EP1993566A1 - Proteasen-inhibitor zur wundbehandlung - Google Patents

Proteasen-inhibitor zur wundbehandlung

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Publication number
EP1993566A1
EP1993566A1 EP07711433A EP07711433A EP1993566A1 EP 1993566 A1 EP1993566 A1 EP 1993566A1 EP 07711433 A EP07711433 A EP 07711433A EP 07711433 A EP07711433 A EP 07711433A EP 1993566 A1 EP1993566 A1 EP 1993566A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
iodine
metallo
protease inhibitor
proteases
wound
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07711433A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans Smola
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paul Hartmann AG
Original Assignee
Paul Hartmann AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paul Hartmann AG filed Critical Paul Hartmann AG
Publication of EP1993566A1 publication Critical patent/EP1993566A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L2300/432—Inhibitors, antagonists
    • A61L2300/434—Inhibitors, antagonists of enzymes

Definitions

  • the invention relates to protease inhibitors, in particular for wound treatment, and to a wound dressing and its use in modern wound treatment.
  • the activity of an enzyme can be influenced in many different ways.
  • the activity of the enzyme can be increased or decreased by influencing the enzyme protein itself, the coenzyme or the substrate. This influence can occur not only by inhibitors or activators, but also by external factors such as temperature, pH, ionic strength or the polarity of the solvent.
  • An influence of the latter factors is nonspecific by modification of the enzyme structure via surface effects, e.g. Interactions with charged groups or disturbances of the hydration shell.
  • the active center is not specifically influenced.
  • Enzyme inhibition is understood to mean the negative influence on the enzyme activity or the reduction of the catalytic activity of an enzyme or coenzyme by specific or nonspecific inhibitors or inhibitors. In this case, the inhibition can be reversible or irreversible.
  • An irreversible enzyme inhibition is usually the result of a covalent linkage of the inhibitor with the active site of the enzyme.
  • These irreversible inhibitors are substances which are first recognized by the enzyme as a substrate and taken up in the active center. There, the inhibitors enter into a solid covalent bond with amino acid residues of the active site, thereby permanently blocking it.
  • a known irreversible inhibitor is the antibiotic penicillin, which can irreversibly turn off an enzyme of bacterial cell wall synthesis.
  • the so-called reversible enzyme inhibition is basically reversible and plays a crucial role in the fine regulation of metabolism in living organisms. Reversible inhibition is further distinguished into competitive inhibition and non-competitive inhibition.
  • competitive inhibition the substrate competes with the inhibitor for binding to the active site of the enzyme. Because the substrate and the Inhibitor can not simultaneously bind to the enzyme and the inhibitor, in contrast to the substrate is not enzymatically implemented, the measurable enzyme activity is reduced. As the concentration of the inhibitor increases, increasing displacement of the substrate occurs, resulting in a decrease in enzyme activity. Increasing the substrate concentration reverses this process and allows for increased substrate conversion.
  • the inhibitor outside the active site binds to both the free enzyme and the enzyme / substrate complex. The binding of the inhibitor does not lead to the inhibition of substrate binding, but to a conformational change of the enzyme, which is thereby inactivated. The binding of the inhibitor and the inactivation of the enzyme take place independently of the presence of substrate.
  • Proteases are enzymes that catalyze the hydrolytic cleavage of a peptide bond in proteins and peptides (proteolysis). Proteases thus belong systematically to the group of hydrolases. Proteases are subdivided with respect to the cleavage site in the substrate. Thus, the cleavage of peptide bonds in the interior of peptides or proteins is catalyzed by endopeptidases (proteinases), whereas peptide bonds at the end of a peptide or protein molecule are cleaved by exopeptidases (formerly peptidases).
  • proteases are distinguished from one another.
  • the group of metallo proteases (metallo-peptidases) have metal ions in their active center involved in the catalytic mechanism of proteolysis. These metal ions, especially divalent metal cations such as magnesium, zinc, calcium, iron and the like are also considered coenzyme.
  • metallo-endopeptidases metalloproteinases
  • metallo-exopeptidases metallo-exopeptidases
  • Matrix metallo-proteases also called matrixins - belong to a family of proteases that have been defined by structural homologies. Their enzymatic activity is dependent on metal ions in the active center. Metallo proteases were first identified by their role in tissue remodeling, particularly by degradation of the extracellular matrix. Systematically, this group of proteases belongs to the metallo-endopeptidases (metalloproteinases). Among the matrix metalloproteinases include other collagenases, gelatinases, stromeolysins, matrilysin and others. For a review and classification see Parks, Matrix Metalloproteinases, Biology of Extracellular Matrix Series, Ed.
  • Serine proteases have an essential for catalysis L-serine residue in the active center, which can be inhibited by diisopropylfluorophosphate. These proteases are also assigned a crucial function in wound healing.
  • the group of serine proteases include, for example, chromotrypsin, elastase, kallikrein, plasmin, trypsin, thrombin and others.
  • Most known serine proteases have, in addition to the L-serine residue in their active center, the residues of the amino acids L-histidine and L-asparagine. All three amino acid residues participate in the protolysis of a cascade of reactions in which a proton of the L-serine residue is transferred to the substrate. Insofar as a serine-dependent mechanism is found in proteinases, one also speaks of serine proteinases.
  • MMP Matrix metallo-proteases
  • Matrix metalloproteases are believed to play a crucial role in wound healing.
  • keratinocytes require matrix metallo proteases to migrate across the provisional matrix for epithelial wound closure (Pilcher et al., 1997, Beare et al., 2003, Mirastschijski et al., 2004).
  • These metallo proteases are formed in cells as inactive pro form, secreted from the cell and activated in the extracellular milieu (limited proteolysis). They are characterized by structural similarities and require divalent ions in the active site for proteolytic activity. Only after activation and in the presence of Ca 2+ or Zn 2+ ions can they degrade the respective substrates (review in Nagase and Woessner 1999).
