EP2046974A2 - Modulators of sc4mol in the treatment of acne or of hyperseborrhoea - Google Patents

Modulators of sc4mol in the treatment of acne or of hyperseborrhoea

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Publication number
EP2046974A2
EP2046974A2 EP07823601A EP07823601A EP2046974A2 EP 2046974 A2 EP2046974 A2 EP 2046974A2 EP 07823601 A EP07823601 A EP 07823601A EP 07823601 A EP07823601 A EP 07823601A EP 2046974 A2 EP2046974 A2 EP 2046974A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression
gene
activity
methyl
sterol oxidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07823601A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Fernand Labrie
Van Luu-The
Mohamed El-Alfy
Jérôme AUBERT
Ezequiel L. Calvo
Johannes Voegel
Isabelle Carlavan
Sophie Deret
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2046974A2 publication Critical patent/EP2046974A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of modulating compounds of C-4 methyl sterol oxidase, for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions.
  • the inventors have now found that the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse sebaceous gland model. They therefore propose to target this gene or its expression product the enzyme C-4 methyl sterol oxidase, to prevent or improve acne phenomena, as well as than any skin disorder associated with hyperseborrhea, including the appearance of oily skin.
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • C-4 methyl sterol oxidase (or “SC4mol”) catalyzes the first of three enzymatic steps of removal of the two methyl groups C-4 4,4-dimethylzymosterol leading to the formation of cholesterol in animals. Changes in the activity of this enzyme result in changes in lipid metabolism, including the accumulation of fatty acids, triglycerides, methyl sterols, and other sterol precursors (Li and Kaplan (1996) J. Biol Chem. 271: 16927-16933).
  • SC4mol gene or "SC4mol nucleic acid” means the gene or nucleic acid sequence that encodes for C-4 methyl sterol oxidase. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous C-4 methyl sterol oxidase, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid coding for the enzyme.
  • a human SC4mol cDNA sequence is reproduced in the appendix (SEQ ID No.1). It is the NM006745 sequence whose coding portion is from nucleic acid 131 to 1012.
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or the activity of the protein C-4 methyl sterol oxidase (SC4mol), the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • SC4mol protein C-4 methyl sterol oxidase
  • the expression of the protein can be determined by an assay of this SC4mol protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of mRNA corresponding, by any method as described above. An assay of the activity of SC4mol can also be envisaged.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in the expression or activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment.
  • treatment with a modulator of SC4mol as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • protein C-4 methyl sterol oxidase (SC4mol) the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by assaying the SC4mol protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of SC4mol can also be envisaged.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control” in this method means a "healthy" reference subject or population.
  • the detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may nevertheless be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum. Screening methods
  • Another subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or any skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising the determination of the capacity of a compound to modulate the expression or the activity of C-4 methyl sterol oxidase or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive treatment or curative of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select the compounds capable of modulating the expression or the activity of the C-4 methyl sterol oxidase, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture.
  • modulation is meant any effect on the level of expression or activity of the enzyme, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, that is, possibly a stimulation. but preferably a partial or complete inhibition.
  • the compounds tested in step d) above preferably inhibit the expression or the activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
  • the difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the SC4mol gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the SC4mol gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin.
  • It may also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a C-4 methyl sterol oxidase, preferably human, or mammalian.
  • a wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to man. of the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • expression of the C-4 methyl sterol oxidase gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its rate of translation.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • detection markers such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage.
  • RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe in slow hybridization conditions in liquid medium.
  • RNA RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe.
  • the hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion.
  • the digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis.
  • the labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-C-4 methyl sterol oxidase antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays, radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In a way Generally, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion. Peptide analysis (in the form of a hydrolyzate) is carried out by separation of the peptides by HPLC (nano-HPLC) based on their physico-chemical properties (reverse phase).
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising a C-4 methyl sterol oxidase enzyme, a substrate of the enzyme and a reductase system (for example NADH with a generating system of NADH or NADPH with an NADPH generator system), and step c) described above is to measure enzymatic activity.
  • a reductase system for example NADH with a generating system of NADH or NADPH with an NADPH generator system
  • the SC4MOL enzyme can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • bacteria for example E. coli or B. subtilis
  • yeasts for example Saccharomyces, Pichia
  • insect cells such as Sf9 or Sf21.
  • the measurement of the enzymatic activity preferably comprises the measurement of the coupling capacity of the methyl sterol oxidase to a decarboxylase.
  • the reaction mixture may for example comprise reacting washed microsomes which supply SC4mol and endogenous decarboxylase, (1 to 2 mg), with 0.5 mM NAD + or 0.1 mM NADH with a NADH generator or 0.1 mM NADPH with an NADPH generator.
  • the generation systems may be 1 ⁇ M b-hydroxybutyrate and 0.31 units / ml b-hydroxybutyrate dehydrogenase for NADH, and 10 mM isocitrate with 0.44 units / ml isocitrate dehydrogenase for NADPH.
  • the sterol substrate is, for example, in a concentration of 50 mM.
