EP2162536A1 - Targeted provision of recombinase activity by trans-splicing - Google Patents

Targeted provision of recombinase activity by trans-splicing

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EP2162536A1
EP2162536A1 EP08759293A EP08759293A EP2162536A1 EP 2162536 A1 EP2162536 A1 EP 2162536A1 EP 08759293 A EP08759293 A EP 08759293A EP 08759293 A EP08759293 A EP 08759293A EP 2162536 A1 EP2162536 A1 EP 2162536A1
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
acid sequence
transcribable
ability
transcript
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Withdrawn
Application number
EP08759293A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Christine Tertilt
Thorsten Buch
Hansjörg Schild
Saskia Hemmers
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Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells

Abstract

The invention relates to nucleic acid transcripts that only as a result of a trans-splicing event provide a nucleic acid transcript that codes a polypeptide with recombinase activity and nucleic acids coding said nucleic acid transcripts. The expression of the nucleic acid transcripts is preferably done in a cell or tissue specific way. Nucleic acids and nucleic acid transcripts of said kind can be used for a method to provide recombinase activity in a cell and for a method for the recombination of DNA in a cell.

Description

Gezielte Bereitstellung von Rekombinase-Aktivität durch Trans-Spleißen Targeted delivery of recombinase activity by trans-splicing
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuretranskripte, die erst durch ein trans-Spleiß-Ereignis ein Nukleinsäuretranskript liefern, das für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert, und für solche Nukleinsäuretranskripte kodierende Nukleinsäuren. Die Expression der Nukleinsäuretranskripte erfolgt vorzugsweise in einer zell- oder gewebsspezifischen Weise. Solche Nukleinsäuren und Nukleinsäuretranskripte sind für ein Verfahren zur Bereitstellung von Rekombinase-Aktivität in einer Zelle und ein Verfahren zur Rekombination von DNA in einer Zelle verwendbar.The invention relates to nucleic acid transcripts which only by a trans-splicing event provide a nucleic acid transcript which codes for a polypeptide having recombinase activity, and for nucleic acids encoding such nucleic acid transcripts. The expression of the nucleic acid transcripts is preferably carried out in a cell or tissue-specific manner. Such nucleic acids and nucleic acid transcripts are useful for a method of providing recombinase activity in a cell and a method of recombining DNA in a cell.
Technischer HintergrundTechnical background
Die Cre Rekombinase ist ein Enzym aus dem Phagen Pl, welches die Rekombination von DNA zwischen spezifischen Target-Sequenzen oder Erkennungssequenzen, den loxP Stellen, vermittelt (Sauer, B. (1993) Methods in Enzymology 225, 890-900; Rajewsky, K. et al. (1996) The Journal of Clinical Investigation 98, 51-53). Dabei kommt es zur Deletion der Sequenz zwischen den loxP Stellen, wenn diese gleichgerichtet sind, und zur Inversion der dazwischen liegenden Sequenz, wenn die loxP Stellen in gegenläufiger Orientierung vorliegen. Das System der Cre Rekombination wird zurzeit umfassend verwendet, um zellspezifische genetische Veränderungen in Mäusen zu erreichen. Dabei wird die Expression der Cre Rekombinase unter die Kontrolle eines zellspezifischen Promoters gestellt, so dass es in Zellen, in denen dieser Promoter aktiv ist, zur gewünschten genetischen Veränderung kommt.Cre recombinase is an enzyme from phage Pl, which mediates the recombination of DNA between specific target sequences or recognition sequences, the loxP sites (Sauer, B. (1993) Methods in Enzymology 225, 890-900, Rajewsky, K. et al., (1996) The Journal of Clinical Investigation 98, 51-53). This results in deletion of the sequence between the loxP sites when aligned and inversion of the intervening sequence when the loxP sites are in opposite orientation. The system of Cre recombination is currently being used extensively to target cell-specific genetic alterations in mice. The expression of the Cre recombinase is placed under the control of a cell-specific promoter, so that it comes in cells in which this promoter is active, the desired genetic change.
Dieses System ist derzeit dadurch limitiert, dass es auf Zellpopulationen beschränkt bleibt, die sich eindeutig durch die Aktivität eines speziellen Promoters definieren lassen. Um das System auch auf Zellen und Subpopulationen von Zellen auszudehnen, die sich hierdurch nicht abgrenzen lassen, wurden bisher folgende Ansätze unternommen:This system is currently limited in that it remains limited to cell populations that can be clearly defined by the activity of a particular promoter. In order to extend the system to cells and subpopulations of cells, which can not be delimited by this, so far the following approaches have been taken:
1. Kombination von Cre Rekombinase unter der Kontrolle eines Promoters und Einfügen eines Konstruktes zur Überexpression eines gewünschten Gens unter der Kontrolle eines zweiten Promoters. Dabei wird die Expression des Transgens zunächst durch eine mit loxP Stellen flankierte Stopp-Kassette verhindert. Nur in Zellen, in denen Cre aktiv ist, wird diese entfernt, und das Transgen exprimiert. Dieses System funktioniert in einigen Ansätzen, ist jedoch auf Überexpression limitiert. Eine Deletion von DNA in durch 2 Promotoren definierten Zellen lässt sich hierdurch nicht erreichen.1. Combining Cre recombinase under the control of a promoter and inserting a construct to overexpress a desired gene under the control of a second promoter. The expression of the transgene is initially prevented by a flanked with loxP sites stop cassette. Only in cells where Cre is active does this become removed, and the transgene expressed. This system works in some ways but is limited to overexpression. A deletion of DNA in cells defined by 2 promoters can not be achieved thereby.
2. Kombination von Cre Rekombinase und FIp Rekombinase. Die FIp Rekombinase ist eine weitere Rekombinase, die ebenso wie Cre zur Rekombination von DNA an spezifischen Target-Sequenzen und dadurch zur Deletion oder Inversion von DNA- Abschnitten führt. Da die FIp Rekombinase andere Target-Sequenzen erkennt als die Cre Rekombinase, lassen sich die beiden Systeme kombinieren. Indem man die eine Rekombinase unter die Kontrolle eines Promoters und die andere Rekombinase unter die Kontrolle eines zweiten Promoters stellt, lassen sich so genetische Veränderungen unter der Kontrolle von zwei Promotoren durchführen. Die FIp Rekombinase ist aber deutlich weniger effizient als die Cre Rekombinase, wodurch stets nur eine relativ niedrige Frequenz an Rekombination erreicht wird (Buchholz, F. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 4256-4262; Buchholz, F. et al. (1998) Nature Biotechnology 16, 657-662; Schaft, J. et al. (2001) Genesis 31, 6-10). Die Kombination von FIp und Cre würde so funktionieren, dass zunächst Cre-transgene Mäuse erzeugt werden, bei denen die Cre Rekombinase unter Kontrolle eines spezifischen Promoters steht, die Expression aber durch eine frt- flankierte Stopp-Kassette unterbunden wird. Erst aufgrund der Expression von FIp (unter Kontrolle eines zweiten Promoters) wird in diesem System die Cre Rekombinase dann ausgeprägt und kann das „gene of interest" ausschneiden. Zusätzlich zu der ohnehin schlechten Effizienz von FIp müssen in diesem System beide Rekombinasen nacheinander wirken. Es ist davon auszugehen, dass die Rekombinationseffizienz sehr schlecht ist (10-30%). Die Effizienz ist aber entscheidend, wenn es darum geht, die Funktion von Genen in Subpopulationen zu untersuchen. Um einen Effekt im Sinne von "loss of function" eines Gens in einer spezifischen Population von Zellen zu untersuchen, ist man darauf angewiesen, dass die Deletion tatsächlich in der überwiegenden Mehrzahl der Zellen erfolgt ist. Nach dem gegenwärtigen Stand der Forschung wird sich dies durch eine Kombination des FIp und des Cre Systems nicht erreichen lassen.2. Combination of Cre recombinase and FIp recombinase. FIp recombinase is another recombinase that, like Cre, results in the recombination of DNA to specific target sequences and thereby the deletion or inversion of DNA segments. Since the FIp recombinase recognizes other target sequences than the Cre recombinase, the two systems can be combined. By placing one recombinase under the control of one promoter and the other recombinase under the control of a second promoter, genetic alterations under the control of two promoters can be made. However, FIp recombinase is significantly less efficient than Cre recombinase, whereby only a relatively low frequency of recombination is always achieved (Buchholz, F. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 4256-4262; Buchholz, F. et al (1998) Nature Biotechnology 16, 657-662; Schaft, J. et al. (2001) Genesis 31, 6-10). The combination of FIp and Cre would work by first producing Cre-transgenic mice in which the Cre recombinase is under the control of a specific promoter, but expression is inhibited by a flanked stop cassette. It is only because of the expression of FIp (under control of a second promoter) that Cre recombinase is expressed in this system and can excise the "gene of interest." In addition to the already poor efficiency of FIp, both recombinases must act in this system in succession It can be assumed that the recombination efficiency is very poor (10-30%), but the efficiency is crucial when it comes to studying the function of genes in subpopulations - an effect in the sense of "loss of function" of a gene In a specific population of cells, it is believed that the deletion actually occurred in the vast majority of cells and, according to the current state of research, this can not be achieved by a combination of the FIp and the Cre system.
Somit liegt der Erfindung insbesondere die Aufgabe zugrunde, Rekombinase- Aktivität gezielter als bisher möglich in bestimmten Zellen bereitzustellen und dadurch vorzugsweise Rekombination in Zellen gezielter als bisher möglich zu steuern. Insbesondere liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Rekombination gezielt in Zellen auszulösen, für die kein Promotor verfügbar ist, der spezifisch in diesen Zellen aktiv ist. Die Rekombination sollte dadurch insbesondere auf bestimmte Zellen oder Gewebe in einem Organismus beschränkt bleiben können.Thus, the invention is more particularly based on the object to provide recombinase activity more targeted than previously possible in certain cells and thereby preferably to control recombination in cells more targeted than previously possible. In particular, the invention is based on the object of specifically triggering recombination in cells for which no Promoter is available, which is specifically active in these cells. The recombination should thereby be able to be limited in particular to certain cells or tissues in an organism.
Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention
Die Erfindung betrifft die Verbindung der Techniken des trans-Spleißens und der Rekombination. Erfindungsgemäß werden verschiedene Teile einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz in zwei oder mehr verschiedene Nukleinsäuremoleküle eingebaut und somit vorzugsweise unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren transkribierbar. Die von den verschiedenen Nukleinsäuremolekülen erhaltenen Transkripte kodieren vorzugsweise kein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität, sind jedoch fähig, als Substrat für ein trans-Spleißen zu fungieren, wobei durch dieses trans-Spleißen eine Nukleinsäure entsteht, die für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert. D.h., die Teile der für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz werden erst durch das trans-Spleißen wieder so zusammengefügt, dass ein funktionelles Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert wird. Erfindungsgemäß kann die Expression einer Rekombinase somit unter die Kontrolle mehrerer verschiedener Promotoren gestellt werden, wobei diese Promotoren vorzugsweise erst in ihrer Kombination eine gewisse Zell- oder Gewebsspezifϊtät der Expression des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität definieren.The invention relates to the combination of the techniques of trans-splicing and recombination. According to the invention, different parts of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity are incorporated into two or more different nucleic acid molecules and thus preferably transcribable under the control of different promoters. The transcripts obtained from the various nucleic acid molecules preferably do not encode a polypeptide having recombinase activity, but are capable of acting as a substrate for trans-splicing, which trans-splicing produces a nucleic acid encoding a polypeptide having recombinase activity. That is, the portions of the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity are reassembled by trans-splicing to encode a functional polypeptide having recombinase activity. According to the invention, the expression of a recombinase can thus be placed under the control of several different promoters, these promoters preferably only when combined to define a certain cell or tissue specificity of the expression of the polypeptide having recombinase activity.
Die Erfindung schafft die Möglichkeit, die Aktivität einer Rekombinase, insbesondere der Cre Rekombinase, durch mehr als einen Promoter zell- und/oder gewebsspezifische zu kontrollieren. Dadurch lassen sich Zellen oder Gewebe ansteuern, die nicht allein durch die Aktivität eines Promoters definierbar sind.The invention makes it possible to control the activity of a recombinase, in particular Cre recombinase, by means of more than one promoter, cell- and / or tissue-specific. As a result, it is possible to control cells or tissue that can not be defined solely by the activity of a promoter.
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, Subpopulation eines Zelltyps zu untersuchen, da sich erfindungsgemäß verschiedene Transgene kombinieren lassen. Zum Beispiel kann ein Teil der trans-Spleiß-Rekombinase unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promoters dieses Zelltyps exprimiert werden, und der andere Teil der trans-Spleiß-Rekombinase unter jeweils für die Subpopulationen spezifischen Promotoren. Dadurch müssen nicht für jede Subpopulation zwei neue Mausstämme generiert werden, sondern es lässt sich ein „zelltyp-spezifischer" Stamm mit diversen „subtyp-spezifischen" Stämmen kombinieren, wobei Mäuse entstehen, die zwei Nukleinsäuren™ leküle tragen, die jeweils für einen von zwei Teilen einer Rekombinase kodieren, wobei der eine Teil zelltyp-spezifisch und der andere Teil subtyp- spezifisch exprimiert wird. Nur in Zellen, in denen beide Promotoren aktiv sind, werden beide Nukleinsäuren transkribiert und deren Transkripte unterlaufen ein trans-Spleißen, nach dem eine für eine funktionelle Rekombinase kodierende Nukleinsäure entsteht. Analog dazu lassen sich auch eine zelltyp-spezifische trans-Spleiß-Rekombinase mit einer induzierbaren Rekombinase (z.B. Cre-ERT2) kombinieren, indem z.B. der erste Teil der Rekombinase zellspezifisch ausgeprägt wird und der zweite Teil der Rekombinase induzierbar ist und ubiquitär ausgeprägt wird.Another advantage is the possibility to study subpopulation of a cell type, since according to the invention different transgenes can be combined. For example, a portion of the trans-splice recombinase may be expressed under the control of a common promoter of this cell type, and the other portion of the trans-splice recombinase under respective subpopulation-specific promoters. As a result, it is not necessary to generate two new mouse strains for each subpopulation, but instead a "cell type-specific" strain can be combined with various "subtype-specific" strains, resulting in mice. carrying two nucleic acid molecules each coding for one of two parts of a recombinase, one part being cell-type specific and the other part being subtype-specifically expressed. Only in cells where both promoters are active, both nucleic acids are transcribed and their transcripts undergo trans-splicing to yield a nucleic acid encoding a functional recombinase. Analogously, a cell-type-specific trans-splice recombinase can be combined with an inducible recombinase (eg Cre-ERT2) by, for example, expressing the first part of the recombinase cell-specifically and the second part of the recombinase being inducible and ubiquitous.
Ein weiterer Vorteil ist, dass nur eine Rekombinase verwendet werden kann, wodurch die effizienteste Rekombinase verwendet werden kann und bereits vorhandene Mausstämme mit Erkennungssequenzen einer Rekombinase direkt verwendet werden können.Another advantage is that only one recombinase can be used, whereby the most efficient recombinase can be used and already existing mouse strains can be used directly with recognition sequences of a recombinase.
Die Erfindung ermöglicht es also, Organismen (i.d.R. Mäuse) mit zellspezifischen bzw. zell- subtyp-spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen. Dies ist bisher so nicht möglich, insbesondere, was die gezielte Deletion von genomischen Sequenzen angeht. Gerade dies ist jedoch interessant, um die physiologische Funktion von Proteinen in bestimmten Zellen zu untersuchen. Durch die Verwendung geeigneter Promotoren lassen sich gezielt Veränderungen in Subpopulationen erzeugen, oder auch Veränderungen, die erst ab einem bestimmten Entwicklungsstadium auftreten. Dies ist über die Immunologie hinaus für die Life Science Forschung von großer Bedeutung. So erzeugte Organismen wie zum Beispiel Mäuse sind zum Beispiel für die Evaluation von neuen Drug Target Molekülen interessant.The invention thus makes it possible to produce organisms (i.c., mice) with cell-specific or cell subtype-specific genomic changes. So far this has not been possible, especially as far as the targeted deletion of genomic sequences is concerned. However, this is interesting to study the physiological function of proteins in certain cells. Through the use of suitable promoters can be targeted to produce changes in subpopulations, or even changes that occur only at a certain stage of development. This is of great importance beyond immunology for life science research. Organisms produced in this way, for example mice, are of interest, for example, for the evaluation of new drug target molecules.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst:In a first aspect, the invention relates to a nucleic acid which comprises in functional connection a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 5 'or 3' splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Vorzugsweise liegt die Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, benachbart zu der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3'-Spleißregion zu fungieren, wobei benachbart umfasst, dass beide Nukleinsäuresequenzen direkt benachbart, das heißt ohne dazwischen liegende Nukleotide, vorliegen oder durch eine Anzahl von Nukleotiden, die vorzugsweise ein Vielfaches von 3 ist, getrennt voneinander vorliegen, jedoch gewöhnlich durch nicht mehr als 3, nicht mehr als 6, nicht mehr als 9, nicht mehr als 15, nicht mehr als 30 oder nicht mehr als 60 Nukleotide getrennt voneinander vorliegen. Vorzugsweise liegt die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3 '-Spleißregion zu fungieren, benachbart zu der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, wobei benachbart umfasst, dass beide Nukleinsäuresequenzen direkt benachbart, das heißt ohne dazwischen liegende Nukleotide, vorliegen oder durch nicht mehr als 20, nicht mehr als 40, nicht mehr als 60, nicht mehr als 80, nicht mehr als 100, nicht mehr als 150, nicht mehr als 200, nicht mehr als 300, nicht mehr als 400 oder nicht mehr als 500 Nukleotide getrennt voneinander vorliegen.(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence. Preferably, the nucleic acid sequence corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity adjacent to the nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'or 3' splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, adjacent, wherein both nucleic acid sequences are directly adjacent, that is, without intervening nucleotides, or are separated by a number of nucleotides, which is preferably a multiple of 3, but usually not more than 3, not more than 6, not more than 9, not more than 15, not more than 30 or not more than 60 nucleotides separated. Preferably, the nucleic acid sequence having the ability to function in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence as a 5 'or 3' splice region adjacent to the nucleic acid sequence having the capability of having in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence adjacent nucleic acid sequence, wherein adjacent comprises both nucleic acid sequences directly adjacent, that is to say without intervening nucleotides, or by not more than 20, not more than 40, not more than 60, not more than 80, not more than 100, not more than 150, not more than 200, not more than 300, not more than 400 or not more than 500 nucleotides separated.
In einer ersten bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts umfasst die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— >3' -Richtung der Transkription:In a first preferred embodiment of the nucleic acid according to the invention of the first aspect, the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
Vorzugsweise umfasst der 5 '-terminale Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz in dieser Ausführungsform ein Startkodon, das es erlaubt, in einem von der Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript eine Translation des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität einzuleiten.Preferably, the 5 '-terminal part of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity in this embodiment comprises a start codon containing it allows initiation of translation of the polypeptide having recombinase activity in a transcript derived from the nucleic acid sequence.
In einer zweiten bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts umfasst die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '—+3 '-Richtung der Transkription:In a second preferred embodiment of the nucleic acid according to the invention of the first aspect, the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '- + 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3 '-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht.(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3 '-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity.
Vorzugsweise umfasst der 3'-terminale Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz in dieser Ausfuhrungsform ein Stoppkodon, das es erlaubt, in einem von der Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript eine Translation des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität zu beenden, und/oder eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Polyadenylierungssignal kodiert.Preferably, the 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity in this embodiment comprises a stop codon which allows translation of the polypeptide having recombinase activity to terminate in a transcript derived from the nucleic acid sequence, and / or a Nucleic acid sequence encoding a polyadenylation signal.
In einer dritten bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts umfasst die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'-Richtung der Transkription:In a third preferred embodiment of the nucleic acid according to the invention of the first aspect, the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und (e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and (e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
Vorzugsweise hybridisiert die erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, beziehungsweise das Nukleinsäuretranskript davon nicht mit der zweiten Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, beziehungsweise dem Nukleinsäuretranskript davon. Vorzugsweise umfasst in dieser Ausführungsform der Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz weder das 5 '-Ende noch das 3'- Ende der für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz.Preferably, the first nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, or the nucleic acid transcript thereof, does not hybridize with the second nucleic acid sequence having the capability in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence to hybridize to another nucleic acid sequence, or the nucleic acid transcript thereof. Preferably, in this embodiment, the portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity comprises neither the 5 'end nor the 3' end of the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity.
Erfindungsgemäß kodiert vorzugsweise eine Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ein Transkript, das fähig ist, mit einem Transkript einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts über die Sequenz, die durch die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, kodiert wird, zu hybridisieren, und es kann ein trans- Spleiß-Ereignis derart stattfinden, dass die jeweiligen Teile einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz derart zusammengefügt werden, dass das entstehende Transkript eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert. Somit fungiert in dieser Ausführungsform in dem trans- Spleiß-Ereignis das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts als Donor-Nukleinsäuresequenz und das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts fungiert als Akzeptor-Nukleinsäuresequenz.According to the present invention, preferably, a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect encodes a transcript capable of transcripting a nucleic acid of the invention according to the second preferred embodiment of the first aspect via the sequence represented by the nucleic acid sequence having the ability in the hybridize transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with a different nucleic acid sequence, and a trans-splicing event may occur such that the respective portions of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity are joined such that the resulting transcript has a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity. Thus, in this embodiment, in the trans-splice event, the transcript of a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect functions as a donor nucleic acid sequence, and the transcript of a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect functions as an acceptor nucleic acid sequence.
Erfindungsgemäß kodiert vorzugsweise eine Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ein Transkript, das fähig ist, mit einem Transkript einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts über die Sequenz, die durch die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, kodiert wird, zu hybridisieren, und es kann ein trans- Spleiß-Ereignis derart stattfinden, dass die jeweiligen Teile einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz derart zusammengefügt werden, dass das entstehende Transkript eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert. Somit fungiert in dieser Ausführungsform in dem trans- Spleiß-Ereignis das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts als Akzeptor-Nukleinsäuresequenz und das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts fungiert als Donor-Nukleinsäuresequenz.Preferably, according to the present invention, a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect encodes a transcript capable of transcripting a nucleic acid of the invention according to the first preferred embodiment of the first aspect via the sequence represented by the nucleic acid sequence having the ability in the Transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another Nucleic acid sequence to hybridize, and a trans-splicing event may take place such that the respective portions of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity are assembled so that the resulting transcript has a nucleic acid sequence encoding a polypeptide encoded with recombinase activity. Thus, in this embodiment, in the trans-splice event, the transcript of a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect functions as an acceptor nucleic acid sequence, and the transcript of a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect functions as a donor nucleic acid sequence.
Li den beiden vorstehend erläuterten Ausführungsformen wurde also eine für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierende Nukleinsäure in zwei Teile gespalten und in zwei verschiedene Nukleinsäuren eingebaut. Vorzugsweise kodieren die beiden jeweiligen Teile ein funktionelles Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität erst nach ihrem Zusammenfügen durch trans-Spleißen.Thus, in the two embodiments explained above, a nucleic acid coding for a polypeptide having recombinase activity was cleaved in two parts and incorporated into two different nucleic acids. Preferably, the two respective parts encode a functional polypeptide having recombinase activity only after their assembly by trans-splicing.
