EP2046960A1 - Process for producing arachidonic acid and/or eicosapentaenoic acid in plants - Google Patents

Process for producing arachidonic acid and/or eicosapentaenoic acid in plants

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Publication number
EP2046960A1
EP2046960A1 EP07787358A EP07787358A EP2046960A1 EP 2046960 A1 EP2046960 A1 EP 2046960A1 EP 07787358 A EP07787358 A EP 07787358A EP 07787358 A EP07787358 A EP 07787358A EP 2046960 A1 EP2046960 A1 EP 2046960A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
desaturase
seq
fatty acids
plant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07787358A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Michael Geiger
Jörg BAUER
Petra Cirpus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Publication of EP2046960A1 publication Critical patent/EP2046960A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • arachidonic acid and eicosapentaenoic acid advantageously in the seed of transgenic plants of the family of
  • further enzymes can be selected from the group of the enzymes ⁇ -3-desaturases, ⁇ -12-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -6-elongases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -5-elongases and / or ⁇ - 4-desaturases are introduced into the plants.
  • the introduced nucleic acid sequences are the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7.
  • other nucleic acid sequences which code for polypeptides having ⁇ -3-desaturase or ⁇ -12 desaturase activity are preferably introduced into the plants and also expressed simultaneously. These are particularly preferably the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.
  • these nucleic acid sequences may optionally be expressed in the organism along with other nucleic acid sequences encoding polypeptides of biosynthesis of the fatty acid or lipid metabolism.
  • nucleic acid sequences which code for a ⁇ -4-desaturase and / or ⁇ -5 elongase activity.
  • the oils, lipids or free fatty acids produced in the process which contain ARA and / or EPA, are added to known quantities of feed, food, cosmetics or pharmaceuticals known to the person skilled in the art.
  • the lipid synthesis can be divided into two sections: the synthesis of fatty acids and their attachment to sn-glycerol-3-phosphate and the addition or modification of a polar head group.
  • Common lipids used in membranes include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides.
  • Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by the acetyl-CoA carboxylase or into acetyl-ACP by the acetyl transacylase. After a condensation reaction, these two product molecules together form acetoacetyl-ACP, which is converted via a series of condensation, reduction and dehydration reactions, so that a saturated fatty acid molecule with the desired chain length is obtained.
  • the production of unsaturated fatty acids from these molecules is catalyzed by specific desaturases, either aerobically by molecular oxygen or anaerobically (for fatty acid synthesis in microorganisms, see FC Neidhardt et al., (1996) E.
  • fatty acids must subsequently be transported to various modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid.
  • Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example by glycerol-fatty acid acyltransferase (see Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5): 161-166).
  • polyunsaturated fatty acids are referred to as PUFAs, PUFAs, LCPUFAs or LCPUFAs
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • LCPUFA long-chain polyunsaturated fatty acids
  • PUFA polyunsaturated fatty acids
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • LCPUFA long-chain polyunsaturated fatty acids
  • Fatty acids and triacylglycerides have a variety of uses in the food, animal nutrition, cosmetics and pharmaceutical industries. Depending on whether they are free saturated and unsaturated fatty acids or triacylglycerides with an increased content of saturated or unsaturated fatty acids, they are suitable for a wide variety of applications. Multiple- Unsaturated fatty acids such as linoleic and linolenic acid are essential for mammals because they can not be produced by them. Therefore, polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids and ⁇ -6 fatty acids represent an important component of animal and human food. Thus, for example, in the human diet lipids with unsaturated fatty acids, especially polyunsaturated fatty acids are preferred.
  • the polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids thereby a positive effect on the cholesterol level in the blood and thus on the prevention of heart disease is attributed.
  • the risk of heart disease, stroke, or hypertension can be significantly reduced (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr., Diet, 88, 100-108).
  • inflammatory, especially chronic inflammatory, processes in the context of immunological diseases can be positively influenced by ⁇ -3 fatty acids (Calder 2002, Proc Nutr Soc 61, 345-358, Cleland and James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307). They are therefore added to foods, especially dietary foods, or are used in medicaments, omega-6 fatty acids such as arachidonic acid have a negative effect in these rheumatic diseases.
  • ARA is beneficial and important for the development of newborns.
  • ⁇ -3 and ⁇ -6 fatty acids are precursors of tissue hormones, called eicosanoids such as the prostaglandins, derived from dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid and the thromboxanes and leukotrienes derived from arachidonic acid and eicosapentaenoic acid.
  • Eicosanoids (so-called PG 2 -SeMe), which are formed from ⁇ -6 fatty acids, usually promote inflammatory reactions, while eicosanoids (so-called PG 3 -SeMe) from ⁇ -3 fatty acids have little or no pro-inflammatory effect.
  • polyunsaturated long-chain fatty acids such as those mentioned above.
  • polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids which are preferred in fish oils, is particularly important for food.
  • the unsaturated fatty acid DHA is thereby attributed a positive effect on the development and maintenance of brain functions. It For this reason there is a need for the production of polyunsaturated long-chain fatty acids.
  • the free fatty acids are advantageously prepared by saponification.
  • Common natural sources of these fatty acids are fish such as herring, salmon, sardine, perch, eel, carp, trout, halibut, mackerel, zander or tuna or algae.
  • Fatty acids from genera of the Brassicaceae family such as Brassica napus or Brassica rapa are often used in the food, feed, cosmetic and / or pharmaceutical industries.
  • a disadvantage of the oils of this family is that they contain some fatty acids such as ⁇ -linolenic acid, icosenoic acid or erucic acid, which are rather undesirable, so that the oils can not be used in any amounts.
  • Other fatty acids contained in the oils, such as oleic acid have a lower value as food additives.
  • the long-chain fatty acids such as icosenoic acid 20: 1 and erucic acid 22: 1 were detected in the family Brassicaceae.
  • the levels of erucic acid are, for example, 35-48% for Brassica carinata, 18-49% for Brassica juncea, 45-54% Brassica napus, 55-60% Crambe abyssinica, 34-47% Eruca sativa, and 33-51 Sinapis alba %, Camelina sativa 3-5%, Raphanus sativa> 22%.
  • Erucic acid should only be present in very small amounts or not at all in oils used in human nutrition.
  • Advantageous oils, lipids and / or fatty acid compositions should have the lowest possible content of fatty acids such as oleic acid, ⁇ -linolenic acid, icosenic acid and / or erucic acid.
  • the highest possible levels of fatty acids such as arachidonic acid and / or eicosapentaenoic acid should be included.
  • the plants used for the production should be as easy to grow as possible and it should be established processing processes for the oils contained, lipids and / or
  • Fatty acid compositions may be present. Externally, the manufacturing process should be simple and inexpensive. Furthermore, the oils, lipids and / or fatty acid compositions of these plants should have been used for an extended period of time for the production of feed, food, cosmetics and / or pharmaceuticals in the industry. It is an object of the present invention to develop a process for the production of large quantities of polyunsaturated fatty acids, especially ARA, EPA and / or DHA, in the seed of transgenic plants and at the same time to reduce the levels of undesired fatty acids.
  • polyunsaturated fatty acids especially ARA, EPA and / or DHA
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • % based on the total lipid content of the transgenic plant characterized in that it comprises the following process steps: a) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop which codes for a ⁇ 6-desaturase, and b) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop c) introducing at least one nucleic acid sequence into the crop which encodes a ⁇ 5-desaturase, and d) harvesting the crop, wherein the enzymatic activity of the enzyme obtained by the steps (a) to (a) (c) enzymes introduced a fatty acid selected from the group consisting of the fatty acids oleic acid [C18: 1 ⁇ 9 ] , Linoleic acid [C18: 2 ⁇ 9 12 ], ⁇ -linolenic acid [C18: 3 ⁇ 6 9 12 ], icosenoic acid [C20: 1 ⁇ 11 ] and erucic acid [C22: 1 ⁇ 13 ] by at least 10%, 11%, 12%,
  • the wild type plant is understood as meaning plants which carry the non-mutated (unmodified) form of a gene or allele and are found, for the most part, in a population living under natural conditions. Under wild-type also so-called zero-zygotes are to be understood. These were transformed with a gene, but lost it again. All of the above data are percentages by weight and refer to the content of the fatty acids in the corresponding wild-type plant.
  • saturated fatty acids are little or not reacted with the nucleic acids used in the process. Little is to be understood, compared to multiple unsatisfied saturated fatty acids have less than 5% of the saturated fatty acids, advantageously less than 3%, more preferably less than 2%, most preferably less than 1%; 0.5; 0.25 or 0.125% are implemented.
  • These produced fatty acids can be produced as the only product in the process or present in a fatty acid mixture.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention are isolated nucleic acid sequences which code for polypeptides having ⁇ -6-desaturase, ⁇ -6-elongase and / or ⁇ -5-desaturase activity.
  • Nucleic acid sequences coding for polypeptides having ⁇ 6-desaturase, ⁇ 6-elongase, or ⁇ 5-desaturase activity are advantageously used in the method according to the invention selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or b) nucleic acid sequences which, as a result of the degenerate genetic code, differ from those shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, which code for polypeptides which have at least 40% identity at the amino acid level with SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 and a ⁇ -6-desaturase, ⁇ -6 Have
  • nucleic acid sequences are advantageously introduced into the crop plants which code for an ⁇ -3-desaturase or ⁇ -12-desaturase or ⁇ -3-desaturase and ⁇ -12-desaturase.
  • a preferred embodiment of the method is characterized in that a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for polypeptides having ⁇ -3-desaturase activity, selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO : 9, or b) nucleic acid sequences that result as a result of the degenerate genetic
  • the method is characterized in that a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for polypeptides having ⁇ 12-desaturase activity, selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO B) nucleic acid sequences which can be deduced as a result of the degenerate genetic code from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 1, which polypeptides encode at least 60% identity with SEQ ID NO: 10 at the amino acid level and have a ⁇ -12 desaturase activity.
  • ⁇ -12-desaturase sequences can be used alone or in combination with the ⁇ 3-desaturase sequences with the nucleic acid sequences used in the method which code for ⁇ -6 desaturases, ⁇ 6-elongases and / or ⁇ 5-desaturases become.
  • the nucleic acids are expressed in vegetative or reproductive tissue.
  • the nucleic acid sequences used in the method result in addition to a lowering of unwanted fatty acids to increase the ARA or EPA or ARA and EPA content in the plants.
  • the process can thereby increase the ARA or EPA or ARA and EPA content to more than 8%, advantageously up to more than 10%, 11%, 12%, 13%, 14%. , 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20%, particularly advantageous to more than 21%, 22%, 23%, 24% or 25%, based on the total lipid content of the plant to be achieved
  • the above percentages are by weight.
  • oils and / or triglycerides with an advantageous over oils and / or triglycerides from wild-type plants increased content of polyunsaturated fatty acids, especially of ARA, EPA or mixtures thereof, it may be advantageous to increase the amount of starting material for fatty acid synthesis. This can be achieved, for example, by introducing a nucleic acid encoding a polypeptide having the activity of a ⁇ 12-desaturase and co-expressing it in the organism.
  • a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for a polypeptide having ⁇ 12-desaturase activity.
  • the ⁇ -12-desaturases used bind fatty acids bound to phospholipids or CoA fatty acid esters, advantageously bound to CoA fatty acid esters. This, if an elongation step has previously taken place, advantageously leads to higher yields of synthesis products, since the elongation in the
  • nucleic acid sequences are introduced into the plants on a common recombinant nucleic acid molecule, wherein each nucleic acid sequence can be under the control of its own promoter and this own promoter can be a seed-specific promoter.
  • nucleic acids which have a certain degree of identity or homology to the sequences specified in the sequence listing.
  • substantially identical enzymatic activity is to be understood as meaning proteins which are at least 20%, 30%, 40%, 50% or 60%, advantageously at least 70%, 80%, 90% or 95%, particularly advantageously at least 96%, 97%. , 98% or 99% of the enzymatic activity of the wild-type enzymes.
  • the sequences are written among themselves (eg, gaps can be inserted into the sequence of one protein or one nucleic acid to create an optimal alignment with the other protein or nucleic acid).
  • the amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in one sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the other sequence, then the molecules at that position are identical. If different amino acids are at the same position but have the same properties, eg two hydrophobic amino acids, then they are homologous or similar.
  • Polypeptides cause can occur. These natural variants usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of the ⁇ 6-desaturase, ⁇ 5-desaturase and / or ⁇ 6-elongase gene. All and all of these nucleotide variations and resulting amino acid polymorphisms in the ⁇ 6-desaturase, ⁇ 5-desaturase and / or ⁇ 6-elongase, which are the result of natural variation and which do not substantially alter enzymatic activity, are said to be in the art Scope of the invention may be included.
  • Essential enzymatic activity of the ⁇ 6-desaturase ⁇ 6-elongase or ⁇ 5-desaturase used in the process according to the invention is to be understood as meaning that it still has an enzymatic activity of the proteins / enzymes encoded by the sequence and its derivatives at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, 40%, 50% or at least 60% and most preferably at least 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99%, and thus to the metabolism of compounds that are required to build up fatty acids, fatty acid esters such as diacylglycerides and / or triacylglycerides in a plant or plant cell or participate in the transport of molecules across membranes.
  • fatty acid esters such as diacylglycerides and / or triacylglycerides in a plant or plant cell or participate in the transport of molecules across membranes.
  • nucleic acid molecules which bind under stringent conditions to the complementary strand of ⁇ -12-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -3-desaturase and / or ⁇ -12-desaturase Hybridize ⁇ 6-elongase nucleic acids.
  • hybridizes under stringent Conditions are meant to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to each other.
  • the conditions are preferably such that sequences that are at least about 65%, 70%, 80% % or 90%, preferably at least about 91%, 92%, 93%, 94% or 95% and more preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or more are homologous to each other, usually remaining hybridized to each other stringent conditions are known to those of skill in the art and are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in Figure 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by one or more washes in 0.2x SSC, 0.1% SDS at 50-65 ° C It is known that these hybridization conditions differ
  • the hybridization temperature is, for example, under "standard hybridization conditions" depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2). If organic solvent, for example 50% formamide, is present in the abovementioned buffer, the temperature under standard conditions is about 42 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 20 ° C to 45 ° C, preferably 30 ° C to 45 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: RNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 30 ° C to 55 ° C, preferably 45 ° C to 55 ° C.
  • hybridization conditions required for a particular nucleic acid can be determined by textbooks such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", ColD Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes and Higgins (Eds.) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
  • an isolated nucleic acid molecule By introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence, an isolated nucleic acid molecule can be generated which is suitable for a ⁇ -12-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -3-desaturase and / or ⁇ 6-elongase encoded with one or more amino acid substitutions, additions or deletions. Mutations can be introduced into one of the sequences by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted nonessential amino acid residues.
  • amino acid residue is raised against an amino acid residue with a similar side chain. exchanges.
  • families of amino acid residues have been defined with similar side chains. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg Alanine, VaNn, Leucine,
  • a predicted non-essential amino acid residue in a ⁇ 12-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ -3-desaturase and / or ⁇ 6-elongase thus becomes preferably a different amino acid residue from the same side-chain family replaced.
  • the mutations may be randomized over all or part of those encoding ⁇ -12 desaturase, ⁇ -6 desaturase, ⁇ -5 desaturase, ⁇ -3 desaturase, and / or ⁇ -6 elongase Sequence are introduced, eg by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be prepared by recombinant expression according to the herein described ⁇ -12-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -3-desaturase and / or ⁇ -6 -Longase activity to identify mutants carrying the ⁇ 12-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ -3-desaturase and / or ⁇ 6-elongase Maintained activity.
  • the polyunsaturated fatty acids ARA or EPA or ARA and EPA produced in the process are advantageously bound in as esters such as membrane lipids such as phospholipids or glycolipids and / or triacylglycerides, but may also occur as free fatty acids or bound in the form of other fatty acid esters in the organisms. They may be present as "pure products" or else advantageously in the form of mixtures of different fatty acids or mixtures of different glycerides.
  • the different fatty acids bound in the triacylglycerides can thereby be derived from short-chain fatty acids having 4 to 6 C atoms, medium-chain fatty acids having 8 to 12 C atoms or long-chain fatty acids having 14 to 24 C atoms, preferably the long-chain fatty acids are particularly preferred the long-chain fatty acids LCPUFAs of DE, C 2 O and / or C 22 fatty acids, very particular preference is given to the long-chain fatty acids LCPUFAs of C 20 and / or C 22 fatty acids such as ARA, EPA or their combination.
  • glycolide is understood to mean a glycerol esterified with one, two or three carboxylic acid residues (mono-, di- or triglyceride).
  • glycolide is also meant a mixture of different glycerides.
  • the glyceride or glyceride mixture may contain other additives, e.g. contain free fatty acids, antioxidants, proteins, carbohydrates, vitamins and / or other substances.
  • a "glyceride” in the sense of the method according to the invention is also understood to mean derivatives derived from glycerol.
  • these also include glycerophospholipids and glyceroglycolipids.
  • Preference is given here to glycerophospholipids such as lecithin (phosphatidylcholine), Cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and Alkylacylglycerophospholipide exemplified.
  • phospholipids are to be understood as meaning phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and / or phosphatidylinositol, advantageously phosphatidylcholine.
  • the fatty acid esters produced in the process may be prepared from the plants used to produce the fatty acid esters in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycosphingolipids, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol , Phosphatidylinositol or diphosphatidylglycerol, monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters such as the acetyl coenzymeA esters.
  • compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycosphingolipids, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatid
  • they are in the form of their diacylglycerides, triacylglycerides and / or in the form of the phospholipids, e.g. the phosphatidylcholine isolated, more preferably in the form of triacylglycerols.
  • the fatty acids produced in the process are also included as free fatty acids or bound to other compounds in the plants.
  • the various compounds mentioned above are present in the organisms in an approximate distribution of 80 to 90% by weight of triglycerides, 2 to 5% by weight of diglycerides, 5 to 10% by weight of monoglycerides, 1 to 5 wt .-% of free fatty acids, 2 to 8 wt .-% phospholipids ago, wherein the sum of the various compounds to 100 wt .-% complements.
  • the LCPUFAs produced have a content of at least 3, 5, 6, 7 or 8% by weight. , preferably of at least 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 wt .-%, preferably of at least 16, 17, 18, 19 or 20 wt .-%, particularly preferably of at least 21, 22, 23, 24 or 25% by weight, very particularly preferably at least 26, 27, 28, 29 or 30% by weight, based on the total fatty acids in the transgenic organisms, of advantage in the seed of the transgenic plants.
  • Ci ⁇ - and / or C 2 o fatty acids present in the host organisms at least 10%, advantageously at least 20%, more preferably at least 30%, most preferably at least 40% in the corresponding products implemented as ARA, EPA or mixtures thereof.
  • the fatty acids are prepared in bound form.
  • polyunsaturated C 2 o-fatty acids with four or five double bonds in the molecule having a content of all such fatty acids of at least 15, 16, 17, 18, 19 or 20% by weight, advantageously at least 21, are advantageous in the process.
  • ARA is used with a content of at least 3, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 wt .-%, advantageously of at least 1 1, 12, 13, 14 or 15 wt .-%, preferably of at least 16 , 17, 18, 19 or 20% by weight, more preferably at least 21, 22, 23, 24 or 25% by weight, most preferably at least 26% by weight, based on the total lipid content in the seeds transgenic plants.
  • EPA is used in the process according to the invention with a content of at least 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9 or 1 wt .-%, advantageously of at least 2, 3, 4 or 5 wt .-%, preferably of at least 6, 7, 8, 9 or 10 wt .-%, particularly preferably of at least 1 1, 12th , 13, 14 or 15% by weight, and most preferably at least 16% by weight, based on the total lipid content in the seeds of the transgenic plants.
  • these unsaturated fatty acids can be brought to the sn1, sn2 and / or sn3 position of the advantageously prepared triglycerides. Since in the process of the invention from the starting compounds linoleic acid (C18: 2) or linolenic acid (C18: 3) are passed through several reaction steps, the end products of the process such as arachidonic acid (ARA) or eicosapentaenoic acid (EPA) are not as absolute pure products, it is always contain small traces of the precursors in the final product.
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • both linoleic acid and linolenic acid are present in the starting organism or in the starting plant, for example, the end products such as ARA or EPA are generally present as mixtures.
  • the end products such as ARA or EPA are generally present as mixtures.
  • only small amounts of the other end products should be present in the final products ARA or EPA. Therefore, in an EPA-containing lipid and / or oil should be less than 15, 14, 13, 12 or 11 wt .-%, advantageously less than 10, 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-%, more preferably less than 4 Be contained 3, 2 or 1 wt .-% ARA.
  • ARA-containing lipid and / or oil should therefore less than 15, 14, 13, 12 or 1 1 wt .-%, advantageously less than 10, 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-%, particularly advantageously less be contained as 4, 3, 2 or 1 wt .-% EPA.
  • the precursors should advantageously not more than 20 wt .-%, preferably not more than 15 wt .-%, more preferably not more than 10 wt .-%, most preferably not more than 5 wt .-% based on the amount of the respective Final product.
  • ARA or EPA are bound in the process according to the invention or produced as free acids in a transgenic plant as end products. If the compounds ARA and EPA are produced simultaneously, they are advantageously used in a ratio of at least 1: 6 (EPA: ARA), preferably of at least 1: 8, preferably of at least 1:10, more preferably of at least 1: 12 in the plant produced.
  • Fatty acid esters or fatty acid mixtures which have been prepared by the process according to the invention advantageously contain 6 to 15% palmitic acid, 1 to 6% stearic acid; 7 - 85% oleic acid; 0.5 to 8% vaccenic acid, 0.1 to 1% arachidic acid, 7 to 25% saturated fatty acids, 8 to 85% monounsaturated fatty acids and 60 to 85% polyunsaturated fatty acids in each case based on 100% and on the total fatty acid content of the organisms.
  • the fatty acid esters or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention advantageously contain fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8,9 Methylene heptadec-8-enoic acid), chaulmo-gruoic acid (cyclopentenodecanoic acid), furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,1-dienanoic acid), vernoic acid (9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid), tartric acid (6-octadecynoic acid), 6-nonadecynoic acid, santalbinic acid (t11-
  • Octadecen-9-ynoic acid 6,9-octadecenynoic acid, pyrulic acid (t10-heptadecen-8-ynonic acid), crepenynic acid (9-octadecen-12-ynonic acid), 13,14-dihydrooropheic acid, octadecene-13-ene-9, 11-diynoic acid, petroselenoic acid (cis-6-octadecenoic acid), 9c, 12t-octadecadienoic acid, calendulic acid (8t10t12c octadecatrienoic acid), catalpinic acid (9t1 1t13c-octadecatrienoic acid), elicolinic acid (9c11t13t octadecatrienoic acid), jacric acid (8c10t12c octadecatrienoic acid), punicin acid (9c11t13c-octadecatrien
  • fatty acids are generally advantageously present only in traces in the fatty acid esters or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention, that is to say they are less than 30%, preferably less than 25%, 24%, 23%, based on the total fatty acids. , 22% or 21%, more preferably less than 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% or 5%, most preferably less than 4%, 3%, 2% or 1% ago.
  • these aforementioned fatty acids come to less than 0.9% based on the total fatty acids; 0.8%; 0.7%; 0.6%; or 0.5%, more preferably less than 0.4%; 0.3%; 0.2%; 0.1% before.
  • the nucleic acid sequences according to the invention or the nucleic acid sequences used in the method according to the invention can increase the yield of polyunsaturated fatty acids, especially ARA and EPA, by at least 50, 80 or 100%, advantageously at least 150, 200 or 250%, particularly advantageously at least 300, 400, 500, 600, 700, 800 or 900%, most preferably at least 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500% relative to the non-transgenic parent plant of for example a plant such as Brassica juncea or Brassica napus as compared to See the GC analysis for examples.
  • polyunsaturated fatty acids especially ARA and EPA
  • the lipids and / or oils produced in the process according to the invention should advantageously have a high proportion of unsaturated fatty acids of polyunsaturated fatty acids of at least 30, 40 or 50% by weight, advantageously of at least 60, 70 or 80% by weight, based on the Total fatty acid content in the seeds of the transgenic plants amount.
  • All saturated fatty acids together should advantageously account for only a small proportion in the plants preferably used for the process according to the invention.
  • a small proportion in this context is a fraction in GC area units of less than 15%, 14%, 13%, 12%, 11% or 10%, preferably less than 9%, 8%, 7% or 6%. to understand.
  • the advantageous in the process as host plants containing the introduced via different methods used in the process genes for the synthesis of polyunsaturated fatty acids advantageously have a higher oil content than protein content in the seed, advantageous plants have an oil / protein content ratio of 5 to 1, 4 to 1, 3 to 1, 2 to 1 or 1 to 1.
  • Host plants which are advantageous for the method are those which have a high proportion of oleic acid, ie of at least 40, 50, 60 or 70% by weight, based on the total fatty acid content of the plant, in comparison with linoleic acid and / or linolenic acid in the lipids and / or oils especially in triglyceride such as Brassica napus, Brassica alba, Brassica hirta, Brassica nigra, Brassica juncea or Brassica carinata.
  • oleic acid ie of at least 40, 50, 60 or 70% by weight, based on the total fatty acid content of the plant, in comparison with linoleic acid and / or linolenic acid in the lipids and / or oils especially in triglyceride such as Brassica napus, Brassica alba, Brassica hirta, Brassica nigra, Brassica juncea or Brassica carinata.
  • Plants used for the method should advantageously have an erucic acid content of less than 2% by weight based on the total fatty acid content of the plant.
  • the content of saturated fatty acids C16: 0 and / or C18: 0 should advantageously be less than 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, or 10% by weight, advantageously less than 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-% based on the total fatty acid content of the plant.
  • longer fatty acids such as C20: 0 or C22: 1 should not at all or in only small amounts advantageously less than 4, 3, 2 or 1 wt .-%, advantageously less than 0.9; 0.8; 0.7; 0.6; 0.5; 0.4; 0.3; 0.2 or 0.1% by weight, based on the total fatty acid content of the plant, in the plants used in the process.
  • no or only small amounts of C16: 1 are present as fatty acid in the plants used for the method according to the invention.
  • Small amounts are to be understood as meaning contents of fatty acids which are less than 4, 3, 2 or 1% by weight, advantageously less than 0.9; 0.8; 0.7; 0.6; 0.5; 0.4; 0.3; 0.2 or 0.1 wt .-% based on the total fatty acid content of the plant.
  • chemically pure polyunsaturated fatty acids or fatty acid compositions can be prepared by the methods described above.
  • the fatty acids or the fatty acid compositions from the plants advantageously the plant seeds in a known manner, for example on breaking up the seeds like Grinding and subsequent extraction, distillation, crystallization, chromatography or combinations of these methods isolated.
  • These chemically pure fatty acids or fatty acid compositions are advantageous for applications in the food industry, the cosmetics industry and especially the pharmaceutical industry.
  • Foliosa Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mustard], Brassica oleracea [fodder beet] or Arabidopsis thaliana ,
  • nucleic acids and the optionally introduced nucleic acid sequences that for the ⁇ -3-desaturases and / or for the ⁇ -12 Desaturases encode to additionally introduce further nucleic acids encoding enzymes of the fatty acid or lipid metabolism.
