CA2694494A1 - Variants de hpiv-2, et leurs applications medicales - Google Patents
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Abstract
La présente demande est relative à un groupe phylogénique variant de HPIV2, plus particulièrement à un sous-groupe phylogénique variant de HPIV2. La demande propose des moyens pour le diagnostic de HPIV2, qui tiennent compte de ce groupe et de ce sous-groupe.
Description
2 PCT/FR2008/001067 TITRE
Variants de HPIV-2, et leurs applications médicales DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente demande est relative à des virus parainfluenza humains de type 2 (HPIV-2) variants, et à leurs applications médicales, plus particulièrement à
leurs applications diagnostiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Au sein de la famille des Paramyxoviridae, les virus parainfluenza humains (HPIV) sont des virus à ARN compris dans deux genres de la sous-famille des Paramyxovirinae :
- les Respirovirus pour les virus parainfluenza de type 1 et 3 (HPIV-1, -3) - les Rubulavirus pour les virus parainfluenza de type 2 et 4 (HPIV-2, -4).
Les HPIV sont des virus enveloppés. Leur génome est d'une taille d'environ 15 kilobases, constitué d'ARN simple brin de polarité négative. Le génome code six protéines principales.
Les gènes NP, P et L codent respectivement la nucléoprotéine, la phosphoprotéine et la polymérase (L pour large polymerase complex). Ces trois protéines forment avec l'ARN viral la nucléocapside (ou holonucléocapside). La nucléoprotéine forme avec l'ARN un support pour la phosphoprotéine et la polymérase, permettant la transcrition et éventuellement la réplication du génome.
Les gènes F et HN codent respectivement la protéine de fusion F et l'hémagglutinine-neuraminidase HN, qui sont les deux protéines d'enveloppe du virus et qui participent au mécanisme d'entrée du virus dans la cellule hôte.
La protéine HN est responsable de l'attachement du virus à la cellule, en se liant aux acides sialiques cellulaires. Une fois le virus attaché, la protéine de fusion F
est activée, insère un de ces domaines dans la membrane cellulaire et s'ensuivent des mécanismes rapprochant les deux membranes et les fusionnant.
Parmi les HPIV, différents virus HPIV2 ont été décrits dans l'art antérieur.
L'isolat HPIV2 de référence est l'isolat Greer, qui a été isolé en 1955 à
partir d'un patient.
Les moyens de diagnostic qui comprennent la détection de HPIV-2 sont tous actuellement construits à partir de la structure de cet isolat de référence.
Par exemple, la détection de HPIV-2 dans le cadre hospitalier se fait actuellement par isolement en culture cellulaire (sur système sensible LLCMK2), ou par immunofluorescence et immuno-capture ELISA. Les anticorps mis en oeuvre dans ces techniques ont été obtenus à partir de la souche HPIV-2 Greer.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe en fait toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de I'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
De même, l'art antérieur propose quelques techniques de détection de HPIV-2 par PCR, mais les amorces sont conçues par référence à la séquence de l'isolat Greer, sans tenir compte du fait que, comme le démontrent les présents inventeurs, il existe en fait toute une famille de virus HPIV-2 qui sont différents de l'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont identifié un nouveau groupe phylogénique variant de HPIV2, et un nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
La demande est relative à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau groupe phylogénique variant, et à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
Le groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus HPIV2 qui ne comprend notamment pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
Le sous-groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus qui ne comprend notamment pas le's isolats Greer, Toshiba et V98, et qui ne comprend en outre pas l'isolat V94.
~
Cinq isolats faisant partie de ce groupe et également de ce sous-groupe ont été
déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest.
La demande est relative aux protéines, plus particulièrement aux protéines d'enveloppe des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, notamment aux protéines F et HN de ces virus, ainsi qu'aux fragments de ces protéines.
La demande est également relative aux acides nucléiques codant ces protéines ou fragments de protéine.
La demande est également relative à des moyens pour la détection, plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
La demande est relative à des régions nucléotidiques particulières des virus du groupe ou sous-groupe HPIV2 de l'invention, qui leur sont suffisamment spécifiques pour permettre leur détection, de préférence leur détection spécifique, par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer et V98.
La demande est ainsi relative à des régions nucléotidiques qui ont été
spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de systèmes de type PCR temps réel, comprenant au moins une paire d'amorces et une sonde, ainsi qu'à des régions nucléotidiques qui ont été spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de sondes spécialement adaptées à une mise en ceuvre sur puce.
La demande est également relative à ces amorces, ces sondes et à des puces comprenant au moins une sonde de l'invention.
La demande est en outre relative à des kits et compositions comprenant au moins une région spécifique et/ou au moins une amorce et/ou au moins une sonde de l'invention.
La demande est également relative à des anticorps dirigés contre une protéine d'enveloppe d'au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et à des hybridomes produisant de tels anticorps.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La demande fait référence aux figures suivantes : -Figure 1: modèle tridimensionnel des ectodomaines de la protéine HN de l'isolat prototype HPIV-2 Greer de l'art antérieur (modèle de gauche), et d'un isolat de l'invention -par exemple, isolat HPIV-2 18620 (modèle de droite).
Cette figure illustre le fait que des isolats de l'invention présentent une protéine HN
différente de celle de l'isolat HPIV-2 Greer, notamment en ce qui concerne les sites de glycosylation. Comme illustré sur la figure, des isolats de l'invention comprennent notamment une mutation S316N, qui crée un site de glycosylation que ne présente pas la protéine HN de l'isolat HPIV-2 Greer.
Figure 2: alignement des séquences aminoacides du peptide de fusion (FP;
fragment 107-126 de la protéine de fusion F) de :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (virus parainfluenza humains de type 2;
isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), sur celles de - l'isolat HPIV-2 Greer de l'art antérieur (virus parainfluenza humain de type 2) et du virus SV5 (virus simien parainfluenza simien de type 5).
Figure 3: Analyse phylogénétique des protéines F (arbre du haut) et HN (arbre du bas) des isolats suivants :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolat HPIV-2 Lyon/20283/2001 = isolat 20283 ; isolat HPIV-2 Lyon/20435/2001 = isolat 20435 ; isolat HPIV-2 Lyon/18620/2001 = isolat 18620 ; isolat HPIV-2 Lyon/26632/1997 = isolat 26632 ; isolat HPIV-2 Lyon/26056/1997 = isolat 26056), - isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (= isolat HPIV-2 V94), - isolat HPIV-2 Vanderbilt/1 998 (= isolat HPIV-2 V98), - isolat HPIV-2 Greer/1955 (= isolat HIPV-2 Greer), - virus SV5 (virus parainfluenza simien de type 5), - HPIV-4A, - HPIV-4B, - HPIV-3, et - HPIV-1.
Les séquences déterminées par les inventeurs sont signalées par une flèche (isolats 20283, 20435, 18620, 26632, 26056).
Les autres séquences ont été obtenues à partir de la base de données Genbank (http///www.ncbi.nim.nih.gov).
5 Les arbres phylogénétiques ont été construits par la méthode du voisin le plus proche ( neighbour-joining ). L'échelle indique le nombre de substitutions d'acides aminés par site, et la longueur des branches horizontales est proportionnelle à l'échelle indiquée. La fiabilité des embranchements a été
évaluée par la méthode des "bootstraps" (1000 réplications) et les pourcentages résultant de cette procédure sont indiqués.
Figure 4: présentation schématique des domaines structurels de la protéine F
de HPIV-2, et présentation de l'alignement des séquences aminoacides de la protéine F pour cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), pour l'isolat HPIV-2 Greer, et pour les isolats HPIV-2 V94 et V98 (Vanderbilt/1 994 et Vanderbilt/1998, respectivement).
Cette figure illustre le fait que certains acides aminés de la protéine F des isolats de l'invention sont différents de ceux observés dans les autres isolats HPIV-2 (isolats Greer, V94 et V98). Par exemple, on voit que :
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat Greer notamment du fait des éléments de séquence suivants :
o la séquence du site de clivage (CS), qui est KPRRER (SEQ ID NO:
14), au lieu de la séquence KTRQER (SEQ ID NO : 13) observée chez l'isolat Greer tel que séquencé par les inventeurs (mutations T102P et Q104R), et au lieu de la séquence KTRQRK (SEQ ID NO :
118) telle que cela apparaît dans la séquence Greer disponible sur la base de données NCBI (NLM, National Library of Medicine) sous le numéro d'accession NC_003443 (mêmes mutations T102P et Q104R), o la séquence du peptide de fusion (FP) qui présente l'acide aminé I en position 112, au lieu de l'acide aminé V (mutation V1121), o la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui présente l'acide aminé T en position 160, au lieu de l'acide aminé D (mutation D160T);
- la protéine F des isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V98 notamment du fait des mêmes éléments de séquence que ceux observés par rapport à l'isolat Greer (mutations T102P, Q104R au niveau du CS ;
mutation V1121 au niveau de FP ; mutation D160T au niveau de HR1), ainsi que par le fait qu'au niveau de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, les isolats de l'invention présentent :
o l'acide aminé R en position 163, au lieu de l'acide aminé K (mutation K163R), et o l'acide aminé R en position 175, au lieu de l'acide aminé H (mutation H175R) ;
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V94 notamment du fait de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui, dans des isolats de l'invention, présente l'acide aminé R en position 175 au lieu de l'acide aminé H (mutation H175R).
On voit également que certains isolats de l'invention présentent d'autres mutations, notamment dans le domaine transmembranaire (TM) de la protéine F. Par exemple, les isolats 20283 et 20435 de l'invention diffèrent des isolats 18620, 26056 et 26632 de l'invention, mais aussi des isolats Greer, V94 et V98, par le fait que leur domaine transmembranaire présente l'acide aminé I en position 516 au lieu de l'acide aminé V (mutation V5161).
Les positions des acides aminés sont ici calculées par rapport à la séquence de la protéine F.
La figure 4 décrit plus particulièrement les séquences des sites de clivage (CS), des peptides de fusion (FP) des domaines HR1, HR2 et TM de chacun des cinq isolats HPIV2 de l'invention (séquences 101-106, 107-126, 133-177, 451-484 et 487-518, respectivement), alignées sur les séquences respectives des isolats Greer, V94 et V98.
Les séquences codantes correspondantes peuvent être déduites par la personne du métier, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
TM = partie transmembranaire On peut observer que, par rapport aux isolats Greer, V98 et V94, les cinq isolats particuliers de l'invention se distinguent par le fait qu'ils présentent à la fois :
- un acide aminé autre que D en position 160 (région HR1), préférablement l'acide aminé T en position 160 (mutation D160T par rapport aux isolats Greer et V98), et - un acide aminé autre que H en position 175 (région HR1), préférablement l'acide aminé R en position 175 (mutation H175R par rapport aux isolats V98 et V94).
Figure 5: alignement des séquences nucléotidiques codant F (1656 nucléotides) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence codant F de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 48), - séquence codant F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 23), - séquence codant F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 28), - séquence codant F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO: 33), - séquence codant F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 38), - séquence codant F de l'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 43).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats particuliers de l'invention, par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
Figure 6: alignement des séquences nucléotidiques codant HN (1716 nucléotides) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de,haut en bas :
- séquence codant HN de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 50), - séquence codant HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 25), - séquence codant HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 30), - séquence codant HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 35), - séquence codant HN de I'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 40).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
Figure 7: alignement des séquences aminoacides de F (551 aa) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 24), - séquence F de I'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 44).
- séquence F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 29), - séquence F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 34), - séquence F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 39), - séquence F de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 49).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de F, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 32 (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V), - position 96 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), - position 102 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P), - position 104 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), - position 112 (acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121), - position 160 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T), - position 247 (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K), - position 248 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L), - position 390 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), - position 524 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A), - position 538 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V).
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment remarquer les substitutions T102P et Q104R que les isolats de l'invention présentent au niveau du site de clivage (CS en Figure 4), la substitution V1121 que les isolats de l'invention présentent au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4), la substitution D160T que les isolats de l'invention présentent au niveau du domaine HR1.
CDS = séquence nucléotidique codante.
Figure 8: alignement des séquences aminoacides de HN (571 aa) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de haut en bas :
- séquence HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 26), - séquence HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 31), - séquence HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 36), - séquence HN de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO: 41).
- séquence HN de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 51).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
5 différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de 10 l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de HN, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 57 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), - position 100 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L), - position 114 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A), - position 139 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), - position 186 (acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861), - position 195 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A), - position 201 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201 S), - position 316 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N), - position 319 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), - position 323 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E), - position 344 (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), - position 348 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481), - position 378 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), - position 379 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E), - position 479 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L), - position 480 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M), - position 482 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R), - position 497 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), - position 513 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N), - position 514 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
CDS = séquence nucléotidique codante.
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment remarquer la substitution N316S qui introduit un nouveau site de glycosylation dans les isolats de l'invention par rapport à la souche Greer.
On peut également remarquer les acides aminés en positions 512, 513, 514 et de la protéine HN, et plus particulièrement les acides aminés en position 513 et 514.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente demande est relative à un nouveau groupe et à un nouveau sous-groupe phylogéniques de virus HPIV2, et aux applications médicales qui peuvent être faites à partir de l'enseignement qui est présentement apporté par les inventeurs, à savoir l'existence de ce nouveau groupe et sous-groupe phylogéniques.
La présente demande est plus particulièrement relative à des moyens pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic, de virus HPIV2 faisant partie de ce groupe et/ou de ce sous-groupe.
Les inventeurs ont isolé plusieurs souches de HPIV2, qui sont des souches variantes par rapport à l'isolat HPIV2 Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98.
Dans l'art antérieur, l'isolat Greer est l'isolat de référence pour la mise au point des outils de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de l'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
Plus particulièrement, les isolats HPIV2 faisant partie du nouveau groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention ne sont pas reconnus par l'anticorps anti-HN
commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Or, ces isolats variants de l'invention ont récemment été observés chez plusieurs patients atteints d'affections respiratoires.
Par contre, la souche HPIV2 qui sert de référence dans l'art antérieur pour la mise au point de moyen de diagnostic HPIV2 est une souche qui date de 1955 (souche Greer).
Les inventeurs mettent donc en évidence le fait qu'il existe une inadéquation entre les moyens actuellement utilisés pour le diagnostic de HPIV2, et la nature des souches HPIV2 actuellement observées chez des patients. Au fil de l'évolution des souches, il est hautement probable que cette inadéquation va aller en s'accentuant.
Le nouveau groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention est caractérisé
par le fait qu'il ne comprend pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
La figure 3 donne une représentation du groupe phylogénique de l'invention, qui est basée sur les protéines d'enveioppe F et HN (arbre du haut : protéine F;
arbre du bas : protéine HN).
Le nouveau groupe phylogénique de l'invention comprend notamment les isolats qui, en figure 3, sont désignés par HPIV-2 Lyon/20283/2001, HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, c'est-à-dire cinq nouveaux isolats qui ont été isolés par les inventeurs et qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., aux fins du Traité de Budapest. Ce nouveau groupe phylogénique comprend également l'isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (=isolat V94).
Le nouveau sous-groupe de l'invention comprend notamment les isolats HPIV-2 Lyon/20283/2001, HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, mais ne comprend pas l'isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (=isolat V94). Des analyses de séquences F et HN permettent en effet de distinguer quelques différences entre l'isolat V94 et le sous-groupe dont font partie les cinq isolats particuliers de l'invention.
Comme la représentation phylogénique de la Figure 3 le fait apparaître à la personne du métier, les isolats HPIV2 qui sont les plus proches du nouveau groupe et du nouveau sous-groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention, mais sans en faire partie, sont les isolats Greer, Toshiba et V98.
Ceci implique également que le nouveau groupe phylogénique et le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus Rubulavirus, et plus particulièrement qu'ils ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus HPIV2.
L'isolat qui, dans l'art antérieur, est décrit sous le nom d'isolat Toshiba, est identique à 99,8% à l'isolat Greer au niveau nucléotidique. La séquence de l'isolat Toshiba a été rapportée dans les bases de données, notamment sous les numéros Genbank X57559, NC003443. On tiendra compte du fait que l'art antérieur démontre que les différences que la séquence de l'isolat Toshiba semble présenter par rapport à la séquence de l'isolat Greer sont en fait plutôt dues à des erreurs de clonage d'ADNc, de synthèse et/ou d'analyse de séquences, qu'à la situation réelle naturelle de l'isolat en question (cf. Skiadopoulos et al. 2003, Journal of Virology, 77(1) : 270-279).
Dans la présente demande, l'isolat Toshiba est donc en fait considéré comme étant identique à l'isolat Greer.
En tout état de cause, une différence par rapport à l'isolat Greer suffit à
constituer une différence par rapport à l'isolat Toshiba.
Les séquences des isolats Greer, Toshiba et V98 sont disponibles sur Genbank sous les numéros d'accession NC_003443 (isolat Greer), X57559 (isolat Toshiba), (isolat V98).
Dans la présente demande, le nouveau groupe phylogénique de l'invention pourra, par simplification, être désigné par groupe phylogénique de variants HPIV2, ou groupe phylogénique variant, ou groupe de l'invention.
De même, le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention pourra être désigné par sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, sous-groupe phylogénique variant, ou sous-groupe de l'invention.
Le nouveau groupe de l'invention est défini par le fait que les virus de ce groupe comprennent :
- une protéine F différente de celle de l'isolat, Greer et/ou - une protéine HN différente de celle de l'isolat Greer.
De préférence, les virus du groupe de l'invention comprennent une protéine F
et une protéine HN différentes des protéines F et HN, respectivement, de l'isolat Greer.
Plus particulièrement, les virus du groupe de l'invention peuvent comprendre :
- une protéine F différente des protéines F des isolats Greer et V98, et/ou - une protéine HN différente des protéines HN des isolats Greer et V98.
De préférence, les virus du groupe de l'invention présentent une protéine F
différente des protéines F des isolats Greer et V98, et une protéine HN
différente des protéines HN des isolats Greer et V98.
Cette ou ces différences protéiques peuvent notamment être une ou des différences de séquences aminacides.
Un virus du groupe de l'invention a donc :
5 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle de l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté
par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même position, et/ou (de préférence, et) - une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle 10 de l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la même position.
Plus particulièrement, un virus du groupe de l'invention peut donc avoir :
15 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celles des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolat V98 à la même position, et/ou (de préférence, et) - une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat V98 à la même position.
Ledit au moins un acide aminé différent par rapport à I'isolat Greer et ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolat V98 peuvent se trouver à
des positions différentes. Dans ce cas, le virus du groupe de l'invention présente au moins deux types de différences (sur sa protéine F et/ou sa protéine HN), à
savoir au moins une différence à une position donnée par rapport à l'isolat Greer, et au moins une différence à une autre position par rapport à l'isolat V98.
Alternativement, ledit au moins un acide aminé différent par rapport à
l'isolat Greer peut se trouver à la même position que ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolat V98. Dans ce cas, la protéine F du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé
qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Greer et V98, et/ou (de préférence, et), la protéine HN
du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Greer et V98.
Dans la présente demande, l'expression au moins un(e) comprend dans sa signification toutes les valeurs supérieures de nombre entier, jusqu'à la valeur maximale possible dans l'ensemble considéré. Par exemple, l'expression au moins un acide aminé comprend dans sa signification au moins deux acides aminés , au moins trois acides aminés , etc., jusqu'au nombre maximal de changements d'acides aminés contenus dans l'ensemble considéré. De même, l'expression en au moins une position comprend dans sa signification en au moins deux positions , en au moins trois positions , etc., jusqu'au nombre maximal de positions contenues dans l'ensemble considéré.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils présentent une protéine F et/ou une protéine HN
(protéines d'enveloppe) de séquence(s) particulière(s). Plus particulièrement :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5%
avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ
ID NO : 24; 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8%
avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ
ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement).
Les pourcentages d'identité indiqués ci-dessus, tout comme, sauf indication contraire, dans le reste de la demande, sont des valeurs d'identité globale, c'est-à-dire une identité calculée sur toute la longueur de la séquence.
De préférence, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent les % indiqués ci-dessus avec chacune des SEQ ID indiquées.
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter au moins un changement au niveau de la séquence aminoacide de la protéine F par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98.
Un virus du groupe de l'invention peut présenter une protéine F dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine F) :
positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes :
a) en position 32, un acide aminé autre que I, préférentiellement l'acide aminé
C (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V), et/ou b) en position 102, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P), et/ou c) en position 104, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), et/ou d) en position 112, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121), et/ou e) en position 160, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T), etlou f) en position 247, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K), et/ou g) en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V), et/ou h) en position 96, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), et/ou i) en position 248, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L), et/ou j) en position 390, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), et/ou k) en position 524, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A).
Parmi les positions de différences par rapport à la protéine F de l'isolat Greer, ci-dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F
comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces sept positions.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer et par rapport à
la protéine F de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide F a) à g) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence a) à g) ci-dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces sept différences.
Parmi ces différences communément présentées par rapport à l'isolat Greer et à
l'isolat V98, les positions 102, 104, 112 et 160 de la séquence de protéine F
sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide F b), c), d) et e) ci-dessus mentionnées.
En effet, ces positions particulières se trouvent situées à des sites caractéristiques des HPIV2 :
- les positions 102 et/ou 104 se situent au niveau du site de clivage de la protéine F (CS en Figure 4), - la position 112 se situe au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4), - la position 160 se situe au niveau du domaine HR1 de la protéine F.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F
de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 102, 104, 112, 160, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en l'ensemble de ces quatre positions.
Un tel virus peut en outre présenter une protéine F:
- dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer en au moins une des positions 5 aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des quatre différences particulières de protéine F ci-dessus mentionnées (différences de séquence de protéine F b), c), d), e)), de 10 préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement l'ensemble de ces quatre différences.
Un tel virus HPIV2 peut bien sûr en outre présenter :
- par rapport aux isolats Greer et V98, au moins une des trois autres différences de séquence de protéine F a) f) g) mentionnées ci-avant, de 15 préférence au moins deux de ces différénces a), f), g), préférentiellement l'ensemble de ces trois différences a), f), g) ; et/ou - par rapport à l'isolat Greer, au moins une des différences de séquence de protéine F a), f) à k) mentionnées ci-avant, de préférence au moins deux de ces différences a), f) à k), préférentiellement l'ensemble de ces sept 20 différences a), f) à k).
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter des changements au niveau de la séquence aminoacide de la protéine HN.
Un virus du groupe de l'invention peut comprendre une protéine HN dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine HN) : positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine Hn de l'isolat Greer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes :
a) en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), et/ou b) en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A), et/ou c) en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), et/ou d) en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A), e) en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201S), et/ou f) en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), et/ou g) en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), et/ou h) en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481), et/ou i) en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), et/ou j) en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E), et/ou k) en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M), et/ou 1) en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R), et/ou m) en position 100, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L), et/ou n) en position 186, un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé isoleucine pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861), et/ou o) en position 316, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N), et/ou p) en position 323, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E), et/ou q) en position 479, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L), et/ou r) en position 497, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), et/ou s) en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N), et/ou t) en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
Parmi les positions de différence par rapport à la protéine HN de l'isolat Greer, ci-dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN
comprend un acide aminé qui est différent de celui présenté par la protéine HN
de l'isolat Greer, et qui est également différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat V98, en au moins-une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces douze positions. En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre comprendre un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer en au moins une des positions aminocides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine HN de l'isolat Greer et par rapport à
la protéine HN de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide HN a) à I) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des douze différences de séquence a) à I) ci-dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces douze différences.
En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre présenter au moins une des différences m) à t) ci-dessus mentionnées.
Parmi les différences présentées par rapport à l'isolat Greer, les positions 316, 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide HN o) s) et t) ci-dessus mentionnées.
L'isolat Greer présente l'acide aminé S en position 316 de leur protéine HN.
L'isolat Greer ne présente pas de site de glycosylation à cette position.
A cette position, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter un acide aminé autre que S, et plus particulièrement un acide aminé
autre que S qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N
(asparagine). Les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc présenter un nouveau site de glycosylation, par rapport à l'isolat Greer.
Par rapport à l'isolat Greer, les virus du groupe phylogénique de l'invention peuvent, alternativement ou complémentairement, se distinguer par le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent en positions 515 de la protéine HN une structure tertiaire différente de celle observée chez le virus HPIV2 Greer.
Cette différence structurale est notamment illustrée par la Figure 1, qui présente la structure tertiaire prédite de la protéine HN de virus du groupe phylogénique variant de l'invention. En Figure 1, la flèche A signale une boucle qui, chez la souche Greer (modèle de gauche), est orientée vers l'intérieur de la protéine HN, alors que chez les isolats du groupe phylogénique variant de l'invention (modèle de droite) cette boucle, signalée par une flèche A' n'est pas orientée vers l'intérieur de la protéine, mais est orientée vers l'extérieur de la protéine HN.
Cette bouche correspond aux positions 512-515 de la protéine HN, et plus particulièrement aux positions 513-514 de la protéine HN des isolats de l'invention.
En terme de séquence aminoacide, les acides aminés qui sont en positions 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont, pour l'isolat Greer, S et A, respectivement, alors qu'ils sont N et S, respectivement, pour - les cinq isolats particuliers de l'invention.
La présence d'un acide aminé autre que S, préférentiellement de l'acide aminé
N, en position 513 de la protéine HN, et d'un acide aminé autre que A, préférentiellement de l'acide aminé S, en position 514 de la protéine HN est un moyen de définir les virus faisant partie du groupe phylogénique de variants de l'invention.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN comprend :
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer et qui est aussi différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et - un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides 316, 513, 514, de 5 préférence en position 316 ou en positions 513 et 514, préférentiellement en positions 36, 513 et 514.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN présente :
10 - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN a) à I) ci-dessus mentionnées (différences communément présentées par rapport à
l'isolat Greer et à l'isolat V98), de préférence au moins deux de ces différences, préférentiellement au moins trois de ces différences, plus préférentiellement au moins quatre de ces différences, encore plus 15 préférentiellement au moins cinq de ces différences, très préférentiellement l'ensemble de ces douze différences, et - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN o) s) t) ci-dessus mentionnées, de préférence la différence o) et/ou les différences s) et t), préférentiellement au moins deux de ces différences, plus 20 préférentiellement au moins les différences s) et t), encore plus préférentiellement les différences o) s) et t).
