EP2047265A2 - Method for influencing living cells through cell-surface interaction - Google Patents

Method for influencing living cells through cell-surface interaction

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Publication number
EP2047265A2
EP2047265A2 EP07785684A EP07785684A EP2047265A2 EP 2047265 A2 EP2047265 A2 EP 2047265A2 EP 07785684 A EP07785684 A EP 07785684A EP 07785684 A EP07785684 A EP 07785684A EP 2047265 A2 EP2047265 A2 EP 2047265A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
magnetic
substrate
magnetic field
cell
external magnetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07785684A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Juliane Issle
Uwe Hartmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet des Saarlandes
Original Assignee
Universitaet des Saarlandes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet des Saarlandes filed Critical Universitaet des Saarlandes
Publication of EP2047265A2 publication Critical patent/EP2047265A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the invention relates to a method for influencing living cells by cell-surface interaction according to the preamble of patent claim 1.
  • the inventors are aware that immobilization steps have already been undertaken in the application of growth factors by means of simple adsorption on biocompatible surfaces. For adsorption, it is necessary first to dissolve the growth factors in a solvent, to apply this solution to a substrate and then to allow it to dry.
  • the object of the invention is therefore to remedy this situation and to influence by targeted adjustment of the surface structure of living cells by Zeil surface interaction and to carry out studies on time-dependent structural changes can.
  • the surface structure formed by the carrier material on the carrier substrate is specifically influenced by applying an external magnetic field.
  • Magnetic particles with diameters of less than 1 ⁇ m can be used as the magnetic carrier material.
  • nanobeads can consist of the magnetic material magnetite, for example, and nanobeads with various reactive surface groups (carboxyl, amino groups, etc.) can be covalently attached to these surface groups as biologically active material, for example growth factors and proteins for a wide variety of cell types become.
  • the biologically active material is well bonded to the magnetic carrier material.
  • the magnetic carrier material is applied to a magnetic carrier substrate by magnetic interaction.
  • the binding of the biologically active material "follows" this of the (electro) magnetic structure of the carrier material and is distributed in the corresponding spatial structure on the magnetic carrier substrate.
  • the biologically active material in the case of immobilization such as the growth factors on the one hand no longer in a liquid environment. This may affect functionality. Furthermore, the biologically active material is not very strongly bound to the surface. This can lead to renewed detachment. In addition, the preparation known from the prior art does not permit structuring in the nanometer to micrometer range. On the other hand, by making this possible with the present method, conclusions regarding cell reactions to different structures are obtained.
  • stem cells can also be differentiated in the present method.
  • magnetic carrier substrates thin films having a specific magnetic domain structure
  • This domain structure can be influenced by external magnetic fields in their shape and strength, whereby a high variability of the system is achieved.
  • an embodiment of the invention is that the external magnetic field is generated by a spatially variably positionable permanent or electromagnet.
  • electrical interconnects are arranged in the magnetic carrier substrate and the external magnetic field is generated or changed by a current flow in the electrical interconnects.
  • the electromagnetic structure of the carrier substrate can be changed by applying an electrical current in the conductor tracks. These changes can be followed by the magnetic particles.
  • the electrical strip conductors it is possible to generate a magnetic field of specific structure and specific thickness in a simple manner in a very targeted and easily adjustable manner so that an external magnetic field, which is generated by a current flow in the electrical strip conductors, can be superimposed on the magnetic field of the carrier substrate becomes.
  • a development of the invention is that the carrier material is locally heated by the external magnetic field is at least in this local area in the kHz to MHz range designed to be variable.
  • This local heating can take place, for example, with a local resolution in the range of a few micrometers.
  • the temporally rapidly changing magnetic fields can be generated on the one hand by magnets arranged in the surroundings of the carrier substrate or, in the case of an embodiment with electrical conductor tracks, by currents with a corresponding component of the alternating current. By these magnetic fields, a movement of the magnetically bonded particles can be induced, which has energy losses in the form of heat. If this excitation is carried out in a controlled manner at certain locations of the substrate, a local heating of the substrate and of the cells located thereon can be achieved. This heating can be used selectively to specifically modify or cleave the biomolecules coupled to the particles.
  • the external magnetic field is changed as a function of time.
  • the spatial arrangement of the magnetic carrier material on the magnetic carrier substrate can thus be influenced.
  • the external magnetic field may be independent and external to the carrier substrate.
  • permanent magnets or electromagnets arranged in the surroundings of the carrier substrate may be considered, which may optionally be repositioned spatially, so that both their field strength and the geometry of the magnetic fields can be varied with respect to the carrier substrate. But it is - as already explained in connection with claim 1 - possible to generate the external external magnetic field by embedded in the carrier substrate electrical conductor tracks.
  • the external magnetic field is temporally changeable with frequencies in the MHz to MHz range.
  • the geometry of the magnetic fields can be changed and specified flexibly. In general, the magnetic fields should be noted that they should not affect the effectiveness of the biologically active material.
  • modular growth factors and specific proteins whose existence is a prerequisite for the controlled influencing of cells, in particular of stem cells, to connect to a surface.
  • the arrangement it is possible, in particular, to classify influences which are caused by surface structures or specific arrangements of the growth factors.
  • the invention also makes use of the fact that a covalent binding of the biologically active material, such as, for example, the growth factors to the magnetic carrier material (nanobeads), takes place. This is definitely a stronger and thus more stable immobilization of the biomolecules than would be the case with physisorption.
  • the invention makes it possible with particular advantage to influence "in vitro" structural properties of the substrates used (space-time profile). Growth factors, relevant biomolecules or proteins can be bound in determinable concentrations in controlled positions at the carrier substrate.
  • variable system allows the study of structural influences on cellular mechanisms.
  • structures are variable, stable immobilization of biomolecules to the surface can be ensured.
