DE19942149A1

DE19942149A1 - Process for the expression of exogenous sequences in mammalian cells

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Publication number: DE19942149A1
Application number: DE1999142149
Authority: DE
Inventors: Daniele Zink
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2001-03-15
Also published as: AU7415800A; WO2001018189A3; WO2001018189A9; WO2001018189A2

Abstract

The invention relates to a method for expressing exogenous sequences in mammalian cells depending on the functional architecture of the genome in the nucleus of the mammalian cell. The invention specifically relates to a method for expressing transgenic and proviral sequences in mammalian cells, wherein the sequences are specifically localized in the active compartment of the nucleus of the mammalian cell. The invention further relates to a method for expressing exogenous sequences in mammalian cells, wherein the sequences are specifically integrated into the DNA of the inactive compartment of the nucleus of the mammalian cells. The invention also relates to a method for identifying regulatory sequences or other sequences that promote a stable localization or integration of sequences to be expressed in the active compartments of the nucleus of a mammalian cell. Also, the invention relates to the use of the inventive method for producing transgenic animals, for producing tissues and organs for the purpose of transplantation and to the use of the inventive method in gene therapy.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression exogener Sequenzen in Abhängigkeit von der funktionellen Architektur des Genoms im Kern von Säugerzellen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Expression von transgenen und proviralen Sequenzen in Säugerzellen, wobei die Sequenzen gezielt im aktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle lokalisiert werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Expression von exogenen Sequenzen in Säugerzellen, bei dem die Sequenzen gezielt in DNA des inaktiven Kompartiments des Kerns der Säugerzellen integriert werden. Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Identifizierung von regulatorischen oder anderen Sequenzen, die eine stabile Lokalisation bzw. Integration zu exprimierender Sequenzen in aktiven Kompartimenten des Kerns einer Säugerzelle fördern. The present invention relates to a method for expressing exogenous sequences in Dependence on the functional architecture of the genome in the nucleus of mammalian cells. The invention particularly relates to a method for the expression of transgenic and proviral sequences in mammalian cells, the sequences being targeted in the active Compartment of the nucleus of the mammalian cell can be localized. The invention also relates a method for the expression of exogenous sequences in mammalian cells, in which the Sequences targeted in DNA of the inactive compartment of the nucleus of the mammalian cells to get integrated. The invention further relates to methods for identifying regulatory or other sequences that provide stable localization or integration promote expressing sequences in active compartments of the nucleus of a mammalian cell.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Erzeugung transgener Tiere, zur Erzeugung von Geweben und Organen für Zwecke der Transplantation sowie den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Gentherapie.The invention further relates to the use of the method according to the invention in the Production of transgenic animals, for the production of tissues and organs for the purposes of Transplantation and the use of the method according to the invention in gene therapy.

Die Expression exogener Sequenzen, und hierbei insbesondere die Langzeitexpression, ist ein zentrales Problem in verschiedenen Gebieten der Biotechnologie und der biomedizini schen Forschung. Dies gilt besonders in Bezug auf Gentherapie, das Design transgener Tiere sowie retrovirale Erkrankungen. Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, daß die Genome von Säugern innerhalb des Zellkerns in höher geordneten Kompartimenten organisiert sind. So wurde jetzt überraschend gefunden, daß zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Kompartimenten unterschieden werden kann, und daß auch die Expression integrierter exogener Sequenzen dieser funktionellen Organisation von Säuger genomen unterliegt. Der bislang weitgehend unbekannte Einfluß der Genomarchitektur auf die Expression von Genen wurde jetzt erstmals gezielt untersucht, und Strategien für effiziente Langzeitexpression von Transgenen im Hinblick auf gentherapeutische Ansätze und das Design transgener Tiere wurden, basierend auf den Ergebnissen, entwickelt.The expression of exogenous sequences, and here in particular the long-term expression, is a central problem in various areas of biotechnology and biomedicine research. This is especially true with regard to gene therapy, the design of transgenic Animals and retroviral diseases. The invention is based on the observation that the genomes of mammals within the cell nucleus in higher order compartments are organized. It has now surprisingly been found that between transcriptional active and inactive compartments can be distinguished, and that also Expression of integrated exogenous sequences of this functional organization in mammals genome is subject. The hitherto largely unknown influence of genome architecture on the expression of genes has now been specifically investigated for the first time, and strategies for efficient long-term expression of transgenes with regard to gene therapy approaches and the design of transgenic animals was developed based on the results.

Das Verständnis der funktionellen Architektur von Zellkernen ist heute ein zentrales Problem der Zellbiologie. Dabei ist die Frage, wie Säugergenome innerhalb von Zellkernen funktionell organisiert sind, von besonderem Interesse. Obwohl dieses Problem seit vielen Jahren diskutiert worden ist, sind keine experimentellen Ergebnisse bekannt geworden, die in zuverlässiger Weise auf Prizipien der funktionellen Organisation hinweisen. Umso über raschender ist es, daß jetzt zum ersten Mal gezeigt werden konnte, wie Säugergenome in Bezug auf wichtige Kernfunktionen organisiert sind. Aus diesen Erkenntnissen konnten vielfältige nützliche Anwendungen in den Bereich Gentherapie und dem Design transgener Tiere entwickelt werden.Understanding the functional architecture of cell nuclei is a key issue today Cell Biology Problem. The question is how mammalian genomes within cell nuclei are functionally organized, of particular interest. Although this has been a problem for many No experimental results have become known for years point out principles of functional organization in a reliable manner. All the more about It is surprising that it was now possible to show for the first time how mammalian genomes in Are organized in relation to important core functions. From these findings diverse useful applications in the field of gene therapy and the design of transgenic Animals are developed.

Die unten beschriebenen Beobachtungen sind in Abb. 1 in veranschaulichender Weise zusammengefaßt. Da jetzt erstmals der Einfluß der funktionellen Genomorganisation auf die Expression von Transgenen aufgeklärt werden konnte, besteht jetzt die Möglichkeit, reproduzierbare und wirksame Langzeitexpression von Transgenen zu realisieren.The observations described below are illustratively summarized in Fig. 1. Since the influence of the functional genome organization on the expression of transgenes has now been elucidated, it is now possible to realize reproducible and effective long-term expression of transgenes.

Frühere Untersuchungen an mitotischen Chromosomen wiesen auf eine funktionelle Kompartimentierung von Säugergenomen hin, die einen deutlichen Zusammenhang mit den bereits bekannten Bandenmustern und deren spezifischen Isochor-Zusammensetzungen aufweist. Eine Korrelation von Isochoren von GC-armen und GC-reichen Familien mit G-/C- bzw. R-Banden konnte bereits vor einigen Jahren mittels in situ-Hybridisierung bestätigt werden. Obwohl weitere Hinweise dafür diskutiert wurden, daß die klassische Bandenstruktur, die nur an mitotischen Chromosomen beobachtet wird, für die Genom organisation in Bezug auf wichtige Kernfunktionen wie Replikation und Transkription von Bedeutung ist, gab es bislang keine konkreten Anhaltspunkte im Zusammenhang mit der Substruktur von Chromosomenterritorien, also den Kernäquivalenten von mitotischen Chromosomen. Vielmehr wurden verschiedene und teilweise gegensätzliche Modelle diskutiert, so daß die Bedeutung der sich in den Bandenmustern widerspiegelnden Organi sation von mitotischen Chromosomen für die funktionelle Organisation des Genoms bis heute unklar war. Jetzt konnte erstmals gezeigt werden, daß Säugergenome funktionell in höher geordnete Kernkompartimente organisiert sind. DNA-Sequenzen innerhalb eines jeden Kompartiments replizieren in spezifischen S-Phasestadien. Höher geordnete Kompartimente, die sich unmittelbar im Anschluß an die Mitose auftauen, bleiben während sämtlicher Interphasestadien stabil, und das organisatorische Prinzip wird klonal vererbt. Die Kompartimente höherer Ordnung werden durch die parallele Ausrichtung von polaren Chromosomenterritorien aufgebaut. Polare Chromosomenterritorien konzentrieren früh replizierende R-Banden- bzw. spät replizierende G-/C-Banden-DNA an verschiedenen subterritorialen Positionen.Previous studies on mitotic chromosomes indicated a functional one Compartmentalization of mammalian genomes that have a clear connection with the already known band patterns and their specific isochor compositions having. A correlation of isochors from GC poor and GC rich families with G- / C- and R-bands were able to use in situ hybridization a few years ago beeing confirmed. Although further evidence has been discussed that the classic Band structure, which is only observed on mitotic chromosomes, for the genome organization in relation to important core functions such as replication and transcription of Meaning, there were no concrete indications in connection with the Substructure of chromosome territories, i.e. the core equivalents of mitotic ones Chromosomes. Rather, different and sometimes opposing models were created discussed, so that the meaning of the organi reflected in the band patterns sation of mitotic chromosomes for the functional organization of the genome was unclear today. It has now been shown for the first time that mammalian genomes function in higher-order core compartments are organized. DNA sequences within one replicate each compartment in specific S-phase stages. Higher order Compartments that thaw immediately after mitosis remain stable during all interphase stages, and the organizational principle becomes clonal inherited. The higher order compartments are determined by the parallel alignment of polar chromosome territories. Concentrate polar chromosome territories early replicating R band or late replicating G / C band DNA on various subterritorial positions.