  • Elongases or ⁇ -9 elongases are used in combination with the aforementioned genes for the ⁇ -5 elongase, ⁇ -6 elongase and / or ⁇ -3 desaturase, wherein single genes or multiple genes can be used in combination.
  • nucleic acid sequences used according to the invention or their derivative or homologues coding for polypeptides which still possess the enzymatic activity of the proteins encoded by nucleic acid sequences are cloned individually or in combination into expression constructs and used for introduction and expression in plants.
  • these expression constructs enable a favorable optimal synthesis of the polyunsaturated fatty acids produced in the process according to the invention.
  • the method further comprises the step of obtaining a transgenic plant containing the nucleic acid sequences used in the method, the plant having a nucleic acid sequence encoding ⁇ -12 desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ - 6-desaturase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ -3-desaturase, a gene construct or a vector as described below, alone or in combination with other nucleic acid sequences coding for proteins of the fatty acid or lipid metabolism is transformed.
  • this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the seed of the plant. Cultivation is, for example, culturing in the case of plant cells, tissue or organs on or in a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics, potting soil or on arable land.
  • a further subject of the invention are gene constructs which contain the nucleic acid sequences used in the method according to the invention which code for a ⁇ 5-desaturase, ⁇ 6-desaturase or ⁇ 6-elongase, wherein the nucleic acid is operably linked to one or more regulatory signals.
  • biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group consist
  • There may be more than one nucleic acid sequence of an enzymatic activity e.g. a ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -3-desaturase or ⁇ -6 elongase.
  • the nucleic acids used in the method are advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner.
  • the procedure is based on the protocol of the Pfu DNA polymerase or of a Pfu / Taq DNA polymerase mixture.
  • the primers are selected taking into account the sequence to be amplified. Conveniently, the primers should be chosen so that the amplificate covers the entire includes codogenic sequence from start to stop codon.
  • the amplificate is conveniently analyzed. For example, a quantitative and qualitative analysis can be carried out after gel electrophoresis separation.
  • the amplificate can be purified according to a standard protocol (eg Qiagen). An aliquot of the purified amplificate is then available for subsequent cloning.
  • Suitable cloning vectors are well known to those skilled in the art. These include, in particular, vectors which can be replicated in microbial systems, ie in particular vectors which ensure efficient cloning in yeasts or fungi, and which enable the stable transformation of plants.
  • various suitable for T-DNA-mediated transformation binary and co-integrated vector systems.
  • Such vector systems are usually characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation as well as the T-DNA limiting sequences (T-DNA border).
  • these vector systems also include other cis-regulatory regions such as promoters and terminator sequences and / or selection markers, with which correspondingly transformed organisms can be identified.
  • binary systems are based on at least two vectors, one of them vir genes, but no T-DNA and a second T-DNA, but no carries vir gene.
  • these binary vectors include vectors of the series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention.
  • the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then enzymatically modified in a suitable manner. The vector is then purified and an aliquot used for cloning. In cloning, the enzymatically cut and, if necessary, purified amplicon is linked to similarly prepared vector fragments using ligase.
  • a particular nucleic acid construct or vector or plasmid construct can have one or more codogenic gene segments.
  • the codogenic gene segments in these constructs are functionally linked to regulatory sequences.
  • the regulatory sequences include in particular plant sequences such as promoters and terminator sequences.
  • the constructs can advantageously be stably propagated in microorganisms, in particular in E.
  • nucleic acids used in the method can be introduced into plants and thus used in the transformation of plants, such as those published and there cited: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); FF White, Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; Genes Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.
  • nucleic acids and / or vectors used in the process can thus be used for the genetic engineering modification of a broad spectrum of plants so that they become better and / or more efficient producers of PUFAs.
  • a de novo synthesis in a plant lacking the activity and ability to biosynthesize the compounds prior to introduction of the corresponding gene (s) is possible.
  • the use of various divergent, i. At the DNA sequence level of different sequences may be advantageous or the use of promoters, the other temporal gene expression, e.g. depending on the maturity level of a seed or oil-storing tissue.
  • the nucleic acid sequences used in the method are advantageously introduced into an expression cassette which enables expression of the nucleic acids in plants.
  • Desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -3-desaturase or ⁇ -6-elongase encode, with one or more regulatory signals advantageously functionally linked to increase gene expression.
  • These regulatory sequences are intended to allow the targeted expression of genes and proteins. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is expressed and / or overexpressed only after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thereby regulate the expression of the nucleic acid. In addition to these new regulatory sequences or instead of these sequences, the natural regulatory elements of these
  • the gene construct may also contain one or more so-called enhancer sequences operably linked to the promoter, which allow for increased expression of the nucleic acid sequence
  • Additional advantageous sequences may also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as additional regulatory elements terminator sequences.
  • gene construct gene construct
  • only one copy of the genes is present in the expression cassette.
  • This gene construct or gene constructs can be expressed together in the host plant.
  • the gene construct or the gene constructs can be inserted in one or more vectors and be present freely in the cell or else be inserted in the genome. It is advantageous for the insertion of additional genes in the host genome when the genes to be expressed are present together in a gene construct.
  • the regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved. It is possible in principle to use all natural promoters with their regulatory sequences, such as those mentioned above, for the new method. It is also possible and advantageous to use synthetic promoters in addition or alone, especially if they mediate seed-specific expression, such as those described in WO 99/16890.
  • the PUFA biosynthesis genes should advantageously be seed-specifically expressed in oilseeds.
  • seed-specific promoters can be used, or such promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm.
  • Bce4 [WO 91/13980], legumes B4 (LegB4 promoter) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 and lpt1 (barley) [WO 95/15389 and US Pat , WO95 / 23230], seed-specific promoters from rice, maize and the like.
  • Plant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter (see review in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter
  • each of the nucleic acids used in the process should be selected for ⁇ 5-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 12-desaturase, ⁇ -3-desaturase or ⁇ 1-desaturase ⁇ 6-elongase encode under the control of its own, preferably one of the other promoters different promoter can be expressed as repetitive sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events.
  • the expression cassette is advantageously designed such that a promoter follows a suitable interface, advantageously in a polylinker, for insertion of the nucleic acid to be expressed, and optionally a terminator sequence lies behind the polylinker.
  • This sequence is repeated several times, preferably three, four, five, six or seven times, so that up to seven genes can be brought together in one construct and introduced into the transgenic plant for expression.
  • the sequence is repeated up to four times.
  • the nucleic acid sequences are inserted for expression via a suitable interface, for example in the polylinker downstream of the promoter.
  • each nucleic acid sequence has its own promoter and optionally its own terminator sequence.
  • Such advantageous constructs are disclosed for example in DE 101 02 337 or DE 101 02 338.
  • nucleic acid sequences behind a common promoter and possibly in front of a common terminator sequence.
  • the insertion site or the sequence of the inserted nucleic acids in the expression cassette is not of crucial importance, that is, a nucleic acid sequence may be inserted at the first or last position in the cassette, without thereby significantly affecting its expression.
  • different promoters such as the USP, LegB4 or DC3 promoter and different terminator sequences can be used in the expression cassette.
  • the transcription of the genes introduced should advantageously be effected by means of suitable terminator sequences at the 3 'end of the introduced biosynthesis gene. ne (behind the stop codon) are aborted.
  • suitable terminator sequences at the 3 'end of the introduced biosynthesis gene are aborted.
  • the OCS1 terminator sequence can be used here.
  • different terminator sequences should be used for each gene.
  • the gene construct can, as described above, also comprise other genes which are to be introduced into the plants. It is possible and beneficial in the
  • Host plants regulate genes such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene by their enzyme activity in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway to introduce and express.
  • genes may be of heterologous or homologous origin.
  • further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, but these genes can also be located on one or more further nucleic acid constructs.
  • a gene selected from the group consisting of acyl-CoA dehydrogenase (s), acyl-ACP [ acyl carrier protein] desaturase (s), acyl-ACP thioesterase (s), as biosynthesis gene of the fatty acid or lipid metabolism, Fatty acid acyltransferase (s), acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase (s), fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (n), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenase (s), lipoxygenase (s), triacylglycerol lipase (s), allene oxide synthase (s), hydroperoxide lyase (s) or fatty acid elongase (s) or combinations thereof.
  • nucleic acid sequences are biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group of acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, ⁇ -8-desaturase, ⁇ -4-desaturase, ⁇ -9-desaturase, ⁇ -5 elongase and / or ⁇ -9 -Elongase.
  • acyl-CoA lysophospholipid acyltransferase
  • ⁇ -8-desaturase ⁇ -4-desaturase
  • ⁇ -9-desaturase ⁇ -5 elongase and / or ⁇ -9 -Elongase.
  • the abovementioned nucleic acids or genes can be cloned in combination with other elongases and desaturases in expression cassettes, such as those mentioned above, and used for the transformation of plants with the aid of Agrobacterium.
  • the regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the expression cassettes can be used in principle directly for introduction into the plant or else be introduced into a vector.
  • These advantageous vectors contain the nucleic acids used in the method which code for ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -3-desaturase or ⁇ -6 elongase
  • Nucleic acid construct containing the nucleic acid used alone or in combination with other biosynthesis genes of fatty acid or lipid metabolism such as the acyl-CoA: l_ysophospholipid acyltransferases, ⁇ -8-desaturases, ⁇ -9-desaturases, ⁇ -4-desaturases, ⁇ -5-elongases and / or ⁇ -9-elongases ,
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid that is bound to it.
  • plasmid a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (e.g., bacterial origin of bacterial vectors). Other vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked.
  • expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass other forms of expression vectors, such as viral vectors that perform similar functions.
  • vector is intended to include other vectors known to those skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • the recombinant expression vectors advantageously used in the method comprise the nucleic acids or the gene construct according to the invention in a form suitable for expression of the nucleic acids used in a host cell, which means that the recombinant expression vectors have one or more regulatory sequences selected on the basis the host cells used for expression, operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • operably linked means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) such that expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked to each other such that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence (eg in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers, and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton , Florida, Ed .: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, including references therein. Regulatory sequences include those which are constitutive Controlling expression of a nucleotide sequence in many types of host cells, and those that direct the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions. Those skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the desired expression level of the protein, etc.
  • the ⁇ -12-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -3-Desatu lawns, ⁇ -6-elongases and / or ⁇ -5-desaturases in unicellular plant cells such as algae
  • unicellular plant cells such as algae
  • plant cells from higher plants eg, spermatophytes, such as crops
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left Biol.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and that are operatively linked so that each sequence can fulfill its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACH ⁇ known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but all other terminator sequences functionally active in plants are also suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence comprising the tobacco mosaic virus 5 'untranslated leader sequence encoding the protein / RNA ratio increased (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
  • translation enhancers for example the overdrive sequence comprising the tobacco mosaic virus 5 'untranslated leader sequence encoding the protein / RNA ratio increased (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
  • the gene to be expressed must be operably linked to a suitable promoter that will trigger gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner.
  • suitable promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or constitutive plant promoters, such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028. Plant gene expression can also be achieved via a chemically inducible promoter as described above (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev.
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner.
  • Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters which respond to biotic or abiotic stress conditions are also suitable, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the tomato heat-inducible hsp ⁇ O promoter (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound inducible pinll promoter (EP-A-0 375 091).
  • promoters which induce gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and oil biosynthesis take place are preferred in sperm cells such as the cells of the endosperm and the developing embryo.
  • Suitable promoters are the rapeseed napin promoter (US Pat. No.
  • Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or lpt1 gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, the wheat glutelin gene, the maize zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum casirin gene, the rye -Secalin gene.
  • promoters which induce plastid-specific expression, since plastids are the compartment in which the precursors as well as some end products of lipid biosynthesis are synthesized.
  • Suitable promoters are the viral RNA polymerase promoter described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the Arabidopsis clpP promoter described in WO 99/46394.
  • promoters such as the plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as those in EP-AO 388 186 (benzylsulfonamide-inducible), Plant J.
  • Plant promoters are the promoter of cytosolic FBPase or the ST-LSI Potato promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), the glycine max phosphoribosyl-pyrophosphatamidotransferase promoter (Genbank Accession No. U87999) or the nodular-specific promoter described in EP-A-0 249 676.
  • Particularly advantageous promoters are promoters which enable expression in tissues involved in fatty acid biosynthesis.
  • seed-specific promoters such as the USP promoter according to the invention but also other promoters such as the LeB4, DC3, phaseolin or napin promoter.
  • promoters are seed-specific promoters which can be used for monocotyledonous or dicotyledonous plants and in US Pat. No. 5,608,152 (napin promoter from rapeseed), WO 98/45461 (oleosin promoter from Arobidopsis), US Pat. No. 5,504,200 (Phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris ), WO 91/13980 (Bce4 promoter from Brassica), Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LeB4 promoter from a legume), these promoters being for dicotyledons suitable.
  • promoters are suitable, for example, for barley monocotylone lpt-2 or ipt-1 promoter (WO 95/15389 and WO 95/23230), barley hordein promoter and other suitable promoters described in WO 99/16890.
  • the PUFA biosynthesis genes should advantageously be seed-specifically expressed in oilseeds.
  • seed-specific promoters can be used, or such promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm.
  • seed-specific promoters can be isolated from both dicotolydone and monocotolydonous plants.
  • advantageous promoters are listed above, e.g. the USP, vicilin, napin, oleosin, phaseolin, Bce4, LegB4, Lpt2, lpt1, Amy32b, Amy 6-6, Aleurain or Bce4 promoter.
  • chemically inducible promoter can be used advantageously in the method according to the invention.
  • promoters which are advantageously suitable for expression in soya are the promoters of the ⁇ -conglycinin ⁇ subunit, the ⁇ -conglycinin ⁇ subunit, the Kunitz trypsin inhibitor, the annexin, the glysinin, the albumin 2S, the Legumin A1, Legumin A2 and BD30.
  • promoters are the USP, LegB4, Fad3, SBP, DC-3 or Cruciferin820 promoter.
  • Advantageous regulatory sequences used for expression of the nucleic acid sequences used in the method of the invention are terminators for the expression advantageous in soya are the Leg2A3 ', Kti3', Phas3 ', BD30 3' or the AIS3 '.
  • terminators are the A7T, OCS, LeB3T or cat terminator.
  • each of the nucleic acids used in the method should be used for the ⁇ -12-desaturase, ⁇ -3-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ -5-desaturase can be expressed under the control of its own preferably a different promoter, since repetitive sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events.
  • the gene construct can, as described above, also comprise other genes which are to be introduced into the plant.
  • the regulatory sequences or factors used to express the nucleic acids used in the method according to the invention can, as described above, preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • These advantageous vectors contain the nucleic acids used in the method which code for ⁇ 12-desaturase, ⁇ -3-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ 5-desaturase, or a nucleic acid construct which contains the nucleic acid used alone or in combination with further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism, such as the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, ⁇ -3-desaturases, ⁇ -4-desaturases, ⁇ -5-desaturases , ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desatuases, ⁇ -9-desaturases, ⁇ -12-desaturases, ⁇ 3-desaturases, ⁇ -5-elongases, ⁇ -6-elongases and / or ⁇ -9-elongases.
  • the term "vector” refers to a nucleic acid molecule that can
  • the recombinant expression vectors used can be designed for the expression of ⁇ -12-desaturases, ⁇ -3-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -6-elongases and / or ⁇ -5-desaturases in prokaryotic or eukaryotic cells. This is advantageous because intermediate steps of the vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity.
  • the ⁇ 12-desaturase, ⁇ -3-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ 5-desaturase genes can be expressed in bacterial cells, insect cells (using baculovirus - expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA, et al., (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, CAMJJ, et al ) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, JW Bennet & LL Lasure, eds., Pp.
  • fusion expression vectors include i.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which glutathione-S Transferase (GST),
  • Maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • Target gene expression from the pET 1 1d vector is based on transcription from a T7 gn10-lac fusion promoter mediated by a co-expressed viral RNA polymerase (T7 gn1). This viral polymerase is provided by the host strains BL21 (DE3) or HMS174 (DE3) from a resident ⁇ prophage harboring a T7 gn1 gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • vectors useful in prokaryotic organisms are known to those of skill in the art, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, the pBR series such as pBR322, the pUC series such as pUC18 or pUC19, the M1 13mp series, pKC30, pRep4 , pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pN-1111 13-B1, ⁇ gt1 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 or plJ361, in Bacillus pUB1 10, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667.
  • the expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYeDesaturased (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and
  • Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdy et al., Eds., Pp.
  • yeast vectors are, for example, pAG-1, YEp6, YEpI 3 or pEMBLYe23.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can perform its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACH ⁇ known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but also all other terminators functionally active in plants are suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, e.g., the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which is the protein / RNA ratio increases (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
  • translation enhancers e.g., the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which is the protein / RNA ratio increases (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
  • Plant gene expression must be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner.
  • useful promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those available from Plant viruses such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or plant promoters such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028.
  • telomeres are preferred sequences necessary to direct the gene product into its corresponding cell compartment (see review in Kermode, Crit., Plant, 15, 4 (1996) 285) -423 and references cited therein), for example to the vacuole, the nucleus, all types of plastids such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, extracellular space, mitochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
  • plastids such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, extracellular space, mitochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
  • Plant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter as described above (see review in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters which react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the heat-inducible hsp ⁇ O promoter Tomato (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound inducible pinll promoter (EP-A-0 375 091).
  • those promoters which induce gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and oil biosynthesis take place are preferred in sperm cells such as the cells of the endosperm and the developing embryo.
  • Suitable promoters are the rapeseed napkin promoter (US 5,608,152), the Vicia faba USP promoter (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the Arabidopsis oleosin promoter (US Pat.
  • phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Brassica Bce4 promoter (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) as well as promoters which induce seed-specific expression in monocotyledonous plants such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or lpt1
  • Barley gene promoter (WO 95/15389 and WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice Proline protein, wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, maize zein gene, oat glutelin gene, sorghum kasirin gene, rye secalin gene).
  • multiparallel expression of ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -3-desaturase or ⁇ -6 elongase used in the method may be desired.
  • the introduction of such expression cassettes can be carried out via a simultaneous transformation of a plurality of individual expression constructs or preferably by combining a plurality of expression cassettes on a construct. It is also possible to transform a plurality of vectors each having a plurality of expression cassettes and to transfer them to the host cell. For the purposes of the invention it is also possible to introduce genes into different plants and to combine them by crossing.
  • Other preferred sequences for use in the functional compound in plant gene expression cassettes are targeting sequences used to direct the gene product into its corresponding cell compartment, for example into the vacuole, the nucleus, all types of plastids, such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, mitochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes, and other compartments of plant cells are necessary (see review in Kermode, Crit., Rev. Plant Sci., 15, 4 (1996) 285-423 and references cited therein).
  • Expression cassette or vector all such constructions realized by genetic engineering methods in which either a) the nucleic acid sequence according to the invention, or b) a genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence according to the invention, for example a promoter, or
  • Natural genetic environment means the natural genomic or chromosomal locus in the source organism or presence in a genomic library.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • non-natural, synthetic ("artificial") methods such as mutagenesis.
  • transgenic plants are therefore to be understood as meaning that the nucleic acids used in the process are not in their natural position in the genome of the plant, it being possible for the nucleic acids to be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of the plant, but that the sequence has been changed from the natural sequence and / or that the
  • Transgenic is preferably understood to mean the expression of the nucleic acids according to the invention or the nucleic acid sequences used in the method according to the invention at a non-natural site in the genome, that is to say a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids.
  • Preferred transgenic plants are oilseed or oilseed crops and especially their various plant parts.
  • Plant is derived and / or can be used to produce the transgenic plant.
  • Plants in the process according to the invention include whole plants and all plant parts, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, callosis, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures that can be derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • the seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
  • the process according to the invention is also suitable for producing polyunsaturated fatty acids, in particular ARA, EPA and / or their
  • Mixtures in plant cell cultures and subsequent extraction of fatty acids from the cultures may in particular be suspension or callus cultures.
  • the compounds prepared in the process according to the invention can also be advantageously isolated from the plants from the plant seeds in the form of their oils, fat, lipids and / or free fatty acids.
  • Produced by this method Polyunsaturated fatty acids can be harvested by harvesting the plants or plant seeds either from the culture in which they grow or from the field.
  • this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the plant or from the culture.
  • the culture may be, for example, a greenhouse or field crop of a plant.
  • the isolation of the oils, lipids or free fatty acids can be carried out by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils, fats, lipids and / or free fatty acids by so-called cold beat or cold pressing can be obtained without supplying heat by pressing.
  • the plant parts, especially the seeds, to be easier to digest they are first crushed, steamed or roasted.
  • the thus pretreated seeds can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane. Subsequently, the solvent is removed again. Thereafter, the products thus obtained, which contain the polyunsaturated fatty acids, further processed, that is refined. First of all, for example, the mucilages and turbid matter are removed.
  • the so-called degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid, such as phosphoric acid. Subsequently, the free fatty acids are removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution. The product obtained is thoroughly washed with water to remove the lye remaining in the product and dried. In order to remove the dyes still contained in the product, the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon. Finally, the product is deodorized, for example, with steam.
  • the oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures obtained after pressing according to the invention are referred to as so-called crude oils.
  • Such compounds are the various tocopherols such as ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol and / or ⁇ -tocopherol or phytosterols such as brassicasterol, campesterol, stigmasterol, ⁇ -sitosterol, sitostanol, ⁇ 5 -avenasterol,
  • ⁇ 5 24-stigmastadienol, ⁇ 7 -stigmastenol or ⁇ 7 -avenasterol.
  • These compounds are contained in a range of 1 to 1000 mg / 100 g, advantageously from 10 to 800 mg / 100 g of lipid or oil.
  • Triterpenes such as germaniol, amyrin, cycloartanol and others may also be included in these lipids and oils.
  • lipids and / or oils contain in the process polyunsaturated fatty acids such as ARA, EPA and / or DHA bound in polar and nonpolar lipids such as phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, galactolipids, monoglycerides, diglycerides or triglycerides only to name a few. Lysophospholipids may also be present in the lipids and / or oils. These components of the lipids and / or oils may be replaced by suitable Methods are separated from each other. Not included in these crude oils is cholesterol.
  • polyunsaturated fatty acids such as ARA, EPA and / or DHA bound in polar and nonpolar lipids
  • phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinos
  • oils, lipids, fatty acids and / or fatty acid composition in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • the oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures according to the invention may be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, such as those described in the art, for example.
  • Fish oils are used. Typical of such fish oils short-chain fatty acids such as C12: 0, C14: 0, C14: 1, branched chain C15: 0, C15: 0, C16: 0 or C16: 1.
  • polyunsaturated C16 fatty acids such as C16: 2, C16: 3 or C16: 4, branched chain C17: 0, C17: 1, branched chain C18: 0 and C19: 0 and C19: 0 and C19: 1 are found in fish oil.
  • Such fatty acids are typical of fish oils and are rarely or not found in vegetable oils.
  • Economically relevant fish oils are e.g. Anchovy oil, menhadne oil, tuna oil, sardine oil, herring oil, marjoram oil, whale oil and salmon oil.
  • oils and / or oils of animal origin may be used for blending with the oils of the invention in the form of crude oils, that is in the form of lipids and / or oils that have not yet been purified, or differentially purified fractions may be used for blending .
  • the oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures according to the invention may be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, such as those described in the art, for example. Fish oils are used. These oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures, which consist of vegetable and animal components, can be used for the production of feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • oil is understood as meaning a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s). It is preferred that the oil, lipid or fat has a high proportion of polyunsaturated free or advantageously esterified fatty acid (s), in particular linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, stearidonic acid or eicosatetraenoic acid , Preferably, the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is a proportion of 50%, even more preferred is a proportion of 60%, 70%, 80%, 85% or more.
  • the proportion of fatty acid after transfer of the fatty acids into the methyl esters can be determined by gas chromatography by transesterification.
  • the oil, lipid or fat may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, e.g. Palmitin, palmitoleic, stearic, oleic acid, etc., included.
  • the proportion of the various fatty acids in the oil or fat may vary depending on the starting plant.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the process are, for example, sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, as described above. Glycolipids, phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol or other fatty acid esters.
  • the polyunsaturated fatty acids containing, for example, via an alkali treatment, for example, aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis advantageously in the presence of an alcohol such as methanol or ethanol or by enzymatic elimination release and isolate over, for example Phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO 4 .
  • an alkali treatment for example, aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis
  • an alcohol such as methanol or ethanol
  • enzymatic elimination release and isolate over, for example Phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO 4 .
  • the release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the plants used in the process can in principle be increased in two ways. Either the pool of free polyunsaturated fatty acids and / or the proportion of the esterified polyunsaturated fatty acids produced by the process can be increased.
  • the process according to the invention increases the pool of esterified polyunsaturated fatty acids in the transgenic organisms.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention are derived from a eukaryotic organism such as a plant, a microorganism such as an alga or an animal.
  • the nucleic acid sequences preferably come from the order Salmoniformes, Xenopus or Ciona, algae such as Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena or Ostreococcus, fungi such as the genus Phytophtora or diatoms such as the genera Thalassiosira or Phaeodactylum.
  • Nucleic acids useful in the method are derived from bacteria, fungi, diatoms, animals such as Caenorhabditis or Oncorhynchus or plants such as algae or mosses such as the genera Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella , Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, especially from the genera and species Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis,
  • Thalassiosira pseudonona Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans, or more particularly from Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonana or Crypthecodinium cohnii.
  • the cloning methods e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, culture of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were performed as described in Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
  • Example 2 Sequence Analysis of Recombinant DNA Sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad., See, USA74, 5463-5467 ). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention for the following examples.
  • a pGPTV derivative was used as described in DE10205607. This vector differs from pGPTV by an additional inserted / Ascl restriction site.
  • the starting point of the cloning was the cloning vector pUC19 (Maniatis et al.). In the first step, the conlinin promoter fragment was amplified with the following primers:
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • the OCS terminator (Genbank Accession V00088; De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Chem.
  • OCS_C 5 ' aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc
  • OCS_C 3' cccgggccggacaatcagtaaattgaacggag
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • the PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu ⁇ and then for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma ⁇ .
  • the vector pUC19-CnH-C was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma ⁇ .
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the Purification of the DNA was carried out using Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer.
  • vector and PCR product were ligated.
  • the Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose.
  • the resulting plasmid pUC19-Cnl1C_OCS was verified by sequencing.
  • the CnH-B promoter was amplified by PCR using the following primers:
  • the OCS terminator for CnII B was inserted.
  • the PCR was carried out with the following primers:
  • OCS2 5 ' aggcctcctgctttaatgagatatgcgagac
  • OCS2 3' cccgggcggacaatcagtaaattgaacggag
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
  • the PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu ⁇ and then for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma ⁇ .
  • the vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma ⁇ .
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions.
  • vector and PCR product were ligated.
  • the Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose.
  • the resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS2 was verified by sequencing.
  • the CnH-A promoter was amplified by PCR using the following primers:
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
  • the PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu ⁇ .
