EP2102332A2 - Procédé d'amplification du vhc chez les aedes mosquitoes - Google Patents

Procédé d'amplification du vhc chez les aedes mosquitoes

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EP2102332A2
EP2102332A2 EP07872002A EP07872002A EP2102332A2 EP 2102332 A2 EP2102332 A2 EP 2102332A2 EP 07872002 A EP07872002 A EP 07872002A EP 07872002 A EP07872002 A EP 07872002A EP 2102332 A2 EP2102332 A2 EP 2102332A2
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EP
European Patent Office
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virus
mosquitoes
hcv
aedes
viral
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07872002A
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German (de)
English (en)
Inventor
Emmanuel Drouet
Yassine Rechoum
Florence Fouque
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Original Assignee
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite Joseph Fourier Grenoble 1, Institut Pasteur filed Critical Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Publication of EP2102332A2 publication Critical patent/EP2102332A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/60—New or modified breeds of invertebrates
    • A01K67/61—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic or polyploid
    • A01K67/65—Genetically modified arthropods
    • A01K67/68—Genetically modified insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to the identification of novel systems for the amplification of Hepatitis C virus (HCV).
  • HCV Hepatitis C virus
  • HCV hepatitis C virus
  • HCV Hepacivirus
  • Flaviviridae which are enveloped single stranded RNA viruses, among which are viruses responsible for major epidemic diseases such as Yellow Fever (YF), Dengue (DEN) and Dengue haemorrhagic fever (DHF), Japanese encephalitis (JE), St. Louis encephalitis (SLE), West NiIe fever (WN) and Hepatitis C (HC) to name only the most important ones.
  • YF Yellow Fever
  • DEN Dengue
  • DHF Dengue haemorrhagic fever
  • JE Japanese encephalitis
  • SLE St. Louis encephalitis
  • WN West NiIe fever
  • HC Hepatitis C
  • Flaviviruses are transmitted by insect vectors, according to very different epidemiological modalities. Some diseases are typically human (or primate-related) and never affect animals such as DEN and DHF; other infections are more zoonotic and more or less accidentally affect humans, such as JE, SLE and WN. Finally, some Flaviviruses can circulate epidemically in both human and animal populations (YF). These different epidemiological modalities nevertheless have common bases such as viral amplification in insect cells.
  • anti-HCV vaccine strategies are today based on two usual methods in the field: on the one hand recombinants Vaccinia or AAV (Adeno-Associated Virus); on the other hand, anti-HCV vaccine strategies are developed based on polypeptides derived from HCV proteins.
  • HCV-JFH1 allows the production of complete infectious viral particles (after transfection in Huh-7 cells). However, at present, the system is not suitable for large biomass production.
  • VLPs Virus Like Particles
  • PPs retroviral pseudo-types
  • the invention relates to a method of in vivo amplification of the hepatitis C virus (HCV) comprising the following steps: a / ingestion of the viral source by female mosquitoes of the genus Aedes; b / breeding of mosquitoes during the time necessary for the amplification of the virus.
  • HCV hepatitis C virus
  • the first step is to "pass" the virus into the mosquito in the most efficient way possible, in this case by ingestion.
  • the virus enters the stomach where it will cross the stomach wall, then disperse into the haemocele and reach different organs, such as the ovaries and salivary glands, where it is likely to multiply.
  • the virus can therefore be transmitted to subsequent generations of mosquitoes or to humans during a sting.
  • Mosquitoes of the genus Aedes are Diptera, Nematocera, family Culicidae, subfamily Culicinae, Tribe Aedini. Females are characterized by short palps and nonplumose antennas. In the context of the present invention, Aedes vexans and Aedes caspius species have been used.
  • the population used in the process comes from a rearing made from material (eggs, larvae or adults) taken directly from the field, in the privileged biotope of these two species.
  • the individuals used advantageously belong to the FO, Fl or F2 generations.
  • the contact between the viral source and the mosquitoes is by ingestion.
  • the viral source is conditioned using red blood cells for example sheep, possibly supplemented with ATP, to increase the palatability of female mosquitoes.
  • ingestion is done during a blood meal taken by female mosquitoes.
  • the ingestion is carried out using the technique of the gorgement.
  • This particularly effective technique is well known to entomologists and described for example in Fouque et al. (7).
