EP1984394A1 - Verfahren zur immunadsorption mittels autoantigenen - Google Patents

Verfahren zur immunadsorption mittels autoantigenen

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EP1984394A1
EP1984394A1 EP07721862A EP07721862A EP1984394A1 EP 1984394 A1 EP1984394 A1 EP 1984394A1 EP 07721862 A EP07721862 A EP 07721862A EP 07721862 A EP07721862 A EP 07721862A EP 1984394 A1 EP1984394 A1 EP 1984394A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
disease
syndrome
autoimmune
anemia
blood
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07721862A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Angelika LÜKING
Christian Scheer
Verena Gruss
Claudia Gutjahr
Kirsten Schulte
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Protagen GmbH
Original Assignee
Protagen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Protagen GmbH filed Critical Protagen GmbH
Publication of EP1984394A1 publication Critical patent/EP1984394A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption

Definitions

  • the invention relates to a novel process for the immunoadsorption of human or mammalian autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases have indication-specific autoantibodies (von Mühlen, CA, Tan E.M. (1995) Autoandibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases, Semin Arthrithis Rheum., 24, 323-358). 5% of the world's population is affected by autoimmune diseases
  • Such autoantibodies e.g. Cardiac structures have been described in recent years in dilated cardiomyopathy (DCM). This is due to the patients on "cardiotoxic antibodies", which are directed against the heart muscle cells. These autoantibodies could be eliminated by immunoadsorbent therapy (Dörffel WV, Felix SB, Wallukat G., et al., Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy, Circulation 1997, 95 (8): 1994-1997). Immunoadsorption therapy is a special blood wash that specifically purifies the blood of autoantibodies. DCM patients were treated with immunoadsorbent therapy at monthly intervals for three months and hemodynamics were analyzed using Swan Ganz monitoring. Increases in cardiac index, stroke volume index and left ventricular ejection fraction (echocardiography) were detected. At the same time, there was a decline in systemic vascular resistance.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • Immunoadsorption is a special method of adsorption that uses immunological properties; It is already used in the prior art for the therapy of patients
  • RA and ITP are both autoimmune diseases characterized by the appearance of autoantibodies in high titers or serum concentrations, these autoantibodies are directly involved in the development of tissue damage and the progression of the disease.
  • adsorbent materials e.g. in appropriate columns or
  • Membrane modules used with immobilized protein A or protein G.
  • Protein A or protein G (e.g., available from Miltenyi Biotec,
  • IgG class immunoglobulins due to its high affinity for the Fc part of the IgG antibodies (class 1, 2 and 4). With less affinity they also bind certain IgG3, IgA and IgM antibodies.
  • Immunoadsorption is a substitute for conventional plasmapheresis and appears to be an important adjunct to immunosuppressive therapy in SLE with difficult disease progression.
  • the immunoadsorbent therapy as described in Artificial Organs, (1996), 986-990, uses the amino acids tryptophan or phenylalanine for attachment to the PVA gel particles and is therefore cumbersome and expensive. Moreover, with this therapy also substances that should not be removed from the plasma, such as IgG and IgM, separated in comparable amounts from the plasma.
  • the invention therefore relates to a therapeutic method for the treatment and prophylaxis of autoimmune diseases, wherein an adsorption of autoantibodies from blood or blood plasma takes place extracorporeally by means of autoantigens (hereinafter: "inventive therapy").
  • the invention also relates, in a preferred embodiment, to a method for producing an adsorbent for adsorbing autoantibodies in blood or blood plasma, comprising the following steps: a.) Providing a carrier material, b.) Immobilizing or fixing at least one autoantigen on this carrier material and bringing it into contact of the adsorbent with blood or blood plasma (hereinafter: "method according to the invention").
  • the method according to the invention is carried out extracorporeally.
  • the blood or blood plasma may continuously flow along the carrier material containing autoantigens.
  • “Extracorporeal” in the sense of this invention means that the therapy according to the invention or the method according to the invention takes place outside the human body (synonymously: “ex vivo”).
  • the therapy according to the invention is for the treatment or prophylaxis of autoimmune diseases.
  • Autoimmune diseases are to be understood as those which have substantially indication-specific autoantibodies which are potentially suitable for harming the organism in any manner, in particular attacking the body's own tissue (for example due to overactive T cells).
  • the following autoimmune diseases are not exhaustively included:
  • AIHA autoimmune hemolytic
  • Atherosclerosis arteriosclerosis, arteriosclerosis
  • Diabetes mellitus type 1 insulin-dependent diabetes mellitus
  • DCM Dilated Cardiomyopathy
  • GAS Guillain-Barre syndrome
  • Idiopathic pulmonary fibrosis IPF
  • AIED Inner ear hearing loss, autoimmune
  • Cardiomyopathy autoimmune cold agglutinin disease (see also: anemia, autoimmune hemolytic type of cold)
  • MCTD Mixed Connective Tissue Disease
  • Addison's disease see also: autoimmune adrenalitis; autoimmune
  • Ankylosing spondylitis (ankylosing spondylitis)
  • MS Multiple Sclerosis
  • Encephalomyelitis disseminata Charcot
  • Myasthenia gravis myasthenia; MG
  • PGA Polyglandular autoimmune
  • Polymyositis polyneuropathy chronic-inflammatory, demyelinating (see also: Chronic-inflammatory, demyelinating
  • CIDP Primary biliary cirrhosis
  • PBC Primary autoimmune cholangitis
  • Reiter syndrome (Reiter's syndrome, urethro-conjunctival synovial syndrome) Rheumatic fever
  • Takayasu's arteritis (Takayasu's disease, aortic arch syndrome)
  • HLA various organs
  • Hyperimmunization acute vascular rejection
  • RA Rheumatoid arthritis
  • ITP idiopathic thrombocytopenic purpura
  • Another object of this invention relates to the identification of suitable autoantigens for the selective removal of autoantibodies.
  • the autoantigens according to the invention can preferably be identified by means of protein micro and macroarrays.
  • protein micro- and macro-arrays encompasses any arrangement of proteins on a surface of a solid support.
  • array means synonymously “arrangement” and insofar as this "array” is used for the identification and characterization of proteins, in particular autoantigen, this is to be understood as an “assay” or “biochip” Macro “array” incubated with patient sera.
  • the arrangement is such that the proteins represented on the array are in the form of a lattice.
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic bead, a silicon wafer, glass, metal, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • a filter PVDF or nylon is preferred (e.g., Hybond N +, GE Health Gare).
  • this corresponds to a grid having the size of a microtiter plate (96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • this corresponds to a grid having the size of a microtiter plate (96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • Protein microarrays and macroarrays enable the rapid and highly parallel detection of a large number of specifically binding analysis molecules in a single experiment. For the production of protein micro and macroarrays, it is necessary to have the required proteins available. Protein expression libraries have been established for this purpose.
  • High-throughput cloning of defined open reading frames is a possibility (Heyman, JA, Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, JR, Gontang, E., Hartman, KJ, Hernandez, CL., Hood, R., Hill HM, Lee, WY, Marcil, R., Marsh, EJ, Mudd, KM, Patino, MJ, Purcell, TJ, Rowland, JJ, Sindici, ML and Hoeffler, JP (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I mediated ligation Genome Res, 9, 383-392;
  • some expression vectors have sequences for so-called affinity epitopes or proteins, which on the one hand allow the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of an antibody directed against the affinity epitope, on the other hand, the specific purification via affinity chromatography (IMAC) allows.
