EP1899274A1 - Utilisation d'archaea sulfato-reductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procede de degradation d'hydrocarbures - Google Patents

Utilisation d'archaea sulfato-reductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procede de degradation d'hydrocarbures

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EP1899274A1
EP1899274A1 EP06778731A EP06778731A EP1899274A1 EP 1899274 A1 EP1899274 A1 EP 1899274A1 EP 06778731 A EP06778731 A EP 06778731A EP 06778731 A EP06778731 A EP 06778731A EP 1899274 A1 EP1899274 A1 EP 1899274A1
Authority
EP
European Patent Office
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hydrocarbons
archaeoglobus
strain
fulgidus
archaeoglobus fulgidus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06778731A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Laure Fardeau
Bernard Ollivier
Agnès HIRSCHLER-REA
Nadia Khelifi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut de Recherche pour le Developpement IRD filed Critical Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Publication of EP1899274A1 publication Critical patent/EP1899274A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/345—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used for biological oxidation or reduction of sulfur compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2101/00—Nature of the contaminant
    • C02F2101/30—Organic compounds
    • C02F2101/32—Hydrocarbons, e.g. oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2301/00—General aspects of water treatment
    • C02F2301/10—Temperature conditions for biological treatment
    • C02F2301/106—Thermophilic treatment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W10/00—Technologies for wastewater treatment
    • Y02W10/10—Biological treatment of water, waste water, or sewage

Definitions

  • the present invention relates to the use of thermophilic sulfato-reducing archaebacteria for carrying out a process for the anaerobic degradation of aliphatic or aromatic hydrocarbons.
  • Hydrocarbons are organic compounds consisting of carbon and hydrogen, one of their main reservoirs is oil, formed geo-chemically at high temperatures and high pressures.
  • the hydrocarbons include saturated compounds; alkanes and cycloalkanes, unsaturated compounds; achenes and cycloalkenes, and aromatic compounds which may be mono or polycyclic.
  • aliphatic and aromatic hydrocarbons make up more than 75% of most crude oils.
  • Oil is the main source of energy used by humans. When distributing problems arise from it. These are problems on the one hand due to transport and storage, the risks of biodegradation of oil and its by-products. In addition, transport carried out mainly by sea, plays a major role in the pollution of the environment. The National Academy of Sciences and the Environment has estimated that the introduction of oil into the environment is 1.7 to 8.8 million metric tons, most of which is of anthropogenic origin (Leahy and Cowell, 1990).
  • Stetter et al isolated a new group of sulpho-reducing and hyperthermophilic archaea from a hydrothermal system on Vulcano Island, Italy (strain Archaeoglobus fulgidus VC 16 (DSM 4304)).
  • the species belonging to the genus Archaeoglobus are characterized by regular or irregular shell-shaped cells ranging in size from 0.4 to 1 ⁇ m. They are negative gram, separate or in pairs. These microorganisms tolerate a growth temperature ranging from 60 ° C. to 95 ° C., a pH of the order of 5.5-7.5. These are chemiorganotrophs that can oxidize formate, formamide, D- and D + lactate, glucose, starch, casamino acids, peptone, gelatin, casein, yeast extract, meat extract and extracts of eubacteria and archaea cells in the presence of sulphate, thiosulfate and sulphite as an electron acceptor.
  • these microorganisms can grow in the presence of H 2 CO 2 .
  • thiosulfate as electron acceptor, there is production of sulfides greater than 6 ⁇ mol / ml and traces of methanes less than 0.1 ⁇ mol / ml.
  • Archaeoglobus fulgidus VC-16 is the type species; the cells are in the form of irregular spheres with an envelope composed of glycoproteins. This strain has an optimum growth temperature of 83 ° C and a generation time of around 4h.
  • A. fulgidus is the first Archaea sulfato-reducing to have its sequence genome.
  • the genome of A. fulgidus is a circular chromosome of 2,178,400 base pairs, with a DNA G + C composition of 48.5%.
  • Sulphate reduction is the most abundant respiratory process in anoxic marine environments.
  • Sulphate SO 4 2 "
  • adenylsulfate Adenosine-5'-phos phosulfate, APS
  • sulfite the enzyme involved in the process of concealing sulphate reduction is adenylsulfate reductase which reduces the sulphite, thus formed, is reduced to sulphide by the action of a desulfoviridine, sulphite reductase.
  • fulgidus is unable to grow on acetate
  • several acetyl-CoA synthetase genes have been detected in its genome. They are responsible for the conversion of acetate to acetyl-CoA.
  • the presence of 57 enzymes involved in ⁇ -oxidation suggests that fulgidus is able to oxidize fatty acids.
  • the pathway of ⁇ -oxidation in Archaea is similar to that occurring in Bacteria and mitochondria.
  • A. fulgidus In A. fulgidus, the production of traces of methane during growth is probably due to a reduction of N5-methyltetrahydromethanopterin through carbon monoxide dehydrogenase. In addition, it has been suggested that A. fulgidus contains a type of CO dehydrogenase similar to that of Rhodospirillum rubrum allowing it to grow using carbon monoxide as the sole source of energy.
  • the object of the present invention is to provide novel processes for the anaerobic degradation of aliphatic or aromatic hydrocarbons, as well as new bacterial strains for carrying out these processes.
  • the invention relates to the use of thermophilic sulfato-reducing archaebacteria for the implementation of a process for the anaerobic degradation of saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbons or aromatic hydrocarbons, where appropriate sulfur-containing hydrocarbons. .
  • the invention relates more particularly to the above-mentioned use, in which the archeobacteria are chosen from species belonging to the genus Archaeoglobus, and in particular from the following species:
  • the invention more particularly relates to the above-mentioned use, in which the archeobacteria are chosen from the following Archaeoglobus fulgidus:
  • the invention relates more particularly to the above-mentioned use, in which the hydrocarbons are chosen from: alkanes, and in particular branched alkanes whose linear chain comprises from 5 to 20 carbon atoms, in particular heptamethymonane (HMN) or prystane, alkenes, and especially linear alkenes whose chain contains from 1 to 20, in particular from 1 to 16 carbon atoms,
  • HNN heptamethymonane
  • prystane alkenes
  • alkenes and especially linear alkenes whose chain contains from 1 to 20, in particular from 1 to 16 carbon atoms
  • DBT dibenzothiophene
  • benzene toluene
  • naphthalene phenanthrene
  • the invention more particularly relates to the above-mentioned use, in which the sulphate or thiosulphate is used as an electron acceptor, the aliphatic hydrocarbons (saturated or non-saturated, branched or linear) and aromatic hydrocarbons are used as electron donors, and the production of H 2 S in the presence of hydrocarbons is greater than or equal to about 1 mM, and especially about 4 mM.
  • the invention also relates to a method of degradation under anaerobic conditions of linear or branched aliphatic hydrocarbons, saturated or unsaturated, or of aromatic hydrocarbons, optionally sulfur-containing, characterized in that it comprises a step of placing said hydrocarbons in contact with said hydrocarbons.
  • thermophilic sulfato-reducing archaebacteria as defined above, if appropriate after addition in the reaction medium of sulfate or thiosulfate used as electron acceptor, and said hydrocarbons used as electron donors.
  • the invention relates more particularly to a method as defined above, characterized in that the .
  • Archaeobacteria are selected from species belonging to the genus Archaeoglobus, and in particular from the following species:
  • the invention more particularly relates to a process as defined above, characterized in that the archeobacteria are chosen from the following Archaeoglobus fulgidus: - Archaeoglobus fulgidus DSM 4304,
  • the invention relates more particularly to a process according to as defined above, characterized in that the hydrocarbons are chosen from:
  • alkanes and in particular branched alkanes whose linear chain comprises from 5 to 20 carbon atoms, in particular heptamethylnonane (HMN) or prystane,
  • alkenes and especially linear alkenes whose chain contains from 1 to 20, in particular from 1 to 16 carbon atoms,
  • DBT dibenzothiophene
  • benzene toluene
  • naphthalene phenanthrene
  • the invention more particularly relates to a process as defined above, characterized in that the production of H 2 S in the presence of hydrocarbons is greater than or equal to about 1 mM, and in particular about 4 mM.
  • the invention relates more particularly to a process according to as defined above, characterized in that the amount of archeobacteria used is about 1 g / L (wet weight) for about 2 mM of hydrocarbons.
  • the invention more particularly relates to a method as defined above, characterized in that the contact time between archaebacteria and hydrocarbons is about 15 days.
  • the invention relates more particularly to a method according to as defined above, characterized in that it comprises a cell recovery step, and optionally purification of membrane lipids.
  • the invention also relates to archaebacteria selected from the following species belonging to the genus Archaeoglobus:
  • Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304) is an archaea sulfato-reducing, strict anaerobic, extreme thermophilic. It has been isolated from a marine hydrothermal system (Vulcano Island) near Naples (Stetter, 1988). The cells have a coccoid shape, a size of 0.4 to 1 ⁇ m and are separated or in pairs. In order to obtain optimal growth, the temperature should be 83 ° C, the pH between 5.5 and 7.5 and the optimum substrate is lactate. The percentage of G + C in the DNA of this strain is 46%.