  • a blood meal is offered to female mosquitoes in a throat which keeps the meal at 37 ° C.
  • the gorge is covered with a skin through which mosquitoes insert their proboscis and take the meal.
  • the viral source comprises a "native" virus (virulent), or advantageously attenuated.
  • a virulent virus replicates the infection and therefore offers a first-rate experimental model.
  • an attenuated virus is of particular interest in the production of vaccines or antibodies.
  • the viral load comes from a serum, advantageously of human origin, for example that of a chronic hepatitis carrier HCV genotype Ib.
  • the conventional title of such a serum is usually around 2 E 6 copies / ml.
  • the contacting should take place at least 1000 copies of the virus per mosquito, preferably 1500 copies of the virus per mosquito.
  • the second step of the method according to the invention consists in raising the mosquitoes for a determined period.
  • the breeding is carried out under controlled conditions, including temperature and humidity.
  • the duration of the breeding is determined according to the following criteria:
  • the amplification appears optimal between 15 and 30 days of breeding for the Aedes tested, with an average value advantageous a breeding time of about 20 days.
  • the recovery of the virus, especially in the form of viral particles, may require their extraction of mosquito tissue.
  • Preferred tissues are the ovaries and salivary glands.
  • the invention thus provides a method of amplifying HCV, taking place in vivo in specific mosquito species, giving results quite unexpected and remarkable.
  • the process according to the invention offers very promising prospects, including for the massive in vitro production of HCV.
  • the method according to the invention gives access to tissues, in particular of ovary or salivary gland, or Aedes cells, advantageously Ae cells. Caspius or vexans, carriers of HCV.
  • the invention also relates to a method for obtaining in vitro producer cells of HCV. It is then a question of cocultivating Aedes cells carrying HCV, obtained using the process according to the invention, and AP61 or C6 / 36 type cells.
  • the AP61 and C6 / 36 cells have been described by Germi et al. (9). These are mosquito cell lines, in particular Aedes pseudoscutellaris, continuous and well defined. Co-culture aims to transfer HCV into these cell lines.
  • the invention therefore also relates to in vitro HCV-producing mosquito cells obtained from this process.
  • FIG. 1 corresponds to a gel illustrating the detection of viral RNA in HCV infected Aedes vexans mosquitoes, after extraction of the total RNAs and standard RT-PCR with revelation of the DNA with ethidium bromide.
  • FIG. 2 illustrates the detection of the viral RNA by qRT-PCR, after extraction of the total RNAs of Aedes mosquitoes (vexans + caspius) after 24 days of breeding.
  • the standard curve was performed on a log dilution of a known title viral RNA extract (120,000 copies / run at 1,200 copies / run) (Fig. 2A).
  • positive controls are identified by (OJ, T +), and individuals who may have replicated HCV after 24 days by (D20).
  • For each sample, are indicated (i) the number of cycles at the end of which the viral RNA was detected (ii) and its initial concentration by compared to the standard curve.
  • the curve of FIG. 2B shows the evolution of the signal detection for each sample.
  • FIG. 3 illustrates the detection of the viral RNA by qRT-PCR, after extraction of the total RNA from Culex mosquitoes (pipiens) after 28 days of breeding.
  • the standard curve was carried out on a logarithmic dilution of an RNA extract. virus of known title (800,000 copies / run at 8,000 copies / run) (Fig. 3A). For each sample, are indicated (i) the number of cycles at the end of which the viral RNA was detected (ii) as well as its initial concentration relative to the standard curve.
  • the curve of FIG. 3B shows the evolution of the signal detection for each sample.
  • the individuals tested come from a breeding made from mosquitoes (eggs, larvae and adults) collected on the ground in the urban area of Marseille for the species Culex pipiens and in the reserve of the Tour du Valat in the Camargue for species Aedes vexans and Aedes caspius. These farms were carried out at the ENSAM premises located at the Domaine du Merle, Salon de elle. These farms are made in a classic insectarium, with breeding standards. The larvae are fed with yeast and fish feed and the adults are fed a sucrose solution. The blood meals of Culex and Aedes are composed of red blood cells washed with sheep, the purpose of the washing being to eliminate the interference of the elements of the blood.
