EP2044435A2 - Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea - Google Patents

Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea

Info

Publication number
EP2044435A2
EP2044435A2 EP07823605A EP07823605A EP2044435A2 EP 2044435 A2 EP2044435 A2 EP 2044435A2 EP 07823605 A EP07823605 A EP 07823605A EP 07823605 A EP07823605 A EP 07823605A EP 2044435 A2 EP2044435 A2 EP 2044435A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
expression
gene
scarb
activity
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07823605A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Fernand Labrie
Pascal Collette
Isabelle Carlavan
Jérôme AUBERT
Ezéquiel L. CALVO
Johannes Voegel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Galderma Research and Development SNC
Original Assignee
Galderma Research and Development SNC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research and Development SNC filed Critical Galderma Research and Development SNC
Publication of EP2044435A2 publication Critical patent/EP2044435A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to the identification and use of SCARB-1 receptor modulating compounds for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
  • Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum.
  • a level of sebum greater than 200 ⁇ g / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin.
  • Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture.
  • the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens.
  • Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence.
  • a hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland.
  • estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used.
  • Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
  • the Applicant has now discovered that the gene coding for the SCARB-1 receptor is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse preputial gland model. It therefore proposes to target the SCARB-1 gene or its expression product, to prevent or improve acne phenomena, as well as the skin disorders associated with hyperseborrhoea, especially the appearance of oily skin.
  • acne we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
  • the Applicant also proposes diagnostic methods, in vitro or prognostic in vitro, based on the detection of the level of expression or activity of SCARB-1.
  • Scavenger receptors are cell surface proteins, which are typically found on macrophages and bind to various types of modified lipoproteins, such as low density lipoproteins (LDL).
  • LDL low density lipoproteins
  • This family of transmembrane receptors which has a great structural diversity, is involved in endocytosis and phagocytosis of apoptotic cells and bacteria, as well as in cell adhesion. These receptors would also intervene in the deposition of LDL cholesterol macrophages at the coronary artery walls, during the early phases of the formation of an atherosclerotic plaque.
  • SCARB-1 scavenger receptor class B, member 1
  • SRB-1 also referred to as SRB-1, or Cla-1
  • SRB-1 belongs to the family of "scavenger” receptors, class B, and is a lipoprotein receptor. high-density, which mediates the incorporation of cholesterol into the cells.
  • SRB-I can also serve as a receptor for non-HDL lipoproteins and would play an important role in the reverse transport of cholesterol. Expression of this gene would be induced by testosterone in macrophages and hepatocytes in culture (Langer et al, Biochem Biophys Res Commun 2002, 296 (5): 1051-1057).
  • Millena et al (Mol CeII Endocrinol, 2004, 224 (1-2): 29-39) have, in turn, shown that an increase in androgen production in response to TGF ⁇ was associated with high levels of mRNA. SCARB-1.
  • SCARB-1 gene or "SCARB-1 nucleic acid” means the gene or nucleic sequence encoding a SCARB-1 transmembrane receptor. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous SCARB-1 receptor, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid sequence. encoding the enzyme (eg an enzyme from another organism). A human SCARB-1 cDNA sequence is reproduced in the appendix (SEQ ID No. 1). This is the NM005505 sequence whose coding portion is from nucleic acid 70 to 1599. Diagnostic applications
  • An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or activity of the subject.
  • SCARB-1 the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by assaying the SCARB-1 protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of SCARB-1 may also be considered.
  • control is a "healthy” subject.
  • control subject refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ).
  • This measurement of the difference in expression or activity of SCARB-1, or expression of its gene or activity of at least one of its promoters makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular treatment with a modulator of SCARB-1, as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
  • Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing SCARB expression or activity. -1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
  • the expression of the protein can be determined by assaying the SCARB-1 protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay.
  • Another method, especially for measuring the expression of the gene is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above.
  • An assay of the activity of SCARB-1 may also be considered.
  • the subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne.
  • the subject "control” in this method means a subject or a "healthy” reference population. The detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy.
  • the sample may nevertheless be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum.
  • An object of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising determining the capacity of a compound to modulate the expression or activity of the SCARB-1 receptor or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • the method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of the SCARB-1 receptor, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
  • the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the SCARB-1 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d.
  • modulation is meant any effect on the expression or the activity of the receptor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, namely possibly a stimulation (ie an agonist activity), but preferably a partial or complete inhibition (ie an antagonistic activity).
  • a stimulation ie an agonist activity
  • a partial or complete inhibition ie an antagonistic activity
  • expression of a protein means the amount of that protein
  • protein activity is meant its biological activity
  • promoter activity is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
  • the compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds. Various techniques can be implemented to test these compounds and to identify the compounds of therapeutic interest, modulators of SCARB-1 receptor expression or activity.
  • the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the SCARB-1 gene, and step c) described above consists in measuring the expression said reporter gene.
  • the reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the assay of the protein encoded by the reporter gene, or its activity, is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescent techniques, among others.
  • the biological samples are cells expressing the SCARB-1 gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene.
  • the cell used here can be of any type. It can be a cell expressing the gene
  • SCARB-1 endogenously such as a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin. It can also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a SCARB-1 receptor, preferably human, or mammalian.
  • host cell systems such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
  • the nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
  • the expression of SCARB-1 can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate.
  • transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced.
  • translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
  • RNAs of a gene of interest are the most common (Northern blot, RT-PCR, RNase protection). It may be advantageous to use detection markers, such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • detection markers such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin).
  • the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection.
  • RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe.
  • the probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage. RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium. RNA: RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe. The hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion. The digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis. The labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
  • the translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene.
  • the antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques.
  • a polyclonal anti-SCARB-1 antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme, sampling and then depleting the antiserum according to methods in themselves known to those skilled in the art.
  • a monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known.
  • monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma.
  • Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
  • the immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples.
  • the capture antibody is immobilized on a solid phase.
  • solid phase it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
  • ELISA assays radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed.
  • the characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion.
  • Peptide analysis in the form of hydrolyzate is carried out by peptide separation by HPLC (nano-HPLC) based on their physicochemical properties (reverse phase).
  • HPLC nano-HPLC
  • the determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode).