  • oxidase activity is measured by collecting the 14 CO2 released following coupling of the oxidation reaction (C-4 sterol methyl oxidase) with the decarboxylase activity also present in microsomes.
  • the invention also relates to the use of a modulator of the human enzyme C-4 methyl sterol oxidase obtainable by one of the methods described above for the preparation of a medicament for the treatment preventive and / or curative acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human enzyme C-4 methyl sterol oxidase, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is an inhibitor of the enzyme.
  • the term "inhibitor” refers to a compound or a chemical substance that substantially eliminates or reduces the enzymatic activity of C-4 methyl sterol oxidase.
  • the term “substantially” means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly it may be a compound that interacts with, and blocks, the catalytic site of the enzyme, as competitive inhibitory type compounds.
  • a preferred inhibitor interacts with the enzyme in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may be an anti-C-4 methyl sterol oxidase inhibitor antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the invention includes the use of compounds inhibiting C-4 methyl sterol oxidase, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of acne, or any skin disorder associated with a hyperseborrhea.
  • examples of inhibitors of C-4 methyl sterol oxidase include the following compounds: 6 - ((2S) -2-Hydroxypentyl) (3S, 9R) -2- aza-3 - ⁇ [4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] methyl ⁇ -2,9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione la (3S, 9R) -2-Aza-3 - ⁇ [4- (2-Hydroxyethoxy) phenyl] methyl) -2,9-dimethyl-5-oxa-6-pentylcyclotridecane-1,4-dione.
  • the modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • These compositions may be administered, for example, enterally, parenterally, or topically.
  • the pharmaceutical composition is applied topically.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres, or lipid or polymeric vesicles for controlled release.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a modulator content of C4-methyl sterol oxidase ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • UV-A and UV-B filters and antioxidants, such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figures 1A, 1B and 1C show the expression of SC4MOL in the sebaceous gland of mouse skin and in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 1A is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization using a sense probe of SC4MOL (negative control;
  • Figure 1B is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 44).
  • Figure 1C is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe in a gonadectomized animal (animal 53).
  • Figures 2A, 2B and 2C show the expression of SC4MOL in the mouse preputial gland by in situ hybridization.
  • Figure 2A is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with a sense probe of SC4MOL (negative control, animal 45).
  • Figure 2B is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe in an intact animal (animal 45).
  • Figure 2C is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe in a gonadectomized animal (animal 52).
  • Figure 3 is a graph showing the measurement of SC4MOL gene expression in gonadectomized male mice.
  • Male mice were gonadectomized and then treated with the vehicle, DHT, DHEA or the combination of DHEA-Flutamide for a period of 7 days once daily (long-term treatment).
  • the preputial glands were removed, RNA was isolated and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique.
  • GDX mice gonadectomized and treated with the vehicle
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA gonadectomized mice treated with Dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands it is metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice treated with a combination of Dihydroepiandrosterone and Flutamide (Androgen receptor antagonist, which blocks the effects of DHT and DHEA agonists).
  • Level of expression level of expression of mRNA Examples: EXPERIMENTAL DATA
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis.
  • RNA expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA.
  • a biotin labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a biotin-conjugated NTP precursor.
  • the cRNAs are then fragmented into small fragments. All molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the effectiveness of enzyme reactions.
  • the Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match") versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
  • Table 1 Measurement of SC4MOL expression in the epidermis and in the human sebaceous gland using the Affymetrix chip technology.
  • Sense and antisense probes were prepared from the SC4MOL gene by incubation of the linearized gene (2 ⁇ g) with 63 ⁇ Ci of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 RNA polymerase or T3.
  • In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 ⁇ m wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated in an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours.
  • Hybridization took place over night in hybridization buffer (prehybridization buffer with DTT and 1 Omm 2X10 6 cpm RNA / .mu.l Smarqué 35) at 53 ° C.
  • the excess probe was removed and the sections were slanted in an LM1 emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month.
  • the sections were then grown and counter stained with hematoxylin and eosin. Hybridization with the sense probe was used as a negative control and only background was detected. These probes were incubated with histological sections of mouse skin or mouse preputial gland.
  • Figure 1A shows a very strong marking of the basal layer of the sebaceous gland, visible by accumulation of silver grains.
  • Figure 1C also shows a marking of the basal layer of the sebaceous gland.
  • SC4MOL is well expressed in the basal layers of the sebaceous glands of mouse skin.
  • a fine analysis based on the observation of histological sections obtained for 4 intact animals and 4 gonadectomized animals indicates a slightly stronger expression in the sebaceous glands of intact animals.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland.
  • Figure 2A shows no marking at the level of the preputial gland which is consistent with the expectations of the inventors because it corresponds to the negative control.
  • Figure 2B shows strong labeling in the acini of the mouse preputial gland in a normal animal.
  • Figure 2C shows a more moderate labeling of acini of the preputial gland in a gonadectomized animal.
  • SC4MOL is expressed in the acini ( Figure 2B) of the mouse preputial gland.
