EP2001454A2 - Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase a2 cytosolique comme médicament pour le traitement symptomatique de la mucoviscidose - Google Patents

Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase a2 cytosolique comme médicament pour le traitement symptomatique de la mucoviscidose

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EP2001454A2
EP2001454A2 EP07731257A EP07731257A EP2001454A2 EP 2001454 A2 EP2001454 A2 EP 2001454A2 EP 07731257 A EP07731257 A EP 07731257A EP 07731257 A EP07731257 A EP 07731257A EP 2001454 A2 EP2001454 A2 EP 2001454A2
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EP
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cpla2
inhibitor
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mucus
cystic fibrosis
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Fariel Dif
Lhousseine Touqui
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Institut Pasteur
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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Definitions

  • the invention is in the field of symptomatic treatment of cystic fibrosis.
  • Cystic fibrosis (Cystic Fibrosis, CF) is an autosomal recessive genetic disorder caused by a mutation in the CFTR gene, a 250 kb gene that encodes a protein of 1480 amino acids called CFTR protein (Cystic Fibrosis, CF)
  • This protein belongs to the family of chloride channels. To date more than 1000 mutations responsible for the disease have been described, but the most common, (discovered in 1989), called ⁇ F508, is present in about 70% of patients. This mutation consists of the deletion of an amino acid, a phenylalanine at position 508,
  • Influenzae which can lead to an exacerbated inflammatory response in the airways, characterized by a massive influx of neutrophils. These pathogens are responsible for most episodes of bronchial infections. The lack of control of this inflammatory process, often associated with bronchial obstruction, causes destruction of lung tissue resulting in a gradual loss of respiratory function until death.
  • This disease is also characterized by digestive disorders mainly due to exocrine pancreatic insufficiency present in 90% of patients. These respiratory and digestive manifestations dominate the clinical picture, but the respiratory compromise conditions the vital prognosis of the patients.
  • mucoid character is virtually specific to the infection.
  • the incidence of mucoid strains increases with age and the progression of respiratory disease. Bronchopulmonary involvement evolves by relapses which lead in a few months or several decades to chronic respiratory insufficiency. Complications such as recurrent pneumothorax or haemoptysis can make life worse.
  • cystic fibrosis can only be treated symptomatically. Management is mainly based on respiratory physiotherapy and anti-infectious treatment with antibiotics. In addition to its heaviness, this treatment must be followed for life.
  • Antibiotic therapy must comply with a certain number of binding general principles: appropriate choice of antibiotics, prevention of resistance due to the chronicity of bronchial infection, high doses over long periods of time (at least two weeks), only parenteral administration for antipyocyanic antibiotics.
  • Molecules make it possible to thin the mucus and in particular rhDNase, catalytic enzyme of hydrolysis of the extracellular DNA which makes it possible to reduce the viscosity of the mucus then easier to evacuate by the physiotherapy.
  • rhDNase catalytic enzyme of hydrolysis of the extracellular DNA which makes it possible to reduce the viscosity of the mucus then easier to evacuate by the physiotherapy.
  • nocturnal oxygen therapy becomes necessary. But, lung transplantation is the last resort.
  • cPLA2 cytosolic phospholipase A2
  • AA is then metabolized by two distinct enzymatic pathways involved in inflammation: the cyclooxygenase (COX) pathway that results in the production of prostaglandins, particularly prostaglandin E2 (PGE2); and the lipooxygenase pathway that results in the production of leukotrienes, particularly leukotriene B4 (LTB4).
  • COX cyclooxygenase
  • PGE2 prostaglandin E2
  • LTB4 leukotriene B4
  • LTB4 leukotriene B4
  • PGE2 prostaglandin E2
  • CFTR mice '' ' stimulated by instillation with lipopolysaccharide (LPS) of Pseudomonas aeruginosa that causes inflammation of the airways secrete more mucus than wild mice.
  • LPS lipopolysaccharide
  • instillation is meant an administration by air, more specifically intratracheally.
  • the inventors have also shown that this secretion of mucus is inhibited by aspirin, a COX inhibitor.
  • Mucus is essentially mucins (glycoproteins) and MUC5AC is one of the most abundant mucins in the lungs of cystic fibrosis patients.
  • the subject of the invention is the use of at least one inhibitor of cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in the preparation of a medicament for the symptomatic preventive and / or curative treatment of cystic fibrosis, particularly increased secretion of cystic fibrosis. mucus secretory epithelia of the respiratory and digestive mucous membranes.
  • cPLA2 cytosolic phospholipase A2
  • cPLA2 inhibitor any chemical or biological molecule, natural or synthetic, any composition which, whatever its mechanism, induces after administration a decrease, or even a complete inhibition, of the activity of the cPLA2 or the expression of the cPLA2 gene.
  • cakA2 inhibitor ATK (Arachidonyl) may be mentioned as an inhibitor of cPLA2.
  • the cPLA2 inhibitor is a siRNA that interferes with the expression of the cPLA2 gene.
  • the inhibitor of cPLA2 used according to the invention is ATK.
