EP2162539A2 - Minor-spleissosom testsystem zur modulierung der zellteilung - Google Patents

Minor-spleissosom testsystem zur modulierung der zellteilung

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EP2162539A2
EP2162539A2 EP08784526A EP08784526A EP2162539A2 EP 2162539 A2 EP2162539 A2 EP 2162539A2 EP 08784526 A EP08784526 A EP 08784526A EP 08784526 A EP08784526 A EP 08784526A EP 2162539 A2 EP2162539 A2 EP 2162539A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
mrna
substance
minor
cell division
uli
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08784526A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harald KÖNIG
Nathalie MATTER-KÖNIG
Ferenc MÜLLER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
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Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut fuer Technologie KIT filed Critical Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Publication of EP2162539A2 publication Critical patent/EP2162539A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
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    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring

Definitions

  • Test system for modulating, inhibiting or activating, the cell division in eukaryotes containing at least one in vivo cellular system containing at least one spliceable pre-mRNA which contains at least one intron and whose splicing depends on at least one snRNA U12 or Uli or U ⁇ atac or U5 or U4atac and the pre-mRNA in (a) contains at least one splice site for U12 or Uli, in the presence of at least one substance of interest and a detectable signal is induced, optionally with further adjuvants.
  • U1-U5 snRNPs consisting of several proteins and one small nuclear (sn) RNA (U1, U2, U4, U5 or U6)
  • sn small nuclear
  • U1-U5 snRNPs consisting of several proteins and one small nuclear (sn) RNA (U1, U2, U4, U5 or U6)
  • minor "(or U12-type) spliceosomes thus distinguishing the major spliceosome (containing the Ul, U2, U4, U5 and U6 snRNPs ), which processes more than 99% of human introns, from the minor spliceosome, which processes a rare class of introns with special, highly conserved sequences near the intron ends and additionally has a different snRNP composition (Uli and U12 snRNPs instead of Ul and U2; and U4atac or U6atac instead of U4 and U6).
  • a splice site splices the boundaries of exons and introns. Its sequence is "Major” (or U2). Type introns are poorly conserved, making prediction of the exons almost impossible only on the basis of the DNA sequence and represents a major challenge in bioinformatics. These sequences are specifically recognized by the spliceosomes and spliced out. Each intron has three sequence regions important for splicing processing: (1) the 5 'splice site, (2) the polypyrimidine tract with the branch point adenosine, and (3) the 3 1 splice site , A standard intron usually starts at the 5 'splice site with GU and ends at the 3' splice site mostly at AG.
  • the sequence 5 'AT - 3' AC can occur, which is why they have also been referred to as AT-AC introns.
  • the key features of "minor” (or U12-type) introns are the highly conserved sequences of the 5 'splice site (detected by Uli snRNA) and the branch point adenosine (recognized by U12 snRNA) and a polypyrimidine tract.
  • the minor spliceosome removes the very rare class of "minor” (or U12-type) introns, which account for as much as 0.4% of all introns in humans (CB Bürge, RA Padgett, PA Sharp, Mol Cell 2, 773 (Dec. 1998), A. Levine, R. Durbin, Nucleic Acids Res 29, 4006 (Oct 1, 2001)
  • this minor spliceosome contains specific snRNAs, namely Uli, U12, U4atac and U6atac ( AA Patel, JA Steitz, Nat Rev Mol Cell Biol 4, 960 (Dec, 2003).
  • an in vitro transcription mRNA is generally first prepared using genetic constructs with portions of viral or cellular genes. Such mRNAs contain all the important structural elements necessary for the recognition of mRNA by the spliceosomes and the process of splicing. In general, the mRNA is radiolabeled so that, after separation by means of a denaturing urea-polyacrylamide gel, the specific band pattern can be assessed with regard to the splicing reaction that has taken place.
  • test systems are not suitable for all mRNAs and very time consuming and laborious. They are therefore not suitable for the systematic detection of substances that can modulate or even inhibit splicing.
  • Further test systems for the major spliceosome are described in: WO00 / 52201 describes a gel-free in vitro detection system of a splicing reaction and the provision of appropriate probes.
  • WO 01/79537 describes a homogeneous test system which is also gel-free.
  • W001 / 7953 describes a cellular in vivo system which utilizes splittable nucleic acids with at least one intron and induces a detectable signal to find drugs. These test systems make no statement about the phenotypic design of the modulation in the organism.
  • W000 / 75309 describes a spliceosomal protein associated with the U11 / U12 snRNP complex of the U12-dependent spliceosome specific for this spliceosome and its use in the diagnosis of disease.
  • a test system for studying the function of the Ul2-dependent spliceosomes in the organism and consequent physiological processes dependent on this spliceosome (whose modulation can be used for the treatment of diseases) are not disclosed.
  • a particular advantage of the present invention is therefore to provide a test system with which the function of the independent minor spliceosome in the physiological context of the intact organism, cellular in vivo system, can be investigated in an effective, specific and simple manner, and from it define dependent physiological processes that can be used to treat diseases.
  • the essential role in cell division found here makes the minor spliceosome an interesting target for the effective treatment of diseases with out-of-control cell division.
  • the invention therefore relates to a test system for modulating, inhibiting or activating, the cell division containing, a) at least one cellular in vivo system containing at least one spliceable pre-mRNA containing at least one intron, b) at least one snRNA U12 or Uli or U6atac or U5 or U4atac contains, c) wherein the pre-mRNA in (a) contains at least one splice site for U12 or Uli, d) in the presence of at least one substance of interest e) and a detectable signal is induced f) optionally further auxiliaries
  • the in vivo cellular system is selected from eukaryotes.
  • in vivo is understood to mean a reaction, ie a reaction, which takes place within a living cell.
  • Cellular "in vivo" systems in the sense of the invention are spliceable eukaryotes preferably single as well as multicellular.
  • cell lines from mammals - including human cell lines or yeasts or fish embryos or insect embryos, most preferably zebrafish embryos (zebrafish embryos (Danio rerio, formerly Brachydanio rerio) or fruit fly embryos (Drosophilidae).
  • the signal according to (e) is morphologically and / or optically and / or biochemically detectable, such as by way of example and not limitation, the detection of BrdU (5'-bromo-2 x -deoxyuridine) BrdU is non-radioactive and can be administered in vivo after Incorporation into replicating DNA can be detected by means of monoclonal antibodies, immunohistochemically on tissue sections, whole embryos or cell cultures.
