DE10023887A1 - Nucleic acid construct for transient cell transfection, useful ,e.g., in gene therapy, contains recombinase gene controlled by inducible promoter and flanking recombinase sites - Google Patents

Nucleic acid construct for transient cell transfection, useful ,e.g., in gene therapy, contains recombinase gene controlled by inducible promoter and flanking recombinase sites

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DE10023887A1 DE2000123887 DE10023887A DE10023887A1 DE 10023887 A1 DE10023887 A1 DE 10023887A1 DE 2000123887 DE2000123887 DE 2000123887 DE 10023887 A DE10023887 A DE 10023887A DE 10023887 A1 DE10023887 A1 DE 10023887A1
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Abstract

Nucleic acid construct (A) comprises: (a) a transcription cassette (TS) containing a recombinase-encoding sequence (I) under control of an inducible promoter system; (b) at least one other coding sequence (II) under control of a constitutive, tissue-specific or inducible promoter; and (c) 5'- and 3'-flanking recombinase target sequences, natural or synthetic. Independent claims are also included for the following: (1) vector containing (A); (2) transient insertion of foreign genetic material into the genome (or extrachromosomal genetic elements) of prokaryotic or eukaryotic cells, using (A) or the vector of (1); (3) prokaryotic or eukaryotic cells, other than human embryonal cells, transfected with (A); and (4) transgenic animals containing cells that include (A)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur transienten Insertion genetischer Elemente in fremde Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren zur Durchführung dieses Verfahrens sowie mit dem Konstrukt transfizierte Zellen und Tiere.The invention relates to a method for transient insertion genetic elements in foreign genomes or extrachromosomal genetic elements of prokaryotic and eukaryotic cells, Nucleic acid constructs and vectors for performing this Process and cells transfected with the construct and Animals.

In der Gentechnik und der Gentherapie ist es häufig erwünscht, bestimmte in die Zelle(n) künstliche eingeführte Gene später wieder zu entfernen, insbesondere, wenn die inserierte Gense­ quenz die normale Zellfunktion stört oder allgemein nicht dau­ erhaft tolerierbar ist.In genetic engineering and gene therapy, it is often desirable later determined artificial genes inserted into the cell (s) remove again, especially if the inserted Gense sequence interferes with normal cell function or generally does not last is tolerably tolerable.

Es ist bekannt, das Ausschneiden bestimmter Sequenzen mit Hilfe targetspezifischer Rekombinasen vorzunehmen. Ein Beispiel hier­ für ist das Cre-Rekombinase-System.It is known to cut out certain sequences with the help target-specific recombinases. An example here for is the Cre recombinase system.

Die Cre Rekombinase, eine Integrase des Coliphagen P1 kata­ lysiert die Sequenz-spezifische Rekombination von 34 Basen­ paaren (bp) langen Erkennungssequenzen, loxP genannt, in Abwesenheit weiterer Kofaktoren (Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. Cell 25, no. 3: 729). Das Cre-lox System erlaubt damit ein präzises Ausschneiden von DNA-Fragmenten, welche von zwei lox sites eingerahmt sind, di­ rekt in der Zelle und ist daher sehr nützlich, um genetische Elemente, welche zuvor in Zellen eingeführt worden sind (z. B. Selektionsmarker), wieder zu entfernen (Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA 85, no. 14: 5166). Ähnliche Funktionen können auch mittels anderer Rekombinssysteme, wie z. B. dem Flp-System ausgeführt werden.The Cre recombinase, an integrase of the Coliphagen P1 kata lyse the sequence-specific recombination of 34 bases pair (bp) long recognition sequences, called loxP, in the absence  other cofactors (Austin, S., M. Ziese, and N. Sternberg. 1981. A novel role for site-specific recombination in maintenance of bacterial replicons. Cell 25, no. 3: 729). The Cre-lox system thus enables precise cutting of DNA fragments which are framed by two lox sites, ie rectifies the cell and is therefore very useful to genetic Elements that have previously been inserted into cells (e.g. Selection marker) to remove again (Sauer, B., and N. Henderson. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA 85, no. 14: 5166). Similar functions can also by means of other recombinant systems, such as e.g. B. the flp system be carried out.

Derzeitige Methoden verwenden Expressionsvektoren, welche Cre (oder Flp) Rekombinase unter Kontrolle von verschiedenen Promo­ toren exprimieren. Transfektion dieser Vektoren in Zellen, die transgen für ein anderes, von Targetsequenzen eingerahmtes Kon­ strukt sind, führen zur präzisen Entfernung dieses zweiten Kon­ struktes (Rinaldi, A., K. R. Marshall, and C. M. Preston. 1999. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site-specific recombination. Vi­ rus Res 65, no. 1: 11). Da jedoch zum einen die Transfektionsef­ fizienz und zum anderen die Effizienz der Cre-Rekombinase nicht hoch genug sind, um mit Sicherheit in 100% der Zellen das Kon­ strukt zu entfernen, hat diese Methode bei vielen Anwendungen große Nachteile.Current methods use expression vectors, which Cre (or Flp) recombinase under the control of various promo express gates. Transfection of these vectors into cells that transgenic for another con framed by target sequences are structured, lead to the precise removal of this second con struktes (Rinaldi, A., K.R. Marshall, and C.M. Preston. 1999. A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site-specific recombination. Vi rus Res 65, no. 1:11). However, since the transfection def efficiency and secondly not the efficiency of the Cre recombinase are high enough to ensure that the con This method has to be removed in many applications big disadvantages.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zu finden, mit dem vorher in Genome oder extrachromo­ somale Elemente prokaryoter und eukaryoter Zellen eingeführte genetische Elemente präzise und in allen betroffen Zellen ent­ fernt werden können. Das Verfahren sollte in vitro und in vivo anwendbar sein.The object of the present invention is therefore a Finding procedure with which previously in genome or extrachromo introduced somale elements of prokaryotic and eukaryotic cells genetic elements precise and ent in all affected cells can be removed. The procedure should be in vitro and in vivo be applicable.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Nukleinsäurekon­ strukt, einen das Nukleinsäurekonstrukt enthaltenden Vektor, sowie ein mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder dem Vektor durch­ führbares Verfahren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Ele­ mente prokaryotischer und erkaryotischer Zellen gelöst. Ferner umfasst die Erfindung prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen humane embryonale Zellen, die mit dem Nukleinsäure­ konstrukt transfiziert sind, sowie transgene Tiere, die Zellen enthalten, die Nukleinsäurekonstrukte nach dieser Erfindung um­ fassen.According to the invention, the object is achieved by a nucleic acid con structure, a vector containing the nucleic acid construct, as well as one with the nucleic acid construct or the vector feasible method for transient insertion of foreign genetic  Elements in genomes or extrachromosomal genetic ele elements of prokaryotic and Erkaryotic cells. Further the invention includes prokaryotic or eukaryotic cells, except human embryonic cells that contain the nucleic acid construct transfected, as well as transgenic animals, the cells contain the nucleic acid constructs according to this invention grasp.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt umfasst folgende Be­ standteile:
The nucleic acid construct according to the invention comprises the following components:

  • a) eine Transkriptionskassette, enthaltend eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promo­ torsystems;a) a transcription cassette containing a recombinase coding sequence under the control of an inducible promo door systems;
  • b) wenigstens eine ein weiteres Gen kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder indu­ zierbaren Promotorsystems;b) at least one sequence encoding a further gene Control of a constitutive, tissue-specific or indu promotable promoter system;
  • c) je eine 5'-flankierende und eine 3'-flankierende natürliche oder künstliche Rekombinase-Targetsequenz.c) one 5'-flanking and one 3'-flanking natural or artificial recombinase target sequence.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Be­ griff "genetisches Element" ein natürliches oder rekombinantes lineares oder zirkuläres Nukleinsäuremolekül, welches ver­ schiedenste regulatorische und proteinkodierende Sequenz­ bereiche, die aus prokaryoten oder eukaryoten Zellen, bzw. aus Viren stammen können, enthalten kann.In the context of the present invention, the Be attacked "genetic element" a natural or recombinant linear or circular nucleic acid molecule, which ver a wide variety of regulatory and protein coding sequences areas that consist of prokaryotic or eukaryotic cells, respectively Viruses can originate, can contain.