Jedoch umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, in denen eine für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierende Nukleinsäure in mehr als zwei Teile gespalten wird und die jeweiligen Teile in verschiedene Nukleinsäuren gemäß des ersten Aspekts der Erfindung eingebaut werden. Auch hier kodieren die jeweiligen Teile vorzugsweise kein funktionelles Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität, sind jedoch durch trans-Spleißen derart kombinierbar, dass ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität entsteht. In einer solchen Ausführungsform bedarf es erfindungsgemäß vorzugsweise zur Bereitstellung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, und somit zur Bereitstellung von Rekombinase- Aktivität mehrere trans-Spleiß-Ereignisse, die zwischen einem Transkript einer Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts, einem oder mehreren Transkripten einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und einem Transkript einer Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts erfolgen. Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, in 3, 4, 5 oder mehr Teile gespalten, wobei der 5 '-terminale Teil in eine Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts eingebaut wird, der 3 '-terminale Teil in eine Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts eingebaut wird und jeder weitere Teil in eine Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts eingebaut wird. Des Weiteren hybridisiert in dieser Ausfuhrungsform vorzugsweise ein Transkript einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts mit einem weiteren Transkript einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts, das einen benachbarten weiter stromabwärts gelegenen Teil der für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäure beziehungsweise einen benachbarten weiter stromaufwärts gelegenen Teil der für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäure trägt.However, the invention also encompasses embodiments in which a nucleic acid encoding a polypeptide having recombinase activity is cleaved into more than two parts and the respective parts are incorporated into different nucleic acids according to the first aspect of the invention. Again, the respective parts preferably do not encode a functional polypeptide having recombinase activity, but are combinable by trans-splicing to produce a polypeptide having recombinase activity. In such an embodiment, according to the present invention, it is preferable to provide a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity, and thus to provide recombinase activity, a plurality of trans-splicing events interposed between a transcript of a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the present invention first aspect, one or more transcripts of a nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect and a transcript of a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect. Preferably, in this embodiment, the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity is cleaved into 3, 4, 5 or more parts, the 5 '-terminal part being incorporated into a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect, the 3 '-terminal part is incorporated into a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect, and each further part is incorporated into a nucleic acid according to the third preferred Embodiment of the first aspect is incorporated. Furthermore, in this embodiment, a transcript of a nucleic acid according to the invention of the first aspect preferably hybridizes with another transcript of a nucleic acid according to the invention of the first aspect, which comprises an adjacent further downstream part of the nucleic acid coding for a polypeptide having recombinase activity or an adjacent further upstream part which carries nucleic acid encoding a polypeptide having recombinase activity.
Wurde die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, in 3 Teile gespalten, durchlaufen in dieser Ausführungsform Transkripte von jeweils einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der ersten, zweiten und dritten bevorzugten Ausfuhrungsformen des ersten Aspekts als Substrat ein trans-Spleißen. Somit fungiert in dieser Ausführungsform in dem trans-Spleiß-Ereignis das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts als Donor- Nukleinsäuresequenz, das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts fungiert als Akzeptor-Nukleinsäuresequenz und das Transkript einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts fungiert sowohl als Akzeptor-Nukleinsäuresequenz für das Transkript der Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und als Donor-Nukleinsäuresequenz für das Transkript der Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts.When the nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity has been cleaved into 3 parts, in this embodiment transcripts of respectively one nucleic acid according to the invention of the first, second and third preferred embodiments of the first aspect undergo trans-splicing as a substrate. Thus, in this embodiment, in the trans-splice event, the transcript of a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect functions as a donor nucleic acid sequence, the transcript of a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect functions as an acceptor nucleic acid sequence, and the transcript of one Nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect functions both as an acceptor nucleic acid sequence for the transcript of the nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect and as a donor nucleic acid sequence for the transcript of the nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect.
Somit ist vorzugsweise im Fall einer Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig, zusammen mit (i) einem von der Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript und (ii) gegebenenfalls einem von einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript oder mehreren von mehreren Nukleinsäuren gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert.Thus, in the case of a nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect, preferably, the nucleic acid-derived transcript is capable, together with (i) a transcript derived from the nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect and (ii) optionally one of Nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect derived transcript or multiple transcripts derived from a plurality of nucleic acids according to the third preferred embodiment of the first aspect, as a substrate to undergo a trans-splicing reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
Ferner ist vorzugsweise im Fall einer Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig, zusammen mit (i) einem von der Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausfuhrungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript und (ii) gegebenenfalls einem von einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript oder mehreren von mehreren Nukleinsäuren gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert.Further, in the case of a nucleic acid according to the second preferred embodiment of the first aspect, preferably, the nucleic acid-derived transcript is capable of together with (i) a transcript derived from the nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect and (ii) optionally a transcript derived from a nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect or a plurality of multiple nucleic acids according to the third preferred embodiment of the first Aspects derived transcripts as a substrate to undergo a trans-splicing reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
Außerdem ist vorzugsweise im Fall einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig, zusammen mit (i) einem von der Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausfuhrungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript, (ii) einem von der Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript und (iii) gegebenenfalls einem weiteren von einer Nukleinsäure gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkript oder mehreren weiteren von mehreren Nukleinsäuren gemäß der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts abgeleiteten Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert.In addition, in the case of a nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect, preferably, the transcript derived from the nucleic acid is capable, together with (i) a transcript derived from the nucleic acid according to the first preferred embodiment of the first aspect, (ii) one of the nucleic acid transcript derived according to the second preferred embodiment of the first aspect; and (iii) optionally another transcript derived from a nucleic acid according to the third preferred embodiment of the first aspect or a plurality of further transcripts derived from a plurality of nucleic acids according to the third preferred embodiment of the first aspect, a trans Undergo a splice reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
In einer weiteren Ausfuhrungsform kann ein Transkript einer Nukleinsäure der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts über die Nukleinsäuresequenz, die durch die Sequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, kodiert wird, mit einer Nukleinsäuresequenz innerhalb eines Introns einer endogenen prä-mRNA einer Wirtszelle hybridisieren. Hierbei findet ein trans-Spleiß-Ereignis zwischen der endogenen prä-mRNA und dem Transkript der erfindungsgemäßen Nukleinsäure statt, wodurch die Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, stromabwärts an die kodierende Nukleinsäuresequenz der endogenen prä-mRNA gekoppelt wird, die stromaufwärts zu dem Intron liegt, mit dem das Transkript der erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisieren kann. In dieser Ausführungsform umfasst der Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz vorzugsweise die gesamte für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenz, jedoch vorzugsweise kein Startkodon, das zu einer Expression des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität ohne Kopplung an die Aminosäuresequenz, die von der kodierenden Nukleinsäuresequenz der endogenen prä-mRNA kodiert wird, fuhren würde. Dadurch kann das Transkript der erfindungsgemäßen Nukleinsäure nicht in ein funktionelles Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität translatiert werden. Erst nach trans-Spleißen des Transkripts mit einer endogenen prä-mRNA kann die Translation in ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität erfolgen. Die Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, ist dabei derart ausgestaltet, das es nach transSpleißen mit der endogenen prä-mRNA nicht zu einem Frameshift kommt.In another embodiment, a transcript of a nucleic acid of the second preferred embodiment of the first aspect may be encoded by the nucleic acid sequence encoded by the sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence Nucleic acid sequence within an intron of an endogenous pre-mRNA of a host cell hybridize. In this case, a trans-splicing event takes place between the endogenous pre-mRNA and the transcript of the nucleic acid according to the invention, whereby the nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, downstream of the coding nucleic acid sequence of the endogenous pre-mRNA. mRNA which is upstream of the intron, with which the transcript of the nucleic acid according to the invention can hybridize. In this embodiment, the portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity preferably comprises the entire nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity, but preferably none A start codon that would result in expression of the polypeptide having recombinase activity without coupling to the amino acid sequence encoded by the coding nucleic acid sequence of the endogenous pre-mRNA. As a result, the transcript of the nucleic acid according to the invention can not be translated into a functional polypeptide having recombinase activity. Only after trans-splicing of the transcript with an endogenous pre-mRNA can the translation into a polypeptide with recombinase activity take place. The nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity is designed in such a way that, after trans-splicing with the endogenous pre-mRNA, no frameshift occurs.
Alternativ kann auch in dieser Ausführungsform der Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierende Nukleinsäuresequenz wiederum wie oben beschrieben auf mehr als eine erfindungsgemäße Nukleinsäure aufgeteilt sein. Somit wäre für die Herstellung eines funktionellen Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität eine Nukleinsäure der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und mindestens eine Nukleinsäure der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts vonnöten, die nach entsprechendem trans-Spleißen miteinander und mit der endogenen prä-mRNA und Translation des resultierenden Transkripts das funktionelle Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität liefern können. Dabei umfasst eine Nukleinsäure der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts den 3 '-terminalen Teil der für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz und eine oder mehrere Nukleinsäuren der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts den weiteren Teil oder die weiteren Teile der für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz. Die Nukleinsäure der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts, die den am weitesten 5 '-terminal gelegenen Teil der für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz umfasst, kodiert jedoch auch nach einem trans-Spleißen mit den Transkripten der vorstehend beschriebenen, gegebenenfalls vorhandenen weiteren Nukleinsäuren der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und/oder dem Transkript der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren der zweiten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und vor trans-Spleißen mit der endogenen prä-mRNA für kein funktionelles Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität. Es fehlt hier vorzugsweise ein Startkodon. Jedoch umfasst diese Nukleinsäure der dritten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer Nukleinsäuresequenz innerhalb eines Introns der endogenen prä-mRNA zu hybridisieren.Alternatively, in this embodiment as well, the part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity can again be divided into more than one nucleic acid according to the invention as described above. Thus, for the production of a functional polypeptide having recombinase activity, a nucleic acid of the second preferred embodiment of the first aspect and at least one nucleic acid of the third preferred embodiment of the first aspect would be needed after corresponding trans-splicing with each other and with endogenous pre-mRNA and translation of the resulting transcript can provide the functional polypeptide having recombinase activity. Here, a nucleic acid of the second preferred embodiment of the first aspect comprises the 3 '-terminal part of the nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity and one or more nucleic acids of the third preferred embodiment of the first aspect, the further part or parts thereof for a polypeptide recombinase activity-encoding nucleic acid sequence. However, the nucleic acid of the third preferred embodiment of the first aspect, which comprises the 5'-most terminal portion of the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity, will also encode after trans-splicing with the transcripts of the optionally present others described above Nucleic acids of the third preferred embodiment of the first aspect and / or the transcript of the above-described nucleic acids of the second preferred embodiment of the first aspect and before trans-splicing with the endogenous pre-mRNA for no functional polypeptide having recombinase activity. It lacks here preferably a start codon. However, this nucleic acid of the third preferred embodiment of the first aspect comprises a nucleic acid sequence having the ability to be in the one of transcribable nucleic acid sequence derived transcript with a nucleic acid sequence within an intron of the endogenous pre-mRNA to hybridize.
Vorzugsweise wird die endogene prä-mRNA zell- oder gewebsspezifisch gebildet und vorzugsweise ist der Promotor des Gens, von dem die endogene prä-mRNA transkribiert wird, verschieden von dem oder den Promotoren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Vorzugsweise stören die durch die endogene prä-mRNA kodierten Aminosäuren, die nach trans-Spleißen und Translation aminoterminal an den von der oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Teil des Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität fusioniert sind, die Rekombinase- Aktivität des Polypeptids nicht. Ferner ist das Intron, das die Nukleinsäuresequenz umfasst, mit der das Transkript einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hybridisieren kann, bevorzugt das erste Intron der endogenen prä-mRNA.Preferably, the endogenous pre-mRNA is formed cell- or tissue-specific and preferably the promoter of the gene from which the endogenous pre-mRNA is transcribed, different from the one or more promoters of the nucleic acids of the invention. Preferably, the amino acids encoded by the endogenous pre-mRNA, which after trans-splicing and translation are amino-terminally fused to the portion of the polypeptide encoded by the nucleic acid (s) of the invention, interfere with the recombinase activity of the polypeptide. Furthermore, the intron comprising the nucleic acid sequence with which the transcript of a nucleic acid according to the invention can hybridise is preferably the first intron of the endogenous pre-mRNA.
Bevorzugte Gene aus Maus, deren prä-mRNA als trans-Spleiß-Donor verwendet werden kann, sind NKl .1 (KLRBD / CD161), CDl Ic (Integrin alpha X / Itgax) und Integrin alpha M (Itgam / CDl lb)Preferred mouse genes whose pre-mRNA can be used as a trans-splice donor are NK1.1 (KLRBD / CD161), CD11c (Integrin alpha X / Itgax) and integrin alpha M (Itgam / CD19b)
Vorzugsweise hat die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert, die in SEQ ID NO: 12 gezeigte Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz. Vorzugsweise umfasst erfindungsgemäß die Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder eine dazu homologe Sequenz und die Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, umfasst vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine dazu homologe Sequenz. Ebenfalls bevorzugt umfasst erfindungsgemäß die Nukleinsäuresequenz, die einem 5 '-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ED NO: 3 oder eine dazu homologe Sequenz und die Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, umfasst vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder eine dazu homologe Sequenz.Preferably, the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity has the sequence shown in SEQ ID NO: 12 or a sequence homologous thereto. Preferably, according to the invention, the nucleic acid sequence which corresponds to a 5'-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a homologous sequence and the nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal part of a nucleic acid sequence for a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity preferably comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence homologous thereto. Likewise preferably according to the invention the nucleic acid sequence which corresponds to a 5 '-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a homologous sequence and the nucleic acid sequence belonging to a 3'-terminal part a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity preferably comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence homologous thereto.
Die transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst erfindungsgemäß vorzugsweise ein Intron oder einen Teil davon, wobei das Intron oder der Teil davon die Nukleinsäuresequenz umfasst, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3 '-Spleißregion zu fungieren. Ein Teil eines Introns umfasst vorzugsweise 20 oder mehr, 40 oder mehr, 60 oder mehr, 80 oder mehr, 100 oder mehr, 120 oder mehr, 150 oder mehr, 200 oder mehr, 300 oder mehr, 400 oder mehr oder 500 oder mehr Nukleotide. Das Intron ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanem VEGF Intron, CD40L Intron 1, Kaninchen beta-Globin Intron 2, Maus Prml Intron, SV40 T-Antigen Intron, IgM C1-C2 Intron und IgE Intron. Vorzugsweise umfasst ein Intron erfindungsgemäß die in SEQ ID NO: 14 gezeigte Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz.The transcribable nucleic acid sequence according to the invention preferably comprises an intron or a part thereof, wherein the intron or the part thereof comprises the nucleic acid sequence which has the ability to function as a 5 'or 3' splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence. A part of an intron preferably comprises 20 or more, 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more, 120 or more, 150 or more, 200 or more, 300 or more, 400 or more or 500 or more nucleotides , The intron is preferably selected from the group consisting of human VEGF intron, CD40L intron 1, rabbit beta globin intron 2, mouse prml intron, SV40 T antigen intron, IgM C1-C2 intron and IgE intron. According to the invention, an intron preferably comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 14 or a sequence homologous thereto.
Erfindungsgemäß wird in dem trans-Spleiß-Ereignis die 5'- oder 3 '-Spleißregion beziehungsweise das Intron oder der Teil davon vorzugsweise zusammen mit dem Teil des Transkripts, das die Fähigkeit hat, mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, aus dem Transkript derart entfernt, das die jeweilige Nukleinsäuresequenzen, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entsprechen, benachbart zueinander vorliegen. Vorzugsweise liegen nach dem trans-Spleiß- Ereignis die Nukleinsäuresequenzen, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entsprechen, unmittelbar benachbart zueinander vor, das heißt, sie sind nicht durch jedwede dazwischen liegende Fremdsequenzen voneinander getrennt. Jedoch umfasst die Erfindung auch Ausführungsformen, in denen die Nukleinsäuresequenzen, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entsprechen, nach dem trans-Spleiß-Ereignis durch Linkersequenzen getrennt vorliegen, wobei die Linkersequenzen nicht verhindern, dass die Expression des Transkripts zur Bildung eines Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität führt. Insbesondere verursachen die Linkersequenzen keinen Frameshift in der für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz. In den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Nukleinsäure des ersten Aspekts, in denen die Nukleinsäuresequenzen durch Nukleotide getrennt voneinander vorliegen, befinden sich diese trennenden Nukleotide in einer Ausführungsform auch nach dem trans-Spleißen zwischen den Nukleinsäuresequenzen, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entsprechen.According to the invention, in the trans-splicing event, the 5 'or 3' splice region or the intron or part thereof is preferably removed from the transcript together with the part of the transcript which has the ability to hybridize with another nucleic acid sequence comprising the respective nucleic acid sequences corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity adjacent to one another. Preferably, after the trans-splice event, the nucleic acid sequences corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity are immediately adjacent to one another, that is, are not separated by any intervening foreign sequences. However, the invention also encompasses embodiments in which the nucleic acid sequences corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity are separated by linker sequences following the trans-splicing event, wherein the linker sequences do not prevent expression of the transcript to form a polypeptide having recombinase activity. In particular, the linker sequences do not cause frameshift in the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity. In the above-described embodiments of the nucleic acid of the first aspect, in which the nucleic acid sequences are separated by nucleotides, in one embodiment, these separating nucleotides are also located after trans-splicing between the nucleic acid sequences that are part of a polypeptide having recombinase activity correspond encoding nucleic acid sequence.
Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, eine Spleißdonorstelle. Mehr bevorzugt umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 5 oder eine dazu homologe Sequenz.Preferably, the nucleic acid sequence having the ability to be in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence as the 5 'splice region act, a splice donor site. More preferably, the nucleic acid sequence having the ability to function as the 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a sequence homologous thereto.
Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren, eine Verzweigungsstelle, eine Polypyrimidinsequenz und eine Spleißakzeptorstelle. Mehr bevorzugt umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'- Spleißregion zu fungieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder eine dazu homologe Sequenz.Preferably, the nucleic acid sequence having the ability to function as the 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises a branching site, a polypyrimidine sequence and a splice acceptor site. More preferably, the nucleic acid sequence having the ability to function as the 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a sequence homologous thereto.
Die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, umfasst vorzugsweise mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 25, mindestens 35, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 80, mindestens 100, mindestens 150, mindestens 200 oder mindestens 300 Nukleotide. Am meisten bevorzugt umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ED NO: 7 oder 8 oder eine dazu homologe Sequenz.The nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence preferably comprises at least 10, at least 15, at least 20, at least 25, at least 35, at least 50, at least 60, at least 80, at least 100, at least 150, at least 200 or at least 300 nucleotides. Most preferably, the nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 or a sequence homologous thereto.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure des ersten Aspekts DNA.Preferably, the nucleic acid of the first aspect of the invention is DNA.
Vorzugsweise umfasst der Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz nicht mehr als 50, nicht mehr als 100, nicht mehr als 200, nicht mehr als 300, nicht mehr als 400 Nukleotide, nicht mehr als 500 oder nicht mehr als 600 Nukleotide der für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz.Preferably, the portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity does not comprise more than 50, not more than 100, not more than 200, not more than 300, not more than 400 nucleotides, not more than 500 or not more than 600 nucleotides the nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity.
Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3'-Spleißregion zu fungieren, 2 oder mehr, 5 oder mehr, 10 oder mehr, 15 oder mehr, 20 oder mehr, 30 oder mehr, 50 oder mehr, 100 oder mehr und vorzugsweise bis 150, 200, 300, 400, 500 oder 600 Nukleotide.Preferably, the nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'or 3' splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises 2 or more, 5 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, 30 or more, 50 or more, 100 or more and preferably to 150, 200, 300, 400, 500 or 600 nucleotides.
In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure des ersten Aspekts ferner weitere Expressionskontrollsequenzen in funktioneller Verbindung mit der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz und/oder weitere Nukleinsäuresequenzen gegebenenfalls in funktioneller Verbindung mit dem Promotor. Solche Nukleinsäuresequenzen können beispielsweise für Marker, insbesondere selektierbare Marker kodieren.In one embodiment, the nucleic acid according to the invention of the first aspect further comprises further expression control sequences in functional connection with the transcribable nucleic acid sequence and / or further nucleic acid sequences optionally in functional connection with the promoter. Such nucleic acid sequences can, for example, code for markers, in particular selectable markers.
Vorzugsweise liegt die Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, direkt benachbart zu der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3 '-Spleißregion zu fungieren.Preferably, the nucleic acid sequence corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity is directly adjacent to the nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'or 3' splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence ,
In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure des ersten Aspekts kein Intron, das zugleich eine 5 '-Spleißregion und eine 3'-Spleißregion aufweist.In one embodiment, the nucleic acid of the first aspect of the invention does not comprise an intron that simultaneously has a 5 'splice region and a 3' splice region.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts einen Promotor, vorzugsweise einen Phosphoglyceratkinase-Promotor, und in 5'— >3 '-Richtung der Transkription:In a preferred embodiment, a nucleic acid according to the invention according to the first preferred embodiment of the first aspect comprises a promoter, preferably a phosphoglycerate kinase promoter, and in the 5'-> 3 'direction of the transcription:
(a) als eine Nukleinsäuresequnez, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ JD NO: 1 oder eine dazu homologe Sequenz,(a) as a nucleic acid sequence which corresponds to a 5'-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or a sequence homologous thereto,
(b) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 oder eine dazu homologe Sequenz, und(b) as a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 5 or a homologous sequence thereof, and
(c) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 oder eine dazu homologe Sequenz. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausftihrungsform des ersten Aspekts einen Promotor, vorzugsweise einen Phosphoglyceratkinase-Promotor, und in 5'— >3' -Richtung der Transkription:(c) as a nucleic acid sequence which has the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 7 or a sequence homologous thereto. In a preferred embodiment, a nucleic acid according to the invention according to the second preferred embodiment of the first aspect comprises a promoter, preferably a phosphoglycerate kinase promoter, and in the 5 '→ 3' direction of the transcription:
(a) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder eine dazu homologe Sequenz,(a) as a nucleic acid sequence which has the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 8 or a sequence homologous thereto,
(b) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder eine dazu homologe Sequenz, und(b) as a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a sequence homologous thereto, and
(c) als eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO:2 oder eine dazu homologe Sequenz.(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity, a nucleic acid of SEQ ID NO: 2 or a sequence homologous thereto.
Eine Transkription dieser beiden vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gefolgt von einem trans-Spleißen der dabei entstehenden Nukleinsäuretranskripte und einer Expression des entstehenden Transkripts kann ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität bereitstellen.Transcription of these two nucleic acids of the invention described above followed by trans-splicing of the resulting nucleic acid transcripts and expression of the resulting transcript may provide a polypeptide having recombinase activity.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts einen Promotor, vorzugsweise einen Phosphoglyceratkinase-Promotor, und in 5 '→3' -Richtung der Transkription:In a further preferred embodiment, a nucleic acid according to the invention according to the first preferred embodiment of the first aspect comprises a promoter, preferably a phosphoglycerate kinase promoter, and in the 5 '→ 3' direction of the transcription:
(a) als eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine dazu homologe Sequenz,(a) as a nucleic acid sequence which corresponds to a 5'-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, a nucleic acid according to SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto,
(b) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ED NO: 5 oder eine dazu homologe Sequenz, und(b) as a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 5 or a sequence homologous thereto, and
(c) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 7 oder eine dazu homologe Sequenz. In einer bevorzugten Ausfiihrungsform umfasst eine erfindungsgemäße Nukleinsäure gemäß der zweiten bevorzugten Ausfiihrungsform des ersten Aspekts einen Promotor, vorzugsweise einen Phosphoglyceratkinase-Promotor, und in 5'— >3' -Richtung der Transkription:(c) as a nucleic acid sequence which has the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 7 or a sequence homologous thereto. In a preferred embodiment, a nucleic acid according to the invention according to the second preferred embodiment of the first aspect comprises a promoter, preferably a phosphoglycerate kinase promoter, and in the 5'-> 3 'direction of the transcription:
(a) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder eine dazu homologe Sequenz,(a) as a nucleic acid sequence which has the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 8 or a sequence homologous thereto,
(b) als eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 oder eine dazu homologe Sequenz, und(b) as a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 6 or a sequence homologous thereto, and
(c) als eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO:4 oder eine dazu homologe Sequenz.(c) as a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity, a nucleic acid of SEQ ID NO: 4 or a sequence homologous thereto.