  • FIG. 3 shows the carrier substrate from FIG. 2 with a domain distribution set according to the method according to the invention
  • Fig. 5 shows an embodiment for setting different magnetic Domain structures
  • FIG. 6 shows an exemplary embodiment for temporally changing an already set domain structure.
  • FIG. 1 shows a magnetic carrier material 1 with a biologically active material 2 attached thereto.
  • the carrier material 1 may consist of so-called nanobeads. These may for example consist of magnetite (Fe 3 O 4 ) 3.
  • the nanobead may have an overall diameter of the order of 100 nm to 500 nm.
  • the individual magnetite particles 3 have a diameter of the order of magnitude of 20 nm; the nanobead consists in total of approximately 80% magnetite.
  • This magnetite may be incorporated in a matrix 4 which occupies the remaining 20% by volume and consists of polysaccharide.
  • the surface 5 of the nanobead can be formed by reactive molecules or proteins, which can be, for example, COOH, NH 2 or other molecules or proteins.
  • the magnetic carrier material 1 is doped with the biologically active material 2, which is attached by a covalent bond to the molecules or proteins of the surface of the nanobeads.
  • FIG. 2 shows a magnetic carrier substrate 6 (in this case YIG, Yttrium Iron Gamet) with a magnetic domain distribution which typically corresponds to the basic or delivery state of the manufacturer.
  • the white or black regions represent domains with antiparallel, in each case perpendicular to the substrate plane magnetization.
  • FIG. 3 shows the carrier substrate 6 after a temporary application and switching off of an external magnetic field.
  • This magnetic field can be generated by means of permanent magnets, which are positioned accordingly or by electric coils, which are flowed through by a controllable current.
  • the magnetic or magnetizable carrier substrate 6 may consist of the elements Y, Sm, Bi, Ga, Fe. These garnet films are just an example list. in principle All magnetic surfaces are suitable as carrier material.
  • FIG. 4 shows a basic illustration of the magnetization of the carrier substrate 6.
  • regions form, which have different orientations of the magnetic fields according to the arrows shown.
  • the orientations in the transition regions of the carrier substrate 6 can be seen in particular.
  • the carrier substrate 6 After such a carrier substrate 6 has been loaded, it can be brought into contact with the living cells.
  • the living cells can be dissolved, for example, in an aqueous solution into which the carrier substrate 6 is immersed.
  • the meandering domain distribution shown in FIG. 5 a can be reconfigured by applying a temporally limited external magnetic field.
  • FIGS. 5b-5d show, by way of example, domain distributions which can be set by different external magnetic fields in the same substrate as in FIG. 5a.
  • a coil can be used which is adjustable in its position angle-dependent to the magnetization of the substrate.
  • the coil is oriented in such a way that its magnetic field forms an angle of 88 ° -89 ° with the magnetization of the substrate. Subsequently, the substrate is brought into magnetic saturation by the coil field and after a slow shutdown, the new domain configuration is established.
  • the stripe domains of Fig. 5 c are set in an analogous manner. However, this requires an angle of approximately 70 ° between the magnetic field of the coil and the output magnetization of the substrate.
  • the mixing state shown in FIG. 5d can be achieved by angle settings between the values mentioned in connection with FIGS. 5b and 5c.
  • a coil can be used to alter these configurations in domain width and / or orientation.
  • the coil field is aligned in parallel with the magnetization of the substrate.
  • the magnetic structure of the carrier substrate can now be varied over time.
  • FIG. 6 shows the temporal change of the domain structure over the period of 60 s, during which the magnetic field strength increased linearly from -6.8 mT to 6.8 mT at the substrate. In order to maintain a certain domain width in this case the corresponding magnetic field must be maintained in its strength.
  • the magnetic carrier material follows the structural change of the magnetic substrate and preferably deposits in the transition region between the individual domains.
  • the magnetic carrier material offers in cell culture a temporally and spatially variable structure by means of which time-dependent cellular processes can be investigated.

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Abstract

The invention relates to a method for influencing living cells through cell-surface interaction where, for the cell-surface interaction, bioactive material is applied to magnetic carrier material, then this magnetic carrier material is applied to a magnetic carrier substrate, and this carrier substrate is combined with the living cells. The magnetic domain arrangement in the substrate can be altered by means of an external magnetic field in such a way that the structure formed by the magnetic carrier material is likewise changed. An in vitro alteration of the structure of the substrate is thus possible.

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION
Verfahren zur Beeinflussung lebender Zellen durch Zell-Oberflächen-WechselwirkungMethod for influencing living cells by cell-surface interaction
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beeinflussung lebender Zellen durch Zell-Oberflächen- Wechselwirkung nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.The invention relates to a method for influencing living cells by cell-surface interaction according to the preamble of patent claim 1.
Den Erfindern ist es bekannt, dass bereits Immobilisierungsschritte bei Applikation von Wachstumsfaktoren mittels einfacher Adsorption an biokompatiblen Oberflächen unternommen wurden. Zur Adsorption ist es nötig, die Wachstumsfaktoren erst in einem Lösemittel zu lösen, diese Lösung auf ein Substrat aufzubringen und sie anschließend eintrocknen zu lassen.The inventors are aware that immobilization steps have already been undertaken in the application of growth factors by means of simple adsorption on biocompatible surfaces. For adsorption, it is necessary first to dissolve the growth factors in a solvent, to apply this solution to a substrate and then to allow it to dry.