Diverse Merkmale der höher geordneten Zellkernkompartimente, wie Replikationstiming oder die Acetylierungsgrade von Histon H4, zeigen, daß perinukleäre, perinukleoläre und kleinere interne Kompartimente die Bereiche des Genoms beherbergen, die in die G- und C-Banden von mitotischen Chromosomen organisiert sind (siehe auch Abb. 1). Ein großes zusammenhängendes Kompartiment innerhalb des Kerninneren umfaßt die Sequen zen der R-Banden, wie u. a. durch in situ-Hybridisierung gezeigt werden konnte. Nur inner halb dieses Kompartiments ist das Chromatin bei der Auflösungsgrenze der Lichtmikros kopie transkriptionell kompetent und transkriptionell aktiv.Various features of the higher-order nuclear compartments, such as replication timing or the degree of acetylation of histone H4, show that perinuclear, perinucleolar and smaller internal compartments harbor the regions of the genome that are organized into the G and C bands of mitotic chromosomes (see also Fig . 1). A large coherent compartment within the core interior comprises the sequences of the R bands, as could be shown, inter alia, by in situ hybridization. Only within this compartment is the chromatin transcriptionally competent and transcriptionally active at the resolution limit of the light microscopy.

Zwecks Klärung der Frage, ob Kompartimente, die DNA-Sequenzen mit einem ähnlichen zeitlichen Replikationsverlauf umfassen, tatsächlich reproduzierbar nach der Mitose etabliert werden und während sämtlicher nachfolgender Interphasestadien stabil bleiben, wurde DNA verschiedener Zellinien und Primärzellen von Mensch, Maus und Hamster während der S-Phase Puls-markiert. Die Untersuchungen wurden mit den folgenden Zell typen durchgeführt: primäre menschliche diploide Fibroblasten (Human Diploid Fibro blasts, HDFs), HeLa S6-Zellen, menschliche Neuroblastom-Zellen (SH-EP N14), CHO- Zellen (Chinese Hamster Ovary) und C2C12-Mausmyoblasten. Die Pulsmarkierung wurde mit BrdU (Bromdesoxyuridin) oder Cy3-dUTP (wurde mikroinjiziert) durchgeführt. Die Zellen wurden 30 Minuten nach Zugabe der modifizierten Nukleotide fixiert, um typische S-Phasemuster zu erhalten. Das Ergebnis ist in Abb. 2, linke Spalte, gezeigt. Bezüglich der S-Phasemuster wurde die Klassifikation von O'Keefe et al. (1992, J. Cell Biol. 116: 1095-1110) beibehalten und fünf verschiedene Mustertypen definiert, die eine geordnete zeitliche Abfolge während des Verlaufs der S-Phase wiedergeben. Typ I zeigt hunderte von kleinen Foci (ungefähr 300 nm im Durchmesser), verteilt über die DNA innerhalb des Kerninneren. DNA-Sequenzen, die in den nukleären und nukleolären Peripherien lokalisiert sind, und kleinere Akkumulationen von spätreplizierendem Chromatin innerhalb des Kerninneren (siehe Typ IV und V) sind nicht markiert. Der durch das Typ I-Muster besetzte Kernraum wird im folgenden als "inneres Kompartiment" betrachtet. Die in Abb. 2 gezeigten Ergebnisse bestätigen für alle Zelltypen die Beobachtung, daß DNA-Sequenzen mit einem definierten Replikationstiming während der S-Phase spezifische Kernräume besetzen. Auf diese Weise werden höher geordnete Kern kompartimente errichtet, die DNA mit einem ähnlichen zeitlichen Replikationsablauf umfassen, z. B. umfaßt das innere Kompartiment die früh replizierenden DNA-Sequenzen. Ein Vergleich mit dem Ergebnis einer Pulsmarkierung von Zellen, die nicht sofort, sondern erst nach einer Wachstumsperiode von 1-5 Tagen nach Markierung fixiert wurden, bestätigte, daß die Kernkompartimente, die DNA mit einem ähnlichen Replika tionstiming umfassen, auch in nicht-S-Phase-Zellen stabil beibehalten werden.In order to clarify the question of whether compartments comprising DNA sequences with a similar temporal replication course are actually reproducibly established after mitosis and remain stable during all subsequent interphase stages, DNA from various cell lines and primary cells from humans, mice and hamsters was Phase pulse marked. The investigations were carried out with the following cell types: primary human diploid fibroblasts (HDFs), HeLa S6 cells, human neuroblastoma cells (SH-EP N14), CHO cells (Chinese Hamster Ovary) and C2C12 cells. Mouse myoblasts. Pulse labeling was done with BrdU (bromodeoxyuridine) or Cy3-dUTP (was micro-injected). The cells were fixed 30 minutes after addition of the modified nucleotides in order to obtain typical S-phase patterns. The result is shown in Fig. 2, left column. Regarding the S-phase pattern, the classification by O'Keefe et al. (1992, J. Cell Biol. 116: 1095-1110) and defined five different types of patterns which represent an ordered chronological sequence during the course of the S phase. Type I shows hundreds of small foci (approximately 300 nm in diameter) distributed over the DNA inside the core. DNA sequences located in the nuclear and nucleolar peripheries and minor accumulations of late replicating chromatin within the core interior (see types IV and V) are not marked. The core space occupied by the type I pattern is considered in the following as an "inner compartment". The results shown in Fig. 2 confirm the observation for all cell types that DNA sequences with a defined replication timing occupy specific core spaces during the S phase. In this way, higher-order core compartments are built that include DNA with a similar temporal replication process, for. B. The inner compartment comprises the early replicating DNA sequences. A comparison with the result of pulse labeling of cells which were not fixed immediately but only after a growth period of 1-5 days after labeling confirmed that the core compartments, which comprise DNA with a similar replication timing, also in non-S- Phase cells are kept stable.

Um zusätzliche Bestätigung für die klonale Vererbung der Kernkompartimentierung zu erhalten, wurden ergänzende Experimente mit IdU (Ioddesoxyuridin)/CldU (Chlordesoxy uridin)-Doppelpulsmarkierung durchgeführt. Auch die auf diese Weise erhaltenen Ergeb nisse bestätigten, daß die Kernkompartimente, die DNA-Sequenzen mit einem ähnlichen Replikationstiming umfassen, sofort nach der Mitose gemäß dem in der vorhergehenden Interphase vorhandenen Muster eingerichtet werden. Ähnliche Kompartimentierungsmuster (IdU-Typ I-Muster mit CIdU-Typ III-V-Mustern) waren auch nach mindestens zwei Mitosen 69 h nach anfänglicher IdU-CIdU-Markierung zu beobachten. Da nach diesem Zeitraum einzelne Replikations-gelabelte Chromosomenterritorien beobachtet werden konnten, zeigten die Ergebnisse auch, wie einzelne Chromosomenterritorien, aufgebaut aus DNA, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der S-Phase repliziert, zu der höheren Ordnung der Kernkompartimente beitragen. Einzelne Territorien zeigen eine polare Organisation mit während der S-Phase (IdU-markiert) früh replizierender DNA, geclustert in subterritorialen Posititionen, die innerhalb des Kerninneren lokalisiert sind, und in späteren 5-Phasestadien (CIdU-markiert) replizierender DNA, geclustert in subterritorialen Positionen, die in den nukleären oder nukleolären Peripherien lokalisiert sind. Die Aus richtung der polaren Territorien läßt die höhere Ordnung der Kernkompartimente entstehen (siehe auch Abb. 1).In order to obtain additional confirmation of the clonal inheritance of the core compartment, additional experiments with IdU (iododeoxy-uridine) / CldU (chlorodeoxyoxy-uridine) double-pulse labeling were carried out. The results obtained in this way also confirmed that the core compartments, which comprise DNA sequences with a similar replication timing, are set up immediately after mitosis according to the pattern present in the previous interphase. Similar compartmentalization patterns (IdU type I pattern with CIdU type III-V patterns) were also observed after at least two mitoses 69 hours after the initial IdU-CIdU labeling. Since individual replication-labeled chromosome territories could be observed after this period, the results also showed how individual chromosome territories, built up from DNA that replicates at different times during the S phase, contribute to the higher order of the core compartments. Individual territories show a polar organization with DNA replicating early during the S phase (IdU-labeled), clustered in subterritorial positions that are located within the core interior, and in later 5-phase stages (CIdU-labeled) replicating DNA, clustered in subterritorial Positions located in the nuclear or nucleolar peripheries. The orientation of the polar territories gives rise to the higher order of the core compartments (see also Fig. 1).