  • telopeptides After secretion and cleavage of the telopeptides under normal circumstances, the organization of the individual collagen molecules into a three-dimensional fibril takes place. Collagen fibrils interact with other molecules of the extracellular matrix, and together with the cells in the mesenchyme, this structure is called connective tissue. An excess of metallo proteases interferes with these processes. Re-formed collagen is degraded after it is released from the cells, and the breakdown products appear to provide the cells with information that negatively impacts normal wound healing.
  • a means is to be provided which influences the pathological condition of a wound in such a way that a normal, natural wound healing process can take place.
  • a metallo-protease inhibitor from the group iodine or iodophores is achieved by a metallo-protease inhibitor from the group iodine or iodophores.
  • iodine or iodophores inactivate matrix metallo proteases as inhibitors.
  • the problem is solved in a preferred manner of matrix metallo-protease inhibitors from the group iodine or iodophores.
  • iodophores comprising iodine and a synthetic polymer.
  • an iodophore is to be understood as meaning a substance which binds iodine in complex fashion and releases iodine.
  • the iodine is not bound to a carrier molecule via a fixed chemical bond, but is merely bound or incorporated via electrochemical bonding to or into a carrier molecule, the chemical properties of the iodine or of the carrier material remaining unchanged.
  • iodine is meant both elemental iodine and iodide ions.
  • Such iodide ions may be, for example, simply negatively charged ions of the form I " , I 3 " , I 5 " , I 7 " or Ig ⁇ .
  • a metallo-protease or matrix metallo-protease should furthermore be understood as meaning those metalloprotease or matrix metalloproteases which are of vertebrate origin.
  • the metallo-protease inhibitor or the matrix metallo-protease inhibitor is selected from the group of the polyvinylpyrrolidone-iodine complexes, that is to say the iodophore consists of a polyvinylpyrrolidone-iodine complex.
  • the poorly water-soluble iodine is reversibly bound in a helical structure of the polyvinylpyrrolidone (PVP) as an I 3 " anion through hydrogen bonding between the carbonyl groups of two pyrrolidone rings, through the ratio of about 18 iodine-free pyrrolidone rings to one with iodine occupied ring, the substance is readily soluble in water.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • Equation (2) In aqueous solutions, an equilibrium (equation (2)) arises, which can be formulated as follows:
  • the complex-bound iodine forms a kind of reservoir, which can be released when needed, ie in the presence of suitable enzymes.
  • the average molecular weight of the iodine-PVP is about 30,000 to 55,000 g / mol.
  • iodine-PVP is a brownish powder containing a content of 9-12% by weight of available iodine and a maximum of 6.6% by weight of iodide. The proportion of active iodine is thus preferably 9-12%.
  • a metallo-protease inhibitor selected from the group consisting of iodine or iodophore for the manufacture of an agent for the treatment of chronic wounds.
  • a matrix metallo-protease inhibitor from the iodine or iodophore group for the preparation of an agent for the treatment of chronic wounds.
  • iodine or iodophores is used as metallo-protease inhibitor, in particular matrix metallo-protease inhibitor for the treatment of chronic wounds.
  • metallo-protease inhibitor in particular matrix metallo-protease inhibitor for the treatment of chronic wounds.
  • the use of iodine or iodophores to inhibit metallo proteases, particularly matrix metallo proteases, is also provided in chronic wounds.
  • iodine or iodophores as metallo-protease inhibitors, preferably as matrix metallo-protease inhibitors, for the preparation of an agent for the treatment of chronic wounds. It also provides the use of iodine or iodophores to prepare an agent for inhibiting metallo-proteases, particularly matrix metallo-proteases, in chronic wounds. It is further particularly preferred to use a metallo-protease inhibitor or a matrix metallo-protease inhibitor from the iodine or iodophore group for the preparation of an agent for the topical treatment of chronic wounds.
  • the agents contemplated by the present invention are topical agents for external application to the wound. These agents may be in the form of a gel, ointment or solution. It can also be provided that a topical agent in the form of a gel, an ointment or a solution is applied or incorporated onto a carrier material, such as, for example, a fleece, a nonwoven or a textile material, for example a knitted or woven fabric.
  • a carrier material such as, for example, a fleece, a nonwoven or a textile material, for example a knitted or woven fabric.
  • Iodine and iodophores have long been known as disinfectants, antiseptics or as fungicides in wound treatment and thus also in the treatment of chronic wounds. Surprisingly, however, it has been found that these substances are capable of inhibiting metalloproteases and in particular matrix metalloproteases, and thus in particular as metalloproteinase inhibitors or as matrix metalloproteinase inhibitors for the treatment can be used by chronic wounds. Their antiseptic effectiveness is unaffected.
  • the metallo-protease inhibitor or the matrix metallo-protease inhibitor can be selected from the group of iodophores, the iodophore comprising iodine and a synthetic polymer.
  • iodophores which comprise iodine and a synthetic polymer from the group of polyvinylpyrrolidones.
  • metalloproteinase inhibitors or matrix metalloproteinase inhibitors comprising iodine or an iodophore comprising 9-12% by weight of active iodine can be used.
  • Chronic wounds can be defined as wounds whose healing process deviates from normal wound healing in one or all stages of wound healing.
  • acute wounds such as wound infection
  • the transition from an acute to a chronic wound can take place at any stage of wound healing.
  • Clinically, chronic wounds are defined as wounds whose healing takes more than 6-8 weeks, although this definition does not cover all clinical pictures correctly. It Chronic wounds are more a diagnosis based on the clinical experience of the medical staff.
  • Chronic wounds occur in particular due to mechanical stress (pressure ulcers, pressure ulcers, pressure ulcers), venous insufficiency (ulcus cruris venosum, venous ulcers), arteriosclerotic vessel change (ulcus cruris arteriosum, arterial ulcers), neuropathic changes (diabetic foot syndrome, neuropathic Ulzera), but also as a result of autoimmune diseases, tumors (exulsive tumors) or radiation damage in tumor therapy.