Ebenfalls aus dem Stand der Technik ist bekannt, magnetisches Trägermaterial, sogenannte „Nanobeads", an deren Oberfläche biologisch wirksames Material angebunden ist, auf einem Substrat mittels magnetischer Kräfte zu fixieren, wobei das Trägermaterial auf dem Substrat eine Oberflächenstruktur ausbildet. Zu diesem Zweck werden entweder magnetische Substrate verwendet oder bei Verwendung nicht magnetischer Substrate ein magnetisches Feld mittels im Bereich des Substrats angeordneter Magnete erzeugt. Als nachteilig bei diesem Stand der Technik hat sich erwiesen, dass die durch das magnetische Trägermaterial erzeugte Oberflächenstruktur Wechselwirkungen mit dem untersuchten Zellmaterial verursacht, eine gezielte Einstellung bzw. Beeinflussung der Oberflächenstruktur und damit der Zeil-Oberflächen- Wechselwirkung jedoch nicht oder nur sehr eingeschränkt möglich ist. Insbesondere ist es dabei nicht möglich, die sich durch die räumliche Anordnung der „Nanobeads" ergebende Geometrie der Oberflächenstruktur (beispielsweise kreisförmige, dreieckige, labyrintartige Anordnungen) gezielt einzustellen.It is also known from the prior art to fix magnetic carrier material, so-called "nanobeads", to whose surface biologically active material is bound, on a substrate by means of magnetic forces, wherein the carrier material forms a surface structure on the substrate Magnetic substrates used or produced using magnetic in the region of the substrate when using non-magnetic substrates.Desadvantageous in this prior art has been found that the surface structure generated by the magnetic carrier material causes interactions with the examined cell material, a targeted adjustment However, it is not possible or only to a very limited extent possible to influence the surface structure and thus the cell-surface interaction, and in particular it is not possible to determine the Ge resulting from the spatial arrangement of the "nanobeads" ometrie the surface structure (for example, circular, triangular, labyrinthine arrangements) to set targeted.
Aufgabe der Erfindung ist daher, hier Abhilfe zu schaffen und durch gezielte Einstellung der Oberflächenstruktur lebende Zellen durch Zeil-Oberflächen- Wechselwirkung zu beeinflussen und Untersuchungen zu zeitabhängigen Strukturveränderungen durchfuhren zu können.The object of the invention is therefore to remedy this situation and to influence by targeted adjustment of the surface structure of living cells by Zeil surface interaction and to carry out studies on time-dependent structural changes can.
Diese Aufgabe wird nach der vorliegenden Erfindung gemäß Anspruch 1 gelöst, daß die von dem Trägermaterial auf dem Trägersubstrat gebildete Oberflächenstruktur durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes gezielt beeinflußt wird.. Als magnetisches Trägermaterial können magnetische Teilchen mit Durchmessern von unter einem 1 μm verwendet werden. Diese sogenannten „Nanobeads" können beispielsweise aus dem magnetischen Material Magnetit bestehen. Kommerziell sind solche Nanobeads mit verschiedenen reaktiven Oberflächengruppen (Carboxyl-, Aminogruppen etc.) zu erhalten. An diese Oberflächengruppen können als biologisch wirksames Material beispielsweise Wachstumsfaktoren und Proteine für verschiedenste Zelltypen kovalent angebunden werden.This object is achieved according to the present invention according to claim 1, that the surface structure formed by the carrier material on the carrier substrate is specifically influenced by applying an external magnetic field. Magnetic particles with diameters of less than 1 μm can be used as the magnetic carrier material. These so-called "nanobeads" can consist of the magnetic material magnetite, for example, and nanobeads with various reactive surface groups (carboxyl, amino groups, etc.) can be covalently attached to these surface groups as biologically active material, for example growth factors and proteins for a wide variety of cell types become.
Durch die kovalente Anbindung ist das biologisch wirksame Material gut an das magnetische Trägermaterial angebunden. Das magnetische Trägermaterial wird durch magnetische Wechselwirkung auf ein magnetisches Trägersubstrat aufgebracht. Durch die Anbindung des biologisch wirksamen Materials „folgt" dieses der (elektro-)magnetischen Struktur des Trägermaterials und ist in der entsprechenden räumlichen Struktur auf dem magnetischen Trägersubstrat verteilt.Due to the covalent bonding, the biologically active material is well bonded to the magnetic carrier material. The magnetic carrier material is applied to a magnetic carrier substrate by magnetic interaction. The binding of the biologically active material "follows" this of the (electro) magnetic structure of the carrier material and is distributed in the corresponding spatial structure on the magnetic carrier substrate.
Beim Stand der Technik ist das biologisch wirksame Material im Falle der Immobilisierung wie beispielsweise die Wachstumsfaktoren einerseits nicht mehr in flüssiger Umgebung. Dadurch wird die Funktionalität unter Umständen beeinflusst. Weiterhin ist das biologisch wirksame Material nicht sehr stark an die Oberfläche gebunden. Dies kann zu erneutem Ablösen führen. Außerdem ermöglicht die aus dem Stand der Technik bekannte Präparation keine Strukturierung im Nanometer- bis Mikrometerbereich. Indem dies mit dem vorliegenden Verfahren möglich wird, ergeben sich demgegenüber Aufschlüsse bezüglich Zellreaktionen auf verschiedene Strukturen.In the prior art, the biologically active material in the case of immobilization such as the growth factors on the one hand no longer in a liquid environment. This may affect functionality. Furthermore, the biologically active material is not very strongly bound to the surface. This can lead to renewed detachment. In addition, the preparation known from the prior art does not permit structuring in the nanometer to micrometer range. On the other hand, by making this possible with the present method, conclusions regarding cell reactions to different structures are obtained.
Bei dem vorliegenden Verfahren können insbesondere auch Stammzellen zur Differenzierung gebracht werden.In particular, stem cells can also be differentiated in the present method.