  • the viral solution containing HCV virus (serum of patient with chronic hepatitis at 2 E 6 copies / ml) is transported by special transporter to the L2 + where are placed mosquitoes.
  • the viral solution is provided by the Laboratory of Molecular and Structural Virology of the Faculty of Medicine of Grenoble.
  • the viral solution is stored in the freezer at -80 ° C. of the L2 +. 4. Preparation of the infected blood solution
  • the batches of females are kept at a constant temperature of about 28 ° C and with a controlled humidity of at least 70%. Each day, the females are fed with cotton soaked in a 10% glucose solution deposited on the metal cage. Spawning lodges are wetted through the cage with a squeeze bottle.
  • mosquitoes are sacrificed by placing the metal cage in the cold. The mosquitoes are then placed in 1.5 ml tubes, identified and returned to the freezer until the RNA extraction step before PCR. Negative witnesses, drunk on non-viremic blood are also sacrificed. The lot of mosquitoes, sacrificed on the day of OJ and put in the freezer at -80 ° C., constitute the positive controls OJ of gorging, extraction and amplification of the viral RNA. // - Search for viral RNA
  • the primers used as well as the probe (for qPCR) were designed for amplification of the conserved region of the 5 'non-coding end of the viral genome.
  • the 2CH sense primer (5'-AAC TAC TGT CTC CTC GCA GAA-3 ') (SEQ ID 1), located between nucleotides -289 and -269, and the antisense primer ITS (5' GCG).
  • ACC CAA CAC TCG TAC GCT-3 ') (SEQ ID 2), located between nucleotides - 70 and -90.
  • the probe used for qPCR is TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT TGG GG A-Tamra-3 ') (SEQ ID 3) located between nucleotides -137 and -119.
  • the RT-PCR was carried out under the following conditions: The retrotranscription is carried out for 30 minutes at 50 ° C., followed by a step of deactivation of the retrotranscriptase (15 minutes at 95 ° C.), then 45 cycles of PCR alternating one step elongation time (1 minute at 63 ° C.) and a denaturation step (30 seconds at 90 ° C.).
  • a first series of experiments revealed the presence of viral RNA in Aedes vexans after 21 days of breeding. The results are shown in Figure 1, which shows detectable amounts of the virus at day 21.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d amplification in vivodu virus de l hépatite 5 C (VHC) comprenant lesétapes suivantes: a/ingestion de la source virale par des moustiques femelles Aedes vexans ou Aedes caspius; b/ élevage des moustiques pendant le temps nécessaire à l amplification du virus.10

Description

PROCEDE D'AMPLIFICATION DU VHC CHEZ LES MOUSTIQUES Aedes
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne l'identification de nouveaux systèmes permettant l'amplification du virus de l'Hépatite C (VHC). Ainsi, il a été mis en évidence que certains moustiques du genre Aedes permettaient la réplication efficace in vivo du VHC. Ceci offre des perspectives prometteuses, notamment en termes de vaccinologie et de développement de médicaments contre cette infection.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE
Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié comme étant responsable de l'hépatite non A non B pouvant évoluer en pathologies chroniques malignes, du type par exemple cirrhose du foie ou encore carcinome hépato-cellulaire.
Le VHC, membre du genre Hepacivirus, appartient à la famille des Flaviviridae qui sont des virus à ARN monobrin enveloppés, parmi lesquels on rencontre les virus responsables de maladies épidémiques majeures telles que la Fièvre Jaune (YF), la Dengue (DEN) et la Dengue Hémorragique (DHF), l'Encéphalite Japonaise (JE), l'Encéphalite de Saint-Louis (SLE), la fièvre de West NiIe (WN) et l'Hépatite C (HC) pour ne citer que les plus importantes.
Les Flavivirus sont transmis par des insectes vecteurs, selon des modalités épidémio logiques très différentes. Certaines maladies sont typiquement humaines (ou liées aux primates) et ne touchent jamais les animaux comme la DEN et la DHF ; d'autres infections sont plutôt zoono tiques et touchent plus ou moins accidentellement l'être humain, comme la JE, la SLE et le WN. Enfin, certains Flavivirus peuvent circuler de façon épidémique aussi bien dans des populations humaines qu'animales (YF). Ces modalités épidémio logiques différentes ont pourtant des bases communes telles qu'une amplification virale dans des cellules d'insectes.