  • IMAC affinity chromatography
  • some of these expression vectors preferably contain inducible promoters. The induction of
  • Expression can be done, for example, by means of an inducer, such as IPTG.
  • inducer such as IPTG.
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • the expression product is preferably in the form of a fusion protein containing, for example, at least one affinity epitope or "tag".
  • the day can be as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag, thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose binding domain, green fluorescent Protein, maltose binding protein, calmodulin binding protein, glutathione S-transferase or lacZ.
  • the gene products of a cDNA expression library of human fetal brain tissue in the bacterial expression system Escherichia coli in high density format were placed on a membrane and successfully screened with different antibodies for specific protein-antibody interaction. It could be shown that the proportion of full-length proteins is at least 66%.
  • the recombinant proteins of this library could be expressed and purified at high throughput. Brown P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome-scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Be U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, and these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Handbook, 2nd edition (1989), CSH press, CoId Spring Harbor, New York Further preferred are expression libraries which are tissue-specific.
  • expression libraries which can be obtained by exon trapping are also included in the invention, and instead of an expression library it is possible to speak synonymously of an expression library.
  • protein micro and macroarrays or corresponding expression libraries which do not provide redundancy (Üniclone® biochips) and can be prepared according to the teachings of WO 99/57311 and WO 99/57312. These preferred Uniclone biochips have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library (see examples).
  • Autoantigens can be safely identified (screened), cultured and purified (protein production) and further characterized. For this, sera, blood or blood plasma from patients are given via a protein micro and macroarray (see examples).
  • potential autoantigens are identified by a macroarray (e.g., a human cDNA expression library containing more than 10,000 clones) that are confirmed by a microarray (selection of potential clones) using patient sera (containing autoantibodies).
  • the invention also relates to a method for
  • Autoantigen consisting of the following steps: a.) Incubation of a first array containing proteins with
  • the first array consists of a cDNA expression library (described, supra) with at least 10,000 clones or proteins. Furthermore, it is preferred that the first array in a) has redundant clones or proteins.
  • Re-Arraying means that identified proteins or clones are rearranged to a second array.
  • the visualization of such autoantibody-autoantigen interactions can be carried out, for example, by means of fluorescence labeling, biotinylation or radio-isotope labeling in a customary manner.
  • a readout is e.g. by means of a microarray laser scanner.
  • autoantigens can be isolated, enriched or cloned by conventional methods.
  • the therapy according to the invention relates to those autoantigens obtainable from a screening method by means of any analytical method, in particular such as protein microarrays and macroarrays, ELISA and / or BIAcore.
  • the therapy according to the invention relates to such
  • Carrier materials which are able to fix or immobilize autoantigens.
  • adsorbers which are able to fix or immobilize autoantigens.
  • the adsorber is biocompatible (Jayabalan M.
  • Suitable carrier materials are such as, but not limited to, glass, carbohydrates and modified carbohydrates, sepharose, proteins such as collagen or gelatin, silica or organic matrices, polymers such as polyamides, PVDF, nylon, nitrocellulose and others.
  • the carrier material may be in the form of spherical, unaggregated particles, so-called beads, fibers or a membrane, wherein a porosity of the matrix increases the surface area.
  • the porosity can be achieved, for example, in the customary manner by adding pore formers, such as cyclohexanol or 1-dodecanol, to the reaction mixture of the suspension polymerization.
  • the autoantigens can be applied in a known and arbitrary manner to the carrier material.
  • the autoantigen is a fusion protein (examples, supra) which is suitable for adhering to the carrier material.
  • individual autoantigens can be identified and used in the therapeutic method by means of the provided protein micro and macroarrays for the patient. If only 50-40% or even 20-10% of the autoantigens of an autoimmune disease are qualitatively identified and specific, a significant or significant therapeutic success already arises. For example, autoantigens are known and active for MS 20. Of these, 8 or less may already lead to therapeutic success.
  • the invention also relates to a method wherein non-individual indication specific autoantigens are used by a particular selection of patients for the therapy of any entity (ever greater than said particular selection) of patients according to the invention.
  • the invention relates to a device or kit consisting of a carrier material containing selected autoantigens including customary agents, in particular components for carrying out the therapy according to the invention or blood washing / immunoadsorption therapy and the method according to the invention.
  • a carrier material containing selected autoantigens including customary agents in particular components for carrying out the therapy according to the invention or blood washing / immunoadsorption therapy and the method according to the invention.
  • Corresponding known devices for blood washing or immunoadsorption therapy can be adapted accordingly.
  • the invention relates to the use of a carrier material containing autoantigens for
  • the invention relates to the use of a carrier material containing autoantigens for the adsorption of autoantibodies from blood or blood plasma of patients with autoimmune diseases.
  • the patient is returned to the outlet of the device of the carrier material is preferably a filter.
  • This is preferably a particle filter of suitable size.
  • the expression clones expressing the autoantigen identified in Example 1 were re-arrayed (ie positively identified clones were seeded onto a second array), and the expression products were purified by IMAC.
  • the purified proteins were first checked by SDS gel electrophoresis for their purity and additionally analyzed by mass spectrometry. The thus purified and characterized proteins were then spotted onto a suitable carrier to make a microarray.
  • the proteins produced in Example 1 were transferred to nitrocellulose-coated carrier surfaces using a spotting robot.
  • the protein biochip contained additional control proteins.
  • Process control human IgG and mouse IgG were used. These immunoglobulins were bound by the secondary antibodies required for the detection of human autoantibodies and can be used in addition to the process control for normalization ("inter chip normalization") . The process control proteins were also distributed over several quadrants of the chip. Intrafield "analysis used to check the homogeneity of the surface or incubation reaction. With appropriate bioinformatic tools (reviewed in: Hamacher, Michael / Marcus, Katrin / Stühler, Kai / van Hall, Andre / Warscheid, Bettina / Meyer, Helmut E. (ed.), Proteomics in Drug Research, Methods and Principles in Medicinal Chemistry (Volume 28) Edited by Mannhold, Raimund / Kubinyi, Hugo / Folkers, Gerd) can be based on the
  • NAAs natural autoantigens
  • stathmin or tubulin which can be found in approximately 90% of all sera (regardless of whether they are sick or healthy)
  • BSA non-epitope-tagged, non-human proteins
  • lysozyme were applied to the protein biochip. These were used to determine the reference value of the background. All of these proteins are present in duplicate spotted (and sometimes on several quadrants) on the protein biochip.
  • the protein biochips prepared in Example 2 are used in Example 5.
  • the patient selection was carried out considering firstly the age and sex of the patients
  • the sera collection was carried out according to a standardized protocol (decrease, centrifugation, aliquoting, flash freezing and storage at -80 0 C), with a total of 15 ml of whole blood were removed for sera extraction. In total, several hundred samples per patient (RA patient) and control group were collected and examined. The sample data (sample and patient ID, date of acceptance, administration of medication) were recorded in a standardized sample sheet at the time of sample acceptance and corresponding samples were collected.
  • a database model was designed. Subsequently, this model was implemented and created a database-based server-client software. In this database, the data of each clone in a collection was collected and archived. For example, the sequencing information, the gene ontology classification of a corresponding protein product, the expression rate and the quality control information such as ID gel and mass spectrometric results were stored and analyzed using various filters and methods
  • RA and MS patient serums were cataloged and the corresponding data were fed into the database in an appropriate format.
  • the patient sera are then examined on the various screening tools.
  • Proteins (Example 1) were screened first using high density filters of expression libraries. Such high density filters contain a large collection of proteins with at least 10,000 different proteins.