Bei der vorliegenden Erfindung können magnetische Trägersubstrate (Dünnschichten) verwendet werden, die eine bestimmte magnetische Domänenstruktur aufweisen. Diese Domänenstruktur lässt sich durch äußere Magnetfelder in ihrer Form und Stärke beeinflussen, womit eine hohe Variabilität des Systems erreicht wird.In the present invention, magnetic carrier substrates (thin films) having a specific magnetic domain structure can be used. This domain structure can be influenced by external magnetic fields in their shape and strength, whereby a high variability of the system is achieved.
Eine Ausbildung der Erfindung besteht darin, daß das äußere Magnetfeld durch einen räumlich variabel positionierbaren Permanent- oder Elektromagneten erzeugt wird.* Ebenso liegt es im Rahmen der Erfindung, daß elektrische Leiterbahnen in dem magnetischen Trägersubstrat angeordnet sind und das äußere Magnetfeld durch einen Stromfluss in den elektrischen Leiterbahnen erzeugt bzw. verändert wird.An embodiment of the invention is that the external magnetic field is generated by a spatially variably positionable permanent or electromagnet. * Likewise, it is within the scope of the invention that electrical interconnects are arranged in the magnetic carrier substrate and the external magnetic field is generated or changed by a current flow in the electrical interconnects.
Es ist auch möglich, beide Arten der Erzeugung des äußeren Magnetfeldes miteinander zu kombinieren.It is also possible to combine both types of generation of the external magnetic field with each other.
Sofern in dem Trägersubstrat elektrische Leiterbahnen verlaufen, kann durch Anlegen eines elektrischen Stroms in den Leiterbahnen die elektromagnetische Struktur des Trägersubstrats geändert werden. Diesen Veränderungen können die magnetischen Teilchen folgen. Insbesondere bei den elektrischen Leiterbahnen ergibt sich die Möglichkeit, in einfacher Weise sehr gezielt und gut einstellbar ein Magnetfeld bestimmter Struktur und bestimmter Stärke zu erzeugen, so dass dem Magnetfeld des Trägersubstrats ein äußeres Magnetfeld überlagert werden kann, das durch einen Stromfluss in den elektrischen Leiterbahnen erzeugt wird.If electrical conductor tracks run in the carrier substrate, the electromagnetic structure of the carrier substrate can be changed by applying an electrical current in the conductor tracks. These changes can be followed by the magnetic particles. Particularly in the case of the electrical strip conductors, it is possible to generate a magnetic field of specific structure and specific thickness in a simple manner in a very targeted and easily adjustable manner so that an external magnetic field, which is generated by a current flow in the electrical strip conductors, can be superimposed on the magnetic field of the carrier substrate becomes.
Eine Weiterbildung der Erfindung besteht darin, dass das Trägermaterial lokal erwärmt wird, indem das äußere Magnetfeld zumindest in diesem lokalen Bereich im kHz- bis MHz-Bereich veränderlich ausgestaltet wird.A development of the invention is that the carrier material is locally heated by the external magnetic field is at least in this local area in the kHz to MHz range designed to be variable.
Diese lokale Erwärmung kann beispielsweise mit einer örtlichen Auflösung im Bereich einiger Mikrometer erfolgen. Die zeitlich sich schnell ändernden Magnetfelder können zum einen von in der Umgebung des Trägersubstrats angeordneten Magneten erzeugt oder bei einer Ausgestaltung mit elektrischen Leiterbahnen durch Ströme mit einem entsprechenden Welchselstromanteil verursacht werden. Durch diese Magnetfelder kann eine Bewegung der magnetisch angebundenen Teilchen induziert werden, die energetische Verluste in Form von Wärme zur Folge hat. Sofern diese Anregung kontrolliert an bestimmten Orten des Substrats vorgenommen wird, kann eine lokale Erwärmung des Substrats und der sich darauf befindlichen Zellen erreicht werden. Diese Erwärmung kann gezielt genutzt werden, um die an die Partikel angekoppelten Biomoleküle gezielt zu verändern oder abzuspalten.This local heating can take place, for example, with a local resolution in the range of a few micrometers. The temporally rapidly changing magnetic fields can be generated on the one hand by magnets arranged in the surroundings of the carrier substrate or, in the case of an embodiment with electrical conductor tracks, by currents with a corresponding component of the alternating current. By these magnetic fields, a movement of the magnetically bonded particles can be induced, which has energy losses in the form of heat. If this excitation is carried out in a controlled manner at certain locations of the substrate, a local heating of the substrate and of the cells located thereon can be achieved. This heating can be used selectively to specifically modify or cleave the biomolecules coupled to the particles.
Dadurch lassen sich zusätzliche Untersuchungen zur gezielten thermischen Beeinflussung von biologischem Material durchführen. Gegenüber anderen Verfahren zur lokalen Erwärmung von Gewebe ergibt sich bei dieser Ausgestaltung als Vorteil, dass die Magnetfelder räumlich sehr exakt variiert werden können, so dass es möglich wird, definiert bestimmte Zellen zu aktivieren und zu beeinflussen, um diese auf Temperatureinflüsse zu untersuchen. Es ist auch möglich, im Mikrometerbereich Temperaturgradienten zu erzeugen.This allows additional investigations to be carried out for the targeted thermal influence of biological material. Compared with other methods for local heating of tissue results in this embodiment, an advantage that the magnetic fields can be spatially varied very accurately, so that it is possible to activate certain defined cells and to influence them in order to examine them for temperature influences. It is also possible to generate temperature gradients in the micrometer range.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß das äußere Magnetfeld in Funktion der Zeit verändert wird.According to the invention it is provided that the external magnetic field is changed as a function of time.
Schließlich ist es auch möglich, daß das äußere Magnetfeld räumlich verändert wird.Finally, it is also possible that the external magnetic field is spatially changed.
Vorteilhaft kann damit die räumliche Anordnung des magnetischen Trägermaterials auf dem magnetischen Trägersubstrat beeinflusst werden.Advantageously, the spatial arrangement of the magnetic carrier material on the magnetic carrier substrate can thus be influenced.