  • a combination of cPLA2 inhibitors (2 or more) in the preparation of a medicament for the treatment of diseases of the respiratory tract leading to a increased secretion of mucus, including the symptomatic treatment of cystic fibrosis.
  • the cPLA2 inhibitor is used in the preparation a drug for the treatment of cystic fibrosis. It can also be envisaged that the cPLA2 inhibitor is used in the preparation of a medicament for the symptomatic treatment of increased mucus secretion in asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) such as laryngitis and pharyngitis, pneumonia, influenza, pneumoconiosis, chronic bronchitis and emphysema or aspergillary asthma.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the cPLA2 inhibitor may be used in the medicament in an amount of between 0.01 mg to 2 g, preferably from 1 mg to 1 g, very preferably from 10 mg to 500 mg.
  • the inhibitor of cPLA2 such as, for example PATK
  • the term "symptomatic treatment” refers to the preventive and / or curative treatment of symptoms related to the disease. This treatment also improves the management of patients (reduction of suffering, improvement of the lifespan, slowing of the progression of the disease etc.). The treatment may also be carried out in combination with other ingredients or treatments, such as in particular other active compounds for treating the pathologies or traumas specified in the present application.
  • the subject of the invention is the use of at least one inhibitor of cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in the preparation of a medicament for the symptomatic treatment of the increased mucus secretion of cystic fibrosis said medicament to be administered in addition to gene therapy of cystic fibrosis.
  • cPLA2 cytosolic phospholipase A2
  • the drug according to the invention can take any conceivable form for its administration.
  • it may be liquid as a syrup or solution for intramuscular injection or intravenous or solid such as a powder or a tablet.
  • the administration can be carried out by any method known to those skilled in the art, preferably orally, aerosolized, or by injection, typically intraperitoneal, intra-cerebral, intrathecal, intravenous, intravenous. -arterial or intramuscular. Oral administration is preferred. As a long-term treatment, the preferred route of administration will be sublingual, oral or transcutaneous.
  • the daily dose of cPLA2 inhibitor used according to the invention will be the minimum dose to obtain the desired therapeutic effect. This dose will depend on various factors such as the weight of the subject to be treated. If necessary, the daily dose may be administered in two, three, four, five, six or more doses taken daily or in multiple sub-doses administered at appropriate intervals during the day.
  • the amount selected will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the timing of administration, the rate of elimination of the compound, the or various products used in combination with the compound, age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and other information known in medicine.
  • the medicaments according to the invention may also comprise at least one other therapeutically active ingredient for simultaneous, separate or spread use over time, in particular during treatment in a subject suffering from a pathology as defined above.
  • the medicaments according to the invention advantageously comprise one or more excipients or inert carriers, that is to say pharmaceutically inactive and non-toxic vehicles.
  • the drugs may contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles that can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils or animal, acacia, etc.
  • compositions may be formulated as injectable suspension, gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally using dosage forms or devices providing sustained and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • mice were tested for at least 5 mice per treatment category, 5-7 weeks old.
  • mice and their wild homologs cPLA2 + / + , of the same genetic background were obtained from the "Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Tokyo” (Uozomi et al., Nature, 1997). These mice were 6-8 weeks old at the time of the experiment.
  • P. aeruginosa LPS serotype 10 (Sigma, St. Louis, MO) EDTA, phenylmethylsulphoxide and dithiothreitol (Sigma, St. Louis, MO)
  • Anti-MUC5AC antibody (clone 45 M1, Neomarkers, Fermont, CA, USA)
  • Antibodies mouse IgG (Dako Cytomation Envision System). Amino Ethyl Carbazol (Sigma, St. Louis, MO).
  • the products used were dissolved in saline solution (or physiological saline) and injected intratracheally (i.t.) or intraperitoneally (i.p.).
  • the usage protocol was as follows:
  • ATK (20 mg / kg, i.p.), 30 min before LPS and 24 h after.
  • mice were anesthetized with 2% Xylazine (8 mg / kg) and Ketamine 1000 (40 mg / kg) prior to instillation of LPS (330 ⁇ g / kg, i.t.).
  • mice were anesthetized with Pentobarbital (i.p.) at 200 mg / kg and their incised and cannulated tracheas.
  • the LBAs were performed with successive washings with 1 ml of saline solution containing 5 mM EDTA and protease inhibitors (5 mM phenylmethylsulphoxide, 5 mM dithiothreitol).
  • the counting of the cells was carried out by an automatic counter Counter ZM (Coultronic, Margency, France). This allows to highlight the state of inflammation of the lungs.
  • Sections 5 ⁇ m thick were stained with Hemotoxylin / Eosin, periodic acid-Schiff (PAS) and Alcian blue (Alcian blue: AB, pH 2.4) according to standard methodologies (Normal and Pathological Histology).
  • MLJ5AC (clone 45 M 1) for 2 h at room temperature, at a concentration of 8 ⁇ g / ml in 1X PBS.
  • Mouse lungs were homogenized with lysis buffer (Quiagen RLT buffer). The homogenates were centrifuged, and equivalent amounts of proteins (10-50 ⁇ g) were deposited on the 7.5% electrophoresis gel (Tris / Glycine / SDS-polyacrylamide).