  • the proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
  • step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising a SCARB-1 receptor and step c) described above consists in measuring the binding capacity of the compound to the receptor. and the modulation of its activity.
  • the SCARB-1 receptor can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21.
  • Activity measurement refers to the determination of cell adhesion activity, transporter activity, apoptotic activity, activity in lipid metabolism, signal transduction and / or cytokine secretion. .
  • An exemplary detection method is presented in TIAN et al., Bio Env Sci, 2005, 18: 265-272.
  • This method of detecting receptor activity is based on the use of fluorescently labeled human lipoproteins, Dil-lipoproteins (DiI-AcLDL and DiLHDL).
  • the measurement of the binding of the Dil-lipoproteins is carried out by incubation of Sf9 cells, previously transformed with a baculovirus, with a MOI (multiplicity of infection) of 5 with baculoviruses which may or may not have the coding sequence for the SCARB1 receptor, in 50 ⁇ L of culture medium containing 0.2% BSA (bovine serum albumin) with different concentrations of DiL-AcLDL and DiI-HDL at room temperature for a few hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • the subject of the invention is also the use of a SCARB-1 human receptor modulator obtainable according to one of the methods described above for the preparation of a medicinal product intended for preventive and / or curative treatment. acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
  • a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea comprising administering a therapeutically effective amount of a modulator of the human SCARB-1 receptor, to a patient in need of such treatment.
  • the invention finally relates to the cosmetic use of a SCARB-1 receptor modulator, for the aesthetic treatment of oily skin.
  • the modulator is a receptor antagonist.
  • antagonist refers to a compound or chemical substance that substantially eliminates or reduces the activity of the SCARB-1 receptor.
  • substantially means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly, it may be a compound that interacts with, and blocks, binding of the receptor with its ligand.
  • a preferred inhibitor interacts with the receptor in solution at inhibitor concentrations of less than 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the modulator compound may be a SCARB-1 anti-receptor inhibitory antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 ⁇ g per ml to about 100 ⁇ g / ml, preferably from about 1 ⁇ g per ml to about 5 ⁇ g / ml.
  • it may be an antibody that binds to the collagenic extracellular domain of the receptor, which plays a role in ligand binding (Acton, 1993, J. Biol Chem 268 (5): 3530-7).
  • neutralizing antibodies are also described in WO04 / 80385.
  • Other neutralizing antibodies are known in the art (see, for example, Frolov, 2000, J. Biol Chem 275 (17): 12769-12780).
  • the invention comprises the use of such SCARB-1 receptor antagonist compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or any skin disorder associated with hyperseborrhoea.
  • Other modulator compounds identified by the screening method described above are also useful.
  • the modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • These compositions may be administered, for example, orally, parenterally, or topically.
  • the pharmaceutical composition is applied topically.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
  • the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release.
  • This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion.
  • the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
  • the composition may comprise a SCARB-1 modulator content ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
  • preserving agents such as esters of parahydroxybenzoic acid; stabilizing agents;
  • osmotic pressure modifying agents emulsifying agents
  • antioxidants such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
  • Figure 1 shows the measurement of SCARB-1 gene expression in male gonadectomized mice treated with vehicle, DHT, DHEA or combination of
  • DHEA-Flutamide for a period of 7 days once a day (long-term treatment).
  • GDX mice gonadectomized and treated with the vehicle
  • DHT gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
  • DHEA gonadectomized mice treated with dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands metabolized to active androgen)
  • DHEA-FIu gonadectomized mice treated with a combination of
  • Dihydroepiandrosterone and Flutamide which blocks the effects of DHT and DHEA agonists.
  • Figure 2 is a graph of a kinetic study of 15 to 96 hours.
  • the dashed blue line represents expression in gonadectomized mice following treatment with DHT at time zero.
  • the red line represents expression in gonadectomized mice without treatment with DHT.
  • Level of expression level of expression of mRNA
  • RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis. Gene expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company. In short, the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA. From the double-stranded cDNA a biotin labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin. The cRNAs are then fragmented into small fragments.
  • Affymetrix station microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer
  • the calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a oligonucleotide hybridizing perfectly ("perfect match") versus an oligonucleotide which contains a single mismatch in the central region of the oligonucleotide (see Table 1)
  • Table 1 Measurement of the expression of SCARB-1 in the epidermis and in the human sebaceous gland by using the Affymetrix technology.
  • SCARB-1 receptor is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis). Differential analysis between expression in the human sebaceous gland and human repornm shows that SCARB-1 is expressed more strongly in the human sebaceous gland.
  • mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
  • Gene expression was analyzed using the Affymetrix technology described above.
  • SCARB-1 mRNA is induced by chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland.
  • mice Male gonadectomized mice treated with the vehicle, or DHT. A kinetic study of gene expression from 15 minutes to 96 hours was performed. For this, the preputial glands were removed for up to 4 days (single androgenic treatment - observation of short-term kinetics), RNA was isolated, and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique ( Figure 2).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

The invention relates to an in vitro method of screening for candidate compounds for the preventive or curative treatment of acne, comprising the determination of the ability of a compound to modulate the expression or the activity of the SCARB-1 receptor, and also to the use of modulators of the expression or of the activity of this receptor for the treatment of acne or of skin disorders associated with hyperseborrhoea. The invention also relates to methods for the diagnosis or prognosis, in vitro, of these pathologies.