Es ist zum einen möglich, die Magnetisierung (d.h. die magnetische Struktur) des Trägersubstrats vor dem Aufbringen des magnetischen Trägermaterials einzustellen.It is possible, on the one hand, to adjust the magnetization (i.e., the magnetic structure) of the carrier substrate prior to applying the magnetic carrier material.
Es ist aber auch möglich, eine Änderung der Magnetisierung nach dem Aufbringen des magnetischen Trägermaterials vorzunehmen. Dies kann insbesondere auch dann erfolgen, wenn das biologisch wirksame Material bereits mit den lebenden Zellen in Wechselwirkung ist. Die Änderung der Magnetstruktur des Trägersubstrats - und damit der vom Trägermaterial gebildeten Oberflächenstruktur - ermöglicht in diesem Fall eine „in-vitro"-Beinflussung der Zeil- Oberflächen- Wechselwirkung. Es ist hierbei nicht nur eine räumliche Variation der Anordnung des magnetischen Trägermaterials und damit auch des biologisch wirksamen Materials möglich, sondern auch eine zeitliche Änderung dieser Anordnung.But it is also possible to make a change in the magnetization after the application of the magnetic carrier material. This can in particular also take place when the biologically active material is already interacting with the living cells. The change in the magnetic structure of the carrier substrate, and thus the surface structure formed by the carrier material, makes it possible to influence the cell-surface interaction in this case the biologically active material possible, but also a temporal change of this arrangement.
Das äußere Magnetfeld kann unabhängig und extern zu dem Trägersubstrat vorhanden sein. Zu seiner Erzeugung kommen im Umfeld des Trägersubstrats angeordnete Permanent- oder Elektromagneten in Betracht, die gegebenenfalls räumlich umpositionierbar sind, so dass sowohl ihre Feldstärke als auch die Geometrie der Magnetfelder in Bezug auf das Trägersubstrat variiert werden können. Es ist aber - wie bereits im Zusammenhang mit Anspruch 1 erläutert - möglich, das externe äußere Magnetfeld zu erzeugen durch in das Trägersubstrat eingebettete elektrische Leiterbahnen.The external magnetic field may be independent and external to the carrier substrate. For its production, permanent magnets or electromagnets arranged in the surroundings of the carrier substrate may be considered, which may optionally be repositioned spatially, so that both their field strength and the geometry of the magnetic fields can be varied with respect to the carrier substrate. But it is - as already explained in connection with claim 1 - possible to generate the external external magnetic field by embedded in the carrier substrate electrical conductor tracks.
Das externe Magnetfeld ist in zeitlicher Hinsicht änderbar mit Frequenzen im mHz- bis MHz- Bereich. Die Geometrie der Magnetfelder ist änderbar und flexibel vorgebbar. Generell ist bei den Magnetfeldern zu beachten, dass diese die Wirksamkeit des biologisch wirksamen Materials nicht beeinträchtigen sollten.The external magnetic field is temporally changeable with frequencies in the MHz to MHz range. The geometry of the magnetic fields can be changed and specified flexibly. In general, the magnetic fields should be noted that they should not affect the effectiveness of the biologically active material.
Durch die Verwendung der Chiptechnologie, bei der Leiterbahnen in ein biokompatibles, magnetisches Substrat eingebettet werden, ergibt sich zusätzlich eine Möglichkeit zur Herstellung von Trägersubstraten mit variablen magnetischen Strukturen, die durch Einsatz von elektrischem Strom beeinflusst werden. Dabei können die bereits angesprochenen äußeren Magnetfelder durch Ströme in den elektrischen Leiterbahnen erzeugt werden.The use of chip technology, in which printed conductors are embedded in a biocompatible, magnetic substrate, additionally provides a possibility for producing carrier substrates with variable magnetic structures, which are influenced by the use of electrical current. The already mentioned external magnetic fields can be generated by currents in the electrical conductor tracks.
Insgesamt wird es mit der vorliegenden Erfindung möglich, Wachstumsfaktoren und spezielle Proteine, deren Vorhandensein eine Voraussetzung zur kontrollierten Beeinflussung von Zellen, insbesondere von Stammzellen, ist, modular an eine Oberfläche anzubinden. Mit der Anordnung ist es insbesondere möglich, Einflüsse zu klassifizieren, die durch Oberflächenstrukturen oder bestimmte Anordnungen der Wachstumsfaktoren hervorgerufen werden.Overall, it is possible with the present invention, modular growth factors and specific proteins whose existence is a prerequisite for the controlled influencing of cells, in particular of stem cells, to connect to a surface. With the arrangement, it is possible, in particular, to classify influences which are caused by surface structures or specific arrangements of the growth factors.
Durch die Möglichkeit, das beschriebene System aus Biomolekülen und Trägersubstraten durch äußere elektromagnetische Felder während der Zellkultivierung strukturell beeinflussen zu können, ergeben sich neue Anwendungsgebiete bezüglich der Untersuchung von Reaktionen biologischer Systeme, basierend auf zeitlich und strukturell veränderlichen Trägersubstraten.The possibility of being able to structurally influence the described system of biomolecules and carrier substrates by external electromagnetic fields during cell cultivation opens up new fields of application with regard to the investigation of reactions of biological systems based on temporally and structurally changeable carrier substrates.
Die Erfindung nutzt außerdem aus, dass eine kovalente Bindung des biologisch wirksamen Materials, wie beispielsweise der Wachstumsfaktoren an das magnetische Trägermaterial (Nanobeads), erfolgt. Dies ist auf jeden Fall eine stärkere und damit stabilere Immobilisierung der Biomoleküle als es bei Physisorption der Fall wäre.The invention also makes use of the fact that a covalent binding of the biologically active material, such as, for example, the growth factors to the magnetic carrier material (nanobeads), takes place. This is definitely a stronger and thus more stable immobilization of the biomolecules than would be the case with physisorption.
