EP1941036A1 - Nouveaux oligonucléotides anti-gènes spécifiques de la tyrosinase comme agents dépigmentants - Google Patents

Nouveaux oligonucléotides anti-gènes spécifiques de la tyrosinase comme agents dépigmentants

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Publication number
EP1941036A1
EP1941036A1 EP06793134A EP06793134A EP1941036A1 EP 1941036 A1 EP1941036 A1 EP 1941036A1 EP 06793134 A EP06793134 A EP 06793134A EP 06793134 A EP06793134 A EP 06793134A EP 1941036 A1 EP1941036 A1 EP 1941036A1
Authority
EP
European Patent Office
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oligonucleotide
tyrosinase
composition
skin
seq
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06793134A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Robin KURFÜRST
Mathilde Bonnet-Duquennoy
Kristell Lazou
Carine Giovannangeli
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
LVMH Recherche GIE
Museum National dHistoire Naturelle
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
LVMH Recherche GIE
Museum National dHistoire Naturelle
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, LVMH Recherche GIE, Museum National dHistoire Naturelle filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1941036A1 publication Critical patent/EP1941036A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine

Definitions

  • the present invention relates to an anti-gene oligonucleotide hybridizing specifically with the gene encoding human tyrosinase by Hoogsteen pairing between complementary bases, said oligonucleotide forming a triple helix structure with the human tyrosinase gene.
  • the invention also relates to the use of said oligonucleotide as a depigmenting or whitening agent for the skin in a cosmetic composition or in a dermatological composition.
  • pigmentation results from the synthesis and distribution of melanin pigments in the skin, hair follicles or eyes. Pigmentation is genetically predefined but it is regulated by many internal or external factors.
  • the melanins produced by melanocytes as well as the number of melanocytes, their tyrosinasic activity and their ability to export melanins to keratinocytes, the size of melanosomes that contain melanin grains, will condition the color of human skin. For each individual, the color of the skin varies mainly according to the more or less significant irradiation of ultraviolet (UV) rays.
  • UV ultraviolet
  • the difference of shade of the skin between the basic pigmentation and the maximum pigmentation is more or less important.
  • people belonging to certain populations with light skin (basic pigmentation) react quickly and / or important to the action of the UV and can thus easily present a skin of dark shade, even when these people did not have exposed themselves voluntarily and prolonged to the sun.
  • these people will be referred to as "people who are very reactive to UV”. This is particularly true of populations of Asian origin or of certain so-called mixed-race populations.
  • the mechanism of formation of cutaneous pigmentation involves the synthesis of melanins. This mechanism is particularly complex and schematically involves the following main steps: Tyrosine "* • Dopa” * • Dopaquinone "* • Dopachrome” * • melanins
  • TRP-I tyrosinase-related-protein 1
  • a molecule is recognized as depigmenting if it acts directly on the epidermal melanocytes by inhibiting the activity of these cells and / or if it blocks one of the stages of melanin biosynthesis or if it degrades the melanin formed. This is particularly the case when the molecule inhibits one of the enzymes involved in melanogenesis or when it reacts with the chemical compounds of the melanin synthesis chain.
  • the known depigmenting substances are in particular hydroquinone and its derivatives, ascorbic acid and its derivatives, placental extracts, kojic acid, arbutin, iminophenols, the combination of carnitine and quinone, amide derivatives of amino-phenol, and benzothiazole derivatives. These substances may have certain disadvantages. They may be unstable, require use at high concentrations, lack specificity as to their mode of action, or be cytotoxic or irritant. The topical use of effective and harmless depigmenting substances is particularly sought after in cosmetics and dermatology.
  • these substances are used to treat regional hyperpigmentations by melanocytic hyperactivity such as idiopathic melasmas, hyperpigmentations localized by melanocytic hyper-activity such as pigmentary spots called solar lentigo and senile lentigo, accidental hyperpigmentations such as photosensitization or post-injury healing, as well as some leukoderma such as vitiligo.
  • melanocytic hyperactivity such as idiopathic melasmas
  • hyperpigmentations localized by melanocytic hyper-activity such as pigmentary spots called solar lentigo and senile lentigo
  • accidental hyperpigmentations such as photosensitization or post-injury healing
  • some leukoderma such as vitiligo.
  • Depigrating substances are also used as skin whitening agents by some people, in particular those mentioned above, which are very reactive with UV, to lighten their complexion, especially that of their face and their hands, so to keep skin color as clear as possible or at least to reduce the pigmenting effects of UV rays.
  • oligonucleotides for treating melanocyte dysfunction has been described in application US 20040014700. Furthermore, certain strategies for obtaining a depigmentation consist in blocking the synthesis of tyrosinase by the use of an oligonucleotide. Double-stranded RNA (FR 2840217). In previous applications, the biological target considered is messenger RNA.
  • the object of the present invention is to provide a depigmenting agent acting on the process of melanogenesis, intended firstly, in the case of a substantially homogeneous pigmentation, the bleaching of the skin and / or hair, it that is to say to reduce their pigmentation, and secondly, to fight against cutaneous hyperpigmentation, ie when the skin has a heterogeneity of pigmentation.
  • the inventors of the present invention have found that oligonucleotides capable of hybridizing with the gene coding for tyrosinase and only with this gene exhibit depigmenting activity.
  • that of the present invention therefore consists in using an oligonucleotide capable of hybridizing with the gene itself.
  • An advantage of this is that the oligonucleotides of the present invention can hybridize with the gene as a double-stranded DNA, whereas the oligonucleotides described in particular in the applications US 20040014700 or FR 2840217 do not have this capacity.
  • Another advantage of this new strategy is that the gene is a less abundant entity than messenger RNA or the protein for which it codes, since most genes have two alleles in diploid cells. As a result, this activity exists even at very low concentration, which increases the interest of these oligonucleotides.
  • the oligonucleotides according to the invention have no cytotoxicity and can be synthesized, characterized, isolated with a high degree of purity and this industrially.
  • the oligonucleotides according to the invention therefore intervene very far upstream of the mechanisms of melanogenesis, interacting directly with the tyrosinase gene to modulate its expression and consequently inhibit the expression of the messenger RNA coding for tyrosinase. This results in a decrease in tyrosinase levels in melanocytes.
  • the oligonucleotides according to the invention offer an ideal solution to the problems posed by the substances conventionally used. Known substances that inhibit the activity of tyrosinase have multiple unacceptable side effects due to their low specificity. Among the various sequences tested, we have found that the sequence SEQ ID No.
  • the invention relates to an anti-gene oligonucleotide comprising a sequence of 15 to 25 nucleotides comprising the sequence 5'- C * TTC * TC * TC * TTTTTC * C * TTTTTC * -3 '(SEQ ID No. 1, C * designating a 5-methyl-cytosine) specifically hybridizing with the gene encoding human tyrosinase by Hoogsteen pairing between complementary bases, said oligonucleotide forming a triple helix structure with the human tyrosinase gene.
  • this anti-gene oligonucleotide comprises between 18 and 21 nucleotides or between 21 and 25 nucleotides, preferably 21 nucleotides.
  • oligonucleotides according to the invention hybridize directly to the gene consisting of a DNA double helix in the cell. They thus make it possible to achieve an ultimate modulation of the amount of messenger RNA coding for tyrosinase and therefore of this enzyme produced by the gene.
  • Hybridization is used to designate the formation of hydrogen bonds, also known as Hoogsteen or reverse-Hoogsteen pairing, between on the one hand the complementary bases, usually distributed on two strands of nucleic acid forming a double helix according to the Watson scheme.
  • - Crick on the other hand a third strand to form a triplex, triple helix structure.
  • the degree of complementarity between the nucleic acid sequences is determined by comparing, after alignment, the first sequence with the complementary sequence of the second sequence.
  • the degree of complementarity is calculated by determining the number of complementary positions for which the nucleotide is complementary between the two sequences thus compared, by dividing this number of complementary positions by the total number of positions and multiplying the result. obtained by 100 to obtain the degree of complementarity between these two sequences expressed as a percentage.
  • the term "specific hybridization” means in particular that there is a degree of complementarity sufficient to avoid nonspecific binding of the oligonucleotide to a non-targeted sequence under conditions where specific binding is desired.
  • the oligonucleotides according to the invention preferably hybridize specifically with the gene coding for tyrosinase.
  • the oligonucleotides of the invention are capable of hybridizing only with the DNA of the genes that encode tyrosinase.
  • the oligonucleotides according to the invention comprise a number of nucleotides sufficient in identity and in number to hybridize specifically.
  • the subject of the present invention is therefore oligonucleotides which hybridise specifically upstream of and / or with the region having the codon for initiation of gene translation.
  • DNA which codes for tyrosinase both exons and introns, especially exons.
  • the subject of the present invention is also oligonucleotides, comprising one or more chemical modifications at their sugar moieties, their nucleobase moieties or their internucleotide backbone which confer desirable physicochemical characteristics on the oligonucleotides according to the invention such as increased bioavailability. , increasing the affinity for target sequences, increasing cellular internalisation or better biological stability or increasing stability in the presence of cellular nucleases.
  • LNAs Locked Nucleic Acids
  • PNAs Peptide Nucleic Acids
  • PNA protein kinase
  • backbone is composed of repeating units of N- (2-aminoethyl) -glycine connected by linkages. peptide.
  • the different purine bases and pyrimidines are linked to the backbone by methylene carbonyl bonds. The structure is presented below:
  • LNA LNA
  • a nucleic acid analogue containing a 2'-O, 4'-C methylene layer This pond blocks the flexibility of the ribofuranose cycle by forming a rigid bicyclic structure. The structure is presented below:
  • oligonucleotide refers to polynucleotides formed from natural nucleobases and pentafuranosyl (sugar) groups forming nucleosides which are linked together by native phosphodiester bonds.