  • a metallo-protease inhibitor or a matrix metallo-protease inhibitor from the group iodine or iodophores for the preparation of an agent for the treatment of decubitus, venous leg ulcers, leg ulcers or diabetic Foot syndrome Subject of the present invention.
  • the tissue structure is promoted by the elimination of the wound healing disturbing mechanisms, which is clinically noticeable in an improvement of the wound state and the reduction of wounds.
  • Pressure ulcers are defined as trophic disturbances of tissues (especially skin and subcutaneous tissue) caused by external, usually longer-term pressure with compression of vessels and local ischaemia, with necrosis, maceration and possibly infection. Decubitus occurs mainly in bed rest, especially at body sites where the skin is directly adjacent to the bone, but also e.g. under badly fitting dentures and too narrow plaster casts.
  • the decubitus ulcer is divided into the following stages. Deco Stages Stage II, Stage III and Stage IV are known as chronic wounds in particular:
  • Muscles, bones, or supporting structures (tendons, joint capsules).
  • the decubitus shows clinically as a large, open and deep ulcer.
  • a wound dressing comprising a metallo-protease inhibitor or a matrix metallo-protease inhibitor selected from the group consisting of iodine or iodophore is also an object of the present invention.
  • the inhibitor in solid form as particles or in liquid form as a dissolved substance in a solvent on a carrier material, in particular a fiber material or be introduced.
  • a wound dressing comprising a carrier material, in particular a fiber material comprising a metallo-protease inhibitor or a matrix metallo-protease inhibitor selected from the group iodine or iodophore, for the manufacture of an agent for the treatment of chronic wounds subject of the present invention.
  • Wound exudate with high protease activity was obtained from patients with chronic wounds and with different concentrations of PVP-iodine solution (Braunol 2000, B. Braun AG, Melsung - Germany or Betaisadona, Mundipharma GmbH, Limburg - Germany, commercial preparations with 10% PVP- iodine) for 30 min. - 2 hrs. Incubated. Subsequently, the treated wound secretions were examined in zymograms for the presence of MMP activity (MMP-2 and MMP-9).
  • This technique is extremely sensitive and is based on a separation of the proteases in an SDS gel, which simultaneously contains a protease substrate (gelatin).
  • the gel is composed of (all chemicals Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim - Germany):
  • the gels can be cast in various commercial gel apparatus and prepared for electrophoretic separation. The person skilled in such apparatuses are known.
  • the sample application buffer may be any protein application buffer that is not allowed to receive reducing substances.
  • the proteases are renatured (wash for 2x15 min in 2.5% Triton-X-100 in H 2 O, then wash for 2 x 15 min in 50 mM Tris / HCl pH 7.4, 5 mM CaCl 2 ) and incubated for 24-48 hr in the last wash buffer.
  • the renatured metallo proteases degrade the gelatin substrate in their immediate vicinity. If these zymograms are stained with a protein dye (Coomassie CAS No.
  • FIG. 1 shows the result of an examination.
  • 10 ⁇ g of wound exudate-protein mixture (WF) was used as described above Zymogram experimental setup examined.
  • Wound exudate was obtained from 4 patients with poorly healing wounds (ulcus cruris venosum).
  • 9 aliquots (samples of a patient 10-18) with in each case 10 ⁇ l of wound exudate-protein mixture with different concentrations of iodine-polyvinylpyrrolidone (Braunol 2000, B. Braun AG, Melsung-Germany) according to Table 2 were used in a parallel batch. added.
  • Each sample of Sample 10 to 18 (10 ⁇ g protein, wound fluid-protein mixture) is diluted to 16 ⁇ l with 0.9% NaCl.
  • 4 ⁇ l of iodine-PVP solution 1 to 8 (L1 to L8) are added and analyzed by the method described above.
  • the solutions L1 to L8 are prepared as follows:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Protease-Inhibitoren ausgewählt aus der Gruppe von Verbindungen, die lod oder lodophore umfassen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden.

Description

Titel: Proteasen-Inhibitor zur Wundbehandlung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Proteasen-Inhibitoren insbesondere zur Wundbehandlung sowie eine Wundauflage und dessen Verwendung in der modernen Wundbehandlung.
Die Aktivität eines Enzyms kann auf verschiedenste Art und Weise beeinflusst werden. So kann beispielsweise die Aktivität des Enzyms durch Einflussnahme auf das Enzymprotein selbst, auf das Coenzym oder auf das Substrat herauf oder herab gesetzt werden. Diese Einflussnahme kann nicht nur durch Inhibitoren oder Aktivatoren erfolgen, sondern auch durch äußere Faktoren wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke oder die Polarität des Lösungsmittels. Eine Beeinflussung durch die zuletzt genannten Faktoren erfolgt unspezifisch durch Modifikation der Enzymstruktur über Oberflächeneffekte z.B. Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen oder Störungen der Hydrathülle. Das aktive Zentrum wird dabei nicht gezielt beeinflusst.
Unter Enzymhemmung (Inhibition) ist die negative Beeinflussung der Enzymaktivität bzw. die Herabsetzung der katalytischen Aktivität eines Enzyms oder Coenzyms durch spezifische oder unspezifische Hemmstoffe oder Inhibitoren zu verstehen. Hierbei kann die Inhibition reversibel oder irreversibel erfolgen.
Eine irreversible Enzyminhibition ist in der Regel die Folge einer kovalenten Verknüpfung des Inhibitors mit dem aktiven Zentrum des Enzyms. Bei diesen irreversiblen Inhibitoren handelt es sich um Substanzen, welche zunächst vom Enzym als Substrat erkannt und in das aktive Zentrum aufgenommen werden. Dort gehen die Inhibitoren eine feste kovalente Bindung mit Aminosäureresten des aktiven Zentrums ein, wodurch dieses dauerhaft blockiert wird. Ein bekannter irreversibler Inhibitor ist das Antibiotikum Penicillin, welches ein Enzym der bakteriellen Zellwandsynthese irreversibel ausschalten kann.