Ein "Nukleinsäurekonstrukt" bezeichnet ein rekombinantes lineares oder zirkulares Nukleinsäuremolekül, das sowohl aus Desoxyribonukleinsaure als auch aus Ribonukleinsäure bestehen kann. Vektoren, die als Ausgangsmaterial für die erfindungs­ gemäßen Nukleinsäurekonstrukte dienen können, sind dem Fachmann bekannt.A "nucleic acid construct" means a recombinant linear or circular nucleic acid molecule consisting of both Deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid consist can. Vectors used as starting material for the invention appropriate nucleic acid constructs can be used by those skilled in the art known.

Eine "Rekombinase" ist ein natürliches oder synthetisches En­ zym, das spezifische Targetsequenzen erkennt, schneidet und miteinander rekombiniert. Beispiele hierfür sind die Cre- Rekombinase aus dem P1-Coliphagen und die Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae (Argos, P., A. Landy, K. Abremski, J. B. Egan, E. Haggard-Ljungquist, R. H. Hoess, M. L. Kahn, B. Kalionis, S. V. Narayana, L. S. d. Pierson, and et al. 1986. The integrase family of site-specific recombinases: regional similarities and global diversity. Embo J 5, no. 2: 433; Hoess, R. H., and K. Abremski. 1984. Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP. Proc Natl Acad Sci USA 81, no. 4: 1026).A "recombinase" is a natural or synthetic ene enzyme that recognizes, cuts and cuts specific target sequences recombined with each other. Examples of this are the cre- Recombinase from the P1 Coliphagen and the Flp recombinase from  S. cerevisiae (Argos, P., A. Landy, K. Abremski, J.B. Egan, E. Haggard-Ljungquist, R.H. Hoess, M.L. Kahn, B. Kalionis, S.V. Narayana, L. S. d. Pierson, and et al. 1986. The integrase family of site-specific recombinases: regional similarities and global diversity. Embo J 5, no. 2: 433; Hoess, R.H., and K. Abremski. 1984. Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP. Proc Natl Acad Sci USA 81, no. 4: 1026).

Eine "Targetsequenz" ist eine natürliche oder synthetische Se­ quenz, die von einer Rekombinase spezifisch erkannt werden kann. Als Beispiel können die loxP-Sequenzen aus dem P1- Coliphagen und die FRT-Sequenzen aus S. cerevisiae angeführt werden.A "target sequence" is a natural or synthetic Se sequence that are specifically recognized by a recombinase can. As an example, the loxP sequences from the P1 Coliphagen and the FRT sequences from S. cerevisiae become.

"Transkriptionskassetten" sind Nukleinsäureeinheiten, die neben der für ein Protein kodierenden Sequenz die erforderlichen regulatorischen Bereiche, z. B. Promotor, Enhancer, Repressor, Transkriptionsfaktorbindestelle und Polyadenylierungssequenzen, enthalten. Vorzugsweise enthalten eine oder mehrere der Kasset­ ten in dem Konstrukt Polyadenylierungssequenz(en)."Transcription cassettes" are nucleic acid units that are next to the sequence coding for a protein regulatory areas, e.g. B. promoter, enhancer, repressor, Transcription factor binding site and polyadenylation sequences, contain. Preferably one or more of the cassettes are included ten in the construct polyadenylation sequence (s).

Zentraler Bestandteil der erfindungsgemäßen Konstrukte ist die in (a) aufgeführte Transkriptionskassette, die eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promo­ torsystems enthält. Die nach Induktion mit dem passenden Induk­ tor induzierte Rekombinase, z. B. die Cre-Rekombinase aus dem P1 Coliphagen, katalysiert über ihre das Nukleinsäurekonstrukt flankierenden Targetsequenzen (z. B. loxP) das Herausschneiden des erfindungsgemäßen Konstruktes und damit auch der eigenen kodierenden Sequenz. Erst nach Gabe des geeigneten Induktors kommt es zur Expression der Rekombinase. Bei Präsenz des Induk­ tors wird in den transgenen Zellen solange Rekombinase exprim­ iert, bis alle erfindungsgemäßen Konstrukte wieder entfernt wurden. Zurück bleibt alleine eine kurze Rekombinase- Targetsequenz, die auf die Funktion der Zelle keine Einfluss hat. Mit der selbstdeletierenden Rekombinase-kodierenden Se­ quenz wird auch die in (b) auf geführte wenigstens eine ein weiteres Gen kodierende Sequenz, die unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotorsys­ tems steht, herausgeschnitten.The central component of the constructs according to the invention is Transcription cassette listed in (a) which contains a recombinase coding sequence under the control of an inducible promo contains torsystems. After induction with the right induc tor induced recombinase, e.g. B. the Cre recombinase from P1 Coliphagen, catalyzes the nucleic acid construct flanking target sequences (e.g. loxP) of the construct according to the invention and thus also your own coding sequence. Only after giving the appropriate inductor the recombinase is expressed. With the presence of the induc tors is expressed in the transgenic cells as long as recombinase iert until all constructs of the invention removed were. All that remains is a short recombinase Target sequence that has no influence on the function of the cell Has. With the self-deleting recombinase-coding Se quenz is also the one listed in (b) at least one another gene coding sequence that is under the control of a constitutive,  tissue-specific or inducible promoter systems tems stands, cut out.

In bevorzugter Ausführungsform ist die Rekombinase eine Cre- Rekombinase aus dem P1 Coliphagen und und die Target-Sequenzen sind loxP-Sequenzen.In a preferred embodiment, the recombinase is a Cre Recombinase from the P1 Coliphagen and and the target sequences are loxP sequences.

Alternativ kann die Rekombinase auch eine Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae sein, wobei die Target-Sequenzen frt-Sequenzen sind.Alternatively, the recombinase can also be an Flp recombinase S. cerevisiae, the target sequences being frt sequences are.

Das induzierbare Promotorsystem für die Rekombinase kann vor­ zugsweise ein Tetracyclin, Ecdysone oder Mifepristone induzier­ bares Promotorsystem sein, d. h. dass zu dem Zeitpunkt, zu dem schließlich die Entfernung des zuvor eingeführten Konstruktes aus der Zelle gewünscht wird, Tetracyclin, Ecdysone, Mifepri­ stone oder Analoga dieser Stoffe zugeführt wird.The inducible promoter system for the recombinase can preferably induce a tetracycline, ecdysone or mifepristone cash promoter system, d. H. that at the time finally the removal of the previously introduced construct from the cell is desired, tetracycline, ecdysone, mifepri stone or analogues of these substances is supplied.

Wichtige Voraussetzung für die Funktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte ist, daß das Basallevel der Rekombinase­ expression (ohne Induktor) extrem niedrig oder im Idealfall gleich null ist. Dieses ist z. B. bekanntermaßen bei bestimmten Ecdysone oder Mifepristone induzierbaren Promotorsystemen der Fall. Nur dann ist es gewährleistet, daß die Konstrukte in den transfizierten Zellen nicht sofort wieder aus der Integrations­ stelle herausgeschnitten werden.Important prerequisite for the function of the invention Nucleic acid constructs is that the basal level of the recombinase expression (without inductor) extremely low or ideally is zero. This is e.g. B. is known to certain Ecdysone or Mifepristone inducible promoter systems from Case. Only then is it guaranteed that the constructs in the transfected cells did not immediately return from the integration be cut out.