  • such a screening approach has been successfully described (Gutjahr, C, et al., Mouse protein arrays from a T (H) cDNA library for antibody screening and serum. Profiling.
  • Genomics, 2005. 85 (3): p. 285-96 The proteins identified in this screening were incorporated into the collection of 2000 and 4000 proteins, respectively.
  • high density filters of the human fetal brain expression library (Büssow, K., et al., A method for global protein expression and antibody screening on high-density filters of an arrayed cDNA library, Nucleic Acids Research, 1998. 26 (21): p. 5007-5008), as well as the T lymphocyte specific expression library.
  • Chip production data production batch, protein batch
  • patient sample data patient sample data
  • associated raw data from the image evaluation in the database taken.
  • bioinformatic evaluation is carried out taking into account the correlation of the patient data with the screening data (example 6). This bioinformatic study results in the selection of putatively relevant protein antigens. The corresponding expression clones of these protein antigens are backvalidated as described in Example 8.
  • a first test set is used to test various normalization methods and statistical tests that have been described for the field of DNA microarrays with regard to their suitability for protein microarrays.
  • the putative biomarkers determined from these analyzes are then examined again in Example 5 with different test sera from patients with other autoimmune diseases such as Sjögren's syndrome, SLE or alopecia areata.
  • the proteomes were analyzed using state-of-the-art technology. DIGE fluorescence difference gel electrophoresis shown and compared.
  • the revalidation of the selected protein antigens is done with a different aliquot of the same serum by Western immunoblot.
  • the corresponding antigens were prepared on an analytical scale.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Immunadsorptionstherapie von humanen Autoimmunerkrankungen mittels immobilisierten oder fixierten Autoantigenen.

Description

Verfahren zur Immunadsorption mittels Äutoantigenen
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Immunadsorption von humanen oder mammalia Autoimmunerkrankungen. Zumeist weisen Autoimmunerkankungen indikationsspezifische Autoantikörper auf (von Mühlen, CA., Tan E. M. (1995) Autoandibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin. Arthrithis Rheum. 24, 323-358). 5% der Weltbevölkerung ist von Autoimmunerkrankungen betroffen
(Davidson, A, Diamond B. (2001) Autoimmune diseases. N. Engl. J. Med. 354, 340-350) .
Solche Autoantikörper z.B. gegen kardiale Strukturen wurden in den letzten Jahren bei der Dilatativen Cardiomyopathie (DCM) beschrieben. Dies ist bei den Patienten auf "kardiotoxische Antikörper" zurückzuführen, die sich gegen die Herzmuskelzellen richten. Diese Autoantikörper konnten durch eine Immunadsorptionstherapie eliminiert werden (Dörffel WV, Felix SB, Wallukat G., et al. Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy. Circulation 1997; 95 (8) :1994-1997) . Bei der Immunadsorptionstherapie handelt es sich um eine spezielle Blutwäsche, die gezielt das Blut von Autoantikörpern befreit. DCM-Patienten wurden mit Hilfe der Immunadsorptionstherapie in monatlichen Abständen über drei Monate behandelt und die Hämodynamik mit Hilfe eines Swan-Ganz-Monitoring analysiert. Es konnten Steigerungen des Herzindex, des Schlagvolumenindex und der linksventrikulären Auswurffraktion (Echokardiographie) nachgewiesen werden. Gleichzeitig war ein Abfall des systemvaskulären Widerstandes zu verzeichnen.
Die Immunadsorption ist eine spezielle Methode der Adsorption, die sich immunologischer Eigenschaften bedient; sie wird im Stand der Technik bereits zur Therapie von Patienten mit
Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Mit dieser Therapie können bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen schädigende Stoffe aus dem Körper effizient und in teilweise großen Mengen entfernt werden. Dadurch kann häufig bereits kurz nach Therapiebeginn eine schnelle Verbesserung der Symptomatik erzielt werden. In der Folge werden jedoch nachteilig vorübergehende oder dauerhafte Remissionen beobachtet.
Beispiele erfolgreicher Therapien sind Rheumatoide Arthritis (RA) und Idiopathischer Thrombocytopenischer Purpura (ITP) . Die RA und die ITP sind beide Autoimmunerkrankungen, die sich durch das Auftreten von Autoantikörpern in hohen Titern bzw. Serumkonzentrationen auszeichnen, diese Autoantikörper sind direkt an der Ausbildung von Gewebeschädigungen und dem Fortschreiten der Erkrankungen beteiligt. Im Stand der Technik werden für die Immunadsorptionstherapie Adsorbermaterialien, z.B. in entsprechenden Säulen oder
Membranmodulen, mit immobilisiertem Protein A oder Protein G verwendet.
Protein A oder Protein G (z.B. erhältlich bei Miltenyi Biotec,
Germany) sind Komponenten der Zellwand des Bakteriums Staphylococcus und haben die Eigenschaft, unselektiv
Immunglobuline der Klasse IgG zu binden aufgrund seiner hohen Affinität zum Fc-Teil der IgG-Antikörper (Klasse 1, 2 und 4) . Mit geringerer Affinität binden sie ebenfalls bestimmte IgG3-, IgA- und IgM-Antikörper .
Im Stand der Technik werden mit Hilfe einer Adsorptionssäule sämtliche IgG aus dem Körper des Patienten entfernt, unter welchen sich ebenfalls die schädlichen zirkulierende Immunkomplexe bei der RA und Immunglobuline gegen Thrombozyten bei der ITP befinden. Um einer Schwächung des Immunsystems vorzubeugen, müssen dem Patienten intakte humane Immunglobuline aufwändig zurückgeführt werden. Diese Substitution ist nicht frei von Nebenwirkungen. Eine solche Adsorptionssäule ist in den USA seit 1987 für die Behandlung der ITP zugelassen und im Gebrauch.
Mehr als 11.000 Patienten wurden hiermit behandelt. Auch in anderen rheumatologischen Indikationen, wie Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) oder Wegener's Granulomatose, bestehen gute Behandlungsaussichten.
Bekannt ist ebenfalls die Immunoadsorptionstherapie bei
Patienten mit schwerem Verlauf von SLE. Die Immunadsorption wurde mit Immunglobulin-bindenden Substraten bei Patientinnen mit aktivem SLE, bei denen eine Zyklophosphamidtherapie nicht ausreichend oder kontraindiziert erschien durchgeführt. Separiertes Patientenplasma wurde mit polyklonalen
Schafantikörpern gegen humanes Immunglobulin (Ig-Therasorb- Säulen) adsorbiert, nach jeweils drei Immunglobulinapheresen wurde je 15 g Immunglobulin von gesunden Spendern substituiert. Die Immunadsorption stellt einen Ersatz für die konventionelle Plasmapherese dar und erscheint bei SLE mit schwierigem Krankheitsverlauf als wichtige Zusatzmöglichkeit zur immunsuppressiven Therapie.
Ebenfalls verwendet die Immunadsorptionstherapie, wie in Artificial Organs, (1996) , 986-990 beschrieben, die Aminosäuren Tryptophan oder Phenylalanin zur Anbindung an die PVA- Gelteilchen und ist daher umständlich und kostspielig. Überdies werden mit dieser Therapie auch Substanzen, die nicht aus dem Plasma entfernt werden sollen, wie IgG und IgM, in vergleichbaren Mengen aus dem Plasma abgetrennt.