Die so genannte reversible Enzymhemmung ist grundsätzlich umkehrbar und spielt bei der Feinregulation des Stoffwechsels in lebenden Organismen eine entscheidende Rolle. Die reversible Hemmung wird weiterhin in die kompetitive Hemmung und die nicht-kompetive Hemmung unterschieden. Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert das Substrat mit dem Hemmstoff um die Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms. Da das Substrat und der Inhibitor nicht gleichzeitig an das Enzym binden können und der Inhibitor im Gegensatz zum Substrat nicht enzymatisch umsetzbar ist, wird die messbare Enzymaktivität vermindert. Mit zunehmender Konzentration des Inhibitors findet eine zunehmende Verdrängung des Substrats statt, wodurch eine Verminderung der Enzymaktivität erfolgt. Eine Erhöhung der Substratkonzentration kehrt diesen Vorgang um und ermöglicht eine vermehrte Substratumsetzung. Im Fall der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der Hemmstoff außerhalb des aktiven Zentrums sowohl an das freie Enzym als auch an den Enzym/Substrat-Komplex. Die Bindung des Inhibitors führt nicht zur Inhibition der Substratbindung, sondern zu einer Konformationsänderung des Enzyms, das dadurch inaktiviert wird. Die Bindung des Inhibitors und die Inaktivierung des Enzyms finden unabhängig vom Vorhandensein von Substrat statt.
Proteasen (Peptidasen, Peptid-Hydrolasen) sind Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung einer Peptid-Bindung in Proteinen und Peptiden (Proteolyse) katalysieren. Proteasen gehören damit systematisch zu der Gruppe der Hydrolasen. Proteasen werden hinsichtlich des Spaltungsortes im Substrat unterteilt. So wird die Spaltung von Peptidbindungen im Inneren von Peptiden oder Proteinen durch Endopeptidasen (Proteinasen) katalysiert, wogegen Peptidbindungen am Ende eines Peptid- oder Proteinmoleküls durch Exopeptidasen (früher Peptidasen) gespalten werden.
Eine weitere Unterscheidung der Proteasen wird hinsichtlich ihrer im aktiven Zentrum für die Katalyse verantwortlichen Gruppen getroffen. So werden beispielsweise a) Serin-Proteasen, b) Cystein-Proteasen, c) Aspartat-Proteasen und d) Metallo-Proteasen voneinander unterschieden. Die Gruppe der Metallo-Proteasen (Metallo-Peptidasen) weisen beispielsweise in ihrem aktiven Zentrum Metallionen auf, die an dem katalytischen Mechanismus der Proteolyse beteiligt sind. Diese Metallionen, insbesondere divalente Metallkationen wie Magnesium, Zink, Calcium, Eisen u.a., werden auch als Coenzym betrachtet. Gemäß dem oben beschriebenen Unterscheidungsmerkmal gibt es weiterhin a) Metallo-Endopeptidasen (Metallo-Proteinasen) und b) Metallo-Exopeptidasen.
Matrix-Metallo-Proteasen (MMP) - auch Matrixine genannt - gehören zu einer Familie von Proteasen, die durch strukturelle Homologien definiert worden sind. Ihre enzymatische Aktivität ist abhängig von Metallionen im aktiven Zentrum. Metallo-Proteasen wurden zuerst durch ihre Rolle beim Gewebe-Umbau identifiziert, insbesondere durch den Abbau der extrazellulären Matrix. Systematisch gehört diese Gruppe der Proteasen zu den Metallo- Endopeptidasen (Metallo-Proteinasen). Zu den Matrix-Metallo-Proteinasen gehören unter anderem die Collagenasen, Gelatinasen, Stromeolysine, Matrilysin u.a.. Eine Übersicht und Einteilung ist in der Fachliteratur bei Parks, Matrix Metalloproteinases, Biology of Extracellular Matrix Series, Ed. Mecham, R. P., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1998) und in der unten stehenden Tabelle 1 zu finden. In dieser Tabelle 1 sind Synonyme und gegebenenfalls, die Nummerierung der Enzyme gemäß der Enzym Commision (EC) angegeben. Die Matrix-Metallo-Proteinasen werden als inaktive Vorstufen synthetisiert und sezemiert. Durch komplexe, derzeit noch nicht im Detail endgültig geklärte Mechanismen werden sie in die aktive Form überführt. Alle Metallo-Proteasen können durch Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gehemmt werden.
Serin-Proteasen weisen im aktiven Zentrum einen für die Katalyse essentiellen L-Serin-Rest auf, der durch Diisopropylfluorophosphat inhibiert werden kann. Auch diesen Proteasen wird in der Wundheilung eine entscheidende Funktion zugeschrieben. Zu der Gruppe der Serin- Proteasen behören beispielsweise Chromotrypsin, Elastase, Kallikrein, Plasmin, Trypsin, Thrombin u.a.. Die meisten bekannten Serin-Proteasen weisen neben dem L-Serin-Rest in ihrem aktiven Zentrum die Reste der Aminosäuren L-Histidin und L-Asparagin auf. Alle drei Aminosäurereste nehmen bei der Protolyse an einer Kaskade von Reaktionen teil, in der ein Proton des L-Serin-Restes auf das Substrat übertragen wird. Insoweit sich ein Serin- abhängiger Mechanismus bei Proteinasen findet, spricht man auch von Serin-Proteinasen.