Eine Transkription dieser beiden vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gefolgt von einem trans-Spleißen der dabei entstehenden Nukleinsäuretranskripte und einer Expression des entstehenden Transkripts kann ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität bereitstellen.Transcription of these two nucleic acids of the invention described above followed by trans-splicing of the resulting nucleic acid transcripts and expression of the resulting transcript may provide a polypeptide having recombinase activity.
In einer weiteren Ausfuhrungsform betrifft die Erfindung eine wie vorstehend beschriebene Nukleinsäure des ersten Aspekts, die jedoch keine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit dem Transkript einer anderen Nukleinsäure des ersten Aspekts oder mit einer Sequenz innerhalb eines Introns einer endogenen prä-mRNA zu hybridisieren, umfasst. Bei Transkripten, die von Nukleinsäuren dieser Ausführungsform abgeleitet sind, kann ein trans-Spleißen wie hierin beschrieben erfolgen, ohne dass die beiden Transkripte eines trans-Spleiß-Ereignisses miteinander hybridisieren. Derartige Nukleinsäuren finden in den hierin beschriebenen weiteren Aspekten in analoger Weise zu den Nukleinsäuren mit einer Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, Anwendung.In a further embodiment, the invention relates to a nucleic acid of the first aspect as described above, but which does not have a nucleic acid sequence having the ability in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with the transcript of another nucleic acid of the first aspect or with a sequence within an intron an endogenous pre-mRNA to hybridize. In transcripts derived from nucleic acids of this embodiment, trans-splicing may be performed as described herein without the two transcripts of a trans-splice event hybridizing to one another. Such nucleic acids, in the other aspects described herein, find application analogously to the nucleic acids having a nucleic acid sequence capable of hybridizing to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, die durch Transkription der Nukleinsäure des ersten Aspekts erhältlich ist. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure des zweiten Aspekts RNA. Alle für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren des ersten Aspekts beschriebenen Ausführungsformen finden sinngemäß Anwendung auf die Nukleinsäuren des zweiten Aspekts, da die Nukleinsäure des ersten Aspekts als Matrize für die Nukleinsäure des zweiten Aspekts fungiert und somit bestimmte Merkmale weitergegeben werden.In a second aspect, the invention relates to a nucleic acid obtainable by transcription of the nucleic acid of the first aspect. Preferably, the nucleic acid of the second aspect is RNA. All for the inventive nucleic acids of the first aspect described embodiments apply mutatis mutandis to the nucleic acids of the second aspect, since the nucleic acid of the first aspect acts as a template for the nucleic acid of the second aspect and thus certain characteristics are passed.
Die Nukleinsäuren des ersten Aspekts können miteinander kombiniert werden, wodurch vorzugsweise ein Satz, d.h. eine Gruppierung, von Nukleinsäuren erhalten wird, der die Ausprägung von Rekombinase- Aktivität wie hierin beschrieben ermöglicht und vorzugsweise in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist.The nucleic acids of the first aspect may be combined with each other, whereby preferably one set, i. a moiety obtained from nucleic acids which enables the expression of recombinase activity as described herein and is preferably useful in the methods of the invention.
hi einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung einen Satz von Nukleinsäuren, der umfasst: (i) eine Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— »3 '-Richtung der Transkription umfasst:In a third aspect, the invention relates to a set of nucleic acids comprising: (i) a nucleic acid operatively linked to a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ü) eine Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'-Richtung der Transkription umfasst:(U) a nucleic acid comprising in functional connection a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht; und gegebenenfalls (iii) eine oder mehrere Nukleinsäuren, die jeweils in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '→3 '-Richtung der Transkription umfasst:(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity; and optionally (iii) one or more nucleic acids, each in functional association comprising a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu rungieren,(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert.(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the nucleic acid-derived transcripts are capable of undergoing a trans-splice reaction with each other as a substrate to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
Im Hinblick auf das vorstehend erläuterte ist ein erfindungsgemäßer Satz von Nukleinsäuren vorzugsweise in der Lage, nach Transkription gefolgt von einem trans-Spleißen der dabei entstehenden Nukleinsäuretranskripte und einer Expression des entstehenden Transkripts ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität bereitzustellen. Alle bezüglich der erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts erläuterten bevorzugten Ausfuhrungsformen gelten gleichermaßen für den Satz von Nukleinsäuren gemäß des dritten Aspekts.In view of the above, a set of nucleic acids of the invention is preferably capable of providing a polypeptide having recombinase activity following transcription followed by trans-splicing of the resulting nucleic acid transcripts and expression of the resulting transcript. All the preferred embodiments explained with regard to the nucleic acid of the first aspect according to the invention apply equally to the set of nucleic acids according to the third aspect.
So hybridisieren vorzugsweise bei einem erfindungsgemäßen Satz von Nukleinsäuren die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte miteinander mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst der Satz von Nukleinsäuren keine Nukleinsäure nach (iii) und die Nukleinsäure nach (i) und die Nukleinsäure nach (ii) können mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren. Vorzugsweise umfasst in einem solchen Satz von Nukleinsäuren die Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die in SEQ ED NO: 1 dargestellt Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz und die Nukleinsäuresequenz, die einem 3 '-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz. In einem weiteren bevorzugten Satz von Nukleinsäuren umfasst die Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die in SEQ ID NO: 3 dargestellt Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz und die Nukleinsäuresequenz, die einem 3'- terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die in SEQ DD NO: 4 dargestellt Sequenz oder eine dazu homologe Sequenz.Thus, preferably, in a set of nucleic acids according to the invention, the transcripts derived from the nucleic acids hybridize to each other by means of the nucleic acid sequence which has the ability to hybridize with another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence. In a preferred embodiment, the set of nucleic acids does not comprise any nucleic acid according to (iii) and the nucleic acid according to (i) and the nucleic acid according to (ii) can, by means of the nucleic acid sequence having the ability, in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another Hybridize nucleic acid sequence, hybridize with each other. Preferably, in such a set of nucleic acids, the nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a sequence homologous thereto and the nucleic acid sequence encoding a nucleic acid sequence 3 '-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a sequence homologous thereto. In another preferred set of nucleic acids, the nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a sequence homologous thereto and the nucleic acid sequence encoding a nucleic acid sequence 3'-terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, the sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a sequence homologous thereto.
Vorzugsweise sind die Promotoren der Nukleinsäuren in einem erfindungsgemäßen Satz von Nukleinsäuren unterschiedlich und definieren vorzugsweise in ihrer Kombination eine ZeIl- und/oder Gewebsspezifϊtät.Preferably, the promoters of the nucleic acids are different in a set of nucleic acids according to the invention and preferably define in their combination a cell and / or tissue specificity.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung einen Vektor, der mindestens eine Nukleinsäure des ersten Aspekts oder einen Satz von Nukleinsäuren des dritten Aspekts umfasst. Ferner können in dem erfindungsgemäßen Satz von Nukleinsäuren die Nukleinsäuren auf Vektoren vorliegen. Verschiedenen Nukleinsäuren liegen vorzugsweise getrennt voneinander auf Vektoren vor.In a fourth aspect, the invention relates to a vector comprising at least one nucleic acid of the first aspect or a set of nucleic acids of the third aspect. Furthermore, in the set of nucleic acids according to the invention, the nucleic acids can be present on vectors. Various nucleic acids are preferably present separately from one another on vectors.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren und/oder Vektoren erlauben vorzugsweise eine Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in ein Genom einer Wirtszelle, in die die Nukleinsäuren und/oder Vektoren eingebracht werden, wodurch unter anderem ein stabiles Vorliegen der Nukleinsäuren in der Zelle erreicht werden kann. In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung eine Wirtszelle, die mindestens eine Nukleinsäure des ersten Aspekts, mindestens einen Satz von Nukleinsäuren des dritten Aspekts und/oder mindestens einen Vektor des vierten Aspekts umfasst. Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann isoliert, in einem isolierten Gewebe oder in einem Organismus vorliegen. Ferner kann die erfindungsgemäße Wirtszelle eukaryotisch oder prokaryotisch sein. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Wirtszelle eukaryotisch. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Wirtszelle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, mehr bevorzugt tierischen Ursprungs. Noch mehr bevorzugt ist die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Zelle eines Säugers wie Maus, Ratten, Affen, Mensch, Zebrafisch, Dorsophila melanogaster oder Xenopus laevis. In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Wirtszelle nicht Teil eines menschlichen Embryos oder eines Menschen.Nucleic acids and / or vectors according to the invention preferably allow integration of the nucleic acids according to the invention into a genome of a host cell, into which the nucleic acids and / or vectors are introduced, whereby, inter alia, a stable presence of the nucleic acids in the cell can be achieved. In a fifth aspect, the invention relates to a host cell which comprises at least one nucleic acid of the first aspect, at least one set of nucleic acids of the third aspect and / or at least one vector of the fourth aspect. The host cell according to the invention can be isolated, present in an isolated tissue or in an organism. Furthermore, the host cell according to the invention may be eukaryotic or prokaryotic. Preferably, the host cell of the invention is eukaryotic. Preferably, the host cell of the invention is of animal or plant origin, more preferably of animal origin. Even more preferably, the host cell of the invention is a mammalian cell such as mouse, rat, monkey, human, zebrafish, Dorsophila melanogaster or Xenopus laevis. In one embodiment, the host cell of the invention is not part of a human embryo or human.
Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann stabil oder transient, vorzugsweise stabil, mit einer oder mehreren Nukleinsäuren des ersten Aspekts, einen Satz von Nukleinsäuren des dritten Aspekts oder einem Vektor des vierten Aspekts transfiziert sein.The host cell of the invention may be transfected stably or transiently, preferably stably, with one or more nucleic acids of the first aspect, a set of nucleic acids of the third aspect, or a vector of the fourth aspect.
Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße Wirtszelle eine DNA mit mindestens einer Erkennungs- oder Target-Sequenz für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität, wobei vorzugsweise bei Vorliegen von Rekombinase- Aktivität eine Rekombination mittels der Erkennungs- oder Target-Sequenz erfolgt. Vorzugsweise umfasst eine erfindungsgemäße Wirtszelle zwei Erkennungs- oder Target-Sequenzen und ein Vorliegen von Rekombinase- Aktivität führt zu einem Ausschneiden des zwischen den Erkennungs- oder Target-Sequenzen liegenden DNA-Bereichs. Vorzugsweise ist die Rekombinase Cre Rekombinase und die Erkennungs- oder Target-Sequenzen sind loxP Stellen.Preferably, the host cell according to the invention comprises a DNA having at least one recognition or target sequence for a polypeptide having recombinase activity, wherein recombination is preferably carried out by means of the recognition or target sequence in the presence of recombinase activity. Preferably, a host cell of the invention comprises two recognition or target sequences and the presence of recombinase activity results in excision of the DNA region located between the recognition or target sequences. Preferably, the recombinase is Cre recombinase and the recognition or target sequences are loxP sites.
hi einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung einen Organismus, der eine erfindungsgemäße Wirtszelle umfasst. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Organismus eukaryotisch und vorzugsweise mehrzellig. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Organismus eine Pflanze oder ein Tier, vorzugsweise ein Säuger. Bevorzugte Beispiele des erfmdungsgemäßen Organismus sind Mensch, Nagetier wie zum Beispiel Maus oder Ratte, Affe wie zum Beispiel Primat, Zebrafisch, Fruchtfliege wie zum Beispiel Dorsophila melanogaster, oder Frosch wie zum Beispiel Xenopus laevis. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Organismus nicht menschlich. Der Organismus weist vorzugsweise mehrere Zellen auf, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie hierin beschrieben eingebracht wurden. Vorzugsweise bilden in einem Organismus Zellen, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie hierin beschrieben eingebracht wurden, einen Teil oder das Gesamte eines oder mehrerer Gewebe. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform besteht der Organismus im Wesentlichen in seiner Gesamtheit aus Zellen, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie vorstehend beschrieben eingebracht wurden. "Erfindungsgemäß eingebracht" beinhaltet in diesem Zusammenhang nicht nur die Situation eines Zufϊihrens der Nukleinsäuren an die Zelle, zum Beispiel durch Transfektion oder Mikroinjektion, sondern auch die Situation, dass zugeführte Nukleinsäuren durch Zellvermehrung an andere Zellen weitergegeben werden. So kann erfindungsgemäß beispielsweise Nukleinsäure in einen Organismus derart eingebracht werden, dass die Nukleinsäure in eine Zelle des Organismus, zum Beispiel eine Oozyte eingebracht wird und daraus der Organismus herangezogen wird.In a sixth aspect, the invention relates to an organism comprising a host cell according to the invention. Preferably, the organism according to the invention is eukaryotic and preferably multicellular. In one embodiment, the organism of the invention is a plant or animal, preferably a mammal. Preferred examples of the inventive organism are human, rodent such as mouse or rat, monkey such as primate, zebrafish, fruit fly such as Dorsophila melanogaster, or frog such as Xenopus laevis. In one embodiment, the organism of the invention is not human. The organism preferably has a plurality of cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described herein. Preferably, in an organism, cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described herein form part or all of one or more tissues. In a particularly preferred embodiment, the organism essentially consists in its entirety of cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described above. "Introduced according to the invention" in this context includes not only the situation of supplying the nucleic acids to the cell, for example by transfection or microinjection, but also the situation that supplied nucleic acids are passed on to other cells by cell proliferation. Thus, according to the invention, for example nucleic acid can be introduced into an organism such that the nucleic acid is introduced into a cell of the organism, for example an oocyte, and the organism is used therefrom.
Erfindungsgemäß ist auch der Fall umfasst, dass sich nicht alle erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren anfänglich in einer Zelle oder in einem Organismus befinden, sondern die erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren auf verschiedene, vorzugsweise zwei Zellen oder Individuen des Organismus verteilt sind und erst beispielsweise durch Zellfusion bzw. Kreuzung der Individuen ein Individuum entsteht, das alle erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren trägt.According to the invention, the case is also encompassed that not all inventively introduced nucleic acids are initially in a cell or in an organism, but the inventively introduced nucleic acids are distributed to different, preferably two cells or individuals of the organism and only for example by cell fusion or crossing of the Individuals an individual arises, which carries all nucleic acids to be introduced according to the invention.
In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der mindestens eine Nukleinsäure des ersten Aspekts, mindestens einen Satz von Nukleinsäuren des dritten Aspekts und/oder mindestens einen Vektor des vierten Aspekts umfasst. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.In a seventh aspect, the invention relates to a kit comprising at least one nucleic acid of the first aspect, at least one set of nucleic acids of the third aspect and / or at least one vector of the fourth aspect. Preferably, the kit according to the invention is suitable for use in a method according to the invention.
In einem achten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung von Rekombinase- Aktivität in einer Zelle, das die Schritte umfasst:In an eighth aspect, the invention relates to a method for providing recombinase activity in a cell comprising the steps of:
(i) Einbringen in die Zelle einer ersten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '—»3 '-Richtung der Transkription umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, (b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(i) introduction into the cell of a first nucleic acid which comprises in functional connection a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises: (a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5 ' -terminal part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity, (b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ii) Einbringen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— >3 '-Richtung der Transkription umfasst:(ii) introduction into the cell of a second nucleic acid, which in functional connection comprises a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(iii) gegebenenfalls Einbringen in die Zelle einer oder mehrerer weiterer Nukleinsäuren, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'- Richrung der Transkription umfasst:(iii) if appropriate, introduction into the cell of one or more further nucleic acids which, in functional connection, comprise a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises 5 '→ 3' transcription initiation:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und (e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and (e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the transcripts derived from the nucleic acids are capable of undergoing a trans-splicing reaction with each other as a substrate to form a transcript indicative of a transcript
Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, wobei eine Transkription aller der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren in der Zelle stattfindet.Polypeptide encoded with recombinase activity, wherein a transcription of all of the introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) nucleic acids in the cell takes place.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst das Verfahren nicht Schritt (iii) und die in den Schritten (i) und (ii) eingebrachten Nukleinsäuren können mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren.In a preferred embodiment, the method does not comprise step (iii) and the nucleic acids introduced in steps (i) and (ii) can be hybridized by means of the nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence to hybridize with each other.
In einem neunten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Rekombination von DNA in einer Zelle, das die Schritte umfasst:In a ninth aspect, the invention relates to a method for recombining DNA in a cell comprising the steps:
(i) Einbringen in die Zelle einer ersten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— >3 '-Richtung der Transkription umfasst:(i) introduction into the cell of a first nucleic acid, which in functional connection comprises a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5 '-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5 '-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ii) Einbringen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— >3' -Richtung der Transkription umfasst: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, (b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(ii) introducing into the cell a second nucleic acid operatively linked to a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of transcription comprises: (a) a nucleic acid sequence having the capability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence, (b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(iii) gegebenenfalls Einbringen in die Zelle einer oder mehrerer weiterer Nukleinsäuren, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'- Richtung der Transkription umfasst:(iii) optionally introducing into the cell one or more further nucleic acids which in functional connection comprise a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises in the 5 '→ 3' direction of the transcription:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the transcripts derived from the nucleic acids are capable of undergoing a trans-splicing reaction with each other as a substrate to form a transcript indicative of a transcript
Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodiert, wobei eine Transkription aller der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren in der Zelle stattfindet, und wobei die Bildung des Polypeptids mit Rekombinase-Aktivität zu einer Rekombination der DNA in der Zelle führt.Polypeptide encoded with recombinase activity, wherein a transcription of all of the introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) nucleic acids takes place in the cell, and wherein the formation of the polypeptide with recombinase activity to recombine the DNA in the cell leads.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren nicht Schritt (iii) und die in den Schritten (i) und (ii) eingebrachten Nukleinsäuren können mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren.In a preferred embodiment, the method does not comprise step (iii), and the nucleic acids introduced in steps (i) and (ii) may be amplified by the nucleic acid sequence having the capability in that derived from the transcribable nucleic acid sequence Hybridize transcript with another nucleic acid sequence, hybridize with each other.
In einer bevorzugten Ausfϊihrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens des neunten Aspekts umfasst die zu rekombinierende DNA mindestens eine Erkennungs- oder Target- Sequenz für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität, wobei vorzugsweise bei Vorliegen von Rekombinase-Aktivität eine Rekombination mittels der Erkennungs- oder Target- Sequenz erfolgt. Vorzugsweise umfasst die zu rekombinierende DNA zwei Erkennungs- oder Target-Sequenzen und ein Vorliegen von Rekombinase-Aktivität führt zu einem Ausschneiden des zwischen den Erkennungs- oder Target-Sequenzen liegenden DNA- Bereichs. Vorzugsweise ist die Rekombinase Cre Rekombinase und die Erkennungs- oder Target-Sequenzen sind loxP Stellen.In a preferred embodiment of the method of the ninth aspect according to the invention, the DNA to be recombined comprises at least one recognition or target sequence for a polypeptide having recombinase activity, recombination being preferably carried out by means of the recognition or target sequence in the presence of recombinase activity , Preferably, the DNA to be recombined comprises two recognition or target sequences and the presence of recombinase activity results in excision of the DNA region located between the recognition or target sequences. Preferably, the recombinase is Cre recombinase and the recognition or target sequences are loxP sites.
Vorzugsweise führt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren des neunten Aspekts die Rekombination von DNA zu einer Aktivierung oder Inaktivierung eines Zielgens. In dieser Ausfuhrungsform betrifft das Ausschneiden eines DNA-Bereichs bei Aktivierung des Zielgens ein Ausschneiden einer Stopp-Kassette im Zielgen und bei Inaktivierung des Zielgens ein Ausschneiden des Zielgens oder eines Teils davon. Das Zielgen kann hierbei ein jegliches Gen von Interesse sein und es können durch eine oder mehrere Rekombinationen von DNA auch mehr als ein Zielgen jeweils aktiviert oder inaktiviert werden. Beispiele für Zielgene in Maus, die durch Rekombination inaktiviert werden können, sind RFX5, Smad5, TGF-beta Rezeptor I, Fas, c-Myb und I kappa B Kinase Untereinheit 2. Beispiele für Zielgene in Maus, die durch Rekombination aktiviert werden können, sind RAGE Reporter, c-Myc, Pim-1 und NFl.Preferably, in the method of the ninth aspect of the invention, the recombination of DNA results in the activation or inactivation of a target gene. In this embodiment, excision of a DNA region upon activation of the target gene involves cutting out a stop cassette in the target gene and, when the target gene is inactivated, cutting out the target gene or a part thereof. The target gene may in this case be any gene of interest, and it is also possible, by one or more recombinations of DNA, to activate or inactivate more than one target gene in each case. Examples of mouse target genes that can be inactivated by recombination are RFX5, Smad5, TGF-beta receptor I, Fas, c-Myb and I kappa B kinase subunit 2. Examples of target genes in mouse that can be activated by recombination, are RAGE reporter, c-myc, pim-1 and NFl.
In einer Ausführungsform des Verfahrens des neunten Aspekts ist die zu rekombinierende DNA genomische DNA und die genomische DNA trägt mindestens eine Erkennungs- oder Target-Sequenz für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität wie vorstehend beschrieben.In one embodiment of the method of the ninth aspect, the DNA to be recombined is genomic DNA and the genomic DNA carries at least one recognition or target sequence for a polypeptide having recombinase activity as described above.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingebrachten Nukleinsäuren entsprechen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren des ersten Aspekts. Ferner wird in den erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise ein erfindungsgemäßer Satz von Nukleinsäuren des dritten Aspekts verwendet. Alle für die erfindungsgemäße Nukleinsäure des ersten Aspekts oder den erfindungsgemäßen Satz von Nukleinsäuren erläuterten bevorzugten Ausfuhrungsformen gelten entsprechend für die erfindungsgemäßen Verfahren.The nucleic acids introduced in the method according to the invention correspond to nucleic acids according to the invention of the first aspect. Furthermore, in the method according to the invention preferably a set of nucleic acids of the third aspect according to the invention is used. All for the inventive nucleic acid of the first aspect or the according to the invention set of nucleic acids explained preferred embodiments apply correspondingly for the inventive method.
Vorzugsweise sind in den erfindungsgemäßen Verfahren die Promotoren der verwendeten Nukleinsäuren unterschiedlich und fuhren in ihrer Kombination zu einer zell- oder gewebsspezifischen Expression des Polypeptides mit Rekombinase- Aktivität.Preferably, in the methods according to the invention, the promoters of the nucleic acids used differ and lead in their combination to a cell- or tissue-specific expression of the polypeptide having recombinase activity.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird bei Ausbleiben einer Aktivierung eines oder mehrerer der Promotoren der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) verwendeten Nukleinsäuren kein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität gebildet.In a preferred embodiment of the method according to the invention, in the absence of activation of one or more of the promoters of the nucleic acids used in steps (i), (ii) and optionally (iii) no polypeptide with recombinase activity is formed.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren liegt die Zelle in einem Organismus vor. Vorzugsweise ist der Organismus eine Pflanze oder ein Tier o, vorzugsweise ein Säuger. Bevorzugte Beispiele des Organismus sind Mensch, Nagetier wie zum Beispiel Maus oder Ratte, Affe wie zum Beispiel Primat, Zebrafisch, Fruchtfliege wie zum Beispiel Dorsophila melanogaster, oder Frosch wie zum Beispiel Xenopus laevis. In einer Ausführungsform ist der Organismus nicht menschlich.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the cell is present in an organism. Preferably, the organism is a plant or animal, preferably a mammal. Preferred examples of the organism are human, rodent such as mouse or rat, monkey such as primate, zebrafish, fruit fly such as Dorsophila melanogaster, or frog such as Xenopus laevis. In one embodiment, the organism is not human.