Ein niedriges basales Expressionslevel kann, falls nötig, durch die Expression einer Rekombinase-Antisense-mRNA oder einem ent­ sprechenden Ribozym kompensiert werden, wie in der Literatur bekannt. Hierfür enthält das Nukleinsäurekonstrukt in Weiter­ bildung der Erfindung eine Transkriptionskassette mit einer Rekombinase-Antisense-Sequenz unter Kontrolle eines konstitu­ tiven oder induzierbaren Promotorsystems, sowie gegebenenfalls eine Polyadenylierungssequenz.A low basal expression level can, if necessary, by the expression of a recombinase antisense mRNA or an ent speaking ribozyme can be compensated, as in the literature known. For this purpose, the nucleic acid construct contains in Next education of the invention, a transcription cassette with a Recombinase antisense sequence under the control of a constitu tive or inducible promoter system, and optionally a polyadenylation sequence.

Die das "weitere" nur transient zu inserierende Gen kodierende Sequenz kann beispielsweise eine Telomerase-reverse- Transkriptase oder eine SV40 large T-Antigen kodierende Sequenz sein.The gene encoding the "further" only to be inserted transiently Sequence can for example a telomerase reverse  Transcriptase or a sequence encoding SV40 large T antigen his.

Innerhalb der Transkriptionskassette(n) können durch Verwendung von IRES-Sequenzen (internal ribosome entry sites elements) weitere Gene, z. B. ein Selektionsmarkergen wie ein Neomycin- oder ein Zeozinresistenzgen, unter Kontrolle desselben Promo­ tors exprimiert werden. Ein Selektrionsmarkergen kann jedoch auch unter Kontrolle eines eigenen Promotors in das erfindungs­ gemäße Konstrukt eingefügt werden.Within the transcription cassette (s) can be used of IRES sequences (internal ribosome entry sites elements) other genes, e.g. B. a selection marker gene such as a neomycin or a zeocin resistance gene under the control of the same promo tors are expressed. However, a selection marker gene can also under the control of its own promoter in the invention appropriate construct can be inserted.

Als zusätzliches Sicherheitsmerkmal, vor allen Dingen im Falle von in vivo Anwendungen, kann optional ein Suizidgen unter Kon­ trolle eines weiteren induzierbaren Promotorsystems in den Nuk­ leinsäurekonstrukten enthalten sein. Damit besteht zusätzlich die Möglichkeit, einzelne Zellen, bei denen das Konstrukt noch vorhanden sein sollte, über Induktion des Suizidgens abzutöten.As an additional security feature, especially in the case of in vivo applications, an optional suicide gene under Kon trolle another inducible promoter system in the nuc contain linseic acid constructs. So there is additional the possibility of single cells where the construct is still should be present to kill via induction of the suicide gene.

Ein "Suizidgen" ist eine Nukleinsauresequenz, die durch Tran­ skription und gegebenenfalls Expression zum Zelltod führt (z. B. Thymidinkinase oder Diphterie-Toxin). In dem hier beschriebenen Konstrukt oder Vektor ist es optional als Teil einer Transkrip­ tionskassette, d. h. in Verbindung mit einem Promotor und gege­ benenfalls einer Polyadenylierungssequenz, vorhanden.A "suicide gene" is a nucleic acid sequence generated by Tran description and possibly expression leads to cell death (e.g. Thymidine kinase or diphtheria toxin). In what is described here Construct or vector, it is optional as part of a transcript tion cassette, d. H. in conjunction with a promoter and opp optionally also a polyadenylation sequence.

Insbesondere bei Anwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte für die transiente Inaktivierung von Genen über 'Gene-Targeting'- Technologien bzw. für die zielgerichtete Einführung der Kon­ strukte (ebenfalls über homologe Rekombination) kann das ver­ wendete Konstrukt in 5'-Richtung der 3'-flankierenden Rekom­ binase-Targetsequenz eine oder mehrere Transkriptions- Terminator-Sequenzen (z. B. T phi, rrnBT1, rrnBT2 oder Tfd) oder andersartige Stop-Sequenzen, wie z. B. beschrieben in: Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E. J. Lee, R. W. Manning, S. H. Yu, K. L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene acti­ vation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 89, no. 14: 6232. Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA 92, no. 1: 160. In particular when using the constructs according to the invention for the transient inactivation of genes via 'gene targeting' Technologies or for the targeted introduction of the Kon structs (also via homologous recombination) can ver turned construct in the 5 'direction of the 3' flanking recom binase target sequence one or more transcription Terminator sequences (e.g. T phi, rrnBT1, rrnBT2 or Tfd) or other stop sequences, such as. B. described in: Lakso, M., B. Sauer, B. Mosinger, Jr., E. J. Lee, R. W. Manning, S. H. Yu, K.L. Mulder, and H. Westphal. 1992. Targeted oncogene acti vation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 89, no. 14: 6232. Araki, K., M. Araki, J. Miyazaki, and P. Vassalli. 1995. Site-specific recombination of a transgene in fertilized eggs by transient expression of Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci USA 92, no. 1: 160.  

"Maneewannakul, S., K. Maneewannakul, and K. Ippen-Ihler. 1994. The pKSM710 vector cassette provides tightly regulated lac and T7lac Promoters and strategies for manipulating N-terminal pro­ tein sequences. Plasmid 31, no. 3: 300". Die Terminations- Sequenzen sorgen für eine Abkopplung des zu inaktivierenden Gens vom endogenen Promoter und von den eingeführten Promotor­ systemen."Maneewannakul, S., K. Maneewannakul, and K. Ippen-Ihler. 1994. The pKSM710 vector cassette provides tightly regulated lac and T7lac Promoters and strategies for manipulating N-terminal pro no sequences. Plasmid 31, no. 3: 300 ". The termination Sequences ensure that the one to be deactivated is decoupled Gene from the endogenous promoter and from the introduced promoter systems.

Wo notwendig können Transkriptions-Terminator-Sequenzen oder andersartige Stop-Sequenzen auch die eingeführten unterschied­ lichen Transkriptionskassetten untereinander entkoppeln. Ein Selektionsgen kann je nach Selektionsstrategie unter Kontrolle eines exogenen Promotors (wie weiter unten zu Abb 2. beschrie­ ben) oder Promotorlos vorliegen (siehe Abb. 3).Where necessary, transcription terminator sequences or other types of stop sequences can also decouple the different transcription cassettes introduced. Depending on the selection strategy, a selection gene can be under the control of an exogenous promoter (as described below for Fig. 2) or without a promoter (see Fig. 3).

Allgemein können die Nukleinsäurekonstrukte als DNA oder RNA, als lineares Molekül oder in geeigneten Vektoren, nackt oder in virale Partikel verpackt, über verschiedenste Transfek­ tionsmethoden in Zielzellen eingebracht werden. Als Transfek­ tionsmethode für die unter Umständen sehr großen Konstrukte ist insbesondere eine Methode zu nennen, bei der inaktivierte Ade­ noviren als Shuttle genutzt werden, um große Nukleinsäure­ moleküle (bis 300 kb) mit hoher Effizienz in Zellen einzubrin­ gen. diese Methode ist ausführlich beschrieben in: Baker, A., and M. Cotten. 1997. Delivery of bacterial artificial chromo­ somes into mammalian cells with psoralen-inactivated adenovirus carrier. Nucleic Acids Res 25, no. 10: 1950, auf die hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, so dass sie hier nicht geson­ dert geschildert zu werden braucht.In general, the nucleic acid constructs can be used as DNA or RNA, as a linear molecule or in suitable vectors, naked or in viral particles packaged via various transfec methods are introduced into target cells. As a transfect tion method for the possibly very large constructs in particular to mention a method in which inactivated Ade noviren can be used as a shuttle to large nucleic acid inserting molecules (up to 300 kb) into cells with high efficiency This method is described in detail in: Baker, A., and M. Cotten. 1997. Delivery of bacterial artificial chromo somes into mammalian cells with psoralen-inactivated adenovirus carrier. Nucleic Acids Res 25, no. 10: 1950, to which hereby is expressly referred to, so that they are not separately here needs to be described.