  • oligonucleotides therefore refers to natural species or synthetic species formed from natural subunits or their close homologues.
  • oligonucleotides may also refer to those parts which have functions similar to natural oligonucleotides but which may exhibit unnatural portions.
  • the oligonucleotides may have sugar moieties, nucleobase moieties, or modified internucleotide linkages.
  • the preferred modifications are Locked Nucleic Acids (LNAs) as described by Braasch DA and Corey DR (Chem Biol.2001, 8, 1-7), N3'-derivatives.
  • Phosphoramidates as described by Faria M and Giovannangeli C (J.
  • PNA Peptide Nucleic Acids
  • the 2'-O-alkyl derivatives on the sugar part in particular the 2'-O-ethyloxymethyl or 2'-O-methyl derivatives, and / or the phosphorothioates or the methylphosphonates for the internucleotide backbone or derivatives thereof.
  • 5 'and / or 3' carriers of intercorptive type reactive group such as acridine or bridging with the target sequence such as psoralen or an azide group.
  • the chimeric oligonucleotides are included in the preferred modifications of the invention.
  • the oligonucleotides contain at least two chemically different regions, each comprising at least one nucleotide. It is in particular one or more regions comprising a modified nucleotide which confers one or more beneficial properties such as for example a better biological stability, an increased bioavailability, the increase of the cellular internalisation or the increase of the affinity for the target DNA.
  • the chimeric oligonucleotides according to the invention are the locked nucleic acids (LNA), the N3'-P5 'phosphoramidate derivatives, the peptide nucleic acids or molecules with an internucleotide backbone which may be wholly or partly phosphodiesters, or phosphorothioates, or methylphosphonates or combinations of phosphodiester and / or phosphorothioate and / or methylphosphonate linkages.
  • LNA locked nucleic acids
  • N3'-P5 'phosphoramidate derivatives the peptide nucleic acids or molecules with an internucleotide backbone which may be wholly or partly phosphodiesters, or phosphorothioates, or methylphosphonates or combinations of phosphodiester and / or phosphorothioate and / or methylphosphonate linkages.
  • oligonucleotides may also refer to oligonucleotides to which a plasmid-type circular delivery vector or a nucleic or peptide-type linear delivery vector has been grafted.
  • the present invention also relates to a cosmetic or dermatological composition containing at least one oligonucleotide described above and at least one excipient or vehicle cosmetically or dermatologically acceptable.
  • a cosmetic or dermatological composition containing at least one oligonucleotide described above and at least one excipient or vehicle cosmetically or dermatologically acceptable.
  • Such a composition may contain, in addition, one or more active ingredients. This or these active ingredients are intended to supplement or reinforce the desired depigmenting effects.
  • the present invention also relates to the use of oligonucleotides capable of hybridizing specifically with the genes coding for tyrosinase as cosmetic agents, in particular for depigmenting and / or bleaching the skin or hair, and / or for reducing stains. pigmentary skin of human skin.
  • the present invention comprises cosmetic compositions using these oligonucleotides as cosmetic agents. They are intended in particular to lighten the complexion, prevent or treat the formation of pigmentary spots due to the action of solar radiation, to reduce pigmentary spots of senescence (senile lentigo), especially on the hands, or to lighten the hairiness of the skin. body or limbs.
  • the present invention also relates to the use of the oligonucleotides described above for the manufacture of a dermatological medicament for the treatment or prevention of diseases resulting in overexpression and overactivity of tyrosinase, topically.
  • This drug may be intended to treat or prevent regional hyperpigmentations by hyper-active melanocytic such as idiopathic melasmas, accidental hyperpigmentations such as photosensitization or in some cases post-injury healing, and for the attenuation of pigmentary contrasts in some leukoderma such as vitiligo.
  • the present invention also relates to a depigmenting composition characterized in that it contains, in a cosmetically and / or dermatologically acceptable medium, an oligonucleotide sequence directed against the gene coding for tyrosinase.
  • the cosmetic composition and the drug according to the invention are suitable for topical use and therefore contain a cosmetically or dermatologically acceptable medium, that is to say, compatible with the skin.
  • the oligonucleotide sequence according to the invention may be present in an amount ranging from 0.00001% to 10% and preferably from 0.0003% to 3% of the total weight of these compositions.
  • compositions of the invention may be in any form suitable for topical application, especially in the form of an aqueous solution, hydroalcoholic or oily, an oil-in-water or water-in-oil emulsion, single or multiple, an aqueous or oily gel, a liquid, pasty or solid anhydrous product, an aqueous or oily dispersion of solid particles, such as nanospheres or polymeric nanocapsules, or an aqueous dispersion of lipid vesicles of ionic or nonionic type, as described in French patent FR 2534487.
  • compositions may be more or less fluid and have the appearance of a white or colored cream, an ointment, a milk, a lotion, a serum, a paste or a mousse . They can optionally be applied to the skin in the form of an aerosol. They may also be in pulverulent solid form or not, for example in stick form. They may also be in the form of single doses, patches, pencils, or applicators allowing a localized application on the spots of the face or hands.
  • the cosmetic composition in particular can be formulated for use as a care product and / or as a make-up product.
  • compositions of the invention may also contain the usual adjuvants in the cosmetic and dermatological fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic active agents, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, sunscreens, pigments, odor absorbers and dyestuffs.
  • adjuvants in the cosmetic and dermatological fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic active agents, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, sunscreens, pigments, odor absorbers and dyestuffs.
  • the amounts of these various adjuvants are those conventionally used in the fields under consideration. These adjuvants, depending on their nature, can be introduced into the fatty phase, into the aqueous phase, into the lipid vesicles and / or into the nanoparticles and / or nanospheres.
  • the proportion of the fatty phase may range from 5 to 80% by weight, and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the oils, emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition in emulsion form are chosen from those conventionally used in the field under consideration.
  • the emulsifier and the co-emulsifier are present in the composition in a proportion ranging from 0.3% to 30% by weight, and preferably from 0.5% to 20% by weight relative to the total weight of the composition. composition.
  • oils that can be used in combination with the oligonucleotides according to the invention mention may be made of mineral oils (vaseline oil), oils of vegetable origin (avocado oil, soya oil), oils of animal origin (lanolin ), synthetic oils (perhydrosqualene), silicone oils (cyclomethicone) and fluorinated oils (perfluoropolyethers).
  • mineral oils vaeline oil
  • oils of vegetable origin oils of vegetable origin
  • oils of animal origin lanolin
  • synthetic oils perhydrosqualene
  • silicone oils cyclomethicone
  • fluorinated oils perfluoropolyethers
  • Fatty alcohols cetyl alcohol
  • fatty acids fatty acids
  • waxes can also be used as fat.
  • emulsifiers and coemulsifiers that can be used in combination with the oligonucleotides according to the invention, mention may be made, for example, of fatty acid and polyethylene glycol esters, such as PEG-20 stearate and fatty acid and glycerin esters, such as glyceryl stearate.
  • hydrophilic gelling agents that may be used in combination with the oligonucleotides according to the invention, mention may in particular be made of carboxyvinyl polymers (carbomer), acrylic copolymers such as copolymers of acrylates / alkylacrylates, polyacrylamides, polysaccharides, natural gums and clays.
  • lipophilic gelling agents that may be mentioned are modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids, hydrophobic silica and polyethylenes.
  • the present invention relates to a cosmetic or dermatological composition containing at least one oligonucleotide described above and one or more other active agents.
  • the present invention also relates to a cosmetic or dermatological process for depigmenting and / or bleaching human skin comprising applying to the pigmented skin a cosmetic composition comprising an oligonucleotide sequence directed against the gene coding for tyrosinase. More particularly, the invention relates to a cosmetic treatment method for depigmenting or bleaching the skin, characterized in that it comprises the application of a composition defined above to one or more pigmented area (s) of the skin. skin for a fixed period. Optionally it is possible to repeat the operation until the appearance of the depigmenting effect.
  • the oligonucleotide content is preferably between 0.0003% and 3% of the total weight of the composition.
  • the present invention also relates to the use of an oligonucleotide as described above for the manufacture of a medicament for simultaneous administration, separate or spread over time in combination with one or more active agents.
  • the cosmetic composition of the invention may further comprise one or more active ingredients that can be used in cosmetics. Said active agents, in combination with the oligonucleotides according to the invention, are used pure or from extracts containing these active ingredients.
  • ellagic acid and its derivatives are especially selected from the following compounds: ellagic acid and its derivatives; resorcinol and its derivatives; arbutin and its derivatives, vitamin C and its derivatives; pantothenate sulfonate and its derivatives; molecules interfering directly or indirectly with the alpha-melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) or its receptor or adrenocorticotropic hormone (ACTH); polyols such as glycerine, glycol or propylene glycol; keratolytic and / or desquamating agents such as salicylic acid and its derivatives; alpha-hydroxy acids such as lactic acid or malic acid, alone or grafted; retinoic acid; retinaldehyde; retinol and its derivatives such as palmitate, propionate or acetate, in liposomal preparation or not; anti-glycation agents and / or antioxidants taken alone or in combination such as tocopherol and its derivatives, ergothi
  • one and / or the other may be incorporated into spherules, in particular liposomes or vesicles formed from ionic or nonionic amphiphilic lipids as described in the patent.
  • spherules in particular liposomes or vesicles formed from ionic or nonionic amphiphilic lipids as described in the patent.
  • FR 2534487 and / or nanoparticles and / or nanospheres and / or nanocapsules The following examples illustrate the present invention without limiting it.