Der Organismus weist vorzugsweise mehrere Zellen auf, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie hierin beschrieben eingebracht wurden. Vorzugsweise bilden in einem Organismus Zellen, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie hierin beschrieben eingebracht wurden, einen Teil oder das Gesamte eines oder mehrerer Gewebe. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Organismus im Wesentlichen in seiner Gesamtheit aus Zellen, in die erfindungsgemäß Nukleinsäuren wie vorstehend beschrieben eingebracht wurden. "Erfindungsgemäß eingebracht" beinhaltet in diesem Zusammenhang nicht nur die Situation eines Zuführens der Nukleinsäuren an die Zelle, zum Beispiel durch Transfektion oder Mikroinjektion, sondern auch die Situation, dass zugeführte Nukleinsäuren durch Zellvermehrung an andere Zellen weitergegeben werden. So kann erfindungsgemäß beispielsweise Nukleinsäure in einen Organismus derart eingebracht werden, dass die Nukleinsäure in eine Zelle des Organismus, zum Beispiel eine Oozyte eingebracht wird und daraus der Organismus herangezogen wird. Erfindungsgemäß ist auch der Fall umfasst, dass sich nicht alle erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren anfänglich in einer Zelle oder in einem Organismus befinden, sondern die erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren auf verschiedene, vorzugsweise zwei Zellen oder Individuen des Organismus verteilt sind und erst beispielsweise durch Zellfusion bzw. Kreuzung der Individuen ein Individuum entsteht, das alle erfindungsgemäß einzubringenden Nukleinsäuren trägt.The organism preferably has a plurality of cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described herein. Preferably, in an organism, cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described herein form part or all of one or more tissues. In a particularly preferred embodiment, the organism essentially consists in its entirety of cells into which nucleic acids according to the invention have been introduced as described above. "Introduced according to the invention" in this context includes not only the situation of supplying the nucleic acids to the cell, for example by transfection or microinjection, but also the situation that supplied nucleic acids are passed on to other cells by cell proliferation. Thus, according to the invention, for example nucleic acid can be introduced into an organism such that the nucleic acid is introduced into a cell of the organism, for example an oocyte, and the organism is used therefrom. According to the invention, the case is also encompassed that not all inventively introduced nucleic acids are initially in a cell or in an organism, but the inventively introduced nucleic acids are distributed to different, preferably two cells or individuals of the organism and only for example by cell fusion or crossing of the Individuals an individual arises, which carries all nucleic acids to be introduced according to the invention.
Vorzugsweise wird beispielsweise in der Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Verfahren, in der keine Nukleinsäure gemäß Schritt (iii) einzubringen ist, das Einbringen aller einzubringenden Nukleinsäuren dadurch bewirkt, dass ein Individuum bereitgestellt wird, das eine in Schritt (i) einzubringende Nukleinsäure trägt, und ein zweites Individuum bereitgestellt wird, das eine in Schritt (ii) einzubringende Nukleinsäure trägt. Vorzugsweise wird ein solches Individuum eines Organismus durch Einbringen der Nukleinsäure in eine Oozyte des Organismus, zum Beispiel durch Mikroinjektion, und Heranziehen des Individuums aus der Oozyte bereitgestellt. Erst durch Kreuzung beider Individuen entsteht ein Individuum, in dem beide Nukleinsäuren gemeinsam in einer Zelle vorliegen und bei Aktivierung aller Promotoren Rekombinase- Aktivität bereitstellen können.For example, in the embodiment of the method according to the invention, in which no nucleic acid according to step (iii) is to be introduced, introduction of all nucleic acids to be introduced is effected by providing an individual carrying a nucleic acid to be introduced in step (i) and a second Individual who carries a nucleic acid to be introduced in step (ii). Preferably, such an individual of an organism is provided by introducing the nucleic acid into an oocyte of the organism, for example by microinjection, and bringing the individual out of the oocyte. Only by crossing both individuals does an individual emerge in which both nucleic acids are present together in one cell and can provide recombinase activity upon activation of all promoters.
Vorzugsweise wird in den vorstehenden Ausfuhrungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren die Rekombinase- Aktivität mittels einer Kombination von Promotoren, die Gewebs- oder Zellspezifität aufweist, gewebs- oder zellspezifisch bereitgestellt. Somit findet eine Rekombination von DNA vorzugsweise gewebs- oder zellspezifisch statt.Preferably, in the above embodiments of the method according to the invention, the recombinase activity is provided by means of a combination of promoters which has tissue or cell specificity, tissue or cell specific. Thus, recombination of DNA preferably occurs tissue or cell specific.
Alle vorstehenden Verfahren sind auch auf die Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure des ersten Aspekts anwendbar, die mit der endogenen prä-mRNA ein transSpleißen eingeht. In dieser Ausführungsform werden die für ein solches trans-Spleißen benötigten vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren in die Zelle eingebracht.All the above methods are also applicable to the embodiment of the nucleic acid according to the invention of the first aspect, which trans-splits with the endogenous pre-mRNA. In this embodiment, the nucleic acids described above for such trans-splicing are introduced into the cell.
In einem zehnten Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das eine für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz durch mindestes eine Intronsequenz unterteilt ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls des zehnten Aspekts liegt eine Intronsequenz zwischen den Nukleotiden der für Cre Rekombinase kodierenden Nukleinsäuresequenz, die den Nukleotiden an den Positionen 504 und 505 beziehungsweise den Positionen 551 und 552 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 12 oder den entsprechenden Positionen einer dazu homologen Sequenz entsprechen.In a tenth aspect, the invention relates to a DNA molecule which comprises a nucleic acid sequence coding for Cre recombinase, characterized in that the nucleic acid sequence coding for Cre recombinase is subdivided by at least one intron sequence. In a preferred embodiment of the DNA molecule of the tenth aspect according to the invention, an intron sequence is located between the nucleotides of the Cre recombinase-encoding nucleic acid sequence corresponding to the nucleotides at positions 504 and 505 or positions 551 and 552 of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12 or the correspond to corresponding positions of a homologous sequence.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls des zehnten Aspekts ist mindestens eine der Intronsequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanem VEGF Intron, CD40L Intron 1, Kaninchen beta-Globin Intron 2, Maus Prml Intron, SV40 T-Antigen Intron, IgM C1-C2 Intron und IgE Intron. Vorzugsweise umfasst mindestens eine der Intronsequenzen die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14 oder einer dazu homologen Sequenz.In a further preferred embodiment of the DNA molecule of the tenth aspect according to the invention, at least one of the intron sequences is selected from the group consisting of human VEGF intron, CD40L intron 1, rabbit beta globin intron 2, mouse Prml intron, SV40 T antigen intron, IgM C1-C2 intron and IgE intron. Preferably, at least one of the intron sequences comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14 or a sequence homologous thereto.
Vorzugsweise ist die für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz durch genau eine Intronsequenz unterteilt.Preferably, the nucleic acid sequence coding for Cre recombinase is subdivided by exactly one intron sequence.
Vorzugsweise umfasst die für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 12 oder einer dazu homologen Sequenz.Preferably, the nucleic acid sequence coding for Cre recombinase comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12 or a sequence homologous thereto.
Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention
Die Begriffe "Nukleinsäure", "Nukleinsäuresequenz" und "Nukleinsäuremolekül" umfassen erfindungsgemäß Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) wie zum Beispiel genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte DNA bzw. RNA. Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen.The terms "nucleic acid", "nucleic acid sequence" and "nucleic acid molecule" according to the invention include deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) such as genomic DNA, cDNA, mRNA, recombinantly produced and chemically synthesized DNA or RNA. According to the invention, a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular closed molecule.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Nukleinsäuren sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifϊziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht.The nucleic acids described according to the invention are preferably isolated. The term "isolated nucleic acid" according to the invention means that the nucleic acid (i) was amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) was produced recombinantly by cloning, (iii) was purified, for example by cleavage and gel electrophoretic separation, or (iv) was synthesized, for example by chemical synthesis. An isolated nucleic acid is a nucleic acid available for manipulation by recombinant DNA techniques.
Eine "transkribierbare Nukleinsäuresequenz" ist erfindungsgemäß eine jegliche Nukleinsäuresequenz, die in ein RNA-Transkript transkribierbar ist.A "transcribable nucleic acid sequence" according to the invention is any nucleic acid sequence that is transcribable into an RNA transcript.
Der Begriff „RNA" oder „Transkript" betrifft ein Molekül, das mindestens zwei Ribonukleotidreste umfasst. „Ribonukleotid" betrifft ein Nukleotid mit einer Hydroxylgruppe an der 2 '-Position einer ß-D-Ribofüranose-Gruppe.The term "RNA" or "transcript" refers to a molecule comprising at least two ribonucleotide residues. "Ribonucleotide" refers to a nucleotide having a hydroxyl group at the 2 'position of a β-D-ribofuranose group.
Der Begriff „Nukleinsäure" umfasst erfindungsgemäß auch „Derivate" einer Nukleinsäure. „Derivate" einer Nukleinsäure bedeutet erfindungsgemäß, dass einzelne oder mehrfache wie mindestens 2, mindestens 4 oder mindestens 6 und vorzugsweise bis zu 3, bis zu 4, bis zu 5, bis zu 6, bis zu 10, bis zu 15, oder bis zu 20 Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen in der Nukleinsäure vorliegen. Ferner umfasst der Begriff „Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, einem Zucker oder an dem Phosphat. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Nukleinsäure, die Nukleotide und Nukleotidanaloge enthalten, die nicht in natürlicher Weise auftreten.The term "nucleic acid" according to the invention also includes "derivatives" of a nucleic acid. "Derivatives" of a nucleic acid means according to the invention that single or multiple such as at least 2, at least 4 or at least 6 and preferably up to 3, up to 4, up to 5, up to 6, up to 10, up to 15, or up to In addition, the term "derivative" also includes a chemical derivatization of a nucleic acid on a nucleotide base, a sugar or on the phosphate. The term "derivative" also includes nucleic acid containing nucleotides and nucleotide analogs that do not naturally occur.
Nukleinsäuren können erfindungsgemäß alleine oder in Kombination mit anderen Nukleinsäuren vorliegen, die homolog oder heterolog zueinander sein können. Der Begriff „homolog" bedeutet, dass eine Nukleinsäure auch natürlich mit der Nukleinsäure, mit der sie kombiniert ist, funktionell verbunden ist und der Begriff „heterolog" bedeutet, dass eine Nukleinsäure nicht natürlich mit der Nukleinsäure, mit der sie kombiniert ist, funktionell verbunden ist.According to the invention, nucleic acids may be present alone or in combination with other nucleic acids which may be homologous or heterologous to one another. The term "homologous" also means that a nucleic acid is also, of course, functionally linked to the nucleic acid with which it is combined and the term "heterologous" means that a nucleic acid is not naturally linked to the nucleic acid with which it is combined is.
"Funktionelle Verbindung" oder "funktionell verbunden" betrifft erfindungsgemäß eine Verbindung in einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleinsäure ist "funktionell verbunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt wird. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einer kodierenden Sequenz funktionell verbunden, falls er die Transkription der kodierenden Sequenz beeinflusst und vorzugsweise die Transkription der kodierenden Sequenz auslöst. Funktionell verbundene Nukleinsäuren sind typischerweise benachbart zueinander, gegebenenfalls getrennt durch weitere Nukleinsäuresequenzen. Eine Nukleinsäuresequenz kann erfindungsgemäß funktionell in Verbindung mit Expressionskontrollsequenzen vorliegen, die in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein können."Functional compound" or "functionally connected" according to the invention relates to a compound in a functional relationship. A nucleic acid is "operably linked" when placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the coding sequence, and preferably triggers transcription of the coding sequence. Functionally linked nucleic acids are typically adjacent to each other, optionally separated by additional nucleic acid sequences. A nucleic acid sequence according to the invention may be functionally in association with expression control sequences which may be homologous or heterologous relative to the nucleic acid.
Eine transkribierbare Nukleinsäure, insbesondere eine für ein Peptid oder Protein kodierende Nukleinsäure, und eine Expressionskontrollsequenz sind dann "funktionell" miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Transkription oder Expression der transkribierbaren und insbesondere kodierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der Expressionskontrollsequenz steht. Falls die Nukleinsäure in ein funktionelles Peptid oder Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktionellen Verbindung einer Expressionskontrollsequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der Expressionskontrollsequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Peptid oder Protein translatiert zu werden.A transcribable nucleic acid, in particular a nucleic acid coding for a peptide or protein, and an expression control sequence are then "functionally" linked together, if they are covalently linked such that the transcription or expression of the transcribable and in particular coding nucleic acid under the control or under the Influence of the expression control sequence is. If the nucleic acid is to be translated into a functional peptide or protein, in a functional connection of an expression control sequence with the coding sequence, induction of the expression control sequence leads to transcription of the coding sequence without resulting in frame shift in the coding sequence or inability of the coding sequence coding sequence comes to be translated into the desired peptide or protein.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, ribosombindende Sequenzen und andere Kontrollelemente, welche die Transkription eines Gens oder die Translation der abgeleiteten RNA steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausfuhrungsformen sind die Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von Expressionskontrollsequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im allgemeinen 5'-nicht-transkribierte und 5'- und 3'-nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA- Box, Capping-Sequenz, CAAT-Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5'-nicht- transkribierte-Expressionskontrollsequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptionelle Kontrolle des funktionell verbundenen Gens einschließt. Expressionskontrollsequenzen können auch Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.The term "expression control sequence" encompasses, according to the invention, promoters, ribosome-binding sequences and other control elements which control the transcription of a gene or the translation of the derived RNA.The expression control sequences are regulatable in certain embodiments according to the invention The exact structure of expression control sequences can vary depending on the species or cell type, but includes generally 5'-untranscribed and 5'- and 3'-untranslated sequences involved in the initiation of transcription, such as TATA box, capping sequence, CAAT sequence and the like Non-transcribed expression control sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for transcriptional control of the functionally linked gene, Expression control sequences may also include enhancer sequences or upstream activator sequences.
Der Begriff "Promotor" oder "Promotorregion" betrifft eine DNA-Sequenz, die stromaufwärts (5') zu der kodierenden Sequenz eines Gens liegt und die Expression der kodierenden Sequenz durch Bereitstellen einer Erkennungs- und Bindungsstelle für RNA-Polymerase steuert. Die Promotorregion kann weitere Erkennungs- oder Bindungsstellen für weitere Faktoren beinhalten, die an der Regulation der Transkription des Gens beteiligt sind. Ein Promotor kann die Transkription eines prokaryontischen oder eukaryontischen Gens steuern. Ein Promotor kann "induzierbar" sein und die Transkription in Reaktion auf ein Induktionsmittel initiieren oder er kann "konstitutiv" sein, falls die Transkription nicht durch ein Induktionsmittel gesteuert wird. Ein induzierbarer Promotor wird nicht exprimiert oder nur in einem sehr geringen Maß exprimiert, wenn ein Induktionsmittel fehlt. In Gegenwart des Induktionsmittels wird das Gen "angeschalten" oder das Transkriptionsniveau erhöht. Dies wird herkömmlicherweise durch die Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors vermittelt. Der Begriff "gewebs- oder zellspezifischer Promotor" betrifft erfindungsgemäß einen Promotor, der nur in einem oder mehreren bestimmten Geweben oder Zellen aktiv ist und keine oder nur sehr geringe Aktivität in anderen Geweben oder Zellen aufweist. Vorzugsweise weist ein gewebs- oder zellspezifischer Promotor in den Geweben oder Zellen, für die er nicht spezifisch ist, höchstens 20%, mehr bevorzugt höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 2%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% der Aktivität auf, die er in Geweben oder Zellen aufweist, für die er spezifisch ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist ein gewebs- oder zellspezifischer Promotor in den Geweben oder Zellen, für die er nicht spezifisch ist keine nachweisbare Aktivität auf.The term "promoter" or "promoter region" refers to a DNA sequence located upstream (5 ') to the coding sequence of a gene and directing the expression of the coding sequence by providing a recognition and binding site for RNA polymerase. The promoter region may include other recognition or binding sites for other factors involved in the regulation of transcription of the gene. One Promoter may direct the transcription of a prokaryotic or eukaryotic gene. A promoter may be "inducible" and initiate transcription in response to an inducer, or it may be "constitutive" if transcription is not controlled by an inducer. An inducible promoter is not expressed or expressed only to a very small extent if an inducer is missing. In the presence of the inducer, the gene is "turned on" or the level of transcription increased. This is conventionally mediated by the binding of a specific transcription factor. The term "tissue- or cell-specific promoter" according to the invention relates to a promoter which is active only in one or more specific tissues or cells and has no or very little activity in other tissues or cells. Preferably, a tissue or cell specific promoter in the tissues or cells for which it is not specific has at most 20%, more preferably at most 10%, at most 5%, at most 2%, at most 1% or at most 0.1% of the activity he has in tissues or cells for which he is specific. In a particularly preferred embodiment, a tissue or cell specific promoter in the tissues or cells for which it is not specific has no detectable activity.
Gewebsspezifische Promotoren sind vorzugsweise spezifisch für ein oder mehrere Gewebe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus epithelialem Gewebe einschließlich Haut, Lunge und Leber, Bindegewebe, zentralem und peripherem Nervensystem einschließlich des autonomen Nervensystems und der Sinnesrezeptoren, glatter und gestreifter Muskulatur, Myokard, und hämatopoetischem System einschließlich des Immunsystems. Zellspezifische Promotoren sind vorzugsweise spezifisch für NK-T Zellen, Mastzellen, lymphoide dendritische Zellen, myeloide dendritische Zellen, Makrophagen, Mikroglia, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Gallengangzellen oder Kombinationen davon.Tissue specific promoters are preferably specific for one or more tissues selected from the group consisting of epithelial tissue including skin, lung and liver, connective tissue, central and peripheral nervous system including the autonomic nervous system and the sensory receptors, smooth and striped musculature, myocardium, and hematopoietic system including the immune system. Cell-specific promoters are preferably specific for NK-T cells, mast cells, lymphoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, macrophages, microglia, plasma cells, memory cells, bile duct cells, or combinations thereof.
Erfindungsgemäß bevorzugte Promotoren sind beispielsweise NKl.1 Promoter, CD8alpha Promoter, CDl Ic Promoter, CDl Ib Promoter, Lysozym M Promoter, CD 19 Promoter, Syndecan-1 Promoter, Kl 9 Promoter und Albumin Promoter. Die ubiquitär ausgeprägten Promotoren der Phosphoglyceratkinase, des RAGE Proteins, des b-Actins, des Chicken- Globulins oder des ROSA26 Genes können vorzugsweise für die Erstellung von Testkonstukten und transgenen Tieren zum Testen der Effizienz von trans-Spleiß- Nukleinsäuren verwendet werden. "Hybridisieren" bedeutet erfindungsgemäß, dass sich Nukleinsäuren in Abhängigkeit von ihrer Sequenz aneinander lagern und vorzugsweise ein stabiles Duplex eingehen können. Vorzugsweise sind miteinander hybridisierende Nukleinsäuren zueinander komplementär.Preferred promoters according to the invention are, for example, NK1.1 promoter, CD8alpha promoter, CD10c promoter, CD19b promoter, lysozyme M promoter, CD19 promoter, syndecan-1 promoter, Kl9 promoter and albumin promoter. The ubiquitous promoters of the phosphoglycerate kinase, the RAGE protein, the b-actin, the chicken globulin or the ROSA26 gene can preferably be used for the preparation of test constructs and transgenic animals for testing the efficiency of trans-splicing nucleic acids. According to the invention, "hybridization" means that nucleic acids can be deposited on one another depending on their sequence and preferably can undergo a stable duplex. Preferably, mutually hybridizing nucleic acids are complementary to each other.
Eine zu einer Referenznukleinsäuresequenz homologe Nukleinsäuresequenz hat vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Referenznukleinsäuresequenz komplementär und weiterhin vorzugsweise funktionsgleich ist.A nucleic acid sequence homologous to a reference nucleic acid sequence preferably has a nucleic acid sequence which is complementary to the reference nucleic acid sequence and further preferably functionally identical.
Die Begriffe „Komplementarität" oder „komplementär" bedeuten, dass eine Nukleinsäure (eine) Wasserstoffbindung(en) mit einer anderen Nukleinsäure durch entweder herkömmliche Watson-Creek oder andere nicht-herkömmliche Arten einer Wechselwirkung eingehen kann. Vorzugsweise sind hybridisierende oder komplementäre Nukleinsäuren erfindungsgemäß „vollständig komplementär", was bedeutet, dass alle benachbarten Reste einer Nukleinsäuresequenz Wasserstoffbindungen mit der gleichen Anzahl an benachbarten Resten in einer zweiten Nukleinsäuresequenz eingehen werden.The terms "complementarity" or "complementary" mean that one nucleic acid can undergo hydrogen bonding (s) with another nucleic acid by either conventional Watson-Creek or other non-conventional species of interaction. Preferably, hybridizing or complementary nucleic acids are "fully complementary" according to the invention, which means that all adjacent residues of one nucleic acid sequence will undergo hydrogen bonding with the same number of adjacent residues in a second nucleic acid sequence.
Vorzugsweise ist eine Nukleinsäure dann zu einer anderen Nukleinsäure „komplementär", wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei die Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Hrsg., 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 650C in Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH2PO4 (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid/ 0,15 M Natriumeitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde, beispielsweise in 2 x SSC bei Raumtemperatur und sodann in 0,1 - 0,5 x SSC/ 0,1 x SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.Preferably, one nucleic acid is "complementary" to another nucleic acid if the two sequences can hybridize to each other and form a stable duplex, preferably hybridizing under conditions allowing specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Ed., 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., eds , John Wiley & Sons, Inc., New York, and refer, for example, to hybridization at 65 ° C. in hybridization buffer (3.5 × SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 2 , 5 mM NaH 2 PO 4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) SSC is 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7. After hybridization, the membrane to which the DNA has been transferred is de, for example, in 2 x SSC at room temperature and then in 0.1 - 0.5 x SSC / 0.1 x SDS at temperatures up to 68 ° C.
Komplementäre Nukleinsäuren weisen erfindungsgemäß mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf. Der Begriff "% Identität" soll einen Prozentwert an Nukleotiden oder Aminosäuren bezeichnen, die zwischen zwei zu vergleichenden Sequenzen bei einem optimalen Alignment identisch sind, wobei dieser Prozentwert rein statistisch ist, die Unterschiede zwischen den zwei Sequenzen zufällig und über die gesamte Sequenzlänge verteilt sein können und die zu vergleichende Sequenz Additionen oder Deletionen im Vergleich zu der Referenzsequenz umfassen kann, um ein optimales Alignment zwischen zwei Sequenzen zu erreichen. Sequenzvergleiche zwischen zwei Sequenzen werden im Allgemeinen durch Vergleich dieser Sequenzen nach einem optimalen Alignment in Bezug auf ein Segment oder "Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Bereiche einer Sequenzübereinstimmung zu identifizieren. Das optimale Alignment für einen Vergleich kann manuell oder mit Hilfe des lokalen Homologiealgorithmus von Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mit Hilfe des lokalen Homologiealgorithmus vonNeddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, und mit Hilfe des Ähnlichkeitssuchalgorithmus von Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85, 2444, oder mit Hilfe von Computerprogrammen, die diese Algorithmen verwenden, (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) durchgeführt werden.Complementary nucleic acids according to the invention have at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98% or at least 99% identity of the nucleotides. The term "% identity" is intended to indicate a percentage of nucleotides or amino acids that are identical between two sequences to be compared in an optimal alignment, this percentage being purely statistical, the differences between the two sequences being random and distributed over the entire sequence length and the sequence to be compared may comprise additions or deletions relative to the reference sequence to achieve optimal alignment between two sequences. Sequence comparisons between two sequences are generally performed by comparing these sequences for optimal alignment with respect to a segment or "comparison window" to identify local regions of sequence match. The optimal alignment for a comparison can be done manually or using the local homology algorithm of Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, using the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, and using the similarity search algorithm of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Be. USA 85, 2444, or by computer programs employing these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) become.