Neben bestimmten "High Copy" Plasmiden, in die DNA-Fragmente bis zu 20 kb kloniert werden können, können auch Cosmide oder "Bacterial Artificial Chromosomes" (BAC's) für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Konstrukte verwendet werden.In addition to certain "high copy" plasmids, in the DNA fragments up to 20 kb can be cloned, can also Cosmide or "Bacterial Artificial Chromosomes" (BAC's) for the construction of the constructs according to the invention can be used.

Allgemein kann der Vektor, der das Nukleinsäurekonstrukt ent­ hält abgeleitet sein aus
In general, the vector containing the nucleic acid construct can be derived from

  • - einem Plasmid, insbesondere einem "High Copy" PlasmidA plasmid, in particular a "high copy" plasmid
  • - einem Cosmid - a cosmid  
  • - einem Bacterial Artificial Chromosome (BAC)- a bacterial artificial chromosome (BAC)
  • - einem Bacteriophagen- a bacteriophage
  • - einem viralen Vektor, vorzugsweise adenoviralen oder retroviralen Ursprungs- a viral vector, preferably adenoviral or of retroviral origin

Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung ferner ein Verfah­ ren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryoti­ scher und eukaryotischer Zellen mit den folgenden Schritten:
To achieve the object, the invention further comprises a method for the transient insertion of foreign genetic elements into genomes or extrachromosomal genetic elements of prokaryotic and eukaryotic cells with the following steps:

  • 1. Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts wie oben beschrie­ ben,1. Preparation of a nucleic acid construct as described above ben,
  • 2. Transfektion des Nukleinsäurekonstrukts oder eines damit erzeugten Vektors in eine prokaryote oder eukaryote Zelle (ausgenommen eine humane embryonale Zelle),2. Transfection of the nucleic acid construct or one with it generated vector into a prokaryote or eukaryote cell (except a human embryonic cell),
  • 3. Induktion der Rekombinaseaktivität mit Hilfe des Induktors für das die Rekombinaseexpression kontrollierende induzierbare Promotorsystem zu einem gewählten späteren Zeitpunkt.3. Induction of recombinase activity using the inductor for the inducible which controls the recombinase expression Promoter system at a later selected time.

Das Nukleinsäurekonstrukt kann wie bereits beschrieben nackt, als DNA oder RNA, als lineares oder zirkulares Molekül oder in­ nerhalb von Vektoren in die Zelle transfiziert werden.As already described, the nucleic acid construct can be bare, as DNA or RNA, as a linear or circular molecule or in can be transfected into the cell within vectors.

Das Verfahren kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden.The method can be carried out in vitro or in vivo.

Eine wichtige Anwendung der Erfindung liegt in der transienten Immortalisierung primärer somatischer Zellen, vorzugsweise mit Hilfe der Telomerase Reverse Transkriptase, einem Enzym, oder dem SV40 large T-Antigen. Generell können auch andere immorta­ lisierende Gene verwendet werden.An important application of the invention lies in the transient Immortalization of primary somatic cells, preferably with Using telomerase reverse transcriptase, an enzyme, or the SV40 large T antigen. Generally, other immorta lising genes can be used.

In Weiterbildung der Erfindung umfasst das Verfahren die ge­ zielte Induktion eines Zell-Suizidmechanismus durch Zugabe des entsprechenden Induktors (der das Promotorsystem für ein in dem Nucleinsäurekonstrukt vorhandenes Suizidgen kontrolliert) zu einem beliebigen gewählten späteren Zeitpunkt in vitro oder in vivo.In a development of the invention, the method comprises the ge aimed to induce a cell suicide mechanism by adding the corresponding inductor (which is the promoter system for one in the Existing suicide gene controls) to any chosen later time in vitro or in vivo.

Die Erfindung umfasst auch prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen embryonale Zellen, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt nach der Erfindung transfiziert sind, sowie transgene Tiere, die Zellen enthalten, in die Nukleinsäure­ konstrukte nach dieser Erfindung eingebracht wurden.The invention also includes prokaryotic or eukaryotic Cells, except embryonic cells, that construct with a nucleic acid  are transfected according to the invention, and transgenic animals containing cells into the nucleic acid constructs were introduced according to this invention.

Der große Vorteil der Erfindung liegt u. a. darin, dass das Re­ kombinasegen fest an die im Zuge der gentechnischen Behandlung in fremdes genetisches Material zu integrierenden Gene gekop­ pelt ist und alle später zu entfernenden Elemente innerhalb des von der Rekombinase geschnittenen Target-Sequenz-Systems lie­ gen. Dadurch kann die vollständige Entfernung der gesamten ein­ geführten Sequenz (bis auf eine verbleibende Target-Sequenz) zu einem sehr variablen, praktisch beliebigen Zeitpunkt extern in­ duziert werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strategien, kann die Erfindung die Entfernung der zuvor eingeführten Konstrukte in 100% der transgenen Zellen garantieren.The great advantage of the invention lies u. a. in that the Re combination blessing firmly in the course of genetic engineering Genes to be integrated into foreign genetic material pelt and all elements to be removed later within the from the recombinase cut target sequence system gen. This can completely remove the entire one performed sequence (except for a remaining target sequence) a very variable, practically any time externally in be reduced. Unlike traditional strategies, can the invention the removal of the previously introduced constructs guarantee in 100% of transgenic cells.

Die Erfindung kann in verschiedenen Bereichen der Biotechnolo­ gie und Medizin vorteilhaft eingesetzt werden.The invention can be used in various fields of biotechnology technology and medicine can be used to advantage.

Verwendungsbereiche für die ErfindungAreas of use for the invention Tissue-EngineeringTissue engineering

Ein weites Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Kon­ strukte liegt in der Therapie verschiedener Erkrankungen, die sich durch Transplantation syngener oder allogener Zellen oder durch Transplantation bioartifiziell hergestellter Gewebe oder Organe behandeln lassen. Eines der Hauptprobleme des Tissue- Engineering ist, daß die meisten Typen primärer somatischer Zellen sich nicht oder nur sehr schlecht kultivieren und in Zellkultur expandieren lassen. Tumorzellinien oder auf andere Art und Weise permanent immortalisierte Zellinien sind für eine Anwendung im Patienten normalerweise nicht geeignet, da sie häufig im Vergleich zur primären Ursprungszelle stark modi­ fizierte Eigenschaften aufweisen. Außerdem wachsen solche Zel­ linien in vivo oft unkontrollierbar und können zur Ausbildung von Tumoren führen. Ob die Transplantation von Zellen, welche konstitutiv und auf hohem Level Telomerase Reverse Transkrip­ tase (hTERT) exprimieren, langfristig zur Entstehung von Tu­ moren führen kann, ist unklar. Aus diesem Grund werden auch Zellen, stabil immortalisiert mit hTERT, kaum Anwendung im Pa­ tienten finden.A wide field of application for the con structs lies in the therapy of various diseases that by transplanting syngeneic or allogeneic cells or Tissue manufactured by transplantation or Have organs treated. One of the main problems of tissue Engineering is that most types are primary somatic Cells do not cultivate or cultivate very poorly and in Let cell culture expand. Tumor cell lines or others Way permanently immortalized cell lines are for one Application in the patient is not normally suitable as it often strongly modi compared to the primary cell of origin have fected properties. Such cells also grow Lines in vivo are often uncontrollable and can be used for training lead from tumors. Whether the transplantation of cells, which constitutive and high level telomerase reverse transcript express tase (hTERT), long-term to the formation of Tu can lead to moren is unclear. For this reason, too  Cells, stable immortalized with hTERT, hardly used in pa find clients.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die transiente Immortalis­ ierung von Zellen durch Einführung von erfindungsgemäßen Kon­ strukten, welche immortalisierende Gene wie z. B. Telomerase Re­ verse Transkriptase oder das SV40 large T-Antigen enthalten. Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist in Abb. 2 gezeigt und wird dort noch näher beschrieben. Unter Verwendung der er­ findungsgemäßen Konstrukte kann das immortalisierende Gen bei Bedarf wieder aus allen transgenen Zellen entfernt werden.The present invention enables the transient immortalization of cells by introducing constructs according to the invention, which immortalizing genes such as. B. Telomerase reverse verse transcriptase or the SV40 large T antigen. An example of such an application is shown in Fig. 2 and is described in more detail there. Using the constructs according to the invention, the immortalizing gene can be removed from all transgenic cells if necessary.