  • the vector pUC19-Cnl1-C was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma ⁇ .
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions.
  • vector and PCR product were ligated. To Roche's Rapid Ligation Kit was used.
  • the resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 was verified by sequencing.
  • the OCS terminator for CnIIA was inserted.
  • the PCR was carried out with the following primers:
  • OCS2 5 ' ggcctcctgctttaatgagatatgcga
  • OCS2 3 ' aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggaga
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
  • the PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu ⁇ and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme H / ⁇ dlM.
  • the vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu ⁇ and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme H / ⁇ dlM.
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions.
  • the plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 was used in the next step to clone the ⁇ 6, ⁇ 5-desaturase and ⁇ 6-elongase.
  • the ⁇ 6-desaturase was amplified from phytium irregular (WO02 / 26946) with the following PCR primers:
  • the PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme ⁇ / col.
  • the vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme ⁇ / col.
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out by means of Qiagen Gel Purification Kit according to
  • the plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) was in the next step for cloning the ⁇ 5-desaturase from Thraustochytrium ssp. (WO02 / 26946).
  • the ⁇ 5-desaturase from Thraustochytrium ssp. amplified with the following PCR primers:
  • the purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was verified by sequencing.
  • the plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was used in the next step for cloning the ⁇ 6 elongase from Physcomitrella patens (WO01 / 59128) for which it was amplified with the following PCR primers:
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • the PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Not ⁇ and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Xba ⁇ .
  • the vector pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Not ⁇ and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Xba ⁇ .
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out by means of Qiagen Gel Purification Kit according to
  • the binary vector for plant transformation was prepared.
  • the pUC19 Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Asc ⁇ .
  • the vector pGPTV was treated in the same way.
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
  • the PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l.
  • the vector pUC19 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l.
  • the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised.
  • the purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions.
  • vector and PCR product were ligated.
  • the Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose.
  • the resulting plasmid pUC19-Cnl1_OCS was verified by sequencing.
  • ⁇ 12-desaturase gene from Calendula officinalis (WO01 / 85968) was cloned into pUC19-Cn17_OCS.
  • d12Des (Co) was amplified with the following primers:
  • composition of the PCR mixture 50 ⁇ l: 5.00 ⁇ l template cDNA
  • Annealing temperature 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
  • the PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and then for 2 h at the same temperature with ⁇ / col.
  • the vector pUC19-Cnl1_OCS was incubated in the same way. Subsequently, the PCR fragment and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_D12Des (Co) was verified by sequencing.
  • the plasmid pUC19-Cnl1_D12Des (Co), as well as the plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) were incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l. Subsequently, the vector fragment and the vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and vector fragment were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was verified by sequencing.
  • the binary vector for plant transformation was prepared.
  • the pUC19 Cnl1_d6Des was incubated with the restriction enzyme Asc ⁇ (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) for 2 h at 37 0 C.
  • the vector pGPTV was treated in the same way.
  • pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was verified by sequencing.
  • Another vector suitable for plant transformation is pSUN2.
  • this vector was used in combination with the Gateway system (Invitrogen, Düsseldorf).
  • the gateway cassette A was inserted into the vector pSUN2 according to the manufacturer's instructions as follows:
  • the pSUN2 vector (1 ⁇ g) was incubated for 1 h with the restriction enzyme EcoRV at 37 °. Subsequently, the Gateway cassette A (Invitrogen, Düsseldorf) was ligated into the cut vector by means of the Rapid Ligation Kit of Roche, Mannheim. The resulting plasmid was transformed into E. coli DB3.1 cells (Invitrogen). The isolated plasmid pSUN-GW was subsequently verified by sequencing.
  • the expression cassette from pUC19-Cn11_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was excised by Ascl and ligated into the similarly treated vector pSUN-GW.
  • Binary vectors in Agrobacterium tumefaciens C58C1: pGV2260 or Escherichia coli can be used to generate transgenic rape plants (Deblaere et al., 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788).
  • oilseed rape plants Var Drakkar, NPZ Nor Weg plant breeding, Hohenlieth, Germany
  • Petioles or hypocotyls of freshly germinated sterile rape plants are incubated in a Petri dish with a 1:50 agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This is followed by a 3-day colncubation in darkness at 25 ° C on 3MS medium with 0.8% Bacto agar. Cultivation is continued after 3 days with 16 hours light / 8 hours darkness and weekly on MS medium with 500 mg / L claforan (Cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued. Growing shoots are transferred to MS medium with 2% sucrose, 250 mg / L claforan and 0.8% Bacto agar. If roots do not form after three weeks, then 2-indolebutyric acid was added to the medium as growth hormone for rooting.
  • 2-indolebutyric acid was added to the medium as growth hormone for rooting.
  • Regenerated shoots are obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred into soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse after cultivation for two weeks, flowered, harvested mature seeds and for elongase expression such as ⁇ 6-elongase activity or ⁇ -3-desaturase activity by means of lipid analyzes. Lines with elevated levels of C20 and C22 polyunsaturated fatty acids can thus be identified. b) Preparation of transgenic Camelina plants
  • Agrobacterium tumefaciens strain C58 was transformed by electroporation with PUFA vector 81, 191 and 192. Inoculation of explants from Camelina seedlings (age> 1 week) grown on MS medium with agrobacteria was performed. After two weeks of coculture, the plants were washed to remove agrobacteria and then transferred to regeneration medium with optimized BaP and NAA. After a further two days of regeneration, optimized amounts of kanamycin were added. This selection pressure was maintained for 12 days. The shoot regeneration was initiated by transfer to kanamycin-free BaP-containing medium. Sprouting was completed> 3 weeks after inoculation and rooting was induced on medium with NAA.
  • Sprouts were transferred to soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse, flowered, harvested mature seeds and examined for elongase expression such as ⁇ 6-elongase activity or ⁇ -3-desaturase activity by lipid analysis. Lines with elevated levels of polyunsaturated fatty acids can be identified.
  • the effect of genetic modification in plants on the production of a desired compound can be determined by cultivating the modified plant under suitable conditions (such as those described above) and increasing the medium and / or cellular components to increased production of the desired product (ie the lipids or a fatty acid).
  • suitable conditions such as those described above
  • suitable conditions such as those described above
  • suitable conditions such as those described above
  • medium and / or cellular components to increased production of the desired product (ie the lipids or a fatty acid).
  • analytical techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, thin layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods, and analytical chromatography such as high performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and p.
  • Analyzes include measurements of nutrient levels in the medium (eg, sugars, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate, and other ions), measurements, etc., used to produce the desired compound, such as by-products and by-products biomass composition and growth, analysis of production of common metabolites of biosynthetic pathways and measurements of gases generated during fermentation Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, Hrsgb., IRL Press , Pp. 103-129, 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and L mentioned therein Iteraturstellen described.
  • fatty acids abbreviations: FAME, fatty acid methyl ester, GC-MS, gas-liquid chromatography-mass spectrometry, TAG, triacylglycerol, TLC, thin-layer chromatography.
  • FAME fatty acid methyl ester
  • GC-MS gas-liquid chromatography-mass spectrometry
  • TAG triacylglycerol
  • TLC thin-layer chromatography
  • the material to be analyzed may be broken up by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or other applicable methods.
  • the material must be centrifuged after rupture.
  • the sediment is distilled in aqua. re-suspended, heated at 100 ° C for 10 min, cooled on ice and recentrifuged, followed by extraction into 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C resulting in hydrolyzed oil and lipid compounds. which give transmethylated lipids.
  • fatty acid methyl esters are extracted into petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 ° C and 240 ° C 20 min and 5 min at 240 ° C subjected.
  • Chropack Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm
  • the identity of the resulting fatty acid methyl esters must be defined using standards available from commercial sources (i.e., Sigma).
  • Plant material is first mechanically homogenized by mortars to make it more accessible to extraction. The mixture is then heated for 10 min at 100 ° C and sedimented again after cooling on ice. The cell sediment is hydrolyzed with 1 M methanolic sulfuric acid and 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C. and the lipids are transmethylated. The resulting fatty acid methyl esters (FAME) are extracted into petroleum ether.
  • FAME fatty acid methyl esters
  • the extracted FAME are purified by gas chromatography using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52CB, 25 m, 0.32 mm) and a temperature gradient from 170 ° C to 240 ° C in 20 min and 5 min at 240 ° C analyzed.
  • the identity of the fatty acid methyl esters is confirmed by comparison with corresponding FAME standards (Sigma).
  • the identity and the position of the double bond can be further analyzed by GC-MS by suitable chemical derivatization of the FAME mixtures, for example to give 4,4-dimethoxoxazoline derivatives (Christie, 1998).
  • Example 5 the seeds of the plants transformed with the constructs pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co), pSUN-5G and pSUN-8G were analyzed. Compared to control plants that were not transformed (wild-type control, WT), a clear change in the fatty acid spectrum was observed. This showed that the transformed genes are functional. Table 1 summarizes the results.
  • Tab. 2 Fatty acid analysis of transgenic seeds which were transformed with the construct pSUN-5G.
  • Table 3 Gas chromatographic analysis of seed material from Camelina sativa, L. The individual fatty acids are given in area percent.

Abstract

The present invention relates to a process for producing arachidonic acid (= ARA) or eicosapentaenoic acid (= EPA) or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, advantageously in the seed of transgenic plants of the family Brassicaceae having a content of ARA or EPA, or ARA and EPA, of at least 3% by weight, based on the total lipid content of the transgenic plant, by introducing into the organism nucleic acids which code for polypeptides having Δ-6-desaturase, Δ-6-elongase and Δ-5-desaturase activity, wherein, as a result of the enzymatic activity of the introduced enzymes, a fatty acid selected from the group consisting of the fatty acids oleic acid [C18:1Δ9], linoleic acid [C18:2Δ9, 12], α-linolenic acid [C18:3Δ6, 9, 12], eicosenoic acid (20:1Δ11) and erucic acid [C22:1Δ13] is reduced by at least 10% compared with the nontransgenic wild type plant. Advantageously, other enzymes selected from the group of the enzymes ω-3-desaturases, Δ-12-desaturases, Δ-6-desaturases, Δ-6-elongases, Δ-5-desaturases, Δ-5-elongases and/or Δ-4-desaturases can be introduced into the plants.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ARACHIDONSÄURE UND/ODER EICOSAPENTAENSÄURE IN PFLANZENMETHOD FOR THE PRODUCTION OF ARACHIDONIC ACID AND / OR EICOSAPENTAIC ACID IN PLANTS
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Herstellung von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorteilhaft im Samen transgener Pflanzen der Familie derThe present invention relates to a process for the preparation of arachidonic acid (= ARA) or eicosapentaenoic acid (= EPA) or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid advantageously in the seed of transgenic plants of the family of
Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide mit Δ-6- Desaturase-, Δ-6-Elongase- und Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, wobei durch die enzymatische Aktivität der eingebrachten Enzyme eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1Δ9], Linolsäure [C18:2Δ9 12], α- Linolensäure [C18:3Δ6 9 12], Icosensäure (20:1Δ11) und Erucasäure [C22:1Δ13] um mindestens 10 % gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze reduziert wird. Vorteilhaft können weitere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme ω-3- Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen in die Pflanzen eingebracht werden.Brassicaceae containing at least 3% by weight of ARA or EPA or ARA and EPA, relative to the total lipid content of the transgenic plant, by introducing nucleic acids into the organism which are responsible for Δ-6-desaturase, Δ-6 polypeptides Encode elongase and Δ-5-desaturase activity, wherein the enzymatic activity of the enzymes introduced a fatty acid selected from the group consisting of the fatty acids oleic acid [C18: 1 Δ9 ], linoleic acid [C18: 2 Δ9 12 ], α-linolenic acid [C18 : 3 Δ6 9 12 ], icosenoic acid (20: 1 Δ11 ) and erucic acid [C22: 1 Δ13 ] is reduced by at least 10% over the non-transgenic wild-type plant. Advantageously, further enzymes can be selected from the group of the enzymes ω-3-desaturases, Δ-12-desaturases, Δ-6-desaturases, Δ-6-elongases, Δ-5-desaturases, Δ-5-elongases and / or Δ- 4-desaturases are introduced into the plants.
Bei den eingebrachten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um die in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenzen. Bevorzugt werden neben diesen Nukleinsäuresequenzen weitere Nukleinsäurese- quenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase- oder Δ-12-Desaturaseaktivität kodieren, in die Pflanzen eingebracht und ebenfalls gleichzeitig exprimiert. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um die in SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 1 1 dargestellten Nukleinsäuresequenzen.The introduced nucleic acid sequences are the sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7. In addition to these nucleic acid sequences, other nucleic acid sequences which code for polypeptides having ω-3-desaturase or Δ-12 desaturase activity are preferably introduced into the plants and also expressed simultaneously. These are particularly preferably the nucleic acid sequences shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.
Vorteilhaft können diese Nukleinsäuresequenzen gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide der Biosynthese des Fettsäureoder Lipidstoffwechels codieren, in dem Organismus exprimiert werden. Besonders vorteilhaft sind Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ-4-Desaturase- und/oder Δ-5- Elongaseaktivität codieren. Vorteilhaft werden die im Verfahren hergestellten Öle, Lipide oder freien Fettsäuren, die ARA und/oder EPA enthalten, in dem Fachmann bekannten Mengen Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika zugesetzt.Advantageously, these nucleic acid sequences may optionally be expressed in the organism along with other nucleic acid sequences encoding polypeptides of biosynthesis of the fatty acid or lipid metabolism. Particularly advantageous are nucleic acid sequences which code for a Δ-4-desaturase and / or Δ-5 elongase activity. Advantageously, the oils, lipids or free fatty acids produced in the process, which contain ARA and / or EPA, are added to known quantities of feed, food, cosmetics or pharmaceuticals known to the person skilled in the art.
Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. DieThe lipid synthesis can be divided into two sections: the synthesis of fatty acids and their attachment to sn-glycerol-3-phosphate and the addition or modification of a polar head group. Common lipids used in membranes include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides. The
Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Aceto- acetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisie- rungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F. C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D. C, S. 612-636 und darin enthaltene Literatur- stellen; Lengeier et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiolo- gical Reviews 57:522-542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend für die weiteren Elonga- tionen aus den Phospholipiden wieder in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA-Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by the acetyl-CoA carboxylase or into acetyl-ACP by the acetyl transacylase. After a condensation reaction, these two product molecules together form acetoacetyl-ACP, which is converted via a series of condensation, reduction and dehydration reactions, so that a saturated fatty acid molecule with the desired chain length is obtained. The production of unsaturated fatty acids from these molecules is catalyzed by specific desaturases, either aerobically by molecular oxygen or anaerobically (for fatty acid synthesis in microorganisms, see FC Neidhardt et al., (1996) E. coli and Salmonella.) ASM Press: Washington, D.C.S. Lengeier et al (Eds.) (1999) Biology of Procaryotes, Thieme: Stuttgart, New York, and the references therein, and Magnuson, K., et al. (1993) Microbiolo - gical Reviews 57: 522-542 and the references contained therein). The fatty acids thus bound to phospholipids must then be converted back into the fatty acid CoA ester pool for the further elongations from the phospholipids. This is facilitated by acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases. Furthermore, these enzymes can transfer the elongated fatty acids again from the CoA esters to the phospholipids. This reaction sequence can optionally be run through several times.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transpor- tiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166).Furthermore, fatty acids must subsequently be transported to various modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid. Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example by glycerol-fatty acid acyltransferase (see Frentzen, 1998, Lipid, 100 (4-5): 161-166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipid- Stoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und - Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641 ; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:11 1-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31 :397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1 ):1- 16.For publications on plant fatty acid biosynthesis, desaturation, lipid metabolism and membrane transport of fatty compounds, beta oxidation, fatty acid modification and cofactors, triacylglycerol storage and assembly, including references therein, see the following articles: Kinney, 1997, Genetic Engineering, eds .: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge and Browse, 1995, Plant Cell 7: 957-970; Shanklin and Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611-641; Voelker, 1996, Genetic Engineering, eds. JK Setlow, 18:11 1-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31: 397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256: 181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34: 267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, eds .: Murata and Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13 (1): 1-16.
Im folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (jxily ynsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren ;_[ong chain jxily ynsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren), im besonderen werden unter PUFA, PUFAs, LCPUFA und LCPUFAs ARA, EPA und/oder Docosahexaensäure (= DHA) verstanden.In the following, polyunsaturated fatty acids are referred to as PUFAs, PUFAs, LCPUFAs or LCPUFAs (PUFA, polyunsaturated fatty acids; ong chain silicone-unsaturated fatty acids, LCPUFA, long-chain polyunsaturated fatty acids), in particular PUFA, PUFAs, LCPUFA and LCPUFAs ARA, EPA and / or docosahexaenoic acid (= DHA) understood.
Fettsäuren und Triacylglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren oder um Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. Mehrfach- ungesättigte Fettsäuren wie Linol- und Linolensäure sind für Säugetiere essentiell, da sie nicht von diesen selbst hergestellt werden können. Deshalb stellen mehrfach ungesättigte ω-3-Fettsäuren und ω-6-Fettsäuren einen wichtigen Bestandteil der tierischen und menschlichen Nahrung dar. So werden z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren, speziell mehrfach ungesättigten, Fettsäuren bevorzugt. Den mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren wird dabei ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Prävention einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3-Fettsäuren zur Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden (Shimikawa 2001 , World Rev. Nutr. Diet. 88, 100-108).Fatty acids and triacylglycerides have a variety of uses in the food, animal nutrition, cosmetics and pharmaceutical industries. Depending on whether they are free saturated and unsaturated fatty acids or triacylglycerides with an increased content of saturated or unsaturated fatty acids, they are suitable for a wide variety of applications. Multiple- Unsaturated fatty acids such as linoleic and linolenic acid are essential for mammals because they can not be produced by them. Therefore, polyunsaturated ω-3 fatty acids and ω-6 fatty acids represent an important component of animal and human food. Thus, for example, in the human diet lipids with unsaturated fatty acids, especially polyunsaturated fatty acids are preferred. The polyunsaturated ω-3 fatty acids thereby a positive effect on the cholesterol level in the blood and thus on the prevention of heart disease is attributed. By adding these ω-3 fatty acids to the diet, the risk of heart disease, stroke, or hypertension can be significantly reduced (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr., Diet, 88, 100-108).
Auch entzündliche, speziell chronisch entzündliche, Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch ω-3-Fettsäuren positiv beeinflussen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61 , 345-358; Cleland und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätetischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung, ω-6- Fettsäuren wie Arachidonsäure üben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt aus. ARA ist aber für die Entwicklung von Neugeborenen vorteilhaft und wichtig.. ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, und den Thromboxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten. Eicosanoide (sog. PG2-SeMe), die aus ω-6-Fettsäuren gebildet werden, fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide (sog. PG3-SeMe) aus ω-3-Fettsäuren geringe oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben.Also inflammatory, especially chronic inflammatory, processes in the context of immunological diseases such as rheumatoid arthritis can be positively influenced by ω-3 fatty acids (Calder 2002, Proc Nutr Soc 61, 345-358, Cleland and James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305-2307). They are therefore added to foods, especially dietary foods, or are used in medicaments, omega-6 fatty acids such as arachidonic acid have a negative effect in these rheumatic diseases. However, ARA is beneficial and important for the development of newborns. Ω-3 and ω-6 fatty acids are precursors of tissue hormones, called eicosanoids such as the prostaglandins, derived from dihomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid and the thromboxanes and leukotrienes derived from arachidonic acid and eicosapentaenoic acid. Eicosanoids (so-called PG 2 -SeMe), which are formed from ω-6 fatty acids, usually promote inflammatory reactions, while eicosanoids (so-called PG 3 -SeMe) from ω-3 fatty acids have little or no pro-inflammatory effect.
Mehrfach ungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20.5 Δ58 i i 14 17) oder Docosaheχaensäure (= DHA, C22:6Δ47 10 13 16 19) sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, der Funktionalität des Auges, der Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA und Yeo YK Pharmacol Res 40:21 1-225, 1999). Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an Produktion mehrfach ungesättigter langketti- ger Fettsäuren, wie den vorgenannten. Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren, die bevorzugt in Fischölen vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Docosahexaensäure (= DHA, C22:6Δ47 10 13 16 19) oder Eisosapentaensäure (= EPA, C20:5A58 11 14 17) Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Der ungesättigten Fettsäure DHA wird dabei ein positiver Effekt auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Gehirnfunktionen zugeschrieben. Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren.Polyunsaturated long-chain ω-3 fatty acids such as eicosapentaenoic acid (= EPA, C20 5 Δ58 ii 14. 17) or Docosahe χ a enoic acid (= DHA, C22: 6 Δ47 10 13 16 19) are important components of the human diet due to their different Roles in health that include aspects such as the development of the child's brain, the functionality of the eye, the synthesis of hormones and other signaling substances, as well as the prevention of cardiovascular complaints, cancer and diabetes (Poulos, A Lipids 30: 1 14, 1995, Horrocks, LA and Yeo YK Pharmacol Res 40: 21 1-225, 1999). There is therefore a need for production of polyunsaturated long-chain fatty acids, such as those mentioned above. Due to the customary composition of human food today, addition of polyunsaturated ω-3 fatty acids, which are preferred in fish oils, is particularly important for food. For example, polyunsaturated fatty acids such as docosahexaenoic acid (= DHA, C22: 6 Δ47 10 13 16 19 ) or icosapentaenoic acid (= EPA, C20: 5 A58 11 14 17 ) are added to baby food to increase the nutritional value. The unsaturated fatty acid DHA is thereby attributed a positive effect on the development and maintenance of brain functions. It For this reason there is a need for the production of polyunsaturated long-chain fatty acids.
Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Tri- glycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (= ARA, C20:4Δ58 11 14), Dihomo-γ-linolensäure (C20:3Δ8 11 14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5Δ7 10 13 16 19) werden in Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färber- saflor nicht synthetisiert. Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.Mainly the various fatty acids and triglycerides are obtained from microorganisms such as Mortierella or Schizochytrium or from oil-producing plants such as soybean, oilseed rape, algae such as Crypthecodinium or Phaeodactylum and others, where they are usually in the form of their triacylglycerides (= triglycerides = triglycerols) attack. But they can also be obtained from animals such as fish. The free fatty acids are advantageously prepared by saponification. Very long-chain polyunsaturated fatty acids such as DHA, EPA, arachidonic acid (= ARA, C20: 4 Δ58 11 14 ), dihomo-γ-linolenic acid (C20: 3 Δ8 11 14 ) or docosapentaenoic acid (DPA, C22: 5 Δ7 10 13 16 19 ) are not synthesized in oil crops such as oilseed rape, soya, sunflower, dyer's safflower. Common natural sources of these fatty acids are fish such as herring, salmon, sardine, perch, eel, carp, trout, halibut, mackerel, zander or tuna or algae.
Fettsäuren aus Gattungen der Familie Brassicaceae wie Brassica napus oder Brassica rapa werden gerne in der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und/oder Pharmaindustrie genommen. Von Nachteil bei den Ölen dieser Familie ist, dass sie einige Fettsäuren wie α-Linolensäure, Icosensäure oder Erucasäure enthalten, die eher unerwünscht sind, so dass die Öle nicht in beliebigen Mengen verwendet werden können. Andere Fettsäuren, die in den Ölen enthalten sind wie Ölsäure, haben als Nahrungsmittelzusatzstoffe einen eher geringeren Wert.Fatty acids from genera of the Brassicaceae family such as Brassica napus or Brassica rapa are often used in the food, feed, cosmetic and / or pharmaceutical industries. A disadvantage of the oils of this family is that they contain some fatty acids such as α-linolenic acid, icosenoic acid or erucic acid, which are rather undesirable, so that the oils can not be used in any amounts. Other fatty acids contained in the oils, such as oleic acid, have a lower value as food additives.
So wurden in der Familie der Brassicaceae im Gegensatz zu anderen Pflanzenfamilien wie Linaceae, Poaceae oder Leguminosae längerkettige Fettsäuren wie Icosensäure 20:1 und Erucasäure 22:1 nachgewiesen. Die Gehalte der Erucasäure liegen zum Beispiel für Brassica carinata bei 35-48%, für Brassica juncea 18-49%, Brassica napus 45-54%, Crambe abyssinica 55-60%, Eruca sativa 34-47%, Sinapis alba 33-51 %, Camelina sativa 3-5%, Raphanus sativa >22%.Thus, unlike other plant families such as Linaceae, Poaceae or Leguminosae, the long-chain fatty acids such as icosenoic acid 20: 1 and erucic acid 22: 1 were detected in the family Brassicaceae. The levels of erucic acid are, for example, 35-48% for Brassica carinata, 18-49% for Brassica juncea, 45-54% Brassica napus, 55-60% Crambe abyssinica, 34-47% Eruca sativa, and 33-51 Sinapis alba %, Camelina sativa 3-5%, Raphanus sativa> 22%.
