock congelé à -800C (1O7'5 TICD 50/50 μL). Culture virale
Pour l'isolement de virus, des cellules LLC-MK2 (cellules de rein de singe, ATCC CCL-7) ont été placées en culture dans des flacons à échantillons cylindriques (« shell-vials », plaques à 24 puits). Les cellules ont été maintenues sur du Milieu Essentiel Minimum d'Eagle complémenté avec de la strypsine (2 (g/mL). Après inoculation, les plaques ont été centrifugées (400 g pendant 30 min à 340C), les milieux de cultures ont été renouvelles, et les plaques ont alors été placées en incubation à 34°C sous CO2 à 5%. L'effet cytopathique du virus a été contrôlé régulièrement pendant 10 jours.
Test d'immunofluorescence (test d'IF)
Les tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des quatre types d'HPIV (anticorps monoclonal anti-HIPV1 , anticorps monoclonal anti-HPIV2, anticorps monoclonal anti-HPIV3 et anticorps monoclonal anti-HPIV4). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal spécifique du type HPIV4 est disponible auprès de Chemicon (Temecula, California, USA) sous la référence « mAb 8780 ».
D'autres tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécificiques de HPIV-2. Les anticorps monoclonaux anti-HPIV2 utilisés reconnaissent HN ou une protéine de structure (protéines internes). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal anti-HPIV2, qui cible la protéine HN de HPIV2, est disponible auprès de ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Extraction et RT-PCR
L'ARN viral a été extrait à partir de 100 μL de surnageant de culture de cellules LLC-MK-2 avec le kit "Absolutely RNA Micropep" (Stratagene, USA) en suivant les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en utilisant rhexamère pd(N)6 aléatoire (Amersham Biosciences, Grande-Bretagne). Brièvement, 5 μL de suspensions d'ARN précédemment extraits ont été placés en incubation avec 1 μL de pd(N)6 (1 (g/μL). Un mélange de 4 μL de tampon AMV-RT (Promega Corporation, USA), 7,5 μL d'eau stérile, 1 μL de dNTP (20 mM) (Eurogentec, Belgique), 0,5 μL d'inhibiteur de Rnase (40 U/μL) (Promega Corporation, USA), et 1 μL de transcriptase inverse AMV (10 U/μL) (Promega Corporation, USA) ont été ensuite ajoutés. La transcription inverse a été réalisée par incubation à 37°C pendant 1 heure et stoppée par chauffage à 95°C pendant 5 minutes. De sorte à obtenir les séquences complètes des gènes F et HN, les amplifications PCR ont été réalisées avec 6 paires d'amorces (présentées en Tableau 2 ci- dessous) construites suivant la séquence nucléotidique de l'isolât HPIV-2 disponible, à savoir l'isolât HPIV-2 Gréer (numéro d'accession GenBank NC_003443). Tableau 2
* Echevarria et al. 1998, J. Clin. Microbiol. 36 :1388-1391
Après optimisation des conditions PCR, l'amplification a été réalisée en ajoutant 5 μl_ d'ADNc précédemment synthétisé dans un tube contenant 45 μl_ du mélange PCR suivant : 24,5 μl_ d'eau stérile, 5 μl_ de tampon PCR (15 mM MgCI2) (Applied Biosystems, Roche, USA), 5 μl_ de dNTP (20 mM), 5 μl_ de chaque amorce (sens et antisens) (20 μM) (Eurogentec, Belgique) et 0,5 μl_ d'ADN polymérase Taq (5 U/μL) (Applied Biosystems, Roche, USA). La souche prototype HPIV-2 et l'eau stérile ont été utilisées comme témoins positif et négatif, respectivement. L'amplification a été réalisée en suivant le protocole suivant : 95°C pendant 5 minutes, suivi de 40 cycles (95°C pendant 30 secondes, 58°C pendant 30 secondes, 720C pendant 1 minute et 30 secondes) et une étape d'élongation finale de 10 minutes à 72°C. Séquencaqe Les produits PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification GFX (Amersham Biosciences, Grande-Bretagne) en suivant les instructions du fabricant. Une quantité de 20 ng/100 bp de chaque produit a été envoyée pour séquençage à la Compagnie MWG Biotech (Ebersberg, Allemagne). Analyse phyloqénétiαue Les alignements ont été obtenus avec le programme ClustaIX (http://www-igbmc.u- strasbg.fr/Bioinfo/clustalX/Top.html). La