  • the L-3 strain is an Archaea that was isolated from a sample at 80 ° C. in a geothermal well located in Melun (Paris region) by ML Fardeau.
  • the cells are shells 1 to 1.5 microns in diameter. This strain is able to grow at temperatures ranging from 55 to 85 ° C, its temperature optimum being 75 ° C. It grows to a pH equal to 6.5.
  • Strain L-3 is a sulphate reducer whose growth is favored by thiosulfate as an electron acceptor instead of sulphate, and lactate as a substrate. During its metabolism, the substrates used are totally oxidized to lead to the formation of CO 2 , unlike Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304) whose oxidation is partial and passes through the excretion of traces of acetate.
  • Culture media were prepared according to techniques developed by Hungate (1969) and developed by Miller and Wollin (1974).
  • the synthetic medium is composed, for 1 liter of distilled water, of NH 4 Cl, 1 g; KH 2 PO 4 , 0.3 g; K 2 HPO 4 , 0.3 g; KCl, 0.1 g; CaCl 2 , 2H 2 O, 0.1 g; NaCl, 20 g; NiSO 4 .6H 2 O, 1.6 mg; Na 2 WO 4 .
  • This micronutrient solution contains, for 1 liter of distilled water, 10 ml of 25% HCl, 1.5 g of FeCl 2 , 4 H 2 O, 190 mg of CoCl 2 , 6 H 2 O , 100 mg of MnCl 2 , 4 H 2 O, 70 mg of ZnCl 2 , 62 mg of H 3 BO 3 , 36 mg of Na 2 MoO 4 , 2 H 2 O, 24 mg of NiCl 2 , 6 H 2 O, 17 mg of CuCl 2 , 2H 2 O, and its pH is adjusted to 7.2.
  • the pH of the medium is adjusted to 7, then the medium is boiled under a stream of nitrogen in order to degas the medium and replace the dissolved oxygen with nitrogen.
  • the anoxic culture medium is distributed according to use either in culture flasks or in anaerobic culture tubes.
  • the sulphide assay was carried out according to two methods, that of Cord-Ruwish (1985) and that of Cline (1969).
  • the Cord-Ruwish sulfide assay is a turbidimetric assay. Experimentally, to 5 ml of sample are added 4 ml of Cord-Ruwish reagent composed of 50 mmol / l HCl and 5 mmol / l CuSO 4 . Copper sulphate (CuSO 4 ), reacting with hydrogen sulphide (H 2 S), forms a precipitate of copper sulphide (CuS) according to the reaction:
  • the CuS is determined spectrophotometrically at 480 nm.
  • the readings are made against a blank consisting of 4 ml of Cord-Ruwish reagent.
  • the amount of sulphide is calculated with respect to a calibration curve made with sodium sulphide.
  • the sulphide assay according to the Cline method is a colorimetric assay. This assay is based on the formation of methylene blue following the combination of 2 molecules of dimethyl p-phenylenediamine (DMPD) in the presence of ferric chloride by a sulphide bridge.
  • DMPD dimethyl p-phenylenediamine
  • a micromethode was used, it is carried out on a fraction of 1 to 20 ⁇ l of sample placed in 2% zinc acetate which will fix the sulphide in the form of insoluble zinc sulphide (qs 500 ⁇ l).
  • the analysis and the quantification of the metabolites are carried out by HPLC and this by measuring the disappearance of the substrate and the appearance of different products of the metabolism.
  • the equipment used consists of:
  • Reference standard curves are established with solutions of known concentrations that allow the software to identify a compound by its retention time and deduce its concentration. The identified peaks are automatically processed and the concentration of each compound is deduced from the importance of the peak.
  • the eluent liquid is sulfuric acid (0.0025 M) at 35 0 C filtered and degassed.
  • the flow rate of the eluent is 0.6 ml / min with a pressure of 1200 psi.
  • the rinsing liquid of the injection syringe is water.
  • Samples are taken and frozen before switching to HPLC. After thawing, the samples are centrifuged for 6 min at 13000 rpm at 20 ° C.
  • the thiosulfate and sulfate assays are performed by ion chromatography.
  • Ion Chromatography is one of the oldest chromatographic techniques.
  • the principle of ion chromatography is based on an ion exchange on resin.
  • the ions are driven by a mobile phase and separated by the action of the stationary phase.
  • the separation will be more or less easily.
  • the analyzes are carried out with a chromato graph (Compact IC 761, Metrohm) equipped with: "A cationic ion exchange column (Metrosep A SUPP 1-250 (6.1005.300)) of size 4.6 * 250 mm”
  • the eluent used is Na 2 CO 3 at a concentration of 3 mmol / l, at a flow rate of 1 to 2.5 ml / min; ((-> the flow rate varies during the analysis)) • A sample changer (Metrohm 838); "A conductivity meter;”
  • a computer where the results are listed, integrated, and analyzed by software (761
  • the operating conditions are such that the temperature is at 20 ° C. and the pressure is at 5 MPa.
  • the samples to be analyzed are filtered.
  • the injection volume is 20 ⁇ l.
  • the detection is of the electrochemical conductimetric type with chemical suppression allowing elution gradients.
  • Gas Chromatography is a transposition of liquid chromatography in which the mobile liquid phase has been replaced by a gas.
  • a gas chromatograph comprises:
  • a column arranged in a thermostatically controlled furnace
  • GPC equipped with a katharometer is used to qualify and quantify the level of consumption of hydrogen, oxygen and CO 2 .
  • the different gaseous solutes will separate by differential migration along the stationary phase.
  • the retention times of these gases in the column are different, which makes it possible to separate them in increasing order of molecular weight and to identify them; the H 2 is eluted first, then the O 2 and finally the CO 2 .
  • the analyzes are carried out with a Schimadzu GC-8A chromatograph equipped with: "a column filled with a carbosphere support, maintained at 150 ° C.” an injector and a detector (katharometer) maintained at a temperature of 200 ° C., reference cell crossed only by the carrier gas N 2 ; a measuring cell traversed by the carrier gas and the sample: it is the potential difference created between the two cells by variation of their resistance which makes it possible to quantify the effluents.
  • the result provided by the device comes out in the form of peaks. Based on pre-established standard curves with known concentrations of pure gases, each peak is assigned to the corresponding compound.
  • the CO 2 determination is carried out after displacement of the CO 2 present in the liquid phase to the gas phase.
  • the release of CO 2 in the gas phase is due to the addition of a volume of 1M phosphoric acid equal to 1% of the volume of the culture, followed by vigorous stirring. 0.1 ml of the gas phase is injected into the chromato graph.
  • the determination of heavy hydrocarbons is by injection of extracted hydrocarbons in a gas chromatograph.
  • the chromato graph used is of type Chrompack CP
  • a carrier gas nitrogen with a flow rate of 10 ml / min;
  • the heavy hydrocarbons are assayed by gas chromatography (GC) after extraction of the cultures with a half volume of heptane, supplemented with an internal standard. By sample, three injections of 1 .mu.l are made. A calibration curve is performed using increasing [hydrocarbon to be determined] / [internal standard] ratios.
  • GC gas chromatography
  • the culture medium is completed as described in section 1.2, without substrate, and distributed in Bellco tubes.
  • the tests are inoculated at 10%.
  • Aliphatic hydrocarbons alkanes and alkenes
  • the other hydrocarbons to be determined (dibenzothiophene (DBT) are dissolved in heptamethylnonane (HMN) and PHMN alone).
  • DBT dibenzothiophene
  • HN heptamethylnonane
  • PHMN heptamethylnonane
  • the hydrocarbons are introduced using a chromatography syringe (Hamilton) after removing the blue caps and placing the tubes under a stream of nitrogen. This operation subsequently allows the blue caps (Bellco) to be replaced by blue caps covered with Teflon.
  • the tubes placed upside down are incubated at 75 ° C.
  • PHMN the internal standard is tetradecane (20 ⁇ l / 25 ml of heptane).
  • Cell count is the determination of the number of cells contained in a specific volume of a liquid medium. The result of counting is expressed in cell concentration, that is to say in number of cells per liter.
  • the cell count adopted during the experiments is carried out either directly by counting under a microscope, using a special counting plate (or counting cell), or indirectly by measuring the absorbance at 580 nm.
  • a counting cell is an object blade in which is dug a count chamber of known volume. It is a thick glass slide, with channels and a grid.
  • the Thoma cell is a glass slide having a surface defined and squared with 400 squares, and which, covered with a flat slide, traps a known volume of microbial suspension.
  • the two side plates of the cell are moistened so that the lamella adheres perfectly to the side plates.
  • the counting chamber is then filled by capillarity with the homogeneous cell suspension, avoiding the creation of air bubbles. The count can be performed after a few minutes when the cells have sedimented on the grid.
  • N n / v with: n: number of counted cells, v: counting volume, given that each large square has a volume of 4.10 "6 ml,
  • N number of cells per liter.
  • Microbial growth was monitored by OD measurements at 580 nm and microbial activity was monitored by sulphide production using the Cordon method.