Ebenso kann das endogene Telomerase Reverse Transkriptase Gen (hTERT) durch Einführung erfindungsgemäßer Konstrukte über "Gene Targeting Technologien" transient unter Kontrolle eines starken konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotors gebracht werden. Ein Beispiel hierfür ist nachfolgend in Abb. 3 und der zugehörigen Beschreibung angegeben.Likewise, the endogenous telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) can be brought transiently under the control of a strong constitutive, tissue-specific or inducible promoter by introducing constructs according to the invention via "gene targeting technologies". An example of this is given below in Fig. 3 and the associated description.

Weiterhin können Zellen auch unter Verwendung der erfindungs­ gemäßen Konstrukte in Verbindung mit geeigneten 'Gene­ targeting-Technologien' immortalisiert werden, indem endogene wachstumsregulierende Gene (Onkogene) durch transiente Ein­ führung von erfindungsgemäßen Konstrukten an geeigneter Stelle von ihren endogenen Promotoren entkoppelt werden. Ein Beispiel hierzu wird nachfolgend in Abb. 4 und der zugehörigen Beschreibung angegeben. In Frage kommen hier z. B. das p21CIP1/WAF1 Gen (Brown, J. P., W. Wei, and J. M. Sedivy. 1997. Bypass of senescence after disruption of p21CIP1/WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts. Science 277, no. 5327: 831) oder Rb/p16INK4a (Kiyono, T., S. A. Foster, J. I. Koop, J. K. McDougall, D. A. Galloway, and A. J. Klingelhutz. 1998. Both Rb/p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells [see comments]. Nature 396, no. 6706: 84).Furthermore, cells can also be immortalized using the constructs according to the invention in connection with suitable 'gene targeting technologies' by decoupling endogenous growth-regulating genes (oncogenes) from their endogenous promoters at a suitable point by transient introduction of constructs according to the invention. An example of this is given below in Fig. 4 and the associated description. Possible here are z. B. the p21 CIP1 / WAF1 gene (Brown, JP, W. Wei, and JM Sedivy. 1997. Bypass of senescence after disruption of p21CIP1 / WAF1 gene in normal diploid human fibroblasts. Science 277, no. 5327: 831) or Rb / p16 INK4a (Kiyono, T., SA Foster, JI Koop, JK McDougall, DA Galloway, and AJ Klingelhutz. 1998. Both Rb / p16INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells [see comments]. Nature 396, no. 6706: 84).

"Gene-Targeting"-Technologien bezeichnen Methoden, mit denen über homologe Rekombination in prokaryoten oder eukaryoten Zel­ len gezielt endogene Gene inaktiviert ("Knock-Out") oder Nuk­ leinsäurekonstrukte an definierte Stellen des zellulären Genoms (oder an definierten Stellen extrachromosomaler Elemente) eingeführt werden können ("Knock-In")."Gene targeting" technologies refer to methods with which via homologous recombination in prokaryotic or eukaryotic cells len specifically endogenous genes inactivated ("knock-out") or nuc linseic acid constructs at defined locations in the cellular genome  (or at defined locations of extrachromosomal elements) can be introduced ("Knock-In").

Primäre somatische Zellen, die erfindungsgemäß transient immor­ talisiert wurden, können für Zelltherapiezwecke und für die in vitro Züchtung von Geweben oder Organen genutzt werden. Nach der notwendigen Expansionsphase können die Zellen in vitro oder in vivo nach Transplantation in Patienten vollständig in einen nicht immortalisierten Zustand zurückversetzt werden. Der einzige genetische Unterschied zur Ursprungszelle ist eine nur wenige Basenpaare lange Rekombinase-Targetsequenz. Wenn die er­ findungsgemäßen Konstrukte in geeignete genomische Bereiche eingeführt worden sind, ist das zelluläre Expressionsmuster nach Entfernung der Konstrukte unverändert im Vergleich zum Ex­ pressionsmuster der Ursprungszelle.Primary somatic cells, which according to the invention are transiently immor talized, can be used for cell therapy purposes and for the in in vitro cultivation of tissues or organs can be used. To the necessary expansion phase, the cells can in vitro or in vivo after transplantation in patients completely into one non-immortalized state. The only genetic difference to the original cell is one only a few base pairs long recombinase target sequence. If he constructs according to the invention in suitable genomic regions has been introduced is the cellular expression pattern after removing the constructs unchanged compared to the Ex pressure pattern of the original cell.

Herstellung von transgenen bzw. Knock Out-Tieren und Zellinien: Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Konstrukte können transgene oder "Knock-Out"-Tiere hergestellt werden. In Verbindung mit immortalisierenden Genen, wie oben beschrieben, können z. B. Maus- oder Rattenstämme etabliert werden, aus denen sich tran­ sient immortalisierte Zellinien der unterschiedlichsten Zelltypen für experimentelle Zwecke etablieren lassen. Weiterhin können nach Herstellung transgener Tiere problemlos die verwendeten Selektionsmarkergene entfernt werden, was z. B. notwendig sein kann, um anschließend weitere Transgene ein­ zuführen. Die Entfernung der Selektionsgene kann dabei auch zeitsparend in vivo erfolgen.Production of transgenic or knock-out animals and cell lines: With the help of the constructs according to the invention, transgenic or "knock-out" animals. Combined with immortalizing genes as described above can e.g. B. Mouse or rat strains are established from which tran serves immortalized cell lines of the most varied Have cell types established for experimental purposes. Furthermore, transgenic animals can be produced without any problems the selection marker genes used are removed, which z. B. may be necessary to subsequently introduce further transgenes respectively. The selection genes can also be removed time-saving in vivo.

GentherapieGene therapy

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte ermöglicht außerdem die vollständige in vivo Excision bestimmter, nur für den Transfektions- oder Selektionsprozeß notwendiger, und unter Umständen später unerwünschter Vektorkomponenten. So können z. B. nach Transfektion der Konstrukte Selektionsmarkergene oder Gene retroviraler oder adenoviraler Vektoren wieder entfernt werden. The use of the constructs according to the invention enables also the full in vivo excision of certain, only for the transfection or selection process more necessary, and under Possibly later undesirable vector components. So can e.g. B. after transfection of the constructs selection marker genes or Genes of retroviral or adenoviral vectors removed become.  