Die anschließende Anbindung der Nanobeads mittels magnetischer Kräfte an die Trägersubstrate ist ebenfalls stärker als reine Physisorption.The subsequent attachment of the nanobeads by means of magnetic forces to the carrier substrates is also stronger than pure physisorption.
Zudem ist eine Umkonfiguration der Oberflächenstruktur durch äußere schwache Magnetfelder, die keine weitere Auswirkung auf Zellen besitzen, möglich und das zu jedem Zeitpunkt, also beispielsweise auch während des Einsatzes in der Zellkultur. In Abhängigkeit von der Konzentration und Größe der eingesetzten, funktionalisierten Nanobeads und der äußeren Magnetfelder, ist es möglich, den Zellen verschiedene Strukturen im Mikrometer- und Nanometerb ereich von Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu stellen.In addition, a reconfiguration of the surface structure by external weak magnetic fields, which have no further effect on cells possible, and that at any time, so for example during use in the cell culture. Depending on the concentration and size of the used, functionalized nanobeads and the external magnetic fields, it is possible to provide the cells with different structures in the micrometer and nanometer range of growth factors.
Zusätzlich sind alle präparatorischen Schritte in Flüssigkeit durchführbar, womit sichergestellt wird, dass die Biomoleküle in physiologischer Umgebung bleiben und nicht getrocknet werden müssen, wie dies beim Stand der Technik der Fall ist.In addition, all preparatory steps in liquid are feasible, thus ensuring that the biomolecules remain in a physiological environment and do not have to be dried, as is the case in the prior art.
Besonders vorteilhaft lassen sich mit der Erfindung „in vitro"-Struktureigenschaften der verwendeten Substrate beeinflussen (Raum-Zeit-Profil). Wachstumsfaktoren, relevante Biomoleküle oder Proteine können in bestimmbaren Konzentrationen kontrolliert an bestimmten Stellen des Trägersubstrats angebunden werden.The invention makes it possible with particular advantage to influence "in vitro" structural properties of the substrates used (space-time profile). Growth factors, relevant biomolecules or proteins can be bound in determinable concentrations in controlled positions at the carrier substrate.
Zur weiteren Zellforschung im Allgemeinen und der Erforschung der Stammzelldifferenzierung wird hiermit ein variables System zur Verfügung gestellt, das die Untersuchung von Struktureinflüssen auf zelluläre Mechanismen erlaubt. Obwohl die Strukturen veränderlich sind, kann eine stabile Immobilisierung der Biomoleküle an die Oberfläche gewährleistet werden.For further cell research in general and the study of stem cell differentiation, a variable system is provided which allows the study of structural influences on cellular mechanisms. Although the structures are variable, stable immobilization of biomolecules to the surface can be ensured.
Die Erfindung wird durch die beiliegenden Zeichnungen noch näher erläutert. Dabei zeigen die Figuren im einzelnen:The invention is explained in more detail by the accompanying drawings. The figures show in detail:
Fig. 1: ein magnetisches Trägermaterial mit daran angebrachtem biologisch wirksamen Material,1: a magnetic carrier material with attached biologically active material,
Fig. 2: ein magnetisches Trägersubstrat mit typischer Verteilung der magnetischen Domänen,2 shows a magnetic carrier substrate with typical distribution of the magnetic domains,
Fig. 3: das Trägersubstrat aus Fig. 2 mit einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingestellten Domänenverteilung,FIG. 3 shows the carrier substrate from FIG. 2 with a domain distribution set according to the method according to the invention, FIG.
Fig. 4: eine Prinzipdarstellung der Magnetstruktur im Trägersubstrat,4 shows a schematic representation of the magnetic structure in the carrier substrate,
Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel zur Einstellung von unterschiedlichen magnetischen Domänenstrukturen,Fig. 5 shows an embodiment for setting different magnetic Domain structures,
Fig. 6 ein Ausfuhrungsbeispiel zur zeitlichen Veränderung einer bereits eingestellten Domänenstruktur.6 shows an exemplary embodiment for temporally changing an already set domain structure.
Figur 1 zeigt ein magnetisches Trägermaterial 1 mit daran angebrachtem, biologisch wirksamem Material 2. Das Trägermaterial 1 kann aus sogenannten Nanobeads bestehen. Diese können beispielsweise aus Magnetit (Fe3O4) 3 bestehen. Das Nanobead kann einen Gesamtdurchmesser in der Größenordnung 100 nm bis 500 nm aufweisen. Die einzelnen Magnetitpartikel 3 weisen einen Durchmesser der Größenordnung 20 nm auf, das Nanobead besteht insgesamt zu ca. 80% aus Magnetit. Dieses Magnetit kann in einer Matrix 4 eingebracht sein, die die verbleibenden 20 Vol.% einnimmt und aus Polysaccharid besteht. Die Oberfläche 5 des Nanobeads kann durch reaktive Moleküle oder Proteine gebildet werden, die beispielsweise COOH, NH2 oder andere Moleküle oder Proteine sein können.FIG. 1 shows a magnetic carrier material 1 with a biologically active material 2 attached thereto. The carrier material 1 may consist of so-called nanobeads. These may for example consist of magnetite (Fe 3 O 4 ) 3. The nanobead may have an overall diameter of the order of 100 nm to 500 nm. The individual magnetite particles 3 have a diameter of the order of magnitude of 20 nm; the nanobead consists in total of approximately 80% magnetite. This magnetite may be incorporated in a matrix 4 which occupies the remaining 20% by volume and consists of polysaccharide. The surface 5 of the nanobead can be formed by reactive molecules or proteins, which can be, for example, COOH, NH 2 or other molecules or proteins.