En résumé, un virus HPIV2 faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut être défini par le fait que :
25 i. la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID NO :, et/ou par le fait que M. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN
des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID
NO :, et/ou par le fait que iii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que iv. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des onze différences de séquence F a) à k), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que v. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que vi. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence F a) à g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que vii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que viii. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que ix. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sein de la séquence de la protéine F), et diffère en outre :
o de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou o de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538 ; et/ou par le fait que X. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre :
o au moins l'une des trois différences de séquence F a), f) g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou o au moins l'une des différences de séquence F a), f) à k) ci-dessus mentionnées ; et/ou par le fait que xi. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514 (positions des acides aminés au sein de la protéine HN) ; et/ou par le fait que xii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des vingt différences de séquence HN a) à t), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xiii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ; et/ou par le fait que xiv. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xv. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminoacides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514; et/ou par le fait que xvi. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à i), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN m) à t), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que xvii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminoacides 316, 513, 514; et/ou par le fait que xviii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN o) s) t), tel que ci-dessus mentionné.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par au moins l'un des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., v. à x., xiii. à xviii, préférentiellement par au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., vii., xiii.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par :
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., vii., et/ou par - au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous ii., xiii., par exemple par au moins les caractéristiques i. et ii., et/ou i. et xiii., et/ou vii. et ii., et/ou vii. et xiii.
Cinq isolats qui font partie du groupe phylogénique variant de l'invention, et qui ont été identifiés par les inventeurs, ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ;
C.N.C.M. ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ;
France).
Leurs numéros de dépôt sont : 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), I-(isolat 18620), I-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435).
IIs ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le : 10 mai 2007.
Ces isolats ont été isolés à partir d'aspirats nasaux ou de lavages bronchoalvéolaires de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le groupe phylogénique variant de l'invention comprend également I'isolat V94.
L'enseignement de l'art antérieur relatif à V94 incitait clairement la personne du métier à considérer que l'isolat V94 était un isolat très proche de l'isolat Greer, et qu'il ne comportait pas de différence technique significative par rapport à
l'isolat G.reer, à tout le moins aucune.Oifférence technique significative pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
Par exemple, l'article Skiadopoulos et al. 2003 (Journal of Virology, vol. 77, No. 1, pp. 270-279) fait état du séquençage complet de l'isolat V94, et rapporte des analyses comparatives de sa séquence avec celles des isolats Greer et V98.
Chacune des informations rapportées dans cet article présente l'isolat V94 comme un isolat qui est très proche de l'isolat Greer.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat présenterait des différences structurales par rapport à l'isolat Greer, qui seraient suffisamment significatives pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolat Greer ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat présenterait des protéines d'enveloppe, et plus particulièrement des protéines F
et/ou HN, suffisamment différentes de celles de l'isolat Greer, pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolat Greer via la détection de ses protéines d'enveloppe ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
En outre, à la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne fait état du fait que, ou n'incite la personne du métier à considérer que, l'isolat V94 n'est pas un cas isolé appartenant au passé (l'isolat V94 a été isolé en 1994), mais qu'il fait en fait partie d'un groupe phylogénique particulier, qui est distinct du groupe de HPIV2 dont fait partie l'isolat Greer, et dont des membres peuvent être actuellement isolés sur des patients.
A la connaissance des inventeurs, l'art antérieur ne suggère pas que l'isolat V94, qui a été isolé en 1994, était susceptible d'être phylogénétiquement lié à
d'autres virus HPIV2 susceptibles d'être isolés postérieurement, notamment dans les années 2000, à partir de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le concept général de l'existence d'un groupe phylogénique variant de HPIV2, qui comprend plusieurs virus qui ont en commun de présenter une variation au niveau de l'enveloppe telle qu'ils pourraient ne pas être détectés par les moyens traditionnels de diagnostic de HPIV2, n'a donc, à la connaissance des inventeurs, été ni divulgué ni suggéré dans l'art antérieur.
Le fait que les isolats faisant partie de ce groupe phylogénique variant sont trouvés sur des patients actuels, alors que la souche Greer de référence a été isolée en 1955, souligne encore l'intérêt de la présente invention.
Au sein du groupe phy(ogénique variant de l'invention, un sous-groupe phylogénique peut être distingué. Ce sous-groupe comprend l'ensemble des cinq isolats particuliers de l'invention, et ne comprend pas l'isolat V94. Ce sous-groupe phylogénique de l'invention comprend des virus HPIV2, qui sont extrèmement 5 proches les uns des autres.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils ne sont pas reconnus par certains anticorps 10 anti-HPIV2 de l'art antérieur, et plus particulièrement par des anticorps de l'art antérieur qui sont dirigés contre la protéine d'enveloppe HN de virus HPIV2.
Ces anticorps anti-HN de l'art antérieur ont en effet été produits ou construits à
partir d'épitope(s) de la protéine HN de la souche HPIV2 qui servait de référence dans l'art antérieur, à savoir la souche HPIV2 Greer. Or, les inventeurs montrent que la 15 protéine HN des virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention ne comprend pas les mêmes épitopes que la protéine HN de I'isolat Greer. Plus particulièrement, certains épitopes qui sont présents dans la protéine HN de l'isolat Greer ne sont pas présents dans la protéine HN des virus du groupe phylogénique variant de l'invention. De ce fait, les virus du groupe phylogénique variant de 20 l'invention ne sont pas reconnus par certains anticorps anti-HN de l'art antérieur.
Un exemple de tels anticorps anti-HN de l'art antérieur est l'anticorps commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ;
France) sous la référence 12E12G9. Cet anticorps de l'art antérieur reconnaît un épitope sur la protéine HN de I'isolat Greer, qui n'est pas présent dans les virus du 25 sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Alternativement, ou en complément, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis comme ayant en commun de présenter une substitution de l'acide aminé qui est en position 175 au sein de la séquence de la 30 protéine F, et/ou une substitution de l'acide aminé qui est position 186 de la séquence de la protéine HN.
La position 175 de la protéine F se situe dans le domaine HR1 du polypeptide Ft:-En position 175, l'isolat V94 présente l'acide aminé H(histidine).
La position 186 de la protéine HN est très proche du site catalytique de la protéine, et la nature de l'acide aminé présent à cette position est donc susceptible d'avoir une influence sur l'activité de la protéine.
En position 186 de la protéine HN, l'isolat V94 présente l'acide aminé M (et !'on peut incidemment noter que l'isolat Greer présente également l'acide aminé M
en position 186).
Un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention peut donc être défini par le fait que :
- il fait partie du groupe phylogénique de l'invention tel que ci-dessus défini, par exemple à l'aide d'une ou plusieurs des caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées (telles que pourcentage d'identité de la protéine F et/ou HN, différence(s) de séquence(s) F et/ou HN, structure tertiaire de HN
différente), et en outre par le fait que:
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine Hn de l'isolat Greer, et/ou - il présente un acide aminé autre que H en position 175 de la protéine F
et/ou (de préférence, et) un acide aminé autre que M en position 186 de la protéine HN.
De préférence, l'acide aminé en position 175 de la séquence de la protéine F
d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acide aminé R (asparagine).
De préférence, l'acide aminé en position 186 de la séquence de la protéine HN
d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acidé aminé ! (isoleucine).
Toutes les combinaisons de caractéristique(s) de groupe et de caractéristique(s) de sous-groupe sont explicitement incluses dans la présente demande.
Par 'exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i., ii., v. à x., xiii. à xviii. ci-dessus listées, et - par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou - en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
Pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, une ou plusieurs dix-huit caractéristiques i. à xviii. peuvent être utilisées, comme indiqué ci-dessus au chapitre de la définition du groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de caractéristiques sont explicitement visées par la présente demande.
Par exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i.
à
xviii. ci-dessus listées, et - par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou - en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, et/ou - il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine HN de l'isolat Greer.
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et en outre par le fait que :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, ils présentent un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé 1(isoleucine).
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que:
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, -et en outre par le fait que :
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, ils présentent un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
A titre récapitulatif ou illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 13:
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement communes de la l'isolat présent présent présent chez des aux isolats protéine Greer/Toshiba chez chez isolats du groupe du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe ou sous- V98 V94 phylogénique de groupe de l'invention l'invention Protéine F 112 V V I 1 Tableau 13 (suite et fin) :
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement communes de la l'isolat présent présent présent chez des aux isolats protéine GreerlToshiba chez chez isolats du groupe du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe ou sous- V98 V94 phylogénique de groupe de l'invention l'invention Protéine 201 A A S S
HN 319 s p T T
513 s N N N
5 Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans faire nécessairement appel à au moins une des caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées, est le % d'identité que présente la séquence aminoacide de leurs protéines F et/ou HN.
En effet, les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention peuvent être définis par le fait que : -- la séquence aminoacide de leur protéine F présente préférentiellement une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Les virus HPIV2 qui répondent à ces critères d'identité font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans qu'il y ait nécessairement à faire appel à
une des caractéristiques de groupe i. à xviii. ci-dessus mentionnées.
La présente demande est donc relative à tout virus HPIV2 :
i. qui répond à au moins des caractéristiques de groupe i. à xviii., tel que ci-dessus mentionné, et à au moins une des caractéristiques de sous-groupe, tel que ci-dessus mentionné (acide aminé autre que H en position 175 de sa protéine F, préférentiellement, l'acide aminé R ; acide aminé autre que M en position 186 de sa protéine HN, préférentiellement, l'acide aminé I; virus non reconnu des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur), et/ou ii. dont la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou iii. dont la séquence âminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Un virus HPIV2 faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente au moins l'une des ces caractéristiques i. à iii. ci-dessus, par exemple une, deux, ou l'ensemble de ces caractériques.
La demande vise plus particulièrement cinq virus particuliers. Ces cinq virus particuliers sont ceux qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le 10 mai 2007, sous les numéros de dépôt 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), 1-3763 (isolat 18620), 1-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435). Ils font partie du groupe phylogénique de l'invention, et également du sous-groupe phylogénique de l'invention.
Les paramètres physico-chimiques des protéines F et HN de ces virus particuliers sont prtésentés en tableaux 14 et 15 ci-dessous (paramètres calculés à l'aide du logiciel CLC Free WorkBench version 3.2).
La présente demande est relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F
présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à celle(s) de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à
celle(s) de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
La présente demande est plus particulièrement relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, un virus HPIV-2 de l'invention a une protéine F qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont une protéine HN qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, lesdits au moins deux paramètres comprennent le paramètre de point isoélectrique.
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La demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence séquence comprend, ou est constituée de (la séquence d'un acide nucléique d'un virus HPIV2 de l'invention; et plus particulièrement) :
5 a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou b) la séquence d'un ADNc (simple-brin ou double-brin) susceptible d'être obtenu par transcription inverse (ou transcription inverse et polymérase) d'un tel ARN génomique, ou 10 c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus, sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
Protéines :
15 La présente demande est relative à toute protéine qui est celle d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Dans la présente demande, le terme protéine comprend dans sa portée les protéines non glycosylées, tout comme les glycoprotéines.
Les virus qui font partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention présente une enveloppe virale différente de celle habituellement observée dans l'art antérieur, plus particulièrement différente de celle de l'isolat Greer, préférentiellement différente de celles des isolats Greer, Toshiba et V98.
L'enveloppe des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention est en outre différente de celle de l'isolat V94.
La présente demande est donc relative à tout protéine d'enveloppe d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Cette protéine d'enveloppe peut être, ou comprendre, la protéine F d'un tel virus et/ou la protéine HN d'un tel virus.
La présente demande est plus particulièrement relative aux protéines d'enveloppe qui sont spécifiques des virus du sous-groupe de l'invention, préférentiellement des cinq isolats particuliers de l'invention qui ont été déposés auprès de la CNCM
sous les numéros 1-3761 à 1-3765.
Ladite protéine F présente un certain nombre de différence(s) par rapport à
une protéine F de l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F
des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
Par exemple, la séquence de cette protéine F peut présenter un certain nombre de substitution(s) d'acide(s) aminé(s), par rapport à la séquence de la protéine F de l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
Chacune des définitions des protéines F et HN ci-dessus présentées au chapitre de la définition des virus selon l'invention s'appliquent naturellement aux protéines F et HN en tant que telles.
Ainsi, comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, les protéines F et HN
peuvent être définies par une combinaison d'au moins une caractéristique de groupe (au moins une différence par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98) et au moins une caractéristique de sous-groupe (au moins une différence par rapport à l'isolat V94).
Par exemple, parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F
d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent notamment être citées les différences suivantes, qui sont relatives au site de clivage de la protéine F (positions 102 à 106 de la séquence complète de la protéine F; cf. CS en Figure 4):
- en position 102, un acide aminé autre que T (thréonine), préférentiellement l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, un acide aminé autre que Q (glutamine), préférentiellement l'acide aminé R (arginine).
De préférence, ladite protéine F comprend à la fois l'acide aminé P en position 102 et l'acide aminé R en position 104.
En position 102, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé T
(thréonine), et non l'acide aminé P.
En position 104, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé Q
(glutamine), et non l'acide aminé R.
De préférence, ladite protéine F présente l'acide aminé E en position 105.
Avantageusement, la séquence de ce site de clivage est KPRRER (SEQ ID NO:
14).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 112, un acide aminé autre que V (valine), préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), et/ou - en position 160, un acide aminé autre que D (acide aspartique), préférentiellement l'acide aminé T (théonine).
La position 112 se situe dans le peptide de fusion (FP) ; la position 160 se situe dans le domaine HR1 du polypeptide F1.
En position 112, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé V (valine).
En position 160, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé D (acide aspartique).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 32, un acide aminé autre que I(isoleucine), préférentiellement l'acide aminé V, - en position 247, un acide aminé aùire que N, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V, La dite protéine F de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, ou plus, voire l'ensemble des différences ci-dessus mentionnées. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande.
La protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut, en sus de la ou des différence(s) ci-dessus mentionnée(s), présenter une ou des différence(s) par rapport à la protéine F de l'isolat V94.
Avantageusement, la protéine F d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente un acide aminé autre que H en position 175, préférentiellement l'acide aminé R (mutation H175R).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F par rapport à
l'isolat V94, peuvent notamment être citées les différences particulières suivantes :
- en position 4, un acide aminé autre que L, préférentiellement l'acide aminé
P, et/ou - en position 403, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé T, et/ou - en position 516, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine).
Par exemple :
- l'isolat 20283 de l'invention présente la substitution L4P et la substitution V5161, par rapport à l'isolat V94, et également par rapport à l'isolat Greer, - l'isolat 26056 de l'invention présente la substitution N403T, par rapport à
l'isolat V94, - l'isolat 20435 présente la substitution V5161 par rapport à l'isolat V94, et également par rapport à l'isolat Greer.
La dite protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, des différences ci-dessus mentionnées, en sus d'au moins une différence de séquence F par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande.
Des virus HPIV2 faisant partie du groupe ou, le cas échéant, du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc être des variants qui présentent la(Ies) mutation(s) V1121 et/ou D160T au sein de la protéine F par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98 et la mutation H175R au sein de la protéine F
par rapport à l'isolat V94.
Comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, des différences au niveau des protéines F permettent de distinguer une protéine F d'un virus du sous-groupe de l'invention, sans avoir nécessairement à combiner cette différence avec une différence de groupe. Il s'agit donc de différences spécifiques particulières, qui distinguent les protéines F des virus du sous-groupe de l'invention, tels que les cinq isolats particuliers déposés auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à
I-3765, des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine F, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (cf tableau 5).
Une protéine d'enveloppe de l'invention peut être, ou comprendre, la protéine HN
d'un virus faisant partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, plylogénique variant de l'invention.
Cette protéine HN peut présenter au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants (éléments de différence par rapport aux protéines HN des isolats Greer, Toshiba et V98) :
- en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E, - en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, 5 - en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S, - en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T, - en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), 10 - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M, - en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
15 Une protéine HN d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente en outre au moins une différence par rapport à la protéine HN
de l'isolat V94.
Préférentiellement, cette protéine HN présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
20 L'isolat V94 présente l'acide aminé M en position 186. L'isolat Greer présente également l'acide aminé M en position 186.
Les cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., présentent quant à eux l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
La présente demande est donc relative à toute protéine HN qui présente au moins 25 l'un des éléments de différences listés ci-dessus, par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, et qui présente un acide aminé autre que M en position 186.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine HN, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,15%, de préférence 30 d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (protéine HN des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (cf. tableau 5).
Fraaments de protéines :
La présente demande est également relative aux fragments des protéines d'enveloppe des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement aux fragments des protéines F et HN des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Sont plus particulièrement visés ceux des fragments de protéine, qui sont spécifiques des virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, et plus particulièrement des cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été
déposés auprès de la CNCM sous les nuémros 1-3761 à 1-3765.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi :
- le fragment partie extracellulaire, - le fragment polypeptide F2, - le fragment site de clivage (CS), - le fragment peptide de fusion (FP), - le fragment domaine HR1, - le fragment domaine HR2, - le fragment polypeptide F1, - le fragment partie transmembranaire, - le fragment partie intracytoplasmique de ces protéines F.
La Figure 4 donne une présentation schématique de tels fragments.
Ces fragments s'étendent des positions suivantes, calculées à partir de la séquence des protéines F complètes :
Tableau 12 : position des-fragments dans la séauence complète de la protéine F
Fragments de ces 1 er acide Dernier protéines F aminé acide aminé
Partie extracellulaire 1 486 Polypeptide F2 1 100 Site de clivage (CS) 101 106 Peptide de fusion (FP) 107 126 Domaine HR1 133 177 Domaine HR2 451 484 Polypeptide F1 101 486 Partie 487 518 transmembranaire Partie 519 551 intracytoplasmique Les séquences des protéines F complètes des cinq isolats particuliers de l'invention sont les séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement).
La présente demande est relative à toute protéine, polypeptide, peptide (glycosylé
ou non), qui comprend au moins (ou qui est constitutée de) la séquence du site de clivage des protéines F des virus de l'invention, c'est-à-dire la séquence KPRRER
(SEQ ID NO : 14).
Une telle protéine, ou le cas échéant un tel polypeptide ou peptide peut être d'origine virale, plus particulièrement issu de l'enveloppe d'un virus, de préférence d'un virus HPIV-2.
La présente demande vise notamment toute protéine F, de préférence toute protéine F de HPIV2, qui comprend la séquence du site de clivage de SEQ ID NO
:
14.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est par ailleurs plus particulièrement relative à ceux des fragments dont la séquence de ce fragment comprend au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était (étaient) à l'une des positions suivantes : positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La taille dudit fragment est d'au moins 10 acides aminés. Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 550. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non-humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H).
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 160 (acide aminé autre que D, tel que T), et a en outre conservé
l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H, tel que R).
Parmi les fragments de protéines HN de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi les fragments d'au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était (étaient) à
l'une des positions suivantes : -57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
De tels fragments peuvent avoir en outre conservé au moins un, de préférence au moins deux, plus préférentiellement les trois, acide(s) aminé(s) parmi ceux qui, dans la séquence complète de la protéine HN dont le fragment dérive, étaient :
- à la position 316 (acide aminé autre que S), - à la position 513 (acide aminé autre que S), - à la position 514 (acide aminé autre que A).
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 316.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 316, au moins l'acide aminé qui était à la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
Les fragments de protéine de l'invention sont notamment des candidats d'intérêt pour la production d'anticorps spécifiques des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, et/ou pour l'identification des épitopes de tels anticorps.
La taille dudit fragment de protéine HN est d'au moins 10 acides aminés.
Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 570. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non-humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine HN de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était à la position 186 (acide aminé autre que M).
Acides nucléiques codant protéines et petits fragments =
La présente demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence code au moins une protéine d'enveloppe selon l'invention, ou au moins un fragment de protéine d'enveloppe selon l'invention, en tenant compte de la dégénérescence du code génétique universel.
Ces acides nucléiques peuvent être de l'ADN ou de l'ARN.
Ladite protéine d'enveloppe peut être une protéine F et/ou HN de l'invention.
Ces acides nucléiques codent une protéine d'enveloppe, ou un fragment de protéine d'enveloppe, d'au moins l'un des virus du group ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention présentent une ou des différences par rapport aux isolats Greer, toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à
l'isolat Greer.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F et/ou une protéine HN peuvent présenter la(les) différence(s) nucléotidique(s), qui correspondent à la (aux) différence(s) aminoacide(s) identifiées ci-dessus pour les protéines et fragment de protéine de l'invention, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F présentent au moins une, de préférence aù moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 94-96, un codon codant un acide aminé autre que I;
préférentiellement un codon codant l'acide, aminé V, - en positions 304-306, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé P, - en positions 310-312, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R, - en positions 334-336, un codon codant un acide aminé autre que V, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I, - en positions 478-480, un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T, - en positions 739-741, un codon codant un acide aminé autre que N, préférentiellement un codon codant l'acide aminé K, - en positions 1612-1614, un codon codant un acide aminé autre que F, préférentiellement un codon codant l'acide aminé V.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 169-171, un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 340-342, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A, - en positions 415-417, un codon codant un acide aminé autre que K, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 583-585, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A, - en positions 601-603, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé S, - en positions 955-957, un codon codant un acide aminé autre que P, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T, - en positions 1030-1032, un codon codant un acide aminé autre que E, préférentiellement un codon codant l'acide aminé K, - en positions 1042-1044, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I, - en positions 1132-1134, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 1135-1137, un codon codant un acide aminé autre que R, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 1438-1440, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé M, - en positions 1444-1446, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention présentent au moins une des différences ci-dessus par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à l'isolat Greer, et en outre au moins une différence par rapport à l'isolat V94.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en position 33, un nucléotide autre que T, préférentiellement le nucléotide C (par exemple, le codon 31-33 de l'isolat V94 est ATT, alors que dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATC), - en position 525, un nucléotide autre que A, préférentiellement le nucléotide G
(par exemple, le codon 524-526 de l'isolat V94 est CAC, codant l'acide aminé H
en position 175 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est CGC, codant l'acide aminé R en position 175), - en position 1479, un nucléotide autre que C, préférentiellement le nucléotide A
(par exemple, le codon 1479-1481 de l'isolat V94 est ATC, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
De préférence, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F
présentent au moins la différence ci-dessus mentionnée pour la position 525.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins la différence suivante :
- en position 558, un nucléotide autre que G, préférentiellement A (par exemple, le codon 556-558 est ATG dans l'isolat V94, codant pour l'acide aminé M en position 186 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA, codant l'acide aminé I-isoleucine- en position 186).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de différences nucléotidiques sont explicitement visées par la présente demande.
A titre récapitulatif et illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 16:
Positions Par rapport à-l'isolat Par rapport aux Par rapport à
de Greer/Toshiba isolats I'isolat V94 différences Greer/Toshiba et communes V98 aux isolats Acide Codon du Acide Codon du Acide Codon du groupe aminé CDS aminé CDS aminé du CDS
ou sous-groupe de l'invention Protéine F 112 334-336 112 334-336 -Protéine 201 601-603 201 601-603 -La présente demande vise plus particulièrement les acides nucléiques qui codent les protéines F et/ou HN des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire les 5 acides nucléiques dont la séquence comprend, ou est constituée, d'une séquence parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40 (cf. tableau 5).
Applications pour la détection de HPIV2, et plus particulièrement pour son 10 diagnostic (moyens immunologigues ou moléculaires) :
Partant de l'identification, de la description et de la caractérisation du groupe phylogénique variant et du sous-groupe phylogénique variant, les inventeurs proposent de nouveaux moyens de détection de HPIV2, et plus particulièrement de 15 nouveaux moyens pour le diagnostic de HPIV2.
Les nouveaux moyens de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2 de l'invention permettent de détecter l'ensemble des virus du groupe phylogénique variant de l'invention.
20 L'invention propose notamment des moyens qui permettent leur détection et/ou leur diagnostic de manière spécifique, c'est-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
L'invention propose en outre des moyens qui permettent la détection et/ou le diagnostic des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention de 25 manière spécifique, c'èst-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et sans détection de l'isolat V94.
Moyens immunolopigues :
La présente demande est également relative à des anticorps, qui se lient à
l'enveloppe de virus HPIV2.
La présente demande est également relative à des fragments de tels anticorps qui ont conservé la capacité de se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2.
Le terme fragment d'anticorps comprend notamment les fragment Fab, F(ab)'2, Fv, les CDR1, CDR2, CDR3, ainsi que les constructions dérivant de tels fragments tels que des scFv ou des anticorps humanisés.
L'expression se lier est ici utilisée dans son sens habituel dans le contexte des liaisons anticorps-antigène.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps, qui se lient à l'enveloppe d'au moins un virus du groupe phylogénique variant de l'invention, de préférence d'au moins l'un des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., de préférence d'au moins deux, trois ou quatre, plus préférentiellement de ces cinq virus.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps qui ne se lient pas à l'enveloppe de l'isolat HPIV2 Greer (la séquence de l'isolat Greer est disponible auprès de Genbank sous le numéro d'accès NC_003443, et est reproduite dans la présente demande, après la partie exemples , point B.2.), et plus particulièrement sans se lier à une protéine d'enveloppe des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
De préférence, cet anticorps ne se lie à aucun microorganisme qui ne serait pas un virus HPIV2.
De préférence, un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention est un anticorps spécifique des virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée d'une protéine F.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine-F de l'invention et/ou à un fragment de protéine F de l'invention. Les caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines F et les fragments de protéines F
de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines F et des fragments de protéines F qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention.-Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine F
en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 96, 102, 104, 112, 160, 247, 248, 390, 524, 538, plus particulièrement en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée, d'une protéine HN.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine HN
de l'invention et/ou à un fragment de protéine HN de l'invention. Les caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines HN de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines HN et des fragments de protéines HN de l'invention qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention.
Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend :
- au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situent en positions 316, 513, 514 (par exemple, un épitope de protéine HN comprend les acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, qui se situe en positions 513-514, ou 512-515), et/ou - au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 100, 114, 139, 186, 195, 201, 319, 323, 344, 348, 378, 379, 479, 480, 482, 497, plus particulièrement en positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
Plus particulièrement encore, la demande est relative à des anticorps ou fragments d'anticorps, qui sont spécifiques des virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention. De tels anticorps ne se lient donc pas à
l'isolat HPIV2 V94.
Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut notamment se lier à une protéine F
d'au moins l'un des virus du sous-groupe phylogénique variant en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en position 175.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut naturellement porter un marquage pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage fluorsecent ou enzymatique.
La présence demande est également relative à des hybridomes produisant de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à des cellules transfectées, infestées ou transformées, qui produisent de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à toute composition qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention, avec éventuellement au moins un véhicule pharmaceutique acceptable.