matrice de distance a été calculée sur DNADIST du lot de programmes Phylip (version 3.64) (Felsenstein J., 1993, PHYLIP Phylogeny Interférence Package version 3.64, Département de Génétique, Université de Washington, Seattle, USA). Les arbres phylogénétiques ont été construits en utilisant l'algorithme du voisin le plus proche (algorithme " Neighbour-Joiningi' ou NJ, ou de Saitou et Nei) du programme NEIGHBOR du lot de programmes Phylip. L'analyse "bootstrap" sur 1000 réplications a été réalisée en utilisant SEQBOOT et CONSENSE du lot de programmes Phylip. Les arbres enracinés ont été édités avec le logiciel Njplot (IBCP, Lyon). Prédiction de structure secondaire et analyse de modélisation moléculaire Les structures secondaires ont été prédites avec le logiciel en ligne SECCONS. (http://Seccons.pbil.ibcp.fr) (IBCP, Lyon, France) (Combet et al. 2000, Trends Biochem Sci, 25:147-150). Ce logiciel donne la structure secondaire consensus telle que déterminée par une unité de 8 logiciels différents de prédiction de structure secondaire. La modélisation moléculaire automatique a été réalisée avec le logiciel GENO3D (http://geno3D-pbil.ibcp.fr) (Combet et al. 2002, Bioinformatics, 18:213-214) et l'interface graphique Rasmol (Rasmol molecular graphies, version 2.7.1). Les domaines susceptibles de participer à des torsades d'hélice (" coiled-coil domains") (HR1 et 2) ont été prédits à l'aide du logiciel Learncoil-VMF (http://web.wi.mit.edu/kim) (Singh M ét al. 1999, J. Mol. Biol., 290:1031 -1041 ).
Résultats
Isolement et identification des virus Cinq souches ont été isolées à partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés. Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (cf. tableau 1 ci-dessus). Les 5 isolats ont une bonne croissance sur les lignées cellulaires LLC-MK2 et ont présenté un effet cytopathogène syncytial important apparaissant 3 à 7 jours après l'infection. Les tests d'immunofluorescence en routine ont été aussi réalisés sur les 5 échantillons en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques des 4 types de HPIV et d'autres pathogènes respiratoires. Tous ces tests ont donné des résultats négatifs. Les isolats de l'invention ne sont pas détectés par ces anticorps anti- HPIV de l'art antérieur.
Par contre, les isolats ont tous donnés un résultat HPIV-2 positif, lorsqu'ils ont été testés par RT-PCR spécifique d'HPIV. Les cinq isolats apparaissent donc comme des isolats HPIV-2 "atypiques", par rapport à la souche de référence HPIV-2 Gréer.
Réactivité avec les anticorps monoclonaux
Des tests d'immunofluorescence ont été réalisés sur les 5 isolats en utilisant 8 anticorps monoclonaux spécifiques de HPIV-2. Seuls les tests réalisés avec les anticorps monoclonaux contre les protéines internes ont donné des résultats positifs. Les tests d'immunofluorescence réalisés avec des anticorps monoclonaux dirigés contre l'hémagglutinine-neuraminidase de l'art antérieur ont donné des résultats négatifs (les résultats de ces tests d'immunofluorescence sont présentés en Tableau 3 ci-dessous). En tant que témoin positif, tous les anticorps monoclonaux ont réagi avec la souche HPIV-2 prototype Gréer. Tableau 3 :
réaction négative + réaction positive ++ importante réaction positive
Caractérisation moléculaire
Après assemblage des différents fragments, les séquences nucléotidiques consensus complètes des gènes F et HN ont été établies pour les isolats HPI V-2 Gréer, 18620, 20283, 20435, 26056 et SV5, et la séquence nucléotidique consensus complète du gène F a été établie pour l'isolât HPIV-2 26632. En tant que témoin, la séquence nucléotidique consensus complète obtenue pour la souche prototype (séquence nucléotidique SEQ ID NO : 45 ; séquence aminoacide SEQ ID NO : 46) a été comparée à la séquence équivalente disponible sur la base de données GenBank/EMBL Les deux séquences présentent un pourcentage d'homologie de 99,9%. L'homologie est complète pour les protéines F et HN.