  • Figure 1 Effect of oligonucleotides SEQ ID No. 1 composed of LNA bases and SEQ ID 6 on the expression of the tyrosinase gene in normal human melanocytes treated with 500 nM oligonucleotides for 8 hours.
  • the symbol * represents a statistically significant difference (p ⁇ 0.05) compared to untreated cells.
  • Figure 2 Effect of oligonucleotide SEQ ID No. 1 composed of DNA bases on the expression of the tyrosinase gene in normal human melanocytes treated with 500 nM oligonucleotides for 8 hours.
  • the symbol * represents a statistically significant difference (p ⁇ 0.05) compared to untreated cells.
  • Figure 3 Effect of oligonucleotide SEQ ID No. 1 on DOPA oxidase activity of tyrosinase in normal human melanocytes.
  • the DOPA oxidase activity is determined in terms of OD per minute and normalized with respect to the viability obtained using the XTT test.
  • the symbol * represents a statistically significant difference (p ⁇ 0.05) compared to untreated cells.
  • Oligonucleotides with natural bases were synthesized with an automatic synthesizer (Perseptive Biosystems Expedite Model 8909) using standard phosphoramidite derivative chemistry using the manufacturer's protocols.
  • the ⁇ -cyanoethyldiisopropylphosphoramidite derivatives of the nucleosides have been used.
  • the oxidation step of the phosphite was carried out with an iodine solution. After cleavage of the column (Controlled Pore Glass, Perseptive Biosystems) and total deprotection of the sequence by a treatment of 18 h at 55 ° C.
  • the oligonucleotides were purified by precipitation in ethanol in presence of sodium acetate. Controls by high pressure liquid chromatography were then carried out by ion exchange chromatography with elution by a sodium chloride gradient and by reverse phase chromatography. Cl 8 eluting with a gradient of acetonitrile in the presence of triethylammonium acetate.
  • the LNA oligonucleotides were synthesized by Proligo or Eurogentec. By way of examples, oligonucleotides have been synthesized. They are described in Table 1. The stars mentioned next to the cytosines indicate that these bases are methylated in position 5. The first 5 sequences of this table, numbered from SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 were subjected to 'studies. Their hybridization property with their target sequence on the tyrosinase gene and their depigmenting activity are reported in the following examples.
  • SEQ ID No. 7 A so-called "scrambled control" sequence, designated SEQ ID No. 7, also in Table 1, comprising the same bases, in kind and in number, as those of the sequence SEQ ID No. 1, but placed in any order. TABLE 1
  • the gel delay technique makes it possible to demonstrate the hybridization of an oligonucleotide with its target DNA sequence.
  • the presence of the target DNA with the oligonucleotide of the radiolabeled invention generates a DNA-o ligonucleotide complex whose migration will be slowed compared with that of the free oligonucleotide. Determining the amount of delayed oligonucleotide makes it possible to measure the formation efficiency of the triple helix.
  • SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 6 are labeled with ⁇ - [ 32 P] ATP by T4 polynucleotide kinase. Radiolabeled SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 6 are isolated on an exclusion column.
  • the purity of the oligonucleotides is controlled by electrophoresis on a 15% acrylamide-urea gel with a migration at 7OW for 1h30.
  • the gel is then dried under vacuum at 70 0 C and the radioactive imprint is read using a Phospholmager (Storm 860, Molecular Dynamics).
  • Hybridization between the labeled oligonucleotides and the DNA fragment comprising a portion of the human tyrosinase gene sequence is performed overnight at 4 ° C at different values of the target DNA / oligonucleotide concentration ratio.
  • the conditions are set forth in Table 2.
  • the radiolabeled sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 6 are tested in two forms: in modified form (LNA) and in unmodified form (DNA).
  • Electrophoresis on acrylamide-Bis 8% non-denaturing gel is carried out during Ih, at a power of 3 W, at 37 ° C.
  • the gel is then dried under vacuum at 70 ° C. and brought into contact one night with an exposure plate.
  • the efficiency of formation of the complex between the oligonucleotide and its target sequence (expressed as a percentage) can be determined by LumiAnalyst software (Roche, Meylan, France).
  • Table 3 Quantification by LumiAnalyst software of the hybridization of SEQ ID 1 with the fragment of the tyrosinase gene.
  • Example 3 Real-Time Quantitative RT-PCR Study of Inhibition of Human Tyrosinase Gene Expression on Normal Human Melanocytes
  • Normal human melanocytes are inoculated into 60 mm diameter Petri dishes at 710,000 cells per dish in Medium 1 (Table 4).
  • an extemporaneous solution is prepared consisting of medium 1 to which was added the complexed sequence with Superfect (Qiagen, Courtab ⁇ uf, France), at a concentration of 500 nanomolar. Twenty four hours after seeding, the cells are treated once with these different solutions and then recovered after 8 hours of treatment in order to extract the total RNA.
  • RNAs all the cellular RNAs thus comprising the messenger RNAs of tyrosinase
  • the total RNAs are extracted (Kit Rneasy, Qiagen, Courtaboeuf, France), assayed, and their quality verified using Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Massy, France). ). They are then treated with DNAse, in order to eliminate any residual genomic DNA.
  • a reverse transcription reaction by the enzyme Superscript II (Qiagen) makes it possible to generate the complementary DNAs (cDNA) from the RNAs. .
  • the real-time quantitative PCR on LightCycler (Roche, Meylan, France) is then carried out according to the reaction mixture described in Table 5 in order to quantify the messenger RNAs of interest present in the initial cell population.
  • Table 5 Typical reaction mixture used for quantitative real-time PCR.
  • sequences - SEQ ID No 2 to 5 - do not exhibit any significant activity on the inhibition of the expression of the tyrosinase gene, nor even the sequences SEQ ID No 6 and SEQ ID No 7 which are respectively the control inverted and scrambled control of the sequence SEQ ID No. 1, which alone has this activity.
  • Table 6 Summary of the effect of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 7 on the rate of transcripts encoding the tyrosinase gene.
  • the oligonucleotides according to the invention appearing in Table 1 of Example 1 are studied for their action on melanogenesis, and therefore on their ability to modulate the production of melanin pigments by melanocytes.
  • the oligonucleotides "reverse control” SEQ ID No. 6
  • "scrambled control” SEQ ID No. 7
  • tyrosinase and TRP-I form an enzymatic complex that catalyzes the transformation of L-dopa into dopaquinone and then dopachrome (Kobayashi T.
  • tyrosinase is also referred to as "dopa-oxidase" because of its multi-functional nature. It fulfills the same function as dopa-oxyidase during the oxidation of tyrosine to dopa. The principle of this test is based on the measurement of the rate of reaction catalyzed by dopa-oxidase in the transformation of L-dopa, used as a substrate, into dopachrome.
  • dopachrome is quantified by measurement of optical density at determined time intervals, which makes it possible to calculate the transformation reaction rate of L-dopa for each of the oligonucleotides tested and for the control test. Knowing that the speed of this reaction depends in particular on the amount of enzyme available, it will be possible, from the results obtained, to verify the inhibitory action of the oligonucleotides tested of the invention on the expression of the tyrosinase gene. , action already observed by the tests of the previous example.
  • a decrease in the reaction rate compared to the control test will correspond to a decrease in the amount of enzyme formed, and therefore a decrease in the enzymatic activity, and consequently, in the reduction of the formation of melanin, and therefore to a depigmenting effect.
  • Table 7 Summary of the effect of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 7 on tyrosinase dopa oxidase activity of normal human melanocytes.
  • Table 7 shows that DOPA oxidase activity is significantly inhibited by 14% in normal human melanocytes treated with SEQ ID No. 1 at 500 nanomolar.
  • SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 7 have no activity on the DOPA oxidase activity. This shows that the inhibitory effect observed with the sequence SEQ ID No. 1 composed of the LNA bases is specific to the targeted sequence.
  • Oligonucleotide SEQ ID No. 1 1.00%
  • This powder has a double action. It allows a cleansing of the skin, and moreover it allows, by a regular use for a few days, to lighten the complexion. It can be applied to the skin of the face once or twice a day.
  • Titanium dioxide 15.00%
  • This composition is to be used before exposure to intense sunlight. It prevents the appearance of pigment spots, in people predisposed to this phenomenon. It should be noted that the presence of a high concentration of sunscreen makes it possible to compensate for the decrease in natural protection, as a consequence of the drop in the melanin content.
  • EXAMPLE 8 Dermatological cream for the treatment of cutaneous hyperpigmentations of pathological or traumatic origin
  • Oligonucleotide SEQ ID No. 1 0.10%
  • This lotion for lightening complexion is used after cleansing and cleansing the skin.
  • This lotion is applied on the hairy areas to be lightened, especially the arms, for the duration sufficient to obtain a progressive lightening of the hairs.
  • Example 12 Cosmetic cream anti-stains for the hands
  • Purified water qs 100% This cream must be applied directly on the spots (solar lentigo and / or senile) hands, to reduce the color.

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Abstract

La présente invention concerne un oligonucléotide anti-gène s'hybridant spécifiquement avec le gène codant pour la tyrosinase humaine par appariement Hoogsteen entre les bases complémentaires, ledit oligonucléotide formant une structure en triple hélice avec le gène de la tyrosinase humaine. L'invention concerne également l'utilisation ledit oligonucléotide comme agent dépigmentant ou blanchissant de la peau dans une composition cosmétique ou dans une composition dermatologique.