  • Figure 2B An analysis of several histological sections from 4 control animals and 4 gonadectomized animals indicate a slightly stronger expression in the preputial glands of intact animals ( Figure 2B and 2C).
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
  • the inventors analyzed the expression of the SC4MOL enzyme in the preputial glands of mice under conditions of steroid hormone deficiency (especially of androgenic hormones) following gonadectomy.
  • the gonadectomized animals were then treated with physiological amounts of Dihydrotestosterone (DHT) or Dihydroepiandrosterone (DHEA) to restore a physiological level of the androgenic hormones, or as a control experiment with a combination of DHEA-Flutamide in which Flutamide, a androgen receptor antagonist, blocks the effect of DHEA.
  • DHT Dihydrotestosterone
  • DHEA Dihydroepiandrosterone
  • the comparison of the gene expression under these experimental conditions makes it possible to unambiguously identify the modulation or not of the gene expression of a gene in question by the androgenic hormones.
  • Figure 3 highlights the expression of SC4MOL depending on the treatment administered. It is observed that the mRNA of the SC4MOL enzyme is induced by a chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland of mice.
  • Example 5 Examples of Compositions

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Abstract

The invention relates to an in vitro method of screening for candidate compounds for the preventive or curative treatment of acne, comprising the determination of the ability of a compound to modulate the expression or the activity of sterol-C4-methyl oxidase (SC4MOL), and also to the use of modulators of the expression or of the activity of this enzyme for the treatment of acne or of skin disorders associated with hyperseborrhoea. The invention also relates to methods for the diagnosis or prognosis, in vitro, of these pathologies.

Description

Modulateurs de SC4MOL dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée Modulators of SC4MOL in the treatment of acne or hyperseborrhoea
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de la C-4 méthyl stérol oxydase, pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.The invention relates to the identification and use of modulating compounds of C-4 methyl sterol oxidase, for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques.Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum. Classically, a level of sebum greater than 200 μg / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin. Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture. In addition to these aesthetic disorders, the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions.
Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti- androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens. Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence. A hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland. In this context, estrogens, anti-androgens, or agents which decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used. Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have potentially severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.There is therefore a need to identify mediators downstream of the action of steroid hormones, and to modulate them, to obtain a similar therapeutic profile, but with reduced side effects.
Les inventeurs ont maintenant trouvé que le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande sébacée de souris. Ils proposent dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression l'enzyme C-4 méthyl stérol oxydase, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse.The inventors have now found that the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse sebaceous gland model. They therefore propose to target this gene or its expression product the enzyme C-4 methyl sterol oxidase, to prevent or improve acne phenomena, as well as than any skin disorder associated with hyperseborrhea, including the appearance of oily skin.
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.By acne, we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
SC4molSC4MOL
La C-4 méthyl stérol oxydase (ou "SC4mol") catalyse la première des trois étapes enzymatiques d'élimination des deux groupes méthyles C-4 de la 4,4- diméthylzymostérol conduisant à la formation de cholestérol chez l'animal. Des changements dans l'activité de cette enzyme résultent dans des modifications du métabolisme lipidique, incluant l'accumulation des acides gras, des triglycérides, des méthyl stérols, et autres précurseurs de stérols (Li and Kaplan (1996) J. Biol. Chem. 271 :16927-16933).C-4 methyl sterol oxidase (or "SC4mol") catalyzes the first of three enzymatic steps of removal of the two methyl groups C-4 4,4-dimethylzymosterol leading to the formation of cholesterol in animals. Changes in the activity of this enzyme result in changes in lipid metabolism, including the accumulation of fatty acids, triglycerides, methyl sterols, and other sterol precursors (Li and Kaplan (1996) J. Biol Chem. 271: 16927-16933).
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène SC4mol » ou « acide nucléique SC4mol » signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la C-4 méthyl stérol oxydase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une C-4 méthyl stérol oxydase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme. Une séquence d'ADNc humain de SC4mol est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). Il s'agit de la séquence NM006745 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 131 à 1012.In the context of the invention, the term "SC4mol gene" or "SC4mol nucleic acid" means the gene or nucleic acid sequence that encodes for C-4 methyl sterol oxidase. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous C-4 methyl sterol oxidase, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid coding for the enzyme. A human SC4mol cDNA sequence is reproduced in the appendix (SEQ ID No.1). It is the NM006745 sequence whose coding portion is from nucleic acid 131 to 1012.