Im folgenden werden zur Veranschaulichung der Erfindung einzel­ ne Ausführungsbeispiele anhand schematischer Abbildungen noch­ mals genauer dargestellt. In den Zeichnungen zeigen:The following are single to illustrate the invention ne exemplary embodiments based on schematic illustrations shown in more detail. The drawings show:

Abb. 1 vereinfachte schematische Darstellung eines für das In­ sertionsverfahren verwendbaren Nukleinsäure­ konstruktes in verallgemeinerten Begriffen; Fig. 1 simplified schematic representation of a nucleic acid construct usable for the insertion process in generalized terms;

Abb. 2 erstes Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu­ rekonstruktes; Fig. 2 first embodiment of a concrete nucleic acid reconstruct;

Abb. 3 zweites Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu­ rekonstruktes; Fig. 3 second embodiment of a concrete nucleic acid reconstruct;

Abb. 4 drittes Ausführungsbeispiel eines konkreten Nukleinsäu­ rekonstruktes. Fig. 4 third embodiment of a concrete nucleic acid reconstruction.

Abb. 1 zeigt in allgemeinen Begriffen eine schematische Dar­ stellung eines Nukleinsäurekonstruktes nach der Erfindung. Das Konstrukt besitzt flankierend zwei Target-Sequenzen (TS) für eine sequenzspezifische Rekombinase (Targetseq. spez. Rek). Beispiele hierfür sind das Cre-Rekombinase kodierende Gen, flankiert von loxP-Targetsequenzen (aus P1-Coliphagen) oder auch das Flp-Rekombinase kodierende Gen flankiert von FRT- Targetsequenzen (aus S. cerevisiae). Das Gen für die target­ spezifische Rekombinase ist mit einem induzierbaren Promotor (ind. Prom) versehen, der die Expression der Rekombinase nur bei Vorhandensein eines bestimmten Induktors bewirkt. Das Ba­ sislevel der Expression sollte ohne Induktor faktisch gleich Null oder sehr niedrig sein. Besonders geeignet sind nach dem derzeitigen Stand der Technik Ecdysone oder Mifepristone induz­ ierbare Promotorsysteme. Weiterhin umfasst das Konstrukt zwischen den Target-Sequenzen wenigstens eine Transkription­ skassette, mit der eine bestimmte, durch den Einbau in das Kon­ strukt transiente Funktion verbunden ist. Fig. 1 shows in general terms a schematic representation of a nucleic acid construct according to the invention. The construct has two flanking target sequences (TS) for a sequence-specific recombinase (Targetseq. Spec. Rek). Examples of this are the gene coding for Cre recombinase, flanked by loxP target sequences (from P1-Coliphagen) or the gene coding for Flp recombinase flanked by FRT target sequences (from S. cerevisiae). The gene for the target-specific recombinase is provided with an inducible promoter (ind. Prom), which effects the expression of the recombinase only in the presence of a specific inducer. The base level of expression should be zero or very low without an inductor. According to the current state of the art, ecdysone or mifepristone inducible promoter systems are particularly suitable. Furthermore, the construct between the target sequences comprises at least one transcription cassette with which a specific function which is transient due to the incorporation into the construct is connected.

Es können weitere, hier nicht gesondert dargestellte Transkrip­ tionskassetten vorhanden sein. There may be other transcripts, not shown separately here tion cassettes.  

Abb. 2 zeigt in vereinfachter Darstellung ein erstes Aus­ führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk­ tes zur transienten Insertion eines humanen Telomerase Reverse Transkriptase-Gens (hTERT) unter Kontrolle eines Cytomegalievi­ rus-Promotors (CMV Pro.) Nach Induktion der unter Kontrolle eines Mifepristone induzierbaren Promotorsystems (MP ind. Pro.) stehenden Cre-Rekombinase-Gens (Cre-Rek.), wird das Konstrukt bis auf eine der beiden Cre-Targetsequenzen loxP enfernt. Fig. 2 shows a simplified representation of a first exemplary embodiment of a nucleic acid construct according to the invention for the transient insertion of a human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) under the control of a cytomegalovirus promoter (CMV Pro.) After induction of the promoter system inducible under the control of a mifepristone ( MP Ind. Pro.) Standing Cre recombinase gene (Cre-Rek.), The construct is removed except for one of the two Cre target sequences loxP.

Weitere AbkürzungenOther abbreviations

BGH: Bovine Growth Hormone
pa: Polyadenylierungssequenz
IRES: Internal Ribosome Entry Site
Neo: NeomycinresistenzgenBGH: Bovine Growth Hormone
pa: polyadenylation sequence
IRES: Internal Ribosome Entry Site
Neo: neomycin resistance gene

Abb. 3 zeigt in vereinfachter Darstellung ein zweites Aus­ führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk­ tes, das zur transienten Aktivierung der endogenen humanen Te­ lomerase Reverse Transkriptase (hTERT)-Expression über Inser­ tion eines konstitutiven Cytomegalievirus-Promotors (CMV Pro.) eingesetzt werden kann. Dabei wird die von zwei loxP Sequenzen umschlossene Kassette zwischen den endogenen Promotor und die endogene Kozak-Sequenz (endo. Kozak) des zellulären hTERT-Gens inseriert. Nach homologer Rekombination des Konstruktes er­ möglicht ein Neomycinresistenzgen (Neo) und ein als Negativse­ lektionsmarker außerhalb der homologen Sequenzen (homol. Seq.) liegendes Thymidinkinase-Gen (HTK) die Selektion geeigneter Zellklone. Eine Induktion mit Mifepristone (MP) führt zur Ex­ pression der Cre-Rekombinase (Cre-Rek.) und damit zur Entfer­ nung des Konstruktes. Die zurückbleibende 34 bp lange loxP- Sequenz zwischen endogenem Promoter und Kozak-Sequenz der hTERT beeinflußt die Expression der hTERT nicht. Bei dieser Strategie steht das Selektionsgen unter Kontrolle eines exogenen Promo­ tors. Fig. 3 shows a simplified representation of a second exemplary embodiment of a nucleic acid construct according to the invention which can be used for the transient activation of the endogenous human telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression via insertion of a constitutive cytomegalovirus promoter (CMV Pro.). The cassette enclosed by two loxP sequences is inserted between the endogenous promoter and the endogenous Kozak sequence (endo. Kozak) of the cellular hTERT gene. After homologous recombination of the construct, a neomycin resistance gene (Neo) and a thymidine kinase gene (HTK) lying outside the homologous sequences (homologous sequence) as a negative selection marker enable the selection of suitable cell clones. Induction with Mifepristone (MP) leads to the expression of the Cre recombinase (Cre-Rek.) And thus to the removal of the construct. The remaining 34 bp loxP sequence between the endogenous promoter and the Kozak sequence of the hTERT does not influence the expression of the hTERT. In this strategy, the selection gene is under the control of an exogenous promoter.