  • the L-3 strain without yeast extract can also be grown on the following medium: compound, for 1 liter of distilled water, of NH 4 Cl, 1 g; KH 2 PO 4 , 0.3 g; K 2 HPO 4 , 0.3 g; KCI,
  • strain L-3 requires yeast extract to grow.
  • Lactate free control 2 0.0751 0.0737 0.2 0.0997 0.1066 0.2
  • strain L-3 does not grow on the formate-containing assays; this has been proven by HPLC.
  • Archaeoglobus fulgidus is able to oxidize lactate, fumarate, pyruvate and formate with a preference for thiosulfate over sulfate as an electron acceptor; its catabolism is characterized by a formation of traces of acetate.
  • strain L-3 is capable of degrading lactate, pyruvate, PH 2 / CO 2 and fumarate; this mineralization is much greater in the presence of thiosulphate than in the presence of sulphate (demonstrated by HPLC). In addition, this mineralization is total, that is to say that it leads to CO 2 .
  • the tests containing lactate, pyruvate and H 2 ZCO 2 show a cell growth accompanied by a production of sulphide, which reaches 5.7 mM, 5.2 mM 5 and 3 4 mM respectively for lactate, pyruvate and H 2 / CO 2 .
  • the hypothesis of the degradation of these substrates has been confirmed by HPLC analyzes.
  • the HPLC analyzes show a decrease in the initial amount of the substrate, as in the case of tests containing glucose, fructose, mannose and ribose. But, this does not imply that there is mineralization of the substrates as long as there is no increase in cellular biomass and sulphide production. In fact, the reduction of a substrate, in HPLC, can be explained by the phenomenon of isomerization caused by a high handling temperature.
  • strain L-3 and Archaeoglobus fulgidus show a similarity of 99% between the DNA sequences coding for the corresponding 16S RNA. DNA / DNA hybridization showed close homology 90%. So, strain L-3 belongs to the genus Archaeoglobus and is close to A.fulgidus species.
  • Archaeoglobus fulgidus Comparing the two archaebacteria, and relying on cell growth (expressed as OD at 580 nm), Archaeoglobus fulgidus shows a much higher cell growth than the L-3 strain. Archaeoglobus fulgidus reaches 0.89 units of DO, unlike strain L-3, which barely reaches 0.26 uDO. This can be explained by the fact that : Archaeoglobus fulgidus is in optimum growth conditions, ie the culture medium meets the nutritional requirements of this Archaea, not L-3
  • This study has two main components, a qualitative study of hydrocarbon degradation capacities by the two Archaea, and a quantitative study of the possible degradation of hydrocarbons.
  • the tubes containing 10 ml of culture medium without substrate are inoculated at 10%, and then the hydrocarbon is introduced by injection through the stopper.
  • hydrocarbons chosen are model molecules belonging to the different classes of hydrocarbons, namely:
  • Hexadecane (CH 3 (CH 2 ) 14 CH 3 , C 16), a saturated linear aliphatic hydrocarbon
  • hexadecene (CH 3 (CH 2 ) 13 CHCH 2 , C 16: 1), an unsaturated linear aliphatic hydrocarbon of biogenic origin;
  • DBT dibenzothiophene
  • the aliphatic hydrocarbons (C 16, C 16: 1) are added to the corresponding tubes at the rate of 0.04 ml / 10 ml of culture medium.
  • the aromatic hydrocarbons (DBT) are solubilized in 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane (HMN, C 16 H 34 ) at a concentration of 20 mg / ml of HMN, and 0.75 ml of this solution is injected into 10 ml of culture medium.
  • the sulphide production is very low, not exceeding 0.5 mM, and is even lower than that of the controls without substrate.
  • the production of sulphide is greater than that produced in controls without substrate, in the tests containing phenanthrene, and hexadecane (C16).
  • it does not reach that of the control containing the solvent, the HMN.
  • the DBT solubilized in the HMN, shows a significant sulphide production compared to the other tests containing the various linear or polycyclic aromatic aliphatic hydrocarbons, and this for the two strains.
  • sulphide production in DBT tests is generally much greater than in controls containing HMN alone.
  • the hypothesis of a possible degradation of the linear saturated aliphatic hydrocarbons (C 16) and that of the polycyclic aromatic hydrocarbon is discarded, phenanthrene.
  • Lactate control 1 0.3 4 3.5 3.3 3.9 3.6 0.3 4.1 1.8 2.5 4.7 4.4 2 0.5 5.8 3.8 3 3, 7 3.2 0.2 2.9 3.2 3.1 4.3 4.1 3 0.5 8.6 4.3 3.1 3.7 3.2 0.6 1.7 1.3 1.4 1.4
  • Phenanthrene test 1 1.1 1.6 0.8 1.5 0.4 0.4 0.5 0.4 0.5 0.1
  • Transplanting was carried out from the previous experiment on naphthalene, DBT solubilized as previously in the HMN, and on HMN alone, for the two strains studied.
  • the tubes constituting the inoculum were selected from the 3 tubes of the preceding experiment on the basis of the following criteria: a Cord-Ruwislx sulfide assay, a cell-mass determination at 580 nm confirmed by a cell count, and microscopic observations revealing the state of the cells (Table T).
  • Tubes with the highest hydrogen sulfide values also have large and healthy bacterial cells and were therefore selected (highlighted panel cells correspond to tubes chosen for subculture).
  • Tables 3 and 4 present the results of the evolution of sulphide production after transplanting.
  • the thick rubber plugs were covered with a Teflon film, an inert material that avoids any loss of the hydrocarbon by absorption or adsorption.
  • the hydrocarbons were added at the rate of:
  • HMN 6 ⁇ l of HMN / 10 ml of culture medium.
  • the prepared tests are inoculated with the previous subculture The results obtained are shown in the table.
  • Biomass and sulphide production are related to the presence of hydrocarbons.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d' archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procédé de dégradation en conditions anaérobies d'hydrocarbures aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou non, ou d'hydrocarbures aromatiques, le cas échéant soufrés.

Description

UTILISATION D'ARCHAEA SULFATO-REDUCTRICES
THERMOPHILES POUR LA MISE EN OEUVRE D'UN PROCEDE DE
DEGRADATION D'HYDROCARBURES
La présente invention concerne l'utilisation d' archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procédé de dégradation en conditions anaérobie d'hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques.
Les hydrocarbures sont des composés organiques constitués de carbone et d'hydrogène, un de leurs principaux réservoirs est le pétrole, formé géόchimiquement à hautes températures et hautes pressions. Les hydrocarbures comprennent des composés saturés ; les alcanes et les cycloalcanes, des composés insaturés ; les akènes et les cycloalcènes, et des composés aromatiques qui peuvent être mono ou poly cycliques. En fait, les hydrocarbures aliphatiques et aromatiques constituent plus de 75 % de la plupart des pétroles bruts. On peut même noter la présence de composés organiques azotés, soufrés ou oxygénés en faible concentration, la présence d'une fraction asphaltique et de porphyrines (Bertrand et Mille, 1989).
Le pétrole est la principale source d'énergie utilisée par l'homme. Lors de sa distribution des problèmes en découlent. Ce sont des problèmes d'une part dus au transport et au stockage, aux risques de biodégradation du pétrole et de ses produits dérivés. Par ailleurs, le transport effectué essentiellement par voie maritime, joue un rôle majeur dans la pollution de l'environnement. L'Académie Nationale des Sciences et de l'Environnement a estimé que l'introduction du pétrole dans l'environnement est de 1,7 à 8,8 millions de tonnes métriques, dont la plupart est d'origine anthropique (Leahy et Cowell, 1990).
La pollution des environnements naturels par les hydrocarbures est devenue une préoccupation importante. En effet, les réservoirs de pétrole contiennent des composés soufrés, comme le dibenzothiophène (DBT). Leur combustion est la principale cause de la pollution urbaine et de l'acidité des pluies. En plus, les microorganismes présents dans les puits pétroliers corrodent l'acier et mettent en péril la sécurité des agents d'exploitation par la production en anaérobiose de sulfures ; ce que l'on appelle le "Souring des gisements". Aussi, les scientifiques se sont attachés à comprendre les mécanismes de dégradation chimiques et biologiques des hydrocarbures dans le dessein de mettre en place des processus biotechnologiques afin de remédier à ce problème environnemental. En fait, le traitement par biodégradation, c'est-à-dire la dégradation naturelle accélérée par les microorganismes, est avantageuse puisqu'elle est moins onéreuse et plus douce d'un point de vue écologique que les traitements physico-chimiques. Elle peut, par ailleurs conduire à une minéralisation complète des hydrocarbures.
Le catabolisme des hydrocarbures a longtemps été considéré comme un procédé ^ strictement dépendant de l'oxygène. Au cours de ce processus, l'étape initiale nécessite l'intervention d'oxygénases (Spormann et Widdel, 2000). La capacité de quelques bactéries à métaboliser les hydrocarbures en absence d'oxygène n'est devenue envisageable que depuis une vingtaine d'années (Atlas, 1981 ; Bertrand &Mille, 1989 ; Leahy & Colwell, 1990). Les microorganismes capables d'un tel métabolisme ont dû trouver une alternative pour dégrader les hydrocarbures en absence d'oxygène. Jusqu' alors, des bactéries dénitrifiantes, des bactéries sulfato-réductrices, et des bactéries réduisant le fer, capables de dégrader les hydrocarbures ont été isolées.