  • the proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore) previously treated with PBS at 5% milk / Tween 1% o.
  • the membrane was then incubated for 1 hour at room temperature in the presence of the primary antibody, then washed 3 times with PBS / Tween 1% o.
  • the membrane was then incubated for 1 hour at room temperature in the presence of the secondary antibody, then washed with PBS / Tween 1% o.
  • Actin control makes it possible to normalize the level of expression of the MU5AC protein.
  • the intensity of the bands is measured with an image analyzer.
  • Lung homogenates were prepared according to Filgueiras et al. (Lipids 22: 731-735, (1987)).
  • the lipids were extracted by the method of Bligh and Dyer (Can.
  • the spots corresponding to phosphatidylcholine (PC) were then recovered and their radioactivity measured using standard scintillation fluid.
  • the cPLA2 activity was expressed in counts per minute (cpm).
  • CF mice secrete more MUC5AC in LBAs both in baseline conditions than after LPS treatment compared with WT mice.
  • mice received a dose of saline and a dose of aspirin.
  • mice received a dose of saline and a dose of ATK.
  • Table 4 The "control” mice received a dose of saline and a dose of ATK.
  • mice received a dose of saline.
  • the secondary antibody used is an anti-mouse IgG antibody (Dako Cytomation Envision System).
  • the measurement of the quantity is related to the measurement of the amount of actin mRNA measured in the same sample for normalization (MUC5AC mRNA / Actin mRNA).
  • the primary antibody used is an anti-cPLA2 monoclonal antibody (CeII Signaling or Santa Cruz).
  • the secondary antibody used is an anti-mouse antibody (Dako Cytomation Envision System).
  • the measurement of the quantity is related to the measurement of the amount of actin messenger RNA measured in the same sample for normalization (cPLA2 mRNA / Actin mRNA). Table 7
  • Histological or immunohistochemical analyzes performed on sections of the lungs of mice, confirm the results obtained in the measurements of the mucus production by the cells of the bronchial epithelium.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique préventif et/ou curatif de la mucoviscidose particulièrement de la sécrétion accrue de mucus dans la mucoviscidose.

Description

Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique comme médicament pour le traitement symptomatique de la mucoviscidose
5 L'invention se place dans le domaine du traitement symptomatique de la mucoviscidose.
La mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF) est une maladie génétique autosomique récessive due à une mutation du gène CFTR, gène de 250 kb qui code pour une protéine de 1480 acides aminés appelée protéine CFTR (Cystic
10 Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Cette protéine fait partie de la famille des canaux chlorures. A ce jour plus de 1000 mutations responsables de la maladie ont été décrites, mais la plus fréquente, (découverte en 1989), appelée ΔF508, est présente chez environ 70% des malades. Cette mutation consiste en la délétion d'un acide aminé, une phénylalanine en position 508,
15 due à une mutation portant sur le dixième exon du gène. L'incidence des mutations dans la population se situe aux environs de 1 sur 3000 naissances, mais seuls les sujets homozygotes sont malades. L'espérance de vie est autour de 35 ans dans les pays développés. Les hétérozygotes ou porteurs sains, phénotypiquement normaux, représentent environ 4 % de la population
20 générale.
Une des principales conséquences de cette maladie est la modification de la composition du mucus (dont la viscosité devient plus élevée que la normale) sécrété principalement par les épithélia sécrétoires des muqueuses respiratoires et digestives. En effet, l'altération du canal CFTR provoque des
25. changements des flux trans-épithéliaux d'ions qui rendent le mucus plus visqueux et plus épais, empêchant ainsi sa progression vers la glotte, chez les patients mucoviscidosiques. Cet excès de mucus et l'absence de clairance mucociliaire favorisent l'infection chronique par des bactéries opportunistes (telles que Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Haemophilus
30 influenzae), ce qui peut engendrer une réponse inflammatoire exacerbée au niveau des voies aériennes, caractérisée par un afflux massif de neutrophiles. Ces agents pathogènes sont responsables de la plupart des épisodes d'infections bronchiques. L'absence de contrôle de ce processus inflammatoire, souvent associé à une obstruction bronchique, provoque la destruction des tissus pulmonaires entraînant ainsi une perte progressive de la fonction respiratoire jusqu'au décès du malade.
Cette maladie est également caractérisée par des troubles digestifs dus essentiellement à une insuffisance pancréatique exocrine présente chez 90 % des malades. Ces manifestations respiratoires et digestives dominent le tableau clinique, mais l'atteinte respiratoire conditionne le pronostic vital des patients.
L'infection chronique à P. aeruginosa constitue le problème infectieux principal et marque le plus souvent un tournant évolutif péjoratif de la maladie. Certaines souches dites "mucoïdes" se développent au sein du mucus sous la forme de microcolonies entourées d'une matrice exopolysaccharidique.
Ce caractère mucoïde est pratiquement spécifique de l'infection. L'incidence des souches mucoïdes augmente avec l'âge et l'évolutivité de la maladie respiratoire. L'atteinte bronchopulmonaire évolue par poussées qui conduisent en quelques mois ou plusieurs dizaines d'années à l'insuffisance respiratoire chronique. Des complications comme les pneumothorax récidivants ou des hémoptysies peuvent aggraver le pronostic vital.