Erucasäure sollte in Ölen, die in der menschlichen Ernährung Verwendung finden, nur in sehr geringen Mengen oder gar nicht enthalten sein. Vorteilhafte Öle, Lipide und/oder Fettsäurekompositionen sollten einen möglichst geringen Anteil an Fettsäuren wie Ölsäure, α-Linolensäure, Icosen- und/oder Erucasäure haben. Vorteilhaft sollten gleichzeitig möglichst hohe Anteile an Fettsäuren wie Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure enthalten sein. Die zur Herstellung verwendeten Pflanzen sollten darüber hinaus möglichst einfach anbaubar sein und es sollten etablierte Aufarbeitungsprozesse für die enthaltenen Öle, Lipide und/oderErucic acid should only be present in very small amounts or not at all in oils used in human nutrition. Advantageous oils, lipids and / or fatty acid compositions should have the lowest possible content of fatty acids such as oleic acid, α-linolenic acid, icosenic acid and / or erucic acid. Advantageously, at the same time the highest possible levels of fatty acids such as arachidonic acid and / or eicosapentaenoic acid should be included. In addition, the plants used for the production should be as easy to grow as possible and it should be established processing processes for the oils contained, lipids and / or
Fettsäurekompositionen vorhanden sein. Außderm sollte das Herstellverfahren einfach und kostengünstig sein. Weiterhin sollten die Öle, Lipide und/oder Fettsäurekompositionen dieser Pflanzen schon über einen längeren Zeitraum zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika und/oder Pharmazeutika in der Industrie verwendet worden sein. Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell ARA, EPA und/oder DHA, im Samen transgener Pflanze zu entwickeln, und gleichzeitig die Gehalte an unerwünschten Fettsäuren zu verringern.Fatty acid compositions may be present. Externally, the manufacturing process should be simple and inexpensive. Furthermore, the oils, lipids and / or fatty acid compositions of these plants should have been used for an extended period of time for the production of feed, food, cosmetics and / or pharmaceuticals in the industry. It is an object of the present invention to develop a process for the production of large quantities of polyunsaturated fatty acids, especially ARA, EPA and / or DHA, in the seed of transgenic plants and at the same time to reduce the levels of undesired fatty acids.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in transgenen Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Desaturase codiert, und b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Elongase codiert, und c) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-5-Desaturase codiert, und d) Ernten der Nutzpflanze, wobei durch die enzymatische Aktivität der unter den Schritten (a) bis (c) eingebrachten Enzyme eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1Δ9], Linolsäure [C18:2Δ9 12], α-Linolensäure [C18:3Δ6 9 12], Icosensäure [C20:1Δ11] und Erucasäure [C22:1Δ13] um mindestens 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 % oder 15 %, vorteilhaft um mindestens 16 %, 17 %, 18 %, 19 % oder 20 %, besonders vorteilhaft um mindestens 25 %, 30 %, 35 % oder 40 % gegenüber der nicht- transgenen Wildtyppflanze reduziert wird. Unter Wildtyppflanze sind Pflanzen zu verstehen, die die nicht mutierte (nicht veränderte) Form eines Gens oder Allels tragen und mehrheitlich in einer unter natürlichen Bedingungen lebenden Population vorkommt. Unter Wildtyp sind auch sogenannte Nullzygoten zu verstehen. Diese wurden mit einem Gen transformiert, haben dieses jedoch wieder verloren. Alle vorgenannten Angaben sind Gewichtsprozentangaben und beziehen sich auf den Gehalt der Fettsäuren in der entsprechenden Wildtyppflanze.This object has been achieved by the process according to the invention for the production of arachidonic acid (= ARA) or eicosapentaenoic acid (= EPA) or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid in transgenic plants of the family Brassicaceae containing at least 3% by weight of ARA or EPA or ARA and EPA. % based on the total lipid content of the transgenic plant, characterized in that it comprises the following process steps: a) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop which codes for a Δ6-desaturase, and b) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop c) introducing at least one nucleic acid sequence into the crop which encodes a Δ5-desaturase, and d) harvesting the crop, wherein the enzymatic activity of the enzyme obtained by the steps (a) to (a) (c) enzymes introduced a fatty acid selected from the group consisting of the fatty acids oleic acid [C18: 1 Δ9 ] , Linoleic acid [C18: 2 Δ9 12 ], α-linolenic acid [C18: 3 Δ6 9 12 ], icosenoic acid [C20: 1 Δ11 ] and erucic acid [C22: 1 Δ13 ] by at least 10%, 11%, 12%, 13% , 14% or 15%, advantageously at least 16%, 17%, 18%, 19% or 20%, more preferably at least 25%, 30%, 35% or 40%, of the non-transgenic wild type plant. The wild type plant is understood as meaning plants which carry the non-mutated (unmodified) form of a gene or allele and are found, for the most part, in a population living under natural conditions. Under wild-type also so-called zero-zygotes are to be understood. These were transformed with a gene, but lost it again. All of the above data are percentages by weight and refer to the content of the fatty acids in the corresponding wild-type plant.
Vorteilhaft enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäuren Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure noch weitere Fettsäuren wie mehrfach ungesättigte Fettsäuren, einfach ungesättigte Fettsäuren und ungesättigte Fettsäuren. Vorteilhaft werden gesättigte Fettsäuren mit den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren wenig oder gar nicht umgesetzt. Unter wenig ist zu verstehen, das im Vergleich zu mehrfach ungesät- tigten Fettsäuren die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5 % der Aktivität, vorteilhaft weniger als 3 %, besonders vorteilhaft mit weniger als 2 %, ganz besonders bevorzugt mit weniger als 1 ; 0,5; 0,25 oder 0,125 % umgesetzt werden. Diese hergestellten Fettsäuren können als einziges Produkt im Verfahren hergestellt werden oder in einem Fettsäuregemisch vorliegen.Advantageously, the fatty acids arachidonic acid (= ARA) or eicosapentaenoic acid (= EPA) or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid produced in the process according to the invention also contain other fatty acids, such as polyunsaturated fatty acids, monounsaturated fatty acids and unsaturated fatty acids. Advantageously, saturated fatty acids are little or not reacted with the nucleic acids used in the process. Little is to be understood, compared to multiple unsatisfied saturated fatty acids have less than 5% of the saturated fatty acids, advantageously less than 3%, more preferably less than 2%, most preferably less than 1%; 0.5; 0.25 or 0.125% are implemented. These produced fatty acids can be produced as the only product in the process or present in a fatty acid mixture.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6- Desaturase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren.The nucleic acid sequences used in the method according to the invention are isolated nucleic acid sequences which code for polypeptides having Δ-6-desaturase, Δ-6-elongase and / or Δ-5-desaturase activity.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, verwendet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 40 % Identität mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO: 8 aufweisen und eine Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-5-Desaturaseaktivität haben.Nucleic acid sequences coding for polypeptides having Δ 6-desaturase, Δ 6-elongase, or Δ 5-desaturase activity are advantageously used in the method according to the invention selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or b) nucleic acid sequences which, as a result of the degenerate genetic code, differ from those shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, which code for polypeptides which have at least 40% identity at the amino acid level with SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 and a Δ-6-desaturase, Δ-6 Have elongase or Δ5-desaturase activity.
Vorteilhaft werden im Verfahren weitere Nukleinsäuresequenzen in die Nutzpflanzen eingebracht, die für eine ω-3-Desaturase oder Δ-12-Desaturase oder ω-3-Desaturase und Δ-12-Desaturase codieren. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz zusätzlich in die transgene Pflanze eingebracht wird, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase-Aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischenIn the method, further nucleic acid sequences are advantageously introduced into the crop plants which code for an ω-3-desaturase or Δ-12-desaturase or ω-3-desaturase and Δ-12-desaturase. A preferred embodiment of the method is characterized in that a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for polypeptides having ω-3-desaturase activity, selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO : 9, or b) nucleic acid sequences that result as a result of the degenerate genetic
Codes von der in SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60 % Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine ω-3-Desaturaseaktivität haben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz zusätzlich in die transgene Pflanze eingebracht wird, die für Polypeptide mit Δ-12-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 1 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60 % Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine Δ-12-Desaturaseaktivität haben.C) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, which code for polypeptides having at least 60% identity with SEQ ID NO: 10 at the amino acid level and an ω Have -3-desaturase activity. In a further preferred embodiment, the method is characterized in that a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for polypeptides having Δ12-desaturase activity, selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO B) nucleic acid sequences which can be deduced as a result of the degenerate genetic code from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 1, which polypeptides encode at least 60% identity with SEQ ID NO: 10 at the amino acid level and have a Δ-12 desaturase activity.
Diese vorgenannten Δ-12-Desaturasesequenzen können allein oder in Kombination mit den ω3-Desaturasesequenzen mit den im Verfahren verwendeten Nukleinsäurese- quenzen, die für Δ-6-Desatu rasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5-Desaturasen codieren verwendet werden.These abovementioned Δ-12-desaturase sequences can be used alone or in combination with the ω3-desaturase sequences with the nucleic acid sequences used in the method which code for Δ-6 desaturases, Δ6-elongases and / or Δ5-desaturases become.
Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren im vegetativen oder reproduktiven Gewebe exprimiert.Advantageously, the nucleic acids are expressed in vegetative or reproductive tissue.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen führen neben einer Erniedri- gung unerwünschter Fettsäuren zu einer Steigerung des ARA- oder EPA- oder ARA- und EPA-Gehalts in den Pflanzen. In den transgenen Pflanzen kann dadurch im Verfahren eine Erhöhung des ARA- oder EPA- oder ARA- und EPA-Gehalts auf bis zu mehr als 8%, vorteilhaft bis zu mehr als 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% oder 20%, besonders vorteilhaft auf mehr als 21 %, 22%, 23%, 24% oder 25%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt der Pflanze erreicht werden, Bei den vorgenannten Prozentwerten handelt es sich um Gewichtsprozentangaben.The nucleic acid sequences used in the method result in addition to a lowering of unwanted fatty acids to increase the ARA or EPA or ARA and EPA content in the plants. In the transgenic plants, the process can thereby increase the ARA or EPA or ARA and EPA content to more than 8%, advantageously up to more than 10%, 11%, 12%, 13%, 14%. , 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20%, particularly advantageous to more than 21%, 22%, 23%, 24% or 25%, based on the total lipid content of the plant to be achieved The above percentages are by weight.
Zur weiteren Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft gegenüber Ölen und/oder Triglyceriden aus Wildtyp-Pflanzen erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vor allem von ARA, EPA oder deren Mischungen, kann es vorteilhaft sein, die Menge des Ausgangsstoffs für die Fettsäuresynthese zu steigern. Dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer Δ-12- Desaturase kodiert, und deren Co-Expression in dem Organismus erreicht werden.To further increase the yield in the process described for the preparation of oils and / or triglycerides with an advantageous over oils and / or triglycerides from wild-type plants increased content of polyunsaturated fatty acids, especially of ARA, EPA or mixtures thereof, it may be advantageous to increase the amount of starting material for fatty acid synthesis. This can be achieved, for example, by introducing a nucleic acid encoding a polypeptide having the activity of a Δ12-desaturase and co-expressing it in the organism.
Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden Pflanzen der Gattung Brassica, z.B. Raps, Rübsen oder Sareptasenf, die einen hohen Ölsäuregehalt, aber nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz in die transgene Pflanze eingebracht, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturaseaktivität kodiert.This is particularly advantageous in oil-producing plants of the genus Brassica, for example rapeseed, turnip rape or sareptase, which have a high oleic acid content but only a low content of linoleic acid. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, a nucleic acid sequence is additionally introduced into the transgenic plant which codes for a polypeptide having Δ12-desaturase activity.
Vorteilhaft setzen die im erfingungsgemäßen Verfahren verwendeten Δ-12- Desaturasen Ölsäure (C18:1Δ9) zu Linolsäure (C18:2Δ9 12) oder C18:2Δ69 zu C18:3Δ69 12 (Gammalinolensäure = GLA), den Ausgangssubstanzen für die Synthese von ARA und/oder EPA um. Vorteilhaft setzen die verwendeten Δ-12-Desaturasen Fettsäuren gebunden an Phospholipide oder CoA-Fettsäureester, vorteilhaft gebunden an CoA- Fettsäureester, um. Dies führt, wenn vorher ein Elongationsschritt stattgefunden hat, vorteilhaft zu höheren Ausbeuten an Syntheseprodukten, da die Elongation in derThe Δ-12-desaturases oleic acid (C18: 1 Δ9 ) used in the process according to the invention advantageously lead to linoleic acid (C18: 2 Δ9 12 ) or C18: 2 Δ69 to C18: 3 Δ69 12 (gamma linolenic acid = GLA), the starting substances for the synthesis from ARA and / or EPA. Advantageously, the Δ-12-desaturases used bind fatty acids bound to phospholipids or CoA fatty acid esters, advantageously bound to CoA fatty acid esters. This, if an elongation step has previously taken place, advantageously leads to higher yields of synthesis products, since the elongation in the
Regel an CoA-Fettsäureestern erfolgt, während die Desaturierung überwiegend an den Phospholipiden oder an den Triglyceriden erfolgt. Ein Ausstausch, der eine weitere möglicherweise limitierende Enzymreaktion erfoderlich machen würde, zwischen den CoA-Fettsäureestern und den Phospholipiden oder Triglyceriden ist somit nicht erforderlich.Usually takes place on CoA fatty acid esters, while the desaturation takes place predominantly on the phospholipids or on the triglycerides. An exchange that would make a further possibly limiting enzyme reaction erfoderlich between the CoA fatty acid esters and the phospholipids or triglycerides is therefore not required.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden alle Nuklein- säuresequenzen auf einem gemeinsamen rekombinanten Nukleinsäuremolekül in die Pflanzen eingebracht werden, wobei jede Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors steht kann und es sich bei diesem eigenen Promotor um einen samenspezifischen Promotor handelt kann.In a further advantageous embodiment of the method, all nucleic acid sequences are introduced into the plants on a common recombinant nucleic acid molecule, wherein each nucleic acid sequence can be under the control of its own promoter and this own promoter can be a seed-specific promoter.
Die Erfindung kann aber nicht nur mit den im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren erfolgreich umgesetzt werden, vielmehr können auch von diesen Sequenzen bis zu einem gewissen Grad abweichende Sequenzen, die für Proteine mit der im Wesentlichen gleichen enzymatischen Aktivität kodieren, eingesetzt werden. Hierbei handelt es sich um Nukleinsäuren, die zu den im Sequenzprotokoll spezifizierten Sequenzen einen bestimmten Identitäts- oder Homologiegrad aufweisen. Unter im wesentlichen gleiche enzymatische Aktivität sind Proteine zu verstehen, die mindestens 20%, 30%, 40%, 50% oder 60%, vorteilhaft mindestens 70%, 80%, 90% oder 95%, besonders vorteilhaft mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% der enzymatischen Aktivität der Wildtyp-Enzyme aufweisen.However, not only can the invention be successfully implemented with the nucleic acids given in the sequence listing, but also sequences which deviate to a certain degree from these sequences and which code for proteins with essentially the same enzymatic activity can be used. These are nucleic acids which have a certain degree of identity or homology to the sequences specified in the sequence listing. Substantially identical enzymatic activity is to be understood as meaning proteins which are at least 20%, 30%, 40%, 50% or 60%, advantageously at least 70%, 80%, 90% or 95%, particularly advantageously at least 96%, 97%. , 98% or 99% of the enzymatic activity of the wild-type enzymes.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie oder Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuren werden die Sequenzen untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Sind an derselben Position unterschiedliche Aminosäuren, die aber diegleichen Eigenschaften aufweisen, z.B. zwei hydrophobe Aminosäuren, so sind sie homolog oder ähnlich. Die prozentuale Identität oder Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an Positionen, die den Sequenzen gemeinsam oder homolog sind (d.h. % Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100).To determine the percent homology or identity of two amino acid sequences or of two nucleic acids, the sequences are written among themselves (eg, gaps can be inserted into the sequence of one protein or one nucleic acid to create an optimal alignment with the other protein or nucleic acid). The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. If a position in one sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding site in the other sequence, then the molecules at that position are identical. If different amino acids are at the same position but have the same properties, eg two hydrophobic amino acids, then they are homologous or similar. The percentage Identity or homology between the two sequences is a function of the number of positions that are common or homologous to the sequences (ie% identity = number of identical positions / total number of positions x 100).
Die Identität wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbe- reich berechnet. Für den Vergleich verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, zur Verfügung. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PiIeUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981 )], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991 )] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 und Average Mismatch: 0.000. Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.The identity was calculated over the entire amino acid or nucleic acid sequence range. For the comparison of different sequences, a number of programs based on different algorithms are available to the person skilled in the art. The algorithms of Needleman and Wunsch or Smith and Waterman provide particularly reliable results. For the sequence comparisons the program PiIeUp was used (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) or the programs Gap and BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) and Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)], which are described in the GCG Software Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison , Wisconsin, USA, 53711 (1991)]. The percent sequence values given above were determined using the GAP program over the entire sequence range with the following settings: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10,000, and Average Mismatch: 0.000 These settings were always used as default settings for sequence comparisons unless otherwise specified.
Der Fachmann erkennt, dass innerhalb einer Population DNA-Sequenzpolymorphis- men, die zu Änderungen der Aminosäuresequenz der im Verfahren verwendetenOne skilled in the art will recognize that within a population, DNA sequence polymorphisms leading to changes in the amino acid sequence of those used in the method
Polypeptide führen, auftreten können. Diese natürlichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des Δ-6-Desaturase-, Δ-5- Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariati- onen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Δ-6-Desaturase, Δ- 5-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die die enzymatische Aktivität nicht wesentlich verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.Polypeptides cause, can occur. These natural variants usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of the Δ6-desaturase, Δ5-desaturase and / or Δ6-elongase gene. All and all of these nucleotide variations and resulting amino acid polymorphisms in the Δ6-desaturase, Δ5-desaturase and / or Δ6-elongase, which are the result of natural variation and which do not substantially alter enzymatic activity, are said to be in the art Scope of the invention may be included.
Unter wesentlicher enzymatischer Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Δ-6-Desaturase Δ-6-Elongase oder Δ-5-Desaturase ist zu verstehen, dass sie gegenüber den durch die Sequenz und deren Derivate kodierten Proteinen/Enzymen im Vergleich noch eine enzymatische Aktivität von mindestens 10 %, bevorzugt von mindestens 20 %, besonders bevorzugt von mindestens 30 %, 40 %, 50 % oder mind. 60 % und am meisten bevorzugt von mindestens 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % aufweisen und damit am Stoffwechsel von Verbindungen, die zum Aufbau von Fettsäuren, Fettsäureestern wie Diacylglyceriden und/oder Triacylglyceriden in einer Pflanze oder Pflanzenzelle benötigt werden oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können.Essential enzymatic activity of the Δ 6-desaturase Δ 6-elongase or Δ 5-desaturase used in the process according to the invention is to be understood as meaning that it still has an enzymatic activity of the proteins / enzymes encoded by the sequence and its derivatives at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, 40%, 50% or at least 60% and most preferably at least 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99%, and thus to the metabolism of compounds that are required to build up fatty acids, fatty acid esters such as diacylglycerides and / or triacylglycerides in a plant or plant cell or participate in the transport of molecules across membranes.
Ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten sind Nukleinsäuremoleküle, die unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang der hier verwendeten Δ-12- Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω-3-Desaturase- und/oder Δ-6- Elongase-Nukleinsäuren hybridisieren. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, 70 %, 80 % oder 90 %, bevorzugt mindestens etwa 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 % und besonders bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, beschrieben. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedin- gungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chlori- de/sodium citrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass sich diese Hybridisierungsbedingungen je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Hybridisierungstemperatur liegt beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel, zum Beispiel 50 % Formamid, im obengenannten Puffer vorliegt, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise 30°C bis 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise 45°C bis 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die für eine bestimmte Nukleinsäure erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie etwa Sambrook et al., "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991 , "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.Also included within the scope of the invention are nucleic acid molecules which bind under stringent conditions to the complementary strand of Δ-12-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-5-desaturase, ω-3-desaturase and / or Δ-12-desaturase Hybridize Δ6-elongase nucleic acids. The term "hybridizes under stringent Conditions "as used herein are meant to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to each other The conditions are preferably such that sequences that are at least about 65%, 70%, 80% % or 90%, preferably at least about 91%, 92%, 93%, 94% or 95% and more preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or more are homologous to each other, usually remaining hybridized to each other stringent conditions are known to those of skill in the art and are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6 A preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in Figure 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by one or more washes in 0.2x SSC, 0.1% SDS at 50-65 ° C It is known that these hybridization conditions differ depending on the type of nucleic acid and, for example, if organic solvents are present, with regard to the temperature and the concentration of the buffer. The hybridization temperature is, for example, under "standard hybridization conditions" depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2). If organic solvent, for example 50% formamide, is present in the abovementioned buffer, the temperature under standard conditions is about 42 ° C. Preferably, the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 20 ° C to 45 ° C, preferably 30 ° C to 45 ° C. Preferably, the hybridization conditions for DNA: RNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 30 ° C to 55 ° C, preferably 45 ° C to 55 ° C. The above-mentioned hybridization temperatures are determined for a nucleic acid of about 100 bp (= base pairs) in length and a G + C content of 50% in the absence of formamide. One skilled in the art will understand how hybridization conditions required for a particular nucleic acid can be determined by textbooks such as Sambrook et al., "Molecular Cloning", ColD Spring Harbor Laboratory, 1989; Harnes and Higgins (Eds.) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder - deletionen in eine Nukleotidsequenz kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül erzeugt werden, das für eine Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3- Desaturase und/oder Δ-6-Elongase mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen kodiert. Mutationen können in eine der Sequenzen durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausge- tauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z.B. Alanin, VaNn, Leucin,By introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence, an isolated nucleic acid molecule can be generated which is suitable for a Δ-12-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-5-desaturase, ω-3-desaturase and / or Δ6-elongase encoded with one or more amino acid substitutions, additions or deletions. Mutations can be introduced into one of the sequences by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted nonessential amino acid residues. In a "conservative amino acid substitution", the amino acid residue is raised against an amino acid residue with a similar side chain. exchanges. In the art, families of amino acid residues have been defined with similar side chains. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg Alanine, VaNn, Leucine,
Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, VaNn, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3-Desaturase und/oder Δ- 6-Elongase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der für die Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmuta- genese, und die resultierenden Mutanten können durch rekombinante Expression nach der hier beschriebenen Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω- 3-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω-3- Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Aktivität beibehalten haben. Die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren ARA oder EPA oder ARA und EPA sind vorteilhaft in als Ester wie Membranlipiden wie Phospholipide oder Glycolipide und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen vorkommen. Dabei können sie als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in Form von Mischun- gen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vorliegen.Isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g., threonine, VaNn, isoleucine) and aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). A predicted non-essential amino acid residue in a Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, ω-3-desaturase and / or Δ6-elongase thus becomes preferably a different amino acid residue from the same side-chain family replaced. Alternatively, in another embodiment, the mutations may be randomized over all or part of those encoding Δ-12 desaturase, Δ-6 desaturase, Δ-5 desaturase, ω-3 desaturase, and / or Δ-6 elongase Sequence are introduced, eg by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be prepared by recombinant expression according to the herein described Δ-12-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-5-desaturase, ω-3-desaturase and / or Δ-6 -Longase activity to identify mutants carrying the Δ12-desaturase, Δ6-desaturase, Δ5-desaturase, ω-3-desaturase and / or Δ6-elongase Maintained activity. The polyunsaturated fatty acids ARA or EPA or ARA and EPA produced in the process are advantageously bound in as esters such as membrane lipids such as phospholipids or glycolipids and / or triacylglycerides, but may also occur as free fatty acids or bound in the form of other fatty acid esters in the organisms. They may be present as "pure products" or else advantageously in the form of mixtures of different fatty acids or mixtures of different glycerides.
Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschieden Fettsäuren lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen ableiten, bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von de-, C20- und/oder C22-Fettsäuren, ganz besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C20- und/oder C22-Fettsäuren wie ARA, EPA oder deren Kombination.The different fatty acids bound in the triacylglycerides can thereby be derived from short-chain fatty acids having 4 to 6 C atoms, medium-chain fatty acids having 8 to 12 C atoms or long-chain fatty acids having 14 to 24 C atoms, preferably the long-chain fatty acids are particularly preferred the long-chain fatty acids LCPUFAs of DE, C 2 O and / or C 22 fatty acids, very particular preference is given to the long-chain fatty acids LCPUFAs of C 20 and / or C 22 fatty acids such as ARA, EPA or their combination.
Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten ver- estertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das GIy- ceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.The term "glyceride" is understood to mean a glycerol esterified with one, two or three carboxylic acid residues (mono-, di- or triglyceride). By "glyceride" is also meant a mixture of different glycerides. The glyceride or glyceride mixture may contain other additives, e.g. contain free fatty acids, antioxidants, proteins, carbohydrates, vitamins and / or other substances.
Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschrie- benen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.A "glyceride" in the sense of the method according to the invention is also understood to mean derivatives derived from glycerol. In addition to the above-described fatty acid glycerides, these also include glycerophospholipids and glyceroglycolipids. Preference is given here to glycerophospholipids such as lecithin (phosphatidylcholine), Cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and Alkylacylglycerophospholipide exemplified.
Unter Phospholipiden im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder Phospha- tidylinositol vorteilhafterweise Phosphatidylcholin.In the context of the invention, phospholipids are to be understood as meaning phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and / or phosphatidylinositol, advantageously phosphatidylcholine.
Die im Verfahren hergestellten Fettsäureester können aus den Pflanzen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycosphingolipide, Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester isoliert werden. Vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form der Phospholipide wie z.B. dem Phosphatidylcholin isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride. Neben diesen Estern sind die im Verfahren hergestellten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden an andere Verbindungen in den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und frei Fettsäuren) in den Organismen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.The fatty acid esters produced in the process may be prepared from the plants used to produce the fatty acid esters in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycosphingolipids, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol , Phosphatidylinositol or diphosphatidylglycerol, monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters such as the acetyl coenzymeA esters. Advantageously, they are in the form of their diacylglycerides, triacylglycerides and / or in the form of the phospholipids, e.g. the phosphatidylcholine isolated, more preferably in the form of triacylglycerols. In addition to these esters, the fatty acids produced in the process are also included as free fatty acids or bound to other compounds in the plants. In general, the various compounds mentioned above (fatty acid esters and free fatty acids) are present in the organisms in an approximate distribution of 80 to 90% by weight of triglycerides, 2 to 5% by weight of diglycerides, 5 to 10% by weight of monoglycerides, 1 to 5 wt .-% of free fatty acids, 2 to 8 wt .-% phospholipids ago, wherein the sum of the various compounds to 100 wt .-% complements.
Im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in den erfindungsgemäßen Verfahren (der Singular soll im Sinne der Erfindung und der hier dargestellten Offenbarung den plural umfassen und umgekehrt) werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3, 5, 6, 7 oder 8 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 9, 10, 11 , 12, 13, 14 oder 15 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 21 , 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in den transgenen Organismen vorteilhaft im Samen der transgenen Pflanzen hergestellt. Dabei werden vorteilhaft Ciβ- und/oder C2o-Fettsäuren, die in den Wirtsorganismen vorhanden sind, zu mindestens 10 %, vorteilhaft zu mindestens 20 %, besonders vorteilhaft zu mindestens 30 %, ganz besonders vorteilhaft zu mindestens 40 % in die entsprechenden Produkte wie ARA, EPA oder deren Mischungen umgesetzt. Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt. Vorteilhaft werden dabei im Verfahren mehrfach ungesättigte C2o-Fettsäuren mit vier oder fünf Doppelbindungen im Molekül mit einem Gehalt von zusammen allen derartigen Fettsäuren von mindestens 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, vorteilhaft zu mindestens 21 , 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, besonders vorteilhaft von mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in den Samen der transgenen Pflanzen hergestellt. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ARA mit einem Gehalt von mindestens 3, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 1 1 , 12, 13, 14 oder 15 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 21 , 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, am meisten bevorzugt von mindestens 26 Gew.-%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt in den Samen der transgenen Pflanzen, hergestellt.In the process according to the invention or in the process according to the invention (the singular should encompass the plural within the meaning of the invention and the disclosure presented here and vice versa), the LCPUFAs produced have a content of at least 3, 5, 6, 7 or 8% by weight. , preferably of at least 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 wt .-%, preferably of at least 16, 17, 18, 19 or 20 wt .-%, particularly preferably of at least 21, 22, 23, 24 or 25% by weight, very particularly preferably at least 26, 27, 28, 29 or 30% by weight, based on the total fatty acids in the transgenic organisms, of advantage in the seed of the transgenic plants. Advantageously, Ciβ- and / or C 2 o fatty acids present in the host organisms, at least 10%, advantageously at least 20%, more preferably at least 30%, most preferably at least 40% in the corresponding products implemented as ARA, EPA or mixtures thereof. Advantageously, the fatty acids are prepared in bound form. In this process, polyunsaturated C 2 o-fatty acids with four or five double bonds in the molecule having a content of all such fatty acids of at least 15, 16, 17, 18, 19 or 20% by weight, advantageously at least 21, are advantageous in the process. 22, 23, 24 or 25 wt .-%, particularly advantageously made of at least 26, 27, 28, 29 or 30 wt .-% based on the total fatty acids in the seeds of the transgenic plants. In the process according to the invention ARA is used with a content of at least 3, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 wt .-%, advantageously of at least 1 1, 12, 13, 14 or 15 wt .-%, preferably of at least 16 , 17, 18, 19 or 20% by weight, more preferably at least 21, 22, 23, 24 or 25% by weight, most preferably at least 26% by weight, based on the total lipid content in the seeds transgenic plants.