  • fluorescently-labeled antibody eg antibodies against BrdU coupled with FITC (fluorescein isothiocyanate; RT-PCR for the detection of minor-class splicing) known proteins which induce an optical signal, as well as reporter molecules such as GFP (green fluorescent protein, protein from the jellyfish Aequorea victoria), or whose variants have other fluorescence spectra, for example CFP (cyan) or YFP (corresponding to the color).
  • GFP green fluorescent protein, protein from the jellyfish Aequorea victoria
  • CFP cyan
  • YFP corresponding to the color
  • eGFP enhanced GFP
  • eYFP enhanced YFP
  • fluorescent proteins from corals such as zoanFP (from Zoanthus sp.) or the red fluorescent protein drFP583 (from Discosoma ), Trade name DsRed, and others encoded by reporter genes, therefore, spliceable nucleic acids according to feature (a) and (c), which represent feature (a) and are preferred for a detek encode animal signal (s), but not selected from such Reportergenmolekülen.
  • adjuvants according to feature (f) may be included, these adjuvants according to feature (f) are not conclusively selected from ATP, antibiotics e.g. Tertracycline, glucose and other adjuvants.
  • Nucleic acids are composed of bases, phosphate groups, as well as the sugars deoxyribose (DNA) or ribose (RNA). They are carriers of genetic information.
  • Nucleotides are the building blocks of the nucleic acids DNA and RNA. Each nucleotide consists of a base (purine or pyrimidine), a sugar molecule (deoxyribose or ribose) and a phosphate group. Through bonds, the nucleotides are linked together to chains. Oligonucleotides are short nucleic acid fragments with only a few nucleotides. You have the option of complementary mating with the DNA or RNA.
  • RNA (English: ribonucleic acid) is a molecular chain composed of nucleotides. Certain types of this ribonucleic acid perform the task of transferring information from the genes to the ribosomes in cells.
  • mRNA is the messenger RNA molecule, which is transcribed as a copy of the DNA's genetic information. The single-stranded mRNA transports the blueprint for the proteins to the ribosomes
  • pre-mRNA refers to an intermediate that occurs in the translation of DNA into proteins in eukaryotes. It is the messenger ribonucleic acid mRNA immediately after its formation in the transcriptional phase of protein biosynthesis (protein synthesis), if it has not been processed.
  • the pre-mRNA occurs as an intermediate in the first translation step, transcription: Not all DNA sections that are in a gene actually code for proteins, only the sections called exons.
  • the enzyme RNA polymerase II copies the complete region of the DNA, including all introns, ie non-protein coding sections.
  • the product is referred to as pre-mRNA.
  • RNA sequence resulting from the splicing of the pre-mRNA is called mRNA.
  • the pre-mRNA is modified by attaching a cap structure (at the 5 'end), a poly (A) tail, and splicing the introns in the nucleus. This happens in part already during the transcrip- tion.
  • the finished processed RNA is called mature mRNA. This is transported to the cytoplasm where translation begins.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA small interfering RNA is a specific class of RNA designed to selectively inhibit the translation of certain mRNAs.
  • Spliceosome is a large aggregate of snRNA and snRNP molecules that perform pre-mRNA splicing in a eukaryotic cell.
  • the individual components pre-mRNA, snRNPs and snRNA
  • SnRNAs small nuclear RNA
  • SnRNAs are RNA molecules that are complexed with proteins to form the ribonucleoprotein particles involved in RNA splicing.
  • SnRNAs are about 100 to 300 base pair RNAs. These are catalytically active RNAs in the nucleus of eukaryotes.
  • snRNPs small nuclear ribonucleoproteins
  • snRNPs small nuclear ribonucleoproteins
  • RNA splicing a process by which intron sequences from RNA transcripts in the nucleus are excised to produce the mRNA and other RNAs.
  • Morpholinos or Morpholino Oligos are nucleic acids that are used as tools in genetics to achieve knockdown of genes. These are synthetic molecules that are produced by structurally modified nucleic acid building blocks and are also called PMOs (phosphorodiamidate morpholino oligo). They are used in antisense RNA experiments and inhibit by binding to the complementary mRNA either the translation or splicing of the pre-mRNA and thus the formation of a protein. Their mode of action is thus comparable to the siRNAs, but Morpholinos have a higher stability and thus longer half-life, as they do not represent RNAse substrates. The disadvantage, however, is that a transfection of morpholinos is difficult, so it is usually resorting to injection
  • a thus (Germanized Latin von thusus) is a so-called Ursegment (Urwirbel), which occurs temporarily in the embryonic development of vertebrates.
  • the somites are pinched in the head-foot direction (craniocaudal) from the mesoderra to the side of the midline (paraxial). They are therefore located in two strands right and left of the axial structures Chorda dorsalis and Neuralrohr.
  • the ventromedial part is called mesenchymal and as a sclerotome.
  • the dorsolateral (lateral), epithelial portion is called the dermatomyotoma.
  • SEQ ID No.1 represents a nucleic acid sequence for the U12 snRNA (human), NCBI Accession J04119.
  • SEQ ID no. Figure 2 depicts a nucleic acid sequence for the U ⁇ atac snRNA (human), NCBI Accession U62823, NCBI Accession JO4119.
  • SEQ ID no. Figure 3 depicts a nucleic acid sequence for the U4atac snRNA (human), NCBI Accession 62822.
  • SEQ ID no. Figure 4 depicts a nucleic acid sequence for Uli snRNA (human), NCBI Accession JO4118.
  • the inventive method for finding an effective substance for inhibiting cell division using a test system characterized in that the substance according to feature (d) affects the pre-mRNA splicing of the minor spliceosomes inhibited or activated.
  • the pre-mRNA splicing by modulating the respective recognition sequence ( Figure 1) between the snRNAs of the minor spliceosome U12 or Uli with the pre-mRNA according to feature (c), or the respective recognition sequence between U6atac or U4atac, or respective recognition sequence between U6atac and U12.
  • active substance is selected from natural substances in the broadest sense, combinatorial substance libraries, pharmaceuticals, insecticides, herbicides, pesticides, nucleic acid oligomers, antibodies. This may be a naturally occurring, naturally occurring and chemically modified and / or synthetic substance.