Daher ist nachteilig im Stand der Technik, dass die Adsorption im Rahmen einer Immunadsorptionstherapie (bzw. Blutwäsche) zu unspezifisch ist und neben den indikationsspezifischen und - relevanten Autoantikörpern wertvolle andere Blutbestandteile entfernt werden, die dem Patient wieder aufwändig zugeführt werden müssen. Dies birgt erhebliche Risiken in der langzeitigen Anwendung.
Daher ist es Aufgabe dieser Erfindung eine spezifische
Protein-Protein Wechselwirkung zu gewährleisten, in der Weise, dass Autoantikörper selektiv entfernt werden können. Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung von Autoantigenen immobilisiert oder fixiert auf einem Adsorbens.
Daher betrifft die Erfindung ein therapeutisches Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen, wobei eine Adsorption von Autoantikörpern aus Blut oder Blutplasma extrakorporal mittels Autoantigenen erfolgt (nachstehend: „erfindungsgemäße Therapie").
Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines Adsorbens zur Adsorption von Autoantikörpern in Blut oder Blutplasma, umfassend die folgenden Schritte: a.) Bereitstellen eines Trägermaterials, b.) Immobilisieren oder Fixieren von mindestens einem Autoantigen auf diesem Trägermaterial und Inkontaktbringen des Adsorbens mit Blut oder Blutplasma (nachstehend: „erfindungsgemäßes Verfahren").
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren extrakorporal. Ferner kann in einer weiteren Ausführungsform das Blut oder Blutplasma kontinuierlich an dem Trägermaterial enthaltend Autoantigene entlang strömen / fließen.
„Extrakorporal" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die erfindungsgemäße Therapie oder das erfindungsgemäße Verfahren außerhalb des menschlichen Körpers erfolgt (synonym: „ex vivo") . Die erfindungsgemäße Therapie erfolgt zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmunerkrankungen. Unter Autoimmunerkrankungen sind solche zu verstehen, die im Wesentlichen indikationsspezifische Autoantikörper aufweisen, die potentiell geeignet sind, den Organismus in beliebiger Weise zu schädigen, insbesondere körpereigenes Gewebe anzugreifen (z.B. aufgrund überaktiven T-Zellen) . Im Sinne dieser Erfindung sind nicht abschließend folgende Autoimmunerkrankungen umfasst:
Alopecia Areata Anämie, autoimmun-hämolytische (AIHA) vom Kältetyp
(Kälteagglutininkrankheit)
Anämie, autoimmun-hämolytische (AIHA) vom Wärmetyp
Anämie, autoimmun-hämolytische Donath-Landsteiner (paroxysmale
Kältehämoglobinurie) Anämie, perniziöse (Morbus Biermer, Addison-Anämie)
Antiphospholipid Syndrom (APS)
Arteriitis temporalis (Riesenzellarteriitis)
Atherosklerose (Arteriosklerose, Arterienverkalkung)
Autoimmun-Adrenalitis (autoimmune Nebennierenrinden-Atrophie, Morbus Addison)
Chronisches Erschöpfungssyndrom (Chronic Fatigue Immune
Dysfunction Syndrome; CFIDS)
Chronisch-inflammatorische, demyelinisierende Polyneuropathie
(CIDP) Churg-Strauss Syndrom
Cogan-Syndrom
Colitis ulcerosa
CREST-Syndrome (Syndrom mit Calcinosis cutis, Raynaud-
Phänomen, Motilitätsstörungen des Ösophagus = engl. Esophagus, Sklerodaktylie und Teleangiektasien)
Diabetes mellitus Typ 1 (Insulin-abhängiger Diabetes mellitus)
Dilatativen Cardiomyopathie (DCM)
Dermatitis Herpetiformis During
Dermatomyositis Fibromyalgie
Gastritis, chronisch autoimmune
Goodpasture Syndrom (Anti-GBM vermittelte Glomerulonephritis)
Guillain-Barre-Syndrom (GBS; Polyradikuloneuritis)
Hashimoto Thyroiditis Hepatitis, autoimmune (Chronisch aktive Hepatitis; CAH)
Idiopathische Pulmonale Fibrose (IPF)
Immun-thrombozytopenische Purpura (Morbus Werlhof; ITP) Infertilität, autoimmune
InnenohrSchwerhörigkeit, autoimmune (AIED)
Juvenile rheumatoide Arthritis (Morbus Still, Still-Syndrom)
Kardiomyopathie, autoimmune Kälteagglutininkrankheit (siehe auch: Anämie, autoimmun- hämolytische vom Kältetyp)
Kryoglobulinämie, essentielle gemischte
Lambert-Eaton-Syndrom
Liehen sclerosus Lupus erythematodes (diskoide Form)
Lyme-Arthritis (Borrelien-Arthritis, Lyme-Krankheit)
Mischkollagenose (Mixed Connective Tissue Disease; MCTD)
Morbus Addison (siehe auch: Autoimmun-Adrenalitis; autoimmune
Nebennierenrinden-Atrophie) Morbus Basedow (Graves Krankheit)
Morbus Behcet
Morbus Crohn
Morbus Bechterew ( Spondylitis ankylosans)
Morbus Meniere (Meniere Krankheit) Morbus Reiter (siehe auch: Reiter Syndrom)
Multiple Sklerose (MS; Encephalomyelitis disseminata; Charcot-
Krankheit)
Myasthenia gravis (Myasthenie; MG)
Ophthalmie, sympathische Pemphigoid, vernarbendes
Pemphigoid, bullöses
Pemphigus vulgaris
Perniziöse Anämie (Morbus Biermer; Addison-Anämie; siehe auch
Anämie, perniziöse) Polyarteriitis nodosa (Periarteriitis nodosa)
Polychondritis (Panchondritis)
Polyglanduläres Autoimmun- (PGA) -Syndrom (Schmidt 's Syndrom)
Polymyalgia rheumatica
Polymyositis Polyneuropathie, chronisch-inflammatorische, demyelinisierende (siehe auch: Chronisch-inflammatorische, demyelinisierende
Polyneuropathie, CIDP) Primäre biliäre Zirrhose (PBC; primäre Autoimmun-Cholangitis)
Psoriasis (Schuppenflechte)
Reiter Syndrom (Morbus Reiter; Urethro-konjunktivales- synoviales Syndrom) Rheumatisches Fieber
Riesenzellarteriitis (siehe auch: Arteriitis temporalis)
Rheumatoide Arthritis (chronische Polyarthritis,
"Gelenkrheuma" )
Sarkoidose (Morbus Boeck, Besnier-Boeck-Schaumann Krankheit) Sjögren-Syndrom
Sklerodermie
Spondylitis ankylosans (siehe auch: Morbus Bechterew)
Sprue/Zöliakie
Stiff-Man-Syndrom (SMS; Moersch-Woltmann-Syndrom) Systemischer Lupus erythematodes (SLE)
Takayasu Arteriitis (Takayasu Krankheit; Aortenbogen-Syndrom)
Transiente Gluten-Intoleranz
Uveitis, autoimmune
Vaskulitis Vitiligo (Weißfleckenkrankheit)
Wegenersche Granulomatose (siehe: Morbus Wegener)
Ferner geeignet ist die erfindungsgemäße Therapie oder das erfindungsgemäße Verfahren im Fall der Transplantatabstoßung, wie z.B. Transplantation verschiedener Organe (HLA,
Hyperimmunisierung) , Akute vaskuläre Abstoßung (AVR) .