Zwecks Klärung der Frage, ob zu spezifischen chromosomalen Banden gehörende DNA zu verschiedenen höher geordneten Kernkompartimenten beiträgt, wurden in situ-Hybridisie rungsexperimente in Kombination mit Cy3-dUTP-Replikationsmarkierung durchgeführt. Als Probe für die in situ-Hybridisierung wurde die H3-Isochor-Fraktion menschlicher DNA (Saccone et al. (1996), Gene 174: 85-94) verwendet. Die H3-Fraktion hybridisiert üblicher weise mit einer Untergruppe von R-Banden an menschlichen mitotischen Chromosomen (Saccone et al., supra). Im Rahmen der hier beschriebenen Untersuchungen wurde eine spezifische Hybridisierung mit sämtlichen R-Banden beobachtet, weshalb diese Fraktion sich besonders gut als Marker im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eignet. Da die Probe ein spezifischer Marker für DNA in R-Banden ist, wurde sie mit replikati onsmarkierten Kernen von HeLa- und SH-EP N14-Zellen hybridisiert. Das Hybridisie rungssignal war über das gesamte innere Kompartiment verteilt, aber von den äußeren Kompartimenten und den Kompartimenten der späten Replikation ausgeschlossen. Diese Daten bestätigten, daß die DNA in R-Banden das innere Kompartiment bildet. Hiermit konnte erstmals eine klare Korrelation zwischen der Organisation von Säugergenomen während der Interphase und der Bandenorganisation von mitotischen Chromosomen gezeigt werden.To clarify the question of whether DNA belongs to specific chromosomal bands contributing to various higher order core compartments were in situ hybridization tion experiments in combination with Cy3-dUTP replication labeling. The H3 isochoric fraction of human DNA was used as a sample for the in situ hybridization (Saccone et al. (1996) Gene 174: 85-94). The H3 fraction hybridizes more commonly wise with a subset of R bands on human mitotic chromosomes (Saccone et al., Supra). In the course of the investigations described here, a specific hybridization with all R bands was observed, which is why this fraction is particularly suitable as a marker in connection with the present invention. Since the sample is a specific marker for DNA in R bands, it was replicated with on-labeled nuclei of HeLa and SH-EP N14 cells hybridized. The hybridisie signal was distributed throughout the inner compartment, but from the outer Compartments and the compartments of late replication excluded. This Data confirmed that the DNA forms the inner compartment in R bands. Herewith was able to establish a clear correlation between the organization of mammalian genomes for the first time shown during the interphase and band organization of mitotic chromosomes become.

Zwecks Überprüfung, ob transkriptionell kompetentes Chromatin tatsächlich auf bestimmte Kernkompartimente beschränkt ist, wurden Replikations-gelabelte Kerne mit Antiserum R 232/8, welches hyperacetylierte Isoformen von Histon H4 erkennt, angefärbt. Ein Ver gleich des Replikationsmarkierungsmusters und der nukleären Verteilung von hyper acetylierten Histon H4-Isoformen zeigte eine klare Korrelation. Hyperacetylierte Histon H4-Isoformen wurden im gesamten inneren Kompartiment detektiert, konnten aber nicht in peripheren und spät-replizierenden Kompartimenten beobachtet werden. Da die trans kriptionelle Kompetenz der Genomkompartimente ein wichtiges Merkmal in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften darstellt, wurde die Analyse auf vier Zelltypen von drei Spezies erstreckt. Bei allen Zelltypen konnte die gleiche Korrelation zwischen Kernkom partimenten, die durch Replikationslabeling sichtbar gemacht wurden, und der nukleären Verteilung von hyperacetylierten Histon H4-Isoformen beobachtet werden. Hyperacetylierte Isoformen von Histon H4 sind auf das innere Kompartiment beschränkt. For the purpose of checking whether transcriptionally competent chromatin is actually specific Core compartments were restricted to replication-labeled nuclei with antiserum R 232/8, which recognizes hyperacetylated isoforms of histone H4, stained. A ver equal to the replication marker pattern and the nuclear distribution of hyper Acetylated histone H4 isoforms showed a clear correlation. Hyperacetylated histone H4 isoforms were detected in the entire inner compartment, but could not in peripheral and late-replicating compartments are observed. Since the trans Critical competence of the genome compartments is an important characteristic in terms of Representing their functional properties, analysis was based on four cell types out of three Species stretches. The same correlation between nuclear com portions that were made visible by replication labeling and the nuclear Distribution of hyperacetylated histone H4 isoforms can be observed. Hyperacetylated Histone H4 isoforms are confined to the inner compartment.

Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß nicht nur die Transkriptionskompetenz, sondern auch der Prozeß der Transkription selbst Gegenstand der höher geordneten Kern kompartimentierung ist. Replikationsmarkierungen mit FITC-dUTP in Kombination mit Puls-Markierung mit BrUTP (wird in nascente RNA eingebaut) und Immunofärbung von inkorporiertem BrUTP zeigten, daß nur das innere Kompartiment transkriptionell aktiv ist. Innerhalb der äußeren Kompartimente war keine erwähnenswerte BrUTP-Markierung sicht bar. Somit konnte gezeigt werden, daß das die früh replizierenden R-Bandensequenzen umfassende innere Kompartiment sowohl das transkriptionell kompetente als auch das aktiv transkribierte Chromatin beherbergt (siehe Abb. 1). Die oben erwähnten und andere zellbiologischen Techniken sind dem Fachmann bekannt und können der einschlä gigen Literatur entnommen werden; bspw. Zink et al. (1998) Hum. Genet. 102: 241-251.Overall, the results suggest that not only transcriptional competence, but also the process of transcription itself is the subject of the higher-order core compartmentalization. Replication labels with FITC-dUTP in combination with pulse labeling with BrUTP (is incorporated in nascent RNA) and immunostaining of incorporated BrUTP showed that only the inner compartment is transcriptionally active. No noteworthy BrUTP labeling was visible within the outer compartments. It could thus be shown that the inner compartment comprising the early replicating R band sequences harbors both the transcriptionally competent and the actively transcribed chromatin (see Fig. 1). The above-mentioned and other cell biological techniques are known to the person skilled in the art and can be found in the relevant literature; for example, zinc et al. (1998) Hum. Genet. 102: 241-251.

Somit konnte jetzt erstmals die funktionelle Kompartimentierung von Säugergenomen während der Interphase charakterisiert werden. Die Daten zeigen, daß ein spezifisches Muster der räumlichen Genomkompartimentierung während aller Interphasestadien vor handen ist und klonal vererbt wird. Verschiedene Kompartimente umfassen DNA-Sequen zen, die zu verschiedenen Chromosomenbanden während der Mitose gehören. R-Banden sequenzen bilden ein zusammenhängendes Kompartiment innerhalb des Kerninneren, welches das transkriptionell kompetente Chromatin beherbergt. Nachweisbare nascente RNA-Synthese ist auf das innere Kompartiment beschränkt. Abb. 1 faßt die Korrela tionen zwischen der funktionellen höher geordneten Kerngenomarchitektur und der Chromosomenorganisation während der Mitose und Interphase zusammen. Die funktionell verschiedenen höher geordneten Kompartimente werden durch die Ausrichtung polarer Chromosomenterritorien mit Clustern von früh replizierender DNA, die zum Kerninneren gerichtet sind, und Clustern spät replizierender DNA, die in den nukleären oder nukleolären Peripherien lokalisiert sind, aufgebaut. Es ergibt sich somit folgendes Bild: Unterscheidbare Banden (in der Größenordnung von Mbp), die auf mitotischen Chromo somen alternieren, werden als unterscheidbare Domänen während der Interphase (auch als subohromosomale Foci, SF, bezeichnet) erhalten, werden aber innerhalb der Territorien reorganisiert. Die unterscheidbaren SF clustern innerhalb eines Territoriums und lassen hierdurch eine polare Organisation dieser Struktur in der Größenordnung von mehreren zehn bis mehreren hundert Mbp entstehen. Die Ausrichtung dieser polaren Territorien erzeugt höher geordnete funktionelle Genomkompartimente (Größenordnung Giga-Basen paare) innerhalb der Kerne von Säugerzellen.The functional compartmentalization of mammalian genomes during the interphase has now been characterized for the first time. The data show that a specific pattern of spatial genomic compartmentalization is present during all interphase stages and is inherited clonally. Different compartments include DNA sequences belonging to different chromosome bands during mitosis. R-band sequences form a coherent compartment within the core that houses the transcriptionally competent chromatin. Detectable nascent RNA synthesis is limited to the inner compartment. Fig. 1 summarizes the correlations between the functional higher order nuclear genome architecture and the chromosome organization during mitosis and interphase. The functionally different, higher-order compartments are constructed by aligning polar chromosome territories with clusters of early replicating DNA directed towards the core and clusters of late replicating DNA located in the nuclear or nucleolar peripheries. This results in the following picture: Distinct bands (in the order of Mbp) that alternate on mitotic chromosomes are obtained as distinguishable domains during the interphase (also referred to as subohromosomal foci, SF), but are reorganized within the territories. The distinguishable SF clusters within a territory, thereby creating a polar organization of this structure in the order of several tens to several hundred Mbp. The alignment of these polar territories creates higher-order functional genome compartments (in the order of magnitude of giga base pairs) within the nuclei of mammalian cells.