C'est en 1987 que Stetter et al ont isolé un nouveau groupe d'Archaea sulfato- réducteurs et hyperthermophiles à partir d'un système hydrothermal dans l'île de Vulcano en Italie (souche Archaeoglobus fulgidus VC 16 (DSM 4304)).
Les espèces appartenant au genre Archaeoglobus se caractérisent par des cellules en forme de coques régulières ou irrégulières, ayant une taille variant entre 0,4 à 1 μm. Ce sont des Gram négatifs, séparés ou en pairs. Ces microorganismes tolèrent une température de croissance allant de 60 0C à 95 °C, un pH de l'ordre de 5,5-7,5. Ce sont des chimiorganotrophes pouvant oxyder le formate, le formamide, le D- et D+ lactate, le glucose, l'amidon, les casaminoacides, la peptone, la gélatine, la caséine, l'extrait de levure, l'extrait de viande et les extraits de cellules d'eubacteria et d'archaea, en présence de sulfate, de thiosulfate et de sulfite en tant qu'accepteur d'électrons. En plus, ces microorganismes peuvent croître en présence de H2CO2.. En présence de thiosulfate comme accepteur d'électrons, il y a production de sulfures supérieure à 6 μmol / ml et de traces de méthanes inférieures à 0,1 μmol / ml.
Archaeoglobus fulgidus VC-16 est l'espèce type; les cellules se présentent sous forme de sphères irrégulières avec une enveloppe composée de glycoprotéines. Cette souche a une température optimale de croissance égale à 83 °C et un temps de génération avoisinant les 4h.
Cette espèce est déposée dans la collection Allemande des microorganismes Braunshweig-Stockheim, portant l'appellation de VC-16 (4304).
Klenk et al (1997) ont fait le séquençage du génome d'_4. fulgidus, VC-16 tout en le comparant avec une Archaea : Methanococcus jannaschii. En fait, A. fulgidus est la première Archaea sulfato-réductrice à avoir son génome séquence. Le génome d' A. fulgidus est un chromosome circulaire formée de 2,178,400 paires de bases, avec une composition en G + C de l'ADN égale à 48,5 °/o.
La sulfato-réduction est le processus respiratoire le plus abondant dans les environnements marins anoxiques. Le sulfate (SO4 2") est le premier à être activé pour donner PAdénylsulfate (Adénosine-5'-phosρhosulfate ; APS) suivi du sulfite. L'enzyme impliquée dans le processus de la sulfato-réduction dissimilatrice est Padénylsulfate réductase qui réduit le suifate activé. Le sulfite, ainsi formé, est réduit en sulfure par l'action d'une désulfoviridine, la sulfite réductase.
Bien qu'il ait été signalé qu'A, fulgidus est incapable de croître sur acétate, plusieurs gènes d'acétyl-CoA synthétase ont été détectés dans son génome. Ils sont responsables de la transformation d'acétate en acétyl-CoA. La présence de 57 enzymes impliquées dans la β- oxydation suggère quΑ fulgidus est capable d'oxyder les acides gras. La voie de la β- oxydation chez les Archaea est similaire à celle s 'effectuant chez les Bacteria et les mitochondries.
Chez A. fulgidus, la production de traces de méthane lors de la croissance est probablement due à une réduction de N5-métliyltetrahydrométhanoptérine par le biais de la monoxyde de carbone déshydrogénase. En plus, il a été suggéré qu' A. fulgidus contient un type de CO déshydrogénase similaire à celui de Rhodospirillum rubrum lui permettant de croître en utilisant le monoxyde de carbone comme seule source d'énergie.
La présente invention a pour but de fournir de nouveaux procédés de dégradation en conditions anaérobie d'hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques, ainsi que de nouvelles souches bactériennes pour la mise en œuvre de ces procédés.
L'invention concerne l'utilisation d' archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procédé de dégradation en conditions anaérobie d'hydrocarbures aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou non, ou d'hydrocarbures aromatiques, le cas échéant soufrés.
L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, dans laquelle les archéobactéries sont choisies parmi les espèces appartenant au genre Archaeoglobus, et notamment parmi les espèces suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus,
- Archaeoglobus profondus,
- Archaeoglobus veneficus. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, dans laquelle les archéobactéries sont choisies parmi les Archaeoglobus fulgidus suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus DSM 4304,
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3),
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4). L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée, dans laquelle les hydrocarbures sont choisis parmi : les alcanes, et notamment les alcanes ramifiés dont la chaîne linéaire comporte de 5 à 20 atomes de carbone, notamment Pheptaméthymonane (HMN) ou le prystane, les alcènes, et notamment les alcènes linéaires dont la chaîne comporte de 1 à 20, notamment de 1 à 16 atomes de carbone,
- les composés aromatiques et notamment le dibenzothiophène (DBT), le benzène, le toluène, le naphtalène ou le phénanthrène.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, dans laquelle le sulfate ou le thiosulfate est utilisé comme accepteur d'électrons, les hydrocarbures aliphatiques (saturés ou non, ramifiés ou linéaires) et aromatiques sont utilisés comme donneur d'électrons, et la production de H2S en présence d'hydrocarbures est supérieure ou égale à environ 1 mM, et notamment à environ 4 mM.
L'invention concerne également un procédé de dégradation en conditions anaérobie d'hydrocarbures aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou non, ou d'hydrocarbures aromatiques, le cas échéant soufrés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdits hydrocarbures avec des archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles telles que définies ci-dessus, le cas échéant après addition dans le milieu réactionnel de sulfate ou de thiosulfate utilisé comme accepteur d'électrons, et desdits hydrocarbures utilisés comme donneurs d'électrons.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que les .archéobactéries sont choisies parmi les espèces appartenant au genre Archaeoglobus, et notamment parmi les espèces suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus,
- Archaeoglobus profondus,
- Archaeoglobus veneficus.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que les archéobactéries sont choisies parmi les Archaeoglobus fulgidus suivantes : - Archaeoglobus fulgidus DSM 4304,
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3),
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4). L'invention concerne plus particulièrement un procédé selon tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que les hydrocarbures sont choisis parmi :
- les alcanes, et notamment les alcanes ramifiés dont la chaîne linéaire comporte de 5 à 20 atomes de carbone, notamment l'heptaméthylnonane (HMN) ou le prystane,
- les alcènes, et notamment les alcènes linéaires dont la chaîne comporte de 1 à 20, notamment de 1 à 16 atomes de carbone,
- les composés aromatiques et notamment le dibenzothiophène (DBT), le benzène, le toluène, le naphtalène ou le phénanthrène.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la production de H2S en présence d'hydrocarbures est supérieure ou égale à environ 1 mM, et notamment à environ 4 mM.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé selon tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la quantité d' archéobactéries utilisée est d'environ 1 g/L (poids humide) pour environ 2 mM d'hydrocarbures.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que le temps de contact entre les archéobactéries et les hydrocarbures est d'environ 15 jours.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé selon tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de récupération des cellules, et le cas échéant de purification de lipides membranaires.
L'invention concerne également les archéobactéries choisies parmi les espèces appartenant au genre Archaeoglobus suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3),
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4). L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en œuvre de souches d' archéobactéries dans le cadre de la dégradation d'hydrocarbures. MATERIELS ET METHODES
I. Les souches utilisées
DANS TOUTE L'ETUDE EXPERIMENTALE QUI SUIT ON DESIGNE PAR « Archeoglobus fulgidus » LA SOUCHE DSM 4304, ET PAR « SOUCHE L-3 » LA SOUCHE CNCM 1-3465 DEPOSEE LE 22 JUIN 2005 A LA CNCM (PARIS). LES RESULTATS EXPERIMENTAUX OBTENUS AVEC LA SOUCHE L-3 PEUVENT ETRE EGALEMENT OBTENUS AVEC LA SOUCHE L-4, C'EST A DIRE LA SOUCHE CNCM 1-3469 DEPOSEE LE 30 JUIN 2005 A LA CNCM (PARIS).
Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304) est une Archaea sulfato-réductrice, anaérobie stricte, thermophile extrême. Elle a été isolée à partir d'un système hydrothermal marin (île de Vulcano) près de Naples (Stetter, 1988). Les cellules ont une forme coccoïde, une taille de 0,4 à 1 μm et sont séparées ou en paires. Afin d'obtenir une croissance optimale, la température doit être de 83°C, le pH compris entre 5,5 et 7,5 et le substrat optimum est le lactate. Le pourcentage en G+C de l' ADN de cette souche est de 46 %.
La souche L-3 est une Archaea qui a été isolée à partir d'un prélèvement à 800C dans un puits géothermique situé à Melun (région parisienne) par M. L. Fardeau. Les cellules sont des coques de 1 à 1,5 μm de diamètre. Cette souche est capable de croître à des températures allant de 55 à 85°C, son optimum de température étant de 75°C. Elle pousse à un pH égal à 6,5.