Description

Modulateurs de SCARB-1 dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée Modulators of SCARB-1 in the treatment of acne or hyperseborrhoea
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du récepteur SCARB-1 , pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.The invention relates to the identification and use of SCARB-1 receptor modulating compounds for the treatment of acne, as well as skin disorders associated with hyperseborrhoea. It also relates to methods of in vitro diagnosis or prognosis in vitro of these pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200μg/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnés en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le fœtus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins.Hyperseborrhoeic oily skin is characterized by excessive secretion and excretion of sebum. Classically, a level of sebum greater than 200 μg / cm 2 measured at the forehead is considered to be characteristic of oily skin. Oily skin is often associated with a lack of desquamation, a glowing complexion, a thick skin texture. In addition to these aesthetic disorders, the excess of sebum can serve as a support for the anarchic development of the saprophytic bacterial flora (P. acnes in particular), and cause the appearance of comedones and / or acne lesions. This stimulation of sebaceous gland production is induced by androgens. Acne is, in fact, a chronic disease of the pilosebaceous follicle under hormonal dependence. A hormonal therapy against acne is a possibility of treatment for women, the goal being to oppose the effects of androgens on the sebaceous gland. In this context, estrogens, anti-androgens, or agents that decrease the production of androgens by the ovaries or the adrenal gland are generally used. Antiandrogens used for the treatment of acne include spironolactone, cyproterone acetate, and flutamide. However, these agents have severe side effects. Thus, any pregnancy must be absolutely prevented, particularly because of a risk of feminization for the male fetus. These agents are prohibited in male patients.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits.There is therefore a need to identify mediators downstream of the action of steroid hormones, and to modulate them, to obtain a similar therapeutic profile, but with reduced side effects.
La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour le récepteur SCARB- 1 était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène SCARB-1 ou son produit d'expression, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle.The Applicant has now discovered that the gene coding for the SCARB-1 receptor is expressed in the human sebaceous glands, and that its expression is regulated by androgens, in vivo, in a mouse preputial gland model. It therefore proposes to target the SCARB-1 gene or its expression product, to prevent or improve acne phenomena, as well as the skin disorders associated with hyperseborrhoea, especially the appearance of oily skin. By acne, we mean all forms of acne, namely in particular vulgar acne, comedonal, polymorphic, nodulocystic acne, conglobata, or secondary acne such as solar acne, drug or professional.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic, in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité du SCARB-1.The Applicant also proposes diagnostic methods, in vitro or prognostic in vitro, based on the detection of the level of expression or activity of SCARB-1.
SCARB-ISCARB-I
Les récepteurs éboueurs ("scavengers") sont des protéines de surface cellulaire, qui sont typiquement trouvées sur les macrophages et qui se lient à divers types de lipoprotéines modifiées, telles que les lipoprotéines de basse densité (LDL). Cette famille de récepteurs transmembranaires, qui présente une grande diversité structurelle, est impliquée dans l'endocytose et la phagocytose des cellules apoptotiques et des bactéries, ainsi que dans l'adhésion cellulaire. Ces récepteurs interviendraient aussi dans le dépôt du LDL cholestérol des macrophages au niveau des parois des artères coronaires, au cours des premières phases de la formation d'une plaque d'athérosclérose.Scavenger receptors are cell surface proteins, which are typically found on macrophages and bind to various types of modified lipoproteins, such as low density lipoproteins (LDL). This family of transmembrane receptors, which has a great structural diversity, is involved in endocytosis and phagocytosis of apoptotic cells and bacteria, as well as in cell adhesion. These receptors would also intervene in the deposition of LDL cholesterol macrophages at the coronary artery walls, during the early phases of the formation of an atherosclerotic plaque.
SCARB-1 ("scavenger receptor class B, member 1 ", désigné également SRB-1 , ou Cla-1 ) appartient à la famille des récepteurs "éboueurs" ("scavengers"), de classe B, et est un récepteur des lipoprotéines de haute-densité, qui médie l'incorporation de cholestérol dans les cellules. SRB-I peut aussi servir de récepteur à des lipoprotéines non-HDL et jouerait un rôle important dans le transport inverse du cholestérol. L'expression de ce gène serait induite par la testostérone dans des macrophages et des hépatocytes en culture (Langer et al, Biochem Biophys Res Commun. 2002, 296(5) :1051 -1057). Millena et al (Mol CeII Endocrinol, 2004, 224(1 -2) :29-39) ont, de leur côté, montré qu'une augmentation de la production androgénique en réponse au TGFβ était associée à des niveaux élevés d'ARNm de SCARB-1.SCARB-1 ("scavenger receptor class B, member 1", also referred to as SRB-1, or Cla-1) belongs to the family of "scavenger" receptors, class B, and is a lipoprotein receptor. high-density, which mediates the incorporation of cholesterol into the cells. SRB-I can also serve as a receptor for non-HDL lipoproteins and would play an important role in the reverse transport of cholesterol. Expression of this gene would be induced by testosterone in macrophages and hepatocytes in culture (Langer et al, Biochem Biophys Res Commun 2002, 296 (5): 1051-1057). Millena et al (Mol CeII Endocrinol, 2004, 224 (1-2): 29-39) have, in turn, shown that an increase in androgen production in response to TGFβ was associated with high levels of mRNA. SCARB-1.