Description

Nouveaux oligonucléotides anti-gènes spécifiques de la tyrosinase comme agents dépigmentants
La présente invention concerne un oligonucléotide anti-gène s'hybridant spécifiquement avec le gène codant pour la tyrosinase humaine par appariement Hoogsteen entre les bases complémentaires, ledit oligonucléotide formant une structure en triple hélice avec le gène de la tyrosinase humaine. L'invention concerne également l'utilisation dudit oligonucléotide comme agent dépigmentant ou blanchissant de la peau dans une composition cosmétique ou dans une composition dermatologique.
Chez l'homme, la pigmentation résulte de la synthèse et de la distribution des pigments mélaniques dans la peau, les follicules pileux ou les yeux. La pigmentation est génétiquement prédéfinie mais elle est régulée par de nombreux facteurs internes ou externes. Les mélanines produites par les mélanocytes ainsi que le nombre de mélanocytes, leur activité tyrosinasique et leur capacité à exporter les mélanines vers les kératinocytes, la taille des mélanosomes qui contiennent des grains de mélanine, vont conditionner la couleur de la peau humaine. Pour chaque individu, la couleur de la peau varie principalement en fonction de l'irradiation plus ou moins importante des rayons ultra- violets (UV). Autrement dit pour chaque individu, il existe une pigmentation cutanée de base lorsqu'il subit la plus faible irradiation UV, correspondant à sa couleur de peau la plus claire, et une pigmentation cutanée plus intense s'il reçoit une irradiation UV plus forte, allant jusqu'à une pigmentation maximum correspondant à sa couleur de peau la plus foncée lorsqu'il est exposé de manière prolongée à une irradiation UV intense. D'autre part, comme on le sait bien, il existe dans la population mondiale, une très grande diversité génétique quant à la pigmentation cutanée. Ainsi, selon les populations, la couleur de la peau correspondant à la pigmentation de base définie ci- dessus, présente une teinte plus ou moins claire se situant entre les deux extrêmes : très claire et très foncée. Egalement selon les populations, la différence de teinte de la peau entre la pigmentation de base et la pigmentation maximum est plus ou moins importante. Ainsi, il est bien connu que les personnes appartenant à certaines populations à peau claire (pigmentation de base) réagissent rapidement et/ou de manière importante à l'action des UV et peuvent donc facilement présenter une peau de teinte foncée, même lorsque ces personnes ne se sont pas exposées volontairement et de façon prolongée au soleil. Dans la suite du texte, ces personnes seront désignées par l'expression « personnes très réactives aux UV ». Il en est notamment ainsi de populations d'origine asiatique ou de certaines populations dites métisses.
Par ailleurs, des personnes voient apparaître sur leur peau, en particulier au niveau du visage ou des mains des zones et/ou des taches plus foncées et/ou plus colorées conférant à la peau une hétérogénéité de couleur. Ces taches sont dues à une concentration importante de mélanine dans les kératinocytes de l'épidémie résultant d'une activité mélanogénique mélanocytaire exacerbée.
Le mécanisme de formation de la pigmentation cutanée fait intervenir la synthèse des mélanines. Ce mécanisme est particulièrement complexe et fait intervenir schématiquement les principales étapes suivantes : Tyrosine »*• Dopa »*• Dopaquinone »*• Dopachrome »*• Mélanines La tyrosinase et la tyrosinase-related-protein 1 (TRP-I) sont les enzymes essentielles intervenant dans cette suite de réactions. Elles catalysent notamment la réaction de transformation de la tyrosine en Dopa (Dihydroxyphénylalanine) et la réaction de transformation de la Dopa en Dopaquinone conduisant à la formation des pigments mélaniques. Une molécule est reconnue comme dépigmentante si elle agit directement sur les mélanocytes épidermiques en inhibant l'activité de ces cellules et/ou si elle bloque l'une des étapes de la biosynthèse des mélanines ou encore si elle dégrade la mélanine formée. C'est le cas notamment lorsque la molécule inhibe l'une des enzymes impliquées dans la mélanogénèse ou lorsqu'elle réagit avec les composés chimiques de la chaîne de synthèse des mélanines.
Les substances dépigmentantes connues sont notamment l'hydroquinone et ses dérivés, l'acide ascorbique et ses dérivés, des extraits placentaires, l'acide kojique, l'arbutine, les iminophénols, l'association de carnitine et de quinone, les dérivés amides d'amino -phénol, et les dérivés de benzothiazole. Ces substances peuvent présenter certains inconvénients. Elles peuvent être instables, nécessiter une utilisation à des concentrations élevées, manquer de spécificité quant à leur mode d'action, ou présenter un pouvoir cytotoxique ou irritant. L'utilisation topique de substances dépigmentantes efficaces et inoffensives est particulièrement recherchée en cosmétique et en dermatologie. On utilise notamment ces substances pour traiter des hyperpigmentations régionales par hyper-activité mélanocytaire telles que les mélasmas idiopathiques, les hyperpigmentations localisées par hyper-activité mélanocytaire telles que les taches pigmentaires dites lentigos solaires et lentigos séniles, les hyperpigmentations accidentelles telles que la photosensibilisation ou la cicatrisation post-lésionnelle, ainsi que certaines leucodermies telles que le vitiligo. Dans ces derniers cas, à défaut de pouvoir repigmenter la peau, on atténue la pigmentation de la périphérie des zones dépigmentées pour donner à la peau une couleur plus homogène.
Des substances dépigmentantes sont également utilisées en tant qu'agents de blanchiment de la peau par certaines personnes, en particulier celles désignées plus haut, qui sont très réactives aux UV, pour éclaircir leur teint, notamment celui de leur visage et de leurs mains, afin de conserver une couleur de peau la plus claire possible ou tout au moins de réduire les effets pigmentants des rayons UV.
Le problème posé aux professionnels est donc la conception, la fabrication ou l'isolement de nouvelles substances dépigmentantes ou de nouveaux agents blanchissant de la peau humaine et/ou des poils ne présentant pas les inconvénients des substances connues, c'est-à-dire qui soient non irritants, non toxiques et/ou non allergisants pour la peau et stables dans une composition.
L'utilisation d'oligonucléotides antisens pour traiter un dysfonctionnement des mélanocytes, a été décrite dans la demande US 20040014700. Par ailleurs, certaines stratégies pour obtenir une dépigmentation consistent à bloquer la synthèse de la tyrosinase par l'utilisation d'un oligonucléotide d'ARN double brin (FR 2840217). Dans les demandes précédentes, la cible biologique considérée est l'ARN messager.
L'objet de la présente invention consiste à fournir un agent dépigmentant agissant sur le processus de la mélanogénèse, destiné d'une part, dans le cas d'une pigmentation sensiblement homogène, au blanchiment de la peau et/ou des poils, c'est- à-dire à diminuer leur pigmentation, et d'autre part, à lutter contre l'hyperpigmentation cutanée à savoir lorsque la peau présente une hétérogénéité de pigmentation. Les inventeurs de la présente invention ont trouvé que des oligonucléotides pouvant s'hybrider avec le gène codant pour la tyrosinase et uniquement avec ce gène présentent une activité dépigmentante.
Contrairement à la stratégie ciblant l'ARNm décrite plus haut, celle de la présente invention consiste donc à utiliser un oligonucléotide capable de s'hybrider avec le gène lui-même. Un avantage de ceci est que les oligonucléotides de la présente invention peuvent s'hybrider avec le gène sous forme de double brin d'ADN, alors que les oligonucléotides décrits notamment dans les demandes US 20040014700 ou FR 2840217 n'ont pas cette capacité. Un autre avantage de cette nouvelle stratégie est que le gène est une entité moins abondante que l'ARN messager ou la protéine pour lequel il code, puisque la plupart des gènes ont deux allèles dans les cellules diploïdes. De ce fait, cette activité existe même à très faible concentration, ce qui augmente l'intérêt de ces oligonucléotides. De plus, les oligonucléotides selon l'invention ne présentent aucune cyto toxicité et peuvent être synthétisés, caractérisés, isolés avec un haut degré de pureté et ceci de façon industrielle.
Les oligonucléotides selon l'invention interviennent donc très en amont des mécanismes de la mélanogénèse, en interagissant directement sur le gène de la tyrosinase pour en moduler son expression et par conséquent inhibe l'expression de l'ARN messager codant pour la tyrosinase. Il s'en suit une diminution du taux de tyrosinase dans les mélanocytes. Les oligonucléotides selon l'invention offrent une solution idéale aux problèmes posés par les substances utilisées classiquement. Les substances connues qui inhibent l'activité de la tyrosinase présentent de multiples effets secondaires inacceptables du fait de leur faible spécificité. Parmi les différentes séquences testées, nous avons trouvé que la séquence SEQ ID No 1 décrite ci-après résout les problèmes rencontrés par les chercheurs antérieurs en modulant le plus en amont possible l'expression du gène de la tyrosinase, et par conséquent la production de l'ARN messager codant pour la tyrosinase et donc celle de cette enzyme, au lieu d'inhiber directement la tyrosinase pour obtenir l'effet dépigmentant. Description
Ainsi, dans un premier aspect, l'invention porte sur un oligonucléotide anti-gène comportant une séquence de 15 à 25 nucléotides comprenant la séquence 5'- C*TTC*TC*TC*TTTTTC*C*TTTTTC* -3' (SEQ ID No 1, C* désignant une 5- méthyl-cytosine) s'hybridant spécifiquement avec le gène codant pour la tyrosinase humaine par appariement Hoogsteen entre les bases complémentaires, ledit oligonucléotide formant une structure en triple hélice avec le gène de la tyrosinase humaine. De préférence, cet oligonucléotide anti-gène comporte entre 18 et 21 nucléotides ou entre 21 et 25 nucléotides, de préférence 21 nucléotides.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « gène codant pour la tyrosinase », la séquence génomique du gène de la tyrosinase.