Tableau 4 :
Le contenu correspondant aux numéros d'accesion Genbank DQ072586, DQ072587, DQ072588, DQ072589, DQ072590 est reproduit ci-après en partie « description de séquences ».
Les séquences nucléotidiques du gène F des isolats HPIV-2 "atypiques" ont été comparées à leur contrepartie dans la souche prototype. L'alignement obtenu met en évidence 57 changements communs à l'ensemble des isolats HPIV-2 "atypiques" sur un total de 1656 nucléotides (3,4%). Ces différences communes représentent la grande majorité (85%) des différences observées. Ces changements conduisent à 11 substitutions d'aminoacides (cf. description de figures 4 et 7), c'est-à-dire 2% de substitutions.
Les séquences nucléotidiques du gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ont aussi été comparées avec la souche de référence. Ainsi, 79 changements communs à l'ensemble des virus "atypiques" ont été mis en évidence sur un total de 1716 nucléotides (4,6%). Ces différences communes représentent aussi la majorité des différences observées (80%). Ces changements conduisent à 20 changements communs (cf. description de figure 8), c'est-à-dire 3,8% de substitutions. Protéine d'attachement HN L'analyse des sites de glycosylation potentiel (N-X-S/T) dans le gène HN montre que l'ensemble des 5 variants HPI V-2 ont en commun une substitution S316N responsable de l'apparition d'un nouveau site de glycosylation qui est absent dans la souche prototype. Les principales différences entre les variants et la souche prototype ont été observées dans la partie carboxy-terminale de la protéine. Les modèles tridimensionnels des protéines HN de la souche HPIV-2 Gréer et des isolats "atypiques", construits sur des homologies structurelles, présentent' une similarité très forte. L'organisation en 6 couches caractéristiques de la neuraminidase a été observée (cf. figure 1). Par analogie avec les structures connues des protéines HN de NDV, SV5 et HPIV-3, la position et la conformation du site catalytique semblent être identiques entre les différents isolats HPIV-2. Les modèles obtenus permettent de constater que le site de glycosylation, qui est seulement présent chez les isolats variants "atypiques" de HPIV-2, est localisé dans une boucle dirigée vers l'extérieur de la protéine. La substitution S316N ne semble pas changer la structure de cette boucle. Les acides aminés qui constituent le pic hydrophobe précédemment décrit sur la souche de référence HPIV-2 Gréer (positions 512-515) forment une boucle qui est dirigée vers l'intérieur de la protéine (cf. boucle signalée par A dans le modèle de gauche de la figure 1), ce qui n'est pas le cas pour les isolats variants "atypiques" de HPIV-2 (cf. boucle signalée par A' dans le modèle de droite de la figure 1 ). Protéine de fusion F L'alignement des 20 acides aminés qui constituent le peptide de fusion de Paramyxovirυs présente une différence d'un acide aminé entre les isolats variants HPI V-2 et la souche prototype (figure 2). Le peptide de fusion des souches V94 et V98 est similaire au peptide de fusion des virus HPIV-2 "atypiques" et au peptide de fusion de la souche HPIV-2 prototype, respectivement (figures 2 et 4). Les alignements d'autres domaines structurellement significatifs (HR1 et 2, TM et CS, figure 4) des isolats HPIV-2 ne présentent aucune différence importante, exception faite des domaines CS et HR1. Dans les isolats Gréer et V98, le site de clivage est KTRQER (SEQ ID NO : 13) ou KTRQKR (SEQ ID NO : 118), au lieu de KPRRER (SEQ ID NO : 14) pour les autres isolats. Analyse phylogénétique Les séquences nucléotidiques des gènes F et HN des isolats HPIV-2 atypiques de la souche prototype HPIV-2 Gréer et de SV5, ont été alignées avec leurs contreparties disponibles dans la base de données GenBank. Cette analyse montre un diagramme d'évolution similaire pour les protéines F et HN montrant que l'évolution des protéines F et HN des virus atypiques divergent de celles de la souche prototype, formant ainsi deux groupes (ou groupements) distincts. Selon la topologie des branches internes, les deux arbres présentent le même profil d'évolution (figure 3). Les protéines d'enveloppe de deux souches HPIV-2 provenant des Etats-Unis correspondent bien également à cette évolution divergente, chaque souche étant présente dans un des deux groupements (figure 3).