La présente demande est également relative à tout kit, plus particulier tout kit de diagnostic, qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment :
- des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les Greer, Toshiba, V98, et/ou - des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1, HPIV3, HPIV4, et/ou - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
La présente demande est également relative à une méthode pour produire un anticorps capable de se lier à au moins un virus du groupe, ou le cas échéant, du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement à
au moins l'un des cinq isolats particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., et de préférence à ces cinq isolats particuliers. De préférence, les anticorps ainsi produits sont des anticorps spécifiques de ces virus.
Cette méthode peut comprendre l'administration à un mammifère (de préférence, un mammifère non-humain) d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, de préférence les cinq isolats particuliers de l'invention, et éventuellement également l'isolat V94, et/ou d'au moins une protéine d'enveloppe ou d'au moins un fragment de protéine d'enveloppe de l'invention, tel que par exemple un fragment de protéine HN qui a conservé l'acide aminé qui, dans la séquence de la protéine HN, était en position 316 et/ou les deux acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, était en positions 513 et 514.
L'administration est réalisée de telle sorte que le(s) virus, protéine(s), fragment(s) de protéine(s) administré(s) induisent la production d'anticorps par le mammifère qui le(s) reçoit.
Cette administration peut être faite avec un adjuvant susceptible d'augmenter l'immunogénicité tel qu'un alun.
Les anticorps produits sont alors recollectés, et de préférence isolés.
Des anticorps monoclonaux peuvent être produits selon les techniques connues de la personne du métier.
Moyens moléculaires :
Acides nucléiques de référence (grands fragments d'acides nucléiques) :
Les inventeurs ont sélectionné des acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'au moins l'un des isolats de l'invention, de préférence de l'ensemble des isolats de l'invention.
Les acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique de l'ensemble des isolats de l'invention permettent de détecter l'ensemble des isolats susceptibles de faire partie du groupe phylogénique variant.
5 La présente demande est relative à des acides nucléiques qui sont spécifiques d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, dont ne font pas partie les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce groupe ou sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production de 10 sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique.
Ces acides nucléiques sont des fragments d'au moins un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique de l'invention, dont font partie les cinq isolats particuliers qui ont été déposés par les inventeurs.
15 Ces acides nucléiques s'hybrident avec un ou plusieurs des virus du groupe, ou sous-groupe, phylogénique de l'invention dans des conditions de forte stringence.
Des conditions de forte de stringence sont des conditiosn connues de la personne du métier, par exemple des conditions d'hybridations sur ADN lié à un flitre dans SSC 5X, dodecyl sulfate de sodium (SDS) 2%, 100 microgrammes/mL d'ADN
20 simple-brin, à 55-65 C pendant 8 heures, et lavage dans SSC 02X et SDS 0,2%
à
60-65 C pendant 30 minutes.
De préférence, de tels acides nucléiques ne s'hybrident à àucun microorganisme autre que HPIV2 dans des conditions de forte stringence.
De préférence, dans des conditions de forte stringence, de tels acides nucléiques 25 ne s'hybrident pas à des isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe phylogénique de l'invention, tels que les isolats Greer, Toshiba et V98.
De tels acides nucléiques sont alors des acides nucléiques qui s'hybrident spécificiquement à un, de préférence à plusieurs, plus préférentiellement à
30 l'ensemble, des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Un tel acide nucléique peut être caractérisés par le fait que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F
et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon la revendication 1, ou - la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment. -De préférence, ledit fragment est un fragment d'au moins 133, 134, 135, 136, nucléotides (par exemple des fragments de 137, 180, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 137, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 180 nucléotides).
Plus préférentiellement, ledit fragment est un fragment d'au moins 170, 175, nucléotides (par exemple, 180, 208, 210 ou 180, ou 208, 210 nucléotides).
Par exemple, ledit fragment est un fragment d'au moins 240 nucléotides.
Avantageusement, notamment pour la construction et la production d'amorces et sone(s) adaptées à une mise en ceuvre en amplification temps réel, ledit fragment est un fragment d'au plus 400 nucléotides.
De préférence, ladite séquence codant la protéine F est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 23, 28, 33, 38, 43, et/ou en ce que ladite séquence codant HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 25, 30, 35, 40, et/ou ladite séquence codant les protéines F et HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 86.
La demande est notamment relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production de sondes ou d'amorces spécifiques du groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention, qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, caractérisé en ce que cet acide nucléique comprend, ou est constituée de:
a) au moins une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 57 à 86, ou b) un fragment conservateur d'au moins l'une des séquences visées sous a), ledit fragment conservateur comprenant, ou étant constitué d'au moins une séquence choisie parmi :
- les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 259 à 395 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 234 à 443 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 961 à 1140 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 1381 à 1560 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 1466 à 1673 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou c) la séquence complémentaire de l'une des séquences visées sous a) et b), sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
La présente demande est plus particulièrement relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en oruvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression acides nucléiques temps réel , par souçi de simplification.
Un tel acide nucléique peut être défini par le fait que sa séquence comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
De préférence, ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :62 à 66, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :67 à 70, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :83 à 86.
La séquence dudit acide nucléique séquence peut alors comprendre, ou être constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
La présente demande est également relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression acides nucléiques puces , par souçi de simplification.
La séquence d'un tel acide nucléique avantageusement comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F et/ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
La présente demande est donc relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production d'au moins une sonde qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique variant, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
Avantageusement, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID
déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82.
Amorces et sondes, spécialement dapatées à une amplification en temps réel :
La présente demande est également relatives à des paires d'amorces et des sondes qui peuvent leur être associées pour une en oauvre en amplification temps réel, de préférence en PCR temps réel.
La présente demande est relative à une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Une paire d'amorces de l'invention peut notamment être définie par le fait que les séquences de chacune des amorces de cette paire sont telles qu'elles permettent l'amplification d'un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des virus HPIV2 Greer, Toshiba et V98, lorsque cette paire d'amorces est placée en contact avec le matériel ARN dudit au moins un des cinq virus de la revendication 1, et d'autre part avec le matériel ARN
de chacun desdits virus Greer, Toshiba et V98, par exemple dans quatre tubes distincts, en présence des réactifs de RT-PCR appropriés, tels que par exemple :
- tampon TaqMan EZ 5X (250 mM bicine -N,N-bis(2-hydroxyéthyle glycine); 575 mM acétate de potassium ; 0,05 mM EDTA ; 40% glycérol; pH 8,2) : pour une concentration finale de 1 X, - acétate de manganèse (25 mM) : pour une concentration finale de 2 à 5 mM, par exemple une concentration finale de 3 mM, - dATP, dCTP, dGTP : pour une concentration finale de 300 pM chacun, - dUTP : pour une concentration finale de 600 pM, - AmpErase UNG : pour une concentration finale de 0,01 U/pL, - 500 nM de chaque amorce de la paire testée, - 10 pg à 100 ng de l'ARN viral, 5 - polymérase thermostable, présentant une activité transcriptase inverse et une activité de ADN polymérase, telle que la rTth polymérase (disponible par exemple auprès de Applied Biosystems sous la référence produit N808-0192) : pour une concentration finale de 0,1 U/pL, - H20 déminéralisée et sans ARN, 10 et sous des conditions de RT-PCR appropriées, telles que par exemple les conditions expérimentales suivantes :
- activité de l'AmpErase UNG (enzyme uracyl N-glycosy(ase ; CE 3.2.2) : 50 C
pendant 2 min, - réverse transcription (rTth polymérase) à 60 C pendant 30 min, 15 - désactivation de l'AmpErase UNG : 95 C pendant 10 min, - PCR : 25 à 40 cycles de - dénaturation à une température de 95 C à 97 C pendant 15 secondes, - annelage et extension à une température qui, de préférence, est de 15 C à
5 C inférieure à la valeur réelle de la température de fusion (Tm) de la paire 20 d'amorces testée et qui est, de préférence, supérieure à 55 C, par exemple à une température de 55 C à 70 C, par exemple 60 C, pendant 1 min.
Le mélange réactionnel commercialisé par Applied Biosystems sous la désignation Taqman EZ RT-PCR kit est une exemple de kit fournissant un milieu 25 réactionnel approprié.
II convient alors de déterminer si la paire d'amorces testée amplifie bien au moins un des cinq virus de l'invention, sans amplifier les isolats Greer, Toshiba et V98, c'est-à-dire si la paire d'amorces testée a conduit à la production d'un amplicon à
30 partir du matériel ARN d'au moins un des cinq virus de l'invention, et n'a pas conduit à la production d'un amplicon à partir du matériel ARN de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98.
. Tout moyen que la personne du métier trouvera adapté à la détection de la présence ou de l'absence d'un amplicon peut être mis en ceuvre.
Un moyen simple, qui ne nécessite pas la production d'une sonde de détection, peut comprendre l'électrophorèse des acides nucléiques (par exemple, sur gel d'agarose à 1%) en présence de bromure d'éthidium et l'analyse visuelle ou densitométrique des bandes résultantes après irradiation aux ultra-violets.
Les paires d'amorces appropriées sont celles :
- dont chacune des deux amorces parvient à s'hybrider à une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins l'un des cinq virus de l'invention, de préférence de chacun des cinq virus de l'invention, de telle sorte à
permettre l'amplification de la région bornée par chacune de ces deux amorces, et - dont au moins une des deux amorces ne trouve pas de cible sur le matériel nucléotidique de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98, qui permettrait l'amplification d'une région du matériel nucléotidique de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98.
Des paires d'amorces candidates peuvent donc être choisies parmi celles dont au moins une des deux amorces présente une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins un des cinq virus de l'invention, et de préférence sur chacun des cinq virus de l'invention, qui ne se retrouve pas à l'identique dans le matériel nucléotidique des isolats Greer, Toshiba et V98 (au moins une différence nucléotidique).
On choisira de préférence des paires d'amorces :
- qui contiennent de 14 à 30 nucléotides, - dont le contenu en G+C est de 20 à 80%, - dont la température de fusion (Tm) est de 58 C à 60 C pour chaque amorce, et - dont les cinq derniers nucléotides à l'extrémité 3' de chaque amorce ne comprennent pas plus de deux bases G et/ou C.
La construction de paires d'amorces est une technique connue de la personne du métier. Des moyens automatisés sont d'ailleurs disponibles à cette fin, tels que le logiciel Primer Express version 3 ou supérieure, commercialisé par Applied Biosystems.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent être celle d'un fragment 5' de la séquence amplifiée à partir de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment 5' de la séquence complémentaire de cette séquence amplifiée (fragments 5' comprenant le tout premier nucléotide à l'extrémité
5').
Dans ce cas, les séquences des paires d'amorces appropriées sont celle d'un fragment de ia séquence de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment de la séquence complémentaire de cette séquence virale.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent également être des séquences variantes de tels fragments, susceptibles d'être obtenues par substitution et/ou addition et/ou délétion d'au moins un nucléotide de la séquence de ces fragments, et qui ont conservé la capacité à amplifier au moins l'un des cinq virus de l'invention, sans amplifier Toshiba, Greer et V98. De préférence, de telles séquences variantes ont conservé au moins une différence nucléotidique par rapport à l'ensemble de leurs cibles potentielles dans chacun des isolats Greer, Toshiba, et V98.
Il est préférable d'extraire l'ARN des virus avant de les mettre en contact avec la paire d'amorces testée, de sorte à rendre cet ARN facilement accessible à
cette paire d'amorces. Des moyens permettant d'extraire le matériel ARN de virus sont connus de la personne du métier. Par exemple, un échantillon de virus peut être traité par un tampon d'extraction contenant du thiocyanate de guanidium 4M, de la N-lauryle sarcosine 0,5%, du dithiothréitol 1 mM, du citrate de sodium 25 mM, et du glycogène à 0,1 mg par mL, puis par précipitations à l'isopropanol et à
l'éthanol 70%.
De préférence, ladite paire d'amorces amplifie un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à 1-3765.
Avantageusement, une paire d'amorces de l'invention est telle que :
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temsp réel de l'invention, et en ce que - la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à
30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique temps réel sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à
l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est capable d'amplifier un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Dans une paire d'amorces de l'invention, chacun desdits fragments 5' est (indépendamment l'un de l'autre) constitué de (14 à 30 nucléotides, de préférence de) 18 à 23 nucléotides.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est constituée (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous) :
- d'une amorce de SEQ ID NO: 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 91, et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
La présente demande est également relative à tout ensemble d'amorces qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention.
La présente demande est également relative à toute amorce, qui est telle que choisie au sein d'une paire d'amorces de l'invention.
La présente demande est également relative à une sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'invention, pour la détection spécifique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Avantageusement, une telle sonde temps réel présente une séquence (d'hybridation) qui est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temps réel de l'invention, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment. -De préférence, ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 14 à 30 nucléotides, de préférence de 23 à 28 nucléotides.
Avantageusement, une telle sonde temps réel est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 89, 90, 93, 94, 97, 98 (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous).
Une telle sonde peut porter un marquage, par exemple pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage radioactif, fluorescent ou enzymatique.
Une telle sonde peut avantageusement porter un marquage fluorescent et un quencher, de sorte à être adaptée à une utilisation en tant que sonde type Taqman ou de type beacon ou de type Scorpion . Une telle sonde pourra alors comporter des bras qui ne s'hybrident pas aux virus HPIV2, et qui sont destinés à
former des bras beacon.
La présente demande est également relative à un ensemble d'oligonucléotides, qui comprend au moins une paire d'amorces temps réel selon l'invention et au moins une sonde temps réel selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 87-88, et la sonde de SEQ ID NO : 89 ou 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO: 91-92, et la sonde de SEQ ID NO : 83 ou 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 95-96, et la sonde de SEQ ID NO : 87 ou 98.
Un ensemble selon l'invention peut par exemple comprendre au moins une paire d'amorces selon l'invention, et au moins deux sondes temps réel selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 87-88, la sonde de SEQ ID NO: 89 et la sonde de SEQ ID NO : 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 91-92, la sonde de SEQ ID NO: 83 et la sonde de SEQ ID NO : 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 95-96, la sonde de SEQ ID NO: 87 et la sonde de SEQ ID NO : 98.
La présente demande est également relative à un kit pour le diagnostic d'une affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention et/ou au moins une sonde selon l'invention.
La présente demande est également relative à un système d'amplification, qui est spécialement adaptée à une amplification temps réel, qui comprend au moins une paire d'amorces de l'invention et au moins une sonde selon l'invention, et plus particulièrement au moins une paire d'amorces selon l'invention et au moins une 10 sonde selon l'invention qui est capable de s'hybrider sur l'amplicon produit par cette paire d'amorces à partir de l'acide nucléique d'un virus du groupe, ou sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
La présente demande est également relative à toute composition et plus 15 particulièrement à toute composition pharmaceutique ou biologique, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système temps réel de l'invention.
La présente demande est également relative à un kit qui est spécialement adapté
20 à la détection de HPIV2, plus particulièrement à son diagnostic, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système temps réel de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment :
25 - des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les Greer, Toshiba, V98, et/ou - des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1, HPIV3, HPIV4, et/ou 30 - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
La présente demande est également relative à une méthode pour la détection, plus particulièrement pour le diagnostic, de HPIV2 qui comprend la mise en contact d'un échantillon susceptible de contenir au moins un virus HPIV2, avec au moins une paire d'amorces et au moins une sonde de l'invention, dans des conditions adaptées à une amplification temps réel, par exemple une PCR temps réel.
La détection de la présence d'un amplicon produit par cette paire d'amorces et détecté par cette sonde est indicatif de la présence d'un virus HPIV2 faisant partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique de l'invention.
La présente demande est également relative à tout amplicon susceptible d'être obtenu par amplification à l'aide d'une paire d'amorces de l'invention d'un acide nucléique d'un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Sondes, spécialement adaptées à une mise en ceuvre sur puce :
La présente demande décrit la sélection d'acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes, qui sont spécialement adaptées à une mise en oruvre sur puce (acides nucléiques puces ci-dessus).
La présente demande est donc relative à une sonde qui est spécialement adaptée à une mise en oeuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
De préférence, une telle sonde est un acide nucléique qui s'hydride en conditions de forte stringence à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98, dans les mêmes conditions de forte stringence.
Des conditions de forte stringence sont connues de la personne du métier, et un exemple de telles conditions a été décrit ci-dessus.
Avantageusement, une telle sonde est telle que sa séquence est celle d'un fragment d'un acide nucléique puce de l'invention, ou celle de la séquence qui est la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
La présente demande est plus particulièrement relative à des sondes capables de s'hybrider à au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider au virus HPIV2 de souche Greer, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'un sous-fragment (de 14 à 30, de préférence de 18 à
23 nucléotides) des fragments suivants :
- les fragments 241-420 de séquences codant F, - les fragments 259-395 de séquences codant F, - les fragments 181-480 de séquences codant HN, - les fragments 234-443 de séquences codant HN, - les fragments 1381-1716 de séquences codant HN, - les fragments 1466-1673 de séquences codant HN, - les séquences qui sont complémentaires de ces séquences sur toute la longueur de ces séquences.
Avantageusement, une telle sonde est choisie parmi les séquences de SEQ ID
NO : 99 à 117 (cf. tableau 11 ci-dessous).
La présente demande est également relative à tout support solide adapté à la circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, qui comprend au moins une telle sonde.
De préférence, cette sonde est fixée sur le supportd e cette puce.
Cette puce peut être sous forme congelée, voire lyophilisée.
Des exemples de puces sont connus de la personne du métier. Des puces sont par exemple décrites dans Korimbocus et al. 2005, Journal of Clinical Microbiology 43(8) : 3779-3787, ou commercialisées par la société Affymetrix (Califormie, USA).
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Variants de HPIV-2, et leurs applications médicales DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente demande est relative à des virus parainfluenza humains de type 2 (HPIV-2) variants, et à leurs applications médicales, plus particulièrement à
leurs applications diagnostiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Au sein de la famille des Paramyxoviridae, les virus parainfluenza humains (HPIV) sont des virus à ARN compris dans deux genres de la sous-famille des Paramyxovirinae :
- les Respirovirus pour les virus parainfluenza de type 1 et 3 (HPIV-1, -3) - les Rubulavirus pour les virus parainfluenza de type 2 et 4 (HPIV-2, -4).
Les HPIV sont des virus enveloppés. Leur génome est d'une taille d'environ 15 kilobases, constitué d'ARN simple brin de polarité négative. Le génome code six protéines principales.
Les gènes NP, P et L codent respectivement la nucléoprotéine, la phosphoprotéine et la polymérase (L pour large polymerase complex). Ces trois protéines forment avec l'ARN viral la nucléocapside (ou holonucléocapside). La nucléoprotéine forme avec l'ARN un support pour la phosphoprotéine et la polymérase, permettant la transcrition et éventuellement la réplication du génome.
Les gènes F et HN codent respectivement la protéine de fusion F et l'hémagglutinine-neuraminidase HN, qui sont les deux protéines d'enveloppe du virus et qui participent au mécanisme d'entrée du virus dans la cellule hôte.
La protéine HN est responsable de l'attachement du virus à la cellule, en se liant aux acides sialiques cellulaires. Une fois le virus attaché, la protéine de fusion F
est activée, insère un de ces domaines dans la membrane cellulaire et s'ensuivent des mécanismes rapprochant les deux membranes et les fusionnant.
Parmi les HPIV, différents virus HPIV2 ont été décrits dans l'art antérieur.
L'isolat HPIV2 de référence est l'isolat Greer, qui a été isolé en 1955 à
partir d'un patient.
Les moyens de diagnostic qui comprennent la détection de HPIV-2 sont tous actuellement construits à partir de la structure de cet isolat de référence.
Par exemple, la détection de HPIV-2 dans le cadre hospitalier se fait actuellement par isolement en culture cellulaire (sur système sensible LLCMK2), ou par immunofluorescence et immuno-capture ELISA. Les anticorps mis en oeuvre dans ces techniques ont été obtenus à partir de la souche HPIV-2 Greer.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe en fait toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de I'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
De même, l'art antérieur propose quelques techniques de détection de HPIV-2 par PCR, mais les amorces sont conçues par référence à la séquence de l'isolat Greer, sans tenir compte du fait que, comme le démontrent les présents inventeurs, il existe en fait toute une famille de virus HPIV-2 qui sont différents de l'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98.
RESUME DE L'INVENTION
Les inventeurs ont identifié un nouveau groupe phylogénique variant de HPIV2, et un nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
La demande est relative à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau groupe phylogénique variant, et à des virus HPIV2 qui font partie de ce nouveau sous-groupe phylogénique variant de HPIV2.
Le groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus HPIV2 qui ne comprend notamment pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
Le sous-groupe phylogénique variant de l'invention est un groupe de virus qui ne comprend notamment pas le's isolats Greer, Toshiba et V98, et qui ne comprend en outre pas l'isolat V94.
~
Cinq isolats faisant partie de ce groupe et également de ce sous-groupe ont été
déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest.
La demande est relative aux protéines, plus particulièrement aux protéines d'enveloppe des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, notamment aux protéines F et HN de ces virus, ainsi qu'aux fragments de ces protéines.
La demande est également relative aux acides nucléiques codant ces protéines ou fragments de protéine.
La demande est également relative à des moyens pour la détection, plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
La demande est relative à des régions nucléotidiques particulières des virus du groupe ou sous-groupe HPIV2 de l'invention, qui leur sont suffisamment spécifiques pour permettre leur détection, de préférence leur détection spécifique, par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer et V98.
La demande est ainsi relative à des régions nucléotidiques qui ont été
spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de systèmes de type PCR temps réel, comprenant au moins une paire d'amorces et une sonde, ainsi qu'à des régions nucléotidiques qui ont été spécifiquement sélectionnées pour la construction et la production de sondes spécialement adaptées à une mise en ceuvre sur puce.
La demande est également relative à ces amorces, ces sondes et à des puces comprenant au moins une sonde de l'invention.
La demande est en outre relative à des kits et compositions comprenant au moins une région spécifique et/ou au moins une amorce et/ou au moins une sonde de l'invention.
La demande est également relative à des anticorps dirigés contre une protéine d'enveloppe d'au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et à des hybridomes produisant de tels anticorps.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La demande fait référence aux figures suivantes : -Figure 1: modèle tridimensionnel des ectodomaines de la protéine HN de l'isolat prototype HPIV-2 Greer de l'art antérieur (modèle de gauche), et d'un isolat de l'invention -par exemple, isolat HPIV-2 18620 (modèle de droite).
Cette figure illustre le fait que des isolats de l'invention présentent une protéine HN
différente de celle de l'isolat HPIV-2 Greer, notamment en ce qui concerne les sites de glycosylation. Comme illustré sur la figure, des isolats de l'invention comprennent notamment une mutation S316N, qui crée un site de glycosylation que ne présente pas la protéine HN de l'isolat HPIV-2 Greer.
Figure 2: alignement des séquences aminoacides du peptide de fusion (FP;
fragment 107-126 de la protéine de fusion F) de :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (virus parainfluenza humains de type 2;
isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), sur celles de - l'isolat HPIV-2 Greer de l'art antérieur (virus parainfluenza humain de type 2) et du virus SV5 (virus simien parainfluenza simien de type 5).
Figure 3: Analyse phylogénétique des protéines F (arbre du haut) et HN (arbre du bas) des isolats suivants :
- cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolat HPIV-2 Lyon/20283/2001 = isolat 20283 ; isolat HPIV-2 Lyon/20435/2001 = isolat 20435 ; isolat HPIV-2 Lyon/18620/2001 = isolat 18620 ; isolat HPIV-2 Lyon/26632/1997 = isolat 26632 ; isolat HPIV-2 Lyon/26056/1997 = isolat 26056), - isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (= isolat HPIV-2 V94), - isolat HPIV-2 Vanderbilt/1 998 (= isolat HPIV-2 V98), - isolat HPIV-2 Greer/1955 (= isolat HIPV-2 Greer), - virus SV5 (virus parainfluenza simien de type 5), - HPIV-4A, - HPIV-4B, - HPIV-3, et - HPIV-1.
Les séquences déterminées par les inventeurs sont signalées par une flèche (isolats 20283, 20435, 18620, 26632, 26056).
Les autres séquences ont été obtenues à partir de la base de données Genbank (http///www.ncbi.nim.nih.gov).
5 Les arbres phylogénétiques ont été construits par la méthode du voisin le plus proche ( neighbour-joining ). L'échelle indique le nombre de substitutions d'acides aminés par site, et la longueur des branches horizontales est proportionnelle à l'échelle indiquée. La fiabilité des embranchements a été
évaluée par la méthode des "bootstraps" (1000 réplications) et les pourcentages résultant de cette procédure sont indiqués.
Figure 4: présentation schématique des domaines structurels de la protéine F
de HPIV-2, et présentation de l'alignement des séquences aminoacides de la protéine F pour cinq isolats HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632), pour l'isolat HPIV-2 Greer, et pour les isolats HPIV-2 V94 et V98 (Vanderbilt/1 994 et Vanderbilt/1998, respectivement).
Cette figure illustre le fait que certains acides aminés de la protéine F des isolats de l'invention sont différents de ceux observés dans les autres isolats HPIV-2 (isolats Greer, V94 et V98). Par exemple, on voit que :
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat Greer notamment du fait des éléments de séquence suivants :
o la séquence du site de clivage (CS), qui est KPRRER (SEQ ID NO:
14), au lieu de la séquence KTRQER (SEQ ID NO : 13) observée chez l'isolat Greer tel que séquencé par les inventeurs (mutations T102P et Q104R), et au lieu de la séquence KTRQRK (SEQ ID NO :
118) telle que cela apparaît dans la séquence Greer disponible sur la base de données NCBI (NLM, National Library of Medicine) sous le numéro d'accession NC_003443 (mêmes mutations T102P et Q104R), o la séquence du peptide de fusion (FP) qui présente l'acide aminé I en position 112, au lieu de l'acide aminé V (mutation V1121), o la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui présente l'acide aminé T en position 160, au lieu de l'acide aminé D (mutation D160T);
- la protéine F des isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V98 notamment du fait des mêmes éléments de séquence que ceux observés par rapport à l'isolat Greer (mutations T102P, Q104R au niveau du CS ;
mutation V1121 au niveau de FP ; mutation D160T au niveau de HR1), ainsi que par le fait qu'au niveau de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, les isolats de l'invention présentent :
o l'acide aminé R en position 163, au lieu de l'acide aminé K (mutation K163R), et o l'acide aminé R en position 175, au lieu de l'acide aminé H (mutation H175R) ;
- la protéine F d'isolats de l'invention diffère de celle de l'isolat V94 notamment du fait de la séquence du domaine HR1 du polypeptide F1, qui, dans des isolats de l'invention, présente l'acide aminé R en position 175 au lieu de l'acide aminé H (mutation H175R).