  • the method according to the invention for selectively inhibiting the function of splicing ⁇ osome-specific snRNAs have been developed.
  • One embodiment is inhibition with synthetic nucleic acid oligomers, so-called morpholino oligomers (morpholinos), that specifically bind to snRNAs and sequester sequences that mediate interaction with sequence elements in the pre-mRNA and with other snRNAs snRNAs.
  • Preferred morpholino oligomers having the nucleic acid sequence SEQ ID No.5 ttgaatactcattccttttattgct-5 '(U12-morpholino) or SEQ ID No.6 cacaacatactctctctctttakaa-5 (U6atac-morpholino) or variations (structural relatedness) of said aforementioned nucleic acid sequences having a sequence homology ( complementary nucleic acid bases) of at least 70 percent in the Northern Blot.
  • FIG. 2A BrdU incorporation into control morpholino-injected (cMO) and U12-morpholino-injected (ul2M0) zebrafish embryos.
  • Figure 2B Detection of mitotic cells in embryos treated as described in Figure 2A using anti-phospho-histone H3 / Cy3 antibody staining.
  • a method of diagnosing a disease characterized in that at least one cellular in vivo system containing at least one spliceable pre-mRNA and at least one snRNA U12 or Uli or U ⁇ atac or U5 or U4atac, in the presence of at least one substance of interest and optionally further adjuvants and that the modulation of cell division is detected.
  • the disease is a tumor disease (cancer) or hereditary disease.
  • the present invention is not only a test system, screening system, for substances but also a method for measuring the minor spliceosome activity and its specific elimination.
  • the interference with the minor spliceosome in the organism and the elucidation of the role of the minor esophagosome in cell proliferation provides the basis for finding substances that encode the minor spliceosome and inhibit cell division.
  • the function of the minor esophagosome in the control of cell division is disease-relevant (eg cancer) and can be modulated with substances that influence the minor spliceosome in cells and in the organism.
  • the essential point is therefore also the possibility of simple, effective and specific inhibition of the minor spliceosome in cells or in the organism (eg zebrafish) and thus the definition of the specific role of the minor spliceosome in the organism.
  • Fertilized zebrafish eggs (without chorion) were injected with 0.5 ⁇ l morpholino solution against U12 snRNA (0.0ImM; TCGTTATTTTCCTTACTCATCAGTT) or a solution of a corresponding morpholino with 5 mismatch nucleotides (0.ImM; TCGTGATTTGCCTTCCTCAGCAGTG) as control.
  • BrdU-incorporating cells markers for DNA synthesis, S-phase
  • human breast cancer cell lines are arrested in the cell division cycle.
  • a morpholino was introduced against Ul2 snRNA (TCGTTATTTTCCTTACTCATAAGTT) or a standard control morpholino (CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA).
  • Ul2 snRNA TCGTTATTTTCCTTACTCATAAGTT
  • CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA a standard control morpholino
  • 2x107 cells were electroporated with 20 ⁇ l of a 0.5 mM morpholino solution in 350 ⁇ l PBS. After 24 h the cells were fixed, the DNA stained with DRAQ 5 and the DNA profile was examined by flow cytometry.

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Abstract

Testsystem zur Modulierung, inhibierend oder aktivierend, der Zellteilung bei Eukaryonten enthaltend, mindestens ein zelluläres in vivo System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA, welche mindestens ein Intron enthält und dessen Spleißen abhängig ist von mindestens einer snRNA Ü12 oder U11 oder U6atac oder U5 oder U4atac und die prä-mRNA in (a) mindestens eine Spleißstelle für U12 oder U11 enthält, in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz und ein detektierbares Signal induziert wird, gegebenenfalls mit weiteren Hilfsmittel.

Description

Minor-Spleißosom Testsystem zur Modulierung der Zellteilung
Testsystem zur Modulierung, inhibierend oder aktivierend, der Zellteilung bei Eukaryonten enthaltend, mindestens ein zelluläres in vivo System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA, welche mindestens ein Intron enthält und dessen Spleißen abhängig ist von mindestens einer snRNA U12 oder Uli oder Uδatac oder U5 oder U4atac und die prä-mRNA in (a) mindestens eine Spleißstelle für U12 oder Uli enthält, in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz und ein detektierbares Signal induziert wird, gegebenenfalls mit weiteren Hilfsmittel.
Die allermeisten Gene in höheren Organismen sind gestückelt; d.h. die Information zur Herstellung eines Proteins ist in kleinen Stücken (E- xons) enthalten, die voneinander durch lange nicht kodierende Genbereiche (Introns) getrennt sind (P. A. Sharp, Cell 77, 805 (Jun 17, 1994) . Während der Reifung eines Vorläufer-Botenmoleküls (prä-mRNA) zum funktionellen Botenmolekül (mRNA) müssen die Introns herausgeschnitten werden und die Exons zu einer zusammenhängenden, proteinkodierenden RNA-Sequenz verbunden werden. Man bezeichnet dies als Spleißen. Spleißen erfordert große Molekülkomplexe aus Proteinen und RNA, die Spleißosomen (M. S. Jurica, M. J. Moore, Mol Cell 12, 5
(JuI, 2003) ) . Den Kern dieser Spleißosomen bilden fünf Ribonukleoprotein-Komplexe
(U1-U5 snRNPs) , bestehend aus mehreren Proteinen und je einer „small nuclear" (sn)RNA (Ul, U2 , U4 , U5 oder U6) . In Tieren und Pflanzen wurde neben dem klassischen und in sehr großer Zahl vorkommenden „Major"- (oder U2-Typ) Spleißosom ein zweites und in viel geringerer Kopienzahl vorkommendes „Minor"- (oder U12-Typ) Spleißosom entdeckt. So unterscheidet man das Major-Spleißosom (enthält die Ul, U2, U4 , U5 und U6 snRNPs) , das mehr als 99% der menschlichen Introns prozessiert, vom Minor-Spleißosom. Dieses prozessiert eine seltene Klasse von Introns mit speziellen, hochkonservierten Sequenzen nahe den Intron-Enden und weist zusätzlich eine andere snRNP Zusammensetzung auf (Uli und U12 snRNPs statt Ul und U2 ; und U4atac bzw. U6atac statt U4 und U6) .