Dans le contexte de l'invention, le terme « gène SCARB-1 » ou « acide nucléique SCARB-1 » signifie le gène ou la séquence nucléique codant pour un récepteur transmembranaire SCARB-1. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant un récepteur SCARB-1 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'une séquence d'acides nucléiques exogène codant pour l'enzyme (par exemple une enzyme d'un autre organisme). Une séquence d'ADNc humain de SCARB-1 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1 ). Il s'agit de la séquence NM005505 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 70 à 1599. Applications diagnostiquesIn the context of the invention, the term "SCARB-1 gene" or "SCARB-1 nucleic acid" means the gene or nucleic sequence encoding a SCARB-1 transmembrane receptor. If the targeted target is preferably the human gene or its expression product, the invention can also use cells expressing a heterologous SCARB-1 receptor, by genomic integration or transient expression of an exogenous nucleic acid sequence. encoding the enzyme (eg an enzyme from another organism). A human SCARB-1 cDNA sequence is reproduced in the appendix (SEQ ID No. 1). This is the NM005505 sequence whose coding portion is from nucleic acid 70 to 1599. Diagnostic applications
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du SCARB-1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SCARB-1 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du SCARB-1 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet « contrôle » est un sujet « sain ». Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié a une hyperséborrhée, le « sujet contrôle » fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou de l'activité du SCARB-1 , ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du SCARB-1 , tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement.An object of the invention relates to an in vitro method for diagnosing or monitoring the progression of acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhea in a subject, comprising comparing the expression or activity of the subject. SCARB-1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject. The expression of the protein can be determined by assaying the SCARB-1 protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above. An assay of the activity of SCARB-1 may also be considered. In the context of a diagnosis, the subject "control" is a "healthy" subject. In the context of a follow-up of the evolution of the acne lesions or a hyperseborrhea-related skin disorder, the "control subject" refers to the same subject at a different time, which preferably corresponds to the beginning of the treatment (To ). This measurement of the difference in expression or activity of SCARB-1, or expression of its gene or activity of at least one of its promoters, makes it possible in particular to monitor the efficacy of a treatment, in particular treatment with a modulator of SCARB-1, as envisaged above or by another treatment against acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea. Such follow-up can reassure the patient as to the appropriateness, or necessity, of continuing this treatment.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité du SCARB-1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle.Another aspect of the present invention relates to an in vitro method for determining susceptibility of a subject to develop acne lesions or skin disorder associated with hyperseborrhoea, comprising comparing SCARB expression or activity. -1, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in a biological sample of a subject relative to a biological sample of a control subject.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine SCARB-1 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du SCARB-1 peut être également envisagé.Here again, the expression of the protein can be determined by assaying the SCARB-1 protein by radioimmunoassay, for example by ELISA assay. Another method, especially for measuring the expression of the gene, is to measure the amount of corresponding mRNA by any method as described above. An assay of the activity of SCARB-1 may also be considered.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet « contrôle », dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence « saine ». La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.The subject tested here is an asymptomatic subject, having no skin disorder associated with hyperseborrhoea or acne. The subject "control" in this method means a subject or a "healthy" reference population. The detection of this susceptibility allows the establishment of a preventive treatment and / or increased monitoring of signs related to acne or a skin disorder associated with hyperseborrhoea.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.In these in vitro diagnostic or prognostic methods, the biological sample tested may be any sample of biological fluid or a sample of a biopsy. Preferably the sample may nevertheless be a preparation of skin cells, obtained for example by desquamation or biopsy. It can also be sebum.
Méthodes de criblageScreening methods
Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 , ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.An object of the invention is an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising determining the capacity of a compound to modulate the expression or activity of the SCARB-1 receptor or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, said modulation indicating the utility of the compound for the preventive or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea. The method therefore makes it possible to select compounds capable of modulating the expression or the activity of the SCARB-1 receptor, or the expression of its gene, or the activity of at least one of its promoters.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SCARB-1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine SCARB-1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par « modulation », on entend tout effet sur l'expression ou l'activité du récepteur, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation (c'est à dire une activité agoniste), mais de préférence une inhibition, partielle ou complète (c'est à dire une activité antagoniste). La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus.More particularly, the invention relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhoea, comprising the following steps: a. preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. measuring the expression or the activity of the SCARB-1 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the SCARB-1 protein, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or the mixture treated in b), relative to the untreated sample or mixture. By "modulation" is meant any effect on the expression or the activity of the receptor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, namely possibly a stimulation (ie an agonist activity), but preferably a partial or complete inhibition (ie an antagonistic activity). The difference in expression obtained with the test compound compared to a control carried out in the absence of the compound is significant from 25% or more.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par « expression d'une protéine », on entend la quantité de cette protéine ;Throughout this text, unless otherwise specified, "expression of a protein" means the amount of that protein;
Par « activité d'une protéine », on entend son activité biologique ;By "protein activity" is meant its biological activity;
Par « activité d'un promoteur », on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante).By "promoter activity" is meant the ability of this promoter to trigger the transcription of the coded DNA sequence downstream of this promoter (and thus indirectly the synthesis of the corresponding protein).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en œuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1 .The compounds tested can be of any type. They can be of natural origin or have been produced by chemical synthesis. It can be a library of structurally defined chemical compounds, compounds or uncharacterized substances, or a mixture of compounds. Various techniques can be implemented to test these compounds and to identify the compounds of therapeutic interest, modulators of SCARB-1 receptor expression or activity.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène SCARB-1 , et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur.According to a first embodiment, the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the SCARB-1 gene, and step c) described above consists in measuring the expression said reporter gene.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène SCARB-1 , et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gèneThe reporter gene may in particular code for an enzyme which, in the presence of a given substrate, leads to the formation of colored products, such as CAT (chloramphenicol acetyltransferase), GAL (beta galactosidase), or GUS (beta glucuronidase). It may also be the gene for luciferase or GFP (Green Fluorescent Protein). The assay of the protein encoded by the reporter gene, or its activity, is carried out conventionally, by colorimetric, fluorometric or chemiluminescent techniques, among others. According to a second embodiment, the biological samples are cells expressing the SCARB-1 gene, and the step c) described above consists in measuring the expression of said gene. The cell used here can be of any type. It can be a cell expressing the gene
SCARB-1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour un récepteur SCARB-1 , de préférence humain, ou de mammifère.SCARB-1 endogenously, such as a liver cell, an ovarian cell, or more preferably a sebocyte. It is also possible to use organs of human or animal origin, such as, for example, the preputial gland, clitoral gland or the sebaceous gland of the skin. It can also be a cell transformed with a heterologous nucleic acid, encoding a SCARB-1 receptor, preferably human, or mammalian.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293.A wide variety of host cell systems can be used, such as, for example, Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells.
L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection.The nucleic acid can be stably or transiently transfected by any method known to those skilled in the art, for example by calcium phosphate, DEAE-dextran, liposome, virus, electroporation, or microinjection.