On voit également que certains isolats de l'invention présentent d'autres mutations, notamment dans le domaine transmembranaire (TM) de la protéine F. Par exemple, les isolats 20283 et 20435 de l'invention diffèrent des isolats 18620, 26056 et 26632 de l'invention, mais aussi des isolats Greer, V94 et V98, par le fait que leur domaine transmembranaire présente l'acide aminé I en position 516 au lieu de l'acide aminé V (mutation V5161).
Les positions des acides aminés sont ici calculées par rapport à la séquence de la protéine F.
La figure 4 décrit plus particulièrement les séquences des sites de clivage (CS), des peptides de fusion (FP) des domaines HR1, HR2 et TM de chacun des cinq isolats HPIV2 de l'invention (séquences 101-106, 107-126, 133-177, 451-484 et 487-518, respectivement), alignées sur les séquences respectives des isolats Greer, V94 et V98.
Les séquences codantes correspondantes peuvent être déduites par la personne du métier, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
TM = partie transmembranaire On peut observer que, par rapport aux isolats Greer, V98 et V94, les cinq isolats particuliers de l'invention se distinguent par le fait qu'ils présentent à la fois :
- un acide aminé autre que D en position 160 (région HR1), préférablement l'acide aminé T en position 160 (mutation D160T par rapport aux isolats Greer et V98), et - un acide aminé autre que H en position 175 (région HR1), préférablement l'acide aminé R en position 175 (mutation H175R par rapport aux isolats V98 et V94).
Figure 5: alignement des séquences nucléotidiques codant F (1656 nucléotides) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence codant F de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 48), - séquence codant F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 23), - séquence codant F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 28), - séquence codant F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO: 33), - séquence codant F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 38), - séquence codant F de l'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 43).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats particuliers de l'invention, par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
Figure 6: alignement des séquences nucléotidiques codant HN (1716 nucléotides) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de,haut en bas :
- séquence codant HN de l'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 50), - séquence codant HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 25), - séquence codant HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 30), - séquence codant HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 35), - séquence codant HN de I'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 40).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un nucléotide différent à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
Figure 7: alignement des séquences aminoacides de F (551 aa) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056 et 26632) ; de haut en bas :
- séquence F de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 24), - séquence F de I'isolat 26632 de l'invention (SEQ ID NO : 44).
- séquence F de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 29), - séquence F de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 34), - séquence F de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO : 39), - séquence F de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 49).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de F, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 32 (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V), - position 96 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), - position 102 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P), - position 104 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), - position 112 (acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121), - position 160 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T), - position 247 (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K), - position 248 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L), - position 390 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), - position 524 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A), - position 538 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V).
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment remarquer les substitutions T102P et Q104R que les isolats de l'invention présentent au niveau du site de clivage (CS en Figure 4), la substitution V1121 que les isolats de l'invention présentent au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4), la substitution D160T que les isolats de l'invention présentent au niveau du domaine HR1.
CDS = séquence nucléotidique codante.
Figure 8: alignement des séquences aminoacides de HN (571 aa) de la souche HPIV-2 Greer et de souches HPIV-2 de l'invention (isolats 18620, 20283, 20435, 26056) ; de haut en bas :
- séquence HN de l'isolat 18620 de l'invention (SEQ ID NO : 26), - séquence HN de l'isolat 20283 de l'invention (SEQ ID NO : 31), - séquence HN de l'isolat 20435 de l'invention (SEQ ID NO : 36), - séquence HN de l'isolat 26056 de l'invention (SEQ ID NO: 41).
- séquence HN de I'isolat Greer NC_003443 (SEQ ID NO : 51).
Chaque position qui n'est pas marquée du symbole étoile (*) est une position où au moins l'une des souches présentées en alignement contient un acide aminé
5 différent des autres à cette position.
On peut ainsi aisément identifier les positions et natures des changements que présente chacun des isolats par rapport à l'une ou plusieurs des autres souches présentées en alignement, et plus particulièrement par rapport à la souche Greer.
On peut ainsi remarquer que, par rapport à la souche Greer, les isolats de 10 l'invention présentent des changements qui leur sont communs au niveau de la séquence de HN, notamment au niveau des positions d'acide aminé suivantes :
- position 57 (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), - position 100 (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L), - position 114 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A), - position 139 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), - position 186 (acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861), - position 195 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A), - position 201 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201 S), - position 316 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N), - position 319 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), - position 323 (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E), - position 344 (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), - position 348 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481), - position 378 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), - position 379 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E), - position 479 (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L), - position 480 (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M), - position 482 (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R), - position 497 (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), - position 513 (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N), - position 514 (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les isolats de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
CDS = séquence nucléotidique codante.
Parmi ces changements communs par rapport à l'isolat Greer, on peut notamment remarquer la substitution N316S qui introduit un nouveau site de glycosylation dans les isolats de l'invention par rapport à la souche Greer.
On peut également remarquer les acides aminés en positions 512, 513, 514 et de la protéine HN, et plus particulièrement les acides aminés en position 513 et 514.
DESCRIPTION DETAILLEE
La présente demande est relative à un nouveau groupe et à un nouveau sous-groupe phylogéniques de virus HPIV2, et aux applications médicales qui peuvent être faites à partir de l'enseignement qui est présentement apporté par les inventeurs, à savoir l'existence de ce nouveau groupe et sous-groupe phylogéniques.
La présente demande est plus particulièrement relative à des moyens pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic, de virus HPIV2 faisant partie de ce groupe et/ou de ce sous-groupe.
Les inventeurs ont isolé plusieurs souches de HPIV2, qui sont des souches variantes par rapport à l'isolat HPIV2 Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98.
Dans l'art antérieur, l'isolat Greer est l'isolat de référence pour la mise au point des outils de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2.
Or, les inventeurs montrent qu'il existe toute une famille de virus HPIV2 qui sont suffisamment différents de l'isolat Greer, et plus particulièrement des isolats Greer, Toshiba et V98, pour ne pas être reconnus par les anticorps anti-protéine d'enveloppe qui, dans l'art antérieur, sont habituellement utilisés pour la détection de HPIV2.
Plus particulièrement, les isolats HPIV2 faisant partie du nouveau groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention ne sont pas reconnus par l'anticorps anti-HN
commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Or, ces isolats variants de l'invention ont récemment été observés chez plusieurs patients atteints d'affections respiratoires.
Par contre, la souche HPIV2 qui sert de référence dans l'art antérieur pour la mise au point de moyen de diagnostic HPIV2 est une souche qui date de 1955 (souche Greer).
Les inventeurs mettent donc en évidence le fait qu'il existe une inadéquation entre les moyens actuellement utilisés pour le diagnostic de HPIV2, et la nature des souches HPIV2 actuellement observées chez des patients. Au fil de l'évolution des souches, il est hautement probable que cette inadéquation va aller en s'accentuant.
Le nouveau groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention est caractérisé
par le fait qu'il ne comprend pas les isolats Greer, Toshiba et V98.
La figure 3 donne une représentation du groupe phylogénique de l'invention, qui est basée sur les protéines d'enveioppe F et HN (arbre du haut : protéine F;
arbre du bas : protéine HN).
Le nouveau groupe phylogénique de l'invention comprend notamment les isolats qui, en figure 3, sont désignés par HPIV-2 Lyon/20283/2001, HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, c'est-à-dire cinq nouveaux isolats qui ont été isolés par les inventeurs et qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., aux fins du Traité de Budapest. Ce nouveau groupe phylogénique comprend également l'isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (=isolat V94).
Le nouveau sous-groupe de l'invention comprend notamment les isolats HPIV-2 Lyon/20283/2001, HPIV-2 Lyon/20435/2001 HPIV-2 Lyon/18620/2001 HPIV-2 Lyon/26632/1997 HPIV-2 Lyon/26056/1997, mais ne comprend pas l'isolat HPIV-2 Vanderbilt/1994 (=isolat V94). Des analyses de séquences F et HN permettent en effet de distinguer quelques différences entre l'isolat V94 et le sous-groupe dont font partie les cinq isolats particuliers de l'invention.
Comme la représentation phylogénique de la Figure 3 le fait apparaître à la personne du métier, les isolats HPIV2 qui sont les plus proches du nouveau groupe et du nouveau sous-groupe phylogénique d'isolats HPIV2 de l'invention, mais sans en faire partie, sont les isolats Greer, Toshiba et V98.
Ceci implique également que le nouveau groupe phylogénique et le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus Rubulavirus, et plus particulièrement qu'ils ne comprennent pas de microorganismes qui ne seraient pas des virus HPIV2.
L'isolat qui, dans l'art antérieur, est décrit sous le nom d'isolat Toshiba, est identique à 99,8% à l'isolat Greer au niveau nucléotidique. La séquence de l'isolat Toshiba a été rapportée dans les bases de données, notamment sous les numéros Genbank X57559, NC003443. On tiendra compte du fait que l'art antérieur démontre que les différences que la séquence de l'isolat Toshiba semble présenter par rapport à la séquence de l'isolat Greer sont en fait plutôt dues à des erreurs de clonage d'ADNc, de synthèse et/ou d'analyse de séquences, qu'à la situation réelle naturelle de l'isolat en question (cf. Skiadopoulos et al. 2003, Journal of Virology, 77(1) : 270-279).
Dans la présente demande, l'isolat Toshiba est donc en fait considéré comme étant identique à l'isolat Greer.
En tout état de cause, une différence par rapport à l'isolat Greer suffit à
constituer une différence par rapport à l'isolat Toshiba.
Les séquences des isolats Greer, Toshiba et V98 sont disponibles sur Genbank sous les numéros d'accession NC_003443 (isolat Greer), X57559 (isolat Toshiba), (isolat V98).
Dans la présente demande, le nouveau groupe phylogénique de l'invention pourra, par simplification, être désigné par groupe phylogénique de variants HPIV2, ou groupe phylogénique variant, ou groupe de l'invention.
De même, le nouveau sous-groupe phylogénique de l'invention pourra être désigné par sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, sous-groupe phylogénique variant, ou sous-groupe de l'invention.
Le nouveau groupe de l'invention est défini par le fait que les virus de ce groupe comprennent :
- une protéine F différente de celle de l'isolat, Greer et/ou - une protéine HN différente de celle de l'isolat Greer.
De préférence, les virus du groupe de l'invention comprennent une protéine F
et une protéine HN différentes des protéines F et HN, respectivement, de l'isolat Greer.
Plus particulièrement, les virus du groupe de l'invention peuvent comprendre :
- une protéine F différente des protéines F des isolats Greer et V98, et/ou - une protéine HN différente des protéines HN des isolats Greer et V98.
De préférence, les virus du groupe de l'invention présentent une protéine F
différente des protéines F des isolats Greer et V98, et une protéine HN
différente des protéines HN des isolats Greer et V98.
Cette ou ces différences protéiques peuvent notamment être une ou des différences de séquences aminacides.
Un virus du groupe de l'invention a donc :
5 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle de l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté
par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même position, et/ou (de préférence, et) - une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle 10 de l'isolat Greer, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la même position.
Plus particulièrement, un virus du groupe de l'invention peut donc avoir :
15 - une protéine F qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celles des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolat Greer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine F de l'isolat V98 à la même position, et/ou (de préférence, et) - une protéine HN qui, lorsque sa séquence aminoacide est alignée sur celle des isolats Greer et V98, comprend au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat Greer à la même position et au moins un acide aminé différent de celui présenté par la séquence de la protéine HN de l'isolat V98 à la même position.
Ledit au moins un acide aminé différent par rapport à I'isolat Greer et ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolat V98 peuvent se trouver à
des positions différentes. Dans ce cas, le virus du groupe de l'invention présente au moins deux types de différences (sur sa protéine F et/ou sa protéine HN), à
savoir au moins une différence à une position donnée par rapport à l'isolat Greer, et au moins une différence à une autre position par rapport à l'isolat V98.
Alternativement, ledit au moins un acide aminé différent par rapport à
l'isolat Greer peut se trouver à la même position que ledit au moins un acide aminé différent par rapport à l'isolat V98. Dans ce cas, la protéine F du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé
qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Greer et V98, et/ou (de préférence, et), la protéine HN
du virus du groupe de l'invention comprend, dans sa séquence aminoacide, au moins une position où l'acide aminé qu'elle y présente est différent de celui présenté à la même position dans la séquence des isolats Greer et V98.
Dans la présente demande, l'expression au moins un(e) comprend dans sa signification toutes les valeurs supérieures de nombre entier, jusqu'à la valeur maximale possible dans l'ensemble considéré. Par exemple, l'expression au moins un acide aminé comprend dans sa signification au moins deux acides aminés , au moins trois acides aminés , etc., jusqu'au nombre maximal de changements d'acides aminés contenus dans l'ensemble considéré. De même, l'expression en au moins une position comprend dans sa signification en au moins deux positions , en au moins trois positions , etc., jusqu'au nombre maximal de positions contenues dans l'ensemble considéré.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils présentent une protéine F et/ou une protéine HN
(protéines d'enveloppe) de séquence(s) particulière(s). Plus particulièrement :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5%
avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ
ID NO : 24; 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8%
avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ
ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement).
Les pourcentages d'identité indiqués ci-dessus, tout comme, sauf indication contraire, dans le reste de la demande, sont des valeurs d'identité globale, c'est-à-dire une identité calculée sur toute la longueur de la séquence.
De préférence, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent les % indiqués ci-dessus avec chacune des SEQ ID indiquées.
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter au moins un changement au niveau de la séquence aminoacide de la protéine F par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98.
Un virus du groupe de l'invention peut présenter une protéine F dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine F) :
positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes :
a) en position 32, un acide aminé autre que I, préférentiellement l'acide aminé
C (acide aminé I pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution 132V), et/ou b) en position 102, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T102P), et/ou c) en position 104, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé P (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé P pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q104P), et/ou d) en position 112, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé V pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution V1121), et/ou e) en position 160, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D160T), etlou f) en position 247, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé N pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution N247K), et/ou g) en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé V pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F538V), et/ou h) en position 96, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T96A), et/ou i) en position 248, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F248L), et/ou j) en position 390, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R390K), et/ou k) en position 524, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S524A).
Parmi les positions de différences par rapport à la protéine F de l'isolat Greer, ci-dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F
comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces sept positions.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine F de l'isolat Greer et par rapport à
la protéine F de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide F a) à g) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence a) à g) ci-dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces sept différences.
Parmi ces différences communément présentées par rapport à l'isolat Greer et à
l'isolat V98, les positions 102, 104, 112 et 160 de la séquence de protéine F
sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide F b), c), d) et e) ci-dessus mentionnées.
En effet, ces positions particulières se trouvent situées à des sites caractéristiques des HPIV2 :
- les positions 102 et/ou 104 se situent au niveau du site de clivage de la protéine F (CS en Figure 4), - la position 112 se situe au niveau du peptide de fusion (FP en Figure 4), - la position 160 se situe au niveau du domaine HR1 de la protéine F.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F
de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 102, 104, 112, 160, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en l'ensemble de ces quatre positions.
Un tel virus peut en outre présenter une protéine F:
- dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer et de celui présenté par la protéine F de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou dont la séquence aminoacide comprend un acide aminé différent de celui présenté par la protéine F de l'isolat Greer en au moins une des positions 5 aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des quatre différences particulières de protéine F ci-dessus mentionnées (différences de séquence de protéine F b), c), d), e)), de 10 préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement l'ensemble de ces quatre différences.
Un tel virus HPIV2 peut bien sûr en outre présenter :
- par rapport aux isolats Greer et V98, au moins une des trois autres différences de séquence de protéine F a) f) g) mentionnées ci-avant, de 15 préférence au moins deux de ces différénces a), f), g), préférentiellement l'ensemble de ces trois différences a), f), g) ; et/ou - par rapport à l'isolat Greer, au moins une des différences de séquence de protéine F a), f) à k) mentionnées ci-avant, de préférence au moins deux de ces différences a), f) à k), préférentiellement l'ensemble de ces sept 20 différences a), f) à k).
Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les différences que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, est le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter des changements au niveau de la séquence aminoacide de la protéine HN.
Un virus du groupe de l'invention peut comprendre une protéine HN dont la séquence aminoacide diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions suivantes (positions des acides aminés dans la séquence de la protéine HN) : positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine Hn de l'isolat Greer, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences suivantes :
a) en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E (acide aminé D pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution D57E), et/ou b) en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T114A), et/ou c) en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K139E), et/ou d) en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé A pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T195A), e) en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A201S), et/ou f) en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé T pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P319T), et/ou g) en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé E pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution E344K), et/ou h) en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé I pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A3481), et/ou i) en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A378E), et/ou j) en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R379E), et/ou k) en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M (acide aminé T pour la souche Greer, acide aminé M pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution T480M), et/ou 1) en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R (acide aminé Q pour la souche Greer, acide aminé R pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution Q482R), et/ou m) en position 100, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé F pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution F100L), et/ou n) en position 186, un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I(acide aminé M pour la souche Greer, acide aminé isoleucine pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution M1861), et/ou o) en position 316, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S316N), et/ou p) en position 323, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E (acide aminé K pour la souche Greer, acide aminé E pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution K323E), et/ou q) en position 479, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé L (acide aminé P pour la souche Greer, acide aminé L pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution P479L), et/ou r) en position 497, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé K (acide aminé R pour la souche Greer, acide aminé K pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution R497K), et/ou s) en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N (acide aminé S pour la souche Greer, acide aminé N pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution S513N), et/ou t) en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S (acide aminé A pour la souche Greer, acide aminé S pour les cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire une substitution A514S).
Parmi les positions de différence par rapport à la protéine HN de l'isolat Greer, ci-dessus mentionnées, certaines peuvent également être des positions de différence(s) par rapport à l'isolat V98. C'est notamment le cas des positions : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN
comprend un acide aminé qui est différent de celui présenté par la protéine HN
de l'isolat Greer, et qui est également différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat V98, en au moins-une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, de préférence en au moins deux de ces positions, préférablement en au moins trois de ces positions, plus préférablement en au moins quatre de ces positions, encore plus préférablement en au moins cinq de ces positions, très préférablement en au moins six de ces positions, et plus particulièrement en l'ensemble de ces douze positions. En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre comprendre un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer en au moins une des positions aminocides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514.
Plus particulièrement, par rapport à la protéine HN de l'isolat Greer et par rapport à
la protéine HN de l'isolat V98, un virus du groupe de l'invention peut présenter au moins l'une des différences de séquence aminoacide HN a) à I) ci-dessus mentionnées. La présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine F présente au moins l'une des douze différences de séquence a) à I) ci-dessus mentionnées, de préférence au moins deux de ces différences, préférablement au moins trois de ces différences, plus préférablement au moins quatre de ces différences, encore plus préférablement au moins cinq de ces différences, très préférablement au moins six de ces différences, et plus particulièrement l'ensemble de ces douze différences.
En sus de cette au moins une différence, la protéine HN dudit virus peut en outre présenter au moins une des différences m) à t) ci-dessus mentionnées.
Parmi les différences présentées par rapport à l'isolat Greer, les positions 316, 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont particulièrement notables, et plus particulièrement les différences de séquence aminoacide HN o) s) et t) ci-dessus mentionnées.
L'isolat Greer présente l'acide aminé S en position 316 de leur protéine HN.
L'isolat Greer ne présente pas de site de glycosylation à cette position.
A cette position, les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent présenter un acide aminé autre que S, et plus particulièrement un acide aminé
autre que S qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N
(asparagine). Les virus du groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc présenter un nouveau site de glycosylation, par rapport à l'isolat Greer.
Par rapport à l'isolat Greer, les virus du groupe phylogénique de l'invention peuvent, alternativement ou complémentairement, se distinguer par le fait que les virus du groupe phylogénique variant de l'invention présentent en positions 515 de la protéine HN une structure tertiaire différente de celle observée chez le virus HPIV2 Greer.
Cette différence structurale est notamment illustrée par la Figure 1, qui présente la structure tertiaire prédite de la protéine HN de virus du groupe phylogénique variant de l'invention. En Figure 1, la flèche A signale une boucle qui, chez la souche Greer (modèle de gauche), est orientée vers l'intérieur de la protéine HN, alors que chez les isolats du groupe phylogénique variant de l'invention (modèle de droite) cette boucle, signalée par une flèche A' n'est pas orientée vers l'intérieur de la protéine, mais est orientée vers l'extérieur de la protéine HN.
Cette bouche correspond aux positions 512-515 de la protéine HN, et plus particulièrement aux positions 513-514 de la protéine HN des isolats de l'invention.
En terme de séquence aminoacide, les acides aminés qui sont en positions 513 et 514 de la séquence de la protéine HN sont, pour l'isolat Greer, S et A, respectivement, alors qu'ils sont N et S, respectivement, pour - les cinq isolats particuliers de l'invention.
La présence d'un acide aminé autre que S, préférentiellement de l'acide aminé
N, en position 513 de la protéine HN, et d'un acide aminé autre que A, préférentiellement de l'acide aminé S, en position 514 de la protéine HN est un moyen de définir les virus faisant partie du groupe phylogénique de variants de l'invention.
Avantageusement, la présente demande est ainsi relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN comprend :
- un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer et qui est aussi différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et - un acide aminé différent de celui présenté par la protéine HN de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides 316, 513, 514, de 5 préférence en position 316 ou en positions 513 et 514, préférentiellement en positions 36, 513 et 514.
Plus particulièrement, la présente demande est relative à tout virus HPIV2, dont la protéine HN présente :
10 - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN a) à I) ci-dessus mentionnées (différences communément présentées par rapport à
l'isolat Greer et à l'isolat V98), de préférence au moins deux de ces différences, préférentiellement au moins trois de ces différences, plus préférentiellement au moins quatre de ces différences, encore plus 15 préférentiellement au moins cinq de ces différences, très préférentiellement l'ensemble de ces douze différences, et - au moins l'une des différences de séquence de protéine HN o) s) t) ci-dessus mentionnées, de préférence la différence o) et/ou les différences s) et t), préférentiellement au moins deux de ces différences, plus 20 préférentiellement au moins les différences s) et t), encore plus préférentiellement les différences o) s) et t).
En résumé, un virus HPIV2 faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut être défini par le fait que :
25 i. la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID NO :, et/ou par le fait que M. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN
des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces SEQ ID
NO :, et/ou par le fait que iii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538, 96, 248, 390, 524 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que iv. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des onze différences de séquence F a) à k), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que v. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F) ; et/ou par le fait que vi. la séquence aminoacide de sa protéine F présente au moins l'une des sept différences de séquence F a) à g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que vii. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sien de la séquence de la protéine F), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que viii. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que ix. la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes : 102, 104, 112, 160 (positions des acides aminés au sein de la séquence de la protéine F), et diffère en outre :
o de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides 32, 247, 538, et/ou o de celle de l'isolat Greer en au moins une des positions aminoacides 32, 96, 247, 248, 390, 524, 538 ; et/ou par le fait que X. la séquence aminoacide de leur protéine F présente au moins l'une des quatre différences de séquence F b) à e), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre :
o au moins l'une des trois différences de séquence F a), f) g), tel que ci-dessus mentionné, et/ou o au moins l'une des différences de séquence F a), f) à k) ci-dessus mentionnées ; et/ou par le fait que xi. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514 (positions des acides aminés au sein de la protéine HN) ; et/ou par le fait que xii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des vingt différences de séquence HN a) à t), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xiii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ; et/ou par le fait que xiv. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et/ou par le fait que xv. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminoacides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminoacides 100, 186, 316, 323, 479, 497, 513, 514; et/ou par le fait que xvi. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à i), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN m) à t), tel que ci-dessus mentionné ; et/ou par le fait que xvii. la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins l'une des positions aminaocides suivantes : 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482, et diffère en outre de celle de l'isolat Greer en au moins l'une des positions aminoacides 316, 513, 514; et/ou par le fait que xviii. la séquence aminoacide de sa protéine HN présente au moins l'une des douze différences de séquence HN a) à I), tel que ci-dessus mentionné, et présente en outre au moins l'une des différences de séquence HN o) s) t), tel que ci-dessus mentionné.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par au moins l'un des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., v. à x., xiii. à xviii, préférentiellement par au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., ii., vii., xiii.
De préférence, un virus du groupe de l'invention est défini par :
- au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous i., vii., et/ou par - au moins l'une des caractéristiques listées ci-dessus sous ii., xiii., par exemple par au moins les caractéristiques i. et ii., et/ou i. et xiii., et/ou vii. et ii., et/ou vii. et xiii.
Cinq isolats qui font partie du groupe phylogénique variant de l'invention, et qui ont été identifiés par les inventeurs, ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ;
C.N.C.M. ; Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ;
France).
Leurs numéros de dépôt sont : 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), I-(isolat 18620), I-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435).
IIs ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le : 10 mai 2007.
Ces isolats ont été isolés à partir d'aspirats nasaux ou de lavages bronchoalvéolaires de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le groupe phylogénique variant de l'invention comprend également I'isolat V94.
L'enseignement de l'art antérieur relatif à V94 incitait clairement la personne du métier à considérer que l'isolat V94 était un isolat très proche de l'isolat Greer, et qu'il ne comportait pas de différence technique significative par rapport à
l'isolat G.reer, à tout le moins aucune.Oifférence technique significative pour la détection, et plus particulièrement le diagnostic de HPIV2.
Par exemple, l'article Skiadopoulos et al. 2003 (Journal of Virology, vol. 77, No. 1, pp. 270-279) fait état du séquençage complet de l'isolat V94, et rapporte des analyses comparatives de sa séquence avec celles des isolats Greer et V98.
Chacune des informations rapportées dans cet article présente l'isolat V94 comme un isolat qui est très proche de l'isolat Greer.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat présenterait des différences structurales par rapport à l'isolat Greer, qui seraient suffisamment significatives pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolat Greer ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
A la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne divulgue que l'isolat présenterait des protéines d'enveloppe, et plus particulièrement des protéines F
et/ou HN, suffisamment différentes de celles de l'isolat Greer, pour considérer qu'un moyen qui permet de détecter l'isolat Greer via la détection de ses protéines d'enveloppe ne permet pas nécessairement de détecter l'isolat V94.
En outre, à la connaissance des inventeurs, aucun art antérieur ne fait état du fait que, ou n'incite la personne du métier à considérer que, l'isolat V94 n'est pas un cas isolé appartenant au passé (l'isolat V94 a été isolé en 1994), mais qu'il fait en fait partie d'un groupe phylogénique particulier, qui est distinct du groupe de HPIV2 dont fait partie l'isolat Greer, et dont des membres peuvent être actuellement isolés sur des patients.