Weitere AbkürzungenOther abbreviations

Pro.: Promoter
TS: Transkriptionsterminationssequenz
Ind. Pro.: Induzierbarees Promotersystem
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: Polyadenylierungssequenz
SV40 Pro.: Simian Virus 40 PromoterPro .: Promoter
TS: transcription termination sequence
Ind. Pro .: Inducible promoter system
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: polyadenylation sequence
SV40 Pro .: Simian Virus 40 promoter

Abb. 4 zeigt in vereinfachter Darstellung ein drittes Aus­ führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruk­ tes, das zur transienten Inaktivierung eines zellulären Gens verwendet wird. Über homologe Rekombination wird die von zwei loxP Sequenzen umschlossene Kassette zwischen den endogenen Promotor (endo. Pro.) und die endogene Kozak-Sequenz (endo. Ko­ zak) des Zielgens inseriert. Die Insertion des Konstruktes inkl, geeigneter Transkriptionsterminationssequenzen entkoppelt den endogenen Promotor vom Zielgen und verhindert damit dessen Expression. Statt dessen wird, nach homologer Rekombination des Konstruktes ein Neomycinresistenzgen (Neo) mit exogener Kozak- sequenz (exo. Kozak) unter Kontrolle des endogenen Promoters exprimiert und ermöglicht damit die hocheffiziente Selektion geeigneter Zellklone. Eine Induktion mit Mifepristone (MP) führt zur Expression der Cre-Rekombinase (Cre-Rek.) und damit zur vollständigen Entfernung des Konstruktes aus allen Zellen. Die zurückbleibende 34 bp lange loxP-Sequenz zwischen endogenem Promoter und Kozak-Sequenz des Zielgens beeinflußt die Expres­ sion des Zielgens nicht. Fig. 4 shows a simplified representation of a third exemplary embodiment of a nucleic acid construct according to the invention, which is used for the transient inactivation of a cellular gene. The cassette enclosed by two loxP sequences is inserted between the endogenous promoter (endo. Pro.) And the endogenous Kozak sequence (endo. Ko zak) of the target gene via homologous recombination. The insertion of the construct including suitable transcription termination sequences decouples the endogenous promoter from the target gene and thus prevents its expression. Instead, after homologous recombination of the construct, a neomycin resistance gene (Neo) with an exogenous Kozak sequence (exo. Kozak) is expressed under the control of the endogenous promoter and thus enables the highly efficient selection of suitable cell clones. Induction with Mifepristone (MP) leads to the expression of the Cre recombinase (Cre-Rek.) And thus to the complete removal of the construct from all cells. The remaining 34 bp loxP sequence between the endogenous promoter and the Kozak sequence of the target gene does not affect the expression of the target gene.

Weitere AbkürzungenOther abbreviations

TS: Transkriptionsterminations­ sequenz
Ind. Pro.: Induzierbares Promotersystem
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: PolyadenylierungssequenzTS: Transcription termination sequence
Ind. Pro .: Inducible promoter system
BGH: Bovine Growth Hormone
pA: polyadenylation sequence

Beispiel für eine transiente Immortalisierung von Zellen mit Hilfe eines spezielle NukleinsäurekonstruktsExample of a transient immortalization of cells with With the help of a special nucleic acid construct

Zur transienten Immortalisierung primärer Zellen wurde das Kon­ strukt aus Abb. 2 wie folgt hergestellt:
For the transient immortalization of primary cells, the construct from Fig. 2 was produced as follows:

  • 1. Die codierende Sequenz der hTERT wurde aus einer cDNA-Library kloniert, für die Herstellung des Konstruktes über LD-PCR am­ plifiziert und über Cla I und Not I in pIRESneo (Clontech GmbH, Heidelberg) kloniert. Anschließend wurden die Not I und EcoR I Schnittstellen durch Not I/EcoR I-Verdau, blunten und Religation zerstört. Nach gleichem Schema wurde zusätzlich auch die Nsi I-Schnittstelle zerstört.1. The coding sequence of hTERT was from a cDNA library cloned, for the production of the construct via LD-PCR on plicated and via Cla I and Not I in pIRESneo (Clontech GmbH, Heidelberg) cloned. Subsequently, the Not I and EcoR I interfaces through Not I / EcoR I digestion, flowered and religation destroyed. According to the same scheme additionally the Nsi I interface destroyed.
  • 2. Die codierende Sequenz der Cre-Rekombinase wurde über PCR aus dem Plasmid 705-Cre (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) amplifiziert und über Hind III und Apa I in den Vek­ tor pGene V5-His (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert.2. The coding sequence of the Cre recombinase was determined via PCR the plasmid 705-Cre (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) and amplified via Hind III and Apa I in the Vek tor pGene V5-His (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Netherlands).
  • 3. Die Expressionskassette aus 1) einschließlich CMV-Promoter, hTERT, IRES, NeoR und Polyadenylierungsstelle wurde über LD- PCR amplifiziert und mittels TA-Kloning in pCRXL-TOPO (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert. Die Entfernung aller Restriktionsschnittstellen in 3'- Richtung des Inserts zwischen EcoR I und Nsi I erfolgte über einen Partialverdau mit EcoR I/Nsi I mit nachfolgendem Blun­ ten und anschließender Religation.3. The expression cassette from 1) including the CMV promoter, hTERT, IRES, NeoR and polyadenylation site was identified via LD PCR amplified and by TA cloning in pCRXL-TOPO (Invitrogen, Groningen, Netherlands) cloned. The removal of all restriction sites in 3'- The direction of the insert between EcoR I and Nsi I was over partial digestion with EcoR I / Nsi I followed by blun ten and subsequent religation.
  • 4. Die pGene V5-His/Cre-Kassette aus 2) wurde über LD-PCR am­ plifiziert und über TA-Kloning in pCRXL-TOPO kloniert.4. The pGene V5-His / Cre cassette from 2) was analyzed by LD-PCR on plicated and cloned into pCRXL-TOPO via TA cloning.
  • 5. Die Sequenz von 0-3000 aus pSwitch (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Niederlande) wurde LD-PCR am­ plifiziert und über TA-Kloning in pCRXL-TOPO kloniert. Alle Schnittstellen zwischen Kpn I und Spe I wurden durch Kpn I/­ Spe I-Verdau, Blunten und nachfolgende Religation zerstört.5. The sequence from 0-3000 from pSwitch (GeneSwitch expression system, Invitrogen, Groningen, Netherlands) was LD-PCR on plicated and cloned into pCRXL-TOPO via TA cloning. All Interfaces between Kpn I and Spe I were established by Kpn I / Spe I digestion, blunting and subsequent religation destroyed.
  • 6. Die pGene V5-His/Cre-Kassette aus 4) wurde über EcoR I in das Konstrukt aus 3) umkloniert.6. The pGene V5-His / Cre cassette from 4) was transferred via EcoR I in the construct from 3) was cloned.
  • 7. Die pSwitch-Kassette aus 5) wurde über Nsi I in das Konstrukt aus 6) umkloniert.7. The pSwitch cassette from 5) was inserted into the construct via Nsi I. from 6) cloned.
  • 8. Die Transkriptionseinheit für die Ampicillinresistenz wurde über PCR aus pGene V5-His amplifiziert und über Not I in das Konstrukt aus 7) kloniert.8. The transcription unit for ampicillin resistance was amplified via PCR from pGene V5-His and via Not I into the Construct from 7) cloned.
  • 9. Die loxP-flankierte Kassette aus pSVKeo (wurde freundlicher­ weise von A. F. Stewart, Heidelberg, zur Verfügung gestellt) wurde über PCR amplifiziert und über Mlu I und Apa I in pCRXL (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert. 9. The loxP-flanked cassette made of pSVKeo (became friendlier provided by A. F. Stewart, Heidelberg) was amplified via PCR and via Mlu I and Apa I in pCRXL (Invitrogen, Groningen, Netherlands) cloned.  
  • 10. Das Konstrukt aus 9) wurde über 'ET-Kloning' (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) in das Konstrukt aus 10 umkloniert. Dazu wurden Primer partiell homolog zu den LoxP- sites verwendet.10. The construct from 9) was via 'ET cloning' (Zhang, Y., 1998, Nature Genetics, 20, 123-128) into the construct from 10 cloned. For this purpose, primers were partially homologous to the LoxP sites used.
  • 11. Die Transkriptionseinheit für die Ampicillinresistenz wurde über Not I-Verdau und Religation aus dem Konstrukt aus 11 entfernt.11. The transcription unit for ampicillin resistance was on Not I digestion and religation from the construct from 11 away.