Über diese Moleküle oder Proteine wird das magnetische Trägermaterial 1 mit dem biologisch wirksamen Material 2 dotiert, das durch eine kovalente Bindung an den Molekülen oder Proteinen der Oberfläche der Nanobeads angelagert wird.Via these molecules or proteins, the magnetic carrier material 1 is doped with the biologically active material 2, which is attached by a covalent bond to the molecules or proteins of the surface of the nanobeads.
Figur 2 zeigt ein magnetisches Trägersubstrat 6 (hier YIG, Yttrium Iron Gamet) mit einer magnetischen Domänenverteilung, die typischerweise dem Grund- oder Auslieferzustand der Hersteller entspricht. Hierbei stellen die weißen bzw. schwarzen Bereiche Domänen mit antiparalleler, jeweils zur Substratebene senkrechter Magnetisierung dar.FIG. 2 shows a magnetic carrier substrate 6 (in this case YIG, Yttrium Iron Gamet) with a magnetic domain distribution which typically corresponds to the basic or delivery state of the manufacturer. In this case, the white or black regions represent domains with antiparallel, in each case perpendicular to the substrate plane magnetization.
Figur 3 zeigt das Trägersubstrat 6 nach zeitlich befristetem Anlegen und Abschalten eines äußeren Magnetfelds. Dieses Magnetfeld kann mittels Permanentmagneten erzeugt werden, die entsprechend positioniert werden oder durch elektrische Spulen, die von einem Steuer- bzw. regelbaren Strom durchflössen werden.FIG. 3 shows the carrier substrate 6 after a temporary application and switching off of an external magnetic field. This magnetic field can be generated by means of permanent magnets, which are positioned accordingly or by electric coils, which are flowed through by a controllable current.
Es ist aber auch möglich, elektrische Leiterbahnen auf das Trägersubstrat 6 aufzubringen, so dass bei einem Stromfluss durch diese elektrischen Leiterbahnen das magnetische Feld erzeugt wird.However, it is also possible to apply electrical conductor tracks to the carrier substrate 6, so that the magnetic field is generated during a current flow through these electrical conductor tracks.
Das magnetische bzw. magnetisierbare Trägersubstrat 6 kann aus den Elementen Y, Sm, Bi, Ga, Fe bestehen. Diese Granatfilme sind lediglich eine beispielhafte Aufzählung. Grundsätzlich kommen alle magnetischen Oberflächen als Trägermaterial in Frage.The magnetic or magnetizable carrier substrate 6 may consist of the elements Y, Sm, Bi, Ga, Fe. These garnet films are just an example list. in principle All magnetic surfaces are suitable as carrier material.
Figur 4 zeigt eine Prinzipdarstellung der Magnetisierung des Trägersubstrats 6.FIG. 4 shows a basic illustration of the magnetization of the carrier substrate 6.
Es ist zu sehen, dass sich Bereich ausbilden, die entsprechend den dargestellten Pfeilen unterschiedliche Orientierungen der Magnetfelder aufweisen. In der vergrößerten Darstellung sind speziell die Orientierungen in den Übergangsbereichen des Trägersubstrats 6 zu sehen.It can be seen that regions form, which have different orientations of the magnetic fields according to the arrows shown. In the enlarged view, the orientations in the transition regions of the carrier substrate 6 can be seen in particular.
Es hat sich gezeigt, dass sich die Nanobeads gerade in diesen Übergangsbereichen anlagern.It has been shown that the nanobeads accumulate precisely in these transition areas.
Nachdem ein solches Trägersubstrat 6 bestückt worden ist, kann dieses mit den lebenden Zellen in Kontakt gebracht werden. Dazu können die lebenden Zellen beispielsweise in einer wässrigen Lösung gelöst sein, in die das Trägersubstrat 6 eingetaucht wird.After such a carrier substrate 6 has been loaded, it can be brought into contact with the living cells. For this purpose, the living cells can be dissolved, for example, in an aqueous solution into which the carrier substrate 6 is immersed.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand zweier Ausführungsbeispiele näher erläutert werden:In the following, the invention will be explained in more detail with reference to two exemplary embodiments:
BEISPIEL l:EXAMPLE I:
Die in Figur 5 a gezeigte mäanderartige Domänenverteilung kann durch Anlegen eines zeitlich begrenzten äußeren Magnetfeldes umkonfiguriert werden.The meandering domain distribution shown in FIG. 5 a can be reconfigured by applying a temporally limited external magnetic field.
Die Figuren 5b - 5d zeigen beispielhaft Domänenverteilungen, die sich durch unterschiedliche äußere Magnetfelder im dem gleichen Substrat wie in Figur 5a einstellen lassen.FIGS. 5b-5d show, by way of example, domain distributions which can be set by different external magnetic fields in the same substrate as in FIG. 5a.
Zu diesem Zweck kann beispielhaft eine Spule verwendet werden, die in ihrer Position winkelabhängig zur Magnetisierung des Substrats justierbar ist.For this purpose, for example, a coil can be used which is adjustable in its position angle-dependent to the magnetization of the substrate.
Um ausgehend vom in Figur 5a gezeigten Zustand zur kreisförmigen Domänenverteilung nach Fig. 5b zu gelangen, wird die Spule derart ausgerichtet, dass ihr Magnetfeld einen Winkel von 88°-89° mit der Magnetisierung des Substrats bildet. Anschließend wird das Substrat durch das Spulenfeld in magnetische Sättigung gebracht und nach langsamem Abschalten stellt sich die neue Domänenkonfiguration ein. Die Streifendomänen nach Fig. 5 c werden in analoger Weise eingestellt. Jedoch ist hierzu ein Winkel von ungefähr 70° zwischen dem Magnetfeld der Spule und der Ausgangsmagnetisierung des Substrats notwendig.In order to arrive at the circular domain distribution of FIG. 5b starting from the state shown in FIG. 5a, the coil is oriented in such a way that its magnetic field forms an angle of 88 ° -89 ° with the magnetization of the substrate. Subsequently, the substrate is brought into magnetic saturation by the coil field and after a slow shutdown, the new domain configuration is established. The stripe domains of Fig. 5 c are set in an analogous manner. However, this requires an angle of approximately 70 ° between the magnetic field of the coil and the output magnetization of the substrate.