EPA wird im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Gehalt von mindestens 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 2, 3, 4 oder 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 1 1 , 12, 13, 14 oder 15 Gew.-% und am meisten bevorzugt von mindestens 16 Gew.-%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt in den Samen der transgenen Pflanzen, hergestellt.EPA is used in the process according to the invention with a content of at least 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9 or 1 wt .-%, advantageously of at least 2, 3, 4 or 5 wt .-%, preferably of at least 6, 7, 8, 9 or 10 wt .-%, particularly preferably of at least 1 1, 12th , 13, 14 or 15% by weight, and most preferably at least 16% by weight, based on the total lipid content in the seeds of the transgenic plants.
Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triglyceride bringen. Da im erfindungsgemäßen Verfahren von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Endprodukte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA) oder Eicosapentaensäure (EPA) nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch geringe Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in dem Ausgangsorganismus bzw. in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA oder EPA in der Regel als Mischungen vor. Vorteilhaft sollten in den Endprodukten ARA oder EPA nur geringe Mengen, der jeweils anderen Endprodukte vorhanden sein. In einem EPA haltigen Lipid und/oder Öl sollten deshalb weniger als 15, 14, 13, 12 oder 11 Gew.-%, vorteilhaft weniger als10, 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% ARA enthalten sein. Auch in einem ARA haltigen Lipid und/oder Öl sollten deshalb weniger als 15, 14, 13, 12 oder 1 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als10, 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% EPA enthalten sein. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweilige Endprodukts betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ARA oder EPA im erfindungsgemäßen Verfahren gebunden oder als freie Säuren hergestellt. Werden die Verbindungen ARA und EPA gleichzeitig hergestellt, werden sie vorteilhaft in einem Verhältnis von mindestens 1 :6 (EPA:ARA), vorteilhaft von mindestens 1 :8, bevorzugt von mindestens 1 :10, besonders bevorzugt von mindestens 1 :12 in der Pflanze hergestellt.With the aid of the nucleic acids used in the method according to the invention, these unsaturated fatty acids can be brought to the sn1, sn2 and / or sn3 position of the advantageously prepared triglycerides. Since in the process of the invention from the starting compounds linoleic acid (C18: 2) or linolenic acid (C18: 3) are passed through several reaction steps, the end products of the process such as arachidonic acid (ARA) or eicosapentaenoic acid (EPA) are not as absolute pure products, it is always contain small traces of the precursors in the final product. If both linoleic acid and linolenic acid are present in the starting organism or in the starting plant, for example, the end products such as ARA or EPA are generally present as mixtures. Advantageously, only small amounts of the other end products should be present in the final products ARA or EPA. Therefore, in an EPA-containing lipid and / or oil should be less than 15, 14, 13, 12 or 11 wt .-%, advantageously less than 10, 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-%, more preferably less than 4 Be contained 3, 2 or 1 wt .-% ARA. Also in an ARA-containing lipid and / or oil should therefore less than 15, 14, 13, 12 or 1 1 wt .-%, advantageously less than 10, 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-%, particularly advantageously less be contained as 4, 3, 2 or 1 wt .-% EPA. The precursors should advantageously not more than 20 wt .-%, preferably not more than 15 wt .-%, more preferably not more than 10 wt .-%, most preferably not more than 5 wt .-% based on the amount of the respective Final product. Advantageously, only ARA or EPA are bound in the process according to the invention or produced as free acids in a transgenic plant as end products. If the compounds ARA and EPA are produced simultaneously, they are advantageously used in a ratio of at least 1: 6 (EPA: ARA), preferably of at least 1: 8, preferably of at least 1:10, more preferably of at least 1: 12 in the plant produced.
Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft 6 bis 15 % Palmitinsäure, 1 bis 6 % Stearinsäure; 7 - 85 % Ölsäure; 0,5 bis 8 % Vaccensäure, 0,1 bis 1 % Arachinsäure, 7 bis 25 % gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85 % einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85 % mehrfach ungesättigte Fettsäuren jeweils bezogen auf 100 % und auf den Gesamtfettsäuregehalt der Organismen.Fatty acid esters or fatty acid mixtures which have been prepared by the process according to the invention advantageously contain 6 to 15% palmitic acid, 1 to 6% stearic acid; 7 - 85% oleic acid; 0.5 to 8% vaccenic acid, 0.1 to 1% arachidic acid, 7 to 25% saturated fatty acids, 8 to 85% monounsaturated fatty acids and 60 to 85% polyunsaturated fatty acids in each case based on 100% and on the total fatty acid content of the organisms.
Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10- Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8- enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten-dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12- Epoxy-octadeca-9,1 1-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure),6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Furthermore, the fatty acid esters or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention advantageously contain fatty acids selected from the group of the fatty acids erucic acid (13-docosaic acid), sterculic acid (9,10-methylene octadec-9-enoic acid), malvalic acid (8,9 Methylene heptadec-8-enoic acid), chaulmo-gruoic acid (cyclopentenodecanoic acid), furan fatty acid (9,12-epoxy-octadeca-9,1-dienanoic acid), vernoic acid (9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid), tartric acid (6-octadecynoic acid), 6-nonadecynoic acid, santalbinic acid (t11-
Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8- ynonsäure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14- Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6- Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c- Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t1 1t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicin- säure (9c11t13c-Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c1 1t13t15c- Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäu- re (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder Coriolin- säure (13-Hydroxy-9c,1 1t-Octadecadienonsäure). Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30 %, bevorzugt zu weniger als 25 %, 24 %, 23 %, 22 % oder 21 %, besonders bevorzugt zu weniger als 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7%, 6 % oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % vor. In einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung kommen diese vorgenannten Fettsäuren bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; oder 0,5%, besonders bevorzugt zu weniger als 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1 % vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1 % bezogen auf die Gesamtfettsäuren und/oder keine Buttersäure, kein Cholesterin, keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5A4 8 12 15 21) sowie keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C23:6Δ38 12 15 18 21).Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-octadecenynoic acid, pyrulic acid (t10-heptadecen-8-ynonic acid), crepenynic acid (9-octadecen-12-ynonic acid), 13,14-dihydrooropheic acid, octadecene-13-ene-9, 11-diynoic acid, petroselenoic acid (cis-6-octadecenoic acid), 9c, 12t-octadecadienoic acid, calendulic acid (8t10t12c octadecatrienoic acid), catalpinic acid (9t1 1t13c-octadecatrienoic acid), elicolinic acid (9c11t13t octadecatrienoic acid), jacric acid (8c10t12c octadecatrienoic acid), punicin acid (9c11t13c-octadecatrienoic acid), parinaric acid (9c1 1t13t15c-octadecatetraenoic acid), pinolenic acid (all-cis-5,9,12-octadecatrienoic acid), labialic acid (5,6-octadecadienenoic acid), ricinoleic acid (12-hydroxyoleic acid) and / or Coriolinic acid (13-hydroxy-9c, 1 1-octadecadienoic acid). The abovementioned fatty acids are generally advantageously present only in traces in the fatty acid esters or fatty acid mixtures prepared by the process according to the invention, that is to say they are less than 30%, preferably less than 25%, 24%, 23%, based on the total fatty acids. , 22% or 21%, more preferably less than 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% or 5%, most preferably less than 4%, 3%, 2% or 1% ago. In a further preferred form of the invention, these aforementioned fatty acids come to less than 0.9% based on the total fatty acids; 0.8%; 0.7%; 0.6%; or 0.5%, more preferably less than 0.4%; 0.3%; 0.2%; 0.1% before. Advantageously, the fatty acid esters or mixtures of fatty acids prepared by the process according to the invention contain less than 0.1% based on the total fatty acids and / or butyric acid, no cholesterol, no clupanodonic acid (= docosapentaenoic acid, C22: 5 A4 8 12 15 21 ) and no nisic acid ( Tetracosahexaenoic acid, C23: 6 Δ38 12 15 18 21 ).
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen kann eine Steigerung der Ausbeute an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vor allem an ARA und EPA von mindestens 50, 80 oder 100 %, vorteilhaft von mindestens 150, 200 oder 250 %, besonders vorteilhaft von mindestens 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder 900 %, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400 oder 1500 % gegenüber der nicht transgenen Ausgangspflanze beispielsweise einer Pflanze wie Brassica juncea oder Brassica napus beim Vergleich in der GC-Analyse siehe Beispiele erreicht werden. Vorteilhaft sollten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Lipide und/oder Öle einen hohen Anteil von ungesättigten Fettsäuren vorteilhaft von mehrfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 30, 40 oder 50 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 60, 70 oder 80 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt in den Samen der transgenen Pflanzen betragen.The nucleic acid sequences according to the invention or the nucleic acid sequences used in the method according to the invention can increase the yield of polyunsaturated fatty acids, especially ARA and EPA, by at least 50, 80 or 100%, advantageously at least 150, 200 or 250%, particularly advantageously at least 300, 400, 500, 600, 700, 800 or 900%, most preferably at least 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 or 1500% relative to the non-transgenic parent plant of for example a plant such as Brassica juncea or Brassica napus as compared to See the GC analysis for examples. The lipids and / or oils produced in the process according to the invention should advantageously have a high proportion of unsaturated fatty acids of polyunsaturated fatty acids of at least 30, 40 or 50% by weight, advantageously of at least 60, 70 or 80% by weight, based on the Total fatty acid content in the seeds of the transgenic plants amount.
Alle gesättigten Fettsäuren zusammen sollten vorteilhaft in den für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt verwendeten Pflanzen nur einen geringen Anteil ausmachen. Unter geringen Anteil ist in diesem Zusammenhang ein Anteil in GC- Flächeneinheiten von weniger als 15%, 14%, 13%, 12%, 1 1 % oder 10%, bevorzugt von weniger als 9%, 8%, 7% oder 6% zu verstehen.All saturated fatty acids together should advantageously account for only a small proportion in the plants preferably used for the process according to the invention. A small proportion in this context is a fraction in GC area units of less than 15%, 14%, 13%, 12%, 11% or 10%, preferably less than 9%, 8%, 7% or 6%. to understand.
Weiterhin sollten die im Verfahren vorteilhaft als Wirtspflanzen, die die über verschiedene Methoden eingebrachten im Verfahren verwendeten Gene zur Synthese der mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, vorteilhaft einen höheren Ölanteil als Proteinanteil im Samen haben, vorteilhafte Pflanzen haben einen Öl-/Protein- gehaltverhältnis von 5 zu 1 , 4 zu 1 , 3 zu 1 , 2 zu 1 oder 1 zu 1. Dabei sollte der Ölgehalt bezogen auf das Gesamtgewicht des Samens in einem Bereich von 15 - 55%, vorteilhaft zwischen 25 - 50%, besonders vorteilhaft zwischen 35 - 50% liegen.Furthermore, the advantageous in the process as host plants containing the introduced via different methods used in the process genes for the synthesis of polyunsaturated fatty acids, advantageously have a higher oil content than protein content in the seed, advantageous plants have an oil / protein content ratio of 5 to 1, 4 to 1, 3 to 1, 2 to 1 or 1 to 1. In this case, the oil content based on the total weight of the seed in a range of 15 - 55%, preferably between 25 - 50%, more preferably between 35 - 50 % lie.
Für das Verfahren vorteilhafte Wirtspflanzen sind solche, die einen hohen Anteil an Ölsäure, das heißt von mindestens 40, 50, 60 oder 70 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze haben, im Vergleich zu Linolsäure und/oder Linolensäure in den Lipiden und/oder Ölen besonders im Triglycerid haben wie z.B. Brassica napus, Brassica alba, Brassica hirta, Brassica nigra, Brassica juncea oder Brassica carinata.Host plants which are advantageous for the method are those which have a high proportion of oleic acid, ie of at least 40, 50, 60 or 70% by weight, based on the total fatty acid content of the plant, in comparison with linoleic acid and / or linolenic acid in the lipids and / or oils especially in triglyceride such as Brassica napus, Brassica alba, Brassica hirta, Brassica nigra, Brassica juncea or Brassica carinata.
Für das Verfahren verwendete Pflanzen sollten vorteilhaft einen Gehalt an Erucasäure von weniger als 2 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt der Pflanze haben. Auch sollte der Gehalt an gesättigten Fettsäuren C16:0 und/oder C18:0 vorteilhaft geringer als 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 1 1 , oder 10 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze sein. Vorteilhaft sollten auch längere Fettsäuren wie C20:0 oder C22:1 gar nicht oder in nur geringen Mengen vorteilhaft geringer als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 oder 0,1 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze in den im Verfahren verwendeten Pflanzen vorhanden sein. Typischerweise ist in den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kein oder nur in geringen Mengen C16:1 als Fettsäure enthalten. Unter geringen Mengen sind vorteilhaft Gehalte an Fettsäuren zu verstehen, die geringer als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 oder 0,1 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze sind.Plants used for the method should advantageously have an erucic acid content of less than 2% by weight based on the total fatty acid content of the plant. Also, the content of saturated fatty acids C16: 0 and / or C18: 0 should advantageously be less than 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, or 10% by weight, advantageously less than 9, 8, 7, 6 or 5 wt .-% based on the total fatty acid content of the plant. Advantageously, longer fatty acids such as C20: 0 or C22: 1 should not at all or in only small amounts advantageously less than 4, 3, 2 or 1 wt .-%, advantageously less than 0.9; 0.8; 0.7; 0.6; 0.5; 0.4; 0.3; 0.2 or 0.1% by weight, based on the total fatty acid content of the plant, in the plants used in the process. Typically, no or only small amounts of C16: 1 are present as fatty acid in the plants used for the method according to the invention. Small amounts are to be understood as meaning contents of fatty acids which are less than 4, 3, 2 or 1% by weight, advantageously less than 0.9; 0.8; 0.7; 0.6; 0.5; 0.4; 0.3; 0.2 or 0.1 wt .-% based on the total fatty acid content of the plant.
Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Fettsäuren oder die Fettsäurezusammensetzungen aus den Pflanzen vorteilhaft den Pflanzensamen in bekannter Weise beispielsweise über aufbrechen der Samen wie Mahlen und anschließender Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft. Als Pflanzen für das erfindungsgemäße Verfahren kommen prinzipiell alle Pflanzen der Familie Brassicaceae in Frage, die in der Lage sind Fettsäuren zu synthetisieren wie alle wie die Gattungen Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z.B. die Gattungen und Arten Brassica alba, Brassica carinata, Brassica hirta, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana.Also, chemically pure polyunsaturated fatty acids or fatty acid compositions can be prepared by the methods described above. For this purpose, the fatty acids or the fatty acid compositions from the plants advantageously the plant seeds in a known manner, for example on breaking up the seeds like Grinding and subsequent extraction, distillation, crystallization, chromatography or combinations of these methods isolated. These chemically pure fatty acids or fatty acid compositions are advantageous for applications in the food industry, the cosmetics industry and especially the pharmaceutical industry. In principle, all plants of the family Brassicaceae which are able to synthesize fatty acids such as the genera Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, for example the genera and species Brassica alba, Brassica carinata, Brassica, come into consideration as plants for the process according to the invention hirta, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. Juncea, Brassica juncea var. Crispifolia, Brassica juncea var. Foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [mustard], Brassica oleracea [fodder beet] or Arabidopsis thaliana ,
Für die erfindungsgemäßen beschriebenen Verfahren ist es vorteilhaft in die Pflanze zusätzlich zu den unter Verfahrensschritt (a) bis (c) eingebrachten Nukleinsäuren sowie den ggf. eingebrachten Nukleinsäuresequenzen, die für die ω-3-Desaturasen und/oder die für die Δ-12-Desaturasen codieren, zusätzlich weitere Nukleinsäuren einzubringen, die für Enzyme des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels codieren.For the described method according to the invention, it is advantageous in the plant in addition to the introduced under step (a) to (c) nucleic acids and the optionally introduced nucleic acid sequences that for the ω-3-desaturases and / or for the Δ-12 Desaturases encode to additionally introduce further nucleic acids encoding enzymes of the fatty acid or lipid metabolism.
Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit der(den) erfinderischen Δ-5-Elongase(n), Δ-Θ-Elongase(n) und/oder ω-3-Desaturase(n) [im Sinne dieser Anmeldung soll der Plural den Singular und umgekehrt beinhalten] im Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren verwendet werden vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen, Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure- Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol- Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in Kombination mit der Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desatu rasen, Δ-12- Desaturasen, Δ-6-Elongasen oder Δ-9-Elongasen in Kombination mit den vorgenannten Genen für die Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können. Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder deren Derivat oder Homologe, die für Polypeptide codieren, die noch die enzymatische Aktivität der durch Nukleinsäuresequenzen codierten Proteine besitzen, einzeln oder in Kombination in Expressionskonstrukte cloniert und diese zum Einbringen und zur Expression in Pflanzen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermögli- chen durch ihre Konstruktion eine vorteilhafte optimale Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer transgenen Pflanze, die die im Verfahren verwendeten Nukleinsäure- sequenzen enthält, wobei die Pflanze mit einer Nukleinsäuresequenz, die für die Δ-12- Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase codiert, einem Genkonstrukt oder einem Vektor wie nachfolgend beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels codieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus dem Samen der Pflanze. Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.In principle, all genes of the fatty acid or lipid metabolism may advantageously be used in combination with the inventive Δ-5 elongase (s), Δ-elongase (s) and / or ω-3-desaturase (s) [in the sense this application should include the plural singular and vice versa] be used in the process for producing polyunsaturated fatty acids are advantageous genes of fatty acid or lipid metabolism selected from the group acyl-CoA dehydrogenase (s), acyl-ACP [= acyl carrier protein] Desaturase (s), acyl-ACP thioesterase (s), fatty acyl transferase (s), acyl-CoAlysophospholipid acyltransferases, fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (n), acyl coenzyme A oxidase (s), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenases, lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allene oxide synthases, hydroperoxide lyases or fatty acid elongase (s) in combination with the Δ 5-elongase, Δ-6 elongase and / or ω-3-desaturase. Particular preference is given to genes selected from the group of Δ-4-desaturases, Δ-5-desaturases, Δ-6-desaturases, Δ-8-desatuases, Δ-9-desaturases, Δ-12-desaturases, Δ-6-. Elongases or Δ-9 elongases are used in combination with the aforementioned genes for the Δ-5 elongase, Δ-6 elongase and / or ω-3 desaturase, wherein single genes or multiple genes can be used in combination. Advantageously, the nucleic acid sequences used according to the invention or their derivative or homologues coding for polypeptides which still possess the enzymatic activity of the proteins encoded by nucleic acid sequences, are cloned individually or in combination into expression constructs and used for introduction and expression in plants. By their construction, these expression constructs enable a favorable optimal synthesis of the polyunsaturated fatty acids produced in the process according to the invention. In a preferred embodiment, the method further comprises the step of obtaining a transgenic plant containing the nucleic acid sequences used in the method, the plant having a nucleic acid sequence encoding Δ-12 desaturase, Δ5-desaturase, Δ- 6-desaturase, Δ6-elongase and / or ω-3-desaturase, a gene construct or a vector as described below, alone or in combination with other nucleic acid sequences coding for proteins of the fatty acid or lipid metabolism is transformed. In a further preferred embodiment, this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the seed of the plant. Cultivation is, for example, culturing in the case of plant cells, tissue or organs on or in a nutrient medium or the whole plant on or in a substrate, for example in hydroponics, potting soil or on arable land.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Genkonstrukte, die die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ-5-Desaturase, Δ-6- Desaturase oder Δ-6-Elongase codieren, enthalten, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist. Zusätzlich können weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]- Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure- Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol- Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) im Genkonstrukt enthalten sein. Vorteilhaft sind zusätzlich Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Δ-12-Desaturase oder ω- 3-Desaturase enthalten.A further subject of the invention are gene constructs which contain the nucleic acid sequences used in the method according to the invention which code for a Δ5-desaturase, Δ6-desaturase or Δ6-elongase, wherein the nucleic acid is operably linked to one or more regulatory signals. In addition, further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can be selected from the group consisting of acyl-CoA dehydrogenase (s), acyl-ACP [= acyl carrier protein] desaturase (s), acyl-ACP thioesterase (s), fatty acid Acyltransferase (s), acyl CoA: lysophospholipid acyltransferase (s), fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (n ), Fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenases, lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allene oxide synthases, hydroperoxide lyases or fatty acid elongase (s) may be included in the gene construct. Advantageously, biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group of Δ-12-desaturase or ω-3-desaturase are additionally contained.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit Δ-5- Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6- Elongase-Aktivität kodieren, werden vorteilhaft allein oder bevorzugt in Kombination in einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), die die Expression der Nukleinsäuren in einer Pflanze ermöglicht, in die Pflanze eingebracht. Es kann im Nukleinsäurekonstrukt mehr als eine Nukleinsäuresequenz einer enzymatischen Aktivität wie z.B. einer Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6- Elongase enthalten sein.The nucleic acid sequences used in the method which code for proteins having Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6 elongase activity become advantageously alone or preferably in combination in an expression cassette (= nucleic acid construct), which allows expression of the nucleic acids in a plant, introduced into the plant. There may be more than one nucleic acid sequence of an enzymatic activity, e.g. a Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6 elongase.
Zum Einbringen der Nukleinsäuren in die Genkonstrukte werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu- DNA-Polymerase oder eines Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches vor. Die Primer werden unter Berücksichtigung der zu amplifizierenden Sequenz ausgewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann nach gelelektrophoretischer Auftrennung eine quantitative und qualitative Analyse erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung.For introducing the nucleic acids into the gene constructs, the nucleic acids used in the method are advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner. Preferably, the procedure is based on the protocol of the Pfu DNA polymerase or of a Pfu / Taq DNA polymerase mixture. The primers are selected taking into account the sequence to be amplified. Conveniently, the primers should be chosen so that the amplificate covers the entire includes codogenic sequence from start to stop codon. Following amplification, the amplificate is conveniently analyzed. For example, a quantitative and qualitative analysis can be carried out after gel electrophoresis separation. Subsequently, the amplificate can be purified according to a standard protocol (eg Qiagen). An aliquot of the purified amplificate is then available for subsequent cloning.
Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilzen gewährleisten, und die die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis- regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatorsequenzen und/oder Selekti- onsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Bin19, pBI101 , pBinAR, pGPTV und pCAMBIA verwendet. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451.Suitable cloning vectors are well known to those skilled in the art. These include, in particular, vectors which can be replicated in microbial systems, ie in particular vectors which ensure efficient cloning in yeasts or fungi, and which enable the stable transformation of plants. In particular, various suitable for T-DNA-mediated transformation, binary and co-integrated vector systems. Such vector systems are usually characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation as well as the T-DNA limiting sequences (T-DNA border). Preferably, these vector systems also include other cis-regulatory regions such as promoters and terminator sequences and / or selection markers, with which correspondingly transformed organisms can be identified. Whereas in co-integrated vector systems vir genes and T-DNA sequences are located on the same vector, binary systems are based on at least two vectors, one of them vir genes, but no T-DNA and a second T-DNA, but no carries vir gene. As a result, the latter vectors are relatively small, easy to manipulate and replicate in both E. coli and Agrobacterium. These binary vectors include vectors of the series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention. For a review of binary vectors and their use, see Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451.
Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonuklea- se(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten unter Einsatz von Ligase verbunden. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatori- sehen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie Promotoren und Terminatorsequenzen. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli und Agrobacterium tumefaciens, unter Selektionsbedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen. Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren in Pflanzen eingebracht werden und damit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie denjenigen, die veröffentlicht und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ), 205-225. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese bessere und/oder effiziente- re Produzenten von PUFAs werden.For the vector preparation, the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then enzymatically modified in a suitable manner. The vector is then purified and an aliquot used for cloning. In cloning, the enzymatically cut and, if necessary, purified amplicon is linked to similarly prepared vector fragments using ligase. In this case, a particular nucleic acid construct or vector or plasmid construct can have one or more codogenic gene segments. Preferably, the codogenic gene segments in these constructs are functionally linked to regulatory sequences. The regulatory sequences include in particular plant sequences such as promoters and terminator sequences. The constructs can advantageously be stably propagated in microorganisms, in particular in E. coli and Agrobacterium tumefaciens, under selection conditions and enable a transfer of heterologous DNA into plants or microorganisms. With the advantageous use of cloning vectors, the nucleic acids used in the method can be introduced into plants and thus used in the transformation of plants, such as those published and there cited: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); FF White, Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; Genes Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225. The nucleic acids and / or vectors used in the process can thus be used for the genetic engineering modification of a broad spectrum of plants so that they become better and / or more efficient producers of PUFAs.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Veränderung des Δ-5- Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6- Elongase-Proteins möglich ist, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einer Pflanze aufgrund dieses veränderten Proteins direkt beeinflusst werden kann. Die Anzahl oder Aktivität der Δ-5- Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6- Elongase-Proteine oder -Gene kann erhöht werden, so dass größere Mengen der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese in einer Pflanze, der die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte, ist möglich. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglichen.There are a number of mechanisms by which it is possible to alter the Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ6-elongase protein, so that the yield, production and / or efficiency of the production of polyunsaturated fatty acids in a plant can be directly influenced by this altered protein. The number or activity of Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6 elongase proteins or genes can be increased so that larger Amounts of gene products and thus ultimately larger amounts of the compounds of general formula I are produced. Also, a de novo synthesis in a plant lacking the activity and ability to biosynthesize the compounds prior to introduction of the corresponding gene (s) is possible. The same applies to the combination with other desaturases or elongases or other enzymes from the fatty acid and lipid metabolism. Also, the use of various divergent, i. At the DNA sequence level of different sequences may be advantageous or the use of promoters, the other temporal gene expression, e.g. depending on the maturity level of a seed or oil-storing tissue.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in Pflanzen ermöglicht, eingebracht.The nucleic acid sequences used in the method are advantageously introduced into an expression cassette which enables expression of the nucleic acids in plants.
Dabei werden die Nukleinsäuresequenzen, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-The nucleic acid sequences encoding Δ5-desaturase, Δ6
Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und dadurch die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen können die natürlichen Regulationselemente dieserDesaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6-elongase encode, with one or more regulatory signals advantageously functionally linked to increase gene expression. These regulatory sequences are intended to allow the targeted expression of genes and proteins. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is expressed and / or overexpressed only after induction, or that it is immediately expressed and / or overexpressed. For example, these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thereby regulate the expression of the nucleic acid. In addition to these new regulatory sequences or instead of these sequences, the natural regulatory elements of these
Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so verändert worden sein, dass ihre natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem Vorteilhafterweiser auch eine oder mehrere sogenannte Εnhancer-Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatorsequenzen.Sequences before the actual structural genes still be present and possibly genetically modified so that their natural regulation turned off and the expression of the genes is increased. These modified promoters can also be brought in the form of partial sequences (= promoter with parts of the nucleic acid sequences used according to the invention) before the natural gene for increasing the activity. Advantageously, the gene construct may also contain one or more so-called enhancer sequences operably linked to the promoter, which allow for increased expression of the nucleic acid sequence Additional advantageous sequences may also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as additional regulatory elements terminator sequences.