Le décès survient en règle générale à la suite d'une exacerbation des signes respiratoires d'allure infectieuse accompagnés de signes d'insuffisance cardiaque droite ou globale dans environ 1/3 des cas. A l'heure actuelle la mucoviscidose ne peut être traitée que de façon symptomatique. La prise en charge repose essentiellement sur la kinésithérapie respiratoire et un traitement anti-infectieux par antibiothérapie. Outre sa lourdeur, ce traitement doit être suivi à vie.
L'antibiothérapie doit obéir à un certain nombre de principes généraux contraignants : choix approprié des antibiotiques, prévention des résistances du fait de la chronicité de l'infection bronchique, fortes posologies sur des cures de longues durées (deux semaines au minimum), voie d'administration uniquement parentérale pour les antibiotiques antipyocyaniques.
Des molécules permettent de fluidifier le mucus et notamment la rhDNase, enzyme catalytique d'hydrolyse de l'ADN extracellulaire qui permet de diminuer la viscosité du mucus alors plus facile à évacuer par la kinésithérapie. En cas d'insuffisance respiratoire chronique évoluée, une oxygénothérapie nocturne devient nécessaire. Mais, la transplantation pulmonaire reste l'ultime recours.
Il existe donc toujours une demande pour un traitement préventif et/ou curatif des symptômes qui n'aurait pas la lourdeur des traitements actuels (sans parler de la transplantation) et qui conférerait aux patients une amélioration de leurs conditions de vie.
C'est un des buts de la présente invention.
L'infection par un agent pathogène comme Pseudomonas aeruginosa entraîne l'activation de protéines inflammatoires comme la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2). Cette dernière se déplace vers la membrane plasmique pour hydrolyser les phospholipides et libérer de l'acide arachidonique (AA).
L'AA est alors métabolisé par deux voies enzymatiques distinctes, impliquées dans l'inflammation : la voie des cyclooxygénases (COX) qui aboutit à la production de prostaglandines, en particulier la prostaglandine E2 (PGE2) ; et la voie des lipooxygénases qui aboutit à la production des leukotriènes, en particulier le leukotriène B4 (LTB4).
Des études antérieures ont montré la présence d'une quantité augmenté de leukotriène B4 (LTB4) et de prostaglandine E2 (PGE2) dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA) des patients atteints de mucoviscidose (patients CF). Cette augmentation a aussi été retrouvée dans un modèle animal de mucoviscidose chez des souris KO (Knock Out) dont le gène codant pour CFTR a été délété, donc ne produisant pas de protéine CFTR (souris mutantes dites CFTR";~). Il a par ailleurs été établi que le LTB4 et la PGE2 sont capables d'induire la sécrétion de mucus. Les inventeurs ont posé l'hypothèse d'un lien entre l'existence de mutation du gène CFTR, agent causal de la mucoviscidose, et la sécrétion accrue de mucus dans le poumon, au travers d'une activité accrue de la cPLA2.
Les inventeurs ont alors montré que des souris CFTR''", stimulées par instillation avec du lipopolysaccharide (LPS) de Pseudomonas aeruginosa qui provoque une inflammation des voies respiratoires, sécrètent plus de mucus que des souris sauvages.
Par instillation on entend une administration par voie aérienne, plus précisément par voie intratrachéale. Les inventeurs ont également montré que cette sécrétion de mucus est inhibée par l'aspirine, un inhibiteur des COX.
De même, l'étude par les inventeurs de la sécrétion de mucus dans les voies respiratoires des souris KO dont le gène codant pour la cPLA2 a été délété (souris mutante cPLA2"A) montre que celle-ci est totalement abolie. La cPLA2 joue donc également un rôle dans la régulation de sécrétion du mucus dans les voies respiratoires.
Le mucus est constitué essentiellement de mucines (glycoprotéines) et MUC5AC est l'une des mucines les plus abondantes dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose.
Là encore, les inventeurs ont pu montrer par marquage immuno- histochimique que MUC5AC est bien exprimée chez les souris CFTR"7" qui présentent une augmentation de la quantité de mucus dans les voies respiratoires. Les inventeurs ont donc confirmé l'hypothèse qu'ils avaient émise en démontrant pour la première fois chez les souris CFTR"7", une relation, probablement directe, entre au moins une mutation du gène CFTR, responsable de la mucoviscidose, et la sécrétion de mucus, liée à une suractivation de cPLA2. La mesure de l'activité cPLA2 dans des homogénats bronchiques d'expiants de poumons de patients CF ayant reçu ou non de I1ATK confirme cette possibilité.
Enfin, les inventeurs ont pu montrer que l'administration par voie intra- péritonéale d'un inhibiteur spécifique de la cPLA2 abolit totalement la sécrétion de mucus dans les voies respiratoires, sécrétion préalablement induite par instillation de LPS de Pseudomonas aeruginosa chez les souris CFTR";", qui expriment la cPLA2 à des niveaux élevés par rapport aux souris CFTR+/+.