Die prozentuale Identität wird durch Bestimmung der Anzahl an identischen Positionen, in denen die zu vergleichenden Sequenzen übereinstimmen, Teilung dieser Anzahl durch die verglichenen Positionen und Multiplikation dieses Ergebnisses mit 100 erhalten.The percent identity is obtained by determining the number of identical positions in which the sequences to be compared match, dividing this number by the positions compared, and multiplying this result by 100.
Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein Grad an Identität der Nukleotide oder Aminosäuren für die gesamte Länge der Referenznukleinsäuresequenz beziehungsweise Referenzaminosäuresequenz angegeben.Preferably, according to the invention, a degree of identity of the nucleotides or amino acids is specified for the entire length of the reference nucleic acid sequence or reference amino acid sequence.
Beispielsweise kann das Programm BLAST "BLAST 2 sequences", das von der Website htφ://www.ncbi.nlm.rήh.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi erhältlich ist, verwendet werden.For example, the program BLAST "BLAST 2 sequences" available from the website htφ: //www.ncbi.nlm.rήh.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi can be used.
„3 '-Ende einer Nukleinsäure" betrifft erfindungsgemäß dasjenige Ende, an dem sich eine freie Hydroxy-Gruppe befindet. In schematischer (auch einzelsträngiger) Darstellung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, insbesondere DNA, befindet sich das 3 '-Ende immer rechts. „5 '-Ende einer Nukleinsäure" betrifft erfindungsgemäß dasjenige Ende, an dem sich eine freie Phosphat-Gruppe befindet. In schematischer (auch einzelsträngiger) Darstellung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, insbesondere DNA, befindet sich das 5 '-Ende immer links.According to the invention, "3 'end of a nucleic acid" refers to the end where a free hydroxy group is located In a schematic (or single-stranded) representation of double-stranded nucleic acids, in particular DNA, the 3' end is always on the right. End of a nucleic acid "according to the invention relates to that end at which a free Phosphate group is located. In schematic (even single-stranded) representation of double-stranded nucleic acids, in particular DNA, the 5 'end is always left.
5'-Ende 5'-P-NNNNNNN-OH-3' 3'-Ende5'-end 5'-P-NNNNNNN-OH-3'3 'end
3'-HO-NNNNNNN-P--5'3'-HO-NNNNNNN-P - 5 '
Bei einzelsträngiger Darstellung von doppelsträngiger DNA eines Gens wird in der Regel der Strang dargestellt, der der mRNA des Gens entspricht.In the case of single-stranded representation of double-stranded DNA of a gene, the strand which corresponds to the mRNA of the gene is generally displayed.
Erfindungsgemäß wird eine erste Polynukleotid-Region als zu einer zweiten Polynukleotid- Region stromabwärts gelegen betrachtet, wenn das 5'-Ende der ersten Polynukleotid-Region der zu dem 3 '-Ende der zweiten Polynukleotid-Region nächstgelegene Teil der ersten Polynukleotid-Region ist. Erfindungsgemäß wird eine erste Polynukleotid-Region als zu einer zweiten Polynukleotid-Region stromaufwärts gelegen betrachtet, wenn das 3 '-Ende der ersten Polynukleotid-Region der zu dem 5 '-Ende der zweiten Polynukleotid-Region nächstgelegene Teil der ersten Polynukleotid-Region ist.According to the invention, a first polynucleotide region is considered downstream to a second polynucleotide region when the 5 'end of the first polynucleotide region is the nearest to the 3' end of the second polynucleotide region of the first polynucleotide region. According to the invention, a first polynucleotide region is considered upstream to a second polynucleotide region when the 3 'end of the first polynucleotide region is the nearest to the 5' end of the second polynucleotide region of the first polynucleotide region.
Ein "Teil einer Nukleinsäure" betrifft ein Fragment an zusammenhängenden und zueinander benachbarten Nukleotiden der Nukleinsäure, das eine beliebige Länge, jedoch eine Länge, die kürzer ist als die gesamte Länge der Nukleinsäure aufweisen kann. Vorzugsweise weist ein Teil einer Nukleinsäure bis zu 5%, bis zu 10%, bis zu 25%, bis zu 40%, bis zu 50%, bis zu 60% oder bis zu 70% der Nukleotide der Nukleinsäure auf. Vorzugsweise weist ein Teil einer Nukleinsäure höchstens 40%, höchstens 50%, höchstens 60%, höchstens 70%, höchstens 80%, höchstens 90% oder höchstens 95% der Nukleotide der Nukleinsäure auf. Der Begriff "5 '-terminaler Teil einer Nukleinsäure" betrifft einen Teil der Nukleinsäure, der das 5'-Ende der Nukleinsäure, jedoch nicht das 3 '-Ende der Nukleinsäure umfasst. Der Begriff "3'- terminaler Teil einer Nukleinsäure" betrifft einen Teil der Nukleinsäure, der das 3 '-Ende der Nukleinsäure, jedoch nicht das 5 '-Ende der Nukleinsäure umfasst.A "part of a nucleic acid" refers to a fragment of contiguous and mutually adjacent nucleotides of the nucleic acid which may be of any length but a length shorter than the entire length of the nucleic acid. Preferably, a portion of a nucleic acid comprises up to 5%, up to 10%, up to 25%, up to 40%, up to 50%, up to 60% or up to 70% of the nucleotides of the nucleic acid. Preferably, a part of a nucleic acid has at most 40%, at most 50%, at most 60%, at most 70%, at most 80%, at most 90% or at most 95% of the nucleotides of the nucleic acid. The term "5 '-terminal part of a nucleic acid" refers to a part of the nucleic acid comprising the 5' end of the nucleic acid but not the 3 'end of the nucleic acid. The term "3'-terminal part of a nucleic acid" refers to a part of the nucleic acid comprising the 3 'end of the nucleic acid but not the 5' end of the nucleic acid.
Der Begriff "Stopp-Kassette" betrifft erfindungsgemäß eine Nukleinsäuresequenz, die die Expression eines Gens verhindern kann, wenn sie in die Nukleinsäuresequenz des Gens eingefügt ist. Vorzugsweise hemmt oder verhindert eine Stopp-Kassette die Transkription der kodierenden Sequenz des Gens, wodurch keine oder nur geringe Mengen der mRNA des Gens gebildet werden können. Vorzugsweise ist eine Stopp-Kassette zwischen dem Promotor und der kodierenden Sequenz eines Gens eingefügt. Bevorzugte Stopp-Kassetten sind von Erkennungssequenzen für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität flankiert, vorzugsweise von gleichgerichteten loxP Stellen, die vorzugsweise bei Vorliegen einer Rekombinase- Aktivität eine Entfernung, d.h. ein Ausschneiden, der Stopp-Kassette aus dem Gen erlauben.The term "stop cassette" according to the invention relates to a nucleic acid sequence which can prevent the expression of a gene when it is inserted into the nucleic acid sequence of the gene. Preferably, a stop cassette inhibits or prevents the transcription of the coding sequence of the gene, whereby no or only small amounts of the mRNA of the gene can be formed. Preferably, a stop cassette is between the promoter and the coding sequence of a gene. Preferred stop cassettes are flanked by recognition sequences for a polypeptide having recombinase activity, preferably rectified loxP sites which, preferably in the presence of recombinase activity, allow for removal, ie, excision, of the stop cassette from the gene.
Der Begriff "Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des Weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen. In Bezug auf RNA betrifft der Begriff „Expression" oder „Translation" insbesondere die Produktion von Peptiden oder Proteinen. "Startkodon" betrifft erfindungsgemäß dasjenige Kodon, bei dem die Translation einer Nukleinsäure in ein Peptid, Polypeptid oder Protein beginnt. Vorzugsweise hat ein Startkodon die Sequenz AUG beziehungsweise ATG. "Stoppkodon" betrifft erfindungsgemäß dasjenige Kodon, bei dem die Translation einer Nukleinsäure in ein Peptid, Polypeptid oder Protein abbricht, da es nicht für eine Aminosäure kodiert, sondern einen Freisetzungsfaktor der Proteinbiosynthese binden kann. Vorzugsweise hat ein Stoppkodon die Sequenz UAG, UAA oder UGA beziehungsweise TAG, TAA oder TGA. Der Begriff "Polyadenylierungssignal" betrifft erfindungsgemäß eine Nukleinsäuresequenz, die stromabwärts zur kodierenden Nukleinsäuresequenz in einer mRNA liegt und die Polyadenylierung der mRNA begünstigt. Vorzugsweise hat ein Polyadenylierungssignal die Nukleinsäuresequenz AAUAAA.The term "expression" is used according to the invention in its most general meaning and includes the production of RNA or of RNA and protein. It also includes partial expression of nucleic acids. Furthermore, the expression can be transient or stable. With regard to RNA, the term "expression" or "translation" refers in particular to the production of peptides or proteins. According to the invention, "start codon" refers to that codon in which the translation of a nucleic acid into a peptide, polypeptide or protein begins. Preferably, a start codon has the sequence AUG or ATG. According to the invention, "stop codon" refers to that codon in which the translation of a nucleic acid into a peptide, polypeptide or protein terminates, since it does not code for an amino acid but can bind a release factor of protein biosynthesis. Preferably, a stop codon has the sequence UAG, UAA or UGA or TAG, TAA or TGA. According to the invention, the term "polyadenylation signal" relates to a nucleic acid sequence which lies downstream of the coding nucleic acid sequence in an mRNA and favors the polyadenylation of the mRNA. Preferably, a polyadenylation signal has the nucleic acid sequence AAUAAA.
Der Begriff „von einer Nukleinsäuresequenz transkribierte Nukleinsäuresequenz" oder "von einer Nukleinsäure abgeleitetes Transkript" betrifft RNA, gegebenenfalls als Teil eines Gesamt-RNA-Moleküls, die ein Transkriptionsprodukt der ersten Nukleinsäuresequenz ist.The term "nucleic acid sequence transcribed from a nucleic acid sequence" or "nucleic acid derived transcript" refers to RNA, optionally as part of a total RNA molecule, which is a transcription product of the first nucleic acid sequence.
Der Begriff „Gen" betrifft erfindungsgemäß eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die für die Produktion eines oder mehrerer zellulärer Produkte und/oder für das Erreichen einer oder mehrerer interzellulärer oder intrazellulärer Funktionen verantwortlich ist. Insbesondere betrifft der Begriff einen DN A- Abschnitt, welcher eine Nukleinsäure umfasst, die für ein spezifisches Protein oder ein funktionelles bzw. strukturelles RNA-Molekül kodiert.According to the invention, the term "gene" refers to a particular nucleic acid sequence which is responsible for the production of one or more cellular products and / or for the achievement of one or more intercellular or intracellular functions, in particular the term refers to a DN A segment which comprises a nucleic acid which codes for a specific protein or a functional or structural RNA molecule.
Der Begriff "Spleißen" betrifft erfindungsgemäß eine Prozessierung von RNA wie prä- mRNA, bei der vorzugsweise eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise Introns, aus der RNA entfernt, d.h. ausgeschnitten werden. Dadurch werden vorzugsweise Nukleinsäuresequenzen, die in der gespeißten RNA durch die entfernten Nukleinsäuresequenzen ursprünglich getrennt waren, aneinander gefügt. Die aneinander gefügten Nukleinsäuresequenzen bilden vorzugsweise erst dann eine funktionsfähige RNA aus, insbesondere RNA, die ein funktionsfähiges Protein oder Peptid expremiert. Im Folgenden werden die durch Spleißen aneinander gefugten Nukleinsäuresequenzen allgemein als "kodierende Nukleinsäuresequenzen" bezeichnet, wobei "kodierend" hier nicht ausschließlich auf für ein Protein, Peptid oder Polypeptid kodierend zu verstehen ist, sondern vielmehr bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz Informationsgehalt aufweist, der insbesondere in einer Zelle von funktioneller Bedeutung ist. Ein Intron liegt erfindungsgemäß vorzugsweise zwischen zwei kodierenden Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise Exons, die nach dem Spleißen direkt aneinander gekoppelt sind.According to the invention, the term "splicing" relates to a processing of RNA such as pre-mRNA, in which preferably one or more nucleic acid sequences, preferably introns, are removed from the RNA, ie excised. This will be preferred Nucleic acid sequences that were originally separated in the RNA stored by the removed nucleic acid sequences, joined together. The joined nucleic acid sequences preferably form a functional RNA only then, in particular RNA, which expresses a functional protein or peptide. In the following, the nucleic acid sequences joined together by splicing are generally referred to as "coding nucleic acid sequences", whereby "coding" is here not exclusively to be understood as coding for a protein, peptide or polypeptide, but rather means that the nucleic acid sequence has information content which is particularly in a cell of functional importance. According to the invention, an intron preferably lies between two coding nucleic acid sequences, preferably exons, which are coupled directly to one another after splicing.
"5'-Spleißstelle" bezeichnet den Übergang vom 3'-Ende der in der RNA stromaufwärts gelegenen aneinander zu fugenden Nukleinsäuresequenz, d.h. kodierenden Sequenz, zum 5'- Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz und "3 '-Spleißstelle" bezeichnet den Übergang vom 3'-Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz zum 5'-Ende der in der RNA stromabwärts gelegenen aneinander zu fügenden Nukleinsäuresequenz. Das Spleißen kann autokatalytisch durch die zu entfernende Nukleinsäuresequenz selbst erfolgen, die in diesem Fall ein Rybozym ist, das die nötige katalytische Aktivität zum Entfernen selbst bereitstellt. Alternative kann das Spleißen mit Hilfe eines Spliceosoms erfolgen, das die zu entfernende Nukleinsäuresequenz erkennt und ausschneidet. Das Spliceosom wird dabei vorzugsweise von der Zelle bereitgestellt, in der das Spleißen stattfindet. Die Spleißstellen sind vorzugsweise durch spezifische Sequenzen definiert. Beispiele hierfür sind für die 5'- Spleißstelle die Sequenz AG-GU und für die 3'-Spleißstelle die Sequenz AG-(G/A), wobei "-" die Spleißstelle kennzeichnet."5 'splice site" refers to the transition from the 3' end of the nucleic acid sequence to be fused upstream in the RNA, i. coding sequence, to the 5 'end of the nucleic acid sequence to be removed and "3' splice site" refers to the transition from the 3 'end of the nucleic acid sequence to be removed to the 5' end of the nucleic acid sequence to be joined in the RNA downstream. The splicing may be autocatalytically effected by the nucleic acid sequence itself to be removed, which in this case is a Rybozyme which provides the necessary catalytic activity for removal itself. Alternatively, splicing can be accomplished by means of a spliceosome that recognizes and excises the nucleic acid sequence to be removed. The spliceosome is preferably provided by the cell in which the splicing takes place. The splice sites are preferably defined by specific sequences. Examples are the sequence AG-GU for the 5 'splice site and the sequence AG- (G / A) for the 3' splice site, where "-" denotes the splice site.
Ferner umfasst die zu entfernende Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Spleißdonorstelle, einer Verzweigungsstelle, einer Polypyrimidinsequenz und einer Spleißakzeptorstelle. Die Spleißdonorstelle umfasst die ersten Nukleotide, vorzugsweise mindestens das erste Nukleotid, mindestens die ersten zwei Nukleotide oder mindestens die ersten fünf Nukleotide am 5'-Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz. Die Verzweigungsstelle ist ein Nukleotid im 3'-terminalen Bereich der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise ein Adenosin, das vorzugsweise 18 bis 37 Nukleotide stromaufwärts vom 3'-Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz liegt. Die Polypyrimidinsequenz liegt vorzugsweise zwei Nukleotide stromaufwärts vom 3'-Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz und umfasst vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz Yi iNY, wobei Y ein beliebiges Pyrimidinnukleotid und N ein beliebiges Nukleotid darstellen. Die Spleißakzeptorstelle umfasst die letzten Nukleotide, vorzugsweise mindestens das letzte Nukleotid oder mindestens die letzten zwei Nukleotide am 3'-Ende der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz.Furthermore, the nucleic acid sequence to be removed preferably comprises one or more components selected from the group consisting of a splice donor site, a branching site, a polypyrimidine sequence and a splice acceptor site. The splice donor site comprises the first nucleotides, preferably at least the first nucleotide, at least the first two nucleotides, or at least the first five nucleotides at the 5 'end of the nucleic acid sequence to be deleted. The branching site is a nucleotide in the 3'-terminal region of the nucleic acid sequence to be removed, preferably an adenosine, which is preferably 18 to 37 nucleotides upstream of the 3'-end of the removing nucleic acid sequence. The polypyrimidine sequence is preferably two nucleotides upstream of the 3 'end of the nucleic acid sequence to be deleted, and preferably comprises the nucleic acid sequence Yi iNY, where Y is any pyrimidine nucleotide and N is any nucleotide. The splice acceptor site comprises the last nucleotides, preferably at least the last nucleotide or at least the last two nucleotides at the 3 'end of the nucleic acid sequence to be removed.
Der Begriff "5 '-Spleißregion" betrifft erfindungsgemäß den 5 '-terminalen Teil einer durch Spleißen entfernbaren Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise eines Introns. Vorzugsweise umfasst die 5'-Spleißregion mindestens die ersten 3, mindestens die ersten 5, mindestens die ersten 10, mindestens die ersten 15, mindestens die ersten 20, mindestens die ersten 30 oder mindestens die ersten 50 Nukleotide am 5'-Ende der durch Spleißen entfernbaren Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise umfasst die 5'-Spleißregion eine Spleißdonorstelle. Der Begriff "3'-Spleißregion" betrifft erfindungsgemäß den 3 '-terminalen Teil einer durch Spleißen entfernbaren Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise eines Introns. Vorzugsweise umfasst die 3'-Spleißregion mindestens die letzten 3, mindestens die letzten 5, mindestens die letzten 10, mindestens die letzten 15, mindestens die letzten 20, mindestens die letzten 30, mindestens die letzten 50 oder mindestens die letzten 100 Nukleotide am 3 '-Ende der durch Spleißen entfernbaren Nukleinsäuresequenz. Vorzugsweise umfasst die 3 '-Spleißregion eine Verzweigungsstelle, eine Polypyrimidinsequenz und/oder eine Spleißakzeptorstelle.The term "5 'splice region" refers, according to the invention, to the 5' -terminal part of a spliceable nucleic acid sequence, preferably an intron. Preferably, the 5 'splice region comprises at least the first 3, at least the first 5, at least the first 10, at least the first 15, at least the first 20, at least the first 30, or at least the first 50 nucleotides at the 5' end of the splice removable nucleic acid sequence. Preferably, the 5 'splice region comprises a splice donor site. The term "3 'splice region" refers according to the invention to the 3' -terminal part of a spliceable nucleic acid sequence, preferably an intron. Preferably, the 3 'splice region comprises at least the last 3, at least the last 5, at least the last 10, at least the last 15, at least the last 20, at least the last 30, at least the last 50 or at least the last 100 nucleotides on the 3' End of the splice removable nucleic acid sequence. Preferably, the 3 'splice region comprises a branching site, a polypyrimidine sequence and / or a splice acceptor site.
"Trans-Spleißen" betrifft erfindungsgemäß einen Spleißvorgang, bei dem die zu entfernende Nukleinsäuresequenz zwei Nukleinsäuresequenzen betrifft, die auf unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen vorliegen. Beim trans-Spleißen liegt die 5'-Spleißstelle bzw. 5'- Spleißregion auf einem anderen Nukleinsäuremolekül als die 3'-Spleißstelle bzw. 3'- Spleißregion, wobei das "Donor-NukleinsäuremoleküT die 5 '-Spleißstelle und eine 5'- Spleißregion umfasst und das "Akzeptor-Nukleinsäuremolekül" die 3'-Spleißstelle und eine 3'-Spleißregion umfasst. Ansonsten gilt im Wesentlichen das hier für Spleißen Erläuterte sinngemäß auch für trans-Spleißen. Die beiden Nukleinsäuremoleküle, die Substrat des trans- Spleiß-Vorgangs sind, wobei eines als Donor-Nukleinsäuremolekül und das andere als Akzeptor-Nukleinsäuremolekül fungiert, weisen gemeinsam alle zum Spleißen notwendigen Bestandteile der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz wie zum Beispiel Spleißdonorstelle, Verzweigungsstelle und Spleißakzeptorstelle auf, wobei allerdings auch ein oder beide Nukleinsäuremoleküle jeweils allein alle diese Bestandteile aufweisen können. Das Donor- Nukleinsäuremolekül weist den 5 '-terminalen Teil der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz auf und das Akzeptor-Nukleinsäuremolekül weist den 3'-terminalen Teil der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz auf. Ferner umfasst das Donor-Nukleinsäuremolekül stromaufwärts zur 5'-Spleißstelle eine kodierende Nukleinsäuresequenz und das Akzeptor-Nukleinsäuremolekül umfasst stromabwärts zur 3'-Spleißstelle eine weitere kodierende Nukleinsäuresequenz. Nach erfolgreichem trans-Spleißen liegen diese beiden kodierenden Nukleinsäuresequenzen kombiniert auf einem Nukleinsäuremolekül vor, wobei die kodierende Nukleinsäuresequenz des Donor-Nukleinsäuremoleküls stromaufwärts zu der kodierenden Nukleinsäuresequenz des Akzeptor-Nukleinsäuremoleküls liegt. Die beiden Nukleinsäuremoleküle, die Substrat für eine trans-Spleißen sind, können vorzugsweise hybridisieren, wobei die Hybridisierung vorzugsweise durch eine bestimmte Nukleinsäuresequenz in den Nukleinsäuremolekülen vermittelt wird. Diese bestimmte Nukleinsäuresequenz kann innerhalb der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz liegen oder beim Donor-Nukleinsäuremolekül stromabwärts zu der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz bzw. beim Akzeptor-Nukleinsäuremolekül stromaufwärts zu der zu entfernenden Nukleinsäuresequenz liegen. Bei einem trans-Spleiß-Vorgang werden immer zwei Nukleinsäuremoleküle kombiniert, wobei aber ein Nukleinsäuremolekül gleichzeitig das Donor-Nukleinsäuremolekül eines trans-Spleiß- Vorgangs und das Akzeptor- Nukleinsäuremolekül eines anderen trans-Spleiß-Vorgangs sein kann. Dadurch können mehrere kodierende Nukleinsäuresequenzen durch mehrere trans-Spleiß-Vorgänge zu einem Nukleinsäuremolekül kombiniert werden."Trans-splicing" according to the invention relates to a splicing process in which the nucleic acid sequence to be removed relates to two nucleic acid sequences which are present on different nucleic acid molecules. In trans-splicing, the 5 'splice site or 5' splice region is located on a different nucleic acid molecule than the 3 'splice site or 3' splice region, with the "donor nucleic acid molecule encoding the 5 'splice site and a 5' splice region Otherwise, essentially what is explained here for splicing also applies analogously to trans-splicing: the two nucleic acid molecules which are the substrate of the trans-splicing process one acting as a donor nucleic acid molecule and the other as an acceptor nucleic acid molecule collectively comprises all necessary components for splicing the nucleic acid sequence to be removed, such as splice donor site, branching site and splice acceptor site, but one or both nucleic acid molecules each alone contain all of these components The donor Nucleic acid molecule has the 5 '-terminal part of the nucleic acid sequence to be removed and the acceptor nucleic acid molecule has the 3'-terminal part of the nucleic acid sequence to be removed. Further, the donor nucleic acid molecule comprises upstream of the 5 'splice site a coding nucleic acid sequence and the acceptor nucleic acid molecule comprises downstream of the 3' splice site a further encoding nucleic acid sequence. After successful trans-splicing, these two encoding nucleic acid sequences are combined on a nucleic acid molecule, wherein the encoding nucleic acid sequence of the donor nucleic acid molecule is upstream of the encoding nucleic acid sequence of the acceptor nucleic acid molecule. The two nucleic acid molecules which are substrate for trans-splicing may preferably hybridize, the hybridization preferably being mediated by a particular nucleic acid sequence in the nucleic acid molecules. This particular nucleic acid sequence may be within the nucleic acid sequence to be deleted or may be downstream of the nucleic acid sequence to be removed from the donor nucleic acid molecule or upstream of the nucleic acid sequence to be removed from the acceptor nucleic acid molecule. In a trans-splice process, two nucleic acid molecules are always combined, but one nucleic acid molecule can simultaneously be the donor nucleic acid molecule of a trans-splice process and the acceptor nucleic acid molecule of another trans-splice process. As a result, several coding nucleic acid sequences can be combined by several trans-splicing processes to form a nucleic acid molecule.