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Tabelle 1 : Matrix-Metallo-Proteasen (MMP)
Matrix-Metallo-Proteasen wird in der Wundheilung eine entscheidende Funktion zugeschrieben. So benötigen beispielsweise Keratinozyten zur Migration über die provisorische Matrix mit dem Ziel des epithelialen Wundschlusses Matrix-Metallo-Proteasen (Pilcher et al., 1997; Beare et al., 2003; Mirastschijski et al., 2004). Diese Metallo-Proteasen werden in Zellen als inaktive Proform gebildet, aus der Zelle sezerniert und im extrazellulären Milieu aktiviert (limitierte Proteolyse). Sie sind durch strukturelle Gemeinsamkeiten gekennzeichnet und benötigen für die proteolytische Aktivität divalente Ionen im aktiven Zentrum. Erst nach Aktivierung und in Gegenwart von Ca2+- oder Zn2+- lonen können sie die jeweiligen Substrate abbauen (Übersicht in Nagase und Woessner 1999). In neueren Arbeiten auf dem Gebiet der Wundbehandlung konnte festgestellt werden, dass mit einer pathologischen Wundheilung eine überschießende Proteaseaktivität im Wundsekret assoziiert ist (Trengove et al., 1999; Wysocki et al., 1993; Weckroth et al., 1996). Experimentell konnte weiterhin gezeigt werden, dass eine erhöhte MMP-Expression in der Haut die Wundheilung deutlich verzögert (Di Colandrea et al., 1998). Weiterhin hat sich gezeigt, dass mit einer exzessiven Proteaseaktivität eine Abnahme der Wachstumsfaktoren zu verzeichnen ist (Tengrove et al., 2003). Es hat sich darüber hinaus gezeigt, dass in chronischen Wunden die extrazelluläre Matrix (Wysocki et al., 1990), Wachstumsfaktoren (Duckworth et al., 2004; Lauer et al., 2000) und deren Rezeptoren (Eming et al., 2004) abgebaut werden, so dass im Wundareal ein relatives Defizit an diesen Stoffen entsteht. Damit behindert eine exzessive Protease-Aktivität, insbesondere eine exzessive Metallo- Proteasen-Aktivität die Wundheilung in außerordentlichem Maß. Dabei wird die Syntheseleistung des Granulationsgewebes behindert insbesondere die Ablagerung neuen Kollagens. Interstitielles Kollagen macht über 80% der extrazellulären Matrix aus und wird hauptsächlich von Fibroblasten synthetisiert. Nach Translation der spezifischen RNA folgen mehrere intrazelluläre Modifikationen des triplehelikalen Kollagenmoleküls. Nach Sezernierung und Abspaltung der Telopeptide erfolgt unter normalen Umständen die Organisation der einzelnen Kollagenmoleküle in eine dreidimensionale Fibrille. Kollagenfibrillen interagieren mit anderen Molekülen der extrazellulären Matrix und zusammen mit den Zellen im Mesenchym wird diese Struktur als Bindegewebe bezeichnet. Ein Überschuss an Metallo-Proteasen interferiert mit diesen Prozessen. Neugebildetes Kollagen wird abgebaut nachdem es aus den Zellen ausgeschleust wurde und die Abbauprodukte scheinen den Zellen Informationen zu vermitteln, die sich negativ auf die normale Wundheilung auswirken.
In der Tat wird eine Korrelation von normalisierter Heilung und Abnahme der exzessiven Proteaseaktivität beschrieben. Versuche, einmal gebildete Proteaseaktivität durch spezifische Inhibitoren pharmakologisch zu reduzieren, waren bislang nicht erfolgreich. Prophylaktisch eingesetzt können einzelne Medikamente, z.B. Corticosteroide, Einfluss auf die Entzündungsphase der Wundheilung haben. Ebenfalls können diese Substanzen zur Reduktion der Proteaseexpression im Rahmen einer überschiessenden Entzündungsreaktion eingesetzt werden. Dies erfolgt hauptsächlich durch Hemmung der Transkription der Metallo-Protease-Gene, aber auch durch Hemmung der Immigration von Entzündungszellen. Den Gewebeaufbau können diese Substanzen jedoch in den meisten Fällen nicht fördern. Viele anti-inflammatorisch wirkende Substanzen haben ausgesprochen negative Effekte auf die Transkription der Kollagene. Es besteht also ein Bedarf an therapeutischen Ansätzen, die einmal gebildete, exzessive Metallo-Pprotease-Aktivitäten zu hemmen und somit der Wunde zu erlauben den Gewebeaufbau mit möglichst wenig Behinderung zu fördern.
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Mittel zur Behandlung von chronischen Wunden bereitzustellen. Darüber hinaus soll ein Mittel bereitgestellt werden, das den pathologischen Zustand einer Wunde derart beeinflusst, dass ein normaler, natürlicher Wundheilungsverlauf stattfinden kann.
Überraschender Weise wird diese Aufgabe durch einen Metallo-Proteasen-Inhibitor aus der Gruppe lod oder lodophore gelöst. Insbesondere hat sich gezeigt, das lod oder lodophore als Inhibitor Matrix-Metallo-Proteasen inaktivieren. Damit wird die Aufgabe in bevorzugter weise von Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitoren aus der Gruppe lod oder lodophore gelöst. Besonders bevorzugt sind dabei lodophore, die lod und ein synthetisches Polymer umfassen.
Hierbei und im Folgenden soll unter einem lodophor eine Substanz verstanden sein, die lod komplexartig bindet und lod freisetzt. Das heißt, dass das lod nicht über feste chemische Bindung an ein Trägermolekül geknüpft ist, sondern lediglich über elektrochemische Bindung an oder in ein Trägermolekül an- oder eingelagert ist, wobei die chemischen Eigenschaften des lod oder des Trägermaterials unverändert bleiben. Unter lod sind sowohl elementares lod als auch lodidionen zu verstehen. Solche lodidionen können beispielsweise einfach negativ geladene Ionen der Form I ", I3 ", I5 ", I7 " oder lg~ sein. Unter einer Metallo-Protease bzw. Matrix-Metallo-Protease soll weiterhin diejenigen Metallo-Protease bzw. Matrix-Metallo- Proteasen verstanden sein, die vertebraten Ursprungs sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Metallo-Proteasen-Inhibitor oder der Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor aus der Gruppe der Polyvinylpyrrolidone-Iod- Komplexe gewählt, das heißt der lodophor besteht aus einem Polyvinylpyrrolidone-Iod- Komplex.