La souche L-3 est une sulfato-réductrice dont la croissance est avantagée par le thiosulfate en tant qu'accepteur d'électrons à la place du sulfate, et le lactate en tant que substrat. Au cours de son métabolisme, les substrats utilisés sont totalement oxydés pour conduire à la formation de CO2, contrairement à Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304) dont l'oxydation est partielle et passe par l'excrétion de traces d'acétate.
Une caractérisation phylogénétique a montré qu'il existe une similitude de 99% entre les séquences d'ADN codant pour l'ARN 16S de la souche L-3 et Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304). D'un point de vue génomique, la souche L-3 hybride à environ 90% (hybridation ADN/ADN) avec A. fulgidus (DSM 4304) H. Méthodes microbiologiques II.1. Milieux de culture anaérobies
Les milieux de culture ont été préparés selon les techniques mises au point par Hungate (1969) et développées par Miller et Wollin (1974). Le milieu synthétique est composé, pour 1 litre d'eau distillée, de NH4Cl, 1 g ; KH2PO4, 0,3 g ; K2HPO4, 0,3 g ; KCl, 0,1 g ; CaCl2, 2 H2O, 0,1 g ; NaCl, 20 g ; NiSO4.6H2O, l,6mg ; Na2WO4.2H2O, 38μg ; Na2Se03.5 H2O, 3μg ; Extrait de levure, 0.1 g ; thiosulfate ou sulfate, 20 mM, selon l'expérience ; L-Cystéine, HCl hydrochloride, 0,5 g; résazurine, 1 ml d'une solution à 0,1 % ; 0,05 ml d'une solution de vitamines (Wollin et al., 1963) ; oligo-éléments, 1 ml. Cette solution d'oligo-éléments contient, pour 1 litre d'eau distillée, 10 ml d'HCl à'25%, 1,5 g de FeCl2, 4 H2O, 190 mg de CoCl2, 6 H2O, 100 mg de MnCl2, 4 H2O, 70 mg de ZnCl2, 62 mg de H3BO3, 36 mg de Na2MoO4, 2 H2O, 24 mg de NiCl2, 6 H20, 17 mg de CuCl2, 2 H2O, et son pH est ajusté à 7,2.
Le pH du milieu est ajusté à 7, puis le milieu est porté à ébullition sous un flux d'azote afin de dégazer le milieu et remplacer l'oxygène dissout par de l'azote. Le milieu de culture anoxique est réparti selon l'usage soit dans des flacons de culture, soit dans des tubes de culture anaérobie.
Après stérilisation du milieu de culture à l'autoclave pendant 45 min à 121,1 °C, celui-ci est complété par l'addition de Na2S, 9 H2O, 2% (0,1 ml pour 5 ml) en tant que réducteur, de NaHCO3, 10% (0,1 ml pour 5 ml) comme tampon, et de MgCl2 , 6H2O (3g/L). Ce dernier est ajouté après stérilisation pour éviter sa précipitation liée à la présence de NaCl. Enfin, le substrat est ajouté suivant les conditions de l'expérience. Lorsqu'il s'agit du lactate, celui-ci est introduit à 20 mM à partir d'une solution stérile à 1 M.
III. Analyses chimiques et biochimiques HLl. Dosage de sulfure
Le dosage de sulfure a été réalisé selon deux méthodes celle de Cord-Ruwish (1985) et celle de Cline (1969).
m.1.1. Dosage de sulfure selon Cord-Ruwish
Le dosage de sulfure selon Cord-Ruwish est un dosage turbidimétrique. Expérimentalement, à O5I ml d'échantillon sont ajoutés 4 ml de réactif de Cord-Ruwish composé de 50 mmol/1 de HCl et de 5 mmol/1 de CuSO4. Le sulfate de cuivre (CuSO4) en réagissant avec le sulfure d'hydrogène (H2S), forme un précipité de sulfure de cuivre (CuS) d'après la réaction :
CuSO4 + H2S ^ CuS + H2SO4
Selon cette méthode, le CuS est dosé par spectrophotométrie à 480 nm. Les lectures sont effectuées contre un blanc constitué de 4 ml du réactif de Cord-Ruwish. Là quantité de sulfure est calculée par rapport à une courbe d'étalonnage réalisée avec du sulfure de sodium.
III.1.2. Dosage de sulfure selon Cline
Le dosage du sulfure selon la méthode de Cline est un dosage colorimétrique. Ce dosage est basé sur la formation de bleu de méthylène suite à l'association de 2 molécules de diméthyl p- phénylène diamine (DMPD) en présence de chlorure ferrique par un pont sulfure.
Une microméthode a été utilisée, elle est réalisée sur une fraction de 1 à 20 μl d'échantillon placé dans l'acétate de zinc à 2% qui va fixer le sulfure sous forme de sulfure de zinc insoluble (qsp 500 μl).
200 μl de DMPD à 0,2 % (2 g de sulfate de diméthylaniline, 200 ml d'acide sulfurique concentré, eau distillée qsp 11), 10 μl de chlorure de fer à 10 % et 200 μl d'eau distillée sont ensuite ajoutés. L'intensité de la coloration est mesurée au spectrqphotomètre à 670 nm, contre un blanc contenant de l'eau à la place de l'échantillon. La concentration en sulfure est déterminée par comparaison avec une courbe d'étalonnage réalisée à partir d'une solution de sulfure de sodium.
III.2. Analyses et quantification des produits du métabolisme πi.2.1. Description
L'analyse et la quantification des métabolites sont effectuées par HPLC et ceci en mesurant la disparition du substrat et l'apparition de différents produits du métabolisme.
L'appareillage utilisé est constitué de :
» Une colonne Aminex HPX-87H 300X7, 8mm (Biorad) portée à 350C ;
• Un passeur d'échantillons de type Spectra Séries AS 100 ;
• Un détecteur réfractomètre différentiel de type Spectra System RI 150 ;
• Un dégazeur automatique Spectra system SCM1000 couplé à Pinjecteur ; " Un ordinateur où les résultats sont répertoriés, intégrés et analysés par un logiciel Azur Datalys.
Des courbes étalons de référence sont établies avec des solutions de concentrations connues qui permettent au logiciel d'identifier un composé par son temps de rétention et d'en déduire sa concentration. Les pics identifiés sont traités automatiquement et la concentration de chaque composé est déduite de l'importance du pic.
II.2.2. Mode opératoire
Le liquide éluant est de l'acide sulfurique (0,0025 M) à 350C filtré et dégazé. Le débit de l'éluant est de 0,6 ml/min avec une pression de 1200 Psi. Le liquide de rinçage de la seringue d'injection est l'eau.
Les échantillons sont prélevés et congelés avant le passage en HPLC. Après décongélation, les échantillons sont centrifugés pendant 6 min à 13000 tr/min à 2O0C.
On introduit 600 μl de surnageant dans des petits flacons adaptés qui seront par la suite placés dans le passeur d'échantillon automatique. Le volume d'injection est de 20 μl. A la fin de chaque série d'analyse, la colonne est rincée par une solution d'acétonitrile à 15 % afin d'éviter toute contamination bactérienne de la colonne susceptible de fausser les mesures.
III.3. Dosage du thiosulfate et du sulfate
π.3.1. Description
Les dosages du thiosulfate et du sulfate sont effectués par chromatographie ionique.
La chromatographie ionique (CI) est une des plus anciennes techniques chromatographiques.
Paradoxalement, les appareils automatiques de la chromatographie ionique n'ont été développés que depuis un peu plus d'une vingtaine d'années (1975).
Le principe de la chromatographie ionique est basé sur un échange d'ions sur résine. Les ions sont entraînés par une phase mobile et séparés par l'action de la phase stationnaire. Selon que l'interaction électrostatique entre la résine de la colonne et les ions à séparer est plus ou moins forte, la séparation se fera plus ou moins facilement.
Les analyses sont réalisées avec un chromato graphe (Compact IC 761, Metrohm) équipé de : " Une colonne échangeuse d'ions cationique (Metrosep A SUPP 1-250 (6.1005.300)) de taille 4,6 * 250 mm ; " L'éluant utilisé est le Na2CO3 à une concentration de 3 mmol/1, à un débit de 1 à 2,5 ml/min ; ((-> le débit varie pendant l'analyse)) • Un passeur d'échantillon (Metrohm 838) ; " Un conductimètre ; " Un ordinateur où les résultats sont répertoriés, intégrés et analysés par un logiciel (761
Compact IC, Metrohm).
133.3.2. Mode opératoire
Les conditions opératoires sont telles que la température est à 2O0C et la pression est à 5 MPa.
Les échantillons à analyser sont filtrés. Le volume d'injection est 20 μl. La détection est de type électrochimique conductimétrique avec suppression chimique autorisant des gradients d'élution.
III.4. Analyses par chromatographie en phase gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse est une transposition de la chromatographie liquide dans laquelle la phase liquide mobile a été remplacée par un gaz. Un chromatographe en phase gazeuse comprend :
" Une colonne, disposée dans un four thermostaté ;
" Un dispositif d'injection de l'échantillon ;
" Un détecteur.