Die Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6- Elongase-Gene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können zusammen in der Wirtspflanze exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen.The Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ12-desaturase, ω3-desaturase or Δ6-elongase genes can be present in one or more copies in the expression cassette (= gene construct) be. Advantageously, only one copy of the genes is present in the expression cassette. This gene construct or gene constructs can be expressed together in the host plant. In this case, the gene construct or the gene constructs can be inserted in one or more vectors and be present freely in the cell or else be inserted in the genome. It is advantageous for the insertion of additional genes in the host genome when the genes to be expressed are present together in a gene construct.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. die in WO 99/16890 beschriebenen. Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren, die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samenspezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Geriet., 1991 , 225(3)], Napin (Raps) [US 5,608,152], Conlinin (Lein) [WO 02/102970], Acyl-Carrier Protein (Raps) [US 5,315,001 und WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO 93/20216], Phaseolin (Phaseo- lus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], Leguminosen B4 (LegB4-Promotor) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 und lpt1 (Gerste) [WO 95/15389 u. WO95/23230], Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (Raps) [US 5,530,149], Glycinin (Soja) [EP 571 741], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitratlyase (Raps) [US 5,689,040] oder α-Amylase (Gerste) [EP 781 849].The regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them. Thus, enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers. In addition, however, an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved. It is possible in principle to use all natural promoters with their regulatory sequences, such as those mentioned above, for the new method. It is also possible and advantageous to use synthetic promoters in addition or alone, especially if they mediate seed-specific expression, such as those described in WO 99/16890. In order to achieve a particularly high content of PUFAs, especially in transgenic plants, the PUFA biosynthesis genes should advantageously be seed-specifically expressed in oilseeds. For this purpose, seed-specific promoters can be used, or such promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm. In principle, seed-specific promoters can be isolated from both dicotyledonous and monocotyledonous plants. The following are preferred promoters listed: USP (= unknown seed protein) and Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gene Geriet., 1991, 225 (3)], napin (rape) [US 5,608,152], Conlinin (Lein) [WO 02/102970], acyl carrier protein (rapeseed) [US Pat. No. 5,315,001 and WO 92/18634], oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 and WO 93/20216], phaseolin (Phaseolus vulgaris [US Pat. No. 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], legumes B4 (LegB4 promoter) [Bäumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 and lpt1 (barley) [WO 95/15389 and US Pat , WO95 / 23230], seed-specific promoters from rice, maize and the like. Wheat [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 and Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (rape) [US 5,530,149], glycinin (soybean) [EP 571 741], phosphoenol pyruvate carboxylase (soybean) [JP 06 / 62870], ADR12-2 (soybean) [WO 98/08962], isocitrate lyase (rapeseed) [US 5,689,040] or α-amylase (barley) [EP 781 849].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer PromotorPlant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter (see review in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter
(WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.(WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3- Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, unter der Kontrolle eines eigenen, bevorzugt eines von den anderen Promotoren verschiedenen, Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zur Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufge- baut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle, vorteilhaft in einem Polylinker, zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt und gegebenenfalls eine Terminatorsequenz hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach, bevorzugt drei-, vier-, fünf-, sechs- oder siebenmal, so dass bis zu sieben Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu viermal. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über eine geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihre eigene Terminatorsequenz. Derartige vorteilhafte Konstrukte sind beispielsweise in DE 101 02 337 oder DE 101 02 338 offenbart. Es ist aber auch möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem gemeinsamen Promotor und ggf. vor einer gemeinsamen Terminatorsequenz zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch ihre Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden, was jedoch zu unerwünschten Rekombination- sereignissen führen kann.In order to ensure stable integration of the biosynthetic genes into the transgenic plant over several generations, each of the nucleic acids used in the process should be selected for Δ5-desaturase, Δ6-desaturase, Δ12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ1-desaturase Δ6-elongase encode under the control of its own, preferably one of the other promoters different promoter can be expressed as repetitive sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events. The expression cassette is advantageously designed such that a promoter follows a suitable interface, advantageously in a polylinker, for insertion of the nucleic acid to be expressed, and optionally a terminator sequence lies behind the polylinker. This sequence is repeated several times, preferably three, four, five, six or seven times, so that up to seven genes can be brought together in one construct and introduced into the transgenic plant for expression. Advantageously, the sequence is repeated up to four times. The nucleic acid sequences are inserted for expression via a suitable interface, for example in the polylinker downstream of the promoter. Advantageously, each nucleic acid sequence has its own promoter and optionally its own terminator sequence. Such advantageous constructs are disclosed for example in DE 101 02 337 or DE 101 02 338. However, it is also possible to insert several nucleic acid sequences behind a common promoter and possibly in front of a common terminator sequence. In this case, the insertion site or the sequence of the inserted nucleic acids in the expression cassette is not of crucial importance, that is, a nucleic acid sequence may be inserted at the first or last position in the cassette, without thereby significantly affecting its expression. Advantageously, different promoters such as the USP, LegB4 or DC3 promoter and different terminator sequences can be used in the expression cassette. However, it is also possible to use only one type of promoter in the cassette, but this can lead to undesired recombination events.
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatorsequenzen am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesege- ne (hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. die OCS1 -Terminatorsequenz. Wie auch für die Promotoren, so sollten für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.As described above, the transcription of the genes introduced should advantageously be effected by means of suitable terminator sequences at the 3 'end of the introduced biosynthesis gene. ne (behind the stop codon) are aborted. For example, the OCS1 terminator sequence can be used here. As with the promoters, different terminator sequences should be used for each gene.
Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Pflanzen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in dieThe gene construct can, as described above, also comprise other genes which are to be introduced into the plants. It is possible and beneficial in the
Wirtspflanzen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein, diese Gene können aber auch auf einem oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl- Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl- Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenase(n), Lipoxygenase(n), Triacylglycerol-Lipase(n), Allenoxid-Synthase(n), Hydroperoxid- Lyase(n) oder Fettsäure-Elongase(n) oder Kombinationen davon verwendet.Host plants regulate genes, such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene by their enzyme activity in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway to introduce and express. These genes may be of heterologous or homologous origin. Furthermore, further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, but these genes can also be located on one or more further nucleic acid constructs. Advantageously, a gene selected from the group consisting of acyl-CoA dehydrogenase (s), acyl-ACP [= acyl carrier protein] desaturase (s), acyl-ACP thioesterase (s), as biosynthesis gene of the fatty acid or lipid metabolism, Fatty acid acyltransferase (s), acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase (s), fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (n), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenase (s), lipoxygenase (s), triacylglycerol lipase (s), allene oxide synthase (s), hydroperoxide lyase (s) or fatty acid elongase (s) or combinations thereof.
Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen sind Biosynthesegene des Fettsäureoder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferase, Δ-8-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-9-Desaturase, Δ-5-Elongase und/oder Δ-9-Elongase. Dabei können die vorgenannten Nukleinsäuren bzw. Gene in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in Expressionskassetten, wie den vorgenannten, kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterium eingesetzt werden.Particularly advantageous nucleic acid sequences are biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group of acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, Δ-8-desaturase, Δ-4-desaturase, Δ-9-desaturase, Δ-5 elongase and / or Δ-9 -Elongase. In this case, the abovementioned nucleic acids or genes can be cloned in combination with other elongases and desaturases in expression cassettes, such as those mentioned above, and used for the transformation of plants with the aid of Agrobacterium.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektor eingebracht werden.The regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them. Thus, enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers. In addition, however, an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved. The expression cassettes can be used in principle directly for introduction into the plant or else be introduced into a vector.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ- 12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, das die verwendete Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie den Acyl- CoA:l_ysophospholipid-Acyltransferasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-4- Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-9-Elongasen enthält.These advantageous vectors, preferably expression vectors, contain the nucleic acids used in the method which code for Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6 elongase Nucleic acid construct containing the nucleic acid used alone or in combination with other biosynthesis genes of fatty acid or lipid metabolism such as the acyl-CoA: l_ysophospholipid acyltransferases, Δ-8-desaturases, Δ-9-desaturases, Δ-4-desaturases, Δ-5-elongases and / or Δ-9-elongases ,
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, die an es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife, in die zusätzliche DNA- Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, auto- nom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff "Vektor" auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid that is bound to it. One type of vector is a "plasmid," a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (e.g., bacterial origin of bacterial vectors). Other vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell and thereby replicated together with the host genome. In addition, certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are referred to herein as "expression vectors". Usually, expression vectors suitable for recombinant DNA techniques are in the form of plasmids. In the present specification, "plasmid" and "vector" can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form. However, the invention is intended to encompass other forms of expression vectors, such as viral vectors that perform similar functions. Further, the term "vector" is intended to include other vectors known to those skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren oder das beschriebene Gen- konstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression verwendeten Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfassen. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird).The recombinant expression vectors advantageously used in the method comprise the nucleic acids or the gene construct according to the invention in a form suitable for expression of the nucleic acids used in a host cell, which means that the recombinant expression vectors have one or more regulatory sequences selected on the basis the host cells used for expression, operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed. In a recombinant expression vector, "operably linked" means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) such that expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked to each other such that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence (eg in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, der gewünschten Expressionsstärke des Proteins usw., abhängen kann.The term "regulatory sequence" is intended to include promoters, enhancers, and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton , Florida, Ed .: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, including references therein. Regulatory sequences include those which are constitutive Controlling expression of a nucleotide sequence in many types of host cells, and those that direct the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions. Those skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the desired expression level of the protein, etc.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die Δ-12-Desaturasen, Δ- 6-Desaturasen, ω-3-Desatu rasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5-Desaturasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechno- logy 1 (3):239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195- 1 197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:871 1-8721 ; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.In a further embodiment of the method, the Δ-12-desaturases, Δ-6-desaturases, ω-3-Desatu lawns, Δ-6-elongases and / or Δ-5-desaturases in unicellular plant cells (such as algae), see Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 and references cited therein, and plant cells from higher plants (eg, spermatophytes, such as crops) are expressed. Examples of plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left Biol. 20: 1195-1 197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 871 1-8721; Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und die funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylie- rungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACHδ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktive Terminatorsequenzen sind geeignet.A plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and that are operatively linked so that each sequence can fulfill its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals. Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACHδ known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but all other terminator sequences functionally active in plants are also suitable.
Da die Regulation der Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabak- mosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-871 1 ).Since the regulation of plant gene expression is very often not limited to the level of transcription, a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence comprising the tobacco mosaic virus 5 'untranslated leader sequence encoding the protein / RNA ratio increased (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
Das zu exprimierende Gen muss, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise auslöst. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder konstitutive Pflanzen- promotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco. Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erreichen (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.The gene to be expressed, as described above, must be operably linked to a suitable promoter that will trigger gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner. Useful promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or constitutive plant promoters, such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028. Plant gene expression can also be achieved via a chemically inducible promoter as described above (see an overview in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignet, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1 -Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hspδO-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor (EP-A-O 375 091 ).Promoters which respond to biotic or abiotic stress conditions are also suitable, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the tomato heat-inducible hspδO promoter (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound inducible pinll promoter (EP-A-0 375 091).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbio- synthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napin-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der Conlinin-Promotor aus Lein (WO 02/102970), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991 , 225 (3):459-67), der Oleosin- Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, die die samenspezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1 -Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen Promotoren aus dem Gersten- Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer- Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen.In particular, those promoters which induce gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and oil biosynthesis take place are preferred in sperm cells such as the cells of the endosperm and the developing embryo. Suitable promoters are the rapeseed napin promoter (US Pat. No. 5,608,152), the flax conlinin promoter (WO 02/102970), the Vicia faba USP promoter (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3) : 459-67), the Arabidopsis oleosin promoter (WO 98/45461), the phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Brassica Bce4 promoter (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) as well as promoters that induce seed-specific expression in monocotyledonous plants, such as corn, barley, wheat, rye, rice, and the like. Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or lpt1 gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, the wheat glutelin gene, the maize zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum casirin gene, the rye -Secalin gene.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Piastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerase-Promotor, beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.Also particularly suitable are promoters which induce plastid-specific expression, since plastids are the compartment in which the precursors as well as some end products of lipid biosynthesis are synthesized. Suitable promoters are the viral RNA polymerase promoter described in WO 95/16783 and WO 97/06250, and the Arabidopsis clpP promoter described in WO 99/46394.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1 , B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-O 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., Tetracyclin- induzierbar), EP-A-O 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeigneteAdvantageous regulatory sequences for the novel process are present, for example, in promoters, such as the plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos or in the ubiquitin or phaseolin promoter. Also advantageous in this context are inducible promoters, such as those in EP-AO 388 186 (benzylsulfonamide-inducible), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., Tetracycline inducible), EP-AO 335 528 ( Abzisinic inducible) or WO 93/21334 (ethanol or cyclohexenol inducible) promoters. Other suitable
Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI- Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosyl- pyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-O 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Ge- weben ermöglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3, Phaseolin- oder Napin- Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder I pt-1 -Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.Plant promoters are the promoter of cytosolic FBPase or the ST-LSI Potato promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), the glycine max phosphoribosyl-pyrophosphatamidotransferase promoter (Genbank Accession No. U87999) or the nodular-specific promoter described in EP-A-0 249 676. Particularly advantageous promoters are promoters which enable expression in tissues involved in fatty acid biosynthesis. Especially advantageous are seed-specific promoters, such as the USP promoter according to the invention but also other promoters such as the LeB4, DC3, phaseolin or napin promoter. Further particularly advantageous promoters are seed-specific promoters which can be used for monocotyledonous or dicotyledonous plants and in US Pat. No. 5,608,152 (napin promoter from rapeseed), WO 98/45461 (oleosin promoter from Arobidopsis), US Pat. No. 5,504,200 (Phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris ), WO 91/13980 (Bce4 promoter from Brassica), Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LeB4 promoter from a legume), these promoters being for dicotyledons suitable. The following promoters are suitable, for example, for barley monocotylone lpt-2 or ipt-1 promoter (WO 95/15389 and WO 95/23230), barley hordein promoter and other suitable promoters described in WO 99/16890.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls mög- lieh und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890.It is possible in principle to use all natural promoters with their regulatory sequences, such as those mentioned above, for the new method. It is also possible and advantageous to use, in addition or alone, synthetic promoters, especially if they mediate seed-specific expression, e.g. described in WO 99/16890.
Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samenspezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotolydonen als auch aus monokotolydonen Pflanzen isoliert werden. Derartige vorteilhafte Promotoren sind weiter oben aufgeführt z.B. der USP-, Vicilin-, Napin-, Oleosin-, Phaseolin-, Bce4-, LegB4-, Lpt2-, lpt1-, Amy32b-, Amy 6-6-, Aleurain- oder Bce4-Promotor.In order to achieve a particularly high content of PUFAs, especially in transgenic plants, the PUFA biosynthesis genes should advantageously be seed-specifically expressed in oilseeds. For this purpose, seed-specific promoters can be used, or such promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm. In principle, seed-specific promoters can be isolated from both dicotolydone and monocotolydonous plants. Such advantageous promoters are listed above, e.g. the USP, vicilin, napin, oleosin, phaseolin, Bce4, LegB4, Lpt2, lpt1, Amy32b, Amy 6-6, Aleurain or Bce4 promoter.
Darüber hinaus sind auch chemisch induzierbaren Promotor vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren nutzbar.In addition, chemically inducible promoter can be used advantageously in the method according to the invention.
Weitere vorteilhafte Promotoren, die vorteilhaft zur Expression in Soya geeignet sind, sind die Promotoren der ß-Conglycinin-α-Untereinheit, der ß-Conglycinin-ß- Untereinheit, des Kunitz-Trypsininhibitors, des Annexin, des Glysinin, des Albumin 2S, des Legumin A1 , des Legumin A2 und der des BD30.Further advantageous promoters which are advantageously suitable for expression in soya are the promoters of the β-conglycinin α subunit, the β-conglycinin β subunit, the Kunitz trypsin inhibitor, the annexin, the glysinin, the albumin 2S, the Legumin A1, Legumin A2 and BD30.
Besonders vorteilhafte Promotoren sind der USP-, LegB4-, Fad3-, SBP-, DC-3- oder Cruciferin820 Promotor.Particularly advantageous promoters are the USP, LegB4, Fad3, SBP, DC-3 or Cruciferin820 promoter.
Vorteilhafte Regulationssequenzen, die für die Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen benutzt werden, sind Terminatoren für die Expression vorteilhaft in Soya sind der Leg2A3', Kti3', Phas3', BD30 3' oder der AIS3'.Advantageous regulatory sequences used for expression of the nucleic acid sequences used in the method of the invention are terminators for the expression advantageous in soya are the Leg2A3 ', Kti3', Phas3 ', BD30 3' or the AIS3 '.
Besonders vorteilhafte Terminatoren sind der A7T-, OCS-, LeB3T- oder cat- Terminator.Particularly advantageous terminators are the A7T, OCS, LeB3T or cat terminator.
Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte, wie oben beschrieben, jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder Δ-5-Desaturase codieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Pflanze eingebracht werden sollen.In order to ensure stable integration of the biosynthetic genes into the transgenic plant over several generations, as described above, each of the nucleic acids used in the method should be used for the Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ 6-elongase and / or Δ-5-desaturase can be expressed under the control of its own preferably a different promoter, since repetitive sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events. The gene construct can, as described above, also comprise other genes which are to be introduced into the plant.
Die zur Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft genutzten regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen.The regulatory sequences or factors used to express the nucleic acids used in the method according to the invention can, as described above, preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder Δ-5-Desaturase codieren, oder ein Nuklein- säurekonstrukt, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie den Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, ω-3-Desatu rasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5- Desaturasen, Δ-6-Desatu rasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, ω3-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-9-Elongasen. Wie hier verwendet und beschrieben, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremo- lekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist.These advantageous vectors, preferably expression vectors, contain the nucleic acids used in the method which code for Δ12-desaturase, ω-3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ6-elongase and / or Δ5-desaturase, or a nucleic acid construct which contains the nucleic acid used alone or in combination with further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism, such as the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, ω-3-desaturases, Δ-4-desaturases, Δ-5-desaturases , Δ-6-desaturases, Δ-8-desatuases, Δ-9-desaturases, Δ-12-desaturases, ω3-desaturases, Δ-5-elongases, Δ-6-elongases and / or Δ-9-elongases. As used and described herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Δ- 12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-6-Desatu rasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5- Desaturasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheithalber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können die Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-5-Desaturase-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus- Expressionsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991 ) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Aca- demic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991 ) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F., et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology.1 , 3:239-251 ), Ciliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocoh- nilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-1 19 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques forThe recombinant expression vectors used can be designed for the expression of Δ-12-desaturases, ω-3-desaturases, Δ-6-desaturases, Δ-6-elongases and / or Δ-5-desaturases in prokaryotic or eukaryotic cells. This is advantageous because intermediate steps of the vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity. For example, the Δ12-desaturase, ω-3-desaturase, Δ6-desaturase, Δ6-elongase and / or Δ5-desaturase genes can be expressed in bacterial cells, insect cells (using baculovirus - expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA, et al., (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, CAMJJ, et al ) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, JW Bennet & LL Lasure, eds., Pp. 396-428: Acadian Press: San Diego, and van den Hondel, CAMJJ, & Punt , PJ. (1991) Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, JF, et al., Eds., Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algae (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology.1, 3: 239-251), ciliates of the types: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocoh- nilembus, Euplotes, Engelmaniella and Stylonychia, in particular of the genus Stylonychia lemnae, with vectors according to a transformation method as described in WO 98/01572, and preferably in cells of multicellular plants (see Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants "Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C. Press, Boca Raton, Fla., Chapter 6/7, p.71-1 19 (1993 FF White, B. Jenes et al., Techniques for
Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1 , Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991 ), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technolo- gy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekom- binante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7- Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (and references cited therein). Suitable host cells are further discussed in Goeddel, Gene Expression Technolgy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatively, the recombinant expression vector may be transcribed and translated in vitro using, for example, T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten, vorteilhaft zu einfachen Detektion der enzymatischen Aktivität z.B. zum Nachweis der Desaturase- oder Elongaseaktivität, erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D. B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST),Expression of proteins in prokaryotes, advantageous for easy detection of enzymatic activity e.g. for the detection of desaturase or elongase activity, is usually carried out with vectors that contain constitutive or inducible promoters that control the expression of fusion or non-fusion proteins. Typical fusion expression vectors include i.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which glutathione-S Transferase (GST),
Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.Maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) und pET 11 d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 1 1d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA- Polymerase (T7 gn1 ) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5- Promotors birgt.Examples of suitable inducible non-fusion E. coli expression vectors are i.a. pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter. Target gene expression from the pET 1 1d vector is based on transcription from a T7 gn10-lac fusion promoter mediated by a co-expressed viral RNA polymerase (T7 gn1). This viral polymerase is provided by the host strains BL21 (DE3) or HMS174 (DE3) from a resident λ prophage harboring a T7 gn1 gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR- Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M1 13mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1 , pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-1111 13-B1 , λgt1 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.Other vectors useful in prokaryotic organisms are known to those of skill in the art, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, the pBR series such as pBR322, the pUC series such as pUC18 or pUC19, the M1 13mp series, pKC30, pRep4 , pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pN-1111 13-B1, λgt1 1 or pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 or plJ361, in Bacillus pUB1 10, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturased (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan undIn another embodiment, the expression vector is a yeast expression vector. Examples of vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYeDesaturased (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and
Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:1 13-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991 ) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Acade- mic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1 , YEp6, YEpI 3 oder pEMBLYe23.Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 1 13-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi, include those described in detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdy et al., Eds., Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, or in: More Gene Manipulations in Fungi [JW Bennet & LL Lasure, eds., Pp. 396-428: Acadic Press: San Diego] Other suitable yeast vectors are, for example, pAG-1, YEp6, YEpI 3 or pEMBLYe23.
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expres- sionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989.The above vectors provide only a brief overview of possible suitable vectors. Other plasmids are known in the art and are described, for example, in: Cloning Vectors (Eds. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). For other suitable expression systems for prokaryotic and eukaryotic cells, see Chapters 16 and 17 of Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, Spring Coast, NY, 1989.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylie- rungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACHδ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.A plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can perform its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals. Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACHδ known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, but also all other terminators functionally active in plants are suitable.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive- Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-871 1 ).Because plant gene expression is very often not limited to transcriptional levels, a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, e.g., the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which is the protein / RNA ratio increases (GaIMe et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-871 1).
Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.Plant gene expression, as described above, must be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in a timely, cell or tissue-specific manner. Useful promoters are constitutive promoters (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), such as those available from Plant viruses such as 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (see also US 5352605 and WO 84/02913) or plant promoters such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.Other preferred sequences for use in the functional compound in plant gene expression cassettes are targeting sequences necessary to direct the gene product into its corresponding cell compartment (see review in Kermode, Crit., Plant, 15, 4 (1996) 285) -423 and references cited therein), for example to the vacuole, the nucleus, all types of plastids such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, extracellular space, mitochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.Plant gene expression can also be facilitated by a chemically inducible promoter as described above (see review in Gatz 1997, Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1 -Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hspδO- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll-Promotor (EP-A-O 375 091 ). Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbio- synthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991 , 225 (3):459-67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1 -Promoters which react to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRP1 gene promoter (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), the heat-inducible hspδO promoter Tomato (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound inducible pinll promoter (EP-A-0 375 091). In particular, those promoters which induce gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and oil biosynthesis take place are preferred in sperm cells such as the cells of the endosperm and the developing embryo. Suitable promoters are the rapeseed napkin promoter (US 5,608,152), the Vicia faba USP promoter (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), the Arabidopsis oleosin promoter (US Pat. WO 98/45461), the phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the Brassica Bce4 promoter (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) as well as promoters which induce seed-specific expression in monocotyledonous plants such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc. Suitable noteworthy promoters are the lpt2 or lpt1
Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen- Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin- Gen, dem Roggen-Secalin-Gen). Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Δ-5- Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden. Im Sinne der Erfindung ist es auch möglich Gene in unterschiedliche Pflanzen einzubringen und diese durch Kreuzung zu kombinieren.Barley gene promoter (WO 95/15389 and WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice Proline protein, wheat gliadin gene, wheat glutelin gene, maize zein gene, oat glutelin gene, sorghum kasirin gene, rye secalin gene). In particular, multiparallel expression of Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-12-desaturase, ω-3-desaturase or Δ-6 elongase used in the method may be desired. The introduction of such expression cassettes can be carried out via a simultaneous transformation of a plurality of individual expression constructs or preferably by combining a plurality of expression cassettes on a construct. It is also possible to transform a plurality of vectors each having a plurality of expression cassettes and to transfer them to the host cell. For the purposes of the invention it is also possible to introduce genes into different plants and to combine them by crossing.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment, beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromo- plasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen).Other preferred sequences for use in the functional compound in plant gene expression cassettes are targeting sequences used to direct the gene product into its corresponding cell compartment, for example into the vacuole, the nucleus, all types of plastids, such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, the extracellular space, mitochondria, endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes, and other compartments of plant cells are necessary (see review in Kermode, Crit., Rev. Plant Sci., 15, 4 (1996) 285-423 and references cited therein).
"Transgen" bzw. "Rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,"Transgene" or "recombinant" in the context of the invention means, for example, a nucleic acid sequence, an expression cassette (= gene construct) or a vector comprising the nucleic acid sequence according to the invention or an organism transformed with the nucleic acid sequences according to the invention,
Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder a) die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oderExpression cassette or vector all such constructions realized by genetic engineering methods in which either a) the nucleic acid sequence according to the invention, or b) a genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence according to the invention, for example a promoter, or
c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleo- tidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen mit den entsprechenden Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen oder Δ-6- Elongasen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nichtnatürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisie- rung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565,350 oder WO 00/15815. Unter transgenen Pflanzen im Sinne der Erfindung ist daher zu verstehen, dass sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom der Pflanze befinden, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom der Pflanze sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das diec) (a) and (b) are not in their natural genetic environment or have been modified by genetic engineering methods, wherein the modification may be, for example, a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues. Natural genetic environment means the natural genomic or chromosomal locus in the source organism or presence in a genomic library. In the case of a genomic library, the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved. The environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp. A naturally occurring expression cassette - for example the naturally occurring combination of the natural promoter of the nucleic acid sequences used in the method according to the invention with the corresponding Δ-5-desaturases, Δ-6-desaturases, Δ-12-desaturases, ω-3-desaturases or Δ-6 Elongase - becomes a transgenic expression cassette when modified by non-natural, synthetic ("artificial") methods such as mutagenesis. Corresponding methods are described, for example, in US Pat. No. 5,565,350 or WO 00/15815. For the purposes of the invention, transgenic plants are therefore to be understood as meaning that the nucleic acids used in the process are not in their natural position in the genome of the plant, it being possible for the nucleic acids to be expressed homologously or heterologously. However, transgene also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of the plant, but that the sequence has been changed from the natural sequence and / or that the
Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenz verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Pflanzen sind Ölsamen- oder Ölfruchtpflanzen und speziell deren verschiedene Pflanzenteile.Regulatory sequences, the natural sequence have been changed. Transgenic is preferably understood to mean the expression of the nucleic acids according to the invention or the nucleic acid sequences used in the method according to the invention at a non-natural site in the genome, that is to say a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids. Preferred transgenic plants are oilseed or oilseed crops and especially their various plant parts.