In einem solchen Komplex (1) liegt das schwer wasserlösliche lod in einer Helixstruktur des Polyvinylpyrrolidon (PVP) als I3 " -Anion über Wasserstoffbrücken zwischen den Carbonylgruppen zweier Pyrrolidonringen reversibel gebunden vor. Durch das Verhältnis von ca. 18 lodfreien Pyrrolidonringen zu einem mit lod besetzten Ring ist die Substanz gut wasserlöslich.
1 n auf 18 m
In wässrigen Lösungen stellt sich ein Gleichgewicht (Gleichung (2)) ein, das folgend formuliert werden kann:
(PVP • H +) I3 " <=> (PVP • H +) + I"+ I2 (2)
Damit bildet das komplexartig gebundene lod eine Art Reservoir, das bei Bedarf, also in Gegenwart von geeigneten Enzymen freigesetzt werden kann. Das mittlere Molekulargewicht der lod-PVP liegt bei etwa 30.000 bis 55.000 g/mol. In fester Form ist lod- PVP ein bräunliches Pulver, das einen Gehalt von 9 - 12 Gew.-% an verfügbaren lod und maximal 6,6 Gew.-% lodid enthält. Der Anteil an aktivem lod beträgt vorzugsweise damit 9 - 12 %.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe lod oder lodophore, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt. Insbesondere wird die Verwendung eines Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe lod oder lodophore, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt.
Weiterhin wird eine Methode zur Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt, wobei lod oder lodophore als Metallo-Proteasen-Inhibitor, insbesondere Matrix-Metallo-Proteasen- Inhibitor zur Behandlung von chronischen Wunden verwendet wird. Damit wird auch die Verwendung von lod oder lodophore zur Inhibition von Metallo-Proteasen, insbesondere Matrix-Metallo-Proteasen, in chronischen Wunden bereitgestellt.
Insbesondere wird weiterhin die Verwendung von lod oder lodophore als Metallo-Proteasen- Inhibitor, vorzugsweise als Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitor, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt. Damit wird auch die Verwendung von lod oder lodophore zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Metallo-Proteasen, insbesondere Matrix-Metallo-Proteasen, in chronischen Wunden bereitgestellt. Weiterhin besonders bevorzugt wird die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors oder eines Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe lod oder lodophore, zur Herstellung eines Mittels zur topischen Behandlung von chronischen Wunden bereitgestellt.
Weiterhin bevorzugt handelt es sich bei den gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Mitteln um topische Mittel zur äußeren Anwendung auf der Wunde. Diese Mittel können in Form eines Gels, einer Salbe oder einer Lösung vorliegen. Es kann auch vorgesehen sein, dass ein topisches Mittel in Form eines Gels, einer Salbe oder einer Lösung auf ein Trägermaterial, wie zum Beispiel ein Vlies, ein Nonwoven oder ein textiles Material wie beispielsweise ein Gewirk oder Gewebe aufgebracht oder eingebracht ist.
lod und lodophore sind in der Wundbehandlung und damit auch bei der Behandlung von chronischen Wunden lange Zeit als Desinfektionsmittel, Antiseptika oder als Fungizide bekannt. Überraschender weise konnte jedoch festgestellt werden, dass diese Substanzen in der Lage sind, Metallo-Proteasen und insbesondere Matrix-Metallo-Proteasen zu inhibieren, und damit in besonderer Weise als Metallo-Proteasen-Inhibitoren oder als Matrix- Metallo-Proteasen-Inhibitoren zur Behandlung von chronischen Wunden eingesetzt werden können. Ihre antiseptische Wirksamkeit ist davon unberührt.
Insbesondere hat sich gezeigt, dass der Metallo-Proteasen-Inhibitor oder der Matrix-Metallo- Proteasen-Inhibitor aus der Gruppe der lodophore gewählt werden kann, wobei der lodophor lod und ein synthetisches Polymer umfasst. Ganz besonders bevorzugt sind lodophore, die lod und ein synthetisches Polymer aus der Gruppe der Polyvinylpyrrolidone umfassen.
Als Ergebnis der vorliegenden Untersuchung hat sich gezeigt, das insbesondere Metallo- Proteasen-Inhibitoren oder der Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitoren verwendet werden können, die lod oder ein lodophor mit 9 - 12 Gew.-% aktivem lod umfassen.
Chronische Wunden können definiert werden als Wunden deren Heilungsverlauf in einem oder allen Stadien der Wundheilung von der normalen Wundheilung abweichen. So kann aus akuten Wunden z.B. durch eine Wundinfektion eine chronische Wunde entstehen, die durch eine verzögerte Heilungsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist. Der Übergang von einer akuten zu einer chronischen Wunde kann dabei in jedem Stadium der Wundheilung erfolgen. Klinisch werden chronische Wunden definiert als Wunden deren Heilung mehr als 6-8 Wochen benötigen, wobei diese Definition nicht alle Krankheitsbilder korrekt abdeckt. Es handelt sich bei chronischen Wunden mehr um eine Diagnose, die sich auf die klinische Erfahrung des medizinischen Personals stützt.
Chronische Wunden entstehen insbesondere aufgrund einer mechanischen Belastung (Dekubitus, Druck-Ulzera, Drückgeschwür), einer venöse Insuffizienz (Ulcus cruris venosum, venöse Ulzera), einer arteriosklerotischen Gefäßveränderung (Ulcus cruris arteriosum, arterielle Ulzera), einer neuropathischen Veränderungen (diabetisches Fußsyndrom, neuropathische Ulzera), aber auch in Folge von Autoimmunerkrankungen, von Tumoren (exulzierende Tumore) oder Strahlenschäden bei der Tumortherapie.