Der Begriff "Vektor" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediären Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B. ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder in eukaryotische Wirtszellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide oder Virusgenome. Der Begriff "Plasmid", wie hierin verwendet, betrifft allgemein ein Konstrukt von extrachromosomalem genetischem Material, gewöhnlich ein zirkuläres DNA-Duplex, das unabhängig von chromosomaler DNA replizieren kann.The term "vector" is used according to the invention in its most general meaning and includes any intermediate vehicle for a nucleic acid which it is e.g. enable the nucleic acid to be introduced into prokaryotic and / or eukaryotic host cells and optionally integrated into a genome. Such vectors are preferably replicated and / or expressed in the cell. Vectors include plasmids, phagemids or viral genomes. The term "plasmid" as used herein refers generally to a construct of extrachromosomal genetic material, usually a circular DNA duplex, which can replicate independently of chromosomal DNA.
Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, in die eine exogene Nukleinsäure zum Beispiel durch Transformation, Transfektion oder Mikroinjektion eingebracht werden kann. Der Begriff „Wirtszelle" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische (z.B. E. coli) oder eukaryontische Zellen (z.B. Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt sind Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Ratte, Hamster, Schwein, Ziege, Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele umfassen Keratinozyten, periphere Blutleukozyten, Stammzellen des Knochenmarks, embryonale Stammzellen, Oozyten, NK-T Zellen, Mastzellen, lymphoide dendritische Zellen, myeloide dendritische Zellen, Makrophagen, Mikroglia, Plasmazellen, Gedächtniszellen und Gallengangzellen. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer Ausführungsform in der Wirtszelle exprimiert.According to the invention, the term "host cell" relates to any cell into which an exogenous nucleic acid can be introduced by transformation, transfection or microinjection. The term "host cell" includes according to the invention prokaryotic (eg E. coli) or eukaryotic cells (eg yeast cells and insect cells). , Especially preferred are mammalian cells such as human, mouse, rat, hamster, pig, goat, primate cells. The cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells, embryonic stem cells, oocytes, NK-T cells, mast cells, lymphoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, macrophages, microglia, plasma cells, memory cells and bile duct cells. A nucleic acid may be present in the host cell in single or multiple copies and in one embodiment is expressed in the host cell.
Der Begriff „Transfektion" betrifft erfindungsgemäß das Einbringen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einen Organismus oder in eine Wirtszelle. Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um erfindungsgemäß Nukleinsäuren in Zellen in vitro oder in vivo einzubringen. Solche Verfahren umfassen die Transfektion von Nukleinsäure-CaPθ4- Präzipitaten, die Transfektion von Nukleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion oder Infektion mit Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, die Liposomen-vermittelte Transfektion und ähnliches. In bestimmten Ausführungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antikörper, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Falls eine Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endozytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörper gegen Proteine, die intemalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern, und ähnliches.The term "transfection" refers according to the invention the introduction of one or more nucleic acids in an organism or in a host cell Various methods can be used in order to introduce according to the invention nucleic acids into cells in vitro or in vivo, such methods comprise transfection of nucleic acid CaPθ. 4. - Precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with viruses carrying the nucleic acids of interest, liposome-mediated transfection, etc. In certain embodiments, control of the nucleic acid to particular cells is preferred For example, a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell (eg, a retrovirus or a liposome) may have a bound targeting molecule, for example, a molecule such as an antibody that targets a surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell are incorporated into or bound to the nucleic acid carrier. If administration of a nucleic acid by liposomes is desired, proteins that bind to a surface membrane protein associated with endocytosis may be incorporated into the liposome formulation to facilitate targeting and / or uptake. Such proteins include capsid proteins or fragments thereof that are specific for a particular cell type, antibodies to proteins that are intemalized, proteins that target an intracellular site, and the like.
Erfϊndungsgemäß können Nukleinsäuren stabil sowie nicht stabil, d.h. transiente, in eine Wirtszelle oder einen Organismus eingebracht werden. Stabiles Einbringen bedeutet, dass die eingebrachte Nukleinsäure in einer Zelle und/oder einem Organismus stabil verbleibt und insbesondere, dass selbst nach Vermehrung der Zelle oder des Organismus die Nukleinsäure an die Tochterzellen oder -Organismen stabil weitergegeben wird. Vorzugsweise wird bei einem stabilen Einbringen die eingebrachte Nukleinsäure in das Genom von Zellen, beispielsweise durch gezielte Rekombination, eingebaut.According to the invention, nucleic acids can be introduced into a host cell or an organism stably and not stably, ie transiently. Stable incorporation means that the introduced nucleic acid remains stable in a cell and / or an organism and, in particular, that even after proliferation of the cell or organism, the nucleic acid is stably transferred to the daughter cells or organisms. Preferably is at a stable introduction of the introduced nucleic acid into the genome of cells, for example by targeted recombination, incorporated.
Der Begriff "Peptid" betrifft Substanzen, die zwei oder mehr, vorzugsweise 3 oder mehr, vorzugsweise 4 oder mehr, vorzugsweise 6 oder mehr, vorzugsweise 8 oder mehr, vorzugsweise 10 oder mehr, vorzugsweise 13 oder mehr, vorzugsweise 16 oder mehr, vorzugsweise 20 oder mehr und bis zu vorzugsweise 50, vorzugsweise 100 oder vorzugsweise 150 aufeinander folgende Aminosäuren umfassen, die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Die Begriffe "Protein" und "Polypeptid" betreffen große Peptide, vorzugsweise Peptide mit mindestens 151 Aminosäuren, jedoch werden die Begriffe „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" hierin im Allgemeinen als Synonyme verwendet. Die Begriffe „Peptid", "Polypeptid" und „Protein" umfassen erfindungsgemäß Substanzen, die nicht nur Aminosäure-Bestandteile, sondern auch nicht- Aminosäure-Bestandteile wie Zucker und Phosphatstrukturen enthalten und umfassen auch Substanzen die Bindungen wie Ester-, Thioether- oder Disulfidbindungen enthalten.The term "peptide" refers to substances which are two or more, preferably 3 or more, preferably 4 or more, preferably 6 or more, preferably 8 or more, preferably 10 or more, preferably 13 or more, preferably 16 or more, preferably 20 or more and up to preferably 50, preferably 100 or preferably 150 consecutive amino acids joined together by peptide bonds. The terms "protein" and "polypeptide" refer to large peptides, preferably peptides having at least 151 amino acids, but the terms "peptide," "polypeptide," and "protein" are generally used herein as synonyms The terms "peptide," "polypeptide "and" protein "according to the invention comprise substances which contain not only amino acid constituents but also non-amino acid constituents such as sugars and phosphate structures and also comprise substances which contain bonds such as ester, thioether or disulfide bonds.
„Derivate" eines Proteins, Polypeptids oder Peptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure-Insertionsvarianten, Aminosäure-Deletionsvarianten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten."Derivatives" of a protein, polypeptide or peptide or an amino acid sequence for the purposes of this invention include amino acid insertion variants, amino acid deletion variants and / or amino acid substitution variants.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure- Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Peptiden nicht konserviert sind und/oder werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or multiple amino acids in a particular amino acid sequence. In amino acid sequence variants with an insertion, one or more amino acid residues are introduced into a predetermined site in an amino acid sequence, although random insertion with appropriate screening of the resulting product is also possible. Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence. Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. Preferably, the modifications are at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or peptides and / or amino acids are replaced by others with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, side chain volume, and the like (conservative substitution). conservative Substitutions, for example, refer to the replacement of one amino acid by another, listed below in the same group as the substituted amino acid:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: AIa, Ser, Thr (Pro, GIy)1. small aliphatic, non-polar or slightly polar radicals: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, GIu, GIn2. negatively charged residues and their amides: Asn, Asp, Glu, GIn
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys3. positively charged residues: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, He, VaI (Cys)4. large aliphatic, non-polar residues: Met, Leu, He, VaI (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.5. large aromatic residues: Phe, Tyr, Trp.
Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. GIy ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die die Kette stark einschränkt. Cys kann eine Disulfidbrücke bilden.Three residues are bracketed because of their special role in protein architecture. GIy is the only remainder without a side chain, giving the chain flexibility. Pro has an unusual geometry that severely limits the chain. Cys can form a disulfide bridge.
Die oben beschriebenen Aminosäure- Varianten können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch „Festphasensynthese" (Merrifield, 1964) und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulation hergestellt werden. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen und Peptiden mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.The amino acid variants described above can readily be synthesized by known peptide synthesis techniques such as e.g. The manipulation of DNA sequences for the production of proteins and peptides with substitutions, insertions or deletions is described, for example, in Sambrook et al. (1989), by "solid-phase synthesis" (Merrifield, 1964) and similar methods or by recombinant DNA manipulation. described in detail.
Vorzugsweise hat die Aminosäuresequenz eines Derivats eines Proteins, Polypeptids oder Peptids, die eine oder mehrere Aminosäure-Insertionen, -Deletionen oder -Substitutionen enthält, eine Identität zu der Aminosäuresequenz des Proteins, Polypeptids oder Peptids von 70% oder mehr, 75% oder mehr, 80% oder mehr, 85% oder mehr, 90% oder mehr, 95% oder mehr, 98% oder mehr oder 99% oder mehr über die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins, Polypeptids oder Peptids.Preferably, the amino acid sequence of a derivative of a protein, polypeptide or peptide containing one or more amino acid insertions, deletions or substitutions has an identity to the amino acid sequence of the protein, polypeptide or peptide of 70% or greater, 75% or greater, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or 99% or more of the entire amino acid sequence of the protein, polypeptide or peptide.
„Derivate" von Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Protein, Polypeptid oder Peptid assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Peptide. Ferner erstreckt sich der Begriff "Derivat" auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der Proteine, Polypeptide und Peptide und Substanzen, die nicht nur Aminosäure-Bestandteile, sondern auch nicht-Aminosäure-Bestandteile wie Zucker und Phosphatstrukturen enthalten und umfassen auch Substanzen die Bindungen wie Ester-, Thioether- oder Disulfidbindungen enthalten."Derivatives" of proteins, polypeptides or peptides according to the invention also include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules associated with the protein, polypeptide or peptide, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or peptides The term "derivative" also refers to all functional chemical equivalents of proteins, polypeptides and peptides and substances that include not only amino acid constituents but also non-amino acid constituents such as Sugar and phosphate structures also include and include substances that contain bonds such as ester, thioether or disulfide bonds.
Der Begriff "Rekombinase- Aktivität" betrifft erfindungsgemäß eine Aktivität, durch die DNA gespalten und neu verbunden werden kann (Rekombination). Beispielsweise kann in einer DNA ein Segment durch Rekombinase-Aktivität ausgeschnitten werden und die verbleibenden DNA-Teile können miteinander verbunden werden, ein Segment einer DNA kann in seiner Orientierung umgekehrt werden oder zwei DNA-Moleküle können gespalten und auf neue Weise wieder verbunden werden. Beispiele für eine durch Rekombinase- Aktivität erfolgte Rekombination von DNA ist die Exzision eines DNA-Segments, die Integration eines DNA-Segments, die Inversion eines DNA-Segments und die homologe Rekombination zweier DNA-Sequenzen.The term "recombinase activity" according to the invention relates to an activity by which DNA can be cleaved and reconnected (recombination). For example, in a DNA, a segment can be excised by recombinase activity and the remaining DNA parts joined together, a segment of DNA can be reversed in orientation, or two DNA molecules can be cleaved and reconnected in a new way. Examples of a recombination of DNA by recombinase activity is the excision of a DNA segment, the integration of a DNA segment, the inversion of a DNA segment and the homologous recombination of two DNA sequences.
Die Begriffe "Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität" und "Rekombinase " umfassen erfϊndungsgemäß natürlich vorkommende und rekombinant hergestellte Proteine oder Polypeptide, die die Rekombination einer DNA bewirken können. Vorzugsweise ist diese Rekombination sequenzspezifisch, d.h. zum Beispiel abhängig von Erkennungs- beziehungsweise Target-Sequenzen. Natürlich vorkommende Proteine umfassen Rekombinasen wie zum Beispiel Integrasen wie die Cre Rekombinase des Phagen Pl, die FIp Rekombinase von Saccharomyces cerevisiae und die Integrase des Streptomyces-Phagen PhiC31. Auch umfasst sind Varianten und Derivate dieser Polypeptide mit Rekombinase- Aktivität, die eine Rekombinase-Aktivität aufweisen. Varianten von Polypeptiden mit Rekombinase-Aktivität umfassen Spleißvarianten und posttranslational modifizierte Varianten der Polypeptide. Derivate von Polypeptiden mit Rekombinase-Aktivität umfassen insbesondere solche Derivate, in denen am aminoterminalen und/oder carboxyterminalen Ende des Polypeptids eine oder mehrere Aminosäuren deletiert sind, wie zum Beispiel Derivate, die nur aus der Aminosäuresequenz bestehen, die für die Rekombinase-Aktivität notwendig ist. Ferner umfasst sind Fusionsproteine von Polypeptiden mit Rekombinase- Aktivität, bei denen sich am aminoterminale und/oder carboxyterminale Ende des Polypeptids mindestens ein weiteres Polypeptid befindet. Polypeptide mit Rekombinase-Aktivität können zum Beispiel mit einem Polypeptid fusioniert sein, das den Transport des Polypeptids in den Zellkern eukaryotischer Zellen begünstigen kann, wie zum Beispiel ein Kernlokalisationssignal (NLS). Eine erfindungsgemäß bevorzugte Cre Rekombinase hat die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäuresequenz von SEQ ED NO: 12 oder einer dazu homologen Sequenz kodiert wird. Diese Nukleinsäuresequenz ist im Vergleich zur natürlichen kodierenden Nukleinsäuresequenz des Cre-Gens sequenzoptimiert.The terms "polypeptide having recombinase activity" and "recombinase" include, according to the invention, naturally occurring and recombinantly produced proteins or polypeptides which can effect the recombination of a DNA. Preferably, this recombination is sequence-specific, ie for example dependent on recognition or target sequences. Naturally occurring proteins include recombinases such as integrases such as Cre recombinase of phage Pl, Saccharomyces cerevisiae FIp recombinase and the integrase of Streptomyces phage PhiC31. Also included are variants and derivatives of these polypeptides having recombinase activity which have recombinase activity. Variants of polypeptides having recombinase activity include splice variants and post-translationally modified variants of the polypeptides. Derivatives of polypeptides having recombinase activity include in particular those derivatives in which one or more amino acids are deleted at the amino-terminal and / or carboxy-terminal end of the polypeptide, such as derivatives consisting only of the amino acid sequence necessary for recombinase activity , Also included are fusion proteins of polypeptides having recombinase activity in which at least one further polypeptide is located at the amino-terminal and / or carboxy-terminal end of the polypeptide. For example, polypeptides having recombinase activity may be fused to a polypeptide that may favor the transport of the polypeptide into the nucleus of eukaryotic cells, such as a nuclear localization signal (NLS). An inventively preferred Cre recombinase has the amino acid sequence which is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12 or a sequence homologous thereto. This nucleic acid sequence is sequence-optimized compared to the natural coding nucleic acid sequence of the Cre gene.
"Induzierbare Rekombinase" betrifft erfindungsgemäß eine Rekombinase, die bei Anwesenheit eines Induktionsmittels eine höhere Rekombinase- Aktivität in einer Zelle aufweist als in Abwesenheit des Induktionsmittels. Vorzugsweise weist eine induzierbare Rekombinase in Abwesenheit des Induktionsmittels eine Rekombinase- Aktivität von höchstens 20%, mehr bevorzugt höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 2%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% der Rekombinase-Aktivität auf, die sie in Anwesenheit des Induktionsmittels aufweist. Vorzugsweise weist eine induzierbare Rekombinase in Abwesenheit des Induktionsmittels keine nachweisbare Rekombinase-Aktivität auf. Ein Beispiel für eine induzierbare Rekombinase ist Cre-ERT2. Cre-ERT2 entspricht einer Cre Rekombinase ohne Kernimportsignalsequenz, an die carboxyterminal eine mutierte Ligandenbindungsdomäne eines Estrogenrezeptors fusioniert ist. Bei Bindung des Liganden 4-Hydroxytamoxiphen an die Ligandenbindungsdomäne werden HSP90 Proteine, die an die Ligandenbindungsdomäne binden, verdrängt, wodurch der Transport des Cre-ERT2 in den Zellkern ermöglicht wird. Eine weitere induzierbare Rekombinase ist zum Beispiel CrePRl, ein Fusionsprotein aus Cre und einer mutierten Hormon-bindenden Domäne des menschlichen Progesteronrezeptors, die nach Bindung von RU 486 eine Kernlokalisierung induziert (Kellendonk, C. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 1404-1411)."Inducible recombinase" according to the invention relates to a recombinase having a higher recombinase activity in a cell in the presence of an inducing agent than in the absence of the inducing agent. Preferably, in the absence of the inducing agent, an inducible recombinase has a recombinase activity of at most 20%, more preferably at most 10%, at most 5%, at most 2%, at most 1%, or at most 0.1% of the recombinase activity which it produces Having presence of the inducing agent. Preferably, an inducible recombinase in the absence of the inducing agent has no detectable recombinase activity. An example of an inducible recombinase is Cre-ERT2. Cre-ERT2 corresponds to a Cre recombinase without nuclear import signal sequence to which a mutated ligand binding domain of an estrogen receptor is fused carboxyterminally. Upon binding of the ligand 4-hydroxytamoxiphene to the ligand binding domain, HSP90 proteins that bind to the ligand binding domain are displaced, thereby allowing the transport of Cre-ERT2 into the cell nucleus. Another inducible recombinase is, for example, CrePR1, a fusion protein of Cre and a mutant hormone-binding domain of the human progesterone receptor which induces nuclear localization upon binding of RU 486 (Kellendonk, C. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 1404 -1411).
Eine "Erkennungssequenz für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität" oder "Target- Sequenz für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität" betrifft erfindungsgemäß eine Nukleinsäuresequenz, die spezifisch von dem Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität erkannt werden kann. Vorzugsweise kann eine DNA-Sequenz, die von zwei Erkennungssequenzen für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität flankiert ist, durch das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität entfernt oder invertiert werden. Die Erkennungssequenz der Cre Rekombinase ist eine loxP Stelle oder eine Variante davon wie zum Beispiel Iox511, Iox2272, Iox5171 oder ähnliche. Die loxP Stelle hat vorzugsweise die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 9 bzw. 10 oder eine dazu homologe Sequenz. Ein von zwei loxP Stellen flankierter DNA-Bereich kann durch ein Polypeptid mit Cre Rekombinase-Aktivität ausgeschnitten werden, wenn die beiden loxP Stellen die selbe Orientierung auf der DNA haben, oder invertiert werden, wenn die beiden loxP Stellen eine entgegen gesetzte Orientierung auf der DNA haben. Die Erkennungssequenz der FIp Rekombinase ist eine fit Stelle. Die Rekombination zwischen zwei fit Stellen läuft analog zu der Rekombination zwischen zwei loxP Stellen wie vorstehend beschrieben ab.A "recognition sequence for a polypeptide having recombinase activity" or "target sequence for a polypeptide having recombinase activity" according to the invention relates to a nucleic acid sequence which can be specifically recognized by the polypeptide having recombinase activity. Preferably, a DNA sequence flanked by two recognition sequences for a polypeptide having recombinase activity can be removed or inverted by the polypeptide having recombinase activity. The recognition sequence of the Cre recombinase is a loxP site or a variant thereof such as iox511, iox2272, iox5171 or the like. The loxP site preferably has the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10 or a sequence homologous thereto. A DNA region flanked by two loxP sites may be excised by a polypeptide having Cre recombinase activity if the two loxP sites have the same orientation on the DNA, or inverted if the two loxP sites have an opposite orientation on the DNA Have DNA. The recognition sequence of FIp recombinase is a fit site. The recombination between two fit sites proceeds analogously to the recombination between two loxP sites as described above.
Der Begriff "Organismus" umfasst erfindungsgemäß eukaryotische und prokaryotische Organismen und betrifft vorzugsweise eukaryotische Organismen. Mehr bevorzugt sind mehrzellige Organismen, vorzugsweise Planzen und Tiere, mehr bevorzugt Wirbeltiere, am meisten bevorzugt Säuger. Bevorzugte Beispiele für Organismen sind der Mensch, Nagetiere wie Mäuse und Ratten, Affen wie Primaten, Zebrafische, Fruchtfliegen wie Dorsophila melanogaster, und Frösche wie Xenopus laevis. In bestimmten Ausfuhrungsformen umfasst der Begriff "Organismus" keine Menschen.The term "organism" includes according to the invention eukaryotic and prokaryotic organisms and preferably relates to eukaryotic organisms. More preferred are multicellular organisms, preferably plants and animals, more preferably vertebrates, most preferably mammals. Preferred examples of organisms are humans, rodents such as mice and rats, monkeys such as primates, zebrafish, fruit flies such as Dorsophila melanogaster, and frogs such as Xenopus laevis. In certain embodiments, the term "organism" does not include humans.
Der Begriff "Gewebe" betrifft erfindungsgemäß ein jegliches Gewebe innerhalb eines Organismus. Vorzugsweise ist ein Gewebe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus epithelialem Gewebe einschließlich Haut, Lunge und Leber, Bindegewebe, zentralem und peripherem Nervensystem einschließlich des autonomen Nervensystems und der Sinnesrezeptoren, glatter und gestreifter Muskulatur, Myokard, und hämatopoetischem System einschließlich des Immunsystems.The term "tissue" according to the invention relates to any tissue within an organism. Preferably, a tissue is selected from the group consisting of epithelial tissue including skin, lung and liver, connective tissue, central and peripheral nervous system including the autonomic nervous system and the sensory receptors, smooth and striped musculature, myocardium, and hematopoietic system including the immune system.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Abbildungen und Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die ebenfalls erfindungsgemäß umfasst sind.The present invention will be described in detail by the following figures and examples, which are given by way of illustration only and not by way of limitation. On the basis of the description and the examples, further embodiments are accessible to the person skilled in the art, which are likewise included according to the invention.