Ces résultats permettent pour la première fois, d'envisager l'utilisation d'un inhibiteur de cPLA2 dans le traitement symptomatique de la mucoviscidose. Ces résultats, surprenants et inattendus, permettent de penser à un rôle thérapeutique, préventif et/ou curatif, des inhibiteurs de la cPLA2 dans le traitement des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus comme par exemple la mucoviscidose, mais aussi l'asthme, les maladies pulmonaires chroniques obstructives (MPOC) comme par exemple les laryngites et pharyngites, les pneumonies, les grippes, les pneumoconioses, la bronchite chronique et l'emphysème ou encore l'asthme aspergillaire.
Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique préventif et/ou curatif de la mucoviscidose, particulièrement de la sécrétion accrue de mucus par les épithélia sécrétoires des muqueuses respiratoires et digestives.
Par inhibiteur de la cPLA2 on entend toute molécule chimique ou biologique, naturelle ou synthétique, toute composition qui, quel qu'en soit le mécanisme, induit après administration une diminution, voire une inhibition complète, de l'activité de la cPLA2 ou de l'expression du gène de la cPLA2. A titre d'exemple on peut citer comme inhibiteur de la cPLA2, l'ATK (Arachidonyl
Trifluoromethyl Ketone ; Ackermann et al., J. Biol. Chem., 1995; 270 : 445-50), la Pyrrolidine-1 (Seno et al., J. Med. Chem. 2000 ; 43: 1041-44), le MAFP
(Methyl arachidonyl fluorophosphonate : Lio et al., Biochim. Biophys. Acta ;
1996 ; 1302: 55-60), le ML3196 (Lehr, J. Med. Chem., 1997, 40 : 2694-2705), la
4-[4-[2-[2-[bis(4-chlorophényl)méthoxy]éthyl-sulfonyl]éthoxy]phényl]-1 ,1 ,1- trifluoro-2-butanone, BMS-229724, (Burke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001 , 298 : 376-85), l'acide 3,3-Dimethyl-6-(3-lauroylureido)-7-oxo-4-thia-1- azabicyclo[3,2,0] heptane-2-carboxylique ou encore les indoles décrits dans la demande internationale WO 03/048122, ainsi que les composés cités dans les brevets US 6,630,496 ou encore US 6,350,892.
Selon une mise en œuvre particulière de l'invention, l'inhibiteur de la cPLA2 est un siRNA interférant avec l'expression du gène de la cPLA2.
Préférentiellement, l'inhibiteur de la cPLA2 utilisé selon l'invention est l'ATK.
Selon une autre forme de mise en œuvre de l'invention, il est possible d'utiliser une combinaison d'inhibiteurs de la cPLA2 (2 ou plus) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus, notamment au traitement symptomatique de la mucoviscidose.
Selon l'invention, l'inhibiteur de la cPLA2 est utilisé dans la préparation d'un médicament destiné au traitement de la mucoviscidose. Il peut aussi être envisagé que l'inhibiteur de la cPLA2 soit utilisé dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique de la sécrétion accrue de mucus dans l'asthme, les maladies pulmonaires chroniques obstructives (MPOC) comme par exemple les laryngites et pharyngites, les pneumonies, les grippes, les pneumoconioses, la bronchite chronique et l'emphysème ou encore l'asthme aspergillaire.
Selon l'invention l'inhibiteur de la cPLA2 peut être utilisé dans le médicament en une quantité comprise entre 0,01 mg à 2g, préférentiellement de 1 mg à 1g, très préférentiellement de 10mg à 500mg.
Plus particulièrement, l'inhibiteur de la cPLA2 tel que, par exemple PATK, peut notamment être administré à des doses comprises entre 0,1 mg/Kg et 500 mg/Kg, préférentiellement 1 mg/Kg à 100 mg/Kg, très préférentiellement 10 mg/Kg à 50 mg/Kg. Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement symptomatique » désigne le traitement préventif et/ou curatif des symptômes liés à la maladie. Ce traitement améliore de plus la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie etc.). Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres ingrédients ou traitements, tels que notamment d'autres composés actifs pour traiter les pathologies ou traumatismes spécifiés dans la présente demande.
Par exemple on sait que les essais de thérapie génique par voie aérienne de la mucoviscidose n'ont donné que des résultats moyens, loin des espoirs qu'ils avaient pu susciter. En fait, dans le traitement par thérapie génique par voie aérienne consistant à instiller dans les poumons (par exemple à l'aide d'aérosol) un vecteur de type acide nucléique porteur d'un gène CFTR non muté et fonctionnel afin qu'il atteigne les cellules épithéliales de la surface des poumons, le vecteur se heurte à la couche de mucus recouvrant lesdites cellules. Le mucus empêche ainsi le vecteur d'atteindre sa cible, tout au moins en quantité suffisante et ce malgré les traitements préalables à l'aide de fluidifiants du mucus sensés débarrasser la surface des alvéoles pulmonaires de sa barrière de mucus. On comprend alors tout l'intérêt de disposer d'un médicament inhibant la sécrétion de mucus qui pourrait être administré en complément d'une thérapie génique par voie aérienne. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique de la sécrétion accrue de mucus de la mucoviscidose, ledit médicament devant être administré en complément d'une thérapie génique de la mucoviscidose.