III.4.1. Dosage du CO2 ///.4.1.1. Description
La CPG équipée d'un catharomètre est utilisée pour qualifier et quantifier le niveau de la consommation de l'hydrogène, de l'oxygène et du CO2. Les différents solutés gazeux vont se séparer par migration différentielle le long de la phase stationnaire. Les temps de rétention de ces gaz dans la colonne sont différents, ce qui permet de les séparer par ordre croissant de poids moléculaires et de les identifier ; l' H2 est élue en premier, puis l'O2 et enfin le CO2. Les analyses sont réalisées avec un chromatographe Schimadzu GC-8A équipé de : " une colonne remplie avec un support de carbosphère, maintenue à 150°C ; " un injecteur et un détecteur (catharomètre) maintenus à une température de 2000C, " une cellule de référence traversée uniquement par le gaz vecteur N2 ; " une cellule de mesure traversée par le gaz vecteur et l'échantillon ; c'est la différence de potentiel crée entre les deux cellules par variation de leur résistance qui permet de quantifier les effluents.
Le résultat fourni par l'appareil ressort sous forme de pics. En fonction de courbes étalons préétablies avec des concentrations connues de gaz purs, on attribue chaque pic au composé correspondant.
III.4.1.2. Mode opératoire
Le dosage du CO2 est réalisé après déplacement du CO2 présent dans la phase liquide vers la phase gazeuse. La libération du CO2 dans la phase gazeuse est due à l'ajout d'un volume d'acide phosphorique 1 M égal à 1% du volume de la culture, suivi d'une agitation vigoureuse. 0,1 ml de la phase gazeuse est injectée dans le chromato graphe.
III.4.2. Dosage des hydrocarbures lourds
IEA.2.1. Description
Le dosage des hydrocarbures lourds se fait par injection d'hydrocarbures extraits dans un chromatographe en phase gazeuse. Le chromato graphe utilisé est de type Chrompack CP
9000, équipé de :
" Une colonne semi-capillaire (Chrompack) en silice fondue (10 m * 0,53 mm) contenant une phase stationnaire de type CP-SiI 5 CB (lμm d'épaisseur) ; sa température est de 8O0C et augmentant jusqu'à 180 0C, à raison de 2°C/min ;
" Un gaz vecteur, l'azote avec un débit de 10 ml/min ;
" Un détecteur à ionisation de flamme maintenu à 300°C ;
" Un injecteur maintenu à 300 0C.
∑ΠA.2.2. Principe
Les hydrocarbures lourds sont dosés par chromatographie en phase gazeuse (CPG) après extraction des cultures avec un demi-volume d'heptane, additionné d'un étalon interne. Par échantillon, on réalise trois injections de 1 μl. Une courbe d'étalonnage est réalisée en utilisant des rapports [hydrocarbure à doser] / [étalon interne] croissants.
IEA.2.3. Mode opératoire de l'étude de la dégradation d'un hydrocarbure
Le milieu de culture est complété comme présenté au paragraphe 1.2, sans substrat, et réparti dans des tubes Bellco. Les essais sont inoculés à 10 %. Les hydrocarbures aliphatiques (alcanes et akènes) sont introduits directement dans les tubes à raison d'environ 2 mM. Les autres hydrocarbures à doser (dibenzothiophène (DBT) sont dissout dans l'heptaméthylnonane (HMN) et PHMN seul). Les hydrocarbures sont introduits à l'aide d'une seringue de chromatographie (Hamilton) après avoir enlevé les bouchons bleus et placés les tubes sous flux d'azote. Cette opération permet par la suite de remplacer les bouchons bleus (Bellco) par des bouchons bleus recouverts de Teflon. Enfin, on incube, les tubes placés à l'envers, à 750C.
La concentration initiale de PHMN introduit, en tant que substrat, est 1 mM (HMN, MM= 226,45 ; d=0,793) et celle du DBT est de 5,4 mM. (en prenant pour le calcul 10 mg / tube de
10 ml ; PM = 184,26)
Deux types de témoins sont préparés ; dans le premier type, les hydrocarbures ont été introduits mais pas l'inoculum, alors que le deuxième type a été inoculé mais les hydrocarbures n'ont pas été introduits.
L'analyse quantitative de la dégradation de ces hydrocarbures est réalisée sur des essais et des témoins sacrifiés au temps initial et au temps final de l'expérience.
L'extraction des hydrocarbures a été faite par un demi- volume d'heptane contenant un étalon interne. Les étalons internes ont été choisis ; dans le cas de l'étude quantitative de la dégradation du DBT, le pristane a été choisi (45 μl / 25 ml d'heptane), par contre, pour
PHMN, l'étalon interne est le tétradécane (20 μl / 25 ml d'heptane).
III.5. Dénombrement cellulaire
Le dénombrement cellulaire est la détermination du nombre de cellules contenues dans un volume précis d'un milieu liquide. On exprime le résultat de la numération en concentration cellulaire, c'est-à-dire en nombre de cellules par litre.
La numération cellulaire adoptée lors des expériences est réalisée soit directement par comptage au microscope, à l'aide d'une lame de comptage spéciale (ou cellule de numération), soit indirectement par mesure de l'absorbance à 580 nm.
IH.5.1. Principe de la numération cellulaire
Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. C'est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage.
11 est à signaler que le volume du comptage est déterminé par la surface du quadrillage gravé sur la lame et la profondeur de la chambre. III.5.2. Cellule de Thoma : Description et principe
La cellule de Thoma est une lame de verre comportant une surface délimitée et quadrillée de 400 carrés, et qui, recouverte d'une lamelle plane, emprisonne un volume connu de suspension microbienne.
Afin d'effectuer une numération cellulaire, on procède comme suit : Les deux plateaux latéraux de la cellule sont humectés de sorte que la lamelle adhère parfaitement aux plateaux latéraux. La chambre de comptage est ensuite remplie par capillarité avec la suspension cellulaire homogène en évitant de créer des bulles d'air. La numération peut être effectuée après quelques minutes lorsque les cellules auront sédimentées sur le quadrillage.
Le comptage se fait à l'objectif x 40 sur 3 à 4 grands carrés. La concentration cellulaire de la suspension étudiée est :
N = n / v avec : n : nombre de cellules comptées, v : volume de comptage, sachant que chaque grand carré a pour volume 4.10"6 ml,
N : nombre de cellules par litre.
RESULTATS
I. Caractérisation physiologique de Ia souche L-3 et d'Àrchaeoslobus fulsidus Ll. Besoin de Ia souche L-3 en extrait de levure
Afin d'étudier le besoin de la souche L-3 en extrait de levure, des essais et des témoins ont été préparés en duplicata. Dans les essais contenant le substrat lactate, des quantités variables d'extrait de levure ont été ajoutées, par contre, les témoins contiennent 2 g / 1 d'extrait de levure et pas de substrat, ceci est illustré par le tableau 1.
Le suivi de la croissance microbienne a été réalisé par des mesures de la DO à 580 nm et l'activité microbienne a été suivie par la production de sulfure selon la méthode de Cord-
Ruwish.
On peut également faire pousser la souche L-3 sans extrait de levure sur le milieu suivant : composé, pour 1 litre d'eau distillée, de NH4Cl, 1 g ; KH2PO4, 0,3 g ; K2HPO4, 0,3 g ; KCl,
0,1 g ; CaCl2, 2 H2O, 0,1 g ; NaCl, 20 g ; NiSO4.6H2O, l,6mg ; Na2WO4.2H2O, 38μg ;
Na2Se03.5 H2O, 3μg. Concernant les témoins, sans substrat, et contenant 2 g / 1 d'extrait de levure aucune hausse de la biomasse cellulaire, ni de production de sulfure n'est observée sur la totalité de la durée de l'incubation. Ceci démontre que la souche L-3 n'est pas capable de se développer sur 2 g / 1 d'extrait de levure, comme seule source de carbone et d'énergie.
Dans les essais à 0 g / 1 d'extrait de levure, il n'y a pas de croissance cellulaire. Ce résultat est confirmé par des valeurs de sulfures ne dépassant pas 0,5 mM. Ainsi, la souche L-3 nécessite de l'extrait de levure pour croître.
Dans les essais, avec des quantités d'extrait de levure variables (0,1 ; 0,5 ; 1 et 2 g / 1), on remarque une hausse des valeurs de la biomasse cellulaire produite, accompagnée par une production de sulfure ; cependant, cette croissance cellulaire varie en fonction de la quantité d'extrait de levure additionnée. En effet, l'essai à 2 g / 1 se caractérise par les valeurs de biomasse cellulaire et de production de sulfure les plus importantes, par rapport aux autres essais, et qui sont respectivement, en moyenne, 0,1968 pour la DO à 580 nm et 2,8 mM de sulfure
Ainsi, la suite des expérimentations sera réalisée avec des milieux contenant 2 g / 1 d'extrait de levure.