Concernant le VHC, les voies de transmission aujourd'hui bien établies sont : transmission par les produits sanguins, toxicomanie, transmission sexuelle et contexte nosocomial. Toutefois, 30 à 40% des infections à VHC aujourd'hui répertoriées chez l'homme ont une origine inexpliquée, dans la mesure où aucune des conditions listées ci- dessus n'est réunie. Par ailleurs, il a été noté une forte prévalence de l'infection à VHC dans des régions chaudes et humides, telles que l'Egypte, ainsi que dans le Japon Sud, à proximité du JEV. A ce jour, aucune explication n'a pu être donnée quant à cette répartition géographique de la maladie.
Concernant les stratégies vaccinales anti-VHC, elles sont aujourd'hui basées sur deux procédés usuels dans le domaine : d'une part des recombinants Vaccinia ou AAV (Adeno-Associated Virus) ; d'autre part, les stratégies de vaccinothérapie anti-VHC sont développées sur la base de polypeptides dérivés des protéines du VHC.
Dans la lutte menée contre les hépatites virales de type C, un obstacle majeur, entravant le développement d'un traitement et d'un vaccin efficace, est l'absence d'un système permettant la multiplication à haut niveau du virus in vitro. Ceci pourrait s'expliquer par une mauvaise adaptation du virus chez l'homme, le rendant incapable de se répliquer in vitro sur des modèles cellulaires conventionnels, tels que la lignée d'hépatocarcinome ou les cellules hépatiques primaires.
Des constructions moléculaires ont été proposées pour pallier ce problème, notamment le modèle des réplicons, mais elles partagent toutes le défaut d'être des formes alternatives assez éloignées des particules C naturelles.
De manière plus exhaustive, les modèles actuellement disponibles pour l'amplification du VHC sont les suivants :
Les modèles in vivo d'infection et de réplication virale sont répertoriés dans la revue de Bartenschlager et al. (1). Concernant les modèles animaux conventionnels, le seul animal susceptible à l'infection par le VHC est le chimpanzé (P. troglodytes), chez qui les virémies sont à haut titre. D'autres primates (Tupaia belangeri chinensis) sont infectables, mais avec des virémies faibles et intermittentes. Un autre modèle animal disponible est la souris beige/nude/immunodéficiente avec xénotransplantation d'hépatocytes humains (souris trimera®), qui présente une virémie importante mais dont le succès est lié à la durée de vie du transgène.
La revue de Bartenschlager et al. (1) rapporte également l'existence de systèmes de cultures cellulaires. Aucune lignée cellulaire autorisant un cycle permissif complet et la production de particules virales, après infection conventionnelle, n'a été décrite (8). Le seul système efficace permettant la réplication est celui décrit par Bartenschlager et Lohmann (2) : il s'agit d'un système de réplicon subgénomique permettant, après transfection de cellules Huh-7 par du réplicon clone, la réplication de l'ARN génomique VHC et l'expression des protéines non structurales (en particulier la protéase-hélicase et 1'ARN polymérase). Ce système est utilisé dans les criblages antiviraux. Une amélioration importante a été apportée par Wakita et al. (11). Ce dernier système de réplicon (clone
HCV-JFHl) permet la production de particules virales complètes infectieuses (après transfection en cellules Huh-7). Toutefois et à l'heure actuelle, le système n'est pas adapté à la production de biomasse importante.
Enfin, des systèmes d'expression hétérologues ont été développés. Il s'agit, d'une part, des « Virus Like Particles » (VLPs), obtenues grâce à un baculovirus exprimant les glycoprotéines d'enveloppe hétérodimériques E1E2 (4). Récemment, le système baculovirus a été exploité sur la base d'un recombinant contenant un ADNc des protéines core + gp E1E2, dans une expérience d'immunisation de chimpanzés à visée vaccinale. D'autre part, des pseudo types ou pseudo particules (pp) rhabdo viraux (VSV, 6) ou rétroviraux (HIV ou MLV, 3) ont été obtenus. Ces systèmes, d'intérêt fondamental, sont utilisés pour l'étude de l'entrée virale via les gp E1E2. Ils ne sont utilisables que pour l'étude des anticorps neutralisants anti-enveloppe VHC et ne présentent donc aucun intérêt en vaccino Io gie .