A la connaissance des inventeurs, l'art antérieur ne suggère pas que l'isolat V94, qui a été isolé en 1994, était susceptible d'être phylogénétiquement lié à
d'autres virus HPIV2 susceptibles d'être isolés postérieurement, notamment dans les années 2000, à partir de patients souffrant d'infections respiratoires.
Le concept général de l'existence d'un groupe phylogénique variant de HPIV2, qui comprend plusieurs virus qui ont en commun de présenter une variation au niveau de l'enveloppe telle qu'ils pourraient ne pas être détectés par les moyens traditionnels de diagnostic de HPIV2, n'a donc, à la connaissance des inventeurs, été ni divulgué ni suggéré dans l'art antérieur.
Le fait que les isolats faisant partie de ce groupe phylogénique variant sont trouvés sur des patients actuels, alors que la souche Greer de référence a été isolée en 1955, souligne encore l'intérêt de la présente invention.
Au sein du groupe phy(ogénique variant de l'invention, un sous-groupe phylogénique peut être distingué. Ce sous-groupe comprend l'ensemble des cinq isolats particuliers de l'invention, et ne comprend pas l'isolat V94. Ce sous-groupe phylogénique de l'invention comprend des virus HPIV2, qui sont extrèmement 5 proches les uns des autres.
Par rapport à l'isolat Greer, et plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis par le fait qu'ils ne sont pas reconnus par certains anticorps 10 anti-HPIV2 de l'art antérieur, et plus particulièrement par des anticorps de l'art antérieur qui sont dirigés contre la protéine d'enveloppe HN de virus HPIV2.
Ces anticorps anti-HN de l'art antérieur ont en effet été produits ou construits à
partir d'épitope(s) de la protéine HN de la souche HPIV2 qui servait de référence dans l'art antérieur, à savoir la souche HPIV2 Greer. Or, les inventeurs montrent que la 15 protéine HN des virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention ne comprend pas les mêmes épitopes que la protéine HN de I'isolat Greer. Plus particulièrement, certains épitopes qui sont présents dans la protéine HN de l'isolat Greer ne sont pas présents dans la protéine HN des virus du groupe phylogénique variant de l'invention. De ce fait, les virus du groupe phylogénique variant de 20 l'invention ne sont pas reconnus par certains anticorps anti-HN de l'art antérieur.
Un exemple de tels anticorps anti-HN de l'art antérieur est l'anticorps commercialisé par ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ;
France) sous la référence 12E12G9. Cet anticorps de l'art antérieur reconnaît un épitope sur la protéine HN de I'isolat Greer, qui n'est pas présent dans les virus du 25 sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Alternativement, ou en complément, les virus du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent être définis comme ayant en commun de présenter une substitution de l'acide aminé qui est en position 175 au sein de la séquence de la 30 protéine F, et/ou une substitution de l'acide aminé qui est position 186 de la séquence de la protéine HN.
La position 175 de la protéine F se situe dans le domaine HR1 du polypeptide Ft:-En position 175, l'isolat V94 présente l'acide aminé H(histidine).
La position 186 de la protéine HN est très proche du site catalytique de la protéine, et la nature de l'acide aminé présent à cette position est donc susceptible d'avoir une influence sur l'activité de la protéine.
En position 186 de la protéine HN, l'isolat V94 présente l'acide aminé M (et !'on peut incidemment noter que l'isolat Greer présente également l'acide aminé M
en position 186).
Un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention peut donc être défini par le fait que :
- il fait partie du groupe phylogénique de l'invention tel que ci-dessus défini, par exemple à l'aide d'une ou plusieurs des caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées (telles que pourcentage d'identité de la protéine F et/ou HN, différence(s) de séquence(s) F et/ou HN, structure tertiaire de HN
différente), et en outre par le fait que:
- il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine Hn de l'isolat Greer, et/ou - il présente un acide aminé autre que H en position 175 de la protéine F
et/ou (de préférence, et) un acide aminé autre que M en position 186 de la protéine HN.
De préférence, l'acide aminé en position 175 de la séquence de la protéine F
d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acide aminé R (asparagine).
De préférence, l'acide aminé en position 186 de la séquence de la protéine HN
d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de variants de l'invention est l'acidé aminé ! (isoleucine).
Toutes les combinaisons de caractéristique(s) de groupe et de caractéristique(s) de sous-groupe sont explicitement incluses dans la présente demande.
Par 'exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i., ii., v. à x., xiii. à xviii. ci-dessus listées, et - par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou - en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
Pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, une ou plusieurs dix-huit caractéristiques i. à xviii. peuvent être utilisées, comme indiqué ci-dessus au chapitre de la définition du groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de caractéristiques sont explicitement visées par la présente demande.
Par exemple, un virus HPIV2 qui fait partie du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention peut être défini :
- par le fait qu'il présente au moins l'une des caractéristiques de groupe i.
à
xviii. ci-dessus listées, et - par le fait qu'il présente en outre au moins l'une des caractéristiques de sous-groupe suivantes :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), et/ou - en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, et/ou - il n'est pas reconnu par des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur qui, tel l'anticorps commercialisé par Argene sous la référence 12E12G9, ont été construits et/ou obtenus à partir de la protéine HN de l'isolat Greer.
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que :
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et en outre par le fait que :
- en position 186 de la séquence de la protéine HN, ils présentent un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé 1(isoleucine).
La présente demande est plus particulièrement relative à des virus HPIV2 qui font partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, et qui peuvent être définis par le fait que:
- la séquence aminoacide de leur protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, -et en outre par le fait que :
- en position 175 de la séquence de sa protéine F, ils présentent un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
A titre récapitulatif ou illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 13:
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement communes de la l'isolat présent présent présent chez des aux isolats protéine Greer/Toshiba chez chez isolats du groupe du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe ou sous- V98 V94 phylogénique de groupe de l'invention l'invention Protéine F 112 V V I 1 Tableau 13 (suite et fin) :
Nature de Position Acide aminé Acide Acide Acide aminé
différences au sein présent chez aminé aminé préférentiellement communes de la l'isolat présent présent présent chez des aux isolats protéine GreerlToshiba chez chez isolats du groupe du groupe l'isolat l'isolat ou sous-groupe ou sous- V98 V94 phylogénique de groupe de l'invention l'invention Protéine 201 A A S S
HN 319 s p T T
513 s N N N
5 Un moyen alternatif ou complémentaire pour définir les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans faire nécessairement appel à au moins une des caractéristiques de groupe ci-dessus mentionnées, est le % d'identité que présente la séquence aminoacide de leurs protéines F et/ou HN.
En effet, les virus du sous-groupe phylogénique de l'invention peuvent être définis par le fait que : -- la séquence aminoacide de leur protéine F présente préférentiellement une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou - la séquence aminoacide de leur protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Les virus HPIV2 qui répondent à ces critères d'identité font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention, sans qu'il y ait nécessairement à faire appel à
une des caractéristiques de groupe i. à xviii. ci-dessus mentionnées.
La présente demande est donc relative à tout virus HPIV2 :
i. qui répond à au moins des caractéristiques de groupe i. à xviii., tel que ci-dessus mentionné, et à au moins une des caractéristiques de sous-groupe, tel que ci-dessus mentionné (acide aminé autre que H en position 175 de sa protéine F, préférentiellement, l'acide aminé R ; acide aminé autre que M en position 186 de sa protéine HN, préférentiellement, l'acide aminé I; virus non reconnu des anticorps monoclonaux anti-HN de l'art antérieur), et/ou ii. dont la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences, et/ou iii. dont la séquence âminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides des protéines HN des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
Un virus HPIV2 faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente au moins l'une des ces caractéristiques i. à iii. ci-dessus, par exemple une, deux, ou l'ensemble de ces caractériques.
La demande vise plus particulièrement cinq virus particuliers. Ces cinq virus particuliers sont ceux qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M. le 10 mai 2007, sous les numéros de dépôt 1-3761 (isolat 26056), 1-3762 (isolat 26632), 1-3763 (isolat 18620), 1-3764 (isolat 20283), 1-3765 (isolat 20435). Ils font partie du groupe phylogénique de l'invention, et également du sous-groupe phylogénique de l'invention.
Les paramètres physico-chimiques des protéines F et HN de ces virus particuliers sont prtésentés en tableaux 14 et 15 ci-dessous (paramètres calculés à l'aide du logiciel CLC Free WorkBench version 3.2).
La présente demande est relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F
présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à celle(s) de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique identique à
celle(s) de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
La présente demande est plus particulièrement relative à tout virus HPIV-2 dont la protéine F présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine F d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont la protéine HN présente une valeur de point isoélectrique identique à celle de la protéine HN d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, un virus HPIV-2 de l'invention a une protéine F qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention, et/ou dont une protéine HN qui présente au moins deux paramètres parmi les paramètres de masse moléculaire et/ou de point isoélectrique et/ou d'index aliphatique, dont les valeurs sont identiques respectivement à celles des paramètres d'au moins l'un des virus particuliers de l'invention.
De préférence, lesdits au moins deux paramètres comprennent le paramètre de point isoélectrique.
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La demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence séquence comprend, ou est constituée de (la séquence d'un acide nucléique d'un virus HPIV2 de l'invention; et plus particulièrement) :
5 a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou b) la séquence d'un ADNc (simple-brin ou double-brin) susceptible d'être obtenu par transcription inverse (ou transcription inverse et polymérase) d'un tel ARN génomique, ou 10 c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus, sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
Protéines :
15 La présente demande est relative à toute protéine qui est celle d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Dans la présente demande, le terme protéine comprend dans sa portée les protéines non glycosylées, tout comme les glycoprotéines.
Les virus qui font partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention présente une enveloppe virale différente de celle habituellement observée dans l'art antérieur, plus particulièrement différente de celle de l'isolat Greer, préférentiellement différente de celles des isolats Greer, Toshiba et V98.
L'enveloppe des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention est en outre différente de celle de l'isolat V94.
La présente demande est donc relative à tout protéine d'enveloppe d'un virus qui fait partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Cette protéine d'enveloppe peut être, ou comprendre, la protéine F d'un tel virus et/ou la protéine HN d'un tel virus.
La présente demande est plus particulièrement relative aux protéines d'enveloppe qui sont spécifiques des virus du sous-groupe de l'invention, préférentiellement des cinq isolats particuliers de l'invention qui ont été déposés auprès de la CNCM
sous les numéros 1-3761 à 1-3765.
Ladite protéine F présente un certain nombre de différence(s) par rapport à
une protéine F de l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F
des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
Par exemple, la séquence de cette protéine F peut présenter un certain nombre de substitution(s) d'acide(s) aminé(s), par rapport à la séquence de la protéine F de l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba et V98, préférentiellement par rapport aux protéines F des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
Chacune des définitions des protéines F et HN ci-dessus présentées au chapitre de la définition des virus selon l'invention s'appliquent naturellement aux protéines F et HN en tant que telles.
Ainsi, comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, les protéines F et HN
peuvent être définies par une combinaison d'au moins une caractéristique de groupe (au moins une différence par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98) et au moins une caractéristique de sous-groupe (au moins une différence par rapport à l'isolat V94).
Par exemple, parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F
d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent notamment être citées les différences suivantes, qui sont relatives au site de clivage de la protéine F (positions 102 à 106 de la séquence complète de la protéine F; cf. CS en Figure 4):
- en position 102, un acide aminé autre que T (thréonine), préférentiellement l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, un acide aminé autre que Q (glutamine), préférentiellement l'acide aminé R (arginine).
De préférence, ladite protéine F comprend à la fois l'acide aminé P en position 102 et l'acide aminé R en position 104.
En position 102, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé T
(thréonine), et non l'acide aminé P.
En position 104, les isolats Greer, Toshiba et V98 présentent l'acide aminé Q
(glutamine), et non l'acide aminé R.
De préférence, ladite protéine F présente l'acide aminé E en position 105.
Avantageusement, la séquence de ce site de clivage est KPRRER (SEQ ID NO:
14).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 112, un acide aminé autre que V (valine), préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine), et/ou - en position 160, un acide aminé autre que D (acide aspartique), préférentiellement l'acide aminé T (théonine).
La position 112 se situe dans le peptide de fusion (FP) ; la position 160 se situe dans le domaine HR1 du polypeptide F1.
En position 112, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé V (valine).
En position 160, les isolats Greer et V98 présentent l'acide aminé D (acide aspartique).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F d'un isolat de l'invention, par rapport à l'isolat Greer, plus particulièrement par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, peuvent être alternativement ou complémentairement citées les différences suivantes :
- en position 32, un acide aminé autre que I(isoleucine), préférentiellement l'acide aminé V, - en position 247, un acide aminé aùire que N, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 538, un acide aminé autre que F, préférentiellement l'acide aminé V, La dite protéine F de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, ou plus, voire l'ensemble des différences ci-dessus mentionnées. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande.
La protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut, en sus de la ou des différence(s) ci-dessus mentionnée(s), présenter une ou des différence(s) par rapport à la protéine F de l'isolat V94.
Avantageusement, la protéine F d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente un acide aminé autre que H en position 175, préférentiellement l'acide aminé R (mutation H175R).
Parmi les différences qui peuvent être identifiées sur la protéine F par rapport à
l'isolat V94, peuvent notamment être citées les différences particulières suivantes :
- en position 4, un acide aminé autre que L, préférentiellement l'acide aminé
P, et/ou - en position 403, un acide aminé autre que N, préférentiellement l'acide aminé T, et/ou - en position 516, un acide aminé autre que V, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine).
Par exemple :
- l'isolat 20283 de l'invention présente la substitution L4P et la substitution V5161, par rapport à l'isolat V94, et également par rapport à l'isolat Greer, - l'isolat 26056 de l'invention présente la substitution N403T, par rapport à
l'isolat V94, - l'isolat 20435 présente la substitution V5161 par rapport à l'isolat V94, et également par rapport à l'isolat Greer.
La dite protéine F de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peut présenter une, deux, trois, des différences ci-dessus mentionnées, en sus d'au moins une différence de séquence F par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98. Toute combinaison de ces différences est explicitement visée par la demande.
Des virus HPIV2 faisant partie du groupe ou, le cas échéant, du sous-groupe phylogénique variant de l'invention peuvent donc être des variants qui présentent la(Ies) mutation(s) V1121 et/ou D160T au sein de la protéine F par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98 et la mutation H175R au sein de la protéine F
par rapport à l'isolat V94.
Comme indiqué ci-dessus au chapitre des virus, des différences au niveau des protéines F permettent de distinguer une protéine F d'un virus du sous-groupe de l'invention, sans avoir nécessairement à combiner cette différence avec une différence de groupe. Il s'agit donc de différences spécifiques particulières, qui distinguent les protéines F des virus du sous-groupe de l'invention, tels que les cinq isolats particuliers déposés auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à
I-3765, des isolats Greer, Toshiba, V98 et V94.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine F, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (protéine F des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44 (cf tableau 5).
Une protéine d'enveloppe de l'invention peut être, ou comprendre, la protéine HN
d'un virus faisant partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, plylogénique variant de l'invention.
Cette protéine HN peut présenter au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants (éléments de différence par rapport aux protéines HN des isolats Greer, Toshiba et V98) :
- en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E, - en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, 5 - en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S, - en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T, - en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), 10 - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M, - en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
15 Une protéine HN d'un virus faisant partie du sous-groupe phylogénique de l'invention présente en outre au moins une différence par rapport à la protéine HN
de l'isolat V94.
Préférentiellement, cette protéine HN présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
20 L'isolat V94 présente l'acide aminé M en position 186. L'isolat Greer présente également l'acide aminé M en position 186.
Les cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été déposés auprès de la C.N.C.M., présentent quant à eux l'acide aminé I(isoleucine) en position 186.
La présente demande est donc relative à toute protéine HN qui présente au moins 25 l'un des éléments de différences listés ci-dessus, par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, et qui présente un acide aminé autre que M en position 186.
La présente demande est plus particulièrement relative à toute protéine HN, dont la séquence aminoacide présente une identité de plus de 99,15%, de préférence 30 d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec la séquence aminoacide de la protéine F d'au moins un des isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire avec au moins une des séquences de SEQ ID NO: 26, 31, 36, 41 (protéine HN des isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement), et de préférence avec chacune de ces séquences.
La présente demande et plus particulièrement relative aux protéines, et plus particulièrement aux protéines d'enveloppe, qui comprennnent au moins une protéine dont la séquence est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (cf. tableau 5).
Fraaments de protéines :
La présente demande est également relative aux fragments des protéines d'enveloppe des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement aux fragments des protéines F et HN des virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Sont plus particulièrement visés ceux des fragments de protéine, qui sont spécifiques des virus du sous-groupe phylogénique de l'invention, et plus particulièrement des cinq isolats particuliers de l'invention, qui ont été
déposés auprès de la CNCM sous les nuémros 1-3761 à 1-3765.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi :
- le fragment partie extracellulaire, - le fragment polypeptide F2, - le fragment site de clivage (CS), - le fragment peptide de fusion (FP), - le fragment domaine HR1, - le fragment domaine HR2, - le fragment polypeptide F1, - le fragment partie transmembranaire, - le fragment partie intracytoplasmique de ces protéines F.
La Figure 4 donne une présentation schématique de tels fragments.
Ces fragments s'étendent des positions suivantes, calculées à partir de la séquence des protéines F complètes :
Tableau 12 : position des-fragments dans la séauence complète de la protéine F
Fragments de ces 1 er acide Dernier protéines F aminé acide aminé
Partie extracellulaire 1 486 Polypeptide F2 1 100 Site de clivage (CS) 101 106 Peptide de fusion (FP) 107 126 Domaine HR1 133 177 Domaine HR2 451 484 Polypeptide F1 101 486 Partie 487 518 transmembranaire Partie 519 551 intracytoplasmique Les séquences des protéines F complètes des cinq isolats particuliers de l'invention sont les séquences de SEQ ID NO: 24, 29, 34, 39, 44 (isolats 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement).
La présente demande est relative à toute protéine, polypeptide, peptide (glycosylé
ou non), qui comprend au moins (ou qui est constitutée de) la séquence du site de clivage des protéines F des virus de l'invention, c'est-à-dire la séquence KPRRER
(SEQ ID NO : 14).
Une telle protéine, ou le cas échéant un tel polypeptide ou peptide peut être d'origine virale, plus particulièrement issu de l'enveloppe d'un virus, de préférence d'un virus HPIV-2.
La présente demande vise notamment toute protéine F, de préférence toute protéine F de HPIV2, qui comprend la séquence du site de clivage de SEQ ID NO
:
14.
Parmi les fragments de protéines F de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est par ailleurs plus particulièrement relative à ceux des fragments dont la séquence de ce fragment comprend au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était (étaient) à l'une des positions suivantes : positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
La taille dudit fragment est d'au moins 10 acides aminés. Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 550. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non-humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H).
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine F de l'invention a conservé l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 160 (acide aminé autre que D, tel que T), et a en outre conservé
l'acide aminé qui, dans la protéine F dont le fragment dérive, était à la position 175 (acide aminé autre que H, tel que R).
Parmi les fragments de protéines HN de virus du groupe phylogénique variant, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention, la présente demande est plus particulièrement relative à ceux des fragments qui comprennent, ou sont constitués d'au moins un fragment choisi parmi les fragments d'au moins 10 acides aminés, et a conservé au moins un acide aminé (de préférence au moins deux acides aminés) qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était (étaient) à
l'une des positions suivantes : -57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
De tels fragments peuvent avoir en outre conservé au moins un, de préférence au moins deux, plus préférentiellement les trois, acide(s) aminé(s) parmi ceux qui, dans la séquence complète de la protéine HN dont le fragment dérive, étaient :
- à la position 316 (acide aminé autre que S), - à la position 513 (acide aminé autre que S), - à la position 514 (acide aminé autre que A).
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 316.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
De préférence, un tel fragment a conservé au moins l'acide aminé qui était à
la position 316, au moins l'acide aminé qui était à la position 513, et au moins l'acide aminé qui était à la position 514.
Les fragments de protéine de l'invention sont notamment des candidats d'intérêt pour la production d'anticorps spécifiques des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, et/ou pour l'identification des épitopes de tels anticorps.
La taille dudit fragment de protéine HN est d'au moins 10 acides aminés.
Préférentiellement, cette taille est d'au moins un nombre entier choisi entre 11 et 570. Plus préférentiellement, cette taille est d'au moins 14, encore plus préférentiellement d'au moins 19.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à être reconnu par un anticorps qui se lie spécifiquement aux virus du groupe phylogénique variant de l'invention, ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Très préférentiellement, ce fragment a conservé la capacité à induire la production d'anticorps, lorsqu'il est injecté à un mammifère, de préférence un mammifère non-humain, de préférence en présence d'alun.
Avantageusement, un fragment d'au moins 10 acides aminés de protéine HN de l'invention a en outre conservé l'acide aminé qui, dans la protéine HN dont le fragment dérive, était à la position 186 (acide aminé autre que M).
Acides nucléiques codant protéines et petits fragments =
La présente demande est également relative aux acides nucléiques, dont la séquence code au moins une protéine d'enveloppe selon l'invention, ou au moins un fragment de protéine d'enveloppe selon l'invention, en tenant compte de la dégénérescence du code génétique universel.
Ces acides nucléiques peuvent être de l'ADN ou de l'ARN.
Ladite protéine d'enveloppe peut être une protéine F et/ou HN de l'invention.
Ces acides nucléiques codent une protéine d'enveloppe, ou un fragment de protéine d'enveloppe, d'au moins l'un des virus du group ou du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention présentent une ou des différences par rapport aux isolats Greer, toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à
l'isolat Greer.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F et/ou une protéine HN peuvent présenter la(les) différence(s) nucléotidique(s), qui correspondent à la (aux) différence(s) aminoacide(s) identifiées ci-dessus pour les protéines et fragment de protéine de l'invention, en suivant le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F présentent au moins une, de préférence aù moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 94-96, un codon codant un acide aminé autre que I;
préférentiellement un codon codant l'acide, aminé V, - en positions 304-306, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé P, - en positions 310-312, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R, - en positions 334-336, un codon codant un acide aminé autre que V, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I, - en positions 478-480, un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T, - en positions 739-741, un codon codant un acide aminé autre que N, préférentiellement un codon codant l'acide aminé K, - en positions 1612-1614, un codon codant un acide aminé autre que F, préférentiellement un codon codant l'acide aminé V.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en positions 169-171, un codon codant un acide aminé autre que D, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 340-342, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A, - en positions 415-417, un codon codant un acide aminé autre que K, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 583-585, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé A, - en positions 601-603, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé S, - en positions 955-957, un codon codant un acide aminé autre que P, préférentiellement un codon codant l'acide aminé T, - en positions 1030-1032, un codon codant un acide aminé autre que E, préférentiellement un codon codant l'acide aminé K, - en positions 1042-1044, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé I, - en positions 1132-1134, un codon codant un acide aminé autre que A, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 1135-1137, un codon codant un acide aminé autre que R, préférentiellement un codon codant l'acide aminé E, - en positions 1438-1440, un codon codant un acide aminé autre que T, préférentiellement un codon codant l'acide aminé M, - en positions 1444-1446, un codon codant un acide aminé autre que Q, préférentiellement un codon codant l'acide aminé R.
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du groupe phylogénique variant de l'invention.
Les acides nucléiques de l'invention qui sont ceux de virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention présentent au moins une des différences ci-dessus par rapport aux isolats Greer, Toshiba et V98, et plus particulièrement par rapport à l'isolat Greer, et en outre au moins une différence par rapport à l'isolat V94.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins une, de préférence au moins deux, plus préférentiellement l'ensemble des différences suivantes :
- en position 33, un nucléotide autre que T, préférentiellement le nucléotide C (par exemple, le codon 31-33 de l'isolat V94 est ATT, alors que dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATC), - en position 525, un nucléotide autre que A, préférentiellement le nucléotide G
(par exemple, le codon 524-526 de l'isolat V94 est CAC, codant l'acide aminé H
en position 175 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est CGC, codant l'acide aminé R en position 175), - en position 1479, un nucléotide autre que C, préférentiellement le nucléotide A
(par exemple, le codon 1479-1481 de l'isolat V94 est ATC, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine F.
De préférence, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine F
présentent au moins la différence ci-dessus mentionnée pour la position 525.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Par rapport à l'isolat V94, les acides nucléiques de l'invention qui codent une protéine HN de virus du sous-groupe phylogénique de l'invention présentent au moins la différence suivante :
- en position 558, un nucléotide autre que G, préférentiellement A (par exemple, le codon 556-558 est ATG dans l'isolat V94, codant pour l'acide aminé M en position 186 de la protéine, alors que, dans les cinq isolats particuliers de l'invention, ce codon est ATA, codant l'acide aminé I-isoleucine- en position 186).
Les positions indiquées sont celles calculées sur la séquence codante la protéine HN.
Ces acides nucléiques sont des acides nucléiques de virus faisant partir du sous-groupe phylogénique variant de l'invention.
Toutes les combinaisons de différences nucléotidiques sont explicitement visées par la présente demande.
A titre récapitulatif et illustratif, le tableau suivant peut être présenté :
Tableau 16:
Positions Par rapport à-l'isolat Par rapport aux Par rapport à
de Greer/Toshiba isolats I'isolat V94 différences Greer/Toshiba et communes V98 aux isolats Acide Codon du Acide Codon du Acide Codon du groupe aminé CDS aminé CDS aminé du CDS
ou sous-groupe de l'invention Protéine F 112 334-336 112 334-336 -Protéine 201 601-603 201 601-603 -La présente demande vise plus particulièrement les acides nucléiques qui codent les protéines F et/ou HN des cinq isolats particuliers de l'invention, c'est-à-dire les 5 acides nucléiques dont la séquence comprend, ou est constituée, d'une séquence parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40 (cf. tableau 5).
Applications pour la détection de HPIV2, et plus particulièrement pour son 10 diagnostic (moyens immunologigues ou moléculaires) :
Partant de l'identification, de la description et de la caractérisation du groupe phylogénique variant et du sous-groupe phylogénique variant, les inventeurs proposent de nouveaux moyens de détection de HPIV2, et plus particulièrement de 15 nouveaux moyens pour le diagnostic de HPIV2.
Les nouveaux moyens de détection, et plus particulièrement de diagnostic, de HPIV2 de l'invention permettent de détecter l'ensemble des virus du groupe phylogénique variant de l'invention.