Eine Linearisierung des kompletten Konstruktes aus 12) zu Transfektionszwecken ist über Sfi I möglich.A linearization of the complete construct from 12) too Transfection purposes is possible via Sfi I.

Claims (20)

1. Nukleinsäurekonstrukt, das folgende Bestandteile umfasst:
  • a) eine Transkriptionskassette, enthaltend eine Rekombinase kodierende Sequenz unter Kontrolle eines induzierbaren Promotorsystems;
  • b) wenigstens eine ein weiteres Gen kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines konstitutiven, gewebespezifischen oder induzierbaren Promotorsystems;
  • c) je eine 5'-flankierende und eine 3'-flankierende natürliche oder künstliche Rekombinase-Targetsequenz.
1. Nucleic acid construct comprising the following components:
  • a) a transcription cassette containing a recombinase coding sequence under the control of an inducible promoter system;
  • b) at least one sequence encoding a further gene under the control of a constitutive, tissue-specific or inducible promoter system;
  • c) a 5'-flanking and a 3'-flanking natural or artificial recombinase target sequence.
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Polyadenylierungs­ sequenz enthält. 2. Nucleic acid construct according to claim 1, characterized characterized in that there is at least one polyadenylation sequence contains.   3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase eine Cre-Rekombinase aus dem P1 Coliphagen und ist und die Target-Sequenzen loxP- Sequenzen sind.3. Nucleic acid construct according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the recombinase is a Cre recombinase the P1 Coliphagen and is and the target sequences loxP- Are sequences. 4. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase eine Flp-Rekombinase aus S. cerevisiae ist und die Target-Sequenzen frt-Sequenzen sind.4. Nucleic acid construct according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the recombinase is a Flp recombinase S. cerevisiae and the target sequences are frt sequences. 5. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das induzierbare Promotorsystem für die Rekombinase ein Tetracyclin, Ecdysone oder Mifepristone induzierbares Promotorsystem ist.5. Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 4, characterized in that the inducible promoter system for the recombinase a tetracycline, ecdysone or mifepristone inducible promoter system. 6. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die das weitere Gen kodierende Sequenz eine Telomerase reverse Transkriptase, SV40 large T- Antigen oder ein anderes immortalisierendes Gen kodierende Sequenz ist.6. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 5, characterized in that the coding for the other gene Sequence of a telomerase reverse transcriptase, SV40 large T- Encoding antigen or another immortalizing gene Sequence is. 7. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in einer der Transkriptionskassetten eine IRES-Sequenz und wenigstens ein weiteres Gen eingebracht ist, das unter Kontrolle des in dieser Kassette vorhandenen Promotors steht.7. Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 6, characterized in that in one of the Transcription cassettes an IRES sequence and at least one another gene is introduced that is under the control of the in this Cassette existing promoter is available. 8. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eines der weiteren Gene ein Selektionsmarkergen ist, vorzugsweise ein Neomycinresistenzgen oder ein Zeozinresistenzgen.8. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 7, characterized in that one of the other genes Is a selection marker gene, preferably a neomycin resistance gene or a zeocin resistance gene. 9. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Transkriptionskassette mit einer Rekombinase-Antisense-Sequenz oder einem Rekombinase-Ribozym unter Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotorsystems und vorzugsweise eine Polyadenylierungssequenz enthält. 9. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 8, characterized in that there is also an Transcription cassette with a recombinase antisense sequence or a recombinase ribozyme under the control of one constitutive or inducible promoter system and preferably contains a polyadenylation sequence.   10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich eine Transkriptionskassette mit einer Suizidgen-Sequenz, vorzugsweise kodierend für Thymidinkinase oder Diphterie-Toxin, unter Kontrolle eines induzierbaren Promotorsystems sowie vorzugsweise eine Polyadenylierungssequenz enthält.10. nucleic acid construct according to one of claims 1 to 9, characterized in that there is also an Transcription cassette with a suicide gene sequence, preferably coding for thymidine kinase or diphtheria toxin, under the control of an inducible promoter system as well preferably contains a polyadenylation sequence. 11. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich in 5'-Richtung der 3'-flankierenden Rekombinase-Targetsequenz eine oder mehrere Transkriptions-Terminator-Sequenzen oder andersartige Stop- Sequenzen enthält.11. Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 10, characterized in that it is additionally in the 5 'direction of the 3'-flanking recombinase target sequence one or more Transcription terminator sequences or other types of stop Contains sequences. 12. Vektor, enthaltend das Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass er abgeleitet ist aus
einem Plasmid, insbesondere einem "High Copy" Plasmid
einem Cosmid
einem Bacterial Artificial Chromosome (BAC)
einem Bacteriophagen
einem viralen Vektor, vorzugsweise adenoviralen oder retroviralen Ursprungs.12. Vector containing the nucleic acid construct according to one of claims 1 to 11, characterized in that it is derived from
a plasmid, in particular a "high copy" plasmid
a cosmid
a bacterial artificial chromosome (BAC)
a bacteriophage
a viral vector, preferably of adenoviral or retroviral origin. 13. Verfahren zur transienten Insertion fremder genetischer Elemente in Genome oder extrachromosomale genetische Elemente prokaryotischer und eukaryotischer Zellen umfassend folgende Schritte:
  • 1. Herstellung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 12;
  • 2. Transfektion des Nukleinsäurekonstrukts oder eines damit erzeugten Vektors in eine prokaryote oder eukaryote Zelle
  • 3. Induktion der Rekombinaseaktivität mit Hilfe des Induktors für das die Rekombinaseexpression kontrollierende induzierbare Promotorsystem zu einem gewählten späteren Zeitpunkt.
13. A method for the transient insertion of foreign genetic elements into genomes or extrachromosomal genetic elements of prokaryotic and eukaryotic cells, comprising the following steps:
  • 1. Preparation of a nucleic acid construct according to one of claims 1 to 12;
  • 2. Transfection of the nucleic acid construct or a vector generated therewith into a prokaryote or eukaryote cell
  • 3. Induction of the recombinase activity with the aid of the inductor for the inducible promoter system controlling the recombinase expression at a selected later point in time.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (3) in vitro oder in vivo durchgeführt wird.14. The method according to claim 13, characterized in that Step (3) is carried out in vitro or in vivo. 15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die transiente Insertion eine transiente Immortalisierung primärer somatischer Zellen, vorzugsweise mit Hilfe der Telomerase Reverse Transkriptase oder SV40 large T-Antigen ist.15. The method according to claim 13 or 14, characterized in that the transient insertion is a transient immortalization primary somatic cells, preferably using the Telomerase reverse transcriptase or SV40 large T antigen. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt nackt als DNA oder RNA in die Zelle transfiziert wird.16. The method according to any one of claims 13 to 15, characterized characterized in that the nucleic acid construct is naked as DNA or RNA is transfected into the cell. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt innerhalb eines Vektors nach Anspruch 13 eingeführt wird.17. The method according to any one of claims 13 to 15, characterized characterized in that the nucleic acid construct within a Vector according to claim 13 is introduced. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig mit oder nach Schritt (3) die Expression eines in dem Nukleinsäurekonstrukt vorhandenen Suizidgens induziert wird.18. The method according to any one of claims 13 to 17, characterized characterized in that with or after step (3) the Expression of one present in the nucleic acid construct Suicide gene is induced. 19. Prokaryotische oder eukaryotische Zellen, ausgenommen humane embryonale Zellen, transfiziert mit einem Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12.19. Prokaryotic or eukaryotic cells, except human embryonic cells transfected with a Nucleic acid construct according to one of claims 1 to 12. 20. Transgenes Tier, Zellen enthaltend, die Nukleinsäure­ konstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfassen.20. Transgenic animal, containing cells, the nucleic acid constructs according to any one of claims 1 to 12.
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