Le médicament selon l'invention peut prendre toutes les formes imaginables pour son administration. Par exemple il peut être liquide comme un sirop ou une solution pour injection intramusculaire ou intraveineuse ou solide comme par exemple une poudre ou un comprimé.
L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale, voie aérosol, ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra- veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée. S'agissant d'un traitement à long terme, la voie d'administration préférée sera sublinguale, orale ou transcutanée.
En général la dose journalière d'inhibiteur de la cPLA2 utilisée selon l'invention sera la dose minimum pour obtenir l'effet thérapeutique recherché. Cette dose dépendra de différents facteurs comme du poids du sujet à traiter. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée.
La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le composé, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine. Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint d'une pathologie telle que définie ci-dessus. Les médicaments selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est-à-dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les médicaments peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.
Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter aucunement.
Matériel et Méthodes » Modèles animaux
Les études ont été effectuées sur un modèle de mucoviscidose établi chez des souris C57BL/6J (souris C/ifrtmUNC) maintenues sur un fond génétique mixte par le "Centre de Distribution, de Typage et d'Archivage Animal" UPS44 CNRS à Orléans. Les souris sauvages CFTR+/+ et mutantes CFTR'7" ont été sevrées à 3-4 semaines et nourries avec une alimentation supplémentée avec un laxatif commercial, le Movicol®. En effet, en absence de laxatif les souris CFTR'7" décèdent rapidement après le sevrage, suite à des occlusions intestinales consécutives à une altération de la sécrétion de fluides dans le tractus digestif.
Les expériences ont été menées sur des groupes d'au moins 5 souris par catégories de traitement, âgées de 5-7 semaines.
Des souris mutantes cPLA2'7" et leurs homologues sauvages cPLA2+/+, de même fond génétique ont été obtenues auprès du "Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Tokyo" (Uozomi et al., Nature, 1997). Ces souris étaient âgées de 6-8 semaines au moment de l'expérience.
• Produits et réactifs utilisés Xylazine (Rompum, Bayer-France) Kétamine (ImalgènelOOO Merial, Lyon-France)
LPS de P. aeruginosa, sérotype 10 (Sigma, St.Louis, MO) EDTA, phénylméthylsulphoxide et dithiothréitol (Sigma, St.Louis, MO) Anticorps anti-MUC5AC (clone 45 M1 , Neomarkers, Fermont, CA, USA) Anticorps anti-lgG de souris (Dako Cytomation Envision System). Amino Ethyl Carbazol (Sigma, St. Louis, MO).
• Protocole expérimental
Les produits utilisés ont été dissous dans de la solution saline injectable (ou sérum physiologique) et injectés par voie intratrachéale (i.t.) ou intrapéritonéale (i.p.). Le protocole d'utilisation était le suivant :
1) Aspirine (50 mg/Kg, i.p.), 30 min avant le LPS, ensuite chaque jour, une fois par jour ;
2) ATK (20 mg/Kg, i.p.), 30 min avant le LPS et 24 h après.
Les souris ont été anesthésiées avec la Xylazine 2 % (8 mg/Kg) et la Kétamine 1000 (40 mg/Kg) avant l'instillation du LPS (330 μg/Kg, i.t.).
Les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les prélèvements des poumons ont été effectués 4 jours après l'instillation du LPS, comme indiqué ci-dessous : » Lavages bronchoalvéolaires (LBA)
Les souris ont été anesthésiées avec du Pentobarbital (i.p.) à 200 mg/Kg et leurs trachées incisées et canulées. Les LBA ont été effectués avec des lavages successifs par 1 ml de solution saline injectable contenant 5 mM d'EDTA et des inhibiteurs de protéases (phénylméthylsulphoxide : 5 mM, dithiothréitol 5 mM).
Le comptage des cellules a été effectué par un compteur automatique Counter ZM (Coultronic, Margency, France). Cela permet de mettre en évidence l'état d'inflammation des poumons.
L'identification des types cellulaires a été obtenue par coloration Diff-Quick (Baxter Dade AG, Dudingen, Allemagne) après cytocentrifugation (Hettich- Universal). Cela permet de compter la proportion des cellules polynucléaires neutrophiles qui reflètent l'inflammation.
Les résultats sont exprimés en nombre de cellules par ml de LBA. • Détection de MUC5AC par test ELISA
50 μl de chaque échantillon de lavage (LBA) ont été incubés pendant 1 heure avec 50 μl d'un mélange bicarbonate-carbonate (50/50) à 400C dans les puits de plaques 96 puits (Nue).
Après séchage, les puits ont été lavés 3 fois avec du PBS puis saturés avec de la BSA 2%, fraction V (Sigma) pendant 1 h à température ambiante.