Eine Spleißstelle bzw. Splice-Site stellt beim Spleißen die Grenzen der Exons und Introns dar. Ihre Sequenz ist bei „Major"- (oder U2- Typ) Introns wenig konserviert, was eine Voraussage der Exons nur anhand der DNA-Sequenz fast unmöglich macht und eine große Herausforderung in der Bioinformatik darstellt. Diese Sequenzen werden durch die Spleißosomen spezifisch erkannt und heraus gespleißt. In jedem Intron finden sich drei Sequenzbereiche die für die Prozessierung durch das Spleißosom wichtig sind: (1) die 5' splice site, (2) der Polypyrimi- din-Trakt mit dem Branch-Point Adenosin und (3) die 31 Splice site. Ein Standardintron beginnt an der 5' splice site meist mit GU und endet an der 3' Splice site meist auf AG. Insbesondere bei Introns, die durch das so genannte Minor-Spleißosom gespleißt werden, kann die Sequenz 5' AT - 3' AC auftreten, weshalb sie auch als AT-AC-Introns bezeichnet wurden. Die entscheidenden Merkmale für „Minor"- (oder U12- Typ) Introns sind aber die hochkonservierten Sequenzen der 5' splice site (erkannt durch Uli snRNA) und um das Branch-Point Adenosin (erkannt durch U12 snRNA) . Zudem fehlt ein Polypyrimidintrakt . Das Minor-Spleißosom entfernt die sehr seltene Klasse der „Minor" - (oder U12-Typ) Introns, die beim Menschen bis zu 0.4% aller Introns ausmachen (C. B. Bürge, R. A. Padgett, P. A. Sharp, Mol Cell 2, 773 (Dec, 1998) , A. Levine, R. Durbin, Nucleic Acids Res 29, 4006 (Oct 1, 2001) . Neben der für beide Spleißosomen gemeinsamen U5 snRNA, enthält dieses Minor-Spleißosom spezifische snRNAs, nämlich Uli, U12, U4atac und U6atac (A. A. Patel, J. A. Steitz, Nat Rev Mol Cell Biol 4, 960 (Dec, 2003) .
Fehlerhaftes Spleißen kann zu stark ausgeprägten Phänotypen des betroffenen Organismus führen. So ist bekannt, dass Insertionsmutatio- nen in den Genen von Fliegen für U12 und U6atac snRNAs deren Entwicklung verhindern (L. R. Otake, P. Scamborova, C. Hashimoto, J. A. Steitz, Mol Cell 9, 439 (Feb, 2002)) und das Einbringen einer siRNA (small interfering RNA) zur Degradation der mRNA für ein U12- assoziiertes Protein beeinträchtigt die Viabilität einer menschlichen Zeil-Linie (C. L. Will et al . , Rna 10, 929 (Jun, 2004). Die Ursachen für diese Effekte sind jedoch unbekannt.
Die funktionellen Erfordernisse, die zur Evolution von zwei Spleißsystemen, einem Major- und einem Minor-Spleißosom in eukaryontischer Zellen führten, sind weitgehend unverstanden. Insbesondere die Erfordernisse hinsichtlich der Zellteilung (Zellproliferation) sind bisher unverstanden . Zur Untersuchung der beiden Spleißosomen wird im Allgemeinen zunächst eine mRNA durch in vitro Transkription hergestellt, in dem genetische Konstrukte mit Teilen viraler oder zellulärer Genen verwendet werden. Derartige mRNAs enthalten alle wichtigen Strukturelemente, die für die Erkennung der mRNA durch die Spleißosomen und den Ablauf des Spleißens notwendig sind. Im Allgemeinen wird die mRNA radioaktiv markiert, damit nach der Auftrennung mittels eines denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgels das spezifische Bandenmuster, hinsichtlich der stattgefundenen Spleißreaktion beurteilt werden kann. Hier können Störungen in den einzelnen Reaktionsschritten beurteilt und lokalisiert werden. Derartige Testsysteme sind jedoch nicht für alle mRNAs geeignet und sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Sie sind daher nicht für das systematische Auffinden von Substanzen, die das Spleißen modulieren oder gar inhibieren können, geeignet. Weitere Testsysteme für das Major-Spleißosom sind beschrieben in: WO00/52201 beschreibt ein gelfreies in-vitro- Nachweissystem einer Spleißreaktion und die Bereitstellung entsprechender Sonden. WO01/79537 beschreibt ein homogenes Testsystem, welches auch gelfrei ist.
W001/7953 beschreibt ein zelluläres in vivo System, welches spleißfähige Nukleinsäuren, mit mindestens einem Intron verwendet und ein de- tektierbares Signal induziert wird um Wirkstoffe aufzufinden. Diese Testsysteme treffen über die phänotypische Ausgestaltung der Modulierung im Organismus keine Aussage.