Il apparaît donc qu'aucun des systèmes décrits ne donne entièrement satisfaction et qu'il persiste le besoin de développer de nouveaux modèles permettant une amplification efficace du VHC.
EXPOSE DE L'INVENTION
Ainsi et pour répondre à ce besoin, l'invention concerne un procédé d'amplification in vivo du virus de l'hépatite C (VHC) comprenant les étapes suivantes : a/ ingestion de la source virale par des moustiques femelles du genre Aedes ; b/ élevage des moustiques pendant le temps nécessaire à l'amplification du virus.
La première étape consiste donc à « faire passer » le virus dans le moustique de la manière la plus efficace possible, en l'occurrence par ingestion. Après ingestion par le moustique, le virus arrive dans l'estomac où il va franchir la paroi stomacale, puis se disperser dans l'hémocèle et atteindre différents organes, tels que les ovaires et les glandes salivaires, où il est susceptible de se multiplier. Le virus peut par conséquent être transmis aux générations suivantes de moustiques ou à l'homme lors d'une piqûre.
Les moustiques du genre Aedes sont des Diptères, Nématocères, de la famille des Culicidae, sous-famille Culicinae, Tribu Aedini. Les femelles sont caractérisées par des palpes courts et des antennes non plumeuses. Dans le cadre de la présente invention, les espèces Aedes vexans et Aedes caspius ont été utilisées.
De manière avantageuse, ce sont des souches sauvages de ces espèces qui sont utilisées dans le cadre de l'invention. Ainsi, la population mise en oeuvre dans le procédé provient d'un élevage réalisé à partir de matériel (œufs, larves ou adultes) prélevé directement sur le terrain, dans le biotope privilégié de ces deux espèces. Les individus utilisés appartiennent avantageusement aux générations FO, Fl ou F2.
Comme déjà dit, la mise en contact entre la source virale et les moustiques se fait par ingestion. Avantageusement, la source virale est conditionnée à l'aide de globules rouges par exemple de mouton, éventuellement supplémentés avec de l'ATP, pour augmenter l'appétence des moustiques femelles.
En pratique, l'ingestion se fait donc au cours d'un repas sanguin pris par les moustiques femelles.
Avantageusement, l'ingestion est réalisée à l'aide de la technique du gorgement. Cette technique particulièrement efficace est bien connue des entomologistes et décrite par exemple dans Fouque et al. (7). Dans le principe, un repas sanguin est proposé à des moustiques femelles dans un gorgeoir qui permet de maintenir le repas à 37°C. Le gorgeoir est recouvert d'une peau au travers de laquelle les moustiques insèrent leur proboscis et prennent le repas.
Dans un mode de réalisation avantageux de cette technique, il est mis en œuvre une peau de poulet.
Selon l'invention, la source virale comprend un virus « natif » (virulent), ou avantageusement atténué. Un virus virulent permet de reproduire l'infection et donc offre un modèle expérimental de premier choix. De manière plus appliquée, un virus atténué présente un intérêt particulier dans la production de vaccins ou d'anticorps.
Selon un mode de réalisation privilégiée de l'invention, la charge virale provient d'un sérum, avantageusement d'origine humaine, par exemple celui d'un porteur d'hépatite chronique VHC de génotype Ib. Le titre classique d'un tel sérum est généralement autour de 2E6 copies / ml. Dans le cadre de l'invention, il a été déterminé que la mise en contact devait avoir lieu à hauteur d'au moins 1000 copies du virus par moustique, avantageusement 1500 copies du virus par moustique.
La seconde étape du procédé selon l'invention consiste à élever les moustiques pendant une durée déterminée. L'élevage est réalisé dans des conditions contrôlées, notamment de température et d'humidité. La durée de l'élevage est déterminée en fonction des critères suivants :
- elle doit être inférieure à la durée de vie moyenne de l'espèce de moustiques en captivité ;
- elle doit permettre de réaliser au moins un cycle d'amplification extrinsèque chez le moustique et préférentiellement d'obtenir un taux de réplication maximal du virus.
Dans le cadre de l'invention, l'amplification apparaît optimale entre 15 et 30 jours d'élevage pour les Aedes testés, avec comme valeur moyenne avantageuse une durée d'élevage d'environ 20 jours.