Applications diagnostiquesDiagnostic applications
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase (SC4mol), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or the activity of the protein C-4 methyl sterol oxidase (SC4mol), the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de SC4mol peut être également envisagé.The expression of the protein can be determined by an assay of this SC4mol protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of mRNA corresponding, by any method as described above. An assay of the activity of SC4mol can also be envisaged.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié a une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine SC4mol, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la SC4mol, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.In the context of a diagnosis, the subject "control" is a "healthy" subject. In the context of a follow-up of the evolution of the acne lesions or a hyperseborrhea-related skin disorder, the "control subject" refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ). This measurement of the difference in the expression or activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment. , in particular treatment with a modulator of SC4mol, as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea. Such follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase (SC4mol), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing the expression or activity of the subject. protein C-4 methyl sterol oxidase (SC4mol), the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a control subject.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de SC4mol peut être également envisagé.Here again, the expression of the protein can be determined by assaying the SC4mol protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above. An assay of the activity of SC4mol can also be envisaged.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou un acné. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.The subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne. The subject "control" in this method means a "healthy" reference subject or population. The detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. Méthodes de criblageIn these in vitro diagnostic or prognostic methods, the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy. Preferably the sample may nevertheless be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum. Screening methods
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou de tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.Another subject of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or any skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising the determination of the capacity of a compound to modulate the expression or the activity of C-4 methyl sterol oxidase or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive treatment or curative of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea. The method therefore makes it possible to select the compounds capable of modulating the expression or the activity of the C-4 methyl sterol oxidase, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.More particularly, the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture.
Par « modulation », on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité de l'enzyme, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine SC4mol, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.By "modulation" is meant any effect on the level of expression or activity of the enzyme, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, that is, possibly a stimulation. but preferably a partial or complete inhibition. Thus, the compounds tested in step d) above preferably inhibit the expression or the activity of the SC4mol protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters. The difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;Throughout this text, unless otherwise specified, "expression of a protein" means the amount of that protein;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;By "protein activity" is meant its biological activity;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).By "promoter activity" is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés.The compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds.
Différents techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase.Various techniques can be implemented to test these compounds and to identify the compounds of therapeutic interest, modulators of the expression or the activity of C-4 methyl sterol oxidase.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène SC4mol, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.According to a first embodiment, the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the SC4mol gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. reporter. The reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein). The assay of the protein encoded by the reporter gene, or of its activity, is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescence techniques, among others. According to a second embodiment, the biological samples are cells expressing the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase, and step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène SC4mol de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.The cell used here can be of any type. It may be a cell expressing the SC4mol gene endogenously, such as for example a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une C-4 méthyl stérol oxydase, de préférence humaine, ou de mammifère.It may also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a C-4 methyl sterol oxidase, preferably human, or mammalian.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.A wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. The nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to man. of the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène de la C-4 méthyl stérol oxydase peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction.In these methods, expression of the C-4 methyl sterol oxidase gene can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its rate of translation.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.By transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced. By translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced. Those skilled in the art are familiar with techniques for the quantitative or semi-quantitative detection of the mRNA of a gene of interest. Techniques based on the hybridization of mRNA with specific nucleotide probes are the most common (Northern Blot, RT-PCR, Rnase protection). It may be advantageous to use detection markers, such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin). In particular, the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection. By RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe. The probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage. RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe in slow hybridization conditions in liquid medium. RNA: RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe. The hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion. The digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis. The labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti - C-4 méthyl stérol oxydase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).The translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene. The antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques. A polyclonal anti-C-4 methyl sterol oxidase antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme. The antiserum is removed and then exhausted according to methods known to those skilled in the art. A monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known. For example, monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma. Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes- anticorps formés.The immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples. According to a preferred embodiment, the capture antibody is immobilized on a solid phase. As non-limiting examples of solid phase, it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads. ELISA assays, radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano- HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).The characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In a way Generally, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion. Peptide analysis (in the form of a hydrolyzate) is carried out by separation of the peptides by HPLC (nano-HPLC) based on their physico-chemical properties (reverse phase). The determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode). The proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme C-4 méthyl stérol oxydase, un substrat de l'enzyme et un système réductase (par exemple du NADH avec un système générateur de NADH ou du NADPH avec un système générateur de NADPH), et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique.According to a third embodiment, step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising a C-4 methyl sterol oxidase enzyme, a substrate of the enzyme and a reductase system (for example NADH with a generating system of NADH or NADPH with an NADPH generator system), and step c) described above is to measure enzymatic activity.
L'enzyme SC4MOL peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.The SC4MOL enzyme can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
La mesure de l'activité enzymatique comprend de préférence la mesure de la capacité de couplage de la méthyl stérol oxydase à une décarboxylase.The measurement of the enzymatic activity preferably comprises the measurement of the coupling capacity of the methyl sterol oxidase to a decarboxylase.
Des dosages de l'activité enzymatique de la SC4mol sont décrits dans la littérature (voir par exemple Miller et al, Biochemistry, 1967, 6 :2673-2678 ; Brady et al, The Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(22) :10624-10629 ; Fukushima et al, The Journal of Biological Chemistry, 1981 , 256(10) :4822-4826 ; ).Assays for the enzymatic activity of SC4mol are described in the literature (see, for example, Miller et al., Biochemistry, 1967, 6: 2673-2678, Brady et al, The Journal of Biological Chemistry, 1980, 255 (22): 10624-10629, Fukushima et al, The Journal of Biological Chemistry, 1981, 256 (10): 4822-4826;).