20 L'invention propose notamment des moyens qui permettent leur détection et/ou leur diagnostic de manière spécifique, c'est-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
L'invention propose en outre des moyens qui permettent la détection et/ou le diagnostic des virus qui font partie du sous-groupe phylogénique de l'invention de 25 manière spécifique, c'èst-à-dire sans détection des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et sans détection de l'isolat V94.
Moyens immunolopigues :
La présente demande est également relative à des anticorps, qui se lient à
l'enveloppe de virus HPIV2.
La présente demande est également relative à des fragments de tels anticorps qui ont conservé la capacité de se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2.
Le terme fragment d'anticorps comprend notamment les fragment Fab, F(ab)'2, Fv, les CDR1, CDR2, CDR3, ainsi que les constructions dérivant de tels fragments tels que des scFv ou des anticorps humanisés.
L'expression se lier est ici utilisée dans son sens habituel dans le contexte des liaisons anticorps-antigène.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps, qui se lient à l'enveloppe d'au moins un virus du groupe phylogénique variant de l'invention, de préférence d'au moins l'un des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., de préférence d'au moins deux, trois ou quatre, plus préférentiellement de ces cinq virus.
La présente demande est plus particulièrement relative à de tels anticorps ou fragments d'anticorps qui ne se lient pas à l'enveloppe de l'isolat HPIV2 Greer (la séquence de l'isolat Greer est disponible auprès de Genbank sous le numéro d'accès NC_003443, et est reproduite dans la présente demande, après la partie exemples , point B.2.), et plus particulièrement sans se lier à une protéine d'enveloppe des isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98.
De préférence, cet anticorps ne se lie à aucun microorganisme qui ne serait pas un virus HPIV2.
De préférence, un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention est un anticorps spécifique des virus faisant partie du groupe phylogénique variant de l'invention.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée d'une protéine F.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine-F de l'invention et/ou à un fragment de protéine F de l'invention. Les caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines F et les fragments de protéines F
de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines F et des fragments de protéines F qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention.-Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine F
en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 96, 102, 104, 112, 160, 247, 248, 390, 524, 538, plus particulièrement en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
De préférence, ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 de l'invention comprend, ou est constituée, d'une protéine HN.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut se lier à une protéine HN
de l'invention et/ou à un fragment de protéine HN de l'invention. Les caractéristiques ci-dessus décrites pour définir les protéines HN de l'invention s'appliquent naturellement à la définition des protéines HN et des fragments de protéines HN de l'invention qui sont les cibles épitopiques des anticorps et fragment d'anticorps de l'invention.
Avantageusement, ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend :
- au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situent en positions 316, 513, 514 (par exemple, un épitope de protéine HN comprend les acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, qui se situe en positions 513-514, ou 512-515), et/ou - au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 100, 114, 139, 186, 195, 201, 319, 323, 344, 348, 378, 379, 479, 480, 482, 497, plus particulièrement en positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
Plus particulièrement encore, la demande est relative à des anticorps ou fragments d'anticorps, qui sont spécifiques des virus faisant partie du sous-groupe phylogénique variant de l'invention. De tels anticorps ne se lient donc pas à
l'isolat HPIV2 V94.
Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut notamment se lier à une protéine F
d'au moins l'un des virus du sous-groupe phylogénique variant en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en position 175.
Un anticorps ou fragment d'anticorps de l'invention peut naturellement porter un marquage pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage fluorsecent ou enzymatique.
La présence demande est également relative à des hybridomes produisant de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à des cellules transfectées, infestées ou transformées, qui produisent de tels anticorps ou fragments d'anticorps.
La présente demande est également relative à toute composition qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention, avec éventuellement au moins un véhicule pharmaceutique acceptable.
La présente demande est également relative à tout kit, plus particulier tout kit de diagnostic, qui comprend au moins un anticorps, fragment d'anticorps, hybridome, cellule transfectée, infectée ou transformée de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment :
- des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les Greer, Toshiba, V98, et/ou - des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1, HPIV3, HPIV4, et/ou - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
La présente demande est également relative à une méthode pour produire un anticorps capable de se lier à au moins un virus du groupe, ou le cas échéant, du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, et plus particulièrement à
au moins l'un des cinq isolats particuliers déposés par les inventeurs auprès de la C.N.C.M., et de préférence à ces cinq isolats particuliers. De préférence, les anticorps ainsi produits sont des anticorps spécifiques de ces virus.
Cette méthode peut comprendre l'administration à un mammifère (de préférence, un mammifère non-humain) d'au moins un des cinq isolats particuliers de l'invention, de préférence les cinq isolats particuliers de l'invention, et éventuellement également l'isolat V94, et/ou d'au moins une protéine d'enveloppe ou d'au moins un fragment de protéine d'enveloppe de l'invention, tel que par exemple un fragment de protéine HN qui a conservé l'acide aminé qui, dans la séquence de la protéine HN, était en position 316 et/ou les deux acides aminés qui, dans la séquence de la protéine HN, était en positions 513 et 514.
L'administration est réalisée de telle sorte que le(s) virus, protéine(s), fragment(s) de protéine(s) administré(s) induisent la production d'anticorps par le mammifère qui le(s) reçoit.
Cette administration peut être faite avec un adjuvant susceptible d'augmenter l'immunogénicité tel qu'un alun.
Les anticorps produits sont alors recollectés, et de préférence isolés.
Des anticorps monoclonaux peuvent être produits selon les techniques connues de la personne du métier.
Moyens moléculaires :
Acides nucléiques de référence (grands fragments d'acides nucléiques) :
Les inventeurs ont sélectionné des acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'au moins l'un des isolats de l'invention, de préférence de l'ensemble des isolats de l'invention.
Les acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique de l'ensemble des isolats de l'invention permettent de détecter l'ensemble des isolats susceptibles de faire partie du groupe phylogénique variant.
5 La présente demande est relative à des acides nucléiques qui sont spécifiques d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, dont ne font pas partie les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et qui sont spécialement adaptés à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce groupe ou sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production de 10 sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique.
Ces acides nucléiques sont des fragments d'au moins un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique de l'invention, dont font partie les cinq isolats particuliers qui ont été déposés par les inventeurs.
15 Ces acides nucléiques s'hybrident avec un ou plusieurs des virus du groupe, ou sous-groupe, phylogénique de l'invention dans des conditions de forte stringence.
Des conditions de forte de stringence sont des conditiosn connues de la personne du métier, par exemple des conditions d'hybridations sur ADN lié à un flitre dans SSC 5X, dodecyl sulfate de sodium (SDS) 2%, 100 microgrammes/mL d'ADN
20 simple-brin, à 55-65 C pendant 8 heures, et lavage dans SSC 02X et SDS 0,2%
à
60-65 C pendant 30 minutes.
De préférence, de tels acides nucléiques ne s'hybrident à àucun microorganisme autre que HPIV2 dans des conditions de forte stringence.
De préférence, dans des conditions de forte stringence, de tels acides nucléiques 25 ne s'hybrident pas à des isolats HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe phylogénique de l'invention, tels que les isolats Greer, Toshiba et V98.
De tels acides nucléiques sont alors des acides nucléiques qui s'hybrident spécificiquement à un, de préférence à plusieurs, plus préférentiellement à
30 l'ensemble, des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Un tel acide nucléique peut être caractérisés par le fait que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F
et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon la revendication 1, ou - la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment. -De préférence, ledit fragment est un fragment d'au moins 133, 134, 135, 136, nucléotides (par exemple des fragments de 137, 180, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 137, 208, 210 nucléotides, ou des fragments de 180 nucléotides).
Plus préférentiellement, ledit fragment est un fragment d'au moins 170, 175, nucléotides (par exemple, 180, 208, 210 ou 180, ou 208, 210 nucléotides).
Par exemple, ledit fragment est un fragment d'au moins 240 nucléotides.
Avantageusement, notamment pour la construction et la production d'amorces et sone(s) adaptées à une mise en ceuvre en amplification temps réel, ledit fragment est un fragment d'au plus 400 nucléotides.
De préférence, ladite séquence codant la protéine F est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 23, 28, 33, 38, 43, et/ou en ce que ladite séquence codant HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 25, 30, 35, 40, et/ou ladite séquence codant les protéines F et HN est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO : 22, 27, 32, 37, 42.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 86.
La demande est notamment relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production de sondes ou d'amorces spécifiques du groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 de l'invention, qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, caractérisé en ce que cet acide nucléique comprend, ou est constituée de:
a) au moins une séquence choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 57 à 86, ou b) un fragment conservateur d'au moins l'une des séquences visées sous a), ledit fragment conservateur comprenant, ou étant constitué d'au moins une séquence choisie parmi :
- les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 259 à 395 des séquences codant F
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 234 à 443 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 241 à 420 des séquences codant HN
des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 961 à 1140 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 1381 à 1560 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, - les séquences qui s'étendent des positions 1466 à 1673 des séquences codant HN des virus du groupe ou sous-groupe de l'invention, ou c) la séquence complémentaire de l'une des séquences visées sous a) et b), sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
La présente demande est plus particulièrement relative à un acide nucléique, qui est spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en oruvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique de variants HPIV2.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression acides nucléiques temps réel , par souçi de simplification.
Un tel acide nucléique peut être défini par le fait que sa séquence comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
De préférence, ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :62 à 66, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :67 à 70, et/ou ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO :83 à 86.
La séquence dudit acide nucléique séquence peut alors comprendre, ou être constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
La présente demande est également relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
De tels acides nucléiques pourront, dans la présente demande, être désignés par l'expression acides nucléiques puces , par souçi de simplification.
La séquence d'un tel acide nucléique avantageusement comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F et/ou de la séquence codant HN d'un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
La présente demande est donc relative à des acides nucléiques, qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production d'au moins une sonde qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus dudit groupe ou sous-groupe phylogénique variant, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
Avantageusement, la séquence d'un tel acide nucléique comprend, ou est constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID
déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
De préférence, la séquence d'un tel acide nucléique est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82.
Amorces et sondes, spécialement dapatées à une amplification en temps réel :
La présente demande est également relatives à des paires d'amorces et des sondes qui peuvent leur être associées pour une en oauvre en amplification temps réel, de préférence en PCR temps réel.
La présente demande est relative à une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique variant de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Une paire d'amorces de l'invention peut notamment être définie par le fait que les séquences de chacune des amorces de cette paire sont telles qu'elles permettent l'amplification d'un acide nucléique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans amplifier un acide nucléique des virus HPIV2 Greer, Toshiba et V98, lorsque cette paire d'amorces est placée en contact avec le matériel ARN dudit au moins un des cinq virus de la revendication 1, et d'autre part avec le matériel ARN
de chacun desdits virus Greer, Toshiba et V98, par exemple dans quatre tubes distincts, en présence des réactifs de RT-PCR appropriés, tels que par exemple :
- tampon TaqMan EZ 5X (250 mM bicine -N,N-bis(2-hydroxyéthyle glycine); 575 mM acétate de potassium ; 0,05 mM EDTA ; 40% glycérol; pH 8,2) : pour une concentration finale de 1 X, - acétate de manganèse (25 mM) : pour une concentration finale de 2 à 5 mM, par exemple une concentration finale de 3 mM, - dATP, dCTP, dGTP : pour une concentration finale de 300 pM chacun, - dUTP : pour une concentration finale de 600 pM, - AmpErase UNG : pour une concentration finale de 0,01 U/pL, - 500 nM de chaque amorce de la paire testée, - 10 pg à 100 ng de l'ARN viral, 5 - polymérase thermostable, présentant une activité transcriptase inverse et une activité de ADN polymérase, telle que la rTth polymérase (disponible par exemple auprès de Applied Biosystems sous la référence produit N808-0192) : pour une concentration finale de 0,1 U/pL, - H20 déminéralisée et sans ARN, 10 et sous des conditions de RT-PCR appropriées, telles que par exemple les conditions expérimentales suivantes :
- activité de l'AmpErase UNG (enzyme uracyl N-glycosy(ase ; CE 3.2.2) : 50 C
pendant 2 min, - réverse transcription (rTth polymérase) à 60 C pendant 30 min, 15 - désactivation de l'AmpErase UNG : 95 C pendant 10 min, - PCR : 25 à 40 cycles de - dénaturation à une température de 95 C à 97 C pendant 15 secondes, - annelage et extension à une température qui, de préférence, est de 15 C à
5 C inférieure à la valeur réelle de la température de fusion (Tm) de la paire 20 d'amorces testée et qui est, de préférence, supérieure à 55 C, par exemple à une température de 55 C à 70 C, par exemple 60 C, pendant 1 min.
Le mélange réactionnel commercialisé par Applied Biosystems sous la désignation Taqman EZ RT-PCR kit est une exemple de kit fournissant un milieu 25 réactionnel approprié.
II convient alors de déterminer si la paire d'amorces testée amplifie bien au moins un des cinq virus de l'invention, sans amplifier les isolats Greer, Toshiba et V98, c'est-à-dire si la paire d'amorces testée a conduit à la production d'un amplicon à
30 partir du matériel ARN d'au moins un des cinq virus de l'invention, et n'a pas conduit à la production d'un amplicon à partir du matériel ARN de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98.
. Tout moyen que la personne du métier trouvera adapté à la détection de la présence ou de l'absence d'un amplicon peut être mis en ceuvre.
Un moyen simple, qui ne nécessite pas la production d'une sonde de détection, peut comprendre l'électrophorèse des acides nucléiques (par exemple, sur gel d'agarose à 1%) en présence de bromure d'éthidium et l'analyse visuelle ou densitométrique des bandes résultantes après irradiation aux ultra-violets.
Les paires d'amorces appropriées sont celles :
- dont chacune des deux amorces parvient à s'hybrider à une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins l'un des cinq virus de l'invention, de préférence de chacun des cinq virus de l'invention, de telle sorte à
permettre l'amplification de la région bornée par chacune de ces deux amorces, et - dont au moins une des deux amorces ne trouve pas de cible sur le matériel nucléotidique de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98, qui permettrait l'amplification d'une région du matériel nucléotidique de chacun des isolats Greer, Toshiba et V98.
Des paires d'amorces candidates peuvent donc être choisies parmi celles dont au moins une des deux amorces présente une cible sur le matériel nucléotidique d'au moins un des cinq virus de l'invention, et de préférence sur chacun des cinq virus de l'invention, qui ne se retrouve pas à l'identique dans le matériel nucléotidique des isolats Greer, Toshiba et V98 (au moins une différence nucléotidique).
On choisira de préférence des paires d'amorces :
- qui contiennent de 14 à 30 nucléotides, - dont le contenu en G+C est de 20 à 80%, - dont la température de fusion (Tm) est de 58 C à 60 C pour chaque amorce, et - dont les cinq derniers nucléotides à l'extrémité 3' de chaque amorce ne comprennent pas plus de deux bases G et/ou C.
La construction de paires d'amorces est une technique connue de la personne du métier. Des moyens automatisés sont d'ailleurs disponibles à cette fin, tels que le logiciel Primer Express version 3 ou supérieure, commercialisé par Applied Biosystems.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent être celle d'un fragment 5' de la séquence amplifiée à partir de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment 5' de la séquence complémentaire de cette séquence amplifiée (fragments 5' comprenant le tout premier nucléotide à l'extrémité
5').
Dans ce cas, les séquences des paires d'amorces appropriées sont celle d'un fragment de ia séquence de l'un au moins des cinq virus de l'invention, et celle d'un fragment de la séquence complémentaire de cette séquence virale.
Les séquences des paires d'amorces appropriées peuvent également être des séquences variantes de tels fragments, susceptibles d'être obtenues par substitution et/ou addition et/ou délétion d'au moins un nucléotide de la séquence de ces fragments, et qui ont conservé la capacité à amplifier au moins l'un des cinq virus de l'invention, sans amplifier Toshiba, Greer et V98. De préférence, de telles séquences variantes ont conservé au moins une différence nucléotidique par rapport à l'ensemble de leurs cibles potentielles dans chacun des isolats Greer, Toshiba, et V98.
Il est préférable d'extraire l'ARN des virus avant de les mettre en contact avec la paire d'amorces testée, de sorte à rendre cet ARN facilement accessible à
cette paire d'amorces. Des moyens permettant d'extraire le matériel ARN de virus sont connus de la personne du métier. Par exemple, un échantillon de virus peut être traité par un tampon d'extraction contenant du thiocyanate de guanidium 4M, de la N-lauryle sarcosine 0,5%, du dithiothréitol 1 mM, du citrate de sodium 25 mM, et du glycogène à 0,1 mg par mL, puis par précipitations à l'isopropanol et à
l'éthanol 70%.
De préférence, ladite paire d'amorces amplifie un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs auprès de la CNCM sous les numéros 1-3761 à 1-3765.
Avantageusement, une paire d'amorces de l'invention est telle que :
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temsp réel de l'invention, et en ce que - la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à
30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique temps réel sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à
l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est capable d'amplifier un acide nucléique de chacun des cinq virus particuliers déposés par les inventeurs, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
Dans une paire d'amorces de l'invention, chacun desdits fragments 5' est (indépendamment l'un de l'autre) constitué de (14 à 30 nucléotides, de préférence de) 18 à 23 nucléotides.
De préférence, une paire d'amorces de l'invention est constituée (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous) :
- d'une amorce de SEQ ID NO: 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 91, et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
La présente demande est également relative à tout ensemble d'amorces qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention.
La présente demande est également relative à toute amorce, qui est telle que choisie au sein d'une paire d'amorces de l'invention.
La présente demande est également relative à une sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'invention, pour la détection spécifique d'au moins un virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention.
Avantageusement, une telle sonde temps réel présente une séquence (d'hybridation) qui est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique temps réel de l'invention, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment. -De préférence, ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 14 à 30 nucléotides, de préférence de 23 à 28 nucléotides.
Avantageusement, une telle sonde temps réel est choisie parmi les séquences de SEQ ID NO: 89, 90, 93, 94, 97, 98 (cf. tableaux 8 et 9 ci-dessous).
Une telle sonde peut porter un marquage, par exemple pour faciliter sa détection, tel qu'un marquage radioactif, fluorescent ou enzymatique.
Une telle sonde peut avantageusement porter un marquage fluorescent et un quencher, de sorte à être adaptée à une utilisation en tant que sonde type Taqman ou de type beacon ou de type Scorpion . Une telle sonde pourra alors comporter des bras qui ne s'hybrident pas aux virus HPIV2, et qui sont destinés à
former des bras beacon.
La présente demande est également relative à un ensemble d'oligonucléotides, qui comprend au moins une paire d'amorces temps réel selon l'invention et au moins une sonde temps réel selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 87-88, et la sonde de SEQ ID NO : 89 ou 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO: 91-92, et la sonde de SEQ ID NO : 83 ou 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 95-96, et la sonde de SEQ ID NO : 87 ou 98.
Un ensemble selon l'invention peut par exemple comprendre au moins une paire d'amorces selon l'invention, et au moins deux sondes temps réel selon l'invention.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 87-88, la sonde de SEQ ID NO: 89 et la sonde de SEQ ID NO : 90.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 91-92, la sonde de SEQ ID NO: 83 et la sonde de SEQ ID NO : 94.
Avantageusement, un tel ensemble comprend au moins la paire d'amorces de SEQ ID NO : 95-96, la sonde de SEQ ID NO: 87 et la sonde de SEQ ID NO : 98.
La présente demande est également relative à un kit pour le diagnostic d'une affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'invention et/ou au moins une sonde selon l'invention.
La présente demande est également relative à un système d'amplification, qui est spécialement adaptée à une amplification temps réel, qui comprend au moins une paire d'amorces de l'invention et au moins une sonde selon l'invention, et plus particulièrement au moins une paire d'amorces selon l'invention et au moins une 10 sonde selon l'invention qui est capable de s'hybrider sur l'amplicon produit par cette paire d'amorces à partir de l'acide nucléique d'un virus du groupe, ou sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
La présente demande est également relative à toute composition et plus 15 particulièrement à toute composition pharmaceutique ou biologique, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système temps réel de l'invention.
La présente demande est également relative à un kit qui est spécialement adapté
20 à la détection de HPIV2, plus particulièrement à son diagnostic, qui comprend au moins une paires d'amorces et/ou au moins une sonde et/ou au moins un système temps réel de l'invention.
Un tel kit de diagnostic peut en outre comprend des moyens pour la détection d'autres microorganismes, et notamment :
25 - des moyens pour la détection des HPIV2 qui ne font pas partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique variant de l'invention, tels que les Greer, Toshiba, V98, et/ou - des moyens pour la détection de HPIV autres que HPIV2, tels que HPIV1, HPIV3, HPIV4, et/ou 30 - des moyens pour la détection de microorganismes qui ne sont pas de HPIV, tels que des microorganismes, et plus particulièrement, des virus impliqués dans des affections ou infections respiratoires (systèmes respiratoires inférieurs et/ou supérieurs), telles que la pneumonie, la bronchiolite, la grippe.
La présente demande est également relative à une méthode pour la détection, plus particulièrement pour le diagnostic, de HPIV2 qui comprend la mise en contact d'un échantillon susceptible de contenir au moins un virus HPIV2, avec au moins une paire d'amorces et au moins une sonde de l'invention, dans des conditions adaptées à une amplification temps réel, par exemple une PCR temps réel.
La détection de la présence d'un amplicon produit par cette paire d'amorces et détecté par cette sonde est indicatif de la présence d'un virus HPIV2 faisant partie du groupe, ou le cas échéant sous-groupe, phylogénique de l'invention.
La présente demande est également relative à tout amplicon susceptible d'être obtenu par amplification à l'aide d'une paire d'amorces de l'invention d'un acide nucléique d'un virus du groupe, ou le cas échéant du sous-groupe, phylogénique variant de l'invention.
Sondes, spécialement adaptées à une mise en ceuvre sur puce :
La présente demande décrit la sélection d'acides nucléiques qui sont spécialement adaptés à la construction et à la production de sondes, qui sont spécialement adaptées à une mise en oruvre sur puce (acides nucléiques puces ci-dessus).
La présente demande est donc relative à une sonde qui est spécialement adaptée à une mise en oeuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98.
De préférence, une telle sonde est un acide nucléique qui s'hydride en conditions de forte stringence à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98, dans les mêmes conditions de forte stringence.
Des conditions de forte stringence sont connues de la personne du métier, et un exemple de telles conditions a été décrit ci-dessus.
Avantageusement, une telle sonde est telle que sa séquence est celle d'un fragment d'un acide nucléique puce de l'invention, ou celle de la séquence qui est la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
La présente demande est plus particulièrement relative à des sondes capables de s'hybrider à au moins l'un des virus du groupe ou sous-groupe phylogénique de l'invention, sans s'hybrider au virus HPIV2 de souche Greer, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'un sous-fragment (de 14 à 30, de préférence de 18 à
23 nucléotides) des fragments suivants :
- les fragments 241-420 de séquences codant F, - les fragments 259-395 de séquences codant F, - les fragments 181-480 de séquences codant HN, - les fragments 234-443 de séquences codant HN, - les fragments 1381-1716 de séquences codant HN, - les fragments 1466-1673 de séquences codant HN, - les séquences qui sont complémentaires de ces séquences sur toute la longueur de ces séquences.
Avantageusement, une telle sonde est choisie parmi les séquences de SEQ ID
NO : 99 à 117 (cf. tableau 11 ci-dessous).
La présente demande est également relative à tout support solide adapté à la circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, qui comprend au moins une telle sonde.
De préférence, cette sonde est fixée sur le supportd e cette puce.
Cette puce peut être sous forme congelée, voire lyophilisée.
Des exemples de puces sont connus de la personne du métier. Des puces sont par exemple décrites dans Korimbocus et al. 2005, Journal of Clinical Microbiology 43(8) : 3779-3787, ou commercialisées par la société Affymetrix (Califormie, USA).
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F- - Q- N 0 0 N 0 0 0 Cl ~~- ~ N Cl Dans la présente demande, le terme "comprenant", avec lequel "incluant" ou "contenant" est synonyme, est un terme ouvert, et n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) de méthode additionnel(s) qui ne
5 serait(seraient) pas explicitement indiqué(s), tandis que le terme "consistant" ou "constitué" est un terme fermé, qui exclut la présence de tout autre élément additionnel, étape, ou ingrédient qui ne serait pas explicitement exposé. Le terme "consistant essentiellement" ou " essentiellement constitué" est un terme partiellement ouvert, qui n'exclut pas la présence d'un ou plusieurs élément(s), 10 ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s), dans la mesure où ce(s) élément(s), ingrédient(s) ou étape(s) additionnel(s) n'affecte(nt) pas matériellement les propriétés de base de l'invention.
Par conséquent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") inclut les termes "consistant", "constitué", aussi bien que les termes "consistant 15 essentiellement" et " essentiellement constitué".
Le contenu des documents et références bibliographiques qui sont cités dans la présente demande est incorporé par référence.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratif, ils ne limitent 20 l'invention en aucune façon.
EXEMPLES
Matériels et Méthodes 25 Isolats variants de HPIV-2 Çinq isolats "atypiques" de HPIV-2 ont été isolés sur des cellules LLC-MK2 à
partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés (cf. tableau 1 ci-dessous). Ces patients (un enfant et trois adultes) ont été admis pour hospitalisation du fait d'infections.
30 respiratoires.
Cinq isolats ont été référencés sous la désignation isolats Lyon/18620/2001, Lyon/20283/2001, Lyon/20435/2001, Lyon/26056/1997 et Lyon/26632/1997.
Dans la présente demande, ces isolats peuvent, par simplification, être également appelés 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement.
Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; C.N.C.M. ;
Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ; France).
Tableau 1 :
isolat Numéro de dépôt C.N.C.M. Date de dépôt C.N.C.M.
18620 1-3763 10 mai 2007 20283 1-3764 10 mai 2007 20435 1-3765 10 mai 2007 26056 1-3761 10 mai 2007 26632 1-3762 10 mai 2007 Souches prototypes La souche HPIV-2 Greer (Numéro ATCC VR-1381) a été isolée en 1955 (USA) sur un enfant de 11 mois. Tous les essais ont été réalisés à partir d'un stock congelé à
-80 C (10',5 TICD 50/50 L).
Culture virale Pour l'isolement de virus, des cellules LLC-MK2 (cellules de rein de singe, ATCC
CCL-7) ont été placées en culture dans des flacons à échantillons cylindriques ( shell-via/s , plaques à 24 puits). Les cellules ont été maintenues sur du Milieu Essentiel Minimum d'Eagle complémenté avec de la strypsine (2 (g/mL). Après inoculation, les plaques ont été centrifugées (400 g pendant 30 min à 34 C), les milieux de cultures ont été renouvellés, et les plaques ont alors été placées en incubation à 34 C sous CO2 à 5%. L'effet cytopathique du virus a été contrôlé
régulièrement pendant 10 jours.