Abbildungenpictures
Abb. 1 : Trans-Spleißen von CreFig. 1: Trans-splicing of Cre
Der ORF der Cre Rekombinase wurde durch die Einbringung eines künstlichen Introns geteilt, so dass er zwei Exons erhielt. Anschließend wurden die Cre-Exons in separate Expressionsvektoren kloniert und Hybridisierungregionen an die offenen Intron-Enden kloniert. Diese Hybridisierungsdomänen ermöglichen das trans-Spleißen, da für die Spleiß- Maschinerie es egal ist, ob es sich bei der Intron-Exon Struktur um ein Molekül handelt oder über zwei durch eine Hybridisierung verbundene Moleküle. Nach dem Spleißen wird die normale Cre-mRNA ausgeprägt. Abb. 2: Trans-Spleißen von Cre für Knockouts in Zell-SubpopulationenThe ORF of Cre recombinase was divided by the introduction of an artificial intron so that it received two exons. Subsequently, the Cre exons were cloned into separate expression vectors and hybridization regions were cloned to the open intron ends. These hybridization domains enable trans-splicing because the splicing machinery does not care if the intron-exon structure is one molecule or two molecules linked by hybridization. After splicing, normal Cre mRNA is expressed. Fig. 2: Trans-splicing of Cre for knockouts in cell subpopulations
(A) Die zwei Cre-Exons werden unter Kontrolle von zwei Promotoren in zwei separaten transgenen Linien ausgeprägt. Durch Zusammenkreuzen finden sich beide pre-mRNAs in der Zellpopulation, die durch gleichzeitige Expression beider Transgene gekennzeichnet ist. In diesen Zellen wird durch trans-Spleißen die funktionelle mRNA von Cre und folglich auch das Protein der Rekombinase hergestellt.(A) The two Cre exons are expressed under control of two promoters in two separate transgenic lines. By cross-breeding, both pre-mRNAs are found in the cell population characterized by simultaneous expression of both transgenes. In these cells, the functional mRNA of Cre and consequently also the protein of the recombinase is produced by trans-splicing.
(B) Nach Zusammenkreuzen der beiden Cre-Transgene mit einem loxP-flankierten Allel wird dieses Allel nur in der Zellpopulation mit Transkription beider Cre-Hälften deletiert. Der Knockout ist also beschränkt auf eine Zellpopulation, die durch zwei Promotoren charakterisiert ist.(B) After crossing the two cre-transgenes with a loxP-flanked allele, this allele is deleted only in the cell population with transcription of both cre-halves. The knockout is thus limited to a cell population characterized by two promoters.
Abb. 3: CV1.5B AssayFig. 3: CV1.5B assay
Dieser Assay nutzt eine Zelllinie (CVl)5 in die ein ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) eingebracht wurde, dessen Expression von einem konstitutiven Promoter getrieben ist. Allerdings kann lacZ nur nach der Entfernung einer loxP-flankierten Stopp-Kassette ausgeprägt werden. Die lacZ-Expression wird durch einen Lumineszenz-Assay (Roche) detektiert und gilt als Maß für die Anzahl an Zellen, die in einer Probe rekombiniert haben.This assay utilizes a cell line (CVI) 5 into which a β-galactosidase gene (lacZ) has been introduced, the expression of which is driven by a constitutive promoter. However, lacZ can only be expressed after the removal of a loxP-flanked stop cassette. LacZ expression is detected by a luminescence assay (Roche) and is a measure of the number of cells that have recombined in a sample.
Abb. 4: Cre trans-Spleiß-KonstrukteFig. 4: Cre trans-splice constructs
Dargestellt sind zwei trans-Spleiß-Kombinationen der Cre-Rekombinase. Die Expression wird durch einen Promoter der Phosphoglyceratkinase ermöglicht (5 '-terminal zu den Pmel Schnittstellen). Exon 1 ist immer in Schwarz und Exon 2 schraffiert dargestellt. Das Intron ist grau und die Hybridisierungsdomänen hellgrau. Do steht für Donor (Exon 1 mit Spleißdonorstelle) und Acc steht für Akzeptor (Exon 2 mit Spleißakzeptorstelle).Shown are two trans-splicing combinations of Cre recombinase. The expression is made possible by a promoter of the phosphoglycerate kinase (5 '-terminal to the Pmel interfaces). Exon 1 is always shown in black and exon 2 in hatched form. The intron is gray and the hybridization domains light gray. Do stands for donor (exon 1 with splice donor site) and Acc stands for acceptor (exon 2 with splice acceptor site).
Abb. 5 und 6: ß-Galaktosidase ExperimenteFig. 5 and 6: ß-galactosidase experiments
Analyse der Rekombinationseffizienz der unterschiedlichen Cre cis-Spleiß-Plasmide und Kombination der trans-Spleiß-Plasmide im CV1.5B Reporter- AssayAnalysis of the recombination efficiency of the different cerebellar splice plasmids and combination of the trans splice plasmids in the CV1.5B reporter assay
Verschiedene Konstrukte wurden im CV1.5B Assay getestet. Die Aktivität der verschiedenen Cre-Rekombinasen wurden auf pGKCrebpA (Plasmid mit Cre ohne Intron) normalisiert (=100%). Die cis-Spleiß-Konstrukte enthalten Exon 1 und Exon 2 auf einem Plasmid, die trans-Spleiß-Konstrukte enthalten die Exons auf separaten Konstrukten. Die Exons DoI, Accl, Do2 und Acc2 haben die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3 beziehungsweise 4. Die Proben, in denen die Zellen nur mit einem trans-Spleiß- Vektor transfiziert wurden, zeigten nur Hintergrundlumineszenz.Various constructs were tested in the CV1.5B assay. The activity of the various Cre recombinases were normalized to pGKCrebpA (plasmid with Cre without intron) (= 100%). The cis-splice constructs contain exon 1 and exon 2 on a plasmid, the trans-splice constructs contain the exons on separate constructs. The exons DoI, AccI, Do2 and Acc2 have the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 and 4. The samples in which the cells were transfected only with a trans-splice vector showed only background luminescence.
Abb. 7: Analyse der Rekombinationseffizienz in T-Zellen einer EGFP Reporter-MausFig. 7: Analysis of recombination efficiency in T cells of an EGFP reporter mouse
T-Zellen aus Maus wurden mit verschiedenen Cre trans-Spleiß-Konstruktpaaren transfiziert. Bei Vorliegen einer funktionsfähigen Cre Rekombinase wurde eine Stopp-Kassette in einem EGFP-Gen ausgeschnitten und es kam zur Expression von EGFP. Der Prozentsatz an EGFP- positiven Zellen ist dargestellt. Als Kontrollen wurde das Plasmid pGKCrebpA (Plasmid mit Cre ohne Intron) und Einfachtransfektionen der einzelnen Cre-Exons eingesetzt.Mouse T cells were transfected with different cre trans-splice construct pairs. In the presence of a functional Cre recombinase, a stop cassette in an EGFP gene was excised and EGFP expressed. The percentage of EGFP positive cells is shown. The controls used were the plasmid pGKCrebpA (plasmid with Cre without intron) and single transfections of the individual Cre exons.
Abb. 8: Analyse der Rekombinationseffizienz in Raw-EGFP-RezeptorzellenFig. 8: Analysis of recombination efficiency in crude EGFP receptor cells
Cre trans-Spleiß-Konstruktpaare wurden zusammen mit einem Plasmid für eine RFP (red fluorescent protein)-Variante (pDsRed) in Raw-EGFP-Rezeptorzellen transfiziert. Als Kontrollen wurde entweder ein Cre cis-Spleiß-Konstrukt, ein Volllängen-Cre-Konstrukt (pGKCrebpA) oder nur pDsRed transfiziert. Bei Vorliegen einer funktionsfähigen Cre Rekombinase kommt es zum Ausschneiden einer Stopp-Kassette in dem EGFP-Gen der Zellen und somit zur Expression von EGFP. Gezeigt ist der Prozentsatz von Zellen, der EGFP expremiert.Cre trans-splice construct pairs were transfected into RAW EGFP receptor cells along with a plasmid for a red fluorescent protein (RFP) variant (pDsRed). As controls, either a cre cis splice construct, a full length Cre construct (pGKCrebpA) or only pDsRed was transfected. In the presence of a functional Cre recombinase results in the excision of a stop cassette in the EGFP gene of the cells and thus for the expression of EGFP. Shown is the percentage of cells expressing EGFP.
BeispieleExamples
Beispiel 1 : Herstellung von trans-Spleiß- Vektoren von CreExample 1: Preparation of trans-splice vectors from Cre
Um die Effizienz des trans-Spleißens von Cre zu untersuchen, wurden mehrere trans-Spleiß- Vektorpaare hergestellt, wobei jeder Vektor jeweils einen Teil einer für Cre kodierenden Nukleinsäuresequenz enthält und ein Vektorpaar insgesamt die gesamte für Cre kodierende Nukleinsäuresequenz aufweist. Alle Vektoren enthalten einen Phosphoglyceratkinase- Promotor. Die Cre-Donor- Vektoren enthalten in 5'— >-3' Richtung der Transkription einen 5'- terminalen Teil der für Cre kodierenden Nukleinsäuresequenz (z.B. SEQ ID NO: 1 oder 3), einen 5'-terminalen Teil eines Introns (5'-Intron, z.B. SEQ ID NO: 5), und eine Nukleinsäuresequenz, die als Hybridisierungsregion in dem abgeleiteten Transkript fungiert (Bindedomäne, z.B. SEQ E) NO: 7). Die Cre-Akzeptor- Vektoren enthalten in 5'→3' Richtung der Transkription eine Nukleinsäuresequenz, die als Hybridisierungsregion in dem abgeleiteten Transkript fungiert (Bindedomäne, z.B. SEQ ID NO: 8), einen 3'-terminalen Teil eines Introns (3'-Intron, z.B. SEQ BD NO: 6), einen 3'-terminalen Teil der für Cre kodierenden Nukleinsäuresequenz (z.B. SEQ ID NO: 2 oder 4), und ein Polyadenylierungssignal des Wachstumshormons aus Rind (z.B. SEQ ID NO: 13) (Abb. 4). Dabei bilden die Vektoren, die die Sequenzen der SEQ ED NO: 1 und 2 enthalten, und die Vektoren, die die Sequenzen der SEQ ID NO: 3 und 4 enthalten, jeweils ein trans-Spleiß-Vektorpaar. Diese Vektoren werden pGKCreDol (enthält SEQ ID NO: 1), pGKCreDo2 (enthält SEQ ID NO: 3), pGKCreAccl (enthält SEQ ID NO: 2) und pGKCreAcc2 (enthält SEQ ID NO: 4) bezeichnet.To study the efficiency of Cre trans-splicing, several trans-splice vector pairs were prepared, each vector containing a portion of a Cre-encoding nucleic acid sequence and a pair of vectors comprising the entire Cre-encoding nucleic acid sequence. All vectors contain a phosphoglycerate kinase promoter. The cre-donor vectors contain in 5'-> -3 'direction of transcription a 5'-terminal part of the Cre coding nucleic acid sequence (eg SEQ ID NO: 1 or 3), a 5'-terminal part of an intron (5 'Intron, eg SEQ ID NO: 5), and a nucleic acid sequence which functions as a hybridization region in the deduced transcript (binding domain, eg SEQ E) NO: 7). The cre acceptor vectors contain in 5 '→ 3' direction of transcription a nucleic acid sequence which functions as a hybridization region in the deduced transcript (binding domain, eg SEQ ID NO: 8), a 3'-terminal part an intron (3'-intron, eg, SEQ ID NO: 6), a 3'-terminal part of the Cre-encoding nucleic acid sequence (eg, SEQ ID NO: 2 or 4), and a bovine growth hormone polyadenylation signal (eg, SEQ ID NO : 13) (Fig. 4). The vectors containing the sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 and the vectors containing the sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 each form a trans-splice vector pair. These vectors are called pGKCreDol (contains SEQ ID NO: 1), pGKCreDo2 (contains SEQ ID NO: 3), pGKCreAccl (contains SEQ ID NO: 2) and pGKCreAcc2 (contains SEQ ID NO: 4).
Als Kontrollvektoren wurde ein Vektor mit der vollständigen für Cre kodierenden Sequenz ohne Introns (pGK-CrebpA) und zwei Vektoren, die jeweils die vollständige für Cre kodierende Sequenz mit einem in dieser Sequenz liegenden Intron enthalten, (pGKCreDol+Accl und pGKCreDo2+Acc2) hergestellt.As control vectors, a vector was generated with the complete Cre coding sequence without introns (pGK-CrebpA) and two vectors each containing the complete Cre coding sequence with an intron lying in this sequence (pGKCreDol + Accl and pGKCreDo2 + Acc2) ,
Beispiel 2: CVl.5B AssayExample 2: CVI.5B Assay
Zum Testen der Rekombinase- Aktivität verschiedener Konstrukte wurde der CVl .5B Assay verwendet. CV1.5B Zellen sind Fibroblastenzellen aus der Niere einer grünen Meerkatze {Cercopithecus aethiops), in die stabil ein Vektor integriert wurde, der den offenen Leserahmen der ß-Galaktosidase aus Escherichia coli enthält. Zwischen dem Promotor und der kodierenden Sequenz der ß-Galaktosidase ist ein Neomycin-Resistenzgen flankiert von zwei loxP Stellen (Stopp-Kassette) eingebaut, so dass die ß-Galaktosidase nur exprimiert werden kann, wenn das Neomycin-Resistenzgen mittels Cre Rekombinase- Aktivität ausgeschnitten wird. Zellen, in denen eine Cre Rekombinase-Aktivität vorliegt, färben sich nach Zugabe von X-GaI blau (Kellendonk, C. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 1404- 1411) (Abb. 3).To test the recombinase activity of various constructs, the CVI .5B assay was used. CV1.5B cells are fibroblast cells derived from the kidney of a green monkey {Cercopithecus aethiops), into which a vector containing the open reading frame of Escherichia coli β-galactosidase has been stably integrated. Between the promoter and the coding sequence of β-galactosidase, a neomycin resistance gene flanked by two loxP sites (stop cassette) is incorporated so that the β-galactosidase can only be expressed when the neomycin resistance gene is excised by Cre recombinase activity becomes. Cells in which Cre recombinase activity is present become blue upon addition of X-GaI (Kellendonk, C. et al. (1996) Nucleic Acids Research 24, 1404-1411) (Figure 3).
Beim CVl .5B Assay wurden CVl .5B Zellen in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) mit 10% FCS (fetal calf serum) und Ix Glutamin bei 10% CO2 aufgetaut und mit PBS gewaschen. Nach Trypsinierung wurden die Zellen gezählt und zentrifugiert. 5000 Zellen pro Well einer 96 Well-Platte in je 100 μl wurden über Nacht wachsen gelassen, das Medium wurde abgesaugt und 100 μl DMEM mit Penicillin und Streptomycin aber ohne FCS wurden zugegeben. 5 μl einer Transfektionslösung aus FuGene Transfektionsreagenz (Roche, Basel, Schweiz) und der zu transfizierenden DNA wurden zugegeben und es wurde über Nacht inkubiert. Die Transfektionslösung mit FuGene und DNA wurde durch Mischen von 96 μl DMEM und 6 μl FuGene, Mischen dieser Lösung mit 1 μg Testplasmid (cis-Spleißkonstrukt oder Kombination aus trans-Spleißkonstrukten) und 0,5 μg Luciferase-Plasmid und Inkubieren für 15 bis 30 min hergestellt.CVl .5B cells were thawed in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) with 10% FCS (fetal calf serum) and Ix-glutamine at 10% CO 2 and washed with PBS. After trypsinization, the cells were counted and centrifuged. 5000 cells per well of a 96 well plate in 100 μl each were grown overnight, the medium was aspirated and 100 μl DMEM with penicillin and streptomycin but without FCS were added. 5 μl of a transfection solution of FuGene transfection reagent (Roche, Basel, Switzerland) and the DNA to be transfected were added and incubated overnight. The transfection solution with FuGene and DNA was prepared by mixing 96 μl DMEM and 6 μl FuGene, mixing this solution with 1 μg test plasmid (cis splice construct or combination of trans splice constructs) and 0.5 μg luciferase plasmid and incubate for 15 to 30 min produced.
Nach der Transfektion wurde das Medium mit Vollmedium (DMEM mit 10% FCS und Ix Glutamin) ersetzt und die Zellen wurden bei 370C und 5% CO2 kultiviert. Nach 4, 5, und 6 Tagen wurde die ß-Galaktosidase- Aktivität als Maß für die Exzision der Stopp-Kassette relativ zur Luciferase- Aktivität als Transfektionskontrolle ausgewertet. Dazu wurden 60 μl einer 1 :4 Verdünnung des reporter gene assay lysis buffer (Roche, Basel, Schweiz) in Wasser zu den Zellen gegeben und für 5 min auf Eis inkubiert.After transfection, the medium was replaced with complete medium (DMEM with 10% FCS and Ix glutamine) and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . After 4, 5, and 6 days, β-galactosidase activity was evaluated as a measure of excision of the stop cassette relative to luciferase activity as a transfection control. For this purpose, 60 μl of a 1: 4 dilution of the reporter gene assay lysis buffer (Roche, Basel, Switzerland) in water were added to the cells and incubated on ice for 5 min.
Zur Analyse der Rekombination wurde die ß-Galaktosidase- Aktivität mittels des Kits beta- GaI Reporter Gene Assay (chemiluminescent) (Roche) bestimmt. Luminescence wurde in einem Luminometer (Wallac) bestimmt. Die Werte wurden in Triplikaten erhoben und der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet, nachdem mittels Luciferase Aktivität (Luciferase Reportergen- Assay (Roche)) normalisiert wurde.For the analysis of the recombination, the β-galactosidase activity was determined by means of the kit beta-GaI reporter gene assay (chemiluminescent) (Roche). Luminescence was determined in a luminometer (Wallac). The values were collected in triplicates and the mean and standard deviation calculated after normalizing by luciferase activity (luciferase reporter gene assay (Roche)).
Abb. 5 zeigt Mittelwerte der Triplikate +/- Standardabweichung, angegeben als Prozent des für das Kontroll-Plasmid (pGKCrebpA) an Tag 5 erhaltenen Werts (offene Balken: Tag4; gestreifte Balken: Tag5; gefüllte Balken: Tag6). Abb. 6 zeigt ebenfalls Mittelwerte der Triplikate +/- Standardabweichung, angegeben als Prozent des für das Kontroll-Plasmid (pGKCrebpA) erhaltenen Werts. Zur Kontrolle wurden die trans-Spleiß-Konstrukte jeweils einzeln transfiziert (Kontra llen).Beispiel 3: T-Zell-AssayFig. 5 shows triplicates mean +/- standard deviation, expressed as a percentage of the value obtained for the control plasmid (pGKCrebpA) on day 5 (open bars: day 4, striped bars: day 5, bars filled: day 6). Figure 6 also shows triplicate +/- standard deviation means expressed as a percentage of the value obtained for the control plasmid (pGKCrebpA). For control, the trans-splice constructs were individually transfected (contraindicated). Example 3: T cell assay
Milz und Lymphknotenzellen einer RAGE-GFP Reportermaus (Constien, R. et al. (2001) Genesis 30, 36-44) wurden präpariert. T Zellen wurden über MACS (Miltenyi Biotech) mit CD4 und CD8 beads angereichert. Je 3x106 T-Zellen wurden mit dem AMAXA mouse T cell transfection kit im Nucleofector mit je 1 μg DNA der eingesetzten Konstrukte transfiziert. Als Konstrukte wurden verwendet: pGK-CrebpA, pGKCreDol, pGKCreDo2, pGKCreAccl, und pGKCreAcc2. Als Kontrolle für die Transfektionseffizienz wurde das GFP Plasmid von AMAXA (mitgeliefert im Kit) verwendet. Die Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS, Ix Glutamin, Ix Penicillin/Streptomycin für 5 Tage gehalten und anschließend in einem Durchflusszytometer (Beckton Dickenson, FACSCantoü) analysiert. In Abb. 7 sind die Prozentzahlen der GFP-positiven Zellen in einem Lymphozytengate gezeigt.Spleen and lymph node cells of a RAGE-GFP reporter mouse (Constien, R. et al. (2001) Genesis 30, 36-44) were prepared. T cells were enriched with CD4 and CD8 beads via MACS (Miltenyi Biotech). 3 × 10 6 T cells each were transfected with the AMAXA mouse T cell transfection kit in the nucleofector with 1 μg DNA each of the constructs used. Constructs used were: pGK-CrebpA, pGKCreDol, pGKCreDo2, pGKCreAccl, and pGKCreAcc2. As a control for transfection efficiency, the GFP plasmid was used by AMAXA (supplied in the kit). The cells were maintained in RPMI 1640 with 10% FCS, Ix glutamine, Ix penicillin / streptomycin for 5 days and then in one Flow cytometer (Beckton Dickenson, FACSCantoü) analyzed. Figure 7 shows the percentages of GFP-positive cells in a lymphocyte gate.
Beispiel 4: RA W-EGFP- AssayExample 4: RA W EGFP Assay
Raw309 EGFP Reporterzellen wurden wie folgt als stabile Zelllinie generiert: Raw309 Zellen wurden mit einem CAG-flox-STOP-flox-EGFP-Konstrukt (CAG: chicken actin globulin reporter), welches eine Neomycin-Selektionskassette enthält, elektroporiert. Stabile Klone wurden nach Neomycin-Selektion durch Limiting Dilution erzielt und per PCR auf die Integration der gewünschten Sequenz getestet. Die Rekombinationseffizienz der Konstrukte wurde durch Doppel- bzw. Tripel-Transfektionen der Raw-EGFP-Reporterzellen mit pDsRedExpress zusammen mit pGKCrebpA oder eis- oder trans-Spleiß-Konstrukten untersucht. In Kontrollen, die nur pDsRed erhielten, oder bei Einzel-Transfektionen der trans- Spleiß-Partner wurden keine EGFP-positiven Zellen beobachtet. In Abb. 8 ist der Anteil von EGFP-positiven Zellen an DsRed-positiven Zellen in Prozent gezeigt. Verwendete Plasmide waren pGKCrebpA (Cre ohne Intron), pGKCreDo+Acc (cis-Spleiß-Konstrukte, Cre mit Intron), und Paare von pGKCreDo und pGKCreAcc trans-Spleiß-Konstrukten. Raw309 EGFP reporter cells were generated as a stable cell line as follows: Raw309 cells were electroporated with a CAG-flox-STOP-flox-EGFP construct (CAG: chicken actin globulin reporter) containing a neomycin selection cassette. Stable clones were obtained after neomycin selection by limiting dilution and tested by PCR for the integration of the desired sequence. The recombination efficiency of the constructs was examined by double or triple transfections of the crude EGFP reporter cells with pDsRedExpress together with pGKCrebpA or cis or trans splice constructs. In controls that received only pDsRed, or in single transfections of the trans-splice partners, no EGFP-positive cells were observed. Fig. 8 shows the percentage of EGFP positive cells on DsRed positive cells. Plasmids used were pGKCrebpA (Cre without intron), pGKCreDo + Acc (cis-splice constructs, Cre with intron), and pairs of pGKCreDo and pGKCreAcc trans-splice constructs.

Claims

Patentansprüche claims
1. Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst:A nucleic acid comprising in functional association a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 51- oder 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 1 or 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '→3' -Richtung der Transkription umfasst:2. Nucleic acid according to claim 1, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '→3' -Richtung der Transkription umfasst:3. Nucleic acid according to claim 1, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht. (c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity.
4. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '-→3 '-Richtung der Transkription umfasst:4. A nucleic acid according to claim 1, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
5. Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, wobei das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig ist, zusammen mitThe nucleic acid of claim 2, wherein the transcript derived from the nucleic acid is capable, together with
(i) einem von der Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 abgeleiteten Transkript und(i) a transcript derived from the nucleic acid according to claim 3 and
(ii) gegebenenfalls einem von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 abgeleiteten(ii) optionally one derived from a nucleic acid according to claim 4
Transkript oder mehreren von mehreren Nukleinsäuren gemäß Anspruch 4 abgeleitetenTranscript or more of several nucleic acids derived according to claim 4
Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert.Transcripts as a substrate undergo a trans-splicing reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
6. Nukleinsäure gemäß Anspruch 3, wobei das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig ist, zusammen mitA nucleic acid according to claim 3, wherein the transcript derived from the nucleic acid is capable, together with
(i) einem von der Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 abgeleiteten Transkript und(i) a transcript derived from the nucleic acid according to claim 2 and
(ii) gegebenenfalls einem von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 abgeleiteten(ii) optionally one derived from a nucleic acid according to claim 4
Transkript oder mehreren von mehreren Nukleinsäuren gemäß Anspruch 4 abgeleitetenTranscript or more of several nucleic acids derived according to claim 4
Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert. Transcripts as a substrate undergo a trans-splicing reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
7. Nukleinsäure gemäß Anspruch 4, wobei das von der Nukleinsäure abgeleitete Transkript fähig ist, zusammen mitA nucleic acid according to claim 4, wherein the nucleic acid derived transcript is capable, together with
(i) einem von der Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 abgeleiteten Transkript,(i) a transcript derived from the nucleic acid according to claim 2,
(ii) einem von der Nukleinsäure gemäß Anspruch 3 abgeleiteten Transkript und(ii) a transcript derived from the nucleic acid according to claim 3 and
(iii) gegebenenfalls einem weiteren von einer anderen Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 abgeleiteten Transkript oder mehreren weiteren von mehreren anderen Nukleinsäuren gemäß(iii) optionally a further transcript derived from another nucleic acid according to claim 4 or several further of several other nucleic acids according to
Anspruch 4 abgeleiteten Transkripten als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert.Claim 4 derived transcripts as a substrate to undergo a trans-splicing reaction to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
8. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte miteinander mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, hybridisieren können.A nucleic acid according to any one of claims 5 to 7, wherein the transcripts derived from the nucleic acids are capable of hybridizing with each other by means of the nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
9. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz nicht für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert.A nucleic acid according to any one of claims 1 to 8, wherein the portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity does not encode a polypeptide having recombinase activity.
10. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Expression der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz kein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität bildet.10. Nucleic acid according to one of claims 1 to 9, wherein an expression of the transcribable nucleic acid sequence does not form a polypeptide having recombinase activity.
11. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Promotor ein gewebs- oder zellspezifischer Promotor ist.11. A nucleic acid according to any one of claims 1 to 10, wherein the promoter is a tissue or cell specific promoter.
12. Nukleinsäure gemäß Anspruch 11, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus epithelialem Gewebe einschließlich Haut, Lunge und Leber, Bindegewebe, zentralem und peripherem Nervensystem einschließlich des autonomen Nervensystems und der Sinnesrezeptoren, glatter und gestreifter Muskulatur, Myokard, hämatopoetischem System einschließlich des Immunsystems, und Kombinationen davon.The nucleic acid of claim 11, wherein the tissue is selected from the group consisting of epithelial tissue including skin, lung and liver, connective tissue, central and peripheral nervous system including the autonomic nervous system and sensory receptors, smooth and striped musculature, myocardium, hematopoietic system including the immune system, and combinations thereof.
13. Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 , wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NK-T Zellen, Mastzellen, lymphoide dendritische Zellen, myeloide dendritische Zellen, Makrophagen, Mikroglia, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Gallengangzellen und Kombinationen davon.The nucleic acid of claim 11, wherein the cell is selected from the group consisting of NK-T cells, mast cells, lymphoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, macrophages, microglia, plasma cells, memory cells, bile duct cells, and combinations thereof.
14. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NKl.1 Promoter, CDδalpha Promoter, CDlIc Promoter, CDl Ib Promoter, Lysozym M Promoter, CD 19 Promoter, Syndecan-1 Promoter, Kl 9 Promoter und Albumin Promoter.14. Nucleic acid according to one of claims 1 to 11, wherein the promoter is selected from the group consisting of NKl.1 promoter, CDδalpha promoter, CDlIc promoter, CDI Ib promoter, lysozyme M promoter, CD 19 promoter, Syndecan-1 promoter, Kl 9 promoter and albumin promoter.
15. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Rekombinase Cre Rekombinase ist.15. A nucleic acid according to any one of claims 1 to 14, wherein the recombinase is Cre recombinase.
16. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Rekombinase eine induzierbare Rekombinase ist.16. Nucleic acid according to one of claims 1 to 14, wherein the recombinase is an inducible recombinase.
17. Nukleinsäure gemäß Anspruch 16, wobei die induzierbare Rekombinase Cre-ERT2 ist.The nucleic acid of claim 16, wherein the inducible recombinase is Cre-ERT2.
18. Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, wobei die Nukleinsäuresequenz, die einem 5'- terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder 3 umfasst.18. The nucleic acid according to claim 2, wherein the nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
19. Nukleinsäure gemäß Anspruch 3, wobei die Nukleinsäuresequenz, die einem 3'- terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst.The nucleic acid of claim 3, wherein the nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
20. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz ein Intron oder einen Teil davon umfasst, wobei das Intron oder der Teil davon die Nukleinsäuresequenz umfasst, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- oder 3'-Spleißregion zu fungieren.20. Nucleic acid according to one of claims 1 to 19, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises an intron or a part thereof, wherein the intron or the part thereof comprises the nucleic acid sequence which has the ability in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence as 5 '. or 3 'splice region.
21. Nukleinsäure gemäß Anspruch 20, wobei das Intron ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus humanem VEGF Intron, CD40L Intron 1, Kaninchen beta-Globin Intron 2, Maus Prml Intron, SV40 T- Antigen Intron, IgM C1-C2 Intron und IgE Intron. The nucleic acid of claim 20, wherein the intron is selected from the group consisting of human VEGF intron, CD40L intron 1, rabbit beta globin intron 2, mouse prml intron, SV40 T antigen intron, IgM C1-C2 intron and IgE intron.
22. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, eine Spleißdonorstelle umfasst.The nucleic acid of any one of claims 1 to 21, wherein the nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises a splice donor site.
23. Nukleinsäure gemäß Anspruch 22, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'- Spleißregion zu fungieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst.The nucleic acid of claim 22, wherein the nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5.
24. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren, eine Verzweigungsstelle, eine Polypyrimidmsequenz und eine Spleißakzeptorstelle umfasst.The nucleic acid of any one of claims 1 to 21, wherein the nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises a branching site, a polypyrimidine sequence and a splice acceptor site.
25. Nukleinsäure gemäß Anspruch 24, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 31- Spleißregion zu fungieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.The nucleic acid of claim 24, wherein the nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 1 splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 6.
26. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, mindestens 20 Nukleotide umfasst.A nucleic acid according to any one of claims 1 to 25, wherein the nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises at least 20 nucleotides.
27. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 7 oder 8 umfasst.The nucleic acid of any of claims 1 to 26, wherein the nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8.
28. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Nukleinsäure DNA ist.28. Nucleic acid according to one of claims 1 to 27, wherein the nucleic acid is DNA.
29. Nukleinsäure, die durch Transkription einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 erhältlich ist.29. A nucleic acid obtainable by transcription of a nucleic acid according to any one of claims 1 to 28.
30. Nukleinsäure gemäß Anspruch 29, wobei die Nukleinsäure RNA ist. 30. Nucleic acid according to claim 29, wherein the nucleic acid is RNA.
31. S atz von Nukleinsäuren, der umfasst:31. Sats of nucleic acids comprising:
(i) eine Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— >3' -Richtung der Transkription umfasst:(i) a nucleic acid functionally comprising a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ii) eine Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '— >3 '-Richtung der Transkription umfasst:(ii) a nucleic acid operatively linked to a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht; und gegebenenfalls(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity; and optionally
(iii) eine oder mehrere Nukleinsäuren, die jeweils in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— »3 '-Richtung der Transkription umfasst:(iii) one or more nucleic acids, each in functional association comprising a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of transcription comprises:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, (c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, (c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert.(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the nucleic acid-derived transcripts are capable of undergoing a trans-splice reaction with each other as a substrate to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity.
32. Satz von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 31 , wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte miteinander mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, hybridisieren können.32. The set of nucleic acids according to claim 31, wherein the transcripts derived from the nucleic acids can hybridize to each other by means of the nucleic acid sequence which has the ability to hybridize to a different nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence.
33. Satz von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 31 , wobei der Satz von Nukleinsäuren keine Nukleinsäure nach (iii) umfasst und wobei die Nukleinsäure nach (i) und die Nukleinsäure nach (ii) mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren können.33. The set of nucleic acids according to claim 31, wherein the set of nucleic acids comprises no nucleic acid according to (iii) and wherein the nucleic acid according to (i) and the nucleic acid according to (ii) by means of the nucleic acid sequence which has the ability in which of the transcribable Nucleic acid sequence derived transcript to hybridize with another nucleic acid sequence, hybridize with each other.
34. Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Promotoren der Nukleinsäuren unterschiedlich sind.34. The set of nucleic acids according to any one of claims 31 to 33, wherein the promoters of the nucleic acids are different.
35. Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei die Promotoren der Nukleinsäuren gewebs- oder zellspezifische Promotoren sind.35. The set of nucleic acids according to claim 31, wherein the promoters of the nucleic acids are tissue- or cell-specific promoters.
36. Satz von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 35, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus epithelialem Gewebe einschließlich Haut, Lunge und Leber, Bindegewebe, zentralem und peripherem Nervensystem einschließlich des autonomen Nervensystems und der Sinnesrezeptoren, glatter und gestreifter Muskulatur, Myokard, hämatopoetischem System einschließlich des Immunsystems, und Kombinationen davon. 36. The set of nucleic acids according to claim 35, wherein the tissue is selected from the group consisting of epithelial tissue including skin, lung and liver, connective tissue, central and peripheral nervous system including the autonomic nervous system and the sensory receptors, smooth and striped musculature, myocardium, hematopoietic system including the immune system, and combinations thereof.
37. Satz von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 35, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NK-T Zellen, Mastzellen, lymphoide dendritische Zellen, myeloide dendritische Zellen, Makrophagen, Mikroglia, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Gallengangzellen und Kombinationen davon.37. The set of nucleic acids according to claim 35, wherein the cell is selected from the group consisting of NK-T cells, mast cells, lymphoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, macrophages, microglia, plasma cells, memory cells, bile duct cells and combinations thereof.
38. Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 37, wobei die Rekombinase Cre Rekombinase ist.38. The set of nucleic acids according to any one of claims 31 to 37, wherein the recombinase is Cre recombinase.
39. Vektor, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einen Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 38 umfasst.39. Vector comprising at least one nucleic acid according to any one of claims 1 to 28 or a set of nucleic acids according to any one of claims 31 to 38.
40. Wirtszelle, die mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, einen Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 38 oder einen Vektor gemäß Anspruch 38 umfasst.40. A host cell comprising at least one nucleic acid according to any one of claims 1 to 28, a set of nucleic acids according to any one of claims 31 to 38 or a vector according to claim 38.
41. Organismus, der eine Wirtszelle gemäß Anspruch 40 umfasst.41. An organism comprising a host cell according to claim 40.
42. Organismus gemäß Anspruch 41, der eine Maus ist.42. The organism of claim 41, which is a mouse.
43. Kit, der einen Satz von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 38 oder einen Vektor gemäß Anspruch 39 umfasst.A kit comprising a set of nucleic acids according to any one of claims 31 to 38 or a vector according to claim 39.
44. Verfahren zur Bereitstellung von Rekombinase-Aktivität in einer Zelle, das die Schritte umfasst:44. A method of providing recombinase activity in a cell comprising the steps of:
(i) Einbringen in die Zelle einer ersten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5 '→3 '-Richtung der Transkription umfasst:(i) introduction into the cell of a first nucleic acid, which in functional connection comprises a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und (c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and (c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ii) Einbringen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3 '-Richtung der Transkription umfasst:(ii) introduction into the cell of a second nucleic acid, which in functional connection comprises a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence which has the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(iii) gegebenenfalls Einbringen in die Zelle einer oder mehrerer weiterer Nukleinsäuren, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'- Richtung der Transkription umfasst:(iii) optionally introducing into the cell one or more further nucleic acids which in functional connection comprise a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence comprises in the 5 '→ 3' direction of the transcription:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3'-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer flir ein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence corresponding to a portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, wobei eine Transkription aller der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren in der Zelle stattfindet.(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the transcripts derived from the nucleic acids are capable of undergoing a trans-splice reaction with each other as a substrate to form a transcript encoding a polypeptide having recombinase activity, wherein a transcription of all of those described in steps (i), (ii) and optionally (iii) incorporated nucleic acids in the cell.
45. Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei in Schritt (iii) keine Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird und wobei die in den Schritten (i) und (ii) eingebrachten Nukleinsäuren mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren können.45. The method of claim 44, wherein in step (iii) no nucleic acid is introduced into the cell, and wherein the nucleic acids introduced in steps (i) and (ii) are amplified by means of the nucleic acid sequence having the capability in the transcriptable nucleic acid sequence to hybridize deduced transcript with another nucleic acid sequence, hybridize with each other.
46. Verfahren zur Rekombination von DNA in einer Zelle, das die Schritte umfasst: (i) Einbringen in die Zelle einer ersten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'-→3'-Richtung der Transkription umfasst:46. A method of recombining DNA in a cell, comprising the steps of: (i) introducing into the cell a first nucleic acid operatively linked to a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence is in 5'-> 3 ' Direction of transcription includes:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 5'-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(a) a nucleic acid sequence corresponding to a 5'-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5 '-Spleißregion zu fungieren, und(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;(c) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence;
(ii) Einbringen in die Zelle einer zweiten Nukleinsäure, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'— »3' -Richtung der Transkription umfasst:(ii) introduction into the cell of a second nucleic acid, which in functional connection comprises a promoter and a transcribable nucleic acid sequence, wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 'to 3' direction of the transcription comprises:
(a) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren, und (c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem 3 '-terminalen Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht, (iii) gegebenenfalls Einbringen in die Zelle einer oder mehrerer weiterer Nukleinsäuren, die in funktioneller Verbindung einen Promotor und eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz in 5'→3'- Richtung der Transkription umfasst:(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and (c) a nucleic acid sequence corresponding to a 3 '-terminal portion of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having recombinase activity; (iii) optionally, introducing into the cell one or more further nucleic acids operatively linked to a promoter and a transcribable nucleic acid sequence , wherein the transcribable nucleic acid sequence in the 5 '→ 3' direction of transcription comprises:
(a) eine erste Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren,(a) a first nucleic acid sequence having the ability to hybridize in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence with another nucleic acid sequence,
(b) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 3 '-Spleißregion zu fungieren,(b) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 3 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence,
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die einem Teil einer für ein Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,(c) a nucleic acid sequence which corresponds to a part of a nucleic acid sequence coding for a polypeptide having recombinase activity,
(d) eine Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript als 5'-Spleißregion zu fungieren, und(d) a nucleic acid sequence having the ability to function as a 5 'splice region in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence, and
(e) eine zweite Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; wobei die von den Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte fähig sind, miteinander als Substrat eine trans-Spleißreaktion zu durchlaufen, um ein Transkript auszubilden, das für ein(e) a second nucleic acid sequence having the ability to hybridize to another nucleic acid sequence in the transcript derived from the transcribable nucleic acid sequence; wherein the transcripts derived from the nucleic acids are capable of undergoing a trans-splicing reaction with each other as a substrate to form a transcript indicative of a transcript
Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität kodiert, wobei eine Transkription aller der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren in der Zelle stattfindet, und wobei die Bildung des Polypeptids mit Rekombinase- Aktivität zu einer Rekombination der DNA in der Zelle führt.Polypeptide recombinase activity is encoded, wherein a transcription of all of the introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) nucleic acids takes place in the cell, and wherein the formation of the polypeptide with recombinase activity to recombine the DNA in the cell leads.
47. Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei in Schritt (iii) keine Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird und wobei die in den Schritten (i) und (ii) eingebrachten Nukleinsäuren mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, miteinander hybridisieren können. 47. The method according to claim 46, wherein in step (iii) no nucleic acid is introduced into the cell and wherein the nucleic acids introduced in steps (i) and (ii) are amplified by means of the nucleic acid sequence having the ability in the transcriptable nucleic acid sequence to hybridize deduced transcript with another nucleic acid sequence, hybridize with each other.
48. Verfahren gemäß Anspruch 46 oder 47, wobei die zu rekombinierende DNA mindestens eine Erkennungssequenz für das Polypeptid mit Rekombinase- Aktivität umfasst.48. The method according to claim 46 or 47, wherein the DNA to be recombined comprises at least one recognition sequence for the polypeptide having recombinase activity.
49. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 46 bis 48, wobei das Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität ein Polypeptid mit Cre Rekombinase- Aktivität ist und die Rekombination der DNA über loxP Stellen vermittelt wird.The method of any of claims 46 to 48, wherein the polypeptide having recombinase activity is a polypeptide having Cre recombinase activity and the recombination of the DNA is mediated via loxP sites.
50. Verfahren gemäß Anspruch 49, wobei die Rekombination der DNA eine Exzision eines DNA-Fragments innerhalb der DNA betrifft, wobei das DNA-Fragment in der DNA von loxP Stellen flankiert wird.50. The method of claim 49, wherein the recombination of the DNA concerns excision of a DNA fragment within the DNA, flanking the DNA fragment in the DNA of loxP sites.
51. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 46 bis 50, wobei die Rekombination von DNA zu einer Aktivierung oder Inaktivierung eines Zielgens führt.51. A method according to any one of claims 46 to 50, wherein recombination of DNA results in activation or inactivation of a target gene.
52. Verfahren gemäß Anspruch 51 , wobei das Zielgen durch Exzision einer Stopp- Kassette im Zielgen aktiviert wird.52. The method of claim 51, wherein the target gene is activated by excision of a stop cassette in the target gene.
53. Verfahren gemäß Anspruch 51, wobei das Zielgen durch Exzision des Zielgens oder eines Teils davon inaktiviert wird.53. The method according to claim 51, wherein the target gene is inactivated by excision of the target gene or a part thereof.
54. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 46 bis 53, wobei die zu rekombinierende DNA genomische DNA ist.54. The method according to any one of claims 46 to 53, wherein the DNA to be recombined is genomic DNA.
55. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 54, wobei die Promotoren der Nukleinsäuren unterschiedlich sind.55. The method according to any one of claims 44 to 54, wherein the promoters of the nucleic acids are different.
56. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 55, wobei bei Ausbleiben einer Aktivierung aller Promotoren der in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren kein Polypeptid mit Rekombinase-Aktivität gebildet wird.56. The method according to any one of claims 44 to 55, wherein in the absence of activation of all promoters of the introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) nucleic acids no polypeptide with recombinase activity is formed.
57. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 56, wobei die von den in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren abgeleiteten Transkripte miteinander mittels der Nukleinsäuresequenz, die die Fähigkeit hat, in dem von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz abgeleiteten Transkript mit einer anderen Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, hybridisieren können.57. The method according to any one of claims 44 to 56, wherein the transcripts derived from the nucleic acids introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) are combined with each other by means of the nucleic acid sequence having the ability in the of the transcribable nucleic acid sequence derived hybridized with another nucleic acid sequence to hybridize.
58. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 57, wobei die Rekombinase Cre- Rekombinase ist.58. The method according to any one of claims 44 to 57, wherein the recombinase is Cre-recombinase.
59. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 58, wobei die Zelle in einem Organismus vorliegt.59. The method according to any one of claims 44 to 58, wherein the cell is present in an organism.
60. Verfahren gemäß Anspruch 59, wobei im Wesentlichen in allen Zellen des Organismus die Rekombinase- Aktivität bereitgestellt wird oder eine Rekombination der DNA stattfindet.60. The method according to claim 59, wherein the recombinase activity is provided in substantially all cells of the organism or recombination of the DNA takes place.
61. Verfahren gemäß Anspruch 59 oder 60, wobei die in den Schritten (i), (ii) und gegebenenfalls (iii) eingebrachten Nukleinsäuren durch Kreuzen zweier Individuen des Organismus, die jeweils mindestens eine dieser Nukleinsäuren umfassen, eingebracht werden.61. The method according to claim 59 or 60, wherein the nucleic acids introduced in steps (i), (ii) and optionally (iii) are introduced by crossing two individuals of the organism, each comprising at least one of these nucleic acids.
62. Verfahren gemäß Anspruch 61 , wobei die Individuen des Organismus durch Einbringen der Nukleinsäure in eine Oozyte des Organismus und Erzeugen des Individuums aus der Oozyte bereitgestellt werden.62. The method of claim 61, wherein the individuals of the organism are provided by introducing the nucleic acid into an oocyte of the organism and producing the individual from the oocyte.
63. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 59 bis 62, wobei die Rekombinase- Aktivität gewebs- oder zellspezifisch bereitgestellt wird oder eine Rekombination der DNA gewebs- oder zellspezifisch stattfindet.63. The method according to any one of claims 59 to 62, wherein the recombinase activity is provided tissue or cell specific or recombination of the DNA tissue or cell-specific takes place.
64. Verfahren gemäß Anspruch 63, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus epithelialem Gewebe einschließlich Haut, Lunge und Leber, Bindegewebe, zentralem und peripherem Nervensystem einschließlich des autonomen Nervensystems und der Sinnesrezeptoren, glatter und gestreifter Muskulatur, Myokard, und hämatopoetischem System einschließlich des Immunsystems, und Kombinationen davon.64. The method of claim 63, wherein the tissue is selected from the group consisting of epithelial tissue including skin, lung and liver, connective tissue, central and peripheral nervous system including the autonomic nervous system and the sensory receptors, smooth and striped musculature, myocardium, and hematopoietic System including the immune system, and combinations thereof.
65. Verfahren gemäß Anspruch 63, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NK-T Zellen, Mastzellen, lymphoide dendritische Zellen, myeloide dendritische Zellen, Makrophagen, Mikroglia, Plasmazellen, Gedächtniszellen, Gallengangzellen und Kombinationen davon.65. The method of claim 63, wherein the cell is selected from the group consisting of NK-T cells, mast cells, lymphoid dendritic cells, myeloid dendritic cells, macrophages, microglia, plasma cells, memory cells, bile duct cells, and combinations thereof.
66. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 59 bis 65, wobei der Organismus ein Säuger ist.66. The method according to any one of claims 59 to 65, wherein the organism is a mammal.
67. Verfahren gemäß Anspruch 66, wobei der Säuger eine Maus ist.67. The method of claim 66, wherein the mammal is a mouse.
68. DNA-Molekül, das eine für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die für Cre Rekombinase kodierende Nukleinsäuresequenz durch mindestes eine Intronsequenz unterteilt ist..68. A DNA molecule which comprises a nucleic acid sequence coding for Cre recombinase, characterized in that the nucleic acid sequence coding for Cre recombinase is subdivided by at least one intron sequence.
69. DNA-Molekül gemäß Anspruch 68, wobei eine Intronsequenz zwischen den Nukleotiden der für Cre Rekombinase kodierenden Nukleinsäuresequenz liegt, die den Nukleotiden an den Positionen 504 und 505 oder den Positionen 551 und 552 der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 12 entsprechen.69. The DNA molecule of claim 68, wherein an intron sequence is between the nucleotides of the Cre recombinase-encoding nucleic acid sequence corresponding to the nucleotides at positions 504 and 505 or positions 551 and 552 of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 12.
70. DNA-Molekül gemäß Anspruch 68 oder 69, wobei mindestens eine der Intronsequenzen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus humanem VEGF Intron, CD40L Intron 1, Kaninchen beta-Globin Intron 2, Maus Prml Intron, SV40 T-Antigen Intron, IgM C1-C2 Intron und IgE Intron.70. The DNA molecule according to claim 68 or 69, wherein at least one of the intron sequences is selected from the group consisting of human VEGF intron, CD40L intron 1, rabbit beta globin intron 2, mouse Prml intron, SV40 T antigen intron, IgM C1-C2 intron and IgE intron.
71. DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 68 bis 70, wobei mindestens eine der Intronsequenzen die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14 umfasst. The DNA molecule of any of claims 68 to 70, wherein at least one of the intron sequences comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 14.
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