In W000/75309 ist ein Spleißosomprotein beschrieben, das mit dem U11/U12 snRNP-Komplex des U12-abhängigen Spleißosoms assoziiert ist und für dieses Spleißosom spezifisch ist und dessen Einsatz für die Diagnostik von Krankheiten. Ein Testsystem zur Untersuchung der Funktion des Ul2 -abhängigen Spleißosoms im Organismus und daraus folgende konkrete, von diesem Spleißosom abhängige physiologische Prozesse, (deren Modulation zur Behandlung von Krankheiten genützt werden können) werden nicht offenbart.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem auf effektive, spezifische und einfache Weise eine große Anzahl von Substanzen auf Ihre Wirkung beim Spleißen durch das Minor-Spleißosom in lebenden Zellen bzw. zellulären in vivo Systemen und hinsichtlich Ihrer Modulation der Zellteilung untersucht werden können. Es besteht ein großes Interesse solche Substanzen und Wirkmechanismen, insbesondere auf ihre modulierende, vorzugsweise inhibierende Wirkung in einem in vivo System zu identifizieren und zu verifizieren, vorzugsweise hinsichtlich der Auswirkungen und Mechanismen der Zellteilung. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es daher ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem auf effektive, spezifische und einfache Weise die Funktion des Unabhängigen Minor-Spleißosoms im physiologischen Kontext des intakten Organismus, zelluläres in vivo System, untersucht werden kann und von ihm abhängige physiologische Prozesse zu definieren, die zur Behandlung von Krankheiten genutzt werden können. Die hierbei gefundene essentielle Rolle bei der Zellteilung macht das Minor-Spleißosom zu einem interessanten Ziel zur effektiven Behandlung von Krankheiten mit außer Kontrolle geratener Zellteilung.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Testsystem zur Modulierung, inhibierend oder aktivierend, der Zellteilung enthaltend, a) mindestens ein zelluläres in vivo System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA, welche mindestens ein Intron enthält, b) mindestens eine snRNA U12 oder Uli oder U6atac oder U5 oder U4atac enthält, c) wobei die prä-mRNA in (a) mindestens eine Spleißstelle für U12 oder Uli enthält , d) in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz e) und ein detektierbares Signal induziert wird f) gegebenenfalls weitere Hilfsmittel
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zelluläre in vivo System aus Eukaryonten ausgewählt. Unter "in vivo" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Umsetzung, d. h. eine Reaktion, verstanden, die innerhalb einer lebenden Zelle abläuft. Zelluläre "in vivo" Systeme im Sinne der Erfindung sind spleißfähige Eukaryonten vorzugsweise Ein- als auch Mehrzeller. Ganz besonders bevorzugt sind Zellinien aus Säugetieren - einschließlich humaner Zellinien oder Hefen oder Fisch-Embryonen oder Insekten-Embryonen, ganz besonders bevorzugt Zebrafisch-Embryonen (Zebrabärbling-Embryonen (Danio rerio, früher Brachydanio rerio) oder Taufliegen-Embryonen (Drosophilidae) . Das Signal nach (e) morphologisch und/oder optisch und/oder biochemisch detektierbar ist, wie beispielhaft und nicht abschließend die Detektion von BrdU (5 ' -Bromo-2 x -deoxyuridin) BrdU ist nicht radioaktiv und kann in vivo appliziert werden nach dem Einbau in replizierende DNA mittels monoklonaler Antikörper, immunhistochemisch an Ge- websschnitten, ganzen Embryonen oder Zellkulturen nachgewiesen werden. (z.B in ELISA für Zellkultur oder direkt im Organismus mit fluo- reszens-markiertem Antikörper, z. B. Antikörper gegen BrdU gekoppelt mit FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat; RT-PCR zur Detektion von minor- class Splicing) . Auch können die dem Fachmann bekannten Proteine, die ein optisches Signal induzieren, sowie Reportermoleküle wie GFP (green fluorescent protein, Protein aus der Qualle Aequorea victo- ria) , oder dessen Varianten die andere Fluoreszenzspektren aufweisen. Entsprechend der Farbe heißen diese zum Beispiel CFP (cyan) oder YFP (yellow) , als auch die enhanced-Varianten wie z.B. dem enhanced GFP (eGFP) oder enhanced YFP (eYFP) . Sowie fluoreszente Proteine aus Korallen (Anthozoa) wie zoanFP (aus Zoanthus sp.) oder auch das rot fluoreszierende Protein drFP583 (aus Discosoma) , Handelsname DsRed und andere, die von Reportergenen kodiert werden. Bevorzugt sind daher spleißfähige Nukleinsäuren gemäß Merkmal (a) und (c) , die Merkmal (a) repräsentieren und für ein detektierbares Signal (e) kodieren, ausgewählt aber nicht abgeschlossen aus derartigen Reportergenmolekülen.
Des Weiteren können weiteren Hilfsmittel gemäß Merkmal (f) enthalten sein, diese Hilfsmittel gemäß Merkmal (f) sind nicht abschließend ausgewählt aus ATP, Antibiotika z. B. Tertracyclin, Glucose und andere Hilfsmittel.
Durch die Interferenz mit Spleißosom-spezifischen „small nuclear" (sn) RNA-Sequenzen ist es gelungen die beiden Spleißsysteme in Zebrafisch-Embryonen und in menschlichen Tumorzellen selektiv zu hemmen. Durch diesen Ansatz wird gezeigt, dass das Minor-Spleißosom eine spezifische und essentielle Funktion im Zellteilungszyklus während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren und in Tumorzellen hat. Diese unerwartete spezifische Funktion in der Zellteilung wird im erfindungsgemäßen Testsystem genutzt um über die Hemmung der snRNA- Funktion das Minor-Spleißsystem in Tumorzellen auszuschalten, und damit deren Wachstum und Teilung zu unterbinden. Folgende Begriffe werden in der vorliegenden Erfindung wie folgt ausgelegt:
Nukleinsäuren setzen sich aus Basen, Phosphatgruppen, sowie den Zuckern Desoxyribose (DNA) oder Ribose (RNA) zusammen. Sie sind Träger der Erbinformationen.
Nukleotide sind die Bausteine der Nukleinsäuren DNA und RNA. Jedes Nukleotid besteht aus einer Base (Purin oder Pyrimidin) einem Zuckermolekül (Desoxyribose oder Ribose) und einer Phosphatgruppe. Über Bindungen werden die Nukleotide miteinander zu Ketten verknüpft. Oligonukleotide sind kurze Nukleinsäurefragmente mit nur wenigen Nukleotiden. Sie haben die Möglichkeit zur komplementären Paarung mit der DNA oder RNA.