Dans cette méthode, l'expression de SCARB-1 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite.In this method, the expression of SCARB-1 can be determined by measuring the transcription rate of said gene, or its translation rate. By transcription rate of a gene is meant the amount of corresponding mRNA produced. By translation rate of a gene is meant the amount of corresponding protein produced.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été clone dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybride est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.Those skilled in the art are familiar with techniques for the quantitative or semi-quantitative detection of the mRNA of a gene of interest. Techniques based on the hybridization of mRNA with specific nucleotide probes are the most common (Northern blot, RT-PCR, RNase protection). It may be advantageous to use detection markers, such as fluorescent, radioactive, enzymatic or other ligands (e.g., avidin / biotin). In particular, the expression of the gene can be measured by real-time PCR or by RNase protection. By RNase protection is meant the detection of a known mRNA from the poly (A) RNAs of a tissue that can be done by means of specific hybridization with a labeled probe. The probe is a complementary RNA labeled (radioactive) messenger to look for. It can be constructed from a known mRNA whose cDNA, after RT-PCR, has been cloned into a phage. RNA-poly (A) of the tissue where the sequence is to be searched is incubated with this probe under slow hybridization conditions in a liquid medium. RNA: RNA hybrids are formed between the desired mRNA and the antisense probe. The hybrid medium is then incubated with a mixture of ribonucleases specific for single-stranded RNA, so that only the hybrids formed with the probe can resist this digestion. The digestion product is then deproteinized and repurified, before being analyzed by electrophoresis. The labeled hybrid RNAs are detected by autoradiography.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal anti-SCARB-1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière, prélèvement puis épuisement de l'antisérum selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).The translation rate of the gene is evaluated for example by immunological assay of the product of said gene. The antibodies used for this purpose may be of polyclonal or monoclonal type. Their production is based on conventional techniques. A polyclonal anti-SCARB-1 antibody can, inter alia, be obtained by immunizing an animal such as a rabbit or a mouse, using the entire enzyme, sampling and then depleting the antiserum according to methods in themselves known to those skilled in the art. A monoclonal antibody can, inter alia, be obtained by the conventional method of Kohler and Milstein (Nature (London), 256: 495-497 (1975)). Other methods of preparing monoclonal antibodies are also known. For example, monoclonal antibodies can be produced by expression of a cloned nucleic acid from a hybridoma. Antibodies can also be produced by the phage display technique, by introducing antibody cDNAs into vectors, which are typically filamentous phages that have V gene libraries on the surface of the phage. (for example fUSE5 for E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.The immunoassay can be carried out in solid phase or in homogeneous phase; in a time or in two stages; sandwich method or competitive method, by way of non-limiting examples. According to a preferred embodiment, the capture antibody is immobilized on a solid phase. As non-limiting examples of solid phase, it is possible to use microplates, in particular polystyrene microplates, or particles or solid beads, paramagnetic beads.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physicochimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).ELISA assays, radioimmunoassays, or any other detection technique can be used to reveal the presence of the antigen-antibody complexes formed. The characterization of antigen / antibody complexes, and more generally isolated or purified but also recombinant proteins (obtained in vitro and in vivo) can be performed by mass spectrometry analysis. This identification is made possible thanks to the analysis (determination of the mass) of the peptides generated by the enzymatic hydrolysis of the proteins (trypsin in general). In general, the proteins are isolated according to methods known to those skilled in the art, prior to enzymatic digestion. Peptide analysis (in the form of hydrolyzate) is carried out by peptide separation by HPLC (nano-HPLC) based on their physicochemical properties (reverse phase). The determination of the mass of the peptides thus separated is carried out by ionization of the peptides and either by direct coupling to the mass spectrometer (electrospray mode ESI) or after deposition and crystallization in the presence of a matrix known to those skilled in the art ( analysis in MALDI mode). The proteins are then identified through the use of appropriate software (eg Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun un récepteur SCARB-1 et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer la capacité de liaison du composé au récepteur et la modulation de son activité.According to a third embodiment, step a) described above consists in preparing reaction mixtures each comprising a SCARB-1 receptor and step c) described above consists in measuring the binding capacity of the compound to the receptor. and the modulation of its activity.
Le récepteur SCARB-1 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. La mesure de l'activité se réfère à la détermination de l'activité d'adhésion cellulaire, activité de transporteur, d'activité apoptotique, d'activité dans le métabolisme lipidique, dans la transduction du signal et/ou dans la sécrétion de cytokine. Un exemple de méthode de détection est présenté dans TIAN et al., Bio Env Sci, 2005, 18 :265-272. Cette méthode de détection de l'activité du récepteur est basée sur l'utilisation de lipoprotéines humaines marquées par fluorescence, les Dil-lipoprotéines (DiI-AcLDL et DiLHDL). La mesure de la liaison des Dil-lipoprotéines est réalisée par incubation de cellules Sf9, préalablement transformées avec un baculovirus à une M. O. I (multiplicité d'infection) de 5 avec des baculovirus possédant ou non la séquence codante pour le récepteur SCARB1 , dans 50 μL de milieu de culture Grâce contenant 0,2% de BSA (sérumalbumine bovine) avec différentes concentrations de DiL-AcLDL et de DiI-HDL à température ambiante pendant quelques heures. Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec un tampon phosphate (PBS) froid, détachées avec une pipette et transférées sur une plaque contenant 100μL de PBS. Les résultats ont été quantifiés avec un lecteur de fluorescence de plaque. La mesure de l'activité de liaison spécifique du récepteur est faite par différence entre l'activité de liaison des cellules transformées avec le baculovirus n'exprimant pas le récepteur (contrôle) et l'activité de liaison les cellules transformées avec le baculovirus exprimant le récepteur. Modulateurs du récepteurThe SCARB-1 receptor can be produced according to standard techniques using Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 cells. It can also be produced using microorganisms such as bacteria (for example E. coli or B. subtilis), yeasts (for example Saccharomyces, Pichia) or insect cells, such as Sf9 or Sf21. Activity measurement refers to the determination of cell adhesion activity, transporter activity, apoptotic activity, activity in lipid metabolism, signal transduction and / or cytokine secretion. . An exemplary detection method is presented in TIAN et al., Bio Env Sci, 2005, 18: 265-272. This method of detecting receptor activity is based on the use of fluorescently labeled human lipoproteins, Dil-lipoproteins (DiI-AcLDL and DiLHDL). The measurement of the binding of the Dil-lipoproteins is carried out by incubation of Sf9 cells, previously transformed with a baculovirus, with a MOI (multiplicity of infection) of 5 with baculoviruses which may or may not have the coding sequence for the SCARB1 receptor, in 50 μL of culture medium containing 0.2% BSA (bovine serum albumin) with different concentrations of DiL-AcLDL and DiI-HDL at room temperature for a few hours. After incubation, the cells were washed twice with cold phosphate buffer (PBS), detached with a pipette and transferred to a plate containing 100 μl of PBS. The results were quantified with a plate fluorescence reader. The measurement of the specific binding activity of the receptor is made by difference between the binding activity of the cells transformed with the baculovirus not expressing the receptor (control) and the binding activity of the cells transformed with the baculovirus expressing the receiver. Receiver modulators
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur humain SCARB-1 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée.The subject of the invention is also the use of a SCARB-1 human receptor modulator obtainable according to one of the methods described above for the preparation of a medicinal product intended for preventive and / or curative treatment. acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur humain SCARB- 1 , à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur du récepteur SCARB-1 , pour le traitement esthétique des peaux grasses.Thus, a method of preventive and / or curative treatment of acne, or skin disorders associated with hyperseborrhoea, is described herein comprising administering a therapeutically effective amount of a modulator of the human SCARB-1 receptor, to a patient in need of such treatment. The invention finally relates to the cosmetic use of a SCARB-1 receptor modulator, for the aesthetic treatment of oily skin.