La récupération du virus, notamment sous forme de particules virales, peut nécessiter leur extraction des tissus de moustiques. Des tissus privilégiés sont les ovaires et les glandes salivaires.
L'invention offre donc un procédé d'amplification du VHC, se déroulant in vivo chez des espèces de moustiques spécifiques, donnant des résultats tout à fait inattendus et remarquables.
Il était certes connu de FR 2793 258 et Germi et al. (9) de produire in vitro du VHC dans de cellules d'insectes, mais avec des résultats insuffisants.
Par ailleurs, des expériences antérieures, réalisées in vivo sur des moustiques appartenant aux espèces Aedes aegypti, Aedes albopictus, Anophèles stephensi et Culex quinquefasciatus, respectivement, se sont révélées négatives (10, 5). Ces résultats sont cohérents avec le concept d'une longue coadaptation et d'une grande spécificité entre virus et moustique vecteur, mettant en lumière le mérite de la présente invention.
Comme déjà dit, le procédé selon l'invention offre des perspectives très prometteuses, y compris pour la production massive in vitro du VHC. Ainsi, le procédé selon l'invention donne accès à des tissus, notamment d'ovaire ou de glande salivaire, ou des cellules d'Aedes, avantageusement d'Ae. Caspius ou vexans, porteurs du VHC.
Ces cellules peuvent être utilisées en tant que telles pour la production massive du VHC in vitro.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également un procédé d'obtention de cellules productrices in vitro de VHC. Il s'agit alors de cocultiver les cellules d'Aedes, porteuses du VHC, obtenues à l'aide du procédé selon l'invention, et des cellules de type AP61 ou C6/36. Les cellules de type AP61 et C6/36 ont été décrites par Germi et al. (9). Il s'agit de lignées cellulaires de moustique, en particulier d'Aedes pseudoscutellaris, continues et bien définies. La coculture a pour but de transférer le VHC dans ces lignées cellulaires. L'invention concerne donc également des cellules de moustique productrices in vitro de VHC, obtenues à l'issu de ce procédé.
Ces deux sources cellulaires de VHC offrent d'importantes perspectives, notamment pour la production de particules virales d'une nouvelle nature (issues d'Aedes), pour la production d'anticorps spécifiques ou pour la préparation de vaccins à visée prophylactique ou thérapeutique.
EXEMPLES DE RÉALISATION
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs.
La figure 1 correspond à un gel illustrant la détection de l'ARN viral au sein des moustiques Aedes vexans infectés par le VHC, après extraction des ARN totaux et RT- PCR classique avec révélation de l'ADN au bromure d'éthidium. Piste 1). Témoin négatif de la PCR ; piste 2) Témoin négatif moustique; pistes 3, 4) jour 0; piste 5) jour 14; pistes 6, 7, 8) jour 21.
La figure 2 illustre la détection de l'ARN viral par qRT-PCR, après extraction des ARN totaux des moustiques Aedes (vexans + caspius) après 24 jours d'élevage. La courbe standard a été réalisée sur une dilution logarithmique d'un extrait d'ARN viral de titre connu (120 000 copies/run à 1 200 copies/run) (Fig. 2A). Dans la figure 2B, les témoins positifs sont identifiés par (JO, T+), et les individus susceptibles d'avoir répliqué le VHC après 24 jours par (J20). Pour chaque échantillon, sont indiqués (i) le nombre de cycles au bout desquels l'ARN viral a été détecté (ii) ainsi que sa concentration au départ par rapport à la courbe standard. La courbe de la figure 2B montre l'évolution de la détection du signal pour chaque échantillon.
La figure 3 illustre la détection de l'ARN viral par qRT-PCR, après extraction des ARN totaux des moustiques Culex (pipiens) après 28 jours d'élevage La courbe standard a été réalisée sur une dilution logarithmique d'un extrait d'ARN viral de titre connu (800 000 copies/run a 8 000 copies/run) (Fig. 3A). Pour chaque échantillon, sont indiqués (i) le nombre de cycles au bout desquels l'ARN viral a été détecté (ii) ainsi que sa concentration au départ par rapport à la courbe standard. La courbe de la Fig. 3B montre l'évolution de la détection du signal pour chaque échantillon.