RNA (engl.: ribonucleic acid) ist eine aus Nukleotiden zusammengesetzte Molekülkette. Bestimmte Typen dieser Ribonukleinsäure übernehmen in Zellen die Aufgabe der Informationsübertragung von den Genen zu den Ribosomen. mRNA ist die messenger-RNA Moleküle, diese entstehen bei der Transkription als Abschrift der genetischen Informationen der DNA. Die einsträngigen mRNA transportiert die Bauanleitung für die Proteine zu den Ribosomen
Als prä-mRNA (synonym: hnRNA von engl, heterogeneous nuclear RNA) bezeichnet man ein Zwischenprodukt, das bei der Übersetzung der DNA in Proteine bei Eukaryonten vorkommt. Es ist die Boten-Ribonukleinsäure mRNA unmittelbar nach ihrer Entstehung in der Transkriptionsphase der Proteinbiosynthese (Eiweißsynthese) , wenn sie noch nicht prozessiert wurde. Die prä-mRNA kommt beim ersten Übersetzungs-Schritt, der Transkription, als Zwischenprodukt vor: Nicht alle DNA-Abschnitte, die in einem Gen liegen, kodieren tatsächlich für Proteine, sondern nur die als Exons bezeichneten Abschnitte. Bei der Transkription kopiert das Enzym RNA-Polymerase II den kompletten Bereich der DNA, inklusive aller Introns, also nicht-proteincodierender Abschnitte. Das Produkt wird als prä-mRNA bezeichnet. Die durch das Spleißen der prä- mRNA entstehende RNA-Sequenz, wird als mRNA bezeichnet. Bei Eukaryonten wird die prä-mRNA durch Anfügen einer Cap-Struktur (am 5 '-Ende), eines PoIy (A) -Schwanzes und durch Spleißen der Introns im Zellkern modifiziert. Dies geschieht teilweise bereits während der Transkrip- tion. Die fertig prozessierte RNA wird reife mRNA genannt. Diese wird in das Cytoplasma transportiert, wo die Translation beginnt. siRNA (small interfering RNA) ist eine bestimmte Klasse der RNA zur gezielten Hemmung der Translation bestimmter mRNAs .
Spleißosom ist ein großes Aggregat von snRNA- und snRNP-Molekülen, das das prä-mRNA-Spleißen in einer Eukaryontenzelle ausführt. Um einen funktionelles Spleißosom zu bilden, werden die einzelnen Bestandteile (prä-mRNA, snRNPs und snRNA) in einem stufenweisen Prozess zusammengesetzt . snRNA (small nuclear RNA) sind RNA-Moleküle, die mit Proteinen kom- plexiert sind, um die am RNA-Spleißen beteiligten Ribonucleoprotein- Partikel zu bilden. snRNAs sind etwa 100 bis 300 Basenpaare große RNAs. Es handelt sich um katalytisch aktive RNAs im Zellkern von Eu- karyonten. Sie liegen mit Proteinen assoziiert in Form snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) vor und sind verantwortlich für das Spleißen der Introns von prä-mRNA zu mRNA. Diese snRNPs bilden den Kern der Spleißosomen, die in der Zelle das Spleißen der prä-mRNA ausführen.
Spleißen, hier RNA-Spleißen (RNA-Splicing) , Vorgang, durch den Intronsequenzen aus RNA-Transkripten im Zellkern bei Bildung der mRNA und anderer RNAs herausgeschnitten wird.
Morpholinos oder Morpholino Oligos sind Nukleinsäuren, die als Werkzeuge in der Genetik verwendet werden, um einen Knockdown von Genen zu erzielen. Es handelt sich um synthetische Moleküle, die durch strukturell veränderte Nukleinsäure-Bausteine erzeugt werden und die auch als PMOs (phosphorodiamidate morpholino oligo) bezeichnet werden. Sie werden in antisense-RNA-Experimenten eingesetzt und hemmen durch die Bindung an die komplementäre mRNA entweder die Translation oder das Spleißen der prä-mRNA und damit die Bildung eines Proteins. Ihre Wirkungsweise ist also vergleichbar den siRNAs, jedoch besitzen Morpholinos eine höhere Stabilität und damit längere Halbwertszeit, da sie keine RNAse Substrate darstellen. Nachteil ist jedoch, dass eine Transfektion der Morpholinos schwierig ist, daher wird meist auf Injektion zurückgegriffen
( Summerton J, Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 Jun;7(3) : 187-95. ) Ein Somit (eingedeutschtes Latein von somitus) ist ein so genanntes Ursegment (Urwirbel) , das vorübergehend in der embryonalen Entwicklung der Wirbeltiere auftritt. Die Somiten werden in Kopf-Fuß- Richtung (kraniokaudal) aus dem Mesoderra seitlich der Mittellinie (paraxial) abgeschnürt. Sie liegen daher in zwei Strängen rechts und links der axialen Strukturen Chorda dorsalis und Neuralrohr. Der Somit besteht zunächst aus Epithel mit einem mesenchymalen Hohlraum, dem Somitozöl . Später wird der ventromediale Anteil mesenchymal und als Skierotom bezeichnet. Der dorsolaterale (zum seitlichen Rücken gerichtete), epithelial gebliebene Anteil, wird Dermatomyotom genannt .
SEQ ID No.1 stellt eine Nukleinsäuresequenz für die U12 snRNA (human) , NCBI Accession J04119 da.
SEQ ID No. 2 stellt eine Nukleinsäuresequenz für die Uδatac snRNA (human), NCBI Accession U62823, NCBI Accession JO4119 da. SEQ ID No. 3 stellt eine Nukleinsäuresequenz für die U4atac snRNA (human) , NCBI Accession 62822 da.
SEQ ID No. 4 stellt eine Nukleinsäuresequenz für die Uli snRNA (human) , NCBI Accession JO4118.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz zur Hemmung der Zellteilung unter Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz gemäß Merkmal (d) das prä-mRNA-Spleißen des Minor- Spleißosoms beeinflusst und zwar inhibiert oder aktiviert. Insbesondere in der Ausführungsform, dass das prä-mRNA-Spleißen durch die Modulierung der jeweiligen Erkennungssequenz (Abbildung 1) zwischen den snRNAs des Minor-Spleißosoms U12 oder Uli mit der prä-mRNA gemäß Merkmal (c) , oder der jeweiligen Erkennungssequenz zwischen U6atac oder U4atac, oder jeweiligen Erkennungssequenz zwischen U6atac und U12 erfolgt. Vorzugsweise wird wirksame Substanz ausgewählt aus Naturstoffen im weitesten Sinne, kombinatorischen Substanzbibliotheken, Pharmazeutika, Insektiziden, Herbiziden, Pestiziden, Nucleinsäure- Oligomere, Antikörper. Diese kann eine natürlich vorkommende, natürliche vorkommende und chemisch modifizierte und/oder synthetische Substanz sein.