Test d'immunofluorescence (test d'IF) Les tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des quatre types d'HPIV (anticorps monoclonal anti-HIPV1, anticorps monoclonal anti-HPIV2, anticorps monoclonal anti-HPIV3 et anticorps monoclonal anti-HPIV4). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal spécifique du type HPIV4 est disponible auprès de Chemicon (Temecula, California, USA) sous la référence mAb 8780 .
D'autres tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécificiques de HPIV-2. Les anticorps monoclonaux anti-HPIV2 utilisés reconnaissent HN ou une protéine de structure (protéines internes). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal anti-HPIV2, qui cible la protéine HN de HPIV2, est disponible auprès de ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Extraction et RT-PCR
L'ARN viral a été extrait à partir de 100 pL de surnageant de culture de cellules LLC-MK-2 avec le kit "Absolutely RNA Micropep" (Stratagene, USA) en suivant les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en utilisant l'hexamère pd(N)6 aléatoire (Amersham Biosciences, Grande-Bretagne).
Brièvement, 5 pL de suspensions d'ARN précédemment extraits ont été placés en incubation avec 1 pL de pd(N)6 (1 (g/pL). Un mélange de 4 pL de tampon AMV-RT
(Promega Corporation, USA), 7,5 pL d'eau stérile, 1 pL de dNTP (20 mM) (Eurogentec, Belgique), 0,5 pL d'inhibiteur de Rnase (40 U/pL) (Promega Corporation, USA), et 1 NL de transcriptase inverse AMV (10 U/pL) (Promega Corporation, USA) ont été ensuite ajoutés. La transcription inverse a été
réalisée par incubation à 37 C pendant 1 heure et stoppée par chauffage à 95 C pendant minutes.
De sorte à obtenir les séquences complètes des gènes F et HN, les amplifications PCR ont été réalisées avec 6 paires d'amorces (présentées en Tableau 2 ci-dessous) construites suivant la séquence nucléotidique de l'isolat HPIV-2 disponible, à savoir l'isolat HPIV-2 Greer .(numéro d'accession GenBank NC_003443).
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L'amplification a été réalisée en suivant le protocole suivant : 95 C pendant minutes, suivi de 40 cycles (95 C pendant 30 secondes, 58 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 1 minute et 30 secondes) et une étape d'élongation finale de 10 minutes à 72 C.
Séguencape Les produits PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification GFX
(Amersham Biosciences, Grande-Bretagne) en suivant les instructions du fabricant. Une quantité de 20 ng/100 bp de chaque produit a été envoyée pour séquençage à la Compagnie MWG Biotech (Ebersberg, Allemagne).
Analyse phylogénétipue Les alignements ont été obtenus avec le programme ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Bioinfo/clustalX/Top.html). La matrice de distance a été calculée sur DNADIST du lot de programmes Phylip (version 3.64) (Felsenstein J., 1993, PHYLIP Phylogeny Interference Package version 3.64, Département de Génétique, Université de Washington, Seattle, USA). Les arbres phylogénétiques ont été construits en utilisant l'algorithme du voisin le plus proche (algorithme "Neighbour-Joining" ou NJ, ou de Saitou et Nei) du programme NEIGHBOR du lot de programmes Phylip. L'analyse "bootstrap" sur 1000 réplications a été
réalisée en utilisant SEQBOOT et CONSENSE du lot de programmes Phylip. Les arbres enracinés ont été édités avec le logiciel Njplot (IBCP, Lyon).
Prédiction de structure secondaire et analyse de modélisation moléculaire Les structures secondaires ont été prédites avec le logiciel en ligne SECCONS.
(http://Seccons.pbil.ibcp.fr) (IBCP, Lyon, France) (Combet et al. 2000, Trends Biochem Sci, 25:147-150). Ce logiciel donne la structure secondaire consensus telle que déterminée par une unité de 8 logiciels différents de prédiction de structure secondaire. La modélisation moléculaire automatique a été réalisée avec le logiciel GEN43D (http://geno3D-pbil.ibcp.fr) (Combet et al. 2002, Bioinformatics, 18:213-214) et l'interface graphique Rasmol (Rasmol molecular graphics, version 2.7.1). Les domaines susceptibles de participer à des torsades d'hélice ("coiled-coil 5 domains") (HR1 et 2) ont été prédits à l'aide du logiciel Learncoil-VMF
(http://web.wi.mit.edu/kim) (Singh M et al. 1999, J. Mol. Biol., 290:1031-1041).
Résultats Isolement et identification des virus 10 Cinq souches ont été isolées à partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés.
Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (cf. tableau 1 ci-dessus).
Les 5 isolats ont une bonne croissance sur les lignées cellulaires LLC-MK2 et ont 15 présenté un effet cytopathogène syncytial important apparaissant 3 à 7 jours après l'infection. Les tests d'immunofluorescence en routine ont été aussi réalisés sur les 5 échantillons en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques des 4 types de HPIV et d'autres pathogènes respiratoires. Tous ces tests ont donné des résultats négatifs. Les isolats de l'invention ne sont pas détectés par ces anticorps anti-20 HPIV de l'art antérieur.
Par contre, les isolats ont tous donnés un résultat HPIV-2 positif, lorsqu'ils ont été
testés par RT-PCR spécifique d'HPIV. Les cinq isolats apparaissent donc comme des isolats HPIV-2 "atypiques", par rapport à la souche de référence HPIV-2 Greer.
25 Réactivité avec les anticorps monoclonaux Des tests d'immunofluorescence ont été réalisés sur les 5 isolats en utilisant anticorps monoclonaux spécifiques de HPIV-2. Seuls les tests réalisés avec les anticorps monoclonaux contre les protéines internes ont donné des résultats positifs. Les tests d'immunofluorescence réalisés avec des anticorps monoclonaux 30 dirigés contre l'hémagglutinine-neuraminidase de l'art antérieur ont donné
des résultats négatifs (les résultats de ces tests d'immunofluorescence sont présentés en Tableau 3 ci-dessous). En tant que témoin positif, tous les anticorps monoclonaux ont réàgi avec la souche HPIV-2 prototype Greer.
Tableau 3:
Anticorps monoclonaux dirigés Anticorps contre des protéines internes monoclonaux dirigés contre HN
H PI V-2 ++ ++ ++ ++ ++ + - -Lyon/26056/1997 H P I V-2 + + ++ ++ ++ ++ - -Lyon/26632/1997 H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ - -Lyon/18620/2001 HPIV-2 ++ ++ + + ++ + - -Lyon/20283/2001 HPIV-2 + + + ++ ++ + - -Lyon/20435/2001 H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Greer/1 955 Virus simien SV5 + + + ++ + + - -- réaction négative + réaction positive ++ importante réaction positive Caractérisation moléculaire Après assemblage des différents fragments, les séquences nucléotidiques consensus complètes des gènes F et HN ont été établies pour les isolats HPIV-2 Greer, 18620, 20283, 20435, 26056 et SV5, et la séquence nucléotidique consensus complète du gène F a été établie pour l'isolat HPIV-2 26632.
En tant que témoin, la séquence nucléotidique consensus complète obtenue pour la souche prototype (séquence nucléotidique SEQ ID NO : 45 ; séquence aminoacide SEQ ID NO : 46) a été comparée à la séquence équivalente disponible sur la base de données GenBank/EMBL. Les deux séquences présentent un pourcentage d'homologie de 99,9%. L'homologie est complète pour les protéines F
et HN.
Tableau 4:
Type Souche Numéro d'accession Genbank Greer/1955/(USA) NC_003443 Vanderbilt 9412-6 AF533010 (V94)/1994 (USA) HPIV-2 Vanderbilt 9811-18 AF533011 (V98)/1998 (USA) Lyon/18620/2001 DQ072586 (gènes F et HN ;
HPIV-2 de CDS F; protéine F;
l'invention CDS HN; protéine HN) Lyon/20283/2001 D0072587 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine HN) Lyon/20435/2001 DQ072588 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN ; protéine HN) Lyon/26056/1997 DQ072589 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine HN) Lyo n/26632/ 1997 D0072590 (gène F; CDS F ;
protéine F) Le contenu correspondant aux numéros d'accesion Genbank DQ072586, DQ072587, DQ072588, DQ072589, DQ072590 est reproduit ci-après en partie description de séquences .
Les séquences nucléotidiques du gène F des isolats HPIV-2 "atypiques" ont été
comparées à leur contrepartie dans la souche prototype. L'alignement obtenu met en évidence 57 changements communs à l'ensemble des isolats HPIV-2 "atypiques" sur un total de 1656 nucléotides (3,4%). Ces différences communes représentent la grande majorité (85%) des différences observées. Ces changements conduisent à 11 substitutions d'aminoacides (cf. description de figures 4 et 7), c'est-à-dire 2% de substitutions.
Les séquences nucléotidiques du gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ont aussi été comparées avec la souche de référence. Ainsi, 79 changements communs à
l'ensemble des virus "atypiques" ont été mis en évidence sur un total de 1716 nucléotides (4,6%). Ces différences communes représentent aussi la majorité
des différences observées (80%). Ces changements conduisent à 20 changements communs (cf. description de figure 8), c'est-à-dire 3,8% de substitutions.
Protéine d'attachement HN
L'analyse des sites de glycosylation potentiel (N-X-S/T) dans le gène HN
montre que l'ensemble des 5 variants HPIV-2 ont en commun une substitution S316N
responsable de l'apparition d'un nouveau site de glycosylation qui est absent dans la souche prototype. Les principales différences entre les variants et la souche prototype ont été observées dans la partie carboxy-terminale de la protéine.
Les modèles tridimensionnels des protéines HN de la souche HPIV-2 Greer et des ' isolats "atypiques", construits sur des homologies structurelles, présentent' une similarité très forte. L'organisation en 6 couches caractéristiques de la neuraminidase a été observée (cf. figure 1). Par analogie avec les structures connues des protéines HN de NDV, SV5 et HPIV-3, la position et la conformation du site catalytique semblent être identiques entre les différents isolats HPIV-2. Les modèles obtenus permettent de constater que le site de glycosylation, qui est seulement présent chez les isolats variants "atypiques" de HPIV-2, est localisé
dans une boucle dirigée vers l'extérieur de la protéine. La substitution S316N
ne semble pas changer la structure de cette boucle. Les acides aminés qui constituent le pic hydrophobe précédemment décrit sur la souche de référence HPIV-2 Greer (positions 512-515) forment une boucle qui est dirigée vers l'intérieur de la protéine (cf. boucle signalée par A dans le modèle de gauche de la figure 1), ce qui n'est pas le cas pour les isolats variants "atypiques" de HPIV-2 (cf.
boucle signalée par A' dans le modèle de droite de la figure 1).
Protéine de fusion F
L'alignement des 20 acides aminés qui constituent le peptide de fusion de Paramyxovirus présente une différence d'un acide aminé entre les isolats variants HPIV-2 et la souche prototype (figure 2). Le peptide de fusion des souches V94 et V98 est similaire au peptide de fusion des virus HPIV-2 "atypiques" et au peptide de fusion de la souche HPIV-2 prototype, respectivement (figures 2 et 4).
Les alignements d'autres domaines structurellement significatifs (HR1 et 2, TM
et CS, figure 4) des isolats HPIV-2 ne présentent aucune différence importante, exception faite des domaines CS et HR1. Dans les isolats Greer et V98, le site de clivage est KTRQER (SEQ ID NO : 13) ou KTRQKR (SEQ ID NO : 118), au lieu de KPRRER (SEQ ID NO : 14) pour les autres isolats.
Analyse ghylociénétigue Les séquences nucléotidiques des gènes F et HN des isolats HPIV-2 atypiques de la souche prototype HPIV-2 Greer et de SV5, ont été alignées avec leurs contreparties disponibles dans la base de données GenBank. Cette analyse montre un diagramme d'évolution similaire pour les protéines F et HN montrant que l'évolution des protéines F et HN des virus atypiques divergent de celles de la souche prototype, formant ainsi deux groupes (ou groupements) distincts. Selon la topologie des branches internes, les deux arbres présentent le même profil d'évolution (figure 3). Les protéines d'enveloppe de deux souches HPIV-2 provenant des Etats-Unis correspondent bien également à cette évolution divergente, chaque souche étant présente dans un des deux groupements (figure 3).
Discussion 5 L'objectif de cette étude est de caractériser des isolats HPIV-2 cliniques qui présentent une réactivité antigène atypique vis-à-vis des anticorps monoclonaux utilisés pour le diagnostic. Pour ce qui concerne les virus HPIV-2, quelques rares études, déjà anciennes, ont mis en évidence une variation antigénique entre les isolats (Numazaki Y et ai. 1968, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 127 :992-996 ; Ray et 10 a/. 1992, Virus Res. 24:107-113). Mais le lien entre la variation antigénique et la variation génétique n'avait pas jusqu'alors été analysé.
Les protéines F et HN des virus HPIV-2 "atypiques" présentent un pourcentage marqué de substitutions par rapport à la souche prototype : 2% pour le gène F
et 3,8% pour le gène HN. Par comparaison, un variant HPIV-3, décrit en 1995, 15 présentait au niveau de la protéine HN seulement 4 substitutions d'acides aminés dont 2 au niveau de sites antigéniques connus (0,7% de substitution). La position des sites antigéniques n'a pas encore été déterminée pour HPIV-2, mais il serait surprenant qu'aucune des 22 substitution d'acides aminés observées sur le gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ne soient localisée dans des sites antigéniques.
20 Hémagglutinine-neuramidase Parmi les substitutions observées, la substitution S316N est à l'origine d'un nouveau site potentiel de glycosylation qui est absent dans la protéine HN de la souche prototype HPIV-2. Les modèles tridimensionnels de la protéine HN
montrent que ce site est localisé dans une boucle qui est dirigée vers l'extérieur de 25 la protéine, c'est-à-dire une zone exposée qui pourrait correspondre à un site antigénique. Une glycosylation est susceptible de masquer un épitope et pourrait expliquer l'absence de réaction avec certains anticorps. Les autres sites potentiels de glycosylation restent inchangés.
Les différences observées dans la structure primaire de la protéine HN des isolats 30 atypiques ont potentiellement des conséquences sur la structure secondaire dans la partie carboxy-terminale de la protéine. Les résultats présentés, qui ne sont pour l'instant que des prédictions, ne mettent en évidence aucun changement structurel significatif, en particulier à la surface de la protéine ou au niveau du site catalytique. Toutefois, ces changements mineurs de structure sans perturbation de la fonction pourraient être responsables de la disparition d'épitopes conformationnels.
Protéine de fusion L'analyse des peptides de fusion des isolats HPIV-2 "atypiques" montre l'existence d'une différence d'un acide aminé par rapport à la protéine F de la souche prototype. Le domaine hydrophobe constitué par le peptide de fusion est présenté
comme étant la zone la plus préservée de la protéine F au sein de la famille des Paramyxoviridae. Ceci suggère que sa structure et sa fonction sont soumises à
une pression de sélection plus intense que les autres domaines de la protéine.
L'analyse des changements spécifiques conservatifs et non conservatifs qui a été
réalisée pour SV5 et NDV a montré que la séquence peptidique est importante pour l'activité de fusion (Horvath CM 1992, Sergel TA et al., 2001). La différence d'un acide aminé que nous observons entre les virus "atypiques" et la souche prototype du même type ne semble donc pas être négligeable. Il a été montré
que des changements qui augmentent l'hydrophobicité du peptide de fusion, favorisant ainsi les interactions avec les lipides de la membrane cellulaire avait pour conséquence une augmentation de la formation des structures syncytiales. Dans le cas présent, la substitution d'une valine par une isoleucine ne modifie pratiquement pas l'hydrophobicité. Cette substitution rapproche les peptides des virus "atypiques" et du SV5, un virus dont l'effet cytopathogène sous la forme de structure syncytiale sont similaires. Cependant, la corrélation entre la substitution observée et une fusion plus significative n'est pas encore établie.
Les isolats variants HPIV-2 possèdent un site de clivage plus basique que la souche prototype. Ceci pourrait aussi expliquer la différence en terme d'activité de fusion. Dans le cas de NDV (gène F) et d'Influenza (gène HA), l'importance du site de clivage pour la virulence virale et la pathogénicité a été étudiée. Des souches qui présentent des résidus multibasiques au niveau du site de clivage sont virulentes et se disséminent facilement au sein de l'hôte. Chez certaines souches d'influenza non-pathogènes, il a été montré que des substitutions Arginine ou Lysine au niveau du site de clivage du gène HA, aux positions 5 ou 6, conduisent à
l'acquisition d'une pathogénicité. De plus amples analyses seront réalisées pour déterminer la relation entre la basicité du site de clivage, l'activité de fusion et la virulence des isolats variants "atypiques" de HPIV-2:
Analyse phylogénétique Les analyses phylogénétiques suggèrent deux groupes distincts ("clusters") au sein de HPIV-2, chaque groupe ayant des propriétés antigéniques différentes.
A la connaissance des inventeurs, c'est la première fois que des analyses phylogénétiques basées-sur les gènes F et HN des séquences HPIV-2 sont réalisées en parallèle. Les deux arbres phylogénétiques (figure 3) présentent une très forte similarité en terme de topologie, même si la protéine HN semble évoluer sensiblement plus rapidement que la protéine F. La co-évolution des deux glycoprotéines de HPIV-2 pourrait être expliquée par une exposition équivalente à
la pression de sélection, une pression qui est plus marquée que pour les autres protéines de structure.
Le diagnostic en laboratoire de HPIV est communément réalisé par isolement conventionnel en culture cellulaire, centrifugation de la culture dans des flacons cylindriques et marquage par immunofluorescence (coloration directe des échantillons rhino-pharyngiens). Les données de séquençage démontrent clairement la présence de souches HPIV-2 nouvelles non encore décrites. On ne sait pas encore si ces variants que nous venons d'isoler sont prédominants au sein de la population des patients. Des études de séquençage sont en cours pour analyser les variations des gènes F et HN dans d'autres isolats clinique de disponibles au sein de notre laboratoire, notamment pour déterminer si des variants de HPIV-2 viennent d'émerger, Une surveillance virale continue est importante pour surveiller les changements antigéniques qui peuvent se produire dans la nature, plus particulièrement par rapport à la sélection de souches pour un développement vaccinal ainsi que pour la réalisation d'essais diagnostics mis à jour.
Par conséquent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") inclut les termes "consistant", "constitué", aussi bien que les termes "consistant 15 essentiellement" et " essentiellement constitué".
Le contenu des documents et références bibliographiques qui sont cités dans la présente demande est incorporé par référence.
Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement illustratif, ils ne limitent 20 l'invention en aucune façon.
EXEMPLES
Matériels et Méthodes 25 Isolats variants de HPIV-2 Çinq isolats "atypiques" de HPIV-2 ont été isolés sur des cellules LLC-MK2 à
partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés (cf. tableau 1 ci-dessous). Ces patients (un enfant et trois adultes) ont été admis pour hospitalisation du fait d'infections.
30 respiratoires.
Cinq isolats ont été référencés sous la désignation isolats Lyon/18620/2001, Lyon/20283/2001, Lyon/20435/2001, Lyon/26056/1997 et Lyon/26632/1997.
Dans la présente demande, ces isolats peuvent, par simplification, être également appelés 18620, 20283, 20435, 26056, 26632, respectivement.
Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ; C.N.C.M. ;
Institut Pasteur ; 25, rue du Docteur Roux ; F-75724 PARIS Cedex 15 ; France).
Tableau 1 :
isolat Numéro de dépôt C.N.C.M. Date de dépôt C.N.C.M.
18620 1-3763 10 mai 2007 20283 1-3764 10 mai 2007 20435 1-3765 10 mai 2007 26056 1-3761 10 mai 2007 26632 1-3762 10 mai 2007 Souches prototypes La souche HPIV-2 Greer (Numéro ATCC VR-1381) a été isolée en 1955 (USA) sur un enfant de 11 mois. Tous les essais ont été réalisés à partir d'un stock congelé à
-80 C (10',5 TICD 50/50 L).
Culture virale Pour l'isolement de virus, des cellules LLC-MK2 (cellules de rein de singe, ATCC
CCL-7) ont été placées en culture dans des flacons à échantillons cylindriques ( shell-via/s , plaques à 24 puits). Les cellules ont été maintenues sur du Milieu Essentiel Minimum d'Eagle complémenté avec de la strypsine (2 (g/mL). Après inoculation, les plaques ont été centrifugées (400 g pendant 30 min à 34 C), les milieux de cultures ont été renouvellés, et les plaques ont alors été placées en incubation à 34 C sous CO2 à 5%. L'effet cytopathique du virus a été contrôlé
régulièrement pendant 10 jours.
Test d'immunofluorescence (test d'IF) Les tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécifiques de chacun des quatre types d'HPIV (anticorps monoclonal anti-HIPV1, anticorps monoclonal anti-HPIV2, anticorps monoclonal anti-HPIV3 et anticorps monoclonal anti-HPIV4). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal spécifique du type HPIV4 est disponible auprès de Chemicon (Temecula, California, USA) sous la référence mAb 8780 .
D'autres tests d'IF ont été réalisés avec des anticorps monoclonaux spécificiques de HPIV-2. Les anticorps monoclonaux anti-HPIV2 utilisés reconnaissent HN ou une protéine de structure (protéines internes). De tels anticorps peuvent être produits par la personne du métier, ou sont disponibles dans le commerce. Par exemple, un anticorps monoclonal anti-HPIV2, qui cible la protéine HN de HPIV2, est disponible auprès de ARGENE S.A. (Parc Technologique Delta Sud 09120 Varilhes ; France) sous la référence 12E12G9.
Extraction et RT-PCR
L'ARN viral a été extrait à partir de 100 pL de surnageant de culture de cellules LLC-MK-2 avec le kit "Absolutely RNA Micropep" (Stratagene, USA) en suivant les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en utilisant l'hexamère pd(N)6 aléatoire (Amersham Biosciences, Grande-Bretagne).
Brièvement, 5 pL de suspensions d'ARN précédemment extraits ont été placés en incubation avec 1 pL de pd(N)6 (1 (g/pL). Un mélange de 4 pL de tampon AMV-RT
(Promega Corporation, USA), 7,5 pL d'eau stérile, 1 pL de dNTP (20 mM) (Eurogentec, Belgique), 0,5 pL d'inhibiteur de Rnase (40 U/pL) (Promega Corporation, USA), et 1 NL de transcriptase inverse AMV (10 U/pL) (Promega Corporation, USA) ont été ensuite ajoutés. La transcription inverse a été
réalisée par incubation à 37 C pendant 1 heure et stoppée par chauffage à 95 C pendant minutes.
De sorte à obtenir les séquences complètes des gènes F et HN, les amplifications PCR ont été réalisées avec 6 paires d'amorces (présentées en Tableau 2 ci-dessous) construites suivant la séquence nucléotidique de l'isolat HPIV-2 disponible, à savoir l'isolat HPIV-2 Greer .(numéro d'accession GenBank NC_003443).
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L'amplification a été réalisée en suivant le protocole suivant : 95 C pendant minutes, suivi de 40 cycles (95 C pendant 30 secondes, 58 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 1 minute et 30 secondes) et une étape d'élongation finale de 10 minutes à 72 C.
Séguencape Les produits PCR ont été purifiés à l'aide du kit de purification GFX
(Amersham Biosciences, Grande-Bretagne) en suivant les instructions du fabricant. Une quantité de 20 ng/100 bp de chaque produit a été envoyée pour séquençage à la Compagnie MWG Biotech (Ebersberg, Allemagne).
Analyse phylogénétipue Les alignements ont été obtenus avec le programme ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Bioinfo/clustalX/Top.html). La matrice de distance a été calculée sur DNADIST du lot de programmes Phylip (version 3.64) (Felsenstein J., 1993, PHYLIP Phylogeny Interference Package version 3.64, Département de Génétique, Université de Washington, Seattle, USA). Les arbres phylogénétiques ont été construits en utilisant l'algorithme du voisin le plus proche (algorithme "Neighbour-Joining" ou NJ, ou de Saitou et Nei) du programme NEIGHBOR du lot de programmes Phylip. L'analyse "bootstrap" sur 1000 réplications a été
réalisée en utilisant SEQBOOT et CONSENSE du lot de programmes Phylip. Les arbres enracinés ont été édités avec le logiciel Njplot (IBCP, Lyon).
Prédiction de structure secondaire et analyse de modélisation moléculaire Les structures secondaires ont été prédites avec le logiciel en ligne SECCONS.
(http://Seccons.pbil.ibcp.fr) (IBCP, Lyon, France) (Combet et al. 2000, Trends Biochem Sci, 25:147-150). Ce logiciel donne la structure secondaire consensus telle que déterminée par une unité de 8 logiciels différents de prédiction de structure secondaire. La modélisation moléculaire automatique a été réalisée avec le logiciel GEN43D (http://geno3D-pbil.ibcp.fr) (Combet et al. 2002, Bioinformatics, 18:213-214) et l'interface graphique Rasmol (Rasmol molecular graphics, version 2.7.1). Les domaines susceptibles de participer à des torsades d'hélice ("coiled-coil 5 domains") (HR1 et 2) ont été prédits à l'aide du logiciel Learncoil-VMF
(http://web.wi.mit.edu/kim) (Singh M et al. 1999, J. Mol. Biol., 290:1031-1041).
Résultats Isolement et identification des virus 10 Cinq souches ont été isolées à partir d'échantillons respiratoires, d'aspirats nasaux ou de lavages broncho alvéolaires collectés sur quatre patients hospitalisés.
Ces cinq isolats ont été déposés auprès de la C.N.C.M. aux fins du Traité de Budapest (cf. tableau 1 ci-dessus).
Les 5 isolats ont une bonne croissance sur les lignées cellulaires LLC-MK2 et ont 15 présenté un effet cytopathogène syncytial important apparaissant 3 à 7 jours après l'infection. Les tests d'immunofluorescence en routine ont été aussi réalisés sur les 5 échantillons en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques des 4 types de HPIV et d'autres pathogènes respiratoires. Tous ces tests ont donné des résultats négatifs. Les isolats de l'invention ne sont pas détectés par ces anticorps anti-20 HPIV de l'art antérieur.
Par contre, les isolats ont tous donnés un résultat HPIV-2 positif, lorsqu'ils ont été
testés par RT-PCR spécifique d'HPIV. Les cinq isolats apparaissent donc comme des isolats HPIV-2 "atypiques", par rapport à la souche de référence HPIV-2 Greer.