Discussion L'objectif de cette étude est de caractériser des isolats HPIV-2 cliniques qui présentent une réactivité antigène atypique vis-à-vis des anticorps monoclonaux utilisés pour le diagnostic. Pour ce qui concerne les virus HPIV-2, quelques rares études, déjà anciennes, ont mis en évidence une variation antigénique entre les isolats (Numazaki Y et al. 1968, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 127 :992-996 ; Ray et al. 1992, Virus Res. 24 :107-113). Mais le lien entre la variation antigénique et la variation génétique n'avait pas jusqu'alors été analysé.
Les protéines F et HN des virus HPIV-2 "atypiques" présentent un pourcentage marqué de substitutions par rapport à la souche prototype : 2% pour le gène F et 3,8% pour le gène HN. Par comparaison, un variant HPIV-3, décrit en 1995, présentait au niveau de la protéine HN seulement 4 substitutions d'acides aminés dont 2 au niveau de sites antigéniques connus (0,7% de substitution). La position des sites antigéniques n'a pas encore été déterminée pour HPIV-2, mais il serait surprenant qu'aucune des 22 substitution d'acides aminés observées sur le gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ne soient localisée dans des sites antigéniques. Hémaqqlutinine-neuramidase
Parmi les substitutions observées, la substitution S316N est à l'origine d'un nouveau site potentiel de glycosylation qui est absent dans la protéine HN de la souche prototype HPIV-2. Les modèles tridimensionnels de la protéine HN montrent que ce site est localisé dans une boucle qui est dirigée vers l'extérieur de la protéine, c'est-à-dire une zone exposée qui pourrait correspondre à un site antigénique. Une glycosylation est susceptible de masquer un épitope et pourrait expliquer l'absence de réaction avec certains anticorps. Les autres sites potentiels de glycosylation restent inchangés. Les différences observées dans la structure primaire de la protéine HN des isolats atypiques ont potentiellement des conséquences sur la structure secondaire dans ta partie carboxy-terminale de la protéine. Les résultats présentés, qui ne sont pour l'instant que des prédictions, ne mettent en évidence aucun changement structurel significatif, en particulier à la surface de la protéine ou au niveau du site catalytique. Toutefois, ces changements mineurs de structure sans perturbation de la fonction pourraient être responsables de la disparition d'épitopes conformationnels. Protéine de fusion
L'analyse des peptides de fusion des isolats HPIV-2 "atypiques" montre l'existence d'une différence d'un acide aminé par rapport à la protéine F de la souche prototype. Le domaine hydrophobe constitué par le peptide de fusion est présenté comme étant la zone la plus préservée de la protéine F au sein de la famille des Paramyxoviridae. Ceci suggère que sa structure et sa fonction sont soumises à une pression de sélection plus intense que les autres domaines de la protéine. L'analyse des changements spécifiques conservatifs et non conservatifs qui a été réalisée pour SV5 et NDV a montré que la séquence peptidique est importante pour l'activité de fusion (Horvath CM 1992, Sergel TA et al., 2001 ). La différence d'un acide aminé que nous observons entre les virus "atypiques" et la souche prototype du même type ne semble donc pas être négligeable. Il a été montré que des changements qui augmentent l'hydrophobicité du peptide de fusion, favorisant ainsi les interactions avec les lipides de la membrane cellulaire avait pour conséquence une augmentation de la formation des structures syncytiales. Dans le cas présent, la substitution d'une valine par une isoleucine ne modifie pratiquement pas l'hydrophobicité. Cette substitution rapproche les peptides des virus "atypiques" et du SV5, un virus dont l'effet cytopathogène sous la forme de structure syncytiale sont similaires. Cependant, la corrélation entre la substitution observée et une fusion plus significative n'est pas encore établie. Les isolats variants HPIV-2 possèdent un site de clivage plus basique que la souche prototype. Ceci pourrait aussi expliquer la différence en terme d'activité de fusion. Dans le cas de NDV (gène F) et d'Influenza (gène HA), l'importance du site de clivage pour la virulence virale et la pathogénicité a été étudiée. Des souches qui présentent des résidus multibasiques au niveau du site de clivage sont virulentes et se disséminent facilement au sein de l'hôte. Chez certaines souches d'Influenza non-pathogènes, il a été montré que des substitutions Arginine ou Lysine au niveau du site de clivage du gène HA, aux positions 5 ou 6, conduisent à l'acquisition d'une pathogénicité. De plus amples analyses seront réalisées pour déterminer la relation entre la basicité du site de clivage, l'activité de fusion et la virulence des isolats variants "atypiques" de HPIV-2. Analyse phylogénétique Les analyses phylogénétiques suggèrent deux groupes distincts ("clusters") au sein de HPIV-2, chaque groupe ayant des propriétés antigéniques différentes. A la connaissance des inventeurs, c'est la première fois que des analyses phylogénétiques basées' sur les gènes F et HN des séquences HPIV-2 sont réalisées en parallèle. Les deux arbres phylogénétiques (figure 3) présentent une très forte similarité en terme de topologie, même si la protéine HN semble évoluer sensiblement plus rapidement que la protéine F. La co-évolution des deux glycoprotéines de HPIV-2 pourrait être expliquée par une exposition équivalente à la pression de sélection, une pression qui est plus marquée que pour les autres protéines de structure.