Zur Untersuchung der Funktion des Minor-Speißsystems ist das erfindungsgemäße Verfahren zur selektiven Hemmung der Funktion von Splei- ßosom spezifischen snRNAs entwickelt worden. Eine Ausführungsform ist die Hemmung mit synthetischen Nukleinsäure-Oligomeren, so genannten Morpholino-Oligomeren (Morpholinos) , die spezifisch an snRNAs binden und Sequenzen maskieren, welche die Interaktion mit Sequenzelementen in der prä-mRNA und mit anderen snRNAs im Spleißosom vermitteln. Bevorzugt Morpholino-Oligomere mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID No.5 ttgaatactcattccttttattgct-5' (U12-Morpholino) oder SEQ ID No.6 cacaa- catactttcctctcttccaa-5 (U6atac-Morpholino) oder Variationen (strukturelle Verwandtschaft) dieser vorgenannten Nukleinsäuresequenzen mit einer Sequenzhomologie (komplementäre Nukleinsäurebasen) von mindestens 70 Prozent im Northern Blot .
Vergleich von Mensch U6atac snRNA und U12 snRNA Sequenzen, sowie Positionen der verwendeten Morpholino-Oligomere (Fig. 1) . Die markierten Bereiche in den menschlichen Sequenzen sind komplementär zu den jeweils verwendeten Morpholino-Oligomeren, deren Sequenz darüber gezeigt ist. Sequenzbereiche, die RNA-RNA-Interaktionen vermitteln sind mit Markierungen unterlegt (Fig. 1): Markierung für Interaktionen der Uli snRNA mit der 5' -Spleissstelle; für U12-U6atac-Helix I- Interaktionen,- sowie für Interaktionen mit der U12 snRNA mit der Verzweigungsstelle („Branch point") und die U4atac-U6atac Interaktion.
Durch Injektion solcher Morpholinos in befruchtete Zebrafish-Eier wurde die Rolle der beiden Spleißsysteme in der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren untersucht. Dabei führte die Hemmung des Major- Spleißosoms, das mehr als 99% aller mRNAs spleißt, zu einer sehr frühen Unterbrechung der Entwicklung (vor der Gastrulation) , d.h. sobald Gene neu abgelesen werden und somit Spleißen benötigt wird. Im Gegensatz dazu, entwickeln sich Embryonen bei denen das Minor-Spleißosom durch Morpholinos erfindungsgemäß gegen U12 oder U6atac snRNAs gehemmt wurde sehr viel weiter, bis zur Bildung der Somiten, und zeigen Defekte in Zonen mit hoher Zellteilungsrate.
Die Morpholino vermittelte Hemmung des Minor-Spleißosoms hemmt den Zellteilungszyklus in Zebrafisch-Embryonen (Fig. 2) und in menschlichen Tumorzellen (Fig. 3) . Fig. 2A BrdU-Einbau in mit Kontroll- Morpholino-inj izierten (cMO) und in U12 -Morpholino- inj izierten (ul2M0) Zebrafisch-Embryonen. BrdU einbauende Zellen wurden durch einen FITC-gekoppelten (FITC = Fluoreszein-Isothiocyanat) anti-BrdU An- tikörper und anschließende Fluoreszensmikroskopie sichtbar gemacht. Fig. 2B Detektion von mitotischen Zellen in Embryonen, die wie in Fig. 2A beschrieben behandelt wurden, mit Hilfe von anti-phospho- Histon H3/Cy3 Antikörper Färbung. Die Zahlen über den Abbildungen geben das Entwicklungsstadium (1 bzw. 6-8 Somiten-Stadium) an. Die Skizze links zeigt den abgebildeten Bereich der Embryonen. Zellzyk- lusprofile (Fig. 3), gemessen durch Durchflusszytometrie, von menschlichen MDA-MB231 und Hs578T Brustkarzinom-Zellen, die entweder mit einem Kontroll-Morpholino (cMO) oder einem oder einem Morpholino gegen U12 snRNA (U12 MO) transfiziert wurden. Die Zellen wurden 24h nach der Transfektion mit Ethanol fixiert und mit dem DNA-Farbstoff DRAQ5 behandelt. SubGl bezeichnet Zellen mit DNA-Gehalt <2n. Überraschenderweise, fanden wir eine spezifische und essentielle Funktion des Minor-Spleißosoms für das Durchlaufen des Zellteilungszyklus: Die Hemmung des Minor-Spleißsystems stoppt die Zellteilung durch Verminderung des Übergangs zur DNA-Replikations-Phase . Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass diese essentielle Funktion für die Zellteilung auch in normalen und tumorigenen menschlichen Zellen konserviert wurde. Zellzyklusanalysen in verschiedenen menschlichen Tumorzellen zeigen eine Arretierung des Zellteilungszykluses nach Hemmung des Minor-Spleißsystems durch Morpholinos gegen U12 und Uδatac snRNAs. Des Weiteren induziert die Unterbrechung des Zellteilungszyklus den Zelltod der Tumorzellen.
Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zelluläres in vivo-System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA und mindestens eine snRNA U12 oder Uli oder Uδatac oder U5 oder U4atac enthält, in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel und das die Modulation des Zellteilung nachgewiesen wird. Vorzugsweise, dass die Erkrankung eine Tumorerkrankung (Krebs) oder eine Erbkrankheit ist.
Die vorliegende Erfindung ist nicht nur ein Testsystem, Screening- system, für Substanzen sondern auch eine Methode zur Messung der Mi- nor-Spliceosome-Aktivität und zu deren spezifischen Ausschaltung. Die Interferenz mit dem Minor-Spliceosome im Organismus und die Aufklärung der Rolle des Minor Speißosoms bei der Zeilproliferation liefert die Grundlage Substanzen zu finden, die das Minor-Spleißosom und da- mit die Zellteilung hemmen. Die Funktion des Minor Speißosoms in der Kontrolle der Zellteilung ist krankheitsrelevant (z.B. Krebs) und kann mit Substanzen die das Minor-Spleißosom beeinflussen in Zellen und im Organismus moduliert werden. Essentieller Punkt ist deshalb auch die Möglichkeit zur einfachen, effektiven und spezifischen Hemmung des Minor-Spleißosoms in Zellen oder im Organismus (z. B. Zebrafisch) und dadurch die Definition der konkreten Rolle des Minor- Spliceosom im Organismus.
Beispiel 1
Die Injektion eines Morpholino-Oligomers gegen U12 snRNA in befruchtete Zebrafisch-Eier führt zu einer Blockade der DNA-Replikation und nachfolgend der Mitose in Zebrafischembryonen während der Somitogene- se .