Bevorzugt ist die Behandlung solcher Autoimmumkrankheiten mittels der erfindungsgemäßen Therapie oder des erfindungsgemäßen Verfahren, die einen erhöhten Titer bzw. Serumkonzentrationen ein oder mehrerer Autoantikörper aufweisen, wie z.B. Rheumatoide Arthritis (RA) und Idiopathischer Thrombocytopenischer Purpura (ITP) .
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft die Identifizierung geeigneter Autoantigene zur selektiven Entfernung von Autoantikörpern. Die erfindungsgemäßen Autoantigene können vorzugsweise mittels Protein-Mikro-und Makroarrays identifiziert werden.
Im Rahmen dieser Erfindung umfasst der Begriff Protein-Mikro- und Makroarrays jedwede Anordnung von Proteinen auf einer Oberfläche eines festen Träger. Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Array" synonym „Anordnung" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, insbesondere Autoantigen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder „Biochip" zu verstehen. Hierzu wird ein solcher Mikro- oder Makro-„Array" mit Patientenseren inkubiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordung repräsentierten Proteine in Form eines Gitters vorliegen. Ferner sind solche
Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von Proteinen erlauben. Solche hochdichte Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart.
Der Begriff "fester Träger" umfasst Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches Kügelchen, ein Silizium-Wafer, Glas, Metall, ein Chip, ein massenspektrometrisch.es Target oder eine Matrix. Als Filter ist PVDF oder Nylon bevorzugt (z.B. Hybond N+, GE Health Gare) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt. Protein-Mikro-und Makroarrays ermöglichen die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem einzigen Experiment. Zur Herstellung von Protein-Mikro-und Makroarrays ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsatz- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J. R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, CL. , Hood, R., HuIl, H.M., Lee, W. Y., Marcil, R., Marsh, E. J., Mudd, K.M., Patino, M. J., Purcell, T. J., Rowland, J. J., Sindici, M. L. and Hoeffler, J. P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392;
Kersten, B., Feilner, T., Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A., Kreutzberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2003) Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J. F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong, CM. , Li, S., Jacotot, L., Bertin, N., Janky, R., Moore, T., Hudson, J. R., Jr., Hartley, J. L., Brasch, M. A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E., Papasotiropoulos, V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M. R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill, D.E. and Vidal, M. (2003) C elegans ORFeome Version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A. J., Temple, G. F., Brasch, M.A., Hartley, J. L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000) GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol, 328, 575-592). Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte, deren Qualität und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA- Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C, Lehrach, H. and Walter, G. (2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C, Lueking, A., Bovekamp, L., Gutjahr, C, Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D. J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames . Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C, Gotthold, C, Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 20, 372- 378). Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen Hefe-Expressionsvektor oder anderen geeigneten Vektor einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen einige Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Affinitätsepitop gerichteten Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht. Weiterhin enthalten einige dieser Expressionsvektoren vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der
Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5) : 523-33) . Zusätzlich liegt das Expressionsprodukt bevorzugt in Form eines Fusionsproteins vor, welches beispielsweise mindestens ein Affinitätsepiptop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten.
Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalen Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern hinsichtlich spezifischer Protein-Antikörper-Wechselwirkung gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine dieser Bibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. (2002) Proteome- scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Hörn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and
Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening. Analytical Biochemistry, 270, 103-111. Solche Protein-Mikro-und Makroarrays auf der Basis von cDNA- Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989) , CSH press, CoId Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
Weiterhin bevorzugt sind Protein-Mikro-und Makroarrays oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (sogenannte: Üniclone®-Biochips) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone-Biochips weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf (siehe Beispiele) . Insbesondere ist es möglich, Protein-Mikro-und Makroarrays herzustellen, die Proteine aus krankheitsspezifischen Gewebe von Autoimmunerkrankungen repräsentieren (Lueking (2003) supra, Lueking A., Huber 0., Wirths C, Schulte K., Stieler K.M., Blume -Peytavi U., Kowald A., Hensel-Wiegel K, Tauber R., Lehrach H, Meyer, H.E., Cahill J. D, Profiling of Alocepia Areata Autoantigens Based on Protein Microarray Technology, Molecular & Cellular Proteomics 4: 1382-1390, 2005).
Mit Hilfe solcher Protein-Mikro-und Makroarrays können
Autoantigene sicher identifiziert (Screening) , kultiviert und gereinigt (Proteinherstellung) und weiter charakterisiert werden. Hierzu werden Seren, Blut oder Blutplasma von Patienten über ein Protein-Mikro-und Makroarrays gegeben (siehe Beispiele) . Insbesondere werden erfindungsgemäß anhand eines Makroarrays (z.B. aus einer humanen cDNA-Expressionsbank mit mehr als 10.000 Clonen) potentielle Autoantigene identifiziert, die anhand eines Mikroarrays (Auswahl der potentiellen Clone) mittels Patientenseren (enthaltend Autoantikörper) bestätigt werden.
Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur
Identifizierung und Charakterisierung von mindestens einem
Autoantigen, bestehend aus den folgenden Schritten: a.) Inkubation eines ersten Arrays enthaltend Proteine mit
Patientenseren, -blut, -plasma, b.) Identifikation der Proteine mit Autoantigen-Autoantikörper
Wechselwirkungen und c.) Re-Arraying der identifizierten Proteine auf einen zweiten Array, d.) Inkubation des Arrays aus c.) mit Patientenseren, -blut, - plasma. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht der erste Array aus einer cDNA Expressionsbibliothek (beschrieben, supra) und zwar mit mindestens 10.000 Clonen oder Proteinen. Ferner ist bevorzugt, dass der erste Array in a) redundante Clone oder Proteine aufweist.
„Re-Arraying" bedeutet, dass identifizierte Proteine oder Clone zu einem zweiten Array neu angeordnet werden.
Die Visualisierung solcher Autoantikörper-Autoantigen- Wechselwirkungen kann beispielsweise mittels Fluoreszenzmarkierung, Biotinylierung oder Radio-Isotopen- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners .
Selbstverständlich sind ebenfalls andere analytische Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von Autoantigenen möglich (ELISA, BIAcore, u.a.). Entsprechend identifizierte Autoantigene können nach üblichen Methoden isoliert, angereichert oder kloniert werden.
Daher betrifft die erfindungsgemäße Therapie solche Autoantigene die erhältlich sind aus einem Screeningverfahren mittels eines beliebigen analytischen Verfahren, insbesondere solche wie Protein-Mikro-und Makroarrays, ELISA und / oder BIAcore.
Ferner betrifft die erfindungsgemäße Therapie solche
Trägermaterialen (Adsorber) , die in der Lage sind Autoantigene zu fixieren oder zu immobilisieren. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist der Adsorber biokompatibel (Jayabalan M.
Sterilization and reprocessing of materials and medical devices—reusability. J Biomater Appl. 1995 JuI; 10 (1) : 97-112.
Review., Ota K. Biocompatibility and capability of haemopurification Systems: review and future development.
Nephrol Dial Transplant. 1991;6 Suppl 2:86-90. Review).
Geeignete Trägermaterialien (im weitesten Sinne Matrix) sind solche nicht abschließend, wie beispielweise Glas, Kohlenhydrate und modifizierte Kohlenhydrate, Sepharose, Proteine, wie z.B. Collagen oder Gelatine, Silica oder organische Matrices, Polymere wie Polyamiden, PVDF, Nylon, Nitrocellulose u.a..
Das Trägermaterial (Matrix) kann in der Form von sphärischen, unaggregierten Partikeln, sog. Beads, Fasern oder einer Membran vorliegen, wobei eine Porosität der Matrix die Oberfläche erhöht. Die Porosität kann beispielsweise in üblicher Weise durch Zugabe von Porenbildnern, wie Cyclohexanol oder 1-Dodecanol zu der Reaktionsmischung der Suspensionspolymerisation erreicht werden.