De manière préférentielle, le modulateur est un antagoniste du récepteur. Le terme « antagoniste » ou « inhibiteur » se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité du récepteur SCARB-1 . Le terme « substantiellement » signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, la liaison du récepteur avec son ligand. Un inhibiteur préféré interagit avec le récepteur en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 μM, de préférence moins de 0,1 μM, de préférence encore moins de 0,01 μM.Preferably, the modulator is a receptor antagonist. The term "antagonist" or "inhibitor" refers to a compound or chemical substance that substantially eliminates or reduces the activity of the SCARB-1 receptor. The term "substantially" means a reduction of at least 25%, preferably at least 35%, more preferably at least 50%, and more preferably at least 70% or 90%. More particularly, it may be a compound that interacts with, and blocks, binding of the receptor with its ligand. A preferred inhibitor interacts with the receptor in solution at inhibitor concentrations of less than 1 μM, preferably less than 0.1 μM, more preferably less than 0.01 μM.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).The modulator compound may also be a polypeptide, an antisense DNA or RNA polynucleotide, an si-RNA, or a PNA ("Peptide nucleic acid", a polypeptide chain substituted with purine and pyrimidine bases, whose spatial structure mimes that of DNA and allows hybridization to it).
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- récepteur SCARB-1 , de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 μg par ml à environ 100μg/ml, de préférence d'environ 1 μg par ml à environ 5μg/ml.The modulator compound may be a SCARB-1 anti-receptor inhibitory antibody, preferably a monoclonal antibody. Advantageously, such an inhibitory antibody is administered in an amount sufficient to obtain a plasma concentration of about 0.01 μg per ml to about 100 μg / ml, preferably from about 1 μg per ml to about 5 μg / ml.
Il peut par exemple s'agir d'un anticorps qui se lie au domaine extracellulaire collagénique du récepteur, qui joue un rôle dans la liaison au ligand (Acton, 1993, J. Biol. Chem. 268 (5): 3530-7). Des exemples d'anticorps neutralisants sont également décrits dans la demande WO04/80385. D'autres anticorps neutralisants sont connus dans l'art antérieur (voir par exemple Frolov, 2000, J. Biol. Chem. 275 (17): 12769-12780). L'invention comprend l'utilisation de tels composés antagonistes du récepteur SCARB-1 pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut sont également utiles.For example, it may be an antibody that binds to the collagenic extracellular domain of the receptor, which plays a role in ligand binding (Acton, 1993, J. Biol Chem 268 (5): 3530-7). . Examples of neutralizing antibodies are also described in WO04 / 80385. Other neutralizing antibodies are known in the art (see, for example, Frolov, 2000, J. Biol Chem 275 (17): 12769-12780). The invention comprises the use of such SCARB-1 receptor antagonist compounds for the preventive and / or curative treatment of acne, or any skin disorder associated with hyperseborrhoea. Other modulator compounds identified by the screening method described above are also useful.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.The modulating compounds are formulated within a pharmaceutical composition, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle. These compositions may be administered, for example, orally, parenterally, or topically. Preferably, the pharmaceutical composition is applied topically. Orally, the pharmaceutical composition can be in the form of tablets, capsules, dragees, syrups, suspensions, solutions, powders, granules, emulsions, suspensions of microspheres or nanospheres or lipid vesicles or polymers for controlled release. Parenterally, the pharmaceutical composition may be in the form of solutions or suspensions for infusion or for injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.Topically, the pharmaceutical composition is more particularly intended for the treatment of skin and mucous membranes and may be in the form of ointments, creams, milks, ointments, powders, soaked swabs, solutions, gels , sprays, lotions or suspensions. It may also be in the form of suspensions of microspheres or nanospheres or lipid or polymeric vesicles or polymeric patches or hydrogels allowing controlled release. This composition for topical application may be in anhydrous form, in aqueous form or in the form of an emulsion. In a preferred variant, the pharmaceutical composition is in the form of a gel, a cream or a lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la SCARB-1 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition.The composition may comprise a SCARB-1 modulator content ranging from 0.001 to 10% by weight, especially from 0.01 to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que :The pharmaceutical composition may further contain inert additives or combinations of these additives, such as:
- des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur;- wetting agents; - flavor enhancers;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants;preserving agents such as esters of parahydroxybenzoic acid; stabilizing agents;
- des agents régulateurs d'humidité;humidity regulating agents;
- des agents régulateurs de pH;pH regulating agents;
- des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants;osmotic pressure modifying agents; emulsifying agents;
- des filtres UV-A et UV-BUV-A and UV-B filters
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux.and antioxidants, such as alpha-tocopherol, butylhydroxyanisole or butylhydroxytoluene, superoxide dismutase, ubiquinol or certain metal chelators.
Les Figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.The following figures and examples illustrate the invention without limiting its scope.
Légendes des FiguresLegends of Figures
La Figure 1 montre la mesure de l'expression du gène SCARB-1 chez des souris mâles gonadectomisés et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison deFigure 1 shows the measurement of SCARB-1 gene expression in male gonadectomized mice treated with vehicle, DHT, DHEA or combination of
DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme).DHEA-Flutamide for a period of 7 days once a day (long-term treatment).
A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées, l'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix. GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhiculeAt the end of the experiment the preputial glands were removed, RNA was isolated and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique. GDX: mice gonadectomized and treated with the vehicle
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes)DHT: gonadectomized mice treated with Dihydrotestosterone (androgen receptor agonist)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-FIu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison deDHEA: gonadectomized mice treated with dihydroepiandrosterone (precursor of steroid hormones, in the preputial glands metabolized to active androgen) DHEA-FIu: gonadectomized mice treated with a combination of
Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux androgènes; qui bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).Dihydroepiandrosterone and Flutamide (androgen receptor antagonist, which blocks the effects of DHT and DHEA agonists).
Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNmLevel of expression: level of expression of mRNA
La Figure 2 est un graphe d'une étude cinétique de 15 à 96 heures. Les points l_24h et l_24h(R1 ) montrent le niveau d'expression de SCARB-1 de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicata) au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique. La ligne bleue pointillée représente l'expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT au temps zéro. La ligne rouge représente l'expression dans les souris gonadectomisées sans traitement avec le DHT. Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNmFigure 2 is a graph of a kinetic study of 15 to 96 hours. The points l_24h and l_24h (R1) show the expression level of SCARB-1 of control mice (= non-gonadectomized mice, duplicates) at the 24-hour point. The following points come from gonadectomized mice and indicate the successive times (in hours) of the kinetic study. The dashed blue line represents expression in gonadectomized mice following treatment with DHT at time zero. The red line represents expression in gonadectomized mice without treatment with DHT. Level of expression: level of expression of mRNA
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALESExamples: EXPERIMENTAL DATA
Exemple 1 : Expression de SCARB-1 dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.Example 1 Expression of SCARB-1 in the human sebaceous gland and in the human epidermis.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système « Lab on a chip » d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide s'hybridant parfaitement (« perfect match ») versus un oligonucléotide qui contient une mutation (« single mismatch ») dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1 )Human sebaceous glands were separated from the human epidermis by dispase treatment and dissection under a binocular microscope. Total RNA samples were prepared from the sebaceous glands and from the epidermis. Gene expression was analyzed on an Affymetrix station (microfluidic module, hybridization oven, scanner, computer) following the protocols provided by the company. In short, the total RNA isolated from the tissues is transcribed into cDNA. From the double-stranded cDNA a biotin labeled cRNA is synthesized using T7 polymerase and a precursor NTP conjugated to biotin. The cRNAs are then fragmented into small fragments. All molecular biology steps are controlled using Agilent's "Lab on a chip" system to confirm the good efficiencies of the enzyme reactions. The Affymetrix chip is hybridized with the biotinylated cRNA, rinsed and then fluorescently labeled using a streptavidin-conjugated fluorophore. After washes the chip is scanned and the results are calculated using the MAS5 software provided by Affymetrix. An expression value is obtained for each gene as well as an indication of the significance of the value obtained. The calculation of the significance of the expression is based on the analysis of the signals that are obtained following the hybridization of the cRNA of a given gene with a oligonucleotide hybridizing perfectly ("perfect match") versus an oligonucleotide which contains a single mismatch in the central region of the oligonucleotide (see Table 1)
Tableau 1 : Mesure de l'expression de SCARB-1 dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine par utilisation de la technologie Affymetrix. Table 1: Measurement of the expression of SCARB-1 in the epidermis and in the human sebaceous gland by using the Affymetrix technology.
indicateur de la significativité du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). indicator of the significance of the gene analyzed in the sample indicated: presence (= 1) or absence (= 0).
Résultats : Le récepteur SCARB-1 est bien exprimé dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et répiderme humain montre que SCARB-1 est exprimé plus fortement dans la glande sébacée humaine.Results: The SCARB-1 receptor is well expressed in both tissues (sebaceous gland, epidermis). Differential analysis between expression in the human sebaceous gland and human repornm shows that SCARB-1 is expressed more strongly in the human sebaceous gland.
Exemple 2 : expression de SCARB-1 dans la glande préputiale de sourisEXAMPLE 2 Expression of SCARB-1 in the Mouse Preputial Gland
A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection.A. The preputial glands of mice show differentiation of the sebocyte type and are used as an experimental model of the sebaceous gland. They are of sufficient size to allow isolation of RNA without the use of microdissection technologies.
L'analyse de l'expression de SCARB-1 dans les glandes préputiales de souris a été réalisée dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEA- Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques (Figure 1 ).Analysis of the expression of SCARB-1 in the mouse preputial glands was carried out under conditions of steroid hormone deficiency (especially in androgenic hormones) following gonadectomy. The gonadectomized animals were then treated with physiological amounts of Dihydrotestosterone (DHT) or Dihydroepiandrosterone (DHEA) to restore a physiological level of the androgenic hormones, or as a control experiment with a combination of DHEA-Flutamide in which Flutamide, a Androgen receptor antagonist blocks the effect of DHEA. The comparison of gene expression under these conditions The experimental method makes it possible to unambiguously identify the modulation or not of the gene expression of a gene in question by the androgenic hormones (FIG. 1).
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci- dessus.Gene expression was analyzed using the Affymetrix technology described above.
Résultat:Result:
L'ARNm de SCARB-1 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.SCARB-1 mRNA is induced by chronic treatment for 7 days with androgens in the preputial gland.
B. Des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou le DHT. Une étude cinétique de l'expression du gène, de 15 minutes à 96 heures, a été réalisée. Pour cela, les glandes préputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme), l'ARN a été isolé, et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix (Figure 2).B. Male gonadectomized mice treated with the vehicle, or DHT. A kinetic study of gene expression from 15 minutes to 96 hours was performed. For this, the preputial glands were removed for up to 4 days (single androgenic treatment - observation of short-term kinetics), RNA was isolated, and gene expression was analyzed by the Affymetrix technique (Figure 2).