Damit ist gemäß einem weiterführenden Gedanken insbesondere auch die Verwendung eines Metallo-Proteasen-Inhibitors oder eines Matrix-Metallo-Proteasen-Inhibitors aus der Gruppe lod oder lodophore, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Dekubitus, Ulcus cruris venosum, Ulcus cruris arteriosum oder diabetisches Fußsyndrom Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dabei wird der Gewebeaufbau durch die Ausschaltung der die Wundheilung störenden Mechanismen gefördert, was sich klinisch in einer Besserung des Wundzustandes sowie der Wundverkleinerung bemerkbar macht.
Der Dekubitus (Druckgeschwür) ist definiert als durch äußere, meist längerfristige Druckeinwirkung mit Kompression von Gefäßen und lokaler Ischämie hervorgerufene trophische Störung von Geweben (v. a. Haut und Unterhautgewebe) mit Nekrose, Mazeration und evtl. Infektion. Dekubita entstehen vor allem bei Bettlägerigkeit, insbesondere an Körperstellen, an denen die Haut dem Knochen unmittelbar anliegt, aber auch z.B. unter schlecht sitzenden Prothesen und zu engen Gipsverbänden.
Der Dekubitus wird in folgende Stadien eingeteilt. Hierbei sind als chronische Wunden insbesondere Dekubita der Stufe II, Stufe III und Stufe IV bekannt:
- Dekubitus - Stufe I: Hierbei handelt es sich um eine persistierende, umschriebene Hautrötung, die auch bei Entlastung bestehen bleibt. Die Rötung ist scharf umgrenzt und kann verhärten oder überwärmt sein. Die Haut ist noch intakt.
- Dekubitus - Stufe II: In dieser Phase kommt es zu Blasenbildung und Hautabschürfung und damit zu Teilverlust der Haut. Die Epidermis bis hin zu Anteilen der Dermis ist geschädigt. In dieser Phase liegt eine oberflächige Wunde oder flaches Geschwür vor.
- Dekubitus - Stufe III: In diesem fortgeschrittenen Stadium ist bereits ein Verlust aller Hautschichten zu beobachten. Darüber hinaus sind eine Schädigung der subkutanen
Gewebe und eventuell Nekrosen zu beobachten, die bis auf die darunter liegende Muskelgewebe reichen können. Erfahrungsgemäß muss es erst zu einer Abgrenzung des nekrotischen Gewebes kommen bis das ganze Ausmaß des Gewebeschadens erkennbar wird. Der Dekubitus zeigt sich klinisch als offenes, tiefes Geschwür. - Dekubitus - Stufe IV: In diesem äußerst kritischem Stadium ist ein Verlust aller Hautschichten mit ausgedehnter Zerstörung, Gewebsnekrose oder Schädigung von
Muskeln, Knochen oder unterstützenden Strukturen (Sehnen, Gelenkkapseln) zu verzeichnen. Der Dekubitus zeigt sich klinisch als großflächiges, offenes und tiefes Geschwür.
Gemäß einem weiterführenden Gedanken der vorliegenden Erfindung, ist auch eine Wundauflage umfassend einen Metallo-Protease-Inhibitor oder einen Matrix-Metallo- Protease-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe lod oder lodophor Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Hierbei kann der Inhibitor in fester Form als Partikel oder in flüssiger Form als gelöste Substanz in einem Lösungsmittel auf ein Trägermaterial, insbesondere ein Fasermaterial auf- oder eingebracht sein.
Damit ist auch die Verwendung einer Wundauflage umfassend ein Trägermaterial, insbesondere ein Fasermaterial, das einen Metallo-Protease-Inhibitor oder einen Matrix- Metallo-Protease-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe lod oder lodophor umfasst, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ausführungsbeispiele
Wundexsudat mit hoher Proteaseaktivität wurde von Patienten mit chronischen Wunden gewonnen und mit verschiedenen Konzentrationen von PVP-lod Lösung (Braunol 2000, Fa. B.Braun AG, Melsung - Deutschland oder Betaisadona, Mundipharma GmbH, Limburg - Deutschland, Handelspräparate mit 10% PVP-lod) für 30 Min.- 2 Std. inkubiert. Anschließend wurde das behandelte Wundsekret in Zymogrammen auf das Vorliegen von MMP Aktivität (MMP-2 und MMP-9) untersucht.
Diese Technik ist äußerst sensitiv und basiert auf einer Auftrennung der Proteasen in einem SDS-GeI, welches gleichzeitig ein Proteasesubstrat (Gelatine) enthält. Das Gel setzt sich zusammen aus (alle Chemikalien Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim - Deutschland):
- 3,3 ml Gelatinelösung (Gelatine, porcine skin (CAS-Nr. 9000-70-8), 3 mg/ ml H2O), - 0,85 ml destilliertes H2O,
- 2,5 ml 1 ,5M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) /
HCl/ 0,4% SDS-Lösung (Sodiumdodecylsulfat-Lösung), pH 8,8,
- 3,35 ml 30% Acrylamid/ 0,8% Bisacrylamid Lösung, - 50 μl (10% w/v) Ammoniumpersulfat und
- 10 μl TEMED (N, N, N', Λ/'-Tetramethylendiamin); das Obergel entspricht
- 3,075 ml destilliertes H2O,
- 0,625 ml 0,5M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminornethan) / HCl/ 0,4% SDS-Lösung (Sodiumdodecylsulfat-Lösung), pH 6.8,
- 0,75 ml 30% Acrylamid/ 0,8% Bisacrylamid Lösung,
- 50 μl (10% w/v) Ammoniumpersulfat und
- 5 μl TEMED (N, N, N', Λ/'-Tetramethylendiamin)
Die Gele können in verschiedenen handelsüblichen Gelapparaturen gegossen und für die elektrophoretische Auftrennung vorbereitet werden. Dem Fachmann sind solche Apparaturen bekannt.