Befruchtete Zebrafisch-Eier (ohne Chorion) wurden mit 0.5-lnl Morpho- lino-Lösung gegen U12 snRNA (0.0ImM; TCGTTATTTTCCTTACTCATCAGTT) oder einer Lösung eines entsprechenden Morpholinos mit 5 Mismatch- Nukleotiden (0.ImM; TCGTGATTTGCCTTCCTCAGCAGTG) als Kontrolle injiziert. Zu verschiedenen Entwicklungsstadien (1 bzw. 6-8 Somiten) wurden BrdU-einbauende Zellen (Marker für DNA-Synthese, S-Phase) nach Fixierung mit einem Fluorescein-gekoppelten anti-BrdU-Antikörper und anschließender Fluoreszensmikroskopie analysiert. Des Weiteren wurden Zellen in der Mitose-Phase (M-Phase) durch einen anti-phospho-Histon H3 Antikörper und einen sekundären Cy3 -gekoppelten Antikörper nach Fluoreszensmikroskopie visualisiert . Parallel wurden beispielhaft das Entfernen von „Minor-class" Introns aus prä-mRNA verschiedener Gene getestet und so nachgewiesen, dass das Minor-Spleißsystem durch das U12-Morpholino spezifisch gehemmt wurde (Daten nicht gezeigt) . Während es bei der Gastrulation keinen Unterschied beim BrdU-Einbau zwischen Kontroll- und U12-Morpholino-injizierten Embryonen gab (Daten nicht gezeigt) , konnten BrdU-positive Zellen im 1-Somiten-Stadium bereits nicht mehr detektiert werden (Fig. 2A) . Die Häufigkeit mitotischer Zellen, visualisiert durch phospho-Histon H3 -Färbung, war im 6- 8 Somiten-Stadium stark verringert (Fig. 2. B) . Dieses Ergebnis zeigt, dass die Hemmung des Minor-Spleißosoms den Eintritt der embryonalen Zellen in die DNA-Synthesephase hemmt. Beispiel 2
Durch das Einbringen eines U12-Morpholino-Oligomers werden menschliche Brustkrebs-Zelllinien im Zellteilungszyklus arretiert. In menschliche Brustkrebs-Zelllinien (MCF7, MDA-MB-231, Hs578T) wurde ein Morpholino gegen Ul2 snRNA (TCGTTATTTTCCTTACTCATAAGTT) oder ein Standard-Kontroll-Morpholino (CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA) eingebracht . Dazu wurden 2x107 Zellen mit 20μl einer 0.5mM Morpholino-Lösung in 350μl PBS elektroporiert . Nach 24h wurden die Zellen fixiert, die DNA mit DRAQ 5 angefärbt und das DNA-Profil mit Durchflußzytometrie untersucht. Parallel wurde das Entfernen von „Minor-class" Introns aus prä-mRNAs verschiedener Gene getestet, und so nachgewiesen, dass das Minor-Spleißsystem nach U12-Morpholino-Elektroporation spezifisch gehemmt wurde. Wie in Fig. 3 gezeigt, führt die U12-Morpholino- Behandlung zu einer starken Reduktion des Anteils an Zellen in der S-
(DNA-Synthese) Phase und in der G2/M- (Mitose) Phase sowie zu einer Akkumulation der Zellen in der Gl-Phase (Phase vor der S-Phase) . Dasselbe Ergebnis wurde mit einem Morpholino gegen Uδatac snRNA
(AACCTTCTCTCCTTTCATACAACAC) erhalten. Dieses Ergebnis zeigt die Arretierung der Zellen vor dem Eintritt in die DNA-Synthese Phase durch Hemmung des Minor-Spleißsystems .

Claims

Patentansprüche ;
1. Testsystem zur Modulierung , inhibierend oder aktivierend, der Zellteilung enthaltend:
a) mindestens ein zelluläres System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA, welche mindestens ein Intron enthält,
b) mindestens eine snRNA U12 oder Uli oder U6atac oder U5 oder U4atac enthält,
c) wobei die prä-mRNA in (a) mindestens eine Spleißstelle für U12 oder Uli enthält ,
d) in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz
e) und ein detektierbares Signal induziert wird
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zelluläre Syεstem aus Eukaryonten ausgewählt ist.
3. Testsystem nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal nach (e) morphologisch und/oder optisch und/oder biochemisch detektierbar ist.
4. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es weitere Hilfsmittel nicht abschließend ausgewählt aus ATP, Antibiotika z. B. Te^rtracyclin, Glucose und andere Hilfsmittel enthalten kann.
5. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz zur Hemmung der Zellteilung unter Verwendung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz gemäß Merkmal (d) das prä-mRNA-Spleißen des Minor-Spleißosoms beein- flusst und zwar inhibiert oder aktiviert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das prä- mRNA-Spleißen durch die Modulierung der jeweiligen Erkennungssequenz zwischen den snRNA des Minor-SpIeißosoms U12 oder Uli mit der prä-mRNA gemäß Merkmal (c) , oder der jeweiligen Erkennungssequenz zwischen Uδatac oder U4atac, oder jeweiligen Erkennungssequenz zwischen Uδatac und U12 oder Uli, erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wirksame Substanz ausgewählt ist aus Naturstoffen im weitesten Sinne, kombinatorischen Substanzbibliotheken, Pharmazeutika, Insektiziden, Herbiziden, Pestiziden, Nucleinsäure-Oligomeren, Antikörper.
8. Verfahren nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchenden Substanz ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürliche vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Substanz.
9. Verfahren zum in vitro Nachweis einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zelluläres System enthaltend mindestens eine spleißfähige prä-mRNA und mindestens eine snRNA U12 oder Uli oder U6atac oder U5 oder U4atac enthält, in Gegenwart mindestens einer interessierenden Substanz und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel und das die Modulation des Zellteilung nachgewiesen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Tumorerkrankung (Krebs) oder eine Erbkrankheit ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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DE19925668A1 (de) 1999-06-04 2001-03-15 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Spleißosomprotein und seine Verwendung
US6137936A (en) 1999-07-22 2000-10-24 Pirelli Cables And Systems Llc Optical fiber cable with single strength member in cable outer jacket
DE10018465A1 (de) 2000-04-14 2001-10-18 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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