Tableau 1. Besoin de la souche L-3 en extrait de levure
Absorbance 580 nm H2S (mM)
Extrait de levure(g / !) initiale finale
Essai 0 0,0754 0,0864 0,5 0,1094 0,1052 1 ,3
Essai 0,1 0,0636 0,0946 0,7 0,0718 0,1176 1,3
Essai 0,5 0,0761 0,1415 0,7 0,1099 0,1671 0,3
Essai 1 0,0998 0,1671 1 ,1 0,0805 0,1475 2,8
Essai 2 0,0928 0,1965 0,7 . 0,0998 0,1972 2,3
Témoin sans lactate 2 0,0751 0,0737 0,2 0,0997 0,1066 0,2
1.2. Dégradation de substrats en fonction de l'accepteur d'électrons (thiosulfate, sulfate)
L'étude des capacités de dégradation de différents substrats chez la souche L-3 a été basée sur une comparaison avec la souche de collection, Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304).La dégradation des substrats, par les deux souches a été suivie par une mesure de la biomasse cellulaire à 580 nm, un dosage de sulfure produit selon la méthode de Cord-Ruwish, une étude des métabolites de dégradation par HPLC, complétés par un dosage du CO2 en CPG- catharomètre. Les résultats sont présentés dans les tableaux 2 et 3.
Deux séries d'essais ont été préparées, l'une avec le thiosulfate, l'autre avec le sulfate en tant qu'accepteur d'électrons.
Dans les essais où le substrat est le lactate et l'accepteur d'électrons est le thiosulfate ou le sulfate, une hausse de la croissance microbienne et une production de sulfure ont été perçues.
Par HPLC, on a confirmé la dégradation du lactate, qui a été accompagnée par une formation de traces d'acétate.
En comparant les deux séries d'essais contenant le lactate en fonction des accepteurs d'électrons, et en se basant sur les résultats de l'HPLC, il y a, avec le thiosulfate, une formation de traces d'acétate beaucoup plus importante qu'avec le sulfate.
Pour les essais contenant le fumarate, par HPLC, on ne peut pas repérer le pic de l'acétate en cas de dégradation, car les deux pics (acétate et fumarate) sortent au même niveau. Néanmoins, on voit une dégradation de substrat accompagnée par une production de sulfure, qui dans le cas du thiosulfate atteint 6,5 mM, et dans le cas du sulfate ne dépasse pas 3,1 mM. Ainsi, la minéralisation du fumarate est beaucoup plus intéressante avec le thiosulfate qu'avec le sulfate en tant qu'accepteur d'électrons, pour Archaeoglobusfulgidus.
Concernant le pyruvate et le formate, chimiquement, leur dégradation n'aboutit pas à une formation d'acétate. Par HPLC, on observe une disparition de ces substrats. La dégradation des substrats a été confirmée par une production de CO2. L'oxydation du pyruvate est plus efficace en présence de thiosulfate. Celle du formate est équivalente pour les deux accepteurs d'électrons.
Pour la souche L-3, le lactate a été métabolisé avec les deux accepteurs d'électrons, mais cette minéralisation confirmée en HPLC, est beaucoup plus importante avec le thiosulfate qu'avec le sulfate. En plus, les résultats de l'analyse en HPLC, montrent qu'il n'y a pas de métabolites produits lors de cette dégradation. On peut donc supposer que la voie de la minéralisation des substrats conduit directement à la formation de CO2. Concernant les essais contenant le pyruvate et le fumarate, les analyses en HPLC ont montré une dégradation des substrats confirmée par une production de CO2.
Contrairement à Archaeoglobus fulgidus, la souche L-3 ne se développe pas sur les essais contenant le formate ; ceci a été prouvé par HPLC.
Pour conclure, Archaeoglobus fulgidus est capable d'oxyder le lactate, le fumarate, le pyruvate et le formate avec une préférence pour le thiosulfate par rapport au sulfate en tant qu'accepteur d'électrons ; son catabolisme est caractérisé par une formation de traces d'acétate. En revanche, la souche L-3 est capable de dégrader le lactate, le pyruvate, PH2/CO2 et le fumarate ; cette minéralisation est beaucoup plus importante en présence de thiosulfate qu'en présence de sulfate (démontré par HPLC). De plus, cette minéralisation est totale, c'est- à-dire qu'elle aboutit au CO2.
Tableau 2. Dégradation de différents substrats, par A. fulgidus, en fonction de l'accepteur d'électrons
Thiosulfate Sulfate
DO 580 DO 580 H2S HPLC DO 580 DO 580 H2S HPLC initiale finale total initiale finale total
Lactate 0,1333 0,3681 8 (+) 0,1657 0,4218 7,1 (+) 0,1419 0,314 9,3 0,1456 0,1199 12,2 Fumarate 0,1085 0,1399 5,1 (+) 0,0759 0,1122 2,4 (+) 0,117 0,1535 6,5 0,085 0,14 3,1 pyruvate 0,1368 0,3668 4,1 (+) 0,1281 0,1643 10,3 (+) 0,1351 0,3489 9,9 0,1377 0,1575 7,3
Formate 0,1107 0,1218 5,8 (+) 0,0805 0,1 3,6 (+) 0,1183 0,120a 7,4 0,0853 0,1157 5
Tableau 3. Dégradation de différents substrats, par Ia souche L-3, en fonction de l'accepteur d'électrons
Thiosulfate Sulfate
DO 580 DO 580 H2S HPLC DO 580 DO 580 H2S HPLC initiale finale total initiale finale total
Lactate 0,073 0,1027 9,3 (+) 0,1024 0,3076 2,8 (+) 0,1029 0,1161 7,2 0,0888 0,2071 1 ,4
Fumarate 0,1083 0,1431 3,2 (+) 0,0606 0,1085 2,5 (+) 0,0796 0,1137 2,5 0,062 0,0899 3,3
Pyruvate 0,0785 0,1161 4 (+) 0,0603 0,0958 3,5 (+) 0,0911 0,0863 4 0,0636 0,0944 3,3
Formate 0,1003 0,1048 3,6 (-) 0,0585 0,0711 2,5. (-) 0,1241 0,1186 2,8 0,0634 0,064 5 1.3. Sources de carbone et d'énergie utilisées par Ia souche L-3
L'étude la croissance de la souche L-3 en présence de différentes sources de carbone et d'énergie été réalisée avec le thiosulfate en tant qu'accepteur d'électrons. Le suivi est effectué par estimation de la biomasse cellulaire (DO 580 nm), par dosage de la production de sulfure (Cord-Ruwish). Les résultats sont confirmés par des analyses en HPLC5 et complétés dans certains cas par un dosage de CO2. L'ensemble de ces résultats est présenté dans le tableau 4. Des témoins ne contenant pas de substrats ont été confectionnés ; la souche L-3 ne se développe pas dans ce témoin, c'est-à-dire qu'elle ne se développe pas sur 2 g / 1 d'extrait de levure comme unique source de carbone et d'énergie.
Par rapport aux témoins (inoculés ou non), les essais contenant le lactate, le pyruvate et le H2ZCO2 , montrent une croissance cellulaire accompagnée par une production de sulfure, qui atteint 5,7 mM, 5,2 mM5 et 3,4 mM respectivement pour le lactate, le pyruvate et le H2/CO2. L'hypothèse de la dégradation de ces substrats a été confirmée par des analyses en HPLC.
Il est à signaler que dans certains cas, les analyses en HPLC montrent une diminution de la quantité initiale du substrat, comme dans le cas des essais contenant du glucose, du fructose, du mannose et du ribose. Mais, ceci n'implique pas qu'il y ait une minéralisation des substrats tant qu'il n'y a pas une hausse de la biomasse cellulaire et une production de sulfure. En effet, la diminution d'un substrat, en HPLC, peut s'expliquer par le phénomène d'isomérisation provoqué par une haute température de manipulation.