Les oligonucléotides selon l'invention s'hybrident directement au gène formé d'une double hélice d'ADN dans la cellule. Ils permettent ainsi de réaliser une modulation ultime de la quantité d'ARN messager codant pour la tyrosinase et donc de cette enzyme produite par le gène.
A la différence des inventions décrites dans les documents US 20040014700 ou FR 2840217 qui sont basées sur des oligonucléotides formant des liaisons hydrogènes selon de le schéma d' appariement de Watson-Crick pour former un structure en double hélice, dans le présent document, le terme "hybridation" est utilisé pour désigner la formation de liaisons hydrogènes, aussi connue comme appariement Hoogsteen ou reverse-Hoogsteen, entre d'une part les bases complémentaires, usuellement réparties sur deux brins d'acide nucléique formant une double hélice selon le schéma de Watson- Crick, avec d'autre part un troisième brin pour former un triplex, structure en triple hélice.
Le degré de complémentarité entre les séquences d'acide nucléique est déterminé en comparant, après alignement, la première séquence avec la séquence complémentaire de la seconde séquence. Le degré de complémentarité est calculé en déterminant le nombre de positions complémentaires pour lesquelles le nucléotide est complémentaire entre les deux séquences ainsi comparées, en divisant ce nombre de positions complémentaires par le nombre total de positions et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le degré de complémentarité entre ces deux séquences exprimé en pourcentage.
Le terme "hybridation spécifique" signifie en particulier qu'il existe un degré de complémentarité suffisant pour éviter la fixation non spécifique de l'oligonucléotide sur une séquence non ciblée dans les conditions où la fixation spécifique est souhaitée. Les oligonucléotides selon l'invention s'hybrident de préférence spécifiquement avec le gène codant pour la tyrosinase. En particulier, les oligonucléotides de l'invention sont capables de s'hybrider uniquement avec l'ADN des gènes qui codent pour la tyrosinase. Les oligonucléotides selon l'invention comportent un nombre de nucléotides suffisant en identité et en nombre pour s'hybrider de façon spécifique. La présente invention a donc pour objet des oligonucléotides qui s'hybrident spécifiquement en amont de et/ou avec la région présentant le codon d'initiation de la traduction des gènes.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « ADN qui codent pour la tyrosinase », aussi bien les exons que les introns, en particulier les exons. La présente invention a aussi pour objet des oligonucléotides, comprenant une ou plusieurs modifications chimiques au niveau de leurs parties sucres, leurs parties nucléobases ou leur squelette internucléotidique qui confèrent des caractéristiques physico-chimiques souhaitables aux oligonucléotides selon l'invention telles qu'une biodisponibilité accrue, l'augmentation de l'affinité pour les séquences cibles, l'augmentation de l'internalisation cellulaire ou une meilleure stabilité biologique ou l'augmentation de la stabilité en présence de nucléases cellulaires.
A titre d'exemple, les modifications pouvant conférer ces caractéristiques sont les Locked Nucleic acids (LNA), les Peptide Nucleic Acids (PNA), les dérivés 2'-O- alkyle et 2'-O-fluoro sur la partie sucre du nucléoside, et les dérivés phosphorothioates ou les dérivés méthylphosphonates au niveau du squelette internucléotidique ou encore des dérivés porteurs en 5' et ou 3' de groupement réactif type intercalant comme l'acridine ou permettant d'établir un pontage avec la séquence cible comme le psoralène ou un groupement azide.
Le terme "PNA" est connu de l'homme du métier et signifie une strucutre chimique similaire à celle de l'ADN mais dans laquelle le squelette est composé d'unités répétées de N-(2-aminoéthyl)-glycine reliées par des liaisons peptidiques. Les différentes bases purines et pyrimidines sont liées au squelette par des liaisons méthylène carbonyl. La structure est présentée ci-après :
Le terme "LNA" est connue de l'homme du métier et désigne un analogue d'acide nucléique contenant un pond 2'-O, 4'-C méthylène. Ce pond bloque la flexibilité du cycle ribofuranose en formant une structure bicyclique rigide. La structure est présentée ci-après :
Monomère de LNA
Dans le présent document, le terme "oligonucléotide" se réfère à des polynucléotides formés à partir de nucléobases naturelles et de groupements pentafuranosyles (sucre) formant des nucléosides qui sont reliés entre eux par liaisons phosphodiesters natives. Le terme "oligonucléotides" se réfère donc aux espèces naturelles ou aux espèces synthétiques formés à partir de sous unités naturelles ou de leurs homologues proches.
Le terme "oligonucléotides" peut se référer aussi aux parties qui ont des fonctions similaires aux oligonucléotides naturels mais qui peuvent présenter des portions non naturelles. Les oligonucléotides peuvent avoir des parties sucres, des parties nucléobases ou des liaisons internucléotidiques modifiées. Comme indiquées ci- dessus, parmi les modifications possibles, les modifications préférées sont les Locked Nucleic acids (LNA) tels que décrits par Braasch DA et Corey DR (Chem. Biol.2001, 8, 1-7), les dérivés N3'-P5' phosphoramidates tels que décrits par Faria M et Giovannangeli C(J. Gène Med 2001, 3, 299-310), les Peptide Nucleic Acids (PNA) décrits par Wang G et Xu XS (CeIl Res. 2004, 14, 111-118), les dérivés 2'-O-alkyle sur la partie sucre, en particulier les dérivés 2'-O-éthyloxyméthyle ou 2'-O-méthyle, et/ou les phosphorothioates ou les méthylphosphonates pour le squelette internucléotidique ou encore des dérivés porteurs en 5' et ou 3' de groupement réactif type intercalant comme l'acridine ou permettant d'établir un pontage avec la séquence cible comme le psoralène ou un groupement azide.
Les oligonucléotides chimériques sont compris dans les modifications préférentielles de l'invention. Les oligonucléotides contiennent au moins deux régions chimiquement différentes, chacune comprenant au moins un nucléotide. Il s'agit en particulier d'une ou de plusieurs régions comprenant un nucléotide modifié qui confère une ou plusieurs propriétés bénéfiques comme par exemple une meilleure stabilité biologique, une biodisponiblité accrue, l'augmentation de l'internalisation cellulaire ou l'augmentation de l'affinité pour l'ADN cible. De façon préférée, les oligonucléotides chimériques selon l'invention sont les locked nucleic acids (LNA), les dérivés N3'-P5' phosphoramidates, les peptide nucleic acids ou des molécules avec un squelette internucléotidique qui peut être en tout ou partie phosphodiesters, ou phosphorothioates, ou méthylphosphonates ou les combinaisons de liaisons phosphodiesters et/ou phosphorothioates et/ou méthylphosphonates.
Le terme " oligonucléotides " peut également se référer à des oligonucléotides auxquels on a greffé un vecteur d'administration circulaire de type plasmidique ou un vecteur d'administration linéaire de type acide nucléique ou peptidique.
La présente invention a aussi pour objet une composition cosmétique ou dermatologique contenant au moins un oligonucléotide décrit précédemment et au moins un excipient ou véhicule cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. Une telle composition peut contenir en outre, un ou plusieurs principes actifs. Ce ou ces principes actifs visent éventuellement à venir en complément ou à renforcer les effets dépigmentants recherchés.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'oligonucléotides capables de s'hybrider spécifiquement avec les gènes codant pour la tyrosinase comme agents cosmétiques, notamment pour dépigmenter et/ou blanchir la peau ou les poils, et/ou pour atténuer les taches pigmentaires de la peau humaine.
En particulier, la présente invention comprend des compositions cosmétiques utilisant ces oligonucléotides comme agents cosmétiques. Elles sont destinées notamment à éclaircir le teint, prévenir ou traiter la formation de taches pigmentaires dues à l'action du rayonnement solaire, à atténuer les taches pigmentaires de sénescence (lentigos séniles), notamment sur les mains, ou encore à éclaircir la pilosité du corps ou des membres.
La présente invention se rapporte également à l'utilisation des oligonucléotides décrits précédemment pour la fabrication d'un médicament dermatologique destiné au traitement ou à la prévention des maladies se traduisant par la surexpression et la suractivité de la tyrosinase, par voie topique. Ce médicament peut être destiné à traiter ou à prévenir des hyperpigmentations régionales par hyper-activité mélanocytaire telles que les mélasmas idiopathiques, des hyperpigmentations accidentelles telles que la photosensibilisation ou dans certains cas de cicatrisation post-lésionnelle, et pour l'atténuation des contrastes pigmentaires dans certaines leucodermies telles que le vitiligo.
La présente invention a aussi pour objet une composition dépigmentante caractérisée en ce qu'elle contient, dans un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable, une séquence oligonucléotide dirigée contre le gène codant pour la tyrosinase.
La composition cosmétique et le médicament selon l'invention sont appropriés pour une utilisation topique et contiennent donc un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau. La séquence oligonucléotide selon l'invention peut être présente en quantité allant de 0,00001% à 10% et de préférence de 0,0003% à 3% du poids total de ces compositions.
Les compositions de l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes appropriées à une application topique notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile, simple ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion aqueuse ou huileuse de particules solides, telles que des nanosphères ou des nanocapsules polymériques, ou encore d'une dispersion aqueuse de vésicules lipidiques de type ionique ou non-ionique, tels que décrit dans le brevet français FR 2534487.
Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent éventuellement être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent également se présenter sous forme solide pulvérulent ou non, par exemple sous forme stick. Elles peuvent encore se présenter sous la forme d'unidoses, de patchs, de crayons, ou d'applicateurs autorisant une application localisée sur les taches du visage ou des mains.
La composition cosmétique notamment peut formulée pour être utilisée comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage.