Da jetzt erstmals die Prinzipien der funktionellen Architektur innerhalb der Zellkerne aufgedeckt wurden, können exogene Sequenzen gezielt in Säugergenome integriert und in gewünschten funktionellen Kompartimenten lokalisiert werden. Auch ist es jetzt erstmals möglich, die Frage, wie die Expression von integrierten exogenen Sequenzen durch die Genomarchitektur beeinflußt wird, zu analysieren und sich die oben beschriebenen Beobachtungen für die gezielte Expression integrierter Sequenzen in den Bereichen Gen therapie, Design von transgenen Tieren und retroviralen Krankheiten sowie für die Konstruktion optimierter retroviraler und lentiviraler Vektoren zunutze zu machen.Now for the first time the principles of functional architecture within the cell nuclei uncovered, exogenous sequences can be specifically integrated into mammalian genomes and into desired functional compartments can be localized. It is also the first time possible the question of how the expression of integrated exogenous sequences by the Genome architecture is influenced, analyze and look at those described above Observations for the targeted expression of integrated sequences in the areas of genes therapy, design of transgenic animals and retroviral diseases as well as for Take advantage of the construction of optimized retroviral and lentiviral vectors.

Im Zusammenhang mit transgenen Tieren wird häufig beobachtet, daß nur ein gewisser Anteil der transgenen Tiere oder Zellen die Transgene exprimiert. Die Ursachen für diese gravierende Einschränkung bei der Erzeugung transgener Tiere liegt hauptsächlich in der stochastischen Inaktivierung von Transgenen, bei der der Integrationslokus sowie die Kopienanzahl des Trangens eine Rolle spielen. Auch in der Gentherapie gibt es bislang viele Probleme, die auf mangelnder Kenntnis über funktionelle Genomorganisation basieren. So war keiner der bisher über 200 klinischen Versuche mit gentherapeutischen Ansätzen bisher erfolgreich (siehe z. B. Cristal (1995) Science 270: 404-410; Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242). Im Zusammenhang mit der Behandlung monogeni scher Krankheiten sind Integrationsvektoren besonders attraktiv, da diese Systeme theoretisch eine stabile Langzeitexpression erlauben. Die hauptsächlich eingesetzten Integrationsvektorsysteme, die für Gentherapie entwickelt wurden, leiten sich von Retro viren und in jüngster Zeit auch von Lentiviren ab. Jedoch ist auch unter Verwendung retroviraler bzw. lentiviraler Vektoren stabile Langzeitexpression ein großes Problem. In connection with transgenic animals it is frequently observed that only a certain Proportion of transgenic animals or cells that express the transgenes. The causes of this a major limitation in the production of transgenic animals lies mainly in the stochastic inactivation of transgenes, in which the integration locus as well as the Number of copies of the strand play a role. So far, there has also been gene therapy many problems due to lack of knowledge about functional genome organization based. So was none of the more than 200 clinical trials with gene therapy so far Approaches have so far been successful (see e.g. Cristal (1995) Science 270: 404-410; Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242). In connection with the treatment monogeni Integration diseases are particularly attractive because of these systems theoretically allow stable long-term expression. The main ones used Integration vector systems developed for gene therapy are derived from Retro viruses and, more recently, lentiviruses. However, it is also in use retroviral or lentiviral vectors stable long-term expression a big problem.

Eingeführte Gene werden allmählich in vivo inaktiviert, wenn retrovirale Vektoren ein gesetzt werden. Die Gründe hierfür konnten bislang nicht geklärt werden. Bevor das Problem der Inaktivierung (sei es durch de novo-Methylierung oder Chromatinrestruk turierung, wobei es sich in beiden Fällen nur um reine Hypothesen handelt) nicht gelöst ist, bleibt die erfolgreiche Gentherapie mit retroviralen Vektoren unmöglich.Introduced genes are gradually inactivated in vivo when retroviral vectors are inserted be set. The reasons for this have not yet been clarified. Before that Inactivation problem (be it through de novo methylation or chromatin restriction) turing, both of which are purely hypotheses) not resolved successful gene therapy with retroviral vectors remains impossible.

Untersuchungen von Retroviren verschiedener Säugerspezien, einschließlich Mensch, haben gezeigt, daß der GC-Gehalt von DNA-Sequenzen an der Integrationsstelle dem GC-Gehalt stabil integrierter proviraler Sequenzen entspricht. Während diese Phänomene bislang nicht erklärt werden konnten, können die oben beschriebenen Beobachtungen über die höher geordnete Kompartimentierung der Genome innerhalb der Zellkerne eingesetzt werden, um retrovirale und lentivirale Vektorsysteme für die Gentherapie zu optimieren, da die Ver teilung von GC-reichen und GC-armen Sequenzen mit der Bandenstruktur von Chromo somen und der korrespondierenden räumlichen Ordnung der Genome zu korrelieren scheint. Vor allen Dingen können die Erkenntnisse genutzt werden, um Vektoren auf ihre Lokalisation im Kern zu charakterisieren und sie daraufhin zu optimieren.Studies of retroviruses from various mammalian species, including humans demonstrated that the GC content of DNA sequences at the integration site is the GC content stably integrated proviral sequences. While these phenomena have not so far The observations described above can be explained above orderly compartmentalization of the genomes within the cell nuclei are used to optimize retroviral and lentiviral vector systems for gene therapy since the ver Division of GC-rich and GC-poor sequences with the band structure of Chromo somen and the corresponding spatial order of the genomes seems. Above all, the insights can be used to point to their vectors Characterize localization in the core and then optimize it.

Eine Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Langzeitexpression von exogenen Sequenzen in Säugerzellen bereitzustellen, das für verschiedene biotechnologische und bio medizinische Bereiche nützlich ist und die Probleme des Standes der Technik, die ins besondere auf den Gebieten der Gentherapie und des Designs transgener Tiere beobachtet wurden, zu überwinden.One task is to develop a method for long-term expression of exogenous To provide sequences in mammalian cells that are suitable for various biotechnological and bio medical fields is useful and the problems of the prior art that ins particularly observed in the fields of gene therapy and the design of transgenic animals have been overcome.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Expression von exogenen Sequenzen in Säugerzellen, worin die zu exprimierenden Sequenzen gezielt im aktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle lokalisiert werden.One solution to this problem is to provide a method for expression of exogenous sequences in mammalian cells, in which the sequences to be expressed are targeted localized in the active compartment of the nucleus of the mammalian cell.