Les puits ont été de nouveau lavés 3 fois avec du PBS. 50 μl d'anticorps primaire dirigé contre MU5AC (clone 45 M1) dilué au 1/100 dans du PBS/Tween20 0,05% ont ensuite été déposés dans chaque puit et l'incubation s'est poursuivie 1 h à température ambiante. Les puits ont été de nouveau lavés 3 fois avec du PBS. 100 μl d'anticorps secondaire anti-lgG de souris conjugué à de la peroxydase (1 : 10 000) ont ensuite été déposés dans chaque puit et l'incubation s'est poursuivie 1h à température ambiante.
Après 3 lavages des puits au PBS, la présence de la protéine a été révélée à l'aide de 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) peroxydase, puis la réaction a été arrêtée avec 1M de H2SO4. L'absorbance a été mesurée à 450nm. Les résultats sont exprimés en milligramme de protéine par ml de LBA. » Fixation des poumons et analyses histologiques Les poumons ont été perfusés par du formaldéhyde à 4%, pour éliminer le sang et immergés dans 4 % de formaldéhyde pendant 48 h à 4° C avant d'être inclus dans la paraffine.
Des coupes de 5 μm d'épaisseur ont été colorées avec l'Hemotoxylin/Eosin, le periodic acid-Schiff (PAS) et le bleu Alcian (Alcian blue : AB ; pH 2,4) selon les méthodologies standards (Histologie Normale et Pathologique. P. GANTER & G. Jolies, éditions Gauthier-Villars).
Après lecture au microscope des coupes colorées au bleu Alcian, qui colore le mucus, un comptage des bronches et des cellules positives est réalisé. Le rapport « nombre de bronches positives / nombre de cellules positives » permet d'établir le score qui sert à évaluer les résultats des études de production de mucus (voir infra).
• Immunohistochimie Les sections de paraffine ont été traitées avec l'anticorps dirigé contre
MLJ5AC (clone 45 M 1) pendant 2 h à température ambiante, à la concentration de 8 μg/ml dans du PBS 1X.
Ces sections ont été ensuite lavées avec du PBS et incubés 30 min avec l'anticorps anti-lgG de souris, conjugué avec de la peroxydase. Les révélations ont été effectuées avec de l'Amino Ethyl Carbazol.
• Western blot
Les poumons de souris ont été homogénéisés avec du tampon de lyse (Tampon RLT de Quiagen). Les homogénats ont été centrifugés, et des quantités équivalentes de protéines (10 - 50 μg) ont été déposées sur le gel d'électrophorèse à 7,5% (Tris/Glycine/SDS-polyacrylamide).
Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Millipore) préalablement traitée avec du PBS à 5% de lait / Tween 1%o.
La membrane a alors été incubée 1h à température ambiante en présence de l'anticorps primaire, puis lavée 3 fois au PBS/Tween 1%o.
La membrane a alors été incubée 1h à température ambiante en présence de l'anticorps secondaire, puis lavée au PBS/Tween 1%o.
La présence des protéines sur la membrane a alors été révélée à l'aide du système ECL (Amersham 2106) qui produit de la chemi-luminescence avec la peroxydase, selon les recommandations du fournisseur. La membrane a ensuite été exposée au contact d'un film radiographique et ce dernier développé.
Un contrôle Actine permet de normaliser le taux d'expression de la protéine MU5AC. L'intensité des bandes est mesurée avec un analyseur d'image.
« Mesure de l'activité cPLA2 dans des homogénats bronchiques d'expiants de poumons de patients CF. Les mesures ont été réalisées selon Kramer et col. (Biochem. J. et al. 248: 779-785 (1987)), avec les modifications apportées par Hidi et col. (J. Immunol. 151 : 5613-5623 (1993)).
Les homogénats de poumons ont été préparés selon Filgueiras et col. (Lipids 22 : 731-735, (1987)).
50 - 100 μl d'homogénats de poumon ont été incubés dans du tampon Tris-Hcl contenant 1 mM de calcium et 100 000 cpm/ml de la phosphatidylcholine radioactive (1-palmitoyl-214C-arachidonoyl-sn- glycerophosphorylcholine à 52 mCi/mmole, Amersham). Après une incubation de 30 min, les réactions sont arrêtées par l'addition d'une solution de chloroforme/méthanol (1:1).
Les lipides ont été extraits par la méthode de Bligh et Dyer (Can. J.
Biochem (1959) 37 :911-918), puis évaporés à sec et soumis à une chromatographie sur couche mince, (Merck) en présence de chloroforme/méthanol/ acide acétique /eau (65 43, 1 , 3) à titre de solution de migration.
Les taches correspondant à la phosphatidylcholine (PC) ont ensuite été récupérées et leur radioactivité est mesurée en utilisant du liquide de scintillation standard. L'activité cPLA2 a été exprimée en coup par minute (cpm).
Résultats :
> Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+/+ et CFTR'7' au 4Ieme jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa. Les souris « contrôle » ont reçu une dose de sérum physiologique.
Tableau 1 :
Ces résultats montrent l'implication du gène CFTR et de la protéine CFTR dans la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique.