Le diagnostic en laboratoire de HPIV est communément réalisé par isolement conventionnel en culture cellulaire, centrifugation de la culture dans des flacons cylindriques et marquage par immunofluorescence (coloration directe des échantillons rhino-pharyngiens). Les données de séquençage démontrent clairement la présence de souches HPIV-2 nouvelles non encore décrites. On ne sait pas encore si ces variants que nous venons d'isoler sont prédominants au sein de la population des patients. Des études de séquençage sont en cours pour analyser les variations des gènes F et HN dans d'autres isolats clinique de HPIV-2 disponibles au sein de notre laboratoire, notamment pour déterminer si des variants de HPIV-2 viennent d'émerger,
Une surveillance virale continue est importante pour surveiller les changements antigéniques qui peuvent se produire dans la nature, plus particulièrement par rapport à la sélection de souches pour un développement vaccinal ainsi que pour la réalisation d'essais diagnostics mis à jour.

Claims

145REVENDICATIONS
1. Virus HPIV2 faisant partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98 et V94, caractérisé en ce que :
- la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou
- la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41.
2. Virus HPIV2 faisant partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98 et V94, caractérisé en ce que : - la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de
99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou par le fait que
- la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins
98,8% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et/ou par le fait que
- la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160, et/ou par le fait que
- la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolât Gréer et de celle de l'isolât V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ; ledit virus étant en outre caractérisé par le fait que 146 o en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, o en position 186 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine).
3. Virus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que :
- en position 316 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé qui est autre que S et qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N (asparagine), et/ou
- en position 513 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou
- en position 514 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
4. Virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les virus HPIV2 disponibles auprès de la C. N. C. M. sous les numéros de dépôt 1-3761 , I-3762, I-3763, I-3764, I-3765.
5. Acide nucléique, caractérisé en que sa séquence comprend, ou est constituée de : a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou b) la séquence d'un ADNc susceptible d'être obtenu par transcription inverse d'un tel ARN génomique, ou c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
6. Protéine, caractérisée en ce que sa séquence aminoacide comprend celle d'au moins une protéine d'enveloppe de l'un des virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite au moins une protéine d'enveloppe est une protéine F. 147
8. Protéine selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine F présente :
- en position 102, l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, l'acide aminé R (arginine).
9. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisée en ce que la séquence du site de clivage de ladite protéine F est KPRRER (SEQ ID NO : 14).
10. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine F présente :
- en position 112, l'acide aminé I (isoleucine), et/ou
- en position 160, l'acide aminé T (thréonine).
11. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que ladite protéine F présente en position 175 de sa séquence un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
12. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 , caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine F est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44.
13. Protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que ladite au moins une protéine d'enveloppe est une protéine HN.
14. Protéine selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite protéine HN présente au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants : - en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A,
- en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A,
- en position 201 , un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S, 148
- en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T1
- en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K,
- en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E,
- en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M1
- en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
15. Protéine selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que :
- en position 316, ladite protéine HN présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N1 et/ou
- en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
16. Protéine selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que ladite protéine HN présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine) en position 186.