Wie oben beschrieben, befindet sich transkriptionell inaktives und inkompetentes Chromatin in Kompartimenten an der Kernperipherie und der Peripherie der Nukleoli sowie kleineren Kompartimenten im Kerninneren (siehe auch Abb. 1). Der Rest des Zellkerns wird von einem großen, zusammenhängenden Kompartiment ausgefüllt, das die transkriptionskompetente und transkriptionsaktive DNA enthält. Die unterschiedlichen Kompartimente werden direkt nach der Mitose etabliert und sind während der gesamten Interphase stabil. Unterschiedliche Merkmale des Chromatins in den verschiedenen Kompartimenten zeigen deutlich, daß diese aus den R- oder G- (und C-)Banden der mitoti schen Chromosomen aufgebaut werden. Im Rahmen der Erfindung handelt es sich bei dem "aktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle" somit um das in Abb. 1 veran schaulichte große, zusammenhängende Kompartiment, das die transkriptionskompetente und transkriptionsaktive DNA enthält und aus den GC-reichen R-Banden der mitotischen Chromosomen aufgebaut wird. Das aktive Kompartiment läßt sich wie oben beschrieben auch mittels konventioneller zellbiologischer Methoden und Nachweise eindeutig identi fizieren. Dabei ist das aktive Kompartiment insbesondere durch Typ I-Replikationsmuster, BrUTP-Anfärbung durch Pulsmarkierung, Anfärbung mit Antikörpern gegen hyper acetyliertes Histon H4 und Vorhandensein von R-Banden-Sequenzen, wie z. B. Alu- Sequenzen oder andere SINES (short interspersed repeats oder sequences) gekennzeichnet.As described above, transcriptionally inactive and incompetent chromatin is found in compartments at the core periphery and the periphery of the nucleoli as well as smaller compartments inside the core (see also Fig. 1). The rest of the cell nucleus is filled by a large, coherent compartment that contains the transcriptionally competent and transcriptionally active DNA. The different compartments are established immediately after mitosis and are stable throughout the interphase. Different characteristics of chromatin in the different compartments clearly show that these are built up from the R or G (and C) bands of the mitotic chromosomes. In the context of the invention, the "active compartment of the nucleus of the mammalian cell" is thus the large, coherent compartment illustrated in FIG. 1, which contains the transcriptionally competent and transcriptionally active DNA and from the GC-rich R bands of the mitotic chromosomes is built up. As described above, the active compartment can also be clearly identified using conventional cell biological methods and evidence. The active compartment is characterized in particular by type I replication patterns, BrUTP staining by pulse labeling, staining with antibodies against hyperacetylated histone H4 and the presence of R-band sequences such as e.g. B. aluminum sequences or other SINES (short interspersed repeats or sequences).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die zu exprimierenden exogenen Sequenzen in Kombination mit regulatorischen Sequenzen auf Säugerzellen übertragen, die eine stabile Lokalisation im aktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle und damit verbundene Langzeitexpression der zu exprimierenden exogenen Sequenzen gewährleisten. Dabei kann die Langzeitexpression nicht nur durch direkte Integration der exogenen Sequenzen in aktiven Kompartimenten, sondern auch durch Ein bringen exogener Sequenzen in inaktive Bereiche und anschließendes Wandern der aktivierten Gene in das aktive Kompartiment erreicht werden. (Siehe hierzu bspw. Brown et al. (1997) Cell 91: 84-854.)In a preferred embodiment of the method according to the invention, the expressing exogenous sequences in combination with regulatory sequences Mammalian cells transmit a stable localization in the active compartment of the nucleus the mammalian cell and the associated long-term expression of the exogenous to be expressed Ensure sequences. Long-term expression can not only be achieved through direct Integration of the exogenous sequences in active compartments, but also through Ein bring exogenous sequences into inactive areas and then migrate them activated genes can be reached in the active compartment. (See, for example, Brown et al. (1997) Cell 91: 84-854.)

Bei den regulatorischen Sequenzen handelt es sich bevorzugt um Promotor- und/oder Enhancersequenzen, die besonders bevorzugt viraler Herkunft sind. In besonders bevor zugten Ausführungsformen stammen die regulatorischen Sequenzen, die zusammen mit den zu exprimierenden exogenen Sequenzen auf Säugerzellen übertragen werden, von House keeping- oder konstitutiv exprimierten Genen. Andererseits stammen die regulatorischen Sequenzen bevorzugt von gewebespezifischen oder induzierbaren Genen.The regulatory sequences are preferably promoter and / or Enhancer sequences that are particularly preferably of viral origin. In especially before preferred embodiments, the regulatory sequences come together with the to be expressed on mammalian cells to be expressed by House keeping or constitutively expressed genes. On the other hand, there are the regulatory ones Sequences preferred of tissue-specific or inducible genes.

Bei den regulatorischen Sequenzen handelt es sich auch bevorzugt um Matrix-Anheftungs regionen (MAR) und Locus-Kontrollregionen (LCR).The regulatory sequences are also preferably matrix attachment regions (MAR) and locus control regions (LCR).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Expression von exogenen Sequenzen, worin die Sequenzen gezielt im aktiven Komparti ment des Kerns der Säugerzelle integriert werden und die zu exprimierenden exogenen Sequenzen in Kombination mit Sequenzen auf Säugerzellen übertragen werden, die eine homologe Rekombination mit endogenen Sequenzen im aktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle und damit verbundene Langzeitexpression der zu exprimierenden exogenen Sequenzen ermöglichen.In a further preferred embodiment, the invention relates to a method for Expression of exogenous sequences, in which the sequences are targeted in the active compartment ment of the nucleus of the mammalian cell and the exogenous to be expressed Sequences in combination with sequences are transferred to mammalian cells that have a homologous recombination with endogenous sequences in the active compartment of the nucleus the mammalian cell and the associated long-term expression of the exogenous to be expressed Enable sequences.

Dabei handelt es sich bei den Sequenzen, die eine homologe Rekombination mit endo genen Sequenzen im aktiven Kompartiment ermöglichen, insbesondere um SINES und besonders bevorzugt um Alu-Sequenzen, d. h. insbesondere die 300 bp-Konsensussequenz der Alu-DNA-Sequenzfamilie (siehe z. B. Singer (1982) Int. Rev. Cytol. 76: 67-112).These are the sequences that have a homologous recombination with endo enable gene sequences in the active compartment, especially around SINES and particularly preferably around aluminum sequences, i. H. especially the 300 bp consensus sequence the Alu-DNA sequence family (see e.g. Singer (1982) Int. Rev. Cytol. 76: 67-112).

Andere DNA-Elemente, die für die stabile Lokalisation von transgenen Sequenzen in aktiven Kernkompartimenten verwendet werden können, sind z. B. Matrix-Anheftungs regionen; hier seien die Hühnchen Lysozymgen Matrix-Anheftungsregionen, 3 kb-Frag ment, erwähnt (McKnight et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 6943-6947). Auch die Locuskontrollregionen (LCRs, Locus Control Regions) können eingesetzt werden, bspw. die β-Globin-LCR (Grosveld et al. (1987) Cell 51:975; Talbot et al. (1989) Nature 338:352), die mini-LCR (7,5 kb mit vier DNAase I hypersensitiven Bereichen) (Forrester et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 10159-10177) oder die humane CD2-Gen-LCR (2 kb 3' flankierende Region) (Festenstein et al. (1996) Science 271:1123). Natürlich sind auch Enhancersequenzen geeignet, als Beispiel sei hier der Mouse Muscle Creatine Kinase (MCK) Enhancer genannt (207 bp, Position -1256 bis -1050) (Jaynes et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 62-70).Other DNA elements necessary for the stable localization of transgenic sequences in active core compartments can be used, for. B. Matrix attachment regions; here are the chicken lysozyme gene attachment regions, 3 kb frag ment, mentioned (McKnight et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6943-6947). Also the locus control regions (LCRs) can be used, for example the β-globin LCR (Grosveld et al. (1987) Cell 51: 975; Talbot et al. (1989) Nature 338: 352), the mini-LCR (7.5 kb with four DNAase I hypersensitive areas) (Forrester et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 10159-10177) or the human CD2 gene LCR (2 kb 3 ' flanking region) (Festenstein et al. (1996) Science 271: 1123). Of course, too Enhancer sequences are suitable, for example the Mouse Muscle Creatine Kinase (MCK) enhancer (207 bp, position -1256 to -1050) (Jaynes et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 62-70).

Weiter sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens Promotoren von ubiquitär und konstitutiv exprimierten Genen (houskeeping Gene) geeignet, hier seien der Promotor des Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gens (Scharfmann et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630) und der Promotor des Mouse Phosphoglycerate Kinase-Gens (mPgK) (Bawden et al. (1995) Transgenic Res. 4: 87-104) als Beispiele erwähnt.Furthermore, promoters of ubiquitous and constitutively expressed genes (houskeeping genes) are suitable, here are the promoter of Dihydrofolate reductase (DHFR) gene (Scharfmann et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630) and the promoter of the mouse phosphoglycerate kinase gene (mPgK) (Bawden et al. (1995) Transgenic Res. 4: 87-104) are mentioned as examples.