De façon connue, les compositions de l'invention peuvent contenir également les adjuvants habituels dans les domaines cosmétique et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres solaires, les pigments, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules et/ou nanosphères. Lorsque la composition cosmétique ou dermatologique de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 80% en poids, et de préférence de 5 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les co-émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3% à 30% en poids, et de préférence de 0,5% à 20% en poids par rapport au poids total de la composition. Comme huiles utilisables en association avec les oligonucléotides selon l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles d'origine végétale (huile d'avocat, huile de soja), les huiles d'origine animale (lanoline), les huiles de synthèse (perhydrosqualène), les huiles siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matière grasses des alcools gras (alcool cétylique), des acides gras, des cires (cire de Carnauba, ozokérite).
Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables en association avec les oligonucléotides selon l'invention, on peut citer par exemple les esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG-20 et les esters d'acide gras et de glycérine tels que le stéarate de glycéryle.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables en association avec les oligonucléotides selon l'invention, on peut citer en particulier les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles. Comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, la silice hydrophobe et les polyéthylènes.
La présente invention a pour objet une composition cosmétique ou dermatologique contenant au moins un oligonucléotide décrit précédemment et un ou plusieurs autres agents actifs.
La présente invention se rapporte également à un procédé cosmétique ou dermatologique de dépigmentation et/ou de blanchiment de la peau humaine consistant à appliquer sur la peau pigmentée une composition cosmétique comprenant une séquence oligonucléotide dirigée contre le gène codant pour la tyrosinase. Plus particulièrement, l'invention vise un procédé de traitement cosmétique pour dépigmenter ou blanchir la peau caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'une composition définie ci-dessus sur une ou plusieurs zone(s) pigmentée(s) de la peau pendant une durée déterminée. Optionnellement il est possible de répéter l'opération, jusqu'à l'apparition de l'effet dépigmentant. Pour cette application cosmétique, la teneur en oligonucléotide est de préférence comprise entre 0,0003% à 3% du poids total de la composition. La présente invention concerne également l'utilisation d'un oligonucléotide tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament destiné à être administré de façon simultanée, séparée ou étalée dans le temps en association avec un ou plusieurs actifs. La composition cosmétique de l'invention peut comprendre en outre un ou plusieurs principes actifs utilisables en cosmétique. Lesdits actifs, en association avec les oligonucléotides selon l'invention, sont utilisés purs ou provenant d'extraits renfermant ces actifs. Ils sont notamment sélectionnés parmi les composés suivants: l'acide ellagique et ses dérivés; le résorcinol et ses dérivés ; l'arbutine et ses dérivés, la vitamine C et ses dérivés; le pantothénate sulfonate et ses dérivés; des molécules interférant directement ou indirectement avec l'alpha-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH) ou son récepteur ou l'hormone adrénocorticotropique (ACTH) ; les polyols tels que la glycérine le glycol ou le propylène glycol ; les agents kératolytiques et/ou desquamants tels que l'acide salicylique et ses dérivés ; les alpha-hydroxyacides tels que l'acide lactique ou l'acide malique, seuls ou greffés ; l'acide rétinoïque ; le rétinaldéhyde ; le rétinol et ses dérivés tels que le palmitate, le propionate ou l'acétate, en préparation liposomique ou non ; des agents antiglycations et/ou antioxydants pris seuls ou en association tels que le tocophérol et ses dérivés, l'ergothionéine, la thiotaurine, l'hypotaurine, l'aminoguanidine, la thiamine pyrophosphate, la pyridoxamine, la lysine, l'histidine, l'arginine, la phénylalanine, la pyridoxine, l'adénosine triphosphate ; les agents anti-inflammatoires tels que le stéaryl glycyrrhétinate ; les agents apaisants et leurs mélanges, un ou plusieurs filtres solaires chimiques ou physiques tels que le méthoxycinnamate d'octyle, le butyl- méthoxydibenzoyl-méthane, l'oxyde de titane et l'oxyde de zinc ; et les acides désoxyribonucléiques et/ou nucléiques. En cas d'incompatibilité entre ces actifs et les oligonucléotides de l'invention, les uns et/ou les autres peuvent être incorporés dans des sphérules, notamment des liposomes ou des vésicules formés de lipides amphiphiles ioniques ou non ioniques telles que décrites dans le brevet français FR 2534487 et/ou des nanoparticules et/ou des nanospheres et/ou des nanocapsules. Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois la limiter.
Dans les exemples qui suivent, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indications contraires et il sera fait référence aux légendes des figures. Légendes des figures se rapportant aux résultats des essais expérimentaux (Exemple n° 3 pour les figures 1 et 2, et exemple n° 4 pour le figure 3)
Figure 1 : Effet des oligonucléotides SEQ ID No 1 composé de bases LNA et SEQ ID 6 sur l'expression du gène de la tyrosinase dans des mélanocytes humains normaux traités avec 500 nM d Oligonucléotides pendant 8 heures.
Le symbole * représente une différence statistiquement significative (p<0.05) par rapport aux cellules non traitées.
Figure 2 : Effet de l'oligonucléotide SEQ ID No 1 composé de bases DNA sur l'expression du gène de la tyrosinase dans des mélanocytes humains normaux traités avec 500 nM d Oligonucléotides pendant 8 heures.
Le symbole * représente une différence statistiquement significative (p<0.05) par rapport aux cellules non traitées.
Figure 3 : Effet de l'oligonucléotide SEQ ID No 1 sur l'activité DOPA-oxydase de la tyrosinase dans des mélanocytes humains normaux.
L'activité DOPA-oxydase est déterminée en DO par minutes et normalisée par rapport à la viabilité obtenue à l'aide du test XTT. Le symbole * représente une différence statistiquement significative (p<0.05) par rapport aux cellules non traitées.
Exemple 1 : Synthèse des Oligonucléotides
Les oligonucléotides avec les bases naturelles ont été synthétisés avec un synthétiseur automatique (Perseptive Biosystems Expedite modèle 8909) en utilisant la chimie standard des dérivés phosphoramidites en utilisant les protocoles du constructeur. Les dérivés β-cyanoéthyldiisopropylphosphoramidites des nucléosides ont été utilisés . L'étape d'oxydation du phosphite a été effectuée avec une solution d'iode. Après clivage de la colonne (Controlled Pore Glass, Perseptive Biosystems) et déprotection totale de la séquence par un traitement de 18h à 55°C par une solution d'ammoniaque à 33%, les oligonucléotides ont été purifiées par précipitation dans l'éthanol en présence d'acétate de sodium. Des contrôles par chromatographie liquide haute pression ont été ensuite réalisés par chromatographie échangeuses d'ions avec élution par un gradient de chlorure de sodium et par chromatographie en phase inverse Cl 8 avec élution par un gradient d'acétonitrile en présence d'acétate de triéthylammonium.
Les oligonucléotides LNA ont été synthétisés par la société Proligo ou Eurogentec. A titre d'exemples, des oligonucléotides ont été synthétisés. Ils sont décrits dans le tableau 1. Les étoiles mentionnées à coté des cytosines indique que ces bases sont methylées en position 5. Les 5 premières séquences de ce tableau, numérotées de SEQ ID No 1 à SEQ ID No 5 ont fait l'objet d'études. Leur propriété d'hybridation avec leur séquence cible sur le gène de la tyrosinase et leur activité dépigmentante sont rapportées dans les exemples suivants.
Dans le tableau 1 , les numéros mentionnés sous chaque extrémité des séquences indiquent la position de l'oligonucléotide dans les séquences d'origine.
Les séquences sont déduites de la séquence dite « HSTYRO 1E» du gène de la tyrosinase humaine, publiée par Kikuchi et al., Biochem. Biophys. Acta 1009 ; 3 ; 283- 286 (1989) (Genbank accession number M 27160) ou de la séquence dite
« HSU03039» du gène de la tyrosinase humaine, publiée par Ponnazhagan et al., J.
Invest. Dermatol., 102, 5, 744-748 (1994)
Par ailleurs, à titre comparatif pour confirmer la spécificité des oligonucléotides selon l'invention vis à vis du gène codant pour la tyrosinase deux oligonucléotides basés sur la séquence SEQ ID No 1 de l'invention, ont été synthétisés, à savoir :
*l* Une séquence dite « contrôle inversé», désignée SEQ ID No 6 dans le tableau 1, consistant à inverser l'ordre des bases de la séquence SEQ ID No 1.
* Une séquence dite « contrôle brouillé », désignée SEQ ID No 7, également dans le tableau 1, comprenant les mêmes bases, en nature et en nombre, que celles de la séquence SEQ ID No 1, mais placées dans un ordre quelconque. TABLEAU 1
SEQ ID No SEQUENCE OLIGONUCLEOTIDE LOCUS
1. 3535 5'_c*TTC*TC*TC*TTTTTC*C*TTTTTC*-3' 3555 HSTYROlE
2. 171 5'-TC*C*C*C*TC*TC*TC*TC*C*C*TC*TC*C*C*-3' 191 HSTYROlE
3. 201 5'-C*TC*TC*TC*TC*C*C*TC*TC*TC*TC*TC*-3' 221 HSTYROlE
4. 407 5'-C*TTTC*TTTC*TC*TC*TC*TC*TTTTC*T-3' 429 HSU03039
5. 1361 5'.τC*TC*TC*TC*C*TC*TTTC*C*TC*TC*T-3' 1381 HSU03039
6. 5,.c*τττττc*c*τττττc*τc*τc*ττc* .3' Contrôle SEQ
ID No I inversée
7. 5>_ττc*ττ c*ττ c*ττ c*ττ c*ττc*ττc* _3' Contrôle SEQ
ID No I brouillée
C* désignant une 5-méthyl cytosine
Exemple 2 : Etude de l'interaction de la SEQ ID No 1 avec sa séquence cible en double hélice sur le gène de la tyrosinase humaine par retard sur gel :
La technique de retard sur gel permet de mettre en évidence l'hybridation d'un oligonucléotide avec sa séquence d'ADN cible. La mise en présence de l'ADN cible avec l' oligonucléotide de l'invention radiomarqué génère un complexe ADN-o ligonucléotide dont la migration sera ralentie par rapport à celle de l' oligonucléotide libre. La détermination de la quantité d'oligonucléotide retardé permet de mesurer l'efficacité de formation de la triple hélice.