Der Probenauftragspuffer kann ein beliebiger Proteinauftragspuffer sein, der keine reduzierenden Substanzen erhalten darf. Nach der Auftrennung werden die Proteasen renaturiert (waschen für 2x15 Min. in 2,5% Triton-X-100 in H2O, dann waschen für 2x15 Min. in 50 mM Tris/ HCl pH 7,4; 5 mM CaCI2) und für 24-48 Std. in dem letzten Waschpuffer inkubiert. Die renaturierten Metallo-Proteasen bauen das Gelatinesubstrat in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft ab. Färbt man diese Zymogramme mit einem Proteinfarbstoff (Coomassie CAS-Nr. 6104-59-2, Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim - Deutschland), gefolgt von der Entfärbung nach Standardprotokollen, stellt sich die nicht abgebaute Gelatine homogen blau im Gel dar (in der Abbildung Figur 1 grau dargestellt). Nur an Stellen an denen sich proteolytische Aktivität befindet und die Gelatine abgebaut wurde, imponieren klare, durchsichtige Banden, sogenannte „Fressbanden" (in der Abbildung Figur 1 weiß auf grauem Grund dargestellt). Diese Versuchsanordnung ist dem Fachmann bekannt. Dem typischen Bandenmuster wird anhand von Proteinmarkern das Molekulargewicht zugeordnet, so dass die Identität der Metallo-Proteasen bestimmt werden kann.
Mit Figur 1 ist das Ergebnis einer Untersuchung wiedergegeben. Bei dieser Untersuchung wurden 10 μg Wundexsudat-Protein-Gemisch (WF) nach der oben beschriebenen Zymogramm-Versuchsanordnung untersucht. Hierzu wurden von 4 Patienten mit schlecht heilenden Wunden (Ulcus cruris venosum) Wundexsudat gewonnen. Es wurden in einem Parallelansatz 9 Aliquots (Proben eines Patienten 10-18) mit jeweils 10 μl Wundexsudat- Protein-Gemisch mit verschiedenen Konzentrationen an lod-Polyvinylpyrrolidon (Braunol 2000, Fa. B.Braun AG, Melsung - Deutschland) gemäß Tabelle 2. versetzt.
Tabelle 2
Durchführung:
Jede Probe Probe 10 bis 18 (10 μg Protein, Wundflüssigkeit-Protein-Gemisch) wird mit 0,9 % NaCI auf 16 μl verdünnt. Zu den vorbereiteten Probe (11 bis 18) werden 4 μl Jod-PVP- Lösung 1 bis 8 (L1 bis L8) gegeben und nach dem oben beschriebenen Verfahren untersucht. Die Lösungen L1 bis L8 werden wie folgt hergestellt:
L1 : 10 ml Jod-PVP-Lösung (Braunol 2000, Fa. B.Braun AG, Melsung - Deutschland) werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
L2: 10 ml der Lösung L1 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt L3: 10 ml der Lösung L2 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
L4: 10 ml der Lösung L3 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
L5: 10 ml der Lösung L4 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
L6: 10 ml der Lösung L5 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
L7: 10 ml der Lösung L6 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt L8: 10 ml der Lösung L7 werden 1 :1 mit dest. Wasser verdünnt
Deutlich ist die Gelatinase Aktivität (MMP-9 = (20) und MMP-2 = 21)) als klare, weiße Banden zu erkennen, wobei die Gelatinase MMP-9 als Doppelbande identifiziert werden kann. Werden Aliquots mit verschiedenen Mengen PVP-lodlösung inkubiert (30 Min. vor Auftrag auf das Zymogrammgel), wird die enzymatische Aktivität dosisabhängig zerstört. Bei Konzentrationen von 1 :80 (125 μg/ml PVP-lod im Reaktionsansatz, L4) bis 1 :10 (1000 μg/ml PVP-lod im Reaktionsansatz, L1) wird die MMP Aktivität fast komplett blockiert. Diese Experimente wurden mit der Wundflüssigkeit der anderen Patienten in identischer Weise wiederholt. Behandlung:
Werden Patienten, die an chronischen Wunden leiden mit topischen Präparationen von PVP- lod Präparationen behandelt, stellt sich je nach Ausgangszustand und zugrundeliegender Erkrankung eine Besserung und Normalisierung der Wundheilung ein.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von lod oder lodophore als Metallo-Proteasen-Inhibitor, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden.
2. Verwendung von lod oder lodophore zur Herstellung eines Mittels zur Inhibition von Metallo-Proteasen in chronischen Wunden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Gewebeaufbau in chronischen Wunden verwendet wird.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der lodophor lod und ein synthetisches Polymer umfasst.
5. Verwendung nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der lodophor lod und ein synthetisches Polymer aus der Gruppe der Polyvinylpyrrolidone umfasst.
6. Verwendung nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der lodophor 9 bis 12 Gew.-% aktives lod umfasst.
7. Metallo-Proteasen-Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe lod oder lodophor.
8. Metallo-Proteasen-Inhibitor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der lodophor lod und ein synthetisches Polymer umfasst.
9. Metallo-Proteasen-Inhibitor nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der lodophor ein Polyvinylpyrrolidone-Iod-Komplex ist.
10. Wundauflage umfassend einen Metallo-Proteasen-Inhibitor nach mindestens einem der vorgenannten Ansprüche 7, bis 9.
11. Wundauflage nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Metallo- Proteasen-Inhibitor auf oder in ein Trägermaterial, insbesondere ein Fasermaterial auf- oder eingebracht ist.
12. Verwendung einer Wundauflage nach mindestens einem der Ansprüche 10 oder 11 , zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von chronischen Wunden.
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