Die Autoantigene können in bekannter und beliebiger Weise auf das Trägermaterial aufgebracht werden. In einer bevorzugten Variante ist beispielsweise das Autoantigen ein Fusionsprotein (Beispiele, supra) , welches geeignet ist, an dem Trägermaterial zu haften.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, können mittels der bereitgestellten Protein-Mikro-und Makroarrays für den Patienten individuelle Autoantigene identifiziert werden und in das therapeutische Verfahren eingesetzt werden. Sofern lediglich bereits 50 - 40 % oder gar 20 - 10 % der Autoantigene einer Autoimmunerkrankung qualitativ identifiziert und spezifisch werden, stellt sich bereits ein erheblicher oder signifikanter Therapieerfolg ein. Beispielsweise sind für MS 20 Autoantigene bekannt und aktiv. Hiervon können bereits 8 und weniger zu einem therapeutischen Erfolg führen.
In einer weiteren Ausführungsform können, ebenfalls nicht individuelle Autoantigene gemittelt über eine Patientenzahl (bereits 5 Patienten gelten als signifikant) für eine Gesamtheit von Patienten verwendet werden. Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren, wobei nicht-individuelle indikationsspezifische Autoantigene von einer bestimmten Auswahl von Patienten zur erfindungsgemäßen Therapie einer beliebigen Gesamtheit (immer größer als die genannte bestimmte Auswahl) von Patienten eingesetzt werden.
Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung oder Kit bestehend aus einem Trägermaterial enthaltend ausgewählte Autoantigene samt üblichen Mitteln, insbesondere Bauteilen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Therapie bzw. Blutwäsche / Immunadsorptionstherapie sowie des erfindungsgemäßen Verfahren. Entsprechende bekannte Vorrichtungen zur Blutwäsche oder Immunadsorptionstherapie können entsprechend adaptiert werden.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Trägermaterials enthaltend Autoantigene zur
Immunadsorptionstherapie. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Trägermaterials enthaltend Autoantigene zur Adsorption von Autoantikörpern aus Blut oder Blutplasma von Patienten mit Autoimmunerkrankungen.
Um zu verhindern, dass unerwünschte Substanzen, z. B. Substanzen, die vom Trägermaterial herrühren, mit dem behandelten Blut bzw. Blutplasma in den Blutkreislauf des
Patienten gegebenenfalls zurückgeführt wird, befindet sich am Auslass der Vorrichtung des Trägermaterials vorzugsweise ein Filter. Dabei handelt es sich vorzugsweise um einen Partikelfilter geeigneter Größe.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Hochdurchsatz Identifizierung von Protein-Antigenen Für die sichere Identifizierung von mammalia Autoantigenen müssen möglichst viele der durch das jeweilige Genom eines Organismus bestimmte Expressionsprodukte (Proteine) in einem Testformat, z.B. in Arrayanordnung, verfügbar sein. Diese, z.B. in Form eines Makroarrays auf einem Trägermaterial geeigneter Größe bereitgestellte Proteinvielfalt, wurde genutzt um durch Inkubation mit mammalia Seren enthaltene Autoantikörper zu identifizieren. Hierbei ist es besonders vorteilhaft, wenn auf dem Makroarray bereitgestellten Expressionsklone bzw. Expressionsprodukte eine gewisse Redundanz, z.B. zwischen 1-10, aufweisen.
Es wurden Screenings unter Verwendung von Hochdichtefiltern von Expressionsbibliotheken durchgeführt. Solche Hochdichtefilter enthalten eine große Proteinsammlung mit mindestens 10.000 unterschiedlichen Proteinen. Darüber hinaus ist ein solcher Screening-Ansatz bereits erfolgreich beschrieben worden (Gutjahr, C, et al., Mouse protein arrays from a T(H)I cell cDNA library for antibody Screening and serum profiling. Genomics, 2005. 85(3): p. 285-96). Für diesen Screening-Ansatz wurden Hochdichtefilter der „human fetal brain" Expressionsbibliothek (Büssow, K., (1998), supra) , sowie der T-Lymphocyten spezifischen Expressionsbibliothek verwendet.
Beispiel 2
Validierung der in Beispiel 1 identifizierten Autoantigene mit Hilfe von Protein-Mikroarrays .
Die in Beispiel 1 identifizierten Autoantigen exprimierenden Expressionsklone wurden re-arrayed (d.h. positiv identifizierte Clone wurden auf einen zweiten Array aufgebracht) , kultiviert und die Expressionsprodukte über IMAC gereinigt. Hierzu wurden die gereinigten Proteine zunächst über SDS-Gelelektrophorese auf ihre Reinheit hin überprüft und zusätzlich massenspektrometrisch analysiert. Die derart gereinigten und charakterisierten Proteine wurden anschließend auf einen geeigneten Träger zur Herstellung eines Mikroarrays gespotted. Die in Beispiel 1 produzierten Proteine wurden mit einem Spotting-Roboter auf Nitrocellulose-beschichtete Trägeroberflächen übertragen. Darüber hinaus enthielt der Protein Biochip zusätzliche Kontrollproteine. Zur
Prozesskontrolle wurden humanes IgG und Maus-IgG verwendet. Diese Immunglobuline wurden von den für die Detektion von humanen Autoantikörpern notwendigen sekundären Antikörpern gebunden und können neben der Prozesskontrolle auch zur Normalisierung („inter chip normalisation") herangezogen werden. Die Prozesskontrollproteine wurden darüber hinaus auf mehrere Quadranten des Chips verteilt. Dies ermöglicht eine sogenannte „Intrafield" Analyse, mit der die Homogenität der Oberfläche bzw. Inkubationsreaktion überprüft wurde. Mit entsprechenden bioinformatischen Tools (reviewed in: Hamacher, Michael / Marcus, Katrin / Stühler, Kai / van Hall, Andre / Warscheid, Bettina / Meyer, Helmut E. (Hrsg.), Proteomics in Drug Research, Methods and Principles in Medicinal Chemistry (Band 28) Herausgegeben von Mannhold, Raimund / Kubinyi, Hugo / Folkers, Gerd) lässt sich basierend auf den
Prozesskontrollproteindaten die Normalisierung innerhalb eines Screens, sowie die Intrafield-Analyse und ggf. folgende Abgleichung innerhalb eines Chips durchführen.
Weiterhin wurden natürliche Autoantigene (NAAs) wie Stathmin oder Tubulin, welche in ungefähr 90% aller Seren (unabhängig ob krank oder gesund) zu finden sind, auf dem Array eingeführt. Damit wurde für Serum Screening Applikationen die Qualität von Seren kontrolliert. Ferner wurden nicht Epitop- getaggte, nicht humane Proteine wie z.B. BSA und Lysozym auf den Protein Biochip aufgebracht. Diese wurden zur Bestimmung des Referenzwertes des Hintergrundes herangezogen. Alle diese Proteine liegen in Duplikaten gespottet (und zum Teil auf mehreren Quadranten) auf dem Protein Biochip vor. Die in Beispiels 2 hergestellten Protein-Biochips werden in Beispiel 5 eingesetzt. Beispiel 3
Patientenauswahl und Serensammlung, Qualitätskontrolle der Seren
Die Patientenauswahl wurde durchgeführt unter Berücksichtigung zum einen von Alter und Geschlecht der Patienten
(Vergleichbarkeit mit der Kontrollgruppe) , sowie von den Krankheitsverlauf beschreibenden Parametern (Klinik- und Laborwerte) . Die Serensammlung erfolgte nach einem standardisierten Protokoll (Abnahme, Zentrifugieren, Aliquotieren, Schockgefrieren und Lagerung bei -800C), wobei insgesamt 15ml Vollblut zur Serengewinnung abgenommen wurden. Insgesamt wurden jeweils mehrere hundert Proben pro Patienten- (RA-Patienten) und Kontrollgruppe gesammelt charakterisiert und untersucht. Die Probendaten (Proben- und Patienten-ID, Abnahmedatum, Medikamentengabe) wurden in einem standardisierten Probenzettel bei der Probenabnahme erfasst und entsprechende Proben wurden gesammelt.