PARTIE EXPERIMENTALE
/ - Infections expérimentales
1. Elevage des espèces testées
Les individus testés proviennent d'un élevage réalisé à partir de moustiques (oeufs, larves et adultes) collectés sur le terrain dans la zone urbaine de Marseille pour l'espèce Culex pipiens et dans la réserve de la Tour du Valat en Camargue pour les espèces Aedes vexans et Aedes caspius. Ces élevages ont été réalisés dans les locaux de l'ENSAM situés au Domaine du Merle, à Salon de Provence. Ces élevages sont réalisés dans un insectarium classique, aux normes d'élevage. Les larves sont nourries avec de la levure de bière et de l'alimentation pour poisson et les adultes sont nourris avec une solution de sucrose. Les repas sanguins des Culex et Aedes sont composés de globules rouges lavés de mouton, le but du lavage étant d'éliminer l'interférence des éléments du sang.
2. Introduction des moustiques dans le Laboratoire Sécurisé (niveau 2+)
Au jour J-I, les moustiques femelles sont répartis en lots, placés dans les boites de gorgement avec un coton humide sur chaque boite et introduits dans le laboratoire sécurisé. Les moustiques sont conservés à température et humidité contrôlées (T = 25°C ±
2, RH 80% ± 10).
3. Introduction du virus VHC dans le Laboratoire L2+ Au jour JO, la solution virale contenant du virus VHC (sérum de patient porteur d'hépatite chronique à 2E6 copies/ml) est transportée par transporteur spécial jusqu'au L2+ où sont placés les moustiques. La solution virale est fournie par le Laboratoire de Virologie moléculaire et structurale de la Faculté de Médecine de Grenoble. La solution virale est conservée dans le congélateur à -800C du L2+. 4. Préparation de la solution sanguine infectée
Au jour JO, le mélange globules rouges lavés (sang de mouton) non-infectés et solution virale est réalisé, de manière à obtenir un titre suffisant pour infecter des moustiques (-1500 copies / moustique). De l'ATP est rajouté pour rendre le sang plus attractif et augmenter l'appétence des femelles. Chaque moustique prend entre 3 et 5 μl par repas de sang.
5. Infection des lots de femelles Au jour JO, le gorgeoir contenant le sang infecté et chauffé à 37°C est présenté aux femelles, privées de glucose depuis 24 heures. Le gorgeoir est posé sur chaque boite et laissé sur place environ 4 heures pour la prise de repas sanguin. En parallèle, le gorgeoir avec du sang non contaminé est présenté au lot de femelles témoins négatifs. Au bout de la durée de gorgement des femelles, celles-ci sont récupérées par l'aspirateur à bouche, endormies par les vapeurs de chloroforme puis triées sous loupe binoculaire. Les femelles ayant gorgé du sang sont remises dans les cages. Un gîte artificiel est laissé dans chaque cage métallique à la disposition des femelles pour la ponte (bac d'eau pour les femelles Aedes et terre humide pour les femelles Culex). A partir de ce jour, les cages métalliques contenant les femelles gorgées ne sont ni ouvertes, ni manipulées jusqu'au sacrifice des moustiques.
(h Entretien des lots de femelles
Les lots de femelles sont maintenus à une température constante d'environ 28°C et avec une humidité contrôlée d'au moins 70%. Chaque jour, les femelles sont nourries grâce à du coton imbibé d'une solution de glucose à 10 % déposé sur la cage métallique. Les gîtes de ponte sont humidifiés à travers la cage avec une pissette.
7. Traitement des femelles
Aux jours de prélèvement, les moustiques sont sacrifiés en plaçant la cage métallique au froid. Les moustiques sont ensuite placés dans des tubes 1,5 ml, identifiés et remis au congélateur jusqu'à l'étape d'extraction d'ARN avant les PCR. Les témoins négatifs, gorgés sur sang non virémique sont aussi sacrifiés. Le lot de moustiques, sacrifié au jour JO et mis au congélateur à -800C, constitue les témoins positifs JO de gorgement, d'extraction et d'amplification de l'ARN viral. // - Recherche d'ARN viral
S. Extraction de TARN pour les organes infectés
L'extraction de l'ARN viral du VHC à partir de tissus de moustiques a été réalisée sous 5 hotte, à l'aide du kit « High Pure RNA Tissue Kit » commercialisé par Roche.