17. Protéine selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 26, 31 , 36, 41.
18. Acide nucléique, dont la séquence code une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 17, en tenant compte de la dégénérescence du code génétique universel.
19. Acide nucléique selon la revendication 18, caractérisé en que sa séquence comprend, ou est constituée d'une séquence choisie parmi les séquences de SEQ
ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40.
20. Acide nucléique, qui est spécifique d'un ou plusieurs virus du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 dont font partie les virus selon l'une quelconque 149 des revendications 1 à 4, mais dont ne font pas partie les isolats HPIV2 Gréer, Toshiba et V98, et qui est spécialement adapté à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production de sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique, caractérisé en que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment.
21 . Acide nucléique selon la revendication 20, qui est spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de : - un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend : - des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
22. Acide nucléique selon la revendication 21 , caractérisé en ce que : ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 62 à 66, ou ledit fragment s'étendant des positions 214 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 67 à 70, ou 150 ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 83 à 86.
23. Acide nucléique selon la revendication 21 ou 22, qui est spécialement adapté à la construction et à la production d'une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Gréer, Toshiba, et V98, et qui est en outre spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une sonde pouvant être mise en œuvre en amplification temps réel avec ladite paire d'amorces, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous- groupe phylogénique variant, caractérisé en ce que sa séquence est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86.
24. Acide nucléique selon la revendication 20, qui est spécialement adapté à la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en œuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de : - un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou
- la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend : - des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou
- des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou
- des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
25. Acide nucléique selon la revendication 24, caractérisé en ce que sa séquence comprend, ou est constituée d'une des séquences suivantes : les séquences de SEQ ID NO : 57 à 61 , 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé. 151
26. Paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Gréer, Toshiba, et V98, caractérisée en ce que : - la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, et en ce que
- la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique selon la revendication 23 sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
27. Paire d'amorces selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle est capable d'amplifier un acide nucléique de chacun des cinq virus objets de la revendication 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Gréer, Toshiba, et V98.
28. Paire d'amorces selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en ce que chacun desdits fragments 5' est, indépendamment l'un de l'autre, constitué de 18 à 23 nucléotides.
29. Paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisée en ce qu'elle est constituée :
- d'une amorce de SEQ ID NO : 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 91 , et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou
- d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
30. Ensemble d'amorces qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29.
31. Amorce, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'une amorce choisie au sein d'une paire selon l'une quelconque des revendications 26 à 29., 152
32. Sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29, pour la détection spécifique d'au moins un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que sa séquence est : - celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
33. Sonde selon la revendication 32, caractérisée en ce que ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 23 à 28 nucléotides.
34. Kit pour le diagnostic d'une affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29 et/ou au moins une sonde selon la revendication 32 ou 33.
35. Sonde qui est spécialement adaptée à une mise en œuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Gréer, Toshiba, V98, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'un fragment d'un acide nucléique selon la revendication 25, ou celle de la séquence qui est la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
36. Support solide adapté à la circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon la revendication 35.
37. Anticorps qui se lie à une protéine d'enveloppe de HPIV2, ou fragment conservateur d'un tel anticorps, ledit fragment conservateur ayant conservé la capacité à se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2, caractérisé en ce que cet anticorps ou fragment conservateur d'anticorps sejie à une protéine d'enveloppe 153 d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans se lier à une protéine d'enveloppe de l'isolât HPIV2 Gréer NC_003443.
38. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il se lie à une protéine d'enveloppe des cinq isolats de la revendication 4.
39. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 37 ou 38, caractérisé en ce que ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprend, ou est constituée d'une protéine F.
40. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il se lie à ladite protéine F en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
41. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 40, caractérisé en ce que ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprend, ou est constituée, d'une protéine HN.
42. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 41 , caractérisé en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 114, 139, 195, 201 , 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
43. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 42, caractérisé en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 316, 513, 514. 154
44. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 43, caractérisé en qu'il ne se lie pas à protéine d'enveloppe de l'isolât HPIV2 V94 (AF533010).
45. Kit pour le diagnostic d'une affection ou infection respiratoire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 44.
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