Le mélange réactionnel peut par exemple comprendre la mise en réaction de microsomes lavés qui apportent la SC4mol et la décarboxylase endogène, (1 à 2mg), avec 0,5mM NAD+ ou 0,1 mM NADH avec un générateur de NADH ou 0,1 mM NADPH avec un générateur de NADPH. Les systèmes de génération peuvent être 1 OmM b-hydroxybutyrate et 0,31 unités/ml de b-hydroxybutyrate déshydrogénase pour le NADH, et 1OmM d'isocitrate avec 0,44 unités/ml d'isocitrate déshydrogénase pour le NADPH. Le substrat stérol est par exemple en concentration de 5OmM. Il peut être marqué au 14C , l'activité oxydase étant dosée en recueillant le 14CO2 libéré suite au couplage de la réaction d'oxydation (C-4 méthyl stérol oxydase) avec l'activité décarboxylase également présente dans les microsomes.The reaction mixture may for example comprise reacting washed microsomes which supply SC4mol and endogenous decarboxylase, (1 to 2 mg), with 0.5 mM NAD + or 0.1 mM NADH with a NADH generator or 0.1 mM NADPH with an NADPH generator. The generation systems may be 1 μM b-hydroxybutyrate and 0.31 units / ml b-hydroxybutyrate dehydrogenase for NADH, and 10 mM isocitrate with 0.44 units / ml isocitrate dehydrogenase for NADPH. The sterol substrate is, for example, in a concentration of 50 mM. he may be labeled with 14 C, oxidase activity is measured by collecting the 14 CO2 released following coupling of the oxidation reaction (C-4 sterol methyl oxidase) with the decarboxylase activity also present in microsomes.
Les réactions catalysées par l'enzyme, et qui peuvent être suivies, sont schématisées ci-après:The reactions catalysed by the enzyme, and which can be followed, are schematized below:
4α-formyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)H + 02 = 4α-carboxy-5α-cholesta-4α-formyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) H + O2 = 4α-carboxy-5α-cholestate
8,24-dien-3β-ol + NAD(P)(+) + H2O ,8.24-dien-3β-ol + NAD (P) (+) + H2O,
4α-hydroxymethyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)H + 02 = 4α-formyl-5α- cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)(+) + 2 H2O ,4α-hydroxymethyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) H + O 2 = 4α-formyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) (+) ) + 2 H2O,
4α-methyl zymosterol + NAD(P)H + 02 = 4α-hydroxymethyl-5α-cholesta-8,24-dien-4α-methyl zymosterol + NAD (P) H + O 2 = 4α-hydroxymethyl-5α-cholesta-8,24-dien
3β-ol + NAD(P)(+) + H20 ,3β-ol + NAD (P) (+) + H20,
4α-formyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)H + 02 = 4α-carboxy-4β- methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)(+) + H20 , 4α-hydroxymethyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)H + 02 = 4α- formyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)(+) + 2 H20 ,4α-formyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) H + O2 = 4α-carboxy-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-b ol + NAD (P) (+) + H 2 O, 4α-hydroxymethyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) H + O 2 = 4α-formyl-4β-methyl- 5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD (P) (+) + 2H 2 O,
4,4-dimethyl-5α-cholesta-8,24-dien-3-β-ol + NAD(P)H + 02 = 4α-hydroxymethyl-4β- methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol + NAD(P)(+) + H204,4-dimethyl-5α-cholesta-8,24-dien-3-β-ol + NAD (P) H + O2 = 4α-hydroxymethyl-4β-methyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β- ol + NAD (P) (+) + H20
Modulateurs de l'enzymeModulators of the enzyme
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.The invention also relates to the use of a modulator of the human enzyme C-4 methyl sterol oxidase obtainable by one of the methods described above for the preparation of a medicament for the treatment preventive and / or curative acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase, à un patient nécessitant un tel traitement.It is thus described here a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea, a method comprising the administration of a therapeutically effective amount of a modulator of the human enzyme C- 4 methyl sterol oxidase, to a patient in need of such treatment.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la C-4 méthyl stérol oxydase. Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM.The invention finally relates to the cosmetic use of a modulator of the human enzyme C-4 methyl sterol oxidase, for the aesthetic treatment of oily skin. Preferably, the modulator is an inhibitor of the enzyme. The term "inhibitor" refers to a compound or a chemical substance that substantially eliminates or reduces the enzymatic activity of C-4 methyl sterol oxidase. The term "substantially" means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly it may be a compound that interacts with, and blocks, the catalytic site of the enzyme, as competitive inhibitory type compounds. A preferred inhibitor interacts with the enzyme in solution at inhibitor concentrations of less than 1 μM, preferably less than 0.1 μM, more preferably less than 0.01 μM.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- C-4 méthyl stérol oxydase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1μg par ml à environ 5μg/ml.The modulator compound may be an anti-C-4 methyl sterol oxidase inhibitor antibody, preferably a monoclonal antibody. Advantageously, such an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 μg per ml to about 100 μg / ml, preferably from about 1 μg per ml to about 5 μg / ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).The modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
L'invention comprend l'utilisation de composés inhibiteurs de C-4 méthyl stérol oxydase, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée.The invention includes the use of compounds inhibiting C-4 methyl sterol oxidase, such as those identified by the screening method described above, for the preventive and / or curative treatment of acne, or any skin disorder associated with a hyperseborrhea.
Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples d'inhibiteurs de la C-4 méthyl stérol oxydase, les composés suivants : - la 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}- 2,9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1 ,4-dione la (3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9-dimethyl-5-oxa-6- pentylcyclotridecane-1 ,4-dione.More particularly, without limitation, examples of inhibitors of C-4 methyl sterol oxidase include the following compounds: 6 - ((2S) -2-Hydroxypentyl) (3S, 9R) -2- aza-3 - {[4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] methyl} -2,9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione la (3S, 9R) -2-Aza-3 - {[4- (2-Hydroxyethoxy) phenyl] methyl) -2,9-dimethyl-5-oxa-6-pentylcyclotridecane-1,4-dione.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.The modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. These compositions may be administered, for example, enterally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres, or lipid or polymeric vesicles for controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.Topically, the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release. This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion. In a preferred variant, the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la C4-méthyl stérol oxydase allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.The composition may comprise a modulator content of C4-methyl sterol oxidase ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :The pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
- des agents mouillants;- wetting agents;
- des agents d'amélioration de la saveur;- flavor enhancers;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque;preserving agents such as esters of parahydroxybenzoic acid;
- des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité;stabilizing agents; humidity regulating agents;
- des agents régulateurs de pH;pH regulating agents;
- des agents modificateurs de pression osmotique;osmotic pressure modifying agents;
- des agents émulsionnants;emulsifying agents;
- des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.UV-A and UV-B filters and antioxidants, such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.The following figures and examples illustrate the invention without limiting its scope.
Légende des figures :Legend of figures:
il Les Figures 1A, 1 B et 1 C montrent l'expression de la SC4MOL dans la glande sébacée de la peau de souris et dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 1A est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens de SC4MOL (contrôle négatif; animalhe Figures 1A, 1B and 1C show the expression of SC4MOL in the sebaceous gland of mouse skin and in the mouse preputial gland by in situ hybridization. Figure 1A is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization using a sense probe of SC4MOL (negative control;
53, gonadectomisé). La Figure 1 B est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 44). La Figure 1 C est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53).53, gonadectomized). Figure 1B is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe, in an intact animal (animal 44). Figure 1C is a photograph of a section of mouse skin subjected to in situ hybridization with an antisense probe in a gonadectomized animal (animal 53).
Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une photographie d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de SC4MOL (contrôle négatif; animal 45). La Figure 2B est une photographie d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 45). La Figure 2C est une photographie d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 52).Figures 2A, 2B and 2C show the expression of SC4MOL in the mouse preputial gland by in situ hybridization. Figure 2A is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with a sense probe of SC4MOL (negative control, animal 45). Figure 2B is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe in an intact animal (animal 45). Figure 2C is a photograph of a prepuce section of mice subjected to in situ hybridization with an antisense probe in a gonadectomized animal (animal 52).
La Figure 3 est un graphe qui montre la mesure de l'expression du gène SC4MOL chez des souris mâles gonadectomisées. Des souris mâles ont été gonadectomisées et ensuite étaient traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhiculeFigure 3 is a graph showing the measurement of SC4MOL gene expression in gonadectomized male mice. Male mice were gonadectomized and then treated with the vehicle, DHT, DHEA or the combination of DHEA-Flutamide for a period of 7 days once daily (long-term treatment). At the end of the experiment the preputial glands were removed, RNA was isolated and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique. GDX: mice gonadectomized and treated with the vehicle
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales il est métabolisé en androgène actif)DHT: gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist) DHEA: gonadectomized mice treated with Dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands it is metabolized to active androgen)
DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes; qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).DHEA-FIu: gonadectomized mice treated with a combination of Dihydroepiandrosterone and Flutamide (Androgen receptor antagonist, which blocks the effects of DHT and DHEA agonists).
Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm Exemples : DONNEES EXPERIMENTALESLevel of expression: level of expression of mRNA Examples: EXPERIMENTAL DATA
Exemple 1 : Expression de l'enzyme SC4MOL dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.EXAMPLE 1 Expression of the SC4MOL Enzyme in the Human Sebaceous Gland and in the Human Epidermis
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.Human sebaceous glands were separated from the human epidermis by dispase treatment and dissection under a binocular microscope. Total RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir d'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation, (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 ).Gene expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company. In short, the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA. From double-stranded cDNA, a biotin labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a biotin-conjugated NTP precursor. The cRNAs are then fragmented into small fragments. All molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the effectiveness of enzyme reactions. The Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a perfectly matched oligonucleotide ("perfect match") versus an oligonucleotide that contains a mutation ("single mismatch") in the central region of the oligonucleotide (see Table 1).
Tableau 1 : mesure de l'expression de SC4MOL dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine par utilisation de la technologie des puces Affymetrix.Table 1: Measurement of SC4MOL expression in the epidermis and in the human sebaceous gland using the Affymetrix chip technology.
Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1 ) ou absence (=0).Indicator of the significance of the expression of the analyzed gene in the sample indicated: presence (= 1) or absence (= 0).
Résultats: L'enzyme SC4MOL est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement plus forte dans la glande sébacée par rapport à l'épiderme.Results: The enzyme SC4MOL is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis). The differential analysis between the expression in the human sebaceous gland and the human epidermis shows that the expression is significantly stronger in the sebaceous gland with respect to the epidermis.
Exemple 2 : Expression de SC4MOL dans la glande sébacée de la peau de souris par « hybridation in situ »EXAMPLE 2 Expression of SC4MOL in the Sebaceous Gland of Mouse Skin by "In Situ Hybridization"
Méthodes :Methods :
Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène SC4MOL par incubation du gène linéarisé (2μg) avec 63μCi de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4μm de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 1 OmM DTT et 2X106 cpm ARN/μl 35Smarqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 1 B et Figure 1C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1A) utilisé comme contrôle négatif.Sense and antisense probes were prepared from the SC4MOL gene by incubation of the linearized gene (2 μg) with 63 μCi of [ 35 S] UTP (1250 Ci / mmol, NEN, Massachusetts, USA) in the presence of T7 RNA polymerase or T3. In situ hybridization was performed on formaldehyde-fixed mouse tissue wrapped in paraffin. Sections (4 μm wide) were then deparaffinized in toluene and rehydrated in an alcohol gradient. After drying, the different sections were incubated in prehybridization buffer for two hours. Hybridization took place over night in hybridization buffer (prehybridization buffer with DTT and 1 Omm 2X10 6 cpm RNA / .mu.l Smarqué 35) at 53 ° C. The excess probe was removed and the sections were slanted in an LM1 emulsion (Amersham Biosciences, UK) and exposed in the dark at 4 ° C for at least one month. The sections were then grown and counter stained with hematoxylin and eosin. Hybridization with the sense probe was used as a negative control and only background was detected. These probes were incubated with histological sections of mouse skin or mouse preputial gland. Following the incubation in the presence of a photographic emulsion, the histological structures marked radioactively by the probe are revealed (accumulation of silver grains). A specific signal is manifested by positive labeling with the antisense probe (Figure 1B and Figure 1C) and the absence of labeling with the sense probe (Figure 1A) used as a negative control.
RESULTATS:RESULTS:
On observe sur la Figure 1A qu'il n'y a pas d'accumulation de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 1 B montre un très fort marquage de la couche basale de la glande sébacée, visible par accumulation de grains argentés. La Figure 1 C montre aussi un marquage de la couche basale de la glande sébacée.It is observed in Figure 1A that there is no accumulation of silver grains (no marking) which is consistent with the expectations of the inventors because it corresponds to the negative control. Figure 1 B shows a very strong marking of the basal layer of the sebaceous gland, visible by accumulation of silver grains. Figure 1C also shows a marking of the basal layer of the sebaceous gland.
SC4MOL est bien exprimée dans les couches basales des glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les glandes sébacées des animaux intacts.SC4MOL is well expressed in the basal layers of the sebaceous glands of mouse skin. A fine analysis based on the observation of histological sections obtained for 4 intact animals and 4 gonadectomized animals indicates a slightly stronger expression in the sebaceous glands of intact animals.
Exemple 3 : Expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris par hybridation in situEXAMPLE 3 Expression of SC4MOL in the Mouse Preputial Gland by In Situ Hybridization
Méthodes :Methods :
Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 2.The methods used in this example are identical to those of Example 2.
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée.The preputial glands of mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland.
RESULTATS:RESULTS:
La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 2B montre un fort marquage dans les acini de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage plus modéré des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé.Figure 2A shows no marking at the level of the preputial gland which is consistent with the expectations of the inventors because it corresponds to the negative control. Figure 2B shows strong labeling in the acini of the mouse preputial gland in a normal animal. Figure 2C shows a more moderate labeling of acini of the preputial gland in a gonadectomized animal.
SC4MOL est exprimée dans les acini (Figure 2B) de la glande préputiale de souris. Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les glandes préputiales des animaux intacts (Figure 2B et 2C).SC4MOL is expressed in the acini (Figure 2B) of the mouse preputial gland. An analysis of several histological sections from 4 control animals and 4 gonadectomized animals indicate a slightly stronger expression in the preputial glands of intact animals (Figure 2B and 2C).
En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression de l'enzyme SC4MOL diminue dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation androgénique (animaux gonadectomisés).In summary, these in situ hybridization results indicate that expression of the SC4MOL enzyme decreases under conditions characterized by a lack of androgenic stimulation (gonadectomized animals).