A partir de solutions à 500 micromolaires, les SEQ ID No 1 et SEQ ID No 6 sont marquées au γ-[32P]ATP par la T4 polynucleotide kinase. Les SEQ ID No 1 et SEQ ID No 6 radiomarquées sont isolées sur colonne d'exclusion.
La pureté des oligonucléotides est contrôlée par une électrophorèse sur un gel d'acrylamide-urée 15% avec une migration à 7OW pendant lh30. Le gel est ensuite séché sous vide à 700C et l'empreinte radioactive est lue à l'aide d'un Phospholmager (Storm 860, Molecular Dynamics).
L'hybridation entre les oligonucléotides marqués et le fragment d'ADN comportant une portion de la séquence du gène de la tyrosinase humaine, est réalisée pendant une nuit à 4°C à différentes valeurs du ratio de concentration ADN cible/oligonucléotide. Les conditions sont mentionnées au tableau 2. Les séquence SEQ ID No 1 et SEQ ID N°6 radiomarquées sont testées sous deux formes: sous une forme modifiée (LNA) et sous une forme non modifiée (DNA).
Une électrophorèse sur gel acrylamide-Bis 8% non dénaturant est effectuée pendant Ih, à une puissance de 3 W, à 37°C. Le gel est ensuite séché sous vide à 700C et mis en contact une nuit avec une plaque d'exposition.
Tableau 2 : Mélange réactionnel de retard sur gel.
A partir de l'image obtenue, l'efficacité de formation du complexe entre l'oligonucléotide et sa séquence cible (exprimée en pourcentage) peut être déterminée par le logiciel LumiAnalyst (Roche, Meylan, France).
Les résultats des essais sont rapportés au tableau 3 ci-dessous. Ces résultats montrent que le rendement d'hybridation de la SEQ ID No 1, composée de bases LNA, avec sa séquence cible varie en fonction du ratio ADN cible/oligonucléotide. Il est de 11% pour un ratio équimolaire, de 65% pour un ratio de 2 et 77% pour un ratio de 4. Pour la SEQ ID No 1, composée de bases DNA, le rendement d'hybridation avec le fragment de gène de la tyrosinase varie de 25 à 33%, ces valeurs n'étant pas dépendantes de la concentration en ADN cible. Par contre, la SEQ ID No 6 n'interagit pas avec la séquence d'ADN tyrosinase, qu'il s'agisse des dérivés LNA aussi bien que de la forme DNA (Tableau 3).
Tableau 3 : Quantification par le logiciel LumiAnalyst, de l'hybridation de la SEQ ID 1 avec le fragment du gène de la tyrosinase. Exemple 3 : Etude par RT-PCR quantitative en temps réel de l'inhibition de l'expression du gène de la tyrosinase humaine sur mélanocytes humains normaux
Les mélanocytes humains normaux sont ensemencés en boîtes de Pétri de 60 mm de diamètre à raison de 710.000 cellules par boîte en milieu 1 (tableau 4). Pour chacune des séquences SEQ ID No 1 à 7, une solution extemporanée est préparée consistant en du milieu 1 auquel a été ajouté la séquence complexée avec du Superfect (Qiagen, Courtabœuf, France), à la concentration 500 nanomolaires. Vingt quatre heures après l'ensemencement, les cellules sont traitées une fois par ces différentes solutions, puis récupérées après 8 heures de traitement pour en extraire les ARN totaux.
Tableau 4: Composition du milieu 1
Les ARN totaux (tous les ARN cellulaires donc comprenant les ARN messagers de la tyrosinase) sont extraits (Kit Rneasy, Qiagen, Courtaboeuf, France), dosés, et leur qualité vérifiée à l'aide du Bioanalyseur 2100 (Agilent Technologies, Massy, France). Ils sont ensuite traités avec de la DNAse, afin d'éliminer toute trace dADN génomique éventuellement résiduel. Pour procéder à la réaction de PCR quantitative en temps réel qui est une réaction d'amplification d'ADN une réaction de transcription inverse par la l'enzyme Superscript II (Qiagen), permet de générer les ADN complémentaires (ADNc) à partir des ARN. A l'aide de ce produit de transcription inverse obtenu, la PCR quantitative en temps réel sur LightCycler (Roche, Meylan, France) est ensuite effectuée selon le mélange réactionnel décrit dans le tableau 5 afin de quantifier les ARN messagers d'intérêts présents dans la population cellulaire initiale. Tableau 5: Mélange réactionnel type utilisé pour la PCR quantitative en temps réel.
2μl du produit de la réaction de transcription inverse décrit ci-dessus et contenant les ADNc cellulaires sont ajoutés au mélange réactionnel type utilisé pour la réaction de PCR quantitative en temps réel et décrit dans le tableau 5. Le taux de transcrits codant pour le gène tyrosinase mesuré pour un échantillon est rapporté au taux de transcrits codant pour le gène invariant όêta-2-microglobuline. Les résultats obtenus pour ce rapport sont récapitulés dans le tableau 6 ci-dessous, et représentés sur les figures 1 et 2 annexées. La SEQ ID No 1 composée de bases LNA diminue de 49 % le taux de transcrits du gène tyrosinase de façon significative, pour la SEQ ID No 1 composée de bases DNA, la diminution du taux de transcrits est de 30%. En revanche les séquences - SEQ ID No 2 à 5 - ne présentent pas d'activité significative sur l'inhibition de l'expression du gène de tyrosinase, ni même les séquences SEQ ID No 6 et SEQ ID No 7 qui sont respectivement le contrôle inversé et le contrôle brouillé de la séquence SEQ ID No 1, qui possède seule cette activité.
Tableau 6: Récapitulatif de l'effet des séquences SEQ ID No 1 à SEQ ID No 7 sur le taux de transcrits codant pour le gène tyrosinase.
Exemple 4 : Etude de l'inhibition de l'expression du gène de la tyrosinase humaine sur mélanocytes humains normaux, par la mesure de l'activité de dopa-oxydase de la tyrosinase :
Les oligonucléotides selon l'invention figurant dans le tableau 1 de l'exemple 1 (SEQ ID No 1 à SEQ ID No 5) sont étudiés pour leur action sur la mélanogénèse, et donc sur leur capacité à moduler la production de pigments mélaniques par les mélanocytes. A titre d'éléments de comparaison, les oligonucléotides « contrôle inversé » (SEQ ID No 6) et « contrôle brouillé » (SEQ ID No 7) sont également étudiés pour cette action. II est rappelé qu'au cours du mécanisme réactionnel de la mélanogénèse, la tyrosinase et la TRP-I forment un complexe enzymatique qui catalyse la transformation de la L-dopa en dopaquinone puis en dopachrome (Kobayashi T. et al., J. Biol. Chem. 273. 31801-5 (1998); Sarangarajan R., Boissy R.E., Pigment CeIl Res., \6, 437-44 (2001)). Il est à noter que la tyrosinase est également dénommée « dopa-oxydase » en raison de sa nature multi-fonctionnelle. Elle remplit en effet la même fonction que la dopa-oxyidase au cours de l'oxydation de la tyrosine en dopa. Le principe du présent test est basé sur la mesure de la vitesse de la réaction catalysée par la dopa-oxydase dans la transformation de la L-dopa, utilisée comme substrat, en dopachrome. L'apparition de dopachrome est quantifiée par mesure de densité optique à intervalles de temps déterminés, ce qui permet de calculer la vitesse de réaction de transformation de la L-dopa pour chacun des oligonucléotides testés et pour l'essai témoin. Sachant que la vitesse de cette réaction dépend en particulier de la quantité d'enzyme disponible, il sera possible, à partir des résultats obtenus, de vérifier l'action inhibitrice des oligonucléotides testés de l'invention sur l'expression du gène de la tyrosinase, action déjà observée par les tests de l'exemple précédent. Une baisse de la vitesse de réaction par rapport à l'essai témoin correspondra à une diminution de la quantité d'enzyme formée, et donc une diminution de l'activité enzymatique, et par conséquent, à la réduction de la formation de la mélanine, et donc à un effet dépigmentant.
Les mélanocytes humains normaux sont ensemencés en microplaque 96 puits à raison de 10.000 cellules par puits en milieu 1 (tableau 4). Pour chacune des séquences SEQ ID No 1 à 7, une solution extemporanée est préparée consistant en du milieu 1 auquel a été ajouté la séquence complexée avec du Superfect (Qiagen, Courtabœuf, France), à la concentration 500 nanomolaires. Vingt quatre heures après l'ensemencement, les cellules sont traitées une fois, puis l'activité dopa-oxydase est mesurée après 72 heures de traitement par spectrophotometrie à 450nm. Les résultats sont mentionnés dans le tableau 7 et représentés sur la figure 3 annexée.
Tableau 7: Récapitulatif de l'effet des séquences SEQ ID No 1 A SEQ ID No 7 sur V activité dopa-oxydase de la tyrosinase de mélanocytes humains normaux.
Le tableau 7 montre que l'activité DOPA-oxydase est inhibée significativement de 14% dans les mélanocytes humains normaux traités avec la SEQ ID No 1 à 500 nano molaires .