Résultats:Results:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit une diminution de la quantité d'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la souris. L'ARNm de SCARB-1 dans la glande préputiale de la souris n'est pas induit par un traitement court terme avec le DHT (effet non visible à 18, 24, 48 et 96 heures). Gonadectomy (which causes a deficiency of steroid hormones) induces a decrease in the amount of SCARB-1 mRNA in the mouse preputial gland. SCARB-1 mRNA in the mouse preputial gland is not induced by short-term treatment with DHT (effect not seen at 18, 24, 48 and 96 hours).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.1. In vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne or skin disorders associated with hyperseborrhea, comprising determining the ability of a compound to modulate receptor expression or activity SCARB-1 or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1 , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité du récepteur SCARB-1 , ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.2. In vitro method for screening candidate compounds for the preventive and / or curative treatment of acne and / or skin disorders associated with hyperseborrhoea according to claim 1, comprising the following steps: a. Preparation of at least two biological samples or reaction mixtures; b. Contacting one of the samples or reaction mixtures with one or more of the test compounds; vs. Measuring the expression or the activity of the SCARB-1 receptor, the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters, in the biological samples or reaction mixtures; d. Selection of compounds for which a modulation of the expression or activity of the SCARB-1 receptor, or a modulation of the expression of its gene or a modulation of the activity of at least one of its promoters, is measured in the sample or mixture treated in (b) in relation to the untreated sample or mixture.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité du récepteur SCARB-1 , ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs.3. Method according to claim 2, characterized in that the compounds selected in step d) inhibit the expression or the activity of the SCARB-1 receptor, or the expression of its gene or the activity of at least one of its promoters.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant le récepteur SCARB-1 , et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 4. Method according to claim 2 or 3, characterized in that the biological samples are cells transfected with a reporter gene operably linked to all or part of the promoter of the gene coding for the SCARB-1 receptor, and in that the step c) consists in measuring the expression of said reporter gene.
5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour SCARB-1 , et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène.5. Method according to claim 2 or 3, characterized in that the biological samples are cells expressing the gene coding for SCARB-1, and in that step c) consists in measuring the expression of said gene.
6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes.The method of claim 4 or 5, wherein the cells are sebocytes.
7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour le récepteur SCARB-1.The method of claim 4 or 5 wherein the cells are cells transformed with a heterologous nucleic acid encoding the SCARB-1 receptor.
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène.8. Method according to one of claims 2 to 7, wherein the expression of the gene is determined by measuring the transcription rate of said gene.
9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène.9. Method according to one of claims 2 to 7, wherein the expression of the gene is determined by measuring the translation rate of said gene.
10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les mélanges réactionnels comprennent chacun un récepteur SCARB-1 , et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité du récepteur. 10. The method of claim 2 or 3, characterized in that the reaction mixtures each comprise a SCARB-1 receptor, and in that step c) comprises measuring the activity of the receptor.
EP07823605A 2006-07-19 2007-07-18 Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea Withdrawn EP2044435A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0653034A FR2904004B1 (en) 2006-07-19 2006-07-19 MODULATORS OF SCARB-1 IN THE TREATMENT OF ACNE OR HYPERSEBORRHEA
PCT/FR2007/051686 WO2008009859A2 (en) 2006-07-19 2007-07-18 Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2044435A2 true EP2044435A2 (en) 2009-04-08

Family

ID=37668112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP07823605A Withdrawn EP2044435A2 (en) 2006-07-19 2007-07-18 Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090246776A1 (en)
EP (1) EP2044435A2 (en)
CA (1) CA2656844A1 (en)
FR (1) FR2904004B1 (en)
WO (1) WO2008009859A2 (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2938336A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-14 Galderma Res & Dev GOS2 MODULATORS IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHIC DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938342A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-14 Galderma Res & Dev TARGETING MODULATORS OF CES1 AND / OR CES3 IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938333A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-14 Galderma Res & Dev MODULATORS OF CIDEA IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938337A1 (en) * 2008-11-13 2010-05-14 Galderma Res & Dev MCAM MODULATORS FOR THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5654013A (en) * 1995-03-13 1997-08-05 Taylor; Lesli A. Method for treating rosacea
US5925333A (en) * 1995-11-15 1999-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Methods for modulation of lipid uptake
US5965790A (en) * 1997-03-06 1999-10-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. SR-BI regulatory sequences and therapeutic methods of use
US5998141A (en) * 1997-07-10 1999-12-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Intronic and polymorphic SR-BI nucleic acids and uses therefor
JP2005512511A (en) * 2001-05-23 2005-05-12 サイトクロマ インコーポレーティッド Retinoic acid metabolizable cytochrome P450
WO2005100998A2 (en) * 2004-04-16 2005-10-27 Europroteome Ag Membrane markers for use in cancer diagnosis and therapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2008009859A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2656844A1 (en) 2008-01-24
US20090246776A1 (en) 2009-10-01
WO2008009859A3 (en) 2008-03-13
FR2904004A1 (en) 2008-01-25
WO2008009859A2 (en) 2008-01-24
FR2904004B1 (en) 2008-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FR2938341A1 (en) MODULATORS OF MONOGLYCERIDE LIPASE IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938338A1 (en) MODULATORS OF ACETYL-COENZYME ACYLTRANSFERASE 1 OR 2 IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEIC DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
WO2008009859A2 (en) Modulators of scarb-1 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
EP2046975A2 (en) Modulators of hsd17b7 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
EP2046974A2 (en) Modulators of sc4mol in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
WO2008009854A2 (en) Modulators of the abcd3 transporter in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
FR2938333A1 (en) MODULATORS OF CIDEA IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
WO2008009857A2 (en) Modulators of udp-glucose ceramide glucosyltransferase in the treatment of acne or of hyperkeratinization
FR2938342A1 (en) TARGETING MODULATORS OF CES1 AND / OR CES3 IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
WO2008009858A2 (en) Modulators of elovl5 in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
FR2938334A1 (en) MODULATORS OF ADFP IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
EP2046980A2 (en) Modulators of lanosterol synthetase in the treatment of acne or of hyperseborrhoea
FR2938340A1 (en) MODULATORS OF CARNITINE OCTANOYLTRANSFERASE IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEIC DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938339A1 (en) MODULATORS OF PCTP IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938337A1 (en) MCAM MODULATORS FOR THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938335A1 (en) MODULATORS OF ISOVALERYL-COENZYME A DEHYDROGENASE IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHEA DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938336A1 (en) GOS2 MODULATORS IN THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHIC DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA
FR2938343A1 (en) TARGETING MODULATORS OF CYP2B15 AND / OR GPD1 FOR THE TREATMENT OF ACNE, SEBORRHIC DERMATITIS OR HYPERSEBORRHEA

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20090219

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA HR MK RS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20090605

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION HAS BEEN WITHDRAWN

18W Application withdrawn

Effective date: 20121217