> Mesure de la quantité de la protéine MUC5AC sécrétée dans les poumons de souris CF (CFTR-/-) et sauvage (CFTR+/+) avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa (test ELISA)
Tableau 2
Les souris CF sécrètent plus de MUC5AC dans les LBA aussi bien dans les conditions basales qu'après traitement au LPS comparées avec les souris WT.
* P < 0,001 CF souris comparées aux WT ;
# P <0,001 LPS comparé au contrôle.
> Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+/+ et CFTR4" au 4ιeme jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa et avec administration d'aspirine (asp)
Les souris « contrôle » ont reçu une dose de sérum physiologique et une dose d'aspirine.
Tableau 3
Les scores obtenus sont à comparer aux scores correspondants du tableau 1.
Ces résultats montrent qu'un inhibiteur de COX entraîne une inhibition de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique, et confirme l'implication des COX dans cette production.
> Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+/+ et CTFR"7' au 4lème jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa et administration d'ATK.
Les souris « contrôle » ont reçu une dose de sérum physiologique et une dose d'ATK. Tableau 4
Les scores obtenus sont à comparer aux scores correspondants du tableau 1.
Ces résultats montrent qu'un inhibiteur de la cPLA2 entraîne une inhibition de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique.
> Production de mucus dans les voies respiratoires de souris cPLA2+/+ et cPLA2"/- au 4ιeme jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa.
Les souris « contrôle » ont reçu une dose de sérum physiologique. Tableau 5
Ces résultats démontrent l'implication de la cPLA2 dans la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique.
> Mesure de la quantité d'ARN messagers de la MUC5AC dans des homogénats bronchiques de souris CFTR+/+ et CTFR-/- avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa, par Western blot L'anticorps primaire utilisé est un anticorps monoclonal anti-MUC5AC (clone 45 M1 , Neomarkers, Fermont, CA, USA)
L'anticorps secondaire utilisé est un anticorps anti-lgG de souris (Dako Cytomation Envision System).
Pour chaque échantillon la mesure de la quantité est rapportée à la mesure de la quantité d'ARN messager de l'actine mesurée dans le même échantillon pour normalisation (ARNm MUC5AC/ARNm Actine).
Tableau 6
Ces résultats confirment l'augmentation des ARNm de MUC5AC chez les souris CF stimulées ou non.
* P < 0,001 CF comparées aux WT;
> Mesure de la quantité d'ARN messagers de la MUC5AC dans des homogénats bronchiques de souris CFTR+/+ avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa et administration ou non d'ATK, par
Western blot.
Dans des conditions identiques à l'expérience précédente, les résultats montrent que l'expression des ARNm de MUC5AC est totalement inhibée chez les souris CFTR+/+ non stimulées et une très faible quantité d'ARNm de MUC5AC chez les souris CFTR+/+ stimulées.
> Mesure de la quantité d'ARN messagers de la cPLA2 dans des homogénats bronchiques de souris.
L'anticorps primaire utilisé est un anticorps monoclonal anti-cPLA2 (CeII Signaling ou Santa-Cruz).
L'anticorps secondaire utilisé est un anticorps anti- souris (Dako Cytomation Envision System).
Pour chaque échantillon la mesure de la quantité est rapportée à la mesure de la quantité d'ARN messager de l'actine mesurée dans le même échantillon pour normalisation (ARNm cPLA2/ARNm Actine). Tableau 7
Ces résultats confirment l'augmentation des ARNm de MUC5AC chez les souris CF stimulées ou non.
* P < 0,001 CF comparées aux WT.
> Mesure de l'activité cPLA2 dans des homogénats bronchiques d'expiants de poumons de patients CF. Tableau 8
Ces résultats démontrent que l'utilisation d'un inhibiteur de cPLA2 rapporte la sécrétion de mucus chez un patient CF à celle d'un patient non-CF. Analyses histologiques et études immunohistochimiques
Les analyses histologiques ou immunohistochimiques, pratiquées sur des coupes des poumons des souris confirment les résultats obtenus dans les mesures de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique de la mucoviscidose.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est toute molécule chimique ou biologique, naturelle ou synthétique, ou toute composition qui induit, après administration, une diminution, voire une inhibition complète, de l'activité de la cPLA2 ou de l'expression du gène codant pour la cPLA2.
3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est choisi parmi l'ATK, la Pyrrolidine-1 , le MAFP, le ML3196, le BMS-229724, l'acide 3,3-Dimethyl-6-(3- lauroylureido)-7-oxo-4-thia-1 -azabicyclo[3,2,0] heptane-2-carboxylique, un siRNA ou encore des indoles.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est I1ATK.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est utilisé dans le médicament en une quantité comprise 0,01 mg à 2g, préférentiellement de 1 mg à 1g, très préférentiellement de 10mg à 500mg.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans un traitement symtomatique préventif et/ou curatif.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le médicament est liquide ou solide, comme par exemple une poudre ou un comprimé.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré par voie orale, par voie aérosol ou par injection, notamment par voie intra-péritonéale, intra- veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire.
9. Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement symptomatique de la sécrétion accrue de mucus de la mucoviscidose, ledit médicament étant destiné à être administré en complément d'une thérapie génique de la mucoviscidose.
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