Les SEQ ID No 6 et SEQ ID No 7 n'ont pas d'activité sur l'activité DOPA-oxydase. Ceci montre que l'effet inhibiteur observé avec la séquence SEQ ID No 1 composée des bases LNA est spécifique de la séquence ciblée.
Exemple 5 : Poudre cosmétique pour l'éclaircissement du teint du visage
Microcellulose 20,00%
Sodium lauryl sulfoacetate 15,00%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 1,00%
Parfum, colorants, conservateurs qs.
Talc Qsp. 100%
Cette poudre présente une double action. Elle permet un nettoyage de la peau, et de plus elle permet, par un usage régulier durant quelques jours, d'éclaircir le teint. On peut l'appliquer sur la peau du visage une à deux fois par jour. Exemple 6 : Crème cosmétique de jour dépigmentante sous forme d'émulsion-gel
Glycérine 5,00% triglycérides caprylique/caprique/succinique 5,00%
Méthoxycinnamate d'octyle 1,00%
Diméthicone copolyol 0,50%
Acrylates / C 10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0,50%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 (LNA) 0,01%
Neutralisant qs.
Conservateurs, parfum, colorants qs.
Eau qsp. 100%
Certaines personnes soumises au rayonnement plus ou moins intense de la lumière du jour, voire du soleil directement, souhaitent conserver un teint clair et éviter l'apparition de taches pigmentées. L'utilisation de l'émulsion-gel ci-dessus permettra d'atteindre ce but. Cette composition s'applique sur le visage généralement le matin. Elle agit aussi bien de manière préventive que curative sur la pigmentation, régulière ou non, du visage.
Exemple 7 : Composition cosmétique fluide protectrice du rayonnement solaire (SPF 30)
Pentacyclométhicone volatile 49,00%
Dioxyde de titane 15,00%
Méthoxycinnamate d'octyle 7,50%
Glycérine 5,00%
Phényltriméthicone 5,00%
Diméthicone copolyol 3,00%
Polyméthylméthacrylate 2,50%
Butyl méthoxydibenzoyle méthane 1,00%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 0, 1%
Neutralisant, Parfum, Conservateurs, antioxydants qs.
Eau qsp. 100%
Cette composition est à utiliser avant l'exposition à un rayonnement solaire intense. Elle prévient l'apparition de taches pigmentaires, chez les personnes prédisposées à ce phénomène,. Il est à noter que la présence d'une concentration élevée en filtre solaire permet de compenser la diminution de la protection naturelle, conséquence de la baisse du taux de mélanine.
Exemple 8 : Crème dermatologique pour le traitement d'hyperpigmentations cutanées d'origine pathologique ou traumatique
Glycéryl stéarate + Peg-100 stéarate 5,00%
Polyisobutène hydrogéné 4,00%
Magnésium ascorbyl phosphate 3,00%
Tricaprylate /caprate de glycérol 3,00%
Squalane 3,00%
Glycérine 2,00%
Cire d'abeille 1,50%
Cétéaryl octanoate 1,50%
Alcool cétylique 1,00%
Alcool stéarylique 1,00%
Diméthicone 1,00%
Gomme xanthane 0,30%
Acide éthylène diamine tétracétique 0,20%
Acide citrique 0,10%
Citrate de sodium 0,10%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 0,10%
Neutralisant, Parfum, Conservateurs qs.
Eau qsp. 100%
L'utilisation de cette crème permet d'atténuer les hyperpigmentations cutanées d'origine pathologique ou traumatique. Cette crème permet également d'atténuer les contrastes de couleur à la périphérie des zones dépigmentées en cas de vitiligo. Exemple 9 : Lotion cosmétique visage pour éclaircir le teint
Alcool éthylique 30,00%
PPG-3 Myristyl éther 5,00%
Glycérine 2,00%
Carbomer 0,20%
Polysorbate 20 0,20%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 (LNA) 0,01%
Neutralisant, Parfum, Conservateurs qs.
Eau qsp. 100%
Cette lotion pour éclaircir le teint s'utilise après le démaquillage et le nettoyage de la peau.
Exemple 10 : Sérum cosmétique éclaircissant pour le visage
Eau qsp 100%
Glycérine 2%
EDTA tetrasodique Acide citrique qsp pH souhaité Citrate trisodique
Gomme xanthane 0.25%
Polyacrylamide, C 13.14 isoparaffin, 0.5% laureth-7
Dimethicone copolyol 0.25%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 0.1%
Parfum, colorant, conservateur qs
Une goutte de cette composition très concentrée de sérum, s'applique sur le visage généralement avant l'application d'une crème pour le visage. Ce sérum s'utilise habituellement par cures d'une à deux semaines pour obtenir ou entretenir un éclaircissement du teint. Exemple 11 : Lotion cosmétique pour éclaircir la pilosité corporelle
Eau qsp 100%
Alcool 50%
Panthenylethyl ether 0.5%
Acétate DL- α -tocopherol 0.2%
Polysorbate 60 1%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 0.01%
Parfum 0.2%
Glycérine 0.5%
Colorant qs
Cette lotion s'applique sur les zones pileuses à éclaircir, notamment les bras, pendant la durée suffisante pour obtenir un éclaircissement progressif des poils.
Exemple 12 : Gel crème cosmétique anti-taches pour les mains
Caprilic/capric diglyceryl succinate 6%
Octyl octanoate 2.5%
Methoxycinnamate d'octyle 6%
Oligonucléotide SEQ ID No 1 0.001%
Phenyltriméticone 2.5%
Benzophenon-3 0.5%
Hyaluronate de sodium 0.05%
Gomme xanthane 0.2%
Acrylates/C 10.30 alkyl acrylate copolymer 0.5%
Glycérine 2%
PEG 150 3%
Neutralisants, Colorants, parfum, conservateurs qs
Eau purifiée qsp 100% Cette crème doit être appliquée directement sur les taches (lentigos solaires et/ou séniles) des mains, pour en atténuer la coloration.

Claims

REVENDICATIONS
1. Oligonucléotide anti-gène comportant une séquence de 15 à 25 nucléotides comprenant la séquence 5'_c*TTC*TC*TC*TTTTTC*C*TTTTTC* -3' (SEQ ID No 1, C* désignant une 5-méthyl-cytosine) s'hybridant spécifiquement avec le gène codant pour la tyrosinase humaine par appariement Hoogsteen entre les bases complémentaires, ledit oligonucléotide formant une structure en triple hélice avec le gène de la tyrosinase humaine.
2. Oligonucléotide selon la revendication 1 comportant entre 18 et 21 nucléotides ou entre 21 et 25 nucléotides, de préférence 21 nucléotides.
3. Oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un oligonucléotide chimérique comprenant au moins une modification chimique au niveau de la partie sucre, de la partie nucléobase et/ou du squelette internucléotidique.
4. Oligonucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un LNA (Locked Nucleic acids) ou d'un PNA (Peptide Nucleic Acids).
5. Oligonucléotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une modification choisie dans le groupe des dérivés 2'-O-alkyle et 2'-O-fluoro sur la partie sucre du nucléoside, des dérivés phosphorothioates ou méthylphosphonates au niveau du squelette internucléotidique, des dérivés porteurs en 5' et/ou 3' de groupement réactif type intercalant, notamment l'acridine, et des dérivés permettant d'établir un pontage avec la séquence cible, notamment le psoralène et un groupement azide.
6. Composition cosmétique ou dermatologique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'oligonucléotide est présent en quantité allant de 0,00001% à 10% et de préférence de 0,0003% à 3% du poids total de la composition.
8. Composition selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée à une application topique, notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile dans eau ou eau dans huile, simple ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une dispersion aqueuse ou huileuse de particules solides, telles que des nanosphères ou des nanocapsules polymériques, ou encore d'une dispersion aqueuse de vésicules lipidiques de type ionique ou non- ionique..
9. Composition cosmétique selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle est formulée pour être utilisée comme produit de soin cosmétique et/ou comme produit de maquillage.
10. Composition selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs principes actifs utilisables en cosmétique, notamment un ou plusieurs filtres solaires chimiques ou physiques.
11. Procédé de traitement cosmétique pour dépigmenter ou blanchir la peau, caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'une composition définie selon l'une des revendications 6 à 10 sur une ou plusieurs zone(s) pigmentée(s) de la peau pendant une durée déterminée, optionnellement répéter l'opération, jusqu'à l'apparition de l'effet dépigmentant.
12. Procédé de traitement cosmétique pour dépigmenter ou blanchir les poils, caractérisé en ce qu'il comprend l'application d'une composition définie selon l'une des revendications 6 à 10 sur une ou plusieurs zone(s) pileuse(s) de la peau pendant une durée déterminée, optionnellement répéter l'opération, jusqu'à l'apparition de l'effet dépigmentant.
13. Procédé de traitement cosmétique selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que la teneur en oligonucléotide est comprise entre 0,0003% à 3% du poids total de la composition.
14. Utilisation d'un oligonucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 pour la fabrication d'un médicament par voie topique destiné au traitement ou à la prévention des maladies se traduisant par la surexpression et la suractivité de la tyrosinase, notamment pour le traitement ou la prévention des hyperpigmentations régionales par hyper-activité mélanocytaire telles que les mélasmas idiopathiques, des hyperpigmentations localisées par hyper-activité et prolifération mélanocytaire bénigne telles que les taches pigmentaires de sénescence (lentigos séniles) , des hyperpigmentations accidentelles telles que la photosensibilisation ou la cicatrisation post-lésionnelle, et pour le traitement de leucodermies telles que le vitiligo.
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