9. Amplification de l'ARN viral
Les amorces utilisées ainsi que la sonde (pour la qPCR) ont été conçues pour l'amplification de la région conservée de l'extrémité 5' non codante du génome viral.
10 Nous avons utilisé l'amorce sens 2CH (5'-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA-3') (SEQ ID 1), localisée entre les nucléotides -289 et -269, et l'amorce antisens ITS (5' GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3') (SEQ ID 2), localisée entre les nucléotides - 70 et -90. La sonde utilisée pour la qPCR est la TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT GCC TGG A-Tamra-3') (SEQ ID 3) située entre les nucléotides -137 et-119.
15
La composition du mélange réactionnel pour la RT PCR classique et la qRT PCR est résumée dans le tableau suivant :
La RT-PCR a été réalisée dans les conditions suivantes: La rétrotranscription se déroule pendant 30 minutes à 500C, suivie par une étape de désactivation de la rétrotranscriptase (15 minutes à 95°C), puis 45 cycles de PCR alternant une étape d'élongation (1 minute à 63°C) et une étape de dénaturation (30 secondes à 900C).
RESULTATS
Une première série d'expériences a révélé la présence de l'ARN viral chez Aedes vexans après 21 jours d'élevage. Les résultats sont illustrés à la figure 1, qui montre des quantités détectables du virus au j our 21.
Une seconde série d'expériences a été réalisée en parallèle sur Culex pipiens (Fig. 3), Aedes vexans et Aedes caspius (Fig. 2). Pour Aedes, les résultats obtenus dans l'expérience précédente sont confirmés. L'analyse par RT-PCR en temps réel de l'ARN total extrait des moustiques gorgés au sang virémique après 24 jours d'élevage montre clairement la présence d'ARN viral du VHC génotype Ib, alors qu'il est totalement absent dans les individus témoins négatifs (Fig. 2).
Ces expériences montrent que : a. II est possible de détecter l'ARN viral présent dans les moustiques ; ceci valide le procédé d'extraction de l'ARN total à partir des moustiques complets et l'amplification par RT-PCR en temps réel du génome viral (capillaires 14, 15 et 16, Fig. 2). b. L'ARN viral est totalement absent au sein des individus du genre Culex élevé jusqu'au 28emejour (Fig. 3). c. Enfin, il est totalement exclu que l'ARN détecté soit de l'ARN résiduel du fait de l'absence totale de cet ARN dans les moustiques Culex au J28 (Fig. 3, capillaires 6 à 17), comme il est exclu qu'il puisse s'agir d'une contamination, vu l'absence de tout ARN viral détectable au sein des témoins négatifs.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé d'amplification in vivo du virus de l'hépatite C (VHC) comprenant les étapes suivantes : a/ ingestion de la source virale par des moustiques femelles Aedes vexans ou
Aedes caspius ; b/ élevage des moustiques pendant le temps nécessaire à l'amplification du virus.
2/ Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les moustiques sont issus de souches sauvages.
3/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source virale est supplémenté en globules rouges, et éventuellement en ATP.
4/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ingestion de la source virale par les moustiques est réalisée par repas sanguin, avantageusement à l'aide de la technique de gorgement.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la technique de gorgement met en œuvre une peau de poulet.
6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la source virale est du sérum, avantageusement d'origine humaine.
Il Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la source virale comprend du virus atténué.
8/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ingestion se fait à hauteur d'au moins 1000 copies du virus / moustique.
9/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élevage des moustiques est réalisé pendant un temps allant de 15 à 30 jours, avantageusement pendant environ 20 jours.
10/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'à la fin du temps d'élevage, le virus est récupéré à partir des tissus de moustique. 11/ Tissu ά'Aedes porteur du VHC susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
12/ Cellule d'Aedes porteuse du VHC susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
13/ Procédé d'obtention de cellules productrices in vitro de VHC comprenant la culture de cellules selon la revendication 12 en présence de cellules de type AP61 ou C6/36.
14/ Cellule de moustique productrice in vitro de VHC susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 13.
15/ Utilisation des cellules selon les revendications 12 ou 14 pour la production de particules virales, pour la production d'anticorps spécifiques ou pour la préparation d'un vaccin à visée prophylactique ou thérapeutique.
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