Der in Fig. 5d dargestellte Mischzustand ist durch Winkeleinstellungen zwischen den im Zusammenhang mit Fig. 5b und 5 c genannten Werten zu erreichen.The mixing state shown in FIG. 5d can be achieved by angle settings between the values mentioned in connection with FIGS. 5b and 5c.
Von jeder beliebigen Domänenkonfϊguration kann zur Mäanderstruktur aus Figur 5a zurückgekehrt werden, sofern man das Substrat parallel zu seiner Magnetisierung mittels Spule in Sättigung bringt und anschließend das Feld wieder abschaltet.From any domain configuration, it is possible to return to the meandering structure of FIG. 5a if the substrate is brought into saturation by means of a coil parallel to its magnetization and then the field is switched off again.
BEISPIEL 2:EXAMPLE 2
Ist ein bestimmter Domänenzustand (Streifendomänen, Mischzustand, etc.) erst einmal erreicht, kann eine Spule dazu verwendet werden, diese Konfigurationen in der Domänenbreite und/oder Ausrichtung zu verändern. Zu diesem Zweck wird das Spulenfeld parallel mit der Magnetisierung des Substrats ausgerichtet.Once a particular domain state (streak domains, blending state, etc.) is achieved, a coil can be used to alter these configurations in domain width and / or orientation. For this purpose, the coil field is aligned in parallel with the magnetization of the substrate.
Abhängig von der Richtung des Magnetfeldes (und somit von der Richtung und Stärke des Stromes in der Spule) kann nun zeitlich variabel die magnetische Struktur des Trägersubstrats geändert werden.Depending on the direction of the magnetic field (and thus on the direction and magnitude of the current in the coil), the magnetic structure of the carrier substrate can now be varied over time.
Figur 6 zeigt die zeitliche Veränderung der Domänenstruktur über den Zeitraum von 60 s, während dem die Magnetfeldstärke linear von -6,8 mT auf 6,8 mT am Substrat anstieg. Zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Domänenbreite muss hierbei das entsprechende Magnetfeld in seiner Stärke aufrecht erhalten werden.FIG. 6 shows the temporal change of the domain structure over the period of 60 s, during which the magnetic field strength increased linearly from -6.8 mT to 6.8 mT at the substrate. In order to maintain a certain domain width in this case the corresponding magnetic field must be maintained in its strength.
Wie bereits zuvor beschrieben, folgt das magnetische Trägermaterial nach Aufbringung auf das Substrat der Strukturveränderung des magnetischen Substrats und lagert sich bevorzugt im Übergangsbereich zwischen den einzelnen Domänen an. Es bietet somit in Zellkultur eine zeitlich und räumlich variable Struktur, mittels der zeitabhängige zelluläre Vorgänge untersucht werden können. As already described above, after being applied to the substrate, the magnetic carrier material follows the structural change of the magnetic substrate and preferably deposits in the transition region between the individual domains. Thus, it offers in cell culture a temporally and spatially variable structure by means of which time-dependent cellular processes can be investigated.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Beeinflussung lebender Zellen durch Zeil-Oberflächen- Wechselwirkung, wobei biologisch wirksames Material (2) zur Zell-Oberflächen-Wechselwirkung auf magnetisches Trägermaterial (1) aufgebracht wird, anschließend dieses magnetische Trägermaterial (1) auf ein magnetisches Trägersubstrat (6) aufgebracht wird und dieses Trägersubstrat (6) in Verbindung zu lebenden Zellen gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die von dem Trägermaterial (1) auf dem Trägersubstrat (6) gebildete Oberflächenstruktur durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes gezielt beeinflußt wird.1. A method for influencing living cells by cell-surface interaction, wherein biologically active material (2) for cell-surface interaction on magnetic carrier material (1) is applied, then this magnetic carrier material (1) on a magnetic carrier substrate (6) is applied and this support substrate (6) is brought into connection with living cells, characterized in that the surface structure formed by the carrier material (1) on the carrier substrate (6) is influenced in a targeted manner by applying an external magnetic field.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das äußere Magnetfeld durch einen räumlich variabel positionierbaren Permanent- oder Elektromagneten erzeugt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the external magnetic field is generated by a spatially variably positionable permanent or electromagnet.
3 Verfahren nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß elektrische Leiterbahnen in dem Trägersubstrat (6) angeordnet sind und das äußere Magnetfeld durch einen Stromfluss in den elektrischen Leiterbahnen erzeugt bzw. verändert wird.3 A method according to claim 1 or claim 2, characterized in that electrical conductor tracks are arranged in the carrier substrate (6) and the external magnetic field is generated or changed by a current flow in the electrical conductor tracks.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial lokal erwärmt wird, indem das äußere Magnetfeld zumindest in diesem lokalen Bereich im kHz- bis MHz-Bereich veränderlich ausgestaltet wird.4. The method according to claim 1, characterized in that the carrier material is locally heated by the external magnetic field is at least in this local area in the kHz to MHz range designed to be variable.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das äußere Magnetfeld in Funktion der Zeit verändert wird.5. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the external magnetic field is changed in function of time.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das äußere Magnetfeld räumlich verändert wird. 6. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the external magnetic field is changed spatially.
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