Beispiel 4 Datenbank Generierung
Für den Umgang mit einer hohen Anzahl von Klonen wurde ein Datenbankmodell konzipiert. Anschließend wurde dieses Modell implementiert und eine Datenbank-basierte Server-Client Software erstellt. In dieser Datenbank wurden die Daten eines jeden Clones einer Sammlung erfasst und archiviert. Dazu wurden zum Beispiel die Sequenzierungsinformationen, die Gene Ontology Classifizierung eines korrespondierenden Proteinprodukts, die Expressionsrate und die Informationen zur Qualitätskontrolle wie ID Gel und massenspektrometrische Ergebnisse gespeichert und über verschiedene Filter und
Suchfunktionen verfügbar gemacht. Ein Abbild der Uniclone® Sammlung auf bestehendes Wissen über RA und MS wurde erzeugt. Die Inhalte der Datenbank bilden die Grundlage zur Auswahl aus der Gesamtheit und dient zur Abbildung die bisherigen Informationen für die Indikationen (RA, MS) auf diese Auswahl. Zusätzlich wurden Interfaces zu bestehenden erhältlichen Applikationen und neuartige Applikationen entwickelt, die für die Auswertung der Screening Ergebnisse genutzt wurden. Dabei wurden insbesondere spezielle Aspekte des Chiplayouts (Intrafield-Analyse) , weitere proteinspezifische Aspekte und die teilautomatisierte Qualitätskontrolle der Daten von Protein-Biochips berücksichtigt.
Beispiel 5
Test der Seren auf den Screening Tools
Im Folgenden wurden RA und MS Patienten-Seren katalogisiert und die korrespondierenden Daten in einem entsprechenden Format in die Datenbank eingespeist. Die Patienten-Seren werden dann auf den verschiedenen Screening Tools untersucht. Proteine (Beispiel 1) wurden erste Screenings durchgeführt unter Verwendung von Hochdichtefiltern von Expressionsbibliotheken. Solche Hochdichtefilter enthalten eine große Proteinsammlung mit mindestens 10.000 unterschiedlichen Proteinen. Darüber hinaus ist ein solcher Screening-Ansatz bereits erfolgreich beschrieben worden (Gutjähr, C, et al . , Mouse protein arrays from a T(H)I cell cDNA library for antibody Screening and serum. profiling.
Genomics, 2005. 85(3): p. 285-96). Die in diesem Screening identifizierten Proteine wurden in die Sammlung der 2000 bzw. 4000 Proteine einfließen. Für diesen Screening-Ansatz werden Hochdichtefilter der „human fetal brain" Expressionsbibliothek (Büssow, K., et al., A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 1998. 26(21): p. 5007- 5008), sowie der T-Lymphocyten spezifischen Expressionsbibliothek verwendet.
Es wurden auf den Hochdichtefiltern jeweils Seren von ungefähr 15-20 RA und MS Referenzpatienten untersucht. Die daraus erhaltenen Datensets wurden mit bereits bestehenden Datensets von gesunden bzw. unauffälligen Personen verglichen. In den folgenden Analysepaketen wurden 50-100 RA-Patienten untersucht und mit „Gesund-Kontrollen" im Erwachsenenalter verglichen.
Es wurden alle Versuchsdaten, wie beispielsweise
Chipproduktionsdaten (Produktions-Batch, Protein-Batch) , Patientenprobendaten, sowie die dazu gehörigen Rohdaten aus der Imageauswertung in die Datenbank (Beispiel 4) übernommen. Für alle Analysepakete erfolgt nach der Image-Analyse die bioinformatische Auswertung unter Berücksichtigung der Korrelation der Patientendaten mit den Screening Daten (Beispiel 6) . Diese bioinformatische Untersuchung resultiert in der Selektion von putativ relevanten Protein-Antigenen. Die korrespondierenden Expressionsklone dieser Protein-Antigene werden, wie in Beispiel 8 beschrieben, rückvalidiert .
Beispiel 6
Auswertung der Daten und Selektion relevanter Protein-Antigene
Nach der Image Analyse erfolgt die pre-Prozessierung der Daten (Normalisierung) , um Signal-Werte über verschiedene
Experimente und Batches vergleichbar zu halten. Hierbei werden an einem ersten Testset verschiedene Normalisierungsmethoden und statistischer Tests, die für den Bereich der DNA Microarrays beschrieben wurden, hinsichtlich ihrer Eignung für Protein Microarrays geprüft.
Die aus diesen Analysen bestimmten putativen Biomarker werden dann in Beispiel 5 nochmals mit verschiedenen Testseren von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen wie Sjögren 's Syndrom, SLE oder Alopecia areata untersucht.
Beispiel 7
Vergleichende Proteomstudie von Biopsie-Material aus RA Patienten zur Validierung der identifizierten Antigene
Mit Hilfe proprietärer Technologien, insbesondere der hochauflösenden 2D Large Gel Technology (LGT) werden die Proteome von Biopsie-Material aus 15 RA Patienten und 15 Kontrollprobanden dargestellt und verglichen. Differenzielle Proteine aus dem Proteomvergleich gesunder und RA-Patienten werden anschließend statistisch ausgewertet und mittels üblicher Massenspektrometrie-Techniken identifiziert.
Um die statistische Relevanz der Analyseergebnisse zu erhöhen, die Gel-zu-Gel-Vergleichbarkeit zu verbessern und zusätzlich einen größeren dynamischen Bereich der Einzelkomponenten innerhalb der komplexen Analytmischung abzudecken, wurden die Proteome mit Hilfe der State-of-the-art-Technologie 2-D DIGE fluorescence difference gel electrophoresis dargestellt und verglichen.
Der Vergleich des Biopsiematerials von Kontroll-Spendern mit RA-Patienten wurde dazu eingesetzt, die unterschiedlich gefundenen Antigene des Seren-Screenings zu bestätigen und gleichzeitig mögliche weitere Proteine zu identifizieren, die bei RA signifikant in ihrer Menge verändert sind.
Beispiel 8
Validierung der relevanten Protein-Antigene über Western
Immunoblot
Die Rückvalidierung der selektierten Protein-Antigene erfolgt mit einem anderen Aliquot des gleichen Serums mittels Western Immunoblot erfolgen. Hierzu wurden die entsprechenden Antigene im analytischen Maßstab hergestellt.