25 Réactivité avec les anticorps monoclonaux Des tests d'immunofluorescence ont été réalisés sur les 5 isolats en utilisant anticorps monoclonaux spécifiques de HPIV-2. Seuls les tests réalisés avec les anticorps monoclonaux contre les protéines internes ont donné des résultats positifs. Les tests d'immunofluorescence réalisés avec des anticorps monoclonaux 30 dirigés contre l'hémagglutinine-neuraminidase de l'art antérieur ont donné
des résultats négatifs (les résultats de ces tests d'immunofluorescence sont présentés en Tableau 3 ci-dessous). En tant que témoin positif, tous les anticorps monoclonaux ont réàgi avec la souche HPIV-2 prototype Greer.
Tableau 3:
Anticorps monoclonaux dirigés Anticorps contre des protéines internes monoclonaux dirigés contre HN
H PI V-2 ++ ++ ++ ++ ++ + - -Lyon/26056/1997 H P I V-2 + + ++ ++ ++ ++ - -Lyon/26632/1997 H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ - -Lyon/18620/2001 HPIV-2 ++ ++ + + ++ + - -Lyon/20283/2001 HPIV-2 + + + ++ ++ + - -Lyon/20435/2001 H P I V-2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Greer/1 955 Virus simien SV5 + + + ++ + + - -- réaction négative + réaction positive ++ importante réaction positive Caractérisation moléculaire Après assemblage des différents fragments, les séquences nucléotidiques consensus complètes des gènes F et HN ont été établies pour les isolats HPIV-2 Greer, 18620, 20283, 20435, 26056 et SV5, et la séquence nucléotidique consensus complète du gène F a été établie pour l'isolat HPIV-2 26632.
En tant que témoin, la séquence nucléotidique consensus complète obtenue pour la souche prototype (séquence nucléotidique SEQ ID NO : 45 ; séquence aminoacide SEQ ID NO : 46) a été comparée à la séquence équivalente disponible sur la base de données GenBank/EMBL. Les deux séquences présentent un pourcentage d'homologie de 99,9%. L'homologie est complète pour les protéines F
et HN.
Tableau 4:
Type Souche Numéro d'accession Genbank Greer/1955/(USA) NC_003443 Vanderbilt 9412-6 AF533010 (V94)/1994 (USA) HPIV-2 Vanderbilt 9811-18 AF533011 (V98)/1998 (USA) Lyon/18620/2001 DQ072586 (gènes F et HN ;
HPIV-2 de CDS F; protéine F;
l'invention CDS HN; protéine HN) Lyon/20283/2001 D0072587 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine HN) Lyon/20435/2001 DQ072588 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN ; protéine HN) Lyon/26056/1997 DQ072589 (gènes F et HN ;
CDS F ; protéine F ;
CDS HN; protéine HN) Lyo n/26632/ 1997 D0072590 (gène F; CDS F ;
protéine F) Le contenu correspondant aux numéros d'accesion Genbank DQ072586, DQ072587, DQ072588, DQ072589, DQ072590 est reproduit ci-après en partie description de séquences .
Les séquences nucléotidiques du gène F des isolats HPIV-2 "atypiques" ont été
comparées à leur contrepartie dans la souche prototype. L'alignement obtenu met en évidence 57 changements communs à l'ensemble des isolats HPIV-2 "atypiques" sur un total de 1656 nucléotides (3,4%). Ces différences communes représentent la grande majorité (85%) des différences observées. Ces changements conduisent à 11 substitutions d'aminoacides (cf. description de figures 4 et 7), c'est-à-dire 2% de substitutions.
Les séquences nucléotidiques du gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ont aussi été comparées avec la souche de référence. Ainsi, 79 changements communs à
l'ensemble des virus "atypiques" ont été mis en évidence sur un total de 1716 nucléotides (4,6%). Ces différences communes représentent aussi la majorité
des différences observées (80%). Ces changements conduisent à 20 changements communs (cf. description de figure 8), c'est-à-dire 3,8% de substitutions.
Protéine d'attachement HN
L'analyse des sites de glycosylation potentiel (N-X-S/T) dans le gène HN
montre que l'ensemble des 5 variants HPIV-2 ont en commun une substitution S316N
responsable de l'apparition d'un nouveau site de glycosylation qui est absent dans la souche prototype. Les principales différences entre les variants et la souche prototype ont été observées dans la partie carboxy-terminale de la protéine.
Les modèles tridimensionnels des protéines HN de la souche HPIV-2 Greer et des ' isolats "atypiques", construits sur des homologies structurelles, présentent' une similarité très forte. L'organisation en 6 couches caractéristiques de la neuraminidase a été observée (cf. figure 1). Par analogie avec les structures connues des protéines HN de NDV, SV5 et HPIV-3, la position et la conformation du site catalytique semblent être identiques entre les différents isolats HPIV-2. Les modèles obtenus permettent de constater que le site de glycosylation, qui est seulement présent chez les isolats variants "atypiques" de HPIV-2, est localisé
dans une boucle dirigée vers l'extérieur de la protéine. La substitution S316N
ne semble pas changer la structure de cette boucle. Les acides aminés qui constituent le pic hydrophobe précédemment décrit sur la souche de référence HPIV-2 Greer (positions 512-515) forment une boucle qui est dirigée vers l'intérieur de la protéine (cf. boucle signalée par A dans le modèle de gauche de la figure 1), ce qui n'est pas le cas pour les isolats variants "atypiques" de HPIV-2 (cf.
boucle signalée par A' dans le modèle de droite de la figure 1).
Protéine de fusion F
L'alignement des 20 acides aminés qui constituent le peptide de fusion de Paramyxovirus présente une différence d'un acide aminé entre les isolats variants HPIV-2 et la souche prototype (figure 2). Le peptide de fusion des souches V94 et V98 est similaire au peptide de fusion des virus HPIV-2 "atypiques" et au peptide de fusion de la souche HPIV-2 prototype, respectivement (figures 2 et 4).
Les alignements d'autres domaines structurellement significatifs (HR1 et 2, TM
et CS, figure 4) des isolats HPIV-2 ne présentent aucune différence importante, exception faite des domaines CS et HR1. Dans les isolats Greer et V98, le site de clivage est KTRQER (SEQ ID NO : 13) ou KTRQKR (SEQ ID NO : 118), au lieu de KPRRER (SEQ ID NO : 14) pour les autres isolats.
Analyse ghylociénétigue Les séquences nucléotidiques des gènes F et HN des isolats HPIV-2 atypiques de la souche prototype HPIV-2 Greer et de SV5, ont été alignées avec leurs contreparties disponibles dans la base de données GenBank. Cette analyse montre un diagramme d'évolution similaire pour les protéines F et HN montrant que l'évolution des protéines F et HN des virus atypiques divergent de celles de la souche prototype, formant ainsi deux groupes (ou groupements) distincts. Selon la topologie des branches internes, les deux arbres présentent le même profil d'évolution (figure 3). Les protéines d'enveloppe de deux souches HPIV-2 provenant des Etats-Unis correspondent bien également à cette évolution divergente, chaque souche étant présente dans un des deux groupements (figure 3).
Discussion 5 L'objectif de cette étude est de caractériser des isolats HPIV-2 cliniques qui présentent une réactivité antigène atypique vis-à-vis des anticorps monoclonaux utilisés pour le diagnostic. Pour ce qui concerne les virus HPIV-2, quelques rares études, déjà anciennes, ont mis en évidence une variation antigénique entre les isolats (Numazaki Y et ai. 1968, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 127 :992-996 ; Ray et 10 a/. 1992, Virus Res. 24:107-113). Mais le lien entre la variation antigénique et la variation génétique n'avait pas jusqu'alors été analysé.
Les protéines F et HN des virus HPIV-2 "atypiques" présentent un pourcentage marqué de substitutions par rapport à la souche prototype : 2% pour le gène F
et 3,8% pour le gène HN. Par comparaison, un variant HPIV-3, décrit en 1995, 15 présentait au niveau de la protéine HN seulement 4 substitutions d'acides aminés dont 2 au niveau de sites antigéniques connus (0,7% de substitution). La position des sites antigéniques n'a pas encore été déterminée pour HPIV-2, mais il serait surprenant qu'aucune des 22 substitution d'acides aminés observées sur le gène HN des virus HPIV-2 "atypiques" ne soient localisée dans des sites antigéniques.
20 Hémagglutinine-neuramidase Parmi les substitutions observées, la substitution S316N est à l'origine d'un nouveau site potentiel de glycosylation qui est absent dans la protéine HN de la souche prototype HPIV-2. Les modèles tridimensionnels de la protéine HN
montrent que ce site est localisé dans une boucle qui est dirigée vers l'extérieur de 25 la protéine, c'est-à-dire une zone exposée qui pourrait correspondre à un site antigénique. Une glycosylation est susceptible de masquer un épitope et pourrait expliquer l'absence de réaction avec certains anticorps. Les autres sites potentiels de glycosylation restent inchangés.
Les différences observées dans la structure primaire de la protéine HN des isolats 30 atypiques ont potentiellement des conséquences sur la structure secondaire dans la partie carboxy-terminale de la protéine. Les résultats présentés, qui ne sont pour l'instant que des prédictions, ne mettent en évidence aucun changement structurel significatif, en particulier à la surface de la protéine ou au niveau du site catalytique. Toutefois, ces changements mineurs de structure sans perturbation de la fonction pourraient être responsables de la disparition d'épitopes conformationnels.
Protéine de fusion L'analyse des peptides de fusion des isolats HPIV-2 "atypiques" montre l'existence d'une différence d'un acide aminé par rapport à la protéine F de la souche prototype. Le domaine hydrophobe constitué par le peptide de fusion est présenté
comme étant la zone la plus préservée de la protéine F au sein de la famille des Paramyxoviridae. Ceci suggère que sa structure et sa fonction sont soumises à
une pression de sélection plus intense que les autres domaines de la protéine.
L'analyse des changements spécifiques conservatifs et non conservatifs qui a été
réalisée pour SV5 et NDV a montré que la séquence peptidique est importante pour l'activité de fusion (Horvath CM 1992, Sergel TA et al., 2001). La différence d'un acide aminé que nous observons entre les virus "atypiques" et la souche prototype du même type ne semble donc pas être négligeable. Il a été montré
que des changements qui augmentent l'hydrophobicité du peptide de fusion, favorisant ainsi les interactions avec les lipides de la membrane cellulaire avait pour conséquence une augmentation de la formation des structures syncytiales. Dans le cas présent, la substitution d'une valine par une isoleucine ne modifie pratiquement pas l'hydrophobicité. Cette substitution rapproche les peptides des virus "atypiques" et du SV5, un virus dont l'effet cytopathogène sous la forme de structure syncytiale sont similaires. Cependant, la corrélation entre la substitution observée et une fusion plus significative n'est pas encore établie.
Les isolats variants HPIV-2 possèdent un site de clivage plus basique que la souche prototype. Ceci pourrait aussi expliquer la différence en terme d'activité de fusion. Dans le cas de NDV (gène F) et d'Influenza (gène HA), l'importance du site de clivage pour la virulence virale et la pathogénicité a été étudiée. Des souches qui présentent des résidus multibasiques au niveau du site de clivage sont virulentes et se disséminent facilement au sein de l'hôte. Chez certaines souches d'influenza non-pathogènes, il a été montré que des substitutions Arginine ou Lysine au niveau du site de clivage du gène HA, aux positions 5 ou 6, conduisent à
l'acquisition d'une pathogénicité. De plus amples analyses seront réalisées pour déterminer la relation entre la basicité du site de clivage, l'activité de fusion et la virulence des isolats variants "atypiques" de HPIV-2:
Analyse phylogénétique Les analyses phylogénétiques suggèrent deux groupes distincts ("clusters") au sein de HPIV-2, chaque groupe ayant des propriétés antigéniques différentes.
A la connaissance des inventeurs, c'est la première fois que des analyses phylogénétiques basées-sur les gènes F et HN des séquences HPIV-2 sont réalisées en parallèle. Les deux arbres phylogénétiques (figure 3) présentent une très forte similarité en terme de topologie, même si la protéine HN semble évoluer sensiblement plus rapidement que la protéine F. La co-évolution des deux glycoprotéines de HPIV-2 pourrait être expliquée par une exposition équivalente à
la pression de sélection, une pression qui est plus marquée que pour les autres protéines de structure.
Le diagnostic en laboratoire de HPIV est communément réalisé par isolement conventionnel en culture cellulaire, centrifugation de la culture dans des flacons cylindriques et marquage par immunofluorescence (coloration directe des échantillons rhino-pharyngiens). Les données de séquençage démontrent clairement la présence de souches HPIV-2 nouvelles non encore décrites. On ne sait pas encore si ces variants que nous venons d'isoler sont prédominants au sein de la population des patients. Des études de séquençage sont en cours pour analyser les variations des gènes F et HN dans d'autres isolats clinique de disponibles au sein de notre laboratoire, notamment pour déterminer si des variants de HPIV-2 viennent d'émerger, Une surveillance virale continue est importante pour surveiller les changements antigéniques qui peuvent se produire dans la nature, plus particulièrement par rapport à la sélection de souches pour un développement vaccinal ainsi que pour la réalisation d'essais diagnostics mis à jour.
Claims (45)
1. Virus HPIV2 faisant partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, caractérisé en ce que :
- la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou - la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41.
- la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,85%, de préférence d'au moins 99,90%, plus préférentiellement d'au moins 99,95% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou - la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 99,15%, de préférence d'au moins 99,20%, plus préférentiellement d'au moins 99,30% avec au moins une des séquences aminoacides de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41.
2. Virus HPIV2 faisant partie d'un sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 qui ne comprend pas les isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98 et V94, caractérisé en ce que :
- la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes :
102, 104, 112, 160, et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes :
57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ;
edit virus étant en outre caractérisé par le fait que ~ en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, ~ en position 186 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine).
- la séquence aminoacide de sa protéine F présente une identité de plus de 99,3%, de préférence d'au moins 99,4%, plus préférentiellement d'au moins 99,5% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 24, 29, 34, 39, 44, et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine HN présente une identité de plus de 98,6%, de préférence d'au moins 98,7%, plus préférentiellement d'au moins 98,8% avec au moins une des séquences de SEQ ID NO : 26, 31, 36, 41 (isolats 18620,20283, 20435, 26056, respectivement), et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine F diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes :
102, 104, 112, 160, et/ou par le fait que - la séquence aminoacide de sa protéine HN diffère de celle de l'isolat Greer et de celle de l'isolat V98 en au moins une des positions aminoacides suivantes :
57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482 ;
edit virus étant en outre caractérisé par le fait que ~ en position 175 de la séquence de sa protéine F, il présente un acide aminé autre que H, préférentiellement l'acide aminé R, ~ en position 186 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine).
3. Virus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que :
- en position 316 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé qui est autre que S et qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N (asparagine), et/ou - en position 513 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 514 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
- en position 316 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé qui est autre que S et qui crée un site de glycosylation, préférentiellement l'acide aminé N (asparagine), et/ou - en position 513 de la séquence de sa protéine HN, il présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 514 de la séquence de la protéine HN, il présente un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
4. Virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les virus HPIV2 disponibles auprès de la C.N.C.M. sous les numéros de dépôt I-3761, I-3762, I-3763, I-3764, I-3765.
5. Acide nucléique, caractérisé en que sa séquence comprend, ou est constituée de:
a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou b) la séquence d'un ADNc susceptible d'être obtenu par transcription inverse d'un tel ARN génomique, ou c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
a) la séquence de l'ARN génomique d'un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou b) la séquence d'un ADNc susceptible d'être obtenu par transcription inverse d'un tel ARN génomique, ou c) la séquence qui est la complémentaire d'une des séquences visées sous a) et b) ci-dessus sur toute la longueur de cette séquence a) ou b).
6. Protéine, caractérisée en ce que sa séquence aminoacide comprend celle d'au moins une protéine d'enveloppe de l'un des virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite au moins une protéine d'enveloppe est une protéine F.
8. Protéine selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine F
présente :
- en position 102, l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, l'acide aminé R (arginine).
présente :
- en position 102, l'acide aminé P (proline), et/ou - en position 104, l'acide aminé R (arginine).
9. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisée en ce que la séquence du site de clivage de ladite protéine F est KPRRER (SEQ ID NO:
14).
14).
10. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce que ladite protéine F présente :
- en position 112, l'acide aminé I(isoleucine), et/ou - en position 160, l'acide aminé T (thréonine).
- en position 112, l'acide aminé I(isoleucine), et/ou - en position 160, l'acide aminé T (thréonine).
11. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisée en ce que ladite protéine F présente en position 175 de sa séquence un acide aminé
autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
autre que H, préférentiellement l'acide aminé R.
12. Protéine selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine F est choisie parmi les séquences de SEQ ID
NO : 24, 29, 34, 39, 44.
NO : 24, 29, 34, 39, 44.
13. Protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, caractérisée en ce que ladite au moins une protéine d'enveloppe est une protéine HN.
14. Protéine selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite protéine HN
présente au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants :
- en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E, - en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S, - en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T, - en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M, - en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
présente au moins l'un des éléments suivants, de préférence au moins deux de ces éléments, plus préférentiellement l'ensemble des éléments suivants :
- en position 57, un acide aminé autre que D, préférentiellement l'acide aminé
E, - en position 114, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 139, un acide aminé autre que K, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 195, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé A, - en position 201, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S, - en position 319, un acide aminé autre que P, préférentiellement l'acide aminé T, - en position 344, un acide aminé autre que E, préférentiellement l'acide aminé K, - en position 348, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé I
(isoleucine), - en position 378, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 379, un acide aminé autre que R, préférentiellement l'acide aminé E, - en position 480, un acide aminé autre que T, préférentiellement l'acide aminé M, - en position 482, un acide aminé autre que Q, préférentiellement l'acide aminé R.
15. Protéine selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que :
- en position 316, ladite protéine HN présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
- en position 316, ladite protéine HN présente un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 513, un acide aminé autre que S, préférentiellement l'acide aminé N, et/ou - en position 514, un acide aminé autre que A, préférentiellement l'acide aminé S.
16. Protéine selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que ladite protéine HN présente un acide aminé autre que M, préférentiellement l'acide aminé I (isoleucine) en position 186.
17. Protéine selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que la séquence de ladite protéine HN est choisie parmi les séquences de SEQ
ID NO: 26, 31, 36, 41.
ID NO: 26, 31, 36, 41.
18. Acide nucléique, dont la séquence code une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 17, en tenant compte de la dégénérescence du code génétique universel.
19. Acide nucléique selon la revendication 18, caractérisé en que sa séquence comprend, ou est constituée d'une séquence choisie parmi les séquences de SEQ
ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40.
ID NO : 22, 27, 32, 37, 42, 23, 28, 33, 38, 43, 25, 30, 35, 40.
20. Acide nucléique, qui est spécifique d'un ou plusieurs virus du sous-groupe phylogénique de variants HPIV2 dont font partie les virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, mais dont ne font pas partie les isolats HPIV2 Greer, Toshiba et V98, et qui est spécialement adapté à la détection spécifique d'un ou plusieurs virus de ce sous-groupe phylogénique et/ou à la construction et à la production de sondes et/ou d'amorces permettant une telle détection spécifique, caractérisé en que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F
et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment.
- un fragment d'au moins 132 nucléotides d'une séquence codant la protéine F
et/ou la protéine HN d'au moins l'un des virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence complémentaire d'un tel fragment sur toute la longueur de ce fragment.
21. Acide nucléique selon la revendication 20, qui est spécialement adapté à
la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
la construction et à la production d'au moins une paire d'amorces et d'au moins une sonde qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre en amplification temps réel pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous-groupe phylogénique de variants HPIV2, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend :
- des positions 259 à 395 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 234 à 443 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN dudit virus.
22. Acide nucléique selon la revendication 21, caractérisé en ce que :
ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 62 à 66, ou ledit fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 67 à 70, ou ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN
est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 83 à 86.
ledit fragment s'étendant des positions 259 à 395 de la séquence codant F est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 62 à 66, ou ledit fragment s'étendant des positions 234 à 443 de la séquence codant HN est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 67 à 70, ou ledit fragment s'étendant des positions 1466 à 1673 de la séquence codant HN
est constitué de l'une des séquences de SEQ ID NO : 83 à 86.
23. Acide nucléique selon la revendication 21 ou 22, qui est spécialement adapté à
la construction et à la production d'une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98, et qui est en outre spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec ladite paire d'amorces, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous-groupe phylogénique variant, caractérisé en ce que sa séquence est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86.
la construction et à la production d'une paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98, et qui est en outre spécialement adapté à la construction et à la production d'au moins une sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec ladite paire d'amorces, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus dudit sous-groupe phylogénique variant, caractérisé en ce que sa séquence est constituée d'une des séquences SEQ ID NO : 62 à 66, 67 à 70, 83 à 86.
24. Acide nucléique selon la revendication 20, qui est spécialement adapté à
la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend - des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
la construction et à la production de sondes qui sont spécialement adaptées à une mise en oeuvre sur puce, pour la détection spécifique d'un ou plusieurs virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la séquence de cet acide nucléique comprend, ou est constituée de :
- un fragment de la séquence codant F ou de la séquence codant HN d'un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ou - la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment, et en ce que ledit fragment s'étend - des positions 241 à 420 de la séquence codant F dudit virus, ou - des positions 241 à 420 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 961 à 1140 de la séquence codant HN dudit virus, ou - des positions 1381 à 1560 de la séquence codant HN dudit virus.
25. Acide nucléique selon la revendication 24, caractérisé en ce que sa séquence comprend, ou est constituée d'une des séquences suivantes :
les séquences de SEQ ID NO: 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID
déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
les séquences de SEQ ID NO: 57 à 61, 71 à 74, 75 à 78, 79 à 82, et les séquences qui sont complémentaires à ces séquences de numéro SEQ ID
déterminé sur toute la longueur de ces séquences de numéro SEQ ID déterminé.
26. Paire d'amorces qui est capable d'amplifier un acide nucléique d'au moins un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98, caractérisée en ce que :
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, et en ce que - la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à
30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique selon la revendication 23 sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à
l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
- la séquence de l'une des amorces de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, et en ce que - la séquence de l'autre amorce de ladite paire est celle d'un fragment 5' de 14 à
30 nucléotides de la séquence qui est complémentaire du même acide nucléique selon la revendication 23 sur toute la longueur de cet acide nucléique, lesdits fragments 5' étant des fragments qui comprennent le premier nucléotide à
l'extrémité 5' de la séquence dont ils sont le fragment.
27. Paire d'amorces selon la revendication 26, caractérisée en ce qu'elle est capable d'amplifier un acide nucléique de chacun des cinq virus objets de la revendication 4, sans amplifier un acide nucléique des isolats HPIV Greer, Toshiba, et V98.
28. Paire d'amorces selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en ce que chacun desdits fragments 5' est, indépendamment l'un de l'autre, constitué de 18 à
23 nucléotides.
23 nucléotides.
29. Paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisée en ce qu'elle est constituée :
- d'une amorce de SEQ ID NO : 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 91, et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
- d'une amorce de SEQ ID NO : 87, et d'une amorce de SEQ ID NO : 88, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 91, et d'une amorce de SEQ ID NO : 92, ou - d'une amorce de SEQ ID NO : 95, et d'une amorce de SEQ ID NO : 96.
30. Ensemble d'amorces qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29.
31. Amorce, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'une amorce choisie au sein d'une paire selon l'une quelconque des revendications 26 à 29.
32. Sonde pouvant être mise en oeuvre en amplification temps réel avec une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29, pour la détection spécifique d'au moins un virus selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisée en ce que sa séquence est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
4, caractérisée en ce que sa séquence est :
- celle est celle d'un fragment de 14 à 30 nucléotides d'un acide nucléique selon la revendication 23, ledit fragment ne comprenant de préférence pas le premier nucléotide à l'extrémité 5' de cet acide nucléique, et de préférence pas non plus le dernier nucléotide à l'extrémité 3' de cet acide nucléique, ou - celle de la séquence qui est complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
33. Sonde selon la revendication 32, caractérisée en ce que ledit fragment d'acide nucléique est constitué de 23 à 28 nucléotides.
34. Kit pour le diagnostic d'une affection ou d'une infection respiratoire, qui comprend au moins une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 26 à 29 et/ou au moins une sonde selon la revendication 32 ou 33.
35. Sonde qui est spécialement adaptée à une mise en oeuvre sur puce, et qui est capable de s'hybrider à un acide nucléique d'un ou plusieurs virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans s'hybrider à un acide nucléique des isolats HPIV2 Greer, Toshiba, V98, caractérisée en ce que sa séquence est celle d'un fragment d'un acide nucléique selon la revendication 25, ou celle de la séquence qui est la complémentaire de ce fragment sur toute la longueur de ce fragment.
36. Support solide adapté à la circulation d'un flux microfluidique, tel qu'une puce, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon la revendication 35.
37. Anticorps qui se lie à une protéine d'enveloppe de HPIV2, ou fragment conservateur d'un tel anticorps, ledit fragment conservateur ayant conservé la capacité à se lier une protéine d'enveloppe de HPIV2, caractérisé en ce que cet anticorps ou fragment conservateur d'anticorps se lie à une protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, sans se lier à une protéine d'enveloppe de l'isolat HPIV2 Greer NC_003443.
38. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 37, caractérisé
en ce qu'il se lie à une protéine d'enveloppe des cinq isolats de la revendication 4.
en ce qu'il se lie à une protéine d'enveloppe des cinq isolats de la revendication 4.
39. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 37 ou 38, caractérisé
en ce que ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprend, ou est constituée d'une protéine F.
en ce que ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprend, ou est constituée d'une protéine F.
40. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 39, caractérisé
en ce qu'il se lie à ladite protéine F en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
en ce qu'il se lie à ladite protéine F en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine F, se situe en positions 32, 102, 104, 112, 160, 247, 538.
41. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 40, caractérisé en ce que ladite protéine d'enveloppe d'au moins un virus HPIV2 selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprend, ou est constituée, d'une protéine HN.
42. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 41, caractérisé
en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 57, 114, 139, 195, 201, 319, 344, 348, 378, 379, 480, 482.
43. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 42, caractérisé
en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 316, 513, 514.
en ce qu'il se lie à ladite protéine HN en au moins un épitope qui comprend au moins un acide aminé choisi parmi les acides aminés qui, dans la séquence de ladite protéine HN, se situe en positions 316, 513, 514.
44. Anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 43, caractérisé en qu'il ne se lie pas à protéine d'enveloppe de l'isolat V94 (AF533010).
45. Kit pour le diagnostic d'une affection ou infection respiratoire, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 37 à 44.
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