Hierzu gehören auch Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in all ihren Erscheinungsformen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, das von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet ist und/oder dazu verwendet werden kann, die transgene Pflanze hervorzubringen.These include plant cells and certain tissues, organs and parts of plants in all their forms, such as anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, cilia, kotelydons, petioles, crops, plant tissue, reproductive tissue and cell cultures, from the actual transgenic ones Plant is derived and / or can be used to produce the transgenic plant.
Transgene Pflanzen bzw. vorteilhaft deren Samen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere ARA, EPA und/oder deren Mischungen enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze abgeleiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe.Transgenic plants, or advantageously their seeds, which contain the polyunsaturated fatty acids synthesized in the process according to the invention, in particular ARA, EPA and / or mixtures thereof, can advantageously be marketed directly without the synthesized oils, lipids or fatty acids having to be isolated. Plants in the process according to the invention include whole plants and all plant parts, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, callosis, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures that can be derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant. The seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
Grundsätzlich eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, insbesondere von ARA, EPA und/oder derenIn principle, the process according to the invention is also suitable for producing polyunsaturated fatty acids, in particular ARA, EPA and / or their
Mischungen in pflanzlichen Zellkulturen und anschließender Gewinnung der Fettsäuren aus den Kulturen. Dabei kann es sich insbesondere um Suspensions- oder Kalluskultu- ren handeln.Mixtures in plant cell cultures and subsequent extraction of fatty acids from the cultures. These may in particular be suspension or callus cultures.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen vorteilhaft aus den Pflanzensamen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigten Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Pflanzen bzw. Pflanzensamen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten.However, the compounds prepared in the process according to the invention can also be advantageously isolated from the plants from the plant seeds in the form of their oils, fat, lipids and / or free fatty acids. Produced by this method Polyunsaturated fatty acids can be harvested by harvesting the plants or plant seeds either from the culture in which they grow or from the field.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus der Pflanze oder aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln.In a further preferred embodiment, this method further comprises the step of recovering the oils, lipids or free fatty acids from the plant or from the culture. The culture may be, for example, a greenhouse or field crop of a plant.
Das Isolieren der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Danach werden die so erhaltenen Produkte, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behand- lung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert. Die nach dem Pressen erhaltenen erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische werden als sogenannte Rohöle bezeichnet. Diese enthalten noch die gesamten Öl- und/oder Lipidkomponenten, sowie Verbindungen, die in diesen löslich sind. Derartige Verbindunge sind die verschiedenen Tocopherole wie α- Tocopherol, ß-Tocopherol, γ-Tocopherol und/oder δ-Tocopherol oder Phytosterole wie Brassicasterol, Campesterol, Stigmasterol, ß-Sitosterol, Sitostanol, Δ5-Avenasterol,The isolation of the oils, lipids or free fatty acids can be carried out by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds. In this case, the oils, fats, lipids and / or free fatty acids by so-called cold beat or cold pressing can be obtained without supplying heat by pressing. In order for the plant parts, especially the seeds, to be easier to digest, they are first crushed, steamed or roasted. The thus pretreated seeds can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane. Subsequently, the solvent is removed again. Thereafter, the products thus obtained, which contain the polyunsaturated fatty acids, further processed, that is refined. First of all, for example, the mucilages and turbid matter are removed. The so-called degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid, such as phosphoric acid. Subsequently, the free fatty acids are removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution. The product obtained is thoroughly washed with water to remove the lye remaining in the product and dried. In order to remove the dyes still contained in the product, the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon. Finally, the product is deodorized, for example, with steam. The oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures obtained after pressing according to the invention are referred to as so-called crude oils. These still contain all the oil and / or lipid components, as well as compounds that are soluble in these. Such compounds are the various tocopherols such as α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol and / or δ-tocopherol or phytosterols such as brassicasterol, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ 5 -avenasterol,
Δ5,24-Stigmastadienol, Δ7-Stigmastenol oder Δ7-Avenasterol. Diese Verbindungen sind in einem Bereich von 1 bis 1000 mg/100 g vorteilhaft von 10 bis 800 mg/100 g Lipid oder Öl enthalten. Auch Triterpene wie Germaniol, Amyrin, Cycloartanol und andere können in diesen Lipiden und Ölen enthalten sein. Diese Lipide und/oder Öle enthalten die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie ARA, EPA und/oder DHA gebunden in polaren und unpolaren Lipiden wie Phospholipiden z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Galactolipiden, Monoglyceride, Diglyceride oder Triglyceride um nur einige zu nennen. Auch Lysophospholipide können in den Lipiden und/oder Ölen vorkommen. Diese Komponenten der Lipide und/oder Öle können durch geeignete Methoden voneinander getrennt werden. Nicht enthalten in diesen Rohölen ist Cholesterol.Δ 5 , 24-stigmastadienol, Δ 7 -stigmastenol or Δ 7 -avenasterol. These compounds are contained in a range of 1 to 1000 mg / 100 g, advantageously from 10 to 800 mg / 100 g of lipid or oil. Triterpenes such as germaniol, amyrin, cycloartanol and others may also be included in these lipids and oils. These lipids and / or oils contain in the process polyunsaturated fatty acids such as ARA, EPA and / or DHA bound in polar and nonpolar lipids such as phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, galactolipids, monoglycerides, diglycerides or triglycerides only to name a few. Lysophospholipids may also be present in the lipids and / or oils. These components of the lipids and / or oils may be replaced by suitable Methods are separated from each other. Not included in these crude oils is cholesterol.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids, der Fettsäuren und/oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungs- mittein, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Typisch für derartige Fischöle kurzkettige Fettsäuren wie C12:0, C14:0, C14:1 , verzweigtkettiges C15:0, C15:0, C16:0 oder C16:1. Auch mehrfach ungesättige C16-Fettsäuren wie C16:2, C16:3 oder C16:4, verzweigtkettiges C17:0, C17:1 , verzweigtkettiges C18:0 und C19:0 sowie C19:0 und C19:1 kommen im Fischöl vor. Derartige Fettsäuren sind typisch für Fischöle und werden nur selten oder gar nicht in pflanzlichen Ölen gefunden. Wirtschaftlich relevante Fischöle sind z.B. Anchovissöl, Menhadneöl, Tunfischöl, Sardinen- öl, Heringsöl, Markrelenöl, Walöl und Lachsöl. Diese Lipide und/oder Öle tierischen Ursprungs können zum Abmischen mit den erfindungsgemäßen Ölen in Form von Rohölen, das heißt in Form von Lipiden und/oder Ölen, die noch nicht aufgereinigt wurden, verwendet werden oder aber es können verschieden aufgereinigte Fraktionen zum Abmischen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Auch diese Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische, die aus pflanzlichen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.Another embodiment of the invention is the use of the oil, lipid, fatty acids and / or fatty acid composition in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals. The oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures according to the invention may be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, such as those described in the art, for example. Fish oils are used. Typical of such fish oils short-chain fatty acids such as C12: 0, C14: 0, C14: 1, branched chain C15: 0, C15: 0, C16: 0 or C16: 1. Also, polyunsaturated C16 fatty acids such as C16: 2, C16: 3 or C16: 4, branched chain C17: 0, C17: 1, branched chain C18: 0 and C19: 0 and C19: 0 and C19: 1 are found in fish oil. Such fatty acids are typical of fish oils and are rarely or not found in vegetable oils. Economically relevant fish oils are e.g. Anchovy oil, menhadne oil, tuna oil, sardine oil, herring oil, marjoram oil, whale oil and salmon oil. These lipids and / or oils of animal origin may be used for blending with the oils of the invention in the form of crude oils, that is in the form of lipids and / or oils that have not yet been purified, or differentially purified fractions may be used for blending , The oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures according to the invention may be mixed with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, such as those described in the art, for example. Fish oils are used. These oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures, which consist of vegetable and animal components, can be used for the production of feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo- γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure oder Eicosatetraen- säure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 %, 85% oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.The term "oil", "lipid" or "fat" is understood as meaning a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s). It is preferred that the oil, lipid or fat has a high proportion of polyunsaturated free or advantageously esterified fatty acid (s), in particular linoleic acid, γ-linolenic acid, dihomo-γ-linolenic acid, arachidonic acid, α-linolenic acid, stearidonic acid or eicosatetraenoic acid , Preferably, the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is a proportion of 50%, even more preferred is a proportion of 60%, 70%, 80%, 85% or more. For determination, e.g. the proportion of fatty acid after transfer of the fatty acids into the methyl esters can be determined by gas chromatography by transesterification. The oil, lipid or fat may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, e.g. Palmitin, palmitoleic, stearic, oleic acid, etc., included. In particular, depending on the starting plant, the proportion of the various fatty acids in the oil or fat may vary.
Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren handelt es sich wie oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester.The polyunsaturated fatty acids produced in the process are, for example, sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, as described above. Glycolipids, phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol or other fatty acid esters.
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Lipiden, Phospholipiden oder Triacylglyceriden lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wäßrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2SO4. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.From the lipids, phospholipids or triacylglycerides thus produced in the process according to the invention, the polyunsaturated fatty acids containing, for example, via an alkali treatment, for example, aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis advantageously in the presence of an alcohol such as methanol or ethanol or by enzymatic elimination release and isolate over, for example Phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO 4 . The release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren verwendeten Pflanzen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann entweder der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehr- fach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Organismen erhöht.By the method according to the invention, the polyunsaturated fatty acids produced in the plants used in the process can in principle be increased in two ways. Either the pool of free polyunsaturated fatty acids and / or the proportion of the esterified polyunsaturated fatty acids produced by the process can be increased. Advantageously, the process according to the invention increases the pool of esterified polyunsaturated fatty acids in the transgenic organisms.
Vorteilhaft stammen alle die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nuklein- säuresequenzen aus einem eukaryontischen Organismus wie einer Pflanze, einem Mikroorganismus wie einer Alge oder einem Tier. Bevorzugt stammen die Nukleinsäu- resequenzen aus der Ordnung Salmoniformes, Xenopus oder Ciona, Algen wie Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena oder Ostreococcus, Pilzen wie der Gattung Phytophtora oder von Diatomeen wie den Gattungen Thalassiosira oder Phaeodacty- lum. Vorteilhaft im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen aus Bakterien, Pilzen, Diatomeen, Tieren wie Caenorhabditis oder Oncorhynchus oder Pflanzen wie Algen oder Moosen wie den Gattungen Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, speziell aus den Gattungen und Arten Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis,Advantageously, all the nucleic acid sequences used in the method according to the invention are derived from a eukaryotic organism such as a plant, a microorganism such as an alga or an animal. The nucleic acid sequences preferably come from the order Salmoniformes, Xenopus or Ciona, algae such as Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena or Ostreococcus, fungi such as the genus Phytophtora or diatoms such as the genera Thalassiosira or Phaeodactylum. Nucleic acids useful in the method are derived from bacteria, fungi, diatoms, animals such as Caenorhabditis or Oncorhynchus or plants such as algae or mosses such as the genera Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella , Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, especially from the genera and species Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis,
Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhaft aus Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonana oder Crypthecodinium cohnii.Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophthora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans, or more particularly from Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonana or Crypthecodinium cohnii.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen. BeispieleThis invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. The contents of all references cited in this patent application, patent applications, patents, and published patent applications are incorporated herein by reference. Examples
Beispiel 1 : Allgemeine Klonierungsverfahren:Example 1 General Cloning Methods
Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0- 87969-309-6) beschrieben durchgeführt.The cloning methods, e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linkage of DNA fragments, transformation of Escherichia coli cells, culture of bacteria and sequence analysis of recombinant DNA were performed as described in Sambrook et al. (1989) (CoId Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).
Beispiel 2: Sequenzanalyse rekombinanter DNA: Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz- DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimieren- den Konstrukten sequenziert und überprüft.Example 2 Sequence Analysis of Recombinant DNA Sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad., See, USA74, 5463-5467 ). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
Beispiel 3: Klonierung von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in PflanzenExample 3 Cloning of expression plasmids for seed-specific expression in plants
Die folgenden beschriebenen allgemeinen Bedingungen gelten für alle nachfolgenden Versuche, wenn nicht anders beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden für die folgenden Beispiele Bin19, pBI101 , pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Verwendet wurde ein pGPTV-Derivat wie in DE10205607 beschrieben. Dieser Vektor unterscheidet sich von pGPTV durch eine zusätzlich eingefügte /Ascl-Restriktionsschnittstelle. Ausgangspunkt der Klonierung war der Klonierungsvektor pUC19 (Maniatis et al.). Im ersten Schritt wurde das Conlinin-Promotor-Fragment mit folgenden Primern amplifi- ziert:The following general conditions described apply to all subsequent experiments unless otherwise specified. Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA are preferably used according to the invention for the following examples. For a review of binary vectors and their use, see Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. A pGPTV derivative was used as described in DE10205607. This vector differs from pGPTV by an additional inserted / Ascl restriction site. The starting point of the cloning was the cloning vector pUC19 (Maniatis et al.). In the first step, the conlinin promoter fragment was amplified with the following primers:
CnM C 5': gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcga CnM C 3': cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgatCnM C 5 ': ccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA5.00 μl template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl) 0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1, 25 μl per primer (10 pmol / μl) 0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR: Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35 Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym EcoRI und dann für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Der Klonierungsvek- tor pUC19 wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der 2668 bp große, geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben.Reaction conditions of the PCR: Annealing temperature: 1 min. 55 ° C. Denaturation temperature: 1 min. 94 ° C. Elongation temperature: 2 min. 72 ° C. number of cycles: 35 The PCR product was first incubated at 37 ° C. for 2 h with the restriction enzyme EcoRI and then at 25 for 12 h 0 C with the restriction enzyme Sma \ incubated. The cloning vector pUC19 was incubated in the same way. Subsequently, the PCR product and the 2668 bp cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions.
Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1-C wurde durch Sequenzierung verifiziert.Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1-C was verified by sequencing.
Im nächsten Schritt wurde der OCS-Terminator (Genbank Accession V00088; De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J.In the next step, the OCS terminator (Genbank Accession V00088; De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Chem.
Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid- encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982)) aus dem Vektor pG PVT-US P/OCS (DE 102 05 607) mit den folgenden Primern amplifiziert:Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982)) from the vector pG PVT-US P / OCS (DE 102 05 607) with the following primers:
OCS_C 5': aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc OCS_C 3': cccgggccggacaatcagtaaattgaacggagOCS_C 5 ': aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc OCS_C 3': cccgggccggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA 5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl) 0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)5.00 μl template cDNA 5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1, 25 μl per primer (10 pmol / μl) 0.50 μl Advantage Polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR: Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Reaction conditions of the PCR: annealing temperature: 1 min 55 ° C. Denaturation temperature: 1 min 94 ° C. Elongation temperature: 2 min 72 ° C. Number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ und dann für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Der Vektor pUC19- CnH-C wurde 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1C_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert. Im nächsten Schritt wurde der CnH-B Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:The PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu \ and then for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. The vector pUC19-CnH-C was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The Purification of the DNA was carried out using Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1C_OCS was verified by sequencing. In the next step, the CnH-B promoter was amplified by PCR using the following primers:
CnH-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatagCnH-B 5 ': aggcctcaacggttccggcggtatag
CnH-B 3': cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttctCnH-B 3 ': cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttct
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl): 5,00 μl Template cDNAComposition of the PCR batch (50 μl): 5.00 μl Template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2
5,00 μl 2mM dNTP5.00 μl 2mM dNTP
1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech) Reaktionsbedingungen der PCR:0.50 μl Advantage polymerase (Clontech) reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35 Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ und dann für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Der Vektor pUC19- CnH-C wurde 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnit- ten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäßAnnealing temperature: 1 min. 55 ° C. Denaturation temperature: 1 min 94 ° C. Elongation temperature: 2 min. 72 ° C. number of cycles: 35 The PCR product was first added for 2 h at 37 ° C. with the restriction enzyme Stu 1 and then for 12 h 25 0 C with the restriction enzyme Sma \ incubated. The vector pUC19-CnH-C was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out by means of Qiagen Gel Purification Kit according to
Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1C_Cnl1 B_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.Manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS was verified by sequencing.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für CnII B eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:In a further step, the OCS terminator for CnII B was inserted. For this purpose, the PCR was carried out with the following primers:
OCS2 5': aggcctcctgctttaatgagatatgcgagac OCS2 3': cccgggcggacaatcagtaaattgaacggagOCS2 5 ': aggcctcctgctttaatgagatatgcgagac OCS2 3': cccgggcggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA 5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)5.00 μl template cDNA 5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:Reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Annealing temperature: 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ und dann für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS wurde für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1C_Cnl1 B_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.The PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu \ and then for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. The vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_OCS2 was verified by sequencing.
Im nächsten Schritt wurde der CnH-A Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:In the next step, the CnH-A promoter was amplified by PCR using the following primers:
CnH-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatagag CnH-B 3': aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggtCnH-B 5 ': aggcctcaacggttccggcggtatagag CnH-B 3': aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggt
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA5.00 μl template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1, 25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:Reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Annealing temperature: 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1-C wurde für 12 h bei 250C mit dem Restriktionsenzym Sma\ inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.The PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu \. The vector pUC19-Cnl1-C was incubated for 12 h at 25 0 C with the restriction enzyme Sma \. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. To Roche's Rapid Ligation Kit was used. The resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 was verified by sequencing.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für CnIIA eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:In a further step, the OCS terminator for CnIIA was inserted. For this purpose, the PCR was carried out with the following primers:
OCS2 5': ggcctcctgctttaatgagatatgcgaOCS2 5 ': ggcctcctgctttaatgagatatgcga
OCS2 3': aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggagaOCS2 3 ': aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA5.00 μl template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25mM MgCl 2 5.00 μl 2mM dNTP
1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:Reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Annealing temperature: 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ und dann für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym H/πdlM inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Stu\ und für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym H/πdlM inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 wurde durch Sequenzierung verifiziert.The PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu \ and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme H / πdlM. The vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS2 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Stu \ and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme H / πdlM. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 was verified by sequencing.
Das Plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-, Δ5-Desaturase und Δ6-Elongase verwendet. Dazu wurde die Δ6- Desaturase aus Phytium irreguläre (WO02/26946) mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:The plasmid pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 was used in the next step to clone the Δ6, Δ5-desaturase and Δ6-elongase. For this purpose, the Δ6-desaturase was amplified from phytium irregular (WO02 / 26946) with the following PCR primers:
DΘDes(Pir) 5': agatctatggtggacctcaagcctggagtg DΘDes(Pir) 3': ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgatDΘDes (Pir) 5 ': agatctatggtggacctcaagcctggagtg DΘDes (Pir) 3': ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl): 5,00 μl Template cDNAComposition of the PCR batch (50 μl): 5.00 μl Template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2mM dNTP
1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR: Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Reaction conditions of the PCR: annealing temperature: 1 min 55 ° C. Denaturation temperature: 1 min 94 ° C. Elongation temperature: 2 min 72 ° C. Number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym BgIW und dann für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Λ/col inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym BgIW und für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Λ/col inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnit- ten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäßThe PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Λ / col. The vector pUC19-Cnl1C_Cnl1 B_Cnl1A_OCS3 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Λ / col. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out by means of Qiagen Gel Purification Kit according to
Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1_d6Des(Pir) wurde durch Sequenzierung verifiziert.Manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) was verified by sequencing.
Das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. (WO02/26946) verwendet. Dazu wurde die Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:The plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) was in the next step for cloning the Δ5-desaturase from Thraustochytrium ssp. (WO02 / 26946). For this purpose, the Δ5-desaturase from Thraustochytrium ssp. amplified with the following PCR primers:
D5Des(Tc) 5': gggatccatgggcaagggcagcgagggccg D5Des(Tc) 3': ggcgccgacaccaagaagcaggactgagatatcD5Des (Tc) 5 ': gggatccatgggcaagggcagcgagggccg D5Des (Tc) 3': ggcgccgacaccaagaagcaggactgagatatc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl): 5,00 μl Template cDNAComposition of the PCR batch (50 μl): 5.00 μl Template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2
5,00 μl 2mM dNTP5.00 μl 2mM dNTP
1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech) Reaktionsbedingungen der PCR:0.50 μl Advantage polymerase (Clontech) reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35 Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym BamYW und dann für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1_d6Des(Pir) wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Bam\Λ\ und für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde durch Sequenzierung verifiziert.Annealing temperature: 1 min 55 0 C Denaturation temperature: 1 min 94 0 C Elongation temperature: 2 min at 72 0 C Number of cycles: 35 The PCR product was first for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BamYW and then for 2 h at 37 0 C incubated with the restriction enzyme EcoRV. The vector pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Bam \ Λ \ and incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme EcoRV. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was verified by sequencing.
Das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (WO01/59128) verwendet, wozu diese mit folgenden PCR-Primern amplifiziert wurde:The plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was used in the next step for cloning the Δ6 elongase from Physcomitrella patens (WO01 / 59128) for which it was amplified with the following PCR primers:
D6 EIo(Pp) 5': gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtg D6Elo(Pp) 3': gcaaaagggagctaaaactgagtgatctagaD6 EIo (Pp) 5 ': gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtg D6Elo (Pp) 3': gcaaaagggagctaaaactgagtgatctaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA 5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl) 0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)5.00 μl template cDNA 5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1, 25 μl per primer (10 pmol / μl) 0.50 μl Advantage Polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR: Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Reaction conditions of the PCR: annealing temperature: 1 min 55 ° C. Denaturation temperature: 1 min 94 ° C. Elongation temperature: 2 min 72 ° C. Number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Not\ und dann für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Xba\ inkubiert. Der Vektor pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Not\ und für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Xba\ inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnit- ten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäßThe PCR product was first incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Not \ and then for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Xba \. The vector pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Not \ and for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Xba \. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out by means of Qiagen Gel Purification Kit according to
Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.Manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) was verified by sequencing.
Ausgehend von pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Asc\ inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.Starting from pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp), the binary vector for plant transformation was prepared. For this purpose the pUC19 Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Asc \. The vector pGPTV was treated in the same way. Subsequently, the fragment from pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) and The cut pGPTV vector was separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) was verified by sequencing.
Ein weiteres Konstrukt, pGPTV- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co), fand Verwendung. Dazu wurde ausgehend von pUC19-Cnl1C_OCS mit folgenden Primern amplifiziert: Cnl1_OCS 5': gtcgatcaacggttccggcggtatagagttg Cnl1_OCS 3': gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggagaAnother construct, pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co), was used. For this purpose, the following primers were amplified starting from pUC19-Cnl1C_OCS: Cnl1_OCS 5 ': gtcgatcaacggttccggcggtatagagttg Cnl1_OCS 3': gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):Composition of the PCR mixture (50 μl):
5,00 μl Template cDNA5.00 μl template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP5.00 μl 10x buffer (Advantage polymerase) + 25mM MgCl 2 5.00 μl 2mM dNTP
1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl)1.25 μl per primer (10 pmol / μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)0.50 μl Advantage polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:Reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Annealing temperature: 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Sa/l inkubiert. Der Vektor pUC19 wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Sa/l inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose- Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19- Cnl1_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.The PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l. The vector pUC19 was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l. Subsequently, the PCR product and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_OCS was verified by sequencing.
In einem weiteren Schritt wurde das Δ12-Desaturase-Gen aus Calendula officinalis (WO01/85968) in pUC19-Cnl1_OCS kloniert. Dazu wurde d12Des(Co) mit folgenden Primern amplifiziert:In a further step, the Δ12-desaturase gene from Calendula officinalis (WO01 / 85968) was cloned into pUC19-Cn17_OCS. For this purpose d12Des (Co) was amplified with the following primers:
D12Des(Co) 5': agatctatgggtgcaggcggtcgaatgc D12Des(Co) 3': ccatggttaaatcttattacgataccD12Des (Co) 5 ': agatctatgggtgcaggcggtcgaatgc D12Des (Co) 3': ccatggttaaatcttattacgatacc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl): 5,00 μl Template cDNAComposition of the PCR mixture (50 μl): 5.00 μl template cDNA
5,00 μl 1Ox Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCI2 5,00 μl 2mM dNTP 1 ,25 μl je Primer (10 pmol/μl) 0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)5.00 μl 1 × buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 μl 2 mM dNTP 1, 25 μl per primer (10 pmol / μl) 0.50 μl Advantage Polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:Reaction conditions of the PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 550C Denaturierungstemperatur: 1 min 940C Elongationstemperatur: 2 min 720C Anzahl der Zyklen: 35Annealing temperature: 1 min 55 0 C denaturation temperature: 1 min 94 0 C elongation temperature: 2 min 72 0 C number of cycles: 35
Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym BgIW und anschließend für 2 h bei gleicher Temperatur mit Λ/col inkubiert. Der Vektor pUC19- Cnl1_OCS wurde in gleicher weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR- Fragment und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert. Das Plasmid pUC19-Cnl1_D12Des(Co), sowie das Plasmid pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurden für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Sa/l inkubiert. Anschließend wurde das Vektor-Fragment sowie der Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA- Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und Vektor- Fragment ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cnl1_ d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.The PCR product was incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme BgIW and then for 2 h at the same temperature with Λ / col. The vector pUC19-Cnl1_OCS was incubated in the same way. Subsequently, the PCR fragment and the cut vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_D12Des (Co) was verified by sequencing. The plasmid pUC19-Cnl1_D12Des (Co), as well as the plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) were incubated for 2 h at 37 0 C with the restriction enzyme Sa / l. Subsequently, the vector fragment and the vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and vector fragment were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was verified by sequencing.
Ausgehend von pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) für 2 h bei 370C mit dem Restriktionsenzym Asc\ inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher Weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR- Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert. Ein weiterer für die Pflanzentransformation geeigneter Vektor ist pSUN2. Um die Zahl der im Vektor enthaltenen Expressionskassetten auf mehr als vier zu erhöhen wurde dieser Vektor in Kombination mit dem Gateway-System (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Dazu wurde in den Vektor pSUN2 gemäss Herstellerangaben die Gateway- Kassette A wie folgendermassen beschrieben, eingefügt:Starting from pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co), the binary vector for plant transformation was prepared. For this purpose the pUC19 Cnl1_d6Des was incubated with the restriction enzyme Asc \ (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) for 2 h at 37 0 C. The vector pGPTV was treated in the same way. Subsequently, the fragment from pUC19-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) and the cut pGPTV vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA was carried out using the Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer's instructions. Subsequently, vector and PCR product were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was verified by sequencing. Another vector suitable for plant transformation is pSUN2. In order to increase the number of expression cassettes contained in the vector to more than four, this vector was used in combination with the Gateway system (Invitrogen, Karlsruhe). For this purpose, the gateway cassette A was inserted into the vector pSUN2 according to the manufacturer's instructions as follows:
Der pSUN2 Vektor (1 μg) wurde 1 h mit dem Restriktionsenzym EcoRV bei 37° inkubiert. Anschliessend wurde die Gateway-Kassette A (Invitrogen, Karlsruhe) in den geschnittene Vektor ligiert mittels des Rapid Ligation Kits von Roche, Mannheim. Das entstandene Plasmid wurde in E. coli DB3.1 Zellen (Invitrogen) transformiert. Das insolierte Plasmid pSUN-GW wurde anschliessend durch Sequenzierung verifiziert.The pSUN2 vector (1 μg) was incubated for 1 h with the restriction enzyme EcoRV at 37 °. Subsequently, the Gateway cassette A (Invitrogen, Karlsruhe) was ligated into the cut vector by means of the Rapid Ligation Kit of Roche, Mannheim. The resulting plasmid was transformed into E. coli DB3.1 cells (Invitrogen). The isolated plasmid pSUN-GW was subsequently verified by sequencing.