Beispiel 9
Alle als positiv validierten Protein-Antigene wurden für die Erstellung des Prototypen verwendet. Alle Proteine wurden aufgereinigt, und über SDS-PAGE, sowie MALDI-MS (-MS) auf ihre Identität und Qualität hin überprüft. In Vorversuchen wurde für jedes der selektierten Protein-Antigene unter Verwendung definierter Testplasma der notwendige Konzentrationsbereich bestimmt . Die isolierten Autoantigene wurden an eine handelsübliche Adsorptionssäule aufgebracht. Patientenblut- oder -plasma- Proben wurden über diese Säulen gewaschen. Anschließend wurde mittels Protein Biochips und ELISA untersucht, ob die gewaschenen Blut- oder Plasma-Proben noch die krankheitsspezifischen Antigene erkennen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Behandlung und Prophylaxe von Autoiπimunerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Adsorption von Autoantikörpern aus Blut oder Blutplasma extrakorporal mittels Autoantigenen erfolgt.
2. Verfahren zum Herstellen eines Adsorbens zur Adsorption von Autoantikörpern in Blut oder Blutplasma, umfassend die folgenden Schritte: a.) Bereitstellen eines Trägermaterials, b.) Immobilisieren oder Fixieren von mindestens einem
Autoantigen auf ein Trägermaterial und Inkontaktbringen des Adsorbens mit Blut oder Blutplasma.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Autoimmunerkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe :
Alopecia Areata Anämie, autoimmun-hämolytische (AIHA) vom Kältetyp
(Kälteagglutininkrankheit)
Anämie, autoimmun-hämolytische (AIHA) vom Wärmetyp Anämie, autoimmun-hämolytische Donath-Landsteiner (paroxysmale Kältehämoglobinurie) Anämie, perniziöse (Morbus Biermer, Addison-Anämie)
Antiphospholipid Syndrom (APS) Arteriitis temporalis (Riesenzellarteriitis) Atherosklerose (Arteriosklerose, Arterienverkalkung) Autoimmun-Adrenalitis (autoimmune Nebennierenrinden- Atrophie, Morbus Addison)
Chronisches Erschöpfungssyndrom (Chronic Fatigue Immune Dysfunction Syndrome; CFIDS) Chronisch-inflammatorische, demyelinisierende Polyneuropathie (CIDP) Churg-Strauss Syndrom Cogan-Syndrom
Colitis ulcerosa
CREST-Syndrome (Syndrom mit Calcinosis cutis,
Raynaud-Phänomen, Motilitätsstörungen des Ösophagus = engl. Esophagus, Sklerodaktylie und
Teleangiektasien)
Diabetes mellitus Typ 1 (Insulin-abhängiger Diabetes mellitus)
Dilatativen Cardiomyopathie (DCM) Dermatitis Herpetiformis During
Dermatomyositis
Fibromyalgie
Gastritis, chronisch autoimmune
Goodpasture Syndrom (Anti-GBM vermittelte Glomerulonephritis)
Guillain-Barre-Syndrom (GBS; Polyradikuloneuritis)
Hashimoto Thyroiditis
Hepatitis, autoimmune (Chronisch aktive Hepatitis;
CAH) Idiopathische Pulmonale Fibrose (IPF)
Immun-thrombozytopenische Purpura (Morbus Werlhof;
ITP)
Infertilität, autoimmune
InnenohrSchwerhörigkeit, autoimmune (AIED) Juvenile rheumatoide Arthritis (Morbus Still, Still-
Syndrom)
Kardiomyopathie, autoimmune
Kälteagglutininkrankheit (siehe auch: Anämie, autoimmun-hämolytische vom Kältetyp) Kryoglobulinämie, essentielle gemischte
Lambert-Eaton-Syndrom
Liehen sclerosus
Lupus erythematodes (diskoide Form)
Lyme-Arthritis (Borrelien-Arthritis, Lyme-Krankheit) Mischkollagenose (Mixed Connective Tissue Disease;
MCTD) Morbus Addison (siehe auch: Autoimmun-Adrenalitis; autoimmune Nebennierenrinden-Atrophie)
Morbus Basedow (Graves Krankheit)
Morbus Behget Morbus Crohn
Morbus Bechterew ( Spondylitis ankylosans)
Morbus Meniere (Meniere Krankheit)
Morbus Reiter (siehe auch: Reiter Syndrom)
Multiple Sklerose (MS; Encephalomyelitis disseminata; Charcot-Krankheit)
Myasthenia gravis (Myasthenie; MG)
Ophthalmie, sympathische
Pemphigoid, vernarbendes
Pemphigoid, bullöses Pemphigus vulgaris
Perniziöse Anämie (Morbus Biermer; Addison-Anämie; siehe auch Anämie, perniziöse)
Polyarteriitis nodosa (Periarteriitis nodosa)
Polychondritis (Panchondritis) Polyglanduläres Autoimmun- (PGA) -Syndrom (Schmidt 's
Syndrom)
Polymyalgia rheumatica
Polymyositis
Polyneuropathie, chronisch-inflammatorische, demyelinisierende (siehe auch: Chronisch- inflammatorische, demyelinisierende Polyneuropathie,
CIDP)
Primäre biliäre Zirrhose (PBC; primäre Autoimmun-
Cholangitis) Psoriasis (Schuppenflechte)
Reiter Syndrom (Morbus Reiter; Urethro- konjunktivales-synoviales Syndrom)
Rheumatisches Fieber
Riesenzellarteriitis (siehe auch: Arteriitis temporalis)
Rheumatoide Arthritis (chronische Polyarthritis,
"Gelenkrheuma") Sarkoidose (Morbus Boeck, Besnier-Boeck-Schaumann
Krankheit)
Sj ögren-Syndrom
Sklerodermie Spondylitis ankylosans (siehe auch: Morbus
Bechterew)
Sprue/Zöliakie
Stiff-Man-Syndrom (SMS; Moersch-Woltmann-Syndrom)
Systemischer Lupus erythematodes (SLE) Takayasu Arteriitis (Takayasu Krankheit;
Aortenbogen-Syndrom)
Transiente Gluten-Intoleranz
Uveitis, autoimmune
Vaskulitis Vitiligo (Weißfleckenkrankheit)
Wegenersche Granulomatose (siehe: Morbus Wegener) .
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung Transplantatabstoßung umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Autoantigene erhältlich sind mittels eines analytischen Verfahren, insbesondere solche wie Proteinmikro- und / oder makroarrays, ELISA, BIAcore.
6. Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von mindestens einem Autoantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bestehend aus den folgenden Schritten: a.) Inkubation eines ersten Arrays enthaltend Proteine mit Patientenseren, -blut, -plasma, b.) Identifikation der Proteine mit Autoantigen- Autoantikörper Wechselwirkungen und c.) Re-Arraying der identifizierten Proteine auf einen zweiten Array, d. ) Inkubation des Arrays aus c.) mit Patientenseren, - blut, -plasma.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Array in a.) aus einer cDNA Expressionsbibliohek mit vorzugsweise mehr als 10.000 Clonen und / oder Proteinen besteht und ggfs. redundante Clone und / oder Proteine enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial aus Glas, Kohlenhydrate, modifizierte Kohlenhydrate, Sepharose, Silica oder organische Matrices, Polymere wie Polyamiden, PVDF, Nylon, Nitrocellulose besteht, insbesondere in Form von sphärischen, unaggregierten Partikeln, wie Beads, Fasern oder einer Membran vorliegen.
9. Verwendung eines Trägermaterials nach Anspruch 8 enthaltend Autoantigene zur Immunadsorptionstherapie .
10. Verwendung eines Trägermaterials nach Anspruch 8 enthaltend Autoantigene zur Adsorption von Autoantikörpern aus Blut oder Blutplasma.
11. Vorrichtung oder Kit bestehend aus einem Trägermaterial enthaltend Autoantigene zur Durchführung eines
Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
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