Wie oben erwähnt, sind auch zelltyp- und gewebespezifische Elemente im Rahmen der Erfindung nützlich, hier beispielhaft zu nennen im Zusammenhang mit Myoblasten der MCK-Enhancer (Jaynes et al. (1988) supra) in Kombination mit dem Promotor des immediate early Gens des humanen Cytomegalovirus (hCMV) (Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895) und im Zusammenhang mit Milchdrüsengewebe der Promotor des Maus-Molkeproteins (Whey Acidic Protein, WAP) (Velander et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003-12007) und der Promotor des Schaf-13-Lacto globulingens (BLG) (Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133).As mentioned above, cell type and tissue-specific elements are also part of the Invention useful, to be mentioned here by way of example in connection with the myoblasts MCK enhancer (Jaynes et al. (1988) supra) in combination with the promoter of immediate early gene of human cytomegalovirus (hCMV) (Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895) and related to mammary tissue the promoter of the mouse whey protein (Whey Acidic Protein, WAP) (Velander et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12003-12007) and the sheep 13-lacto promoter globulingens (BLG) (Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133).

Virale Elemente, die im Rahmen der Erfindung bspw. eingesetzt werden können, sind der 5' LTR (Long Terminal Repeat) des Moloney Murine Leukemia Virus (MuLV) (Yao and Kurachi (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3357-3361), der 5' LTR des Rous Sarcoma Virus (RSV) Barr and Leiden (1991) Science 29: 1507-1509) und der 5' LTR (tat-reguliert) des Human Immunodeficiency Virus (HIV) (Parolin et al. (1996) Virology 222: 415-422).Viral elements that can be used in the context of the invention, for example, are 5 'LTR (Long Terminal Repeat) of Moloney Murine Leukemia Virus (MuLV) (Yao and Kurachi (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3357-3361), the 5 'LTR of Rous Sarcoma Virus (RSV) Barr and Leiden (1991) Science 29: 1507-1509) and the 5 'LTR (tat-regulated) Human Immunodeficiency Virus (HIV) (Parolin et al. (1996) Virology 222: 415-422).

Mit üblichen Klonierungstechniken und anderen molekularbiologischen Methoden ist der Fachmann bestens vertraut; die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens anwend baren Techniken sind auch einschlägigen Manuals zu entnehmen, bspw. dem Manual von Sambrook et al. (1989) A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor.With conventional cloning techniques and other molecular biological methods, the Expert very familiar; apply in the context of the inventive method Techniques can also be found in relevant manuals, e.g. the manual of Sambrook et al. (1989) A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor.

Die Aufgabe der Erfindung wird auch durch ein Verfahren zur Expression von exogenen Sequenzen in Säugerzellen gelöst, in dem die Sequenzen gezielt in DNA des inaktiven Kompartiments des Kerns der Säugerzellen integriert werden.The object of the invention is also achieved by a method for the expression of exogenous Sequences resolved in mammalian cells by targeting the sequences in inactive DNA Compartments of the nucleus of the mammalian cells are integrated.

Im Rahmen dieser Erfindung wird das inaktive Kompartiment, enthaltend transkriptionell inaktives und inkompetentes Chromatin, aus Kompartimenten an der Kernperipherie und der Peripherie der Nukleoli sowie kleineren Kompartimenten im Kerninneren gebildet, die aus den G- und C-Banden der mitotischen Chromosomen aufgebaut werden. Wie oben bereits erwähnt, kann das inaktive Kompartiment anhand diverser Merkmale identifiziert werden, insbesondere durch einen hohen Anteil an G/C-Bandensequenzen, lichtmikros kopisch nicht detektierbaren BrUTP-Einbau, geringem H4Ac-Grad und dem tpyischen TypIII-V-Replikationsmuster.In the context of this invention, the inactive compartment containing transcriptional inactive and incompetent chromatin, from compartments at the core periphery and the periphery of the nucleoli as well as smaller compartments inside the nucleus, the are built up from the G and C bands of the mitotic chromosomes. As above already mentioned, the inactive compartment can be identified on the basis of various characteristics are, especially due to a high proportion of G / C band sequences, light micros Copically undetectable BrUTP incorporation, low H4Ac level and the typical Type III-V replication pattern.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Expression von exogenen Sequenzen im inaktiven Kompartiment werden die zu exprimierenden Sequenzen in Kombination mit regulatorischen Sequenzen auf Säugerzellen übertragen, die eine stabile Expression nach Integration in Sequenzen des inaktiven Kompartiments des Kerns der Säugerzelle und damit verbundene Langzeitexpression der zu exprimierenden exogenen Sequenzen gewährleisten, übertragen. Bei den regulatorischen Sequenzen handelt es sich insbesondere um Promotor- und/oder Enhancer-Sequenzen, die bevorzugt viraler Herkunft sind. In besonderen Ausführungsformen des Verfahrens stammen die regulatorischen Sequenzen von gewebespezifischen oder induzierbaren Genen einerseits, oder von House keeping- oder konstitutiv exprimierten Genen anderseits. Besonders geeignet für die Expression im inaktiven Kompartiment sind die oben erwähnten Matrix-Anheftungs regionen und Locus-Kontrollregionen. In a preferred embodiment of the method for the expression of exogenous Sequences in the inactive compartment are the sequences to be expressed in Combination with regulatory sequences transferred to mammalian cells that are stable Expression after integration into sequences of the inactive compartment of the core of the Mammalian cell and associated long-term expression of the exogenous to be expressed Ensure sequences are transmitted. The regulatory sequences are especially around promoter and / or enhancer sequences, which are preferably of viral origin are. In particular embodiments of the method, the regulatory ones originate Sequences of tissue-specific or inducible genes on the one hand, or of House keeping or constitutively expressed genes on the other hand. Particularly suitable for the Expression in the inactive compartment are the matrix attachments mentioned above regions and locus control regions.

Da das Risiko einer insertionellen Mutagenese im Falle der Insertion exogener Sequenzen in endogene Sequenzbereiche mit geringer Gendichte deutlich geringer ist als bei Integration in genreiche Bereiche des Genoms, kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Form eingesetzt werden, daß die zu exprimierenden exogenen Sequenzen in Kombi nation mit Sequenzen auf Säugerzellen übertragen werden, die eine homologe Rekombi nation mit endogenen Sequenzen im inaktiven Kompartiment des Kerns der Säugerzelle ermöglichen und damit das Risiko einer insertionellen Mutagenese verringern, da die in inaktiven Kompartimenten vorhandenen G-IC-Banden-Sequenzen genarm sind.Because of the risk of insertional mutagenesis in the case of insertion of exogenous sequences in endogenous sequence areas with low gene density is significantly lower than in The method according to the invention can be integrated into genomic regions of the genome the form that the exogenous sequences to be expressed are used in combination nation with sequences transferred to mammalian cells that have a homologous recombination nation with endogenous sequences in the inactive compartment of the nucleus of the mammalian cell enable and thus reduce the risk of insertional mutagenesis, since the in inactive compartments existing G-IC band sequences are poor.

Bei den eine homologe Rekombination ermöglichenden Sequenzen kann es sich bspw. um LINES (Long Interspersed Repeats oder Sequences) handeln, z. B. um die 6400 bp Konsensussequeriz (oder Teile davon) der L1 DNA-Sequenzfamilie (Singer and Skowronski (1985) TIBS 10: 119-122).The sequences which make homologous recombination possible can be, for example Act LINES (Long Interspersed Repeats or Sequences), e.g. B. around 6400 bp Consensus sequence (or parts thereof) of the L1 DNA sequence family (Singer and Skowronski (1985) TIBS 10: 119-122).

Wie oben erwähnt, ist das erfindungsgemäße Verfahren der gezielten Lokalisation bzw. Integration exogener Sequenzen zwecks Langzeitexpression in Säugerzellen besonders nützlich für die Gentherapie. Aus diesem Grund handelt es sich bei den exogenen Sequenzen, die langzeitexprimiert werden, um retrovirale oder lentivirale Sequenzen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den exogenen Sequenzen um Sequenzen des Murine Leukemia Virus (MuLV) oder Human Immunodeficiency Virus (HIV-I).As mentioned above, the method of targeted localization or Integration of exogenous sequences for long-term expression especially in mammalian cells useful for gene therapy. For this reason, it is exogenous Sequences that are long term expressed to retroviral or lentiviral sequences. The exogenous sequences are particularly preferably sequences of the Murine Leukemia Virus (MuLV) or Human Immunodeficiency Virus (HIV-I).

Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Screening bzw. zur Charakterisierung proviraler Sequenzen nützlich eingesetzt werden. Wie oben erwähnt, ist gegenwärtig nichts darüber bekannt, wie Proviren im Zusammenhang mit Säugergenom architektur reguliert werden. Ein besseres Verständnis der proviralen Integration und Expression ist nicht nur wegen der großen klinischen Bedeutung von Viren wie HIV interessant, sondern gleichzeitig eine Voraussetzung für das Optimieren von Gentherapie vektoren. Hierzu muß zunächst die Lokalisation im Kern von stabil integrierten Wildtyp- Proviren bezüglich der funktionellen Genomkompartimente analysiert werden. Parallel hierzu kann die provirale Genexpression durch in situ-Hybridisierung an virale mRNA überwacht werden. Weiter kann, z. B. unter Einsatz des GC-armen Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) untersucht werden, ob Proviren innerhalb der GC-armen "silenced" Kompartimente ausnahmsweise exprimiert werden können, oder ob sie das Kompartiment wechseln, also Shuttle-artig in ein aktives Kompartiment "wandern", um exprimiert zu werden. Auf diese Weise können nicht nur zusätzlich wichtige Erkenntnisse bezüglich der für die Gentherapie wichtigen Proviren und retroviralen Vektoren gewonnen werden, für die Gentherapie nützliche Vektoren können auch verbessert und optimiert werden im Hinblick auf Lokalisierung und damit verbundene Expressionsoptimierung.Of course, the method according to the invention can also be used for screening or Characterization of proviral sequences can be used useful. As mentioned above, is currently nothing is known about how Proviren is related to the mammalian genome architecture to be regulated. A better understanding of proviral integration and Expression is not just because of the great clinical importance of viruses like HIV interesting, but at the same time a prerequisite for optimizing gene therapy vectors. For this, the localization in the core of stable integrated wild-type Proviren be analyzed with regard to the functional genome compartments. Parallel this can be done by proviral gene expression by in situ hybridization to viral mRNA be monitored. Further, e.g. B. using the GC-poor Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) to investigate whether proviruses are "silenced" within the GC-poor Compartments can be expressed exceptionally, or whether they are the compartment switch, ie shuttle-like, to "walk" into an active compartment in order to express become. In this way, not only additional important knowledge regarding the Proviren and retroviral vectors important for gene therapy are obtained for Vectors useful for gene therapy can also be improved and optimized in the With regard to localization and associated expression optimization.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von regulatorischen oder anderen (z. B. Alu) für die homologe Rekombination mit endogenen Sequenzen geeigneten Sequenzen, die eine stabile Lokalisation bzw. Integration zu exprimierender Sequenzen in aktiven Kompartimenten des Kerns einer Säugerzelle fördern, umfassend die Schritte:
The invention further relates to a method for identifying regulatory or other (e.g. Alu) sequences suitable for homologous recombination with endogenous sequences which promote stable localization or integration of sequences to be expressed in active compartments of the nucleus of a mammalian cell, comprising the Steps:

a) Transfer of a fusion of regulatory and / or for the homologous recombi nation with endogenous sequences suitable sequences with to be expressed exogenous sequences on mammalian cells, and
b) Localization of the integrated fusion in the cell nucleus using cell biological methods.

Bei den zellbiologischen Methoden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen und mit denen dieser vertraut ist, handelt es sich z. B. um in situ- oder in vivo-Hybridisierung (auch verstärkt), Bindung spezifischer Proteine an Sequenzen des Konstrukts, die durch Fluoreszenz, Lumeniszenz oder spezifische Antikörper, spezifische Enzymaktivität nach gewiesen werden können, wie z. B. Nachweis integrierter Sequenzen über spezifisch bindende GFP(green fluorescent protein)-Fusionsproteine oder GFP-Derivate mit anderen Spektren, in Kombination mit Replikationsmarkierung, BrUTP-Pulsmarkierung oder anderen Verfahren zum Nachweis nascenter RNA, Immunofärbung ganzer Kompartimente, Nachweis Kompartiment-spezifischer Sequenzen (Alu/LINE-Sequenzen, Isochor- Fraktionen), Nachweis der Kompartimente über spezifische, in vivo-visualisierbare Fusionsproteine. Die Expression der Fusion kann mittels Expressionsanalyse, geeigneter Reportergene, sowie quantitativer RT-PCR bestimmt werden.With the cell biological methods that are available to the expert and with who is familiar with this, it is z. B. to in situ or in vivo hybridization (also enhanced), binding of specific proteins to sequences of the construct by Fluorescence, lumeniscence or specific antibodies, specific enzyme activity after can be pointed such. B. Detection of integrated sequences over specific binding GFP (green fluorescent protein) fusion proteins or GFP derivatives with others Spectra, in combination with replication labeling, BrUTP pulse labeling or other methods for the detection of nascent RNA, immunostaining of entire compartments, Detection of compartment-specific sequences (Alu / LINE sequences, isochoric Fractions), detection of the compartments via specific, in vivo-visualisable Fusion proteins. Expression of the fusion can be more appropriate by means of expression analysis Reporter genes and quantitative RT-PCR can be determined.

Die oben erwähnten Methoden sind beispielsweise in folgenden Publikationen beschrieben:
Kurz et al.(1996) J. Cell Biol. 135: 1195-1202, im Zusammenhang mit in situ-Hybridi sierung; Wansink et al. (1993) J. Cell Biol. 122: 283-293, im Zusammenhang mit BrUTP- Pulsmarkierung; Robinett et al. (1996) J. Cell Biol. 135: 1685-1700, im Zusammenhang mit dem Nachweis über bindende Fusionsproteine; Zink et al. (1998) Hum. Genet. 102: 241-251, im Zusammenhang mit Replikationsmarkierung; Dobie et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6659-6664, im Zusammenhang mit der Expressionsanalyse.The methods mentioned above are described in the following publications, for example:
Kurz et al. (1996) J. Cell Biol. 135: 1195-1202, in connection with in situ hybridization; Wansink et al. (1993) J. Cell Biol. 122: 283-293, in connection with BrUTP pulse labeling; Robinett et al. (1996) J. Cell Biol. 135: 1685-1700, in connection with the detection of binding fusion proteins; Zink et al. (1998) Hum. Genet. 102: 241-251, related to replication labeling; Dobie et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6659-6664, in connection with expression analysis.

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Identifizierung von regulatorischen Sequenzen, die eine stabile Integration zu exprimierender Sequenzen im inaktiven Kompartiment des Kerns einer Säugerzelle fördern, umfassend die Schritte:
The invention further relates to a method for identifying regulatory sequences which promote stable integration of sequences to be expressed in the inactive compartment of the nucleus of a mammalian cell, comprising the steps:

a) Transfer of a fusion of regulatory sequences to be expressed exogenous sequences on mammalian cells, and
b) Localization of the fusion in the cell nucleus using cell biological methods.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Lokalisation integrierter exogener Sequenzen, insbesondere integrierter retroviraler oder lentiviraler Sequenzen, im aktiven Kompartiment oder im inaktiven Kompartiment des Kerns einer Säugerzelle mittels zell biologischer Methoden.The invention also relates to a method for localizing integrated exogenous Sequences, particularly integrated retroviral or lentiviral sequences, in the active Compartment or in the inactive compartment of the nucleus of a mammalian cell using cell biological methods.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, nützliche Verwendungen und Einsatzmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Verfahren aufzuzeigen.Another object of the invention is to provide useful uses and To show possible uses of the method according to the invention.

Diese und weitere Aufgaben werden durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Ver fahrens in der Erzeugung transgener Tiere gelöst. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur Erzeugung eines transgenen Tieres, das sich durch Expression eines Transgenprodukts in die Milch des Tieres auszeichnet. Eine weitere bevorzugte Verwendung besteht in der Verwendung zur Erzeugung transgener Tiere zur Gewinnung eines biomedizinischen Produkts bzw. zur Erzeugung von Geweben und Organen für Zwecke der Transplantation. Weiterhin kann das Verfahren nützlich eingesetzt werden zur gezielten Veränderung von Eigenschaften, z. B. der Behaarung, Milch zusammensetzung, Größe oder des Gewichts, transgener Tiere.These and other objects are achieved through the use of the invention driving in the production of transgenic animals. In particular, the invention relates to the Use of the method for producing a transgenic animal which is characterized by Expression of a transgenic product in the milk of the animal. Another preferred use is the use for the production of transgenic animals for Obtaining a biomedical product or for producing tissues and Organs for transplantation purposes. Furthermore, the method can be used usefully are used for the targeted change of properties, e.g. B. the hair, milk composition, height or weight, transgenic animals.

Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft in der Gentherapie zum Einsatz kommen. Ebenso nützlich ist die Verwendung des erfindungs gemäßen Verfahrens, bei dem regulatorische und/oder für die homologe Rekombination mit endogenen Sequenzen geeignete Sequenzen identifiziert werden, für die Herstellung und Verbesserung von Vektoren, insbesondere von Vektoren für die Gentherapie, geeignet. Gleiches gilt selbstverständlich für das Screenen von transgenen Tieren bzw. transgener Zellen im Zusammenhang mit der Herstellung transgener Tiere.As already mentioned, the method according to the invention can be particularly advantageous in the Gene therapy are used. The use of the invention is equally useful according to the method, in the regulatory and / or for the homologous recombination suitable sequences can be identified with endogenous sequences for the production and improvement of vectors, in particular vectors for gene therapy. The same naturally applies to the screening of transgenic animals or transgenic Cells related to the production of transgenic animals.

Der Fachmann ist mit den einschlägigen Methoden für die Übertragung von DNA- Sequenzen auf Säugerzellen vertraut. Auf dem Gebiet der Gentherapie bieten sich hier besonders die ex vivo- oder in vivo-Infektion mit rekombinanten Retro- oder Lentiviren an (Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Kafri et al. (1997) Nat. genet. 17: 314-317; Naldini et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-11388; Scharfmann et, al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630); Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242).The person skilled in the art is familiar with the relevant methods for the transfer of DNA Sequences familiar to mammalian cells. In the field of gene therapy there are here especially the ex vivo or in vivo infection with recombinant retro or lentiviruses (Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Kafri et al. (1997) Nat. well. 17: 314-317; Naldini et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11382-11388; Scharfmann et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4626-4630); Verma and Somia (1997) Nature 389: 239-242).

Auch Methoden in der Erzeugung transgener Tiere sind dem Fachmann bestens bekannt, hier insbesondere die Mikroinjektion von DNA in Vorkerne befruchteter Eizellen (Hammer et al. (1985) Nature 31: 680-683), die Injektion gentechnisch veränderter embryonaler Stammzellen (Es-Zellen) oder Zellen vergleichbaren Potentials in einen frühen Embryo (Ramirez-Solis and Bradley (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 528-533; Sims and First (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6143-6147), der Transfer von Kernen gentechnisch veränderter somatischer Zellen in entkernte Eizellen (Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813; Wolf et al. (1998) J. Biotechnol. 65: 99-110) und der Transfer von Kernen aus Zellen gentechnisch veränderter in vitro kultivierter Zellen in entkernte Eizellen (Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133; Wilmut et al. (1997) supra).Methods in the production of transgenic animals are also well known to the person skilled in the art, here in particular the microinjection of DNA into the nuclei of fertilized egg cells (Hammer et al. (1985) Nature 31: 680-683), the injection of genetically modified embryonic Stem cells (Es cells) or cells of comparable potential in an early embryo (Ramirez-Solis and Bradley (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 528-533; Sims and First (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6143-6147), the transfer of cores genetically altered somatic cells in cored egg cells (Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813; Wolf et al. (1998) J. Biotechnol. 65: 99-110) and the transfer of nuclei from cells genetically modified in vitro cultivated cells in enucleated egg cells (Schnieke et al. (1997) Science 278: 2130-2133; Wilmut et al. (1997) supra).

Claims

1. A method for the expression of exogenous sequences in mammalian cells, characterized in that the sequences are localized in the active compartment of the nucleus of the mammalian cell.

2. A method of expression according to claim 1, wherein those to be expressed exogenous sequences in combination with regulatory sequences on mammalian cells are transferred, which have a stable localization in the active compartment of the core of the Mammalian cell and associated long-term expression of the exogenous to be expressed Ensure sequences.

3. A method of expression according to claim 2, wherein the regulatory Sequences include promoter and / or enhancer sequences.

4. A method of expression according to claim 2 or 3, wherein the regula toric sequences of viral origin.

5. A method of expression according to any one of claims 2 to 4, wherein the regulatory sequences of housekeeping or constitutively expressed genes come.

6. A method of expression according to any one of claims 2 to 4, wherein the regulatory sequences of tissue-specific or inducible genes.

7. A method of expression according to any one of claims 2 to 4, wherein the regulatory sequences are matrix attachment regions (MAR) or of these come.

8. A method for expression according to any one of claims 2 to 4, wherein the regulatory sequences are locus control regions (LCR) or originate from these.

9. A method of expression according to claim 1, wherein those to be expressed exogenous sequences in combination with sequences are transferred to mammalian cells, which a homologous recombination with endogenous sequences in the active compartment of the Nucleus of the mammalian cell and the associated long-term expression of the to be expressed enable exogenous sequences.

10. A method of expression according to claim 9, wherein the in combination with Alu sequences transferred to the exogenous sequences to be expressed include.

11. Process for the expression of exogenous sequences in mammalian cells, characterized in that the sequences are targeted in DNA of the inactive compartment of the nucleus of mammalian cells.

12. A method of expression according to claim 11, wherein those to be expressed exogenous sequences in combination with regulatory sequences on mammalian cells will carry stable expression after integration into sequences of the inactive Compartments of the nucleus of the mammalian cell and associated long-term expression of the guarantee to express exogenous sequences.

13. A method of expression according to claim 12, wherein the regulatory Sequences include promoter and / or enhancer sequences.

14. A method for expression according to claim 12 or 13, wherein the regulatory sequences of viral origin.

15. A method for expression according to any one of claims 12 to 14, wherein the regulatory sequences of tissue-specific or inducible genes.

16. A method of expression according to any one of claims 12 to 14, wherein the regulatory sequences of housekeeping or constitutively expressed genes come.

17. A method of expressionio according to any one of claims 12 to 14, wherein the regulatory sequences are or are from matrix attachment regions (MAR) come.

18. A method for expression according to any one of claims 12 to 14, wherein the regulatory sequences are locus control regions (LCR) or originate from these.

19. A method of expression according to claim 11, wherein those to be expressed exogenous sequences in combination with sequences are transferred to mammalian cells, which is a homologous recombination with endogenous sequences in the inactive compartment of the nucleus of the mammalian cell and thus the risk of insertional Reduce mutagenesis.

20. A method of expression according to claim 19, wherein the in combination with sequences transferred to the exogenous sequences to be expressed include.

21. A method for expression according to one of the preceding claims, where the exogenous sequences are retroviral or lentiviral sequences acts.

22. A method for expression according to one of the preceding claims, where the exogenous sequences are sequences of the Murine Leukemia Virus (MuLV) or Human Immunodeficiency Virus (HIV-I).

23. A method for identifying regulatory sequences or sequences suitable for homologous recombination with endogenous sequences, e.g. B. Alu sequences that promote stable localization or integration of sequences to be expressed in active compartments of the nucleus of a mammalian cell, comprising the steps:

a) Transfer of a fusion of regulatory sequences or sequences suitable for homologous recombination with endogenous sequences, e.g. B. Alu sequences with expri ming exogenous sequences on mammalian cells and
b) Localization of the integrated fusion in the cell nucleus using cell biological methods.

24. A method for identifying regulatory sequences which promote stable integration of sequences to be expressed in the inactive compartment of the nucleus of a mammalian cell, comprising the steps:

a) transfer of a fusion of regulatory sequences with exogenous sequences to be expressed to mammalian cells and
b) Localization of the fusion in the cell nucleus using cell biological methods.

25. Method for localizing endogenous sequences in the active compartment or in the inactive compartment of the nucleus of a mammalian cell using cell biological Methods.

26. Method for localization of integrated exogenous sequences in particular integrated retroviral or lentiviral sequences, in the active compartment or in the inactive compartment of the nucleus of a mammalian cell using cell biological methods.

27. Use of the method according to any one of claims 1 to 22 in the Generation of transgenic animals.

28. Use according to claim 27, wherein the transgenic animal expression of a transgenic product in the milk of the animal.

29. Use according to claim 27 or 28 for obtaining a biomedicine product.

30. Use according to claim 27 for the production of tissues and organs for transplant purposes.

31. Use according to claim 27 for the targeted change of Eigen shafts, e.g. B. the hair, milk composition, size or weight.

32. Use of the method according to one of claims 1 to 22 in the Gene therapy.

33. Use of the method according to claim 23 for the production of Vectors, in particular vectors for gene therapy, for a method according to Claim 1 are suitable.

34. Use of the method according to claim 23 for screening together menhang with the production of transgenic animals.

35. Use of the method according to claim 24 for the production of Vectors, in particular vectors for gene therapy, for a method according to Claim 11 are suitable.