Exemple 4 : Expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris suite à une stimulation androqéniqueEXAMPLE 4 Expression of SC4MOL in the Mouse Preputial Gland Following Androgenic Pivoting
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.The preputial glands of mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
Les inventeurs ont analysé l'expression de l'enzyme SC4MOL dans les glandes préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment d'hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes, bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.The inventors analyzed the expression of the SC4MOL enzyme in the preputial glands of mice under conditions of steroid hormone deficiency (especially of androgenic hormones) following gonadectomy. The gonadectomized animals were then treated with physiological amounts of Dihydrotestosterone (DHT) or Dihydroepiandrosterone (DHEA) to restore a physiological level of the androgenic hormones, or as a control experiment with a combination of DHEA-Flutamide in which Flutamide, a androgen receptor antagonist, blocks the effect of DHEA. The comparison of the gene expression under these experimental conditions makes it possible to unambiguously identify the modulation or not of the gene expression of a gene in question by the androgenic hormones.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci- dessus. Résultat: La Figure 3 met en avant l'expression de SC4MOL en fonction du traitement administré. On observe que l'ARNm de l'enzyme SC4MOL est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale de souris.Gene expression was analyzed using the Affymetrix technology described above. Result: Figure 3 highlights the expression of SC4MOL depending on the treatment administered. It is observed that the mRNA of the SC4MOL enzyme is induced by a chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland of mice.
Exemple 5 : Exemples de Compositions Example 5: Examples of Compositions

Claims

A- VOIE ORALE Comprimé de 0,2 g- 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9- dimethyl-5-oxacyclotridecane-1 ,4-dione 0,001 g- Amidon 0,1 14 g- Phosphate bicalcique 0,020 g- Silice 0,020 g- Lactose 0,030 g- Talc 0,010 g- Stéarate de magnésium 0,005 gB- VOIE TOPIQUE(a) Onquent-6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9- dimethyl-5-oxacyclotridecane-1 ,4-dione 0,300 g- Vaseline blanche codex qsp lOO g(b) Lotion- (3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9-dimethyl-5-oxa-6- pentylcyclotridecane-1 ,4-dione 0,100 g - Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g- Ethanol à 95% 30,000 g REVENDICATIONS ORAL CHART 0.2 g-6 - ((2S) -2-Hydroxypentyl) (3S, 9R) -2-aza-3 - {[4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] methyl} -2 tablet, 9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 0.001 g-0.114 g starch 0.15 g dibasic calcium phosphate 0.020 g-lactose 0.030 g-Talc 0.010 g magnesium stearate 0.005 gB-TOPICAL RING (a ) -6 - ((2S) -2-Hydroxypentyl) (3S, 9R) -2-aza-3 - {[4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] methyl} -2,9-dimethyl-5-oxacyclotridecane; 1, 4-dione 0.300 g- White Vaseline codex qs 100 g (b) Lotion- (3S, 9R) -2-Aza-3 - {[4- (2-hydroxyethoxy) phenyl] methyl} -2,9-dimethyl -5-oxa-6-pentylcyclotridecane-1,4-dione 0.100 g - Polyethylene glycol (PEG 400) 69.900 g-95% Ethanol 30,000 g CLAIMS
1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.An in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising determining the ability of a compound to modulate expression or activity of C-4 methyl sterol oxidase or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.2. In vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea according to claim 1, comprising the following steps: a. Preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. Contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. Measuring the expression or the activity of the C-4 methyl sterol oxidase protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. Selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the protein C-4 methyl sterol oxidase, or a modulation of the expression of its gene or a modulation of the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or mixture treated in b) relative to the untreated sample or mixture.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.3. Method according to claim 2, characterized in that the compounds selected in step d) inhibit the expression or the activity of the protein C-4 methyl sterol oxidase, or the expression of its gene or activity. at least one of its promoters.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 4. Method according to claim 2 or 3, characterized in that the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase, and in that that step c) consists in measuring the expression of said reporter gene.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la C- 4 méthyl stérol oxydase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.5. Method according to claim 2 or 3, characterized in that the biological samples are cells expressing the gene coding for C-4 methyl sterol oxidase, and in that step c) consists in measuring the expression of said gene. .
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.The method of claim 4 or 5, wherein the cells are sebocytes.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase.The method of claim 4 or 5, wherein the cells are cells transformed with a heterologous nucleic acid encoding C-4 methyl sterol oxidase.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.8. Method according to one of claims 2 to 7, wherein the expression of the gene is determined by measuring the transcription rate of said gene.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.9. Method according to one of claims 2 to 7, wherein the expression of the gene is determined by measuring the translation rate of said gene.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les mélanges réactionnels comprennent chacun une enzyme C-4 méthyl stérol oxydase, un substrat de l'enzyme et un système réductase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.10. Method according to claim 2 or 3, characterized in that the reaction mixtures each comprise a C-4 methyl sterol oxidase enzyme, a substrate of the enzyme and a reductase system, and in that step c) consists of measure enzymatic activity.
11. Méthode selon la revendication 10, dans laquelle la mesure de l'activité enzymatique comprend la mesure de la capacité de couplage de la méthyl stérol oxydase à une décarboxylase. The method of claim 10, wherein measuring the enzymatic activity comprises measuring the coupling ability of the methyl sterol oxidase to a decarboxylase.
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