Im zweiten Schritt wurde die Expressionskassette aus pUC19-Cnl1_ d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) mittels Ascl ausgeschnitten und in den in gleicherweise behandelten Vektor pSUN-GW ligiert.In the second step, the expression cassette from pUC19-Cn11_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co) was excised by Ascl and ligated into the similarly treated vector pSUN-GW.
Beispiel 4: Erzeugung von transgenen Pflanzen a) Erzeugung transgener Brassicapflanzen (verändert nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)Example 4 Generation of Transgenic Plants a) Production of Transgenic Brassica Plants (Modified According to Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238-242)
Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen können binäre Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1 :pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wird eine 1 :50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3 % Saccharose (3MS-Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm2) werden in einer Petrischale mit einer 1 :50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgt eine 3-tägige Colnkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wird nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefota- xime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1 ,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse werden auf MS-Medium mit 2 % Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Bilden sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-lndolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben.Binary vectors in Agrobacterium tumefaciens C58C1: pGV2260 or Escherichia coli can be used to generate transgenic rape plants (Deblaere et al., 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). For the transformation of oilseed rape plants (Var Drakkar, NPZ Nordeutsche plant breeding, Hohenlieth, Germany), a 1:50 dilution of an overnight culture of a positively transformed agrobacterial colony in Murashige-Skoog medium (Murashige and Skoog 1962 Physiol., Plant 15, 473) with 3 % Sucrose (3MS medium). Petioles or hypocotyls of freshly germinated sterile rape plants (about 1 cm 2 each) are incubated in a Petri dish with a 1:50 agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This is followed by a 3-day colncubation in darkness at 25 ° C on 3MS medium with 0.8% Bacto agar. Cultivation is continued after 3 days with 16 hours light / 8 hours darkness and weekly on MS medium with 500 mg / L claforan (Cefotaxime sodium), 50 mg / L kanamycin, 20 microM benzylaminopurine (BAP) and 1, 6 g / l glucose continued. Growing shoots are transferred to MS medium with 2% sucrose, 250 mg / L claforan and 0.8% Bacto agar. If roots do not form after three weeks, then 2-indolebutyric acid was added to the medium as growth hormone for rooting.
Regenerierte Sprosse werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Elongase-Expression wie Δ-6-Elongaseaktivität oder ω-3- Desaturaseaktivität mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an C20- und C22 mehrfachungesättigten Fettsäuren können so identifiziert werden. b) Herstellung von transgenen Camelina PflanzenRegenerated shoots are obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan, transferred into soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse after cultivation for two weeks, flowered, harvested mature seeds and for elongase expression such as Δ6-elongase activity or ω-3-desaturase activity by means of lipid analyzes. Lines with elevated levels of C20 and C22 polyunsaturated fatty acids can thus be identified. b) Preparation of transgenic Camelina plants
Agrobacterium tumefaciens Stamm C58 wurde mittels Elektroporation mit dem PUFA- Vektor 81 , 191 and 192 transformiert. Eine Inokulation von Explantaten von Camelina Keimlingen (Alter >1 Woche), die auf MS medium angezogen wurden, mit Agrobkak- terien wurde durchgeführt. Nach zwei Wochen Kokultivierung wurden die Pflanzen gewaschen um Agrobakterien zu entfernen, und anschließend auf Regenerationsmedium mit optimierten BaP und NAA überführt. Nach weitern zwei Tagen Regeneration wurden optimierte Mengen an Kanamycinn zugefügt. Dieser Selektionsdruck wurde 12 Tage aufrecht erhalten. Die Sprossregeneration wurde durch Transfer zu Kanamycin- freiem BaP enthaltenem Medium initiiert. Sprossebildung wurden nach >3 Wochen nach Inokulation abgeschlossen und die Wurzelbildung auf Medium mit NAA induziert. Sprosse wurden nach Bewurzelung in Erde überführt und in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Elongase-Expression wie Δ-6-Elongaseaktivität oder ω-3-Desaturaseaktivität mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an mehrfachungesättigten Fettsäuren können so identifiziert werden.Agrobacterium tumefaciens strain C58 was transformed by electroporation with PUFA vector 81, 191 and 192. Inoculation of explants from Camelina seedlings (age> 1 week) grown on MS medium with agrobacteria was performed. After two weeks of coculture, the plants were washed to remove agrobacteria and then transferred to regeneration medium with optimized BaP and NAA. After a further two days of regeneration, optimized amounts of kanamycin were added. This selection pressure was maintained for 12 days. The shoot regeneration was initiated by transfer to kanamycin-free BaP-containing medium. Sprouting was completed> 3 weeks after inoculation and rooting was induced on medium with NAA. Sprouts were transferred to soil after rooting and grown in a climatic chamber or greenhouse, flowered, harvested mature seeds and examined for elongase expression such as Δ6-elongase activity or ω-3-desaturase activity by lipid analysis. Lines with elevated levels of polyunsaturated fatty acids can be identified.
Beispiel 5: Lipidextraktion aus Samen:Example 5 Lipid Extraction from Seed:
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. der Lipide oder einer Fettsäure) untersucht werden. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel IM: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).The effect of genetic modification in plants on the production of a desired compound (such as a fatty acid) can be determined by cultivating the modified plant under suitable conditions (such as those described above) and increasing the medium and / or cellular components to increased production of the desired product (ie the lipids or a fatty acid). These analytical techniques are well known to those skilled in the art and include spectroscopy, thin layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods, and analytical chromatography such as high performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and p. 443-613, VCH: Weinheim (1985), Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17, Rehm et al Biotechnology, Vol. 3, Chapter IM: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, PA, et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy JF, and Cabral, JMS (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons, Shaeiwitz, JA, and Henry, JD (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. Pp. 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145 beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1 ); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN. Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z.B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.In addition to the above-mentioned methods, plant lipids derived from plant material as described by Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Be. USA 96 (22): 12935-12940, and Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145. Qualitative and quantitative lipid or fatty acid analysis is described in Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr / Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 p. (OiIy Press Lipid Library, 1); Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) udT: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN In addition to measuring the end product of fermentation, it is also possible to use other components of the metabolic pathways Analyzes include measurements of nutrient levels in the medium (eg, sugars, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate, and other ions), measurements, etc., used to produce the desired compound, such as by-products and by-products biomass composition and growth, analysis of production of common metabolites of biosynthetic pathways and measurements of gases generated during fermentation Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, Hrsgb., IRL Press , Pp. 103-129, 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and L mentioned therein Iteraturstellen described.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Tria- cylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie). Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, OiIy Press, Dundee, 1 19-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353).One example is the analysis of fatty acids (abbreviations: FAME, fatty acid methyl ester, GC-MS, gas-liquid chromatography-mass spectrometry, TAG, triacylglycerol, TLC, thin-layer chromatography). The unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms by standard analytical methods: GC, GC-MS or TLC as variously described by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition. Christie, Oliver Press, Dundee, 1 19-169, 1998, Gas Chromatography Mass Spectrometry Method, Lipids 33: 343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.The material to be analyzed may be broken up by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or other applicable methods. The material must be centrifuged after rupture. The sediment is distilled in aqua. re-suspended, heated at 100 ° C for 10 min, cooled on ice and recentrifuged, followed by extraction into 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C resulting in hydrolyzed oil and lipid compounds. which give transmethylated lipids. These fatty acid methyl esters are extracted into petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 ° C and 240 ° C 20 min and 5 min at 240 ° C subjected. The identity of the resulting fatty acid methyl esters must be defined using standards available from commercial sources (i.e., Sigma).
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen. Dann wird 10 min auf 100°C erhitzt und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedimen- tiert. Das Zellsediment wird mit 1 M methanolischer Schwefelsäure und 2 % Dimetho- xypropan für 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide transmethyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fettsäuremethylester wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME-Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der Doppelbindung kann durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z.B. zu 4,4-Dimethoxy- oxazolin-Derivaten (Christie, 1998) mittels GC-MS weiter analysiert werden.Plant material is first mechanically homogenized by mortars to make it more accessible to extraction. The mixture is then heated for 10 min at 100 ° C and sedimented again after cooling on ice. The cell sediment is hydrolyzed with 1 M methanolic sulfuric acid and 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C. and the lipids are transmethylated. The resulting fatty acid methyl esters (FAME) are extracted into petroleum ether. The extracted FAME are purified by gas chromatography using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused silica, CP-Wax-52CB, 25 m, 0.32 mm) and a temperature gradient from 170 ° C to 240 ° C in 20 min and 5 min at 240 ° C analyzed. The identity of the fatty acid methyl esters is confirmed by comparison with corresponding FAME standards (Sigma). The identity and the position of the double bond can be further analyzed by GC-MS by suitable chemical derivatization of the FAME mixtures, for example to give 4,4-dimethoxoxazoline derivatives (Christie, 1998).
Beispiel 6: Analyse der Samen von den erzeugten transgenen PflanzenExample 6: Analysis of the seeds from the transgenic plants produced
Entsprechend Beispiel 5, wurden die Samen der Pflanzen, die mit den Konstrukten pGPTV- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co), pSUN-5G und pSUN- 8G transformiert wurden, analysiert. Im Vergleich zu Kontroll-Pflanzen, die nicht transformiert wurden (Wildtyp-Kontrolle, WT) konnte eine deutliche Veränderung im Fettsäurespektrum festgestellt werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die transformierten Gene funktionell sind. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen.According to Example 5, the seeds of the plants transformed with the constructs pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co), pSUN-5G and pSUN-8G were analyzed. Compared to control plants that were not transformed (wild-type control, WT), a clear change in the fatty acid spectrum was observed. This showed that the transformed genes are functional. Table 1 summarizes the results.
Tabelle 1 :Table 1 :
Die Analyse der Samen mit dem Konstrukt pSUN-5G zeigt dabei Linien, die eine deutliche Erhöhung des Gehaltes an Arachidonsäure verglichen mit dem Konstrukt pGPTV- Cnl1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) haben. Dabei konnten Linien mit bis zu 25 % ARA erhalten werden. Die Ergebnisse dieser Linie sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Analysis of the seeds with the construct pSUN-5G shows lines which have a marked increase in the content of arachidonic acid compared with the construct pGPTV-Cnl1_d6Des (Pir) _d5Des (Tc) _D6Elo (Pp) _D12Des (Co). Lines with up to 25% ARA could be obtained. The results of this line are summarized in Table 2.
Tab. 2: Fettsäureanalytik von transgenen Samen, die mit dem Konstrukt pSUN-5G transformiert wurden.Tab. 2: Fatty acid analysis of transgenic seeds which were transformed with the construct pSUN-5G.
Beispiel 7: Analyse von transgenem Samenmaterial von Camelina sativa, LExample 7: Analysis of transgenic seed material of Camelina sativa, L
Die Extraktion von Samen transgener Camelina sativa Pflanzen tranformiert mit PUFA 81 (enthaltend:Δ6Des(Pir) SEQ ID NO: 1_Δ5Des(Tc) SEQ ID NO: 3_Δ6Elo(Pp) SEQ ID NO: 5_Δ12Des(Co) SEQ ID NO: 11 ). sowie die gaschromatographische Analyse wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Analy- sen. Dabei wurden die verschiedenen Fettsäuren in Flächenprozent angegeben. Für Camelina sativa konnte erstmals die Synthese von langkettigen-mehrfach ungesättigte Fettsäuren gezeigt werden. Überraschenderweise konnte durch die Einbringung des Syntheseweges für die Produktion von langkettigen-mehrfach ungesättigte Fettsäuren der Gehalt an Erucasäure (22:1 ) und Icosensäure (20:1 ) deutlich gesenkt werden, obwohl am direkten Syntheseweg für Erucasäure wie er bei Mietkiewska, et al., Plant Phys 2004 oder Katavic et al., 2002 Europ. Journal of Biochem beschrieben ist, nichts verändert wurdeExtraction of seeds of transgenic Camelina sativa plants transformed with PUFA 81 (containing: Δ6Des (Pir) SEQ ID NO: 1_Δ5Des (Tc) SEQ ID NO: 3_Δ6Elo (Pp) SEQ ID NO: 5_Δ12Des (Co) SEQ ID NO: 11). and the gas chromatographic analysis was carried out as described in Example 5. Table 3 shows the results of the analyzes. The different fatty acids were expressed in area percent. For Camelina sativa was the first to demonstrate the synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids. Surprisingly, the introduction of the synthesis route for the production of long-chain polyunsaturated fatty acids, the content of erucic acid (22: 1) and icosenoic acid (20: 1) could be significantly reduced, although in the direct pathway for erucic acid as in Mietkiewska, et al. , Plant Phys 2004 or Katavic et al., 2002 Europ. Journal of Biochem is described, nothing has been changed
Tabelle 3: Gaschromatographische Analyse von Samenmaterial von Camelina sativa, L. Die einzelnen Fettsäuren sind in Flächenprozent angegeben. Table 3: Gas chromatographic analysis of seed material from Camelina sativa, L. The individual fatty acids are given in area percent.
16:0 18:0 18:1Δ9 18:1Δ11 18:2 γ18:3 α18:316: 0 18: 0 18: 1Δ9 18: 1Δ11 18: 2 γ18: 3 α18: 3
PUFA81 1 9,4 4,6 3,5 1,1 8,0 26,6 9,5PUFA81 1 9.4 4.6 3.5 1.1 8.0 26.6 9.5
PUFA81 2 12,7 4,4 4,8 0,9 19,3 15,9 18,0PUFA81 2 12,7 4.4 4,8 0,9 19,3 15,9 18,0
PUFA81 _3 13,1 4,7 4,2 1,2 17,1 18,1 13,1PUFA81 _3 13.1 4.7 4.2 1.2 17.1 18.1 13.1
PUFA81 4 9,2 3,2 3,7 1,1 5,8 23,7 10,8PUFA81 4 9.2 3.2 3.7 1.1 5.8 23.7 10.8
PUFA81 6 8,1 4,8 1,1 0,0 9,3 19,9 14,6PUFA81 6 8.1 4.8 1.1 0.0 9.3 19.9 14.6
PUFA81 7 8,0 3,3 4,3 0,9 7,8 21,1 13,7PUFA81 7 8.0 3.3 4.3 0.9 7.8 21.1 13.7
PUFA81 8 7,9 3,7 5,0 1,2 8,5 19,9 16,1PUFA81 8 7.9 3.7 5.0 1.2 8.5 19.9 16.1
PUFA81 9 8,0 3,5 4,6 1,1 7,3 21,9 13,1PUFA81 9 8.0 3.5 4.6 6.1 7.3 21.9 13.1
PUFA81 10 8,2 3,9 7,2 1,5 9,1 20,4 15,2PUFA81 10 8.2 3.9 7.2 1.5 9.1 20.4 15.2
PUFA81 16 8,0 3,4 4,7 0,8 8,4 22,0 14,8PUFA81 16 8.0 3.4 4.7 0.8 8.4 22.0 14.8
PUFA81. 20 8,7 3,2 5,9 1,4 8,1 21,8 14,3PUFA81 . 20 8.7 3.2 5.9 1.4 8.1 21.8 14.3
wt_1 5,7 2,3 12,6 0,7 12,1 n.n. 41,6 wt_2 6,6 1,9 10,1 0,9 14,3 n.n. 42,4 wt_3 5,6 1,9 8,9 0,8 15,0 n.n. 43,1 wt_4 6,1 2,0 9,4 0,9 15,3 n.n. 42,9 wt_5 6,3 2,2 10,6 0,9 15,9 n.n. 41,3 wt 6 6,2 2,4 7,5 0,8 14,8 n.n. 43,2wt_1 5.7 2.3 12.6 0.7 12.1 n.n. 41.6 wt_2 6.6 1.9 10.1 0.9 14.3 n.n. 42.4 wt_3 5.6 1.9 8.9 0.8 15.0 n.n. 43.1 wt_4 6.1 2.0 9.4 0.9 15.3 n.n. 42.9 wt_5 6.3 2.2 10.6 0.9 15.9 n.n. 41.3 wt 6 6.2 2.4 7.5 0.8 14.8 n.n. 43.2
20:420: 4
20:3 (ARA) 20:5 (EPA)20: 3 (ARA) 20: 5 (EPA)
18:4 20:0 20:1 (11,14,17) (5,8,11, 14)(5,8,11, 14,17) 22:118: 4 20: 0 20: 1 (11,14,17) (5,8,11, 14) (5,8,11, 14,17) 22: 1
PUFA81 1 10,6 2,5 7,4 1,0 9,2 3,3 1,6PUFA81 1 10.6 2.5 7.4 1.0 9.2 3.3 1.6
PUFA81 2 5,3 2,9 0,5 0,7 6,7 1,8 3,1PUFA81 2 5.3 2.9 0.5 0.7 6.7 1.8 3.1
PUFA81 _3 8,9 2,7 0,4 0,6 7,9 3,4 1,9PUFA81 _3 8.9 2.7 0.4 0.6 7.9 3.4 1.9
PUFA81 4 12,1 2,0 9,8 1,4 8,3 3,3 2,8PUFA81 4 12.1 2.0 9.8 1.4 8.3 3.3 2.8
PUFA81 6 11,7 3,6 10,1 1,5 6,3 3,0 3,1PUFA81 6 11.7 3.6 10.1 1.5 6.3 3.0 3.1
PUFA81 7 11,1 2,7 9,1 1,4 7,6 3,3 3,0PUFA81 7 11.1 2.7 9.1 1.4 7.6 3.3 3.0
PUFA81 8 11,8 2,6 9,5 1,7 6,3 3,1 0,1PUFA81 8 11.8 2.6 9.5 1.7 6.3 3.1 0.1
PUFA81 9 11,3 2,4 7,7 1,4 8,8 3,7 2,3PUFA81 9 11.3 2.4 7.7 1.4 8.8 3.7 2.3
PUFA81 10 10,7 2,1 8,0 1,1 6,0 2,7 1,7PUFA81 10 10.7 2.1 8.0 1.1 6.0 2.7 1.7
PUFA81 16 8,4 1,8 12,8 1,6 6,1 2,1 2,4PUFA81 16 8.4 1.8 12.8 1.6 6.1 2.1 2.4
PUFA81. 20 10,1 1,5 10,3 1,3 6,3 2,7 2,1 wt_1 n.n. 1,4 14,2 1,7 n.n. n.n. 3,7 wt_2 n.n. 1,2 13,1 2,1 n.n. n.n. 3,2 wt_3 n.n. 1,4 12,9 2,0 n.n. n.n. 4,0 wt_4 n.n. 1,3 12,3 1,9 n.n. n.n. 3,4 wt_5 n.n. 1,5 12,5 1,7 n.n. n.n. 3,3 wt 6 n.n. 1,9 12,3 1,9 n.n. n.n. 3,9 Äquivalente:PUFA81 . 20 10.1 1.5 10.3 1.3 6.3 2.7 2.1 wt_1 nn 1.4 14.2 1.7 nnnn 3.7 wt_2 nn 1.2 13.1 2.1 nnnn 3 , 2 wt_3 nn 1.4 12.9 2.0 nnnn 4.0 wt_4 nn 1.3 12.3 1.9 nnnn 3.4 wt_5 nn 1.5 12.5 1.7 nnnn 3.3 wt 6 nn 1.9 12.3 1.9 nnnn 3.9 equivalents:
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein. One skilled in the art will recognize or recognize many equivalents of the specific embodiments of the invention described herein, using only routine experimentation. These equivalents are intended to be encompassed by the claims.

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaen- säure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in transgenen Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipid- gehalt der transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Desaturase codiert, und b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Elongase codiert, und c) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-5-Desaturase codiert, und d) Ernten der Nutzpflanze, wobei durch die enzymatische Aktivität der unter den Schritten (a) bis (c) eingebrachten Enzyme eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1Δ9], Linolsäure [C18:2Δ9 12], α-Linolensäure [C18:3Δ6 9 12], Icosensäure [C20:1Δ11] und Erucasäure [C22:1Δ13] um mindestens 10 % gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze reduziert wird. 1. A process for the production of arachidonic acid (= ARA) or eicosapentaenoic acid (= EPA) or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid in transgenic plants of the family Brassicaceae with a content of ARA or EPA or ARA and EPA of at least 3 wt .-% based on the total lipid content of the transgenic plant, characterized in that it comprises the following procedural steps: a) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop which codes for a Δ6-desaturase, and b) introduction of at least one nucleic acid sequence into the crop suitable for c) introducing at least one nucleic acid sequence into the crop which encodes a Δ5-desaturase, and d) harvesting the crop, wherein, by the enzymatic activity, that of the steps (a) to ( c) enzymes introduced a fatty acid selected from the group consisting of the fatty acids oleic acid [C18: 1 Δ9 ], linoleic acid [C18: 2 Δ9 12 ], α-linolenic acid e [C18: 3 Δ6 9 12 ], icosenoic acid [C20: 1 Δ11 ] and erucic acid [C22: 1 Δ13 ] is reduced by at least 10% compared to the wild type non-transgenic plant.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein- säuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder2. The method according to claim 1, characterized in that the nucleic acid sequences coding for polypeptides having Δ-6-desaturase, Δ-6-elongase, or Δ-5-desaturase activity are selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7, or b) nucleic acid sequences which, as a result of the degenerate genetic code, are different from those shown in SEQ SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 derive amino acid sequences, or c) derivatives of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or
SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 40 % Identität mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 aufweisen und eine Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität haben. SEQ ID NO: 7, which encode polypeptides having at least 40% identity at amino acid level with SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 and a Δ-6 Desaturase, Δ6-elongase, or Δ5-desaturase activity.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in die3. The method according to claim 1, characterized in that additionally in the
Nutzpflanzen eine Nukleinsäuresequenz eingebracht wird, die für eine ω-3- Desaturase oder Δ-12-Desaturase oder ω-3-Desaturase und Δ-12-Desaturase codieren. Crop plants a nucleic acid sequence is introduced, which encode an ω-3-desaturase or Δ-12-desaturase or ω-3-desaturase and Δ-12-desaturase.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60 % Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine ω-3-Desaturaseaktivität haben.4. The method according to claim 3, characterized in that the nucleic acid sequence coding for polypeptides with ω-3-desaturase activity is selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 9, or b ) Nucleic acid sequences which can be derived as a result of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, which code for polypeptides which at least 60% identity at the amino acid level having SEQ ID NO: 10 and having ω-3 desaturase activity.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit Δ-12-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 1 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60 % Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine Δ-12-Desaturase- aktivität haben.5. The method according to claim 3, characterized in that the nucleic acid sequence which codes for polypeptides with Δ-12 desaturase activity is selected from the group consisting of: a) a nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 1 1, or b) nucleic acid sequences which can be derived as a result of the degenerate genetic code from the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 12, or c) derivatives of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, which code for polypeptides which at least 60% at the amino acid level Have identity with SEQ ID NO: 10 and have Δ-12 desaturase activity.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren im vegetativen Gewebe exprimiert werden.6. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the nucleic acids are expressed in the vegetative tissue.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosa- pentaensäure in den Nutzpflanzen vorwiegend als Ester in Phospholipiden oder Triacylglyceriden gebunden vorliegt. 7. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid is present in the useful plants predominantly as an ester bound in phospholipids or triacylglycerides.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorwiegend als Ester in den Phospholipiden gebunden vorliegt und wobei die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure mit einem Gehalt von mindestens 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtlipide in den Phosholipidester vorliegt.8. The method according to claim 6, characterized in that the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid is predominantly bound as an ester in the phospholipids and wherein the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid is present in the phosholipid ester with a content of at least 10 wt .-% based on the total lipids.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäu- re oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorwiegend als Ester in den Triacylglyceriden gebunden vorliegt und wobei die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure mit einem Gehalt von mindestens 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtlipide in den Triacylglyceridestern vorliegt.9. The method according to claim 6, characterized in that the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid present predominantly bound as an ester in the triacylglycerides and wherein the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid with a content of at least 10 wt .-% based on the total lipids in the triacylglyceride esters are present.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu den Fettsäuren Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that in addition to the fatty acids arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or
Arachidonsäure und Eicosapentaensäure eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren bestehend aus γ-Linolensäure [C18:3A9 12 15] und Di- homo-γ-l_inolensäure [C20:3A6 9 12 15] um mindestens 10 % gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze erhöht wird. Arachidonic acid and eicosapentaenoic acid is a fatty acid selected from the group of fatty acids consisting of γ-linolenic acid [C18: 3 A9 12 15 ] and di-homo-γ-1-linolenic acid [C20: 3 A6 9 12 15 ] by at least 10% compared with the non-transgenic Wildtype plant is increased.
1 1. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanze eine Öl-produzierende Pflanze, eine Gemüse-, Salat- oder Zierpflanze ist.1 1. A method according to claim 1, characterized in that the crop is an oil-producing plant, a vegetable, salad or ornamental plant.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure aus den Nutzpflanzen in Form ihrer Öle, Lipide oder freien Fett- säuren isoliert werden.12. Process according to claims 1 to 9, characterized in that the arachidonic acid or eicosapentaenoic acid or arachidonic acid and eicosapentaenoic acid are isolated from the useful plants in the form of their oils, lipids or free fatty acids.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthält ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure- Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäu- re-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A- Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fett- säure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid- Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in die Nutz- pflanzen eingebracht werden.13. The method according to claims 1 to 10, characterized in that additional additional biosynthesis genes of fatty acid or lipid metabolism selected from the group acyl-CoA dehydrogenase (s), acyl-ACP [= acyl carrier protein] desaturase (s) , Acyl-ACP thioesterase (s), fatty acid acyltransferase (s), acyl CoA: lysophospholipid acyltransferase (s), fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase (s), acetyl coenzyme A - carboxylase (s), acyl-coenzyme A oxidase (s), fatty acid desaturase (s), fatty acid acetylenases, lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allene oxide synthases, hydroperoxide lyases or fatty acid elongase (s) in the crops are introduced.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt ist aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-9-Elongase.14. The method according to claim 13, characterized in that the additional biosynthesis of the fatty acid or lipid metabolism is selected from the group of Δ-4-desaturase, Δ-5-desaturase, Δ-6-desaturase, Δ-8- Desaturase, Δ-9-desaturase, Δ-12-desaturase, Δ-6 elongase or Δ-9 elongase.
15. Verwendung von Ölen, Lipiden oder freien Fettsäuren hergestellt gemäß Anspruch 12 zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. 15. Use of oils, lipids or free fatty acids prepared according to claim 12 for the production of feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
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