Tableau 4. Sources de carbone et d'énergie utilisées par la souche L-3
H2S (480
DO 580 nm nm) HPLC
Initiale Finale
Témoin 0,0807 0,0579 0,4 (-) non inoculé 0,068 0,0621 0,2
Témoin 0,0678 0,0756 0,3 (-) Inoculé 0,065 0,0632 0,2
Acétate 0,0671 0,0904 0,4 (-) 0,0771 0,0812 0,3
Formate 0,0765 0,0672 0,2 (-) 0,0875 0,0759 0,4
Lactate 0,0742 0,1249 5,7 (+) 0,0841 0,1173 2,9
Fructose 0,0663 0,1003 0,3 (-) 0,0818 0,0893 0,3
Glucose 0,0665 0,0855 0,3 (-) 0,0637 0,0801 0,3
Mannose 0,0788 0,0731 0,3 (-) 0,0723 0,0757 0,3
Propionate 0,0669 0,0871 0,3 B 0,0717 0,072 0,3
Pyruvate 0,067 0,1315 2 (+) 0,0713 0,1758 5,2
Succinate 0,0845 0,0659 0,3 (-) 0,0791 0,0672 0,3
Amidon 0,8834 0,069 0,8 (-) 0,8614 0,603 0,7
Ribose 0,2715 0,3422 0,6 (-) 0,0915 0,21 0,5
Gélatine 0,0629 0,0743 0,3 (-) 0,0894 0,0767 0,2
Casamino 0,0837 0,0721 0,5 (-) Acide 0,0793 0,0821 0,2
Peptone 0,0824 0,0785 0,2 . (-) 0,0773 0,0592 0,3
H2/CO2 0,0627 0,112 3,4 (-) 0,071 0,109 2,8
1.4. Capacités à utiliser des acides gras à plus longue chaîne
L'étude de l'utilisation d'acides gras comme source de carbone et d'énergie a été entreprise pour les deux souches, la souche L-3 et la souche d'Archaeoglobus fulgidus DSM 4304, et ce avec des acides gras (AG) à plus longue chaîne (que formate AG en Cl3 acétate AG en C2, propionate AG en C3). Suivi du thiosulfate lors de la dégradation d'acides gras par A. fulgidus etpar L-3 A. fulgidus temps 0 (7/4/05) mM thiosulfate fin Mai 05 mM thiosulfate
E1 E2 E1 E2
-T+ (lactate) T+ (iactate) butyrate (5 mM) 12,51 Ac Gras en C4 * 9,29 valérate (5 mM) Ac Gras en C5 11 ,86 9,39 octanoate (2 mM) Ac Gras en C8 8,2 9,27 nonanoate (2 mM) Ac Gras en C9 7,65 10,52 palmitate (2 mM) 11 ,54 Ac Gras en C16 9,12 stéarate (2 mM) Ac Gras en C18 10,55 7,05
souche L-3 temps 0 (2/5/05) mM thiosulfate fin Mai 05 mM thiosulfate
E1 E2 E1 E2
T+ (lactate) T+ (lactate) butyrate 15,45 Ac Gras en C4 valérate13,95* Ac Gras en C5 octanoate Ac Gras en C8 9,56 et 9,33 nonanoate Ac Gras en C9 palmitate 15,52 Ac Gras en C16 stéarate14,64* Ac Gras en C18
* il reste environ la moitié du butyrate et présence de traces d'acétate (HPLC)
L'utilisation des acides gras testés de C4 à C18 permet une croissance de la souche de collection. En effet, la concentration en accepteur d'électrons (thiosulfate) diminue.
1.4. Cinétiques de croissance de la souche L-3 et d; 'Ar chaeoglobus fulgidus,
1.4.1. Suivi de la DO à 580 nm
II a déjà été montré que d'un point de vue phylogénétique, la souche L-3 et Archaeoglobus fulgidus (DSM 4304) montrent une similitude de 99% entre les séquences d'ADN codant pour l'ARN 16S correspondant. L'hybridation ADN / ADN a montré une homologie proche de 90 %. Donc, la souche L-3 appartient au genre Archaeoglobus et elle est proche de l'espèce A.fulgidus.
Le suivi de la croissance, d'Archaeoghbus fulgidus et de la souche L-3 , montre une courte phase de latence, suivie d'une phase exponentielle et d'une phase stationnaire. D'après les courbes , on constate une courte phase de latence correspondant à une restauration des fonctions physiologiques de ces deux souches, et une adaptation aux conditions du milieu de culture. Pour Archaeoglobus fulgidus et pour la souche L— 3, la phase de latence dure entre 1 à 2 jours. Concernant la phase exponentielle, elle dure presque 11 jours pour Archaeoglobus fulgidus, alors que pour la souche L-3, cette phase ne dure qu'une semaine.
Comparant les deux archéobactéries, et s' appuyant sur la croissance cellulaire (exprimée en DO à 580 nm), Archaeoglobus fulgidus montre une croissance cellulaire beaucoup plus importante que la souche L-3. Archaeoglobus fulgidus atteint 0,89 unité de DO contrairement à la souche L-3 qui n'atteint à peine 0,26 uDO. .Ceci peut s'expliquer par le fait qu: Archaeoglobus fulgidus se trouve dans les conditions optimums pour sa croissance, c'est-à- dire que le milieu de culture répond aux exigences nutritionnelles de cette Archaea, et non de L-3
Pour conclure, bien qu: Archaeoglobus fulgidus montre des valeurs de biomasse cellulaire beaucoup plus importante que la souche L-3.
1.4.2. Cinétique de dégradation du lactate pour la souche L-3 et Archaeoglobus fulgidus
Dans les manipulations précédentes, nous avons montré que le métabolisme de dégradation du lactate chez A. fulgidus est caractérisé par une formation de traces d'acétate. Par contre, pour la souche L-3, la minéralisation aboutit au CO2.
L'évolution de la concentration en lactate, pour les deux souches, a été suiviesur une durée avoisinant les 3 mois. La concentration en lactate chute rapidement pendant les 15 premiers jours traduisant une consommation efficace du lactate pendant la phase de croissance exponentielle. Par la suite la concentration en lactate continue de baisser mais plus lentement. Pour Archaeoglobus fulgidus, au bout de trois mois, la totalité du lactate est dégradé contrairement à la souche L-3. Ceci peut être expliqué par le fait que la souche L-3 peut présenter un métabolisme de dégradation du substrat différent de celui d' Archaeoglobus fulgidus.
II. Les hydrocarbures Lourds
Le comportement d' J Archaeoglobus fulgidus et de la souche L-3 a été étudié en présence d'hydrocarbures comme seule source de carbone et d'énergie.
Cette étude comporte deux grands volets, une étude qualitative des capacités de dégradation d'hydrocarbures par les deux Archaea, et une étude quantitative de l'éventuel dégradation d'hydrocarbures.
II.1. Etude qualitative
II.1.1. Criblage pour la dégradation d'hydrocarbures
L'étude des capacités de dégradation des hydrocarbures est une expérience qui nécessite une incubation particulièrement longue. Ainsi, elle a été réalisée dans des tubes Bellco fermés par des bouchons en caoutchouc épais.
Pour ces expériences, les tubes contenant 10 ml de milieu de culture sans substrat, sont inoculés à 10 %, puis l'hydrocarbure est introduit par injection à travers le bouchon.
Les hydrocarbures choisis sont des molécules modèles appartenant aux différentes classes d'hydrocarbures, à savoir :
- Fhexadécane (CH3(CH2)14CH3, C 16), un hydrocarbure aliphatique linéaire saturé ;
- l'hexadécène (CH3(CH2)13CHCH2, C16 :1), un hydrocarbure aliphatique linéaire insaturé d'origine biogène ;
- le dibenzothiophène (DBT, C12H8S), un hydrocarbure aromatique soufré.
Les hydrocarbures aliphatiques (C 16 ; C16 :l) sont additionnés, dans les tubes correspondants, à raison de 0,04 ml / 10 ml de milieu de culture. Les hydrocarbures aromatiques ( DBT) sont solubilisés dans le 2,2,4,4,6,8,8-heptaméthylnonane (HMN, C16H34) à raison de 20 mg / ml d'HMN, et 0.75ml de cette solution est injectée dans 10ml de milieu de culture.
Les hydrocarbures aromatiques ont été solubilisés dans l'heptaméthylnonane (HMN), un hydrocarbure aliphatique saturé ramifié, en raison de la toxicité de ces hydrocarbures aromatiques (Rabus ét al., 1993). 3 tubes ont été réalisés pour chaque essai et témoin. La croissance des souches a été suivie indirectement par la production de sulfure. Le tableau 1 présente les résultats de l'évolution des sulfures.
Pour les deux souches, la production de sulfure est rapide pour les témoins positifs où le substrat est le lactate ; en effet, en l'espace de 9 jours, la concentration en sulfure a au moins triplé. Les valeurs obtenues sont parfois instables en fonction du temps, ceci peut s'expliquer, d'une part par l'oxydation des sulfures produits suite à une introduction involontaire d'O2 au cours des prélèvements et d'autre part par la précision limitée de la méthode turbidimétrique de dosage du sulfure.
Pour une série de témoins négatifs constitués d'essais où aucun substrat n'a été ajouté (témoin sans substrat), la production de sulfure ne dépasse pas 0,8 mM sur l'ensemble de la durée de l'expérience, et ce, pour les deux souches. Ces témoins sans substrat permettent de quantifier le sulfure produit par la dégradation des traces de lactate provenant de Pinoculum et/ou par une éventuelle minéralisation de l'extrait de levure contenu dans le milieu de culture. Pour la seconde série de témoins, témoins où dans l'essai uniquement le solvant des hydrocarbures aromatiques, c'est-à-dire l'HMN a été introduit (témoin HMN), des productions de sulfure supérieures à celles des témoins précédents (témoins sans substrat) ont généralement été obtenues.
Concernant les essais réalisés en présence d'hydrocarbures aliphatiques (Essai Cl 6 ; Essai C16 :1) la production du sulfure s'avère très faible pour Palcane; en effet, celle-ci ne dépasse pas 0,8 mM, et ceci pour les deux souches. Au contraire pour l'akène (C16 :1), environ 3mM de sulfure sont produits.
Concernant les essais avec les hydrocarbures aromatiques polycycliques et en particulier le phénanthrène, la production de sulfure est très faible, ne dépassant pas 0,5 mM, et est même inférieure à celle des témoins sans substrat. Par contre, dans le cas du naphtalène, la production de sulfure est supérieure à celles produites dans les témoins sans substrat, dans les essais contenant le phénanthrène, et Phexadécane (C16). En revanche, en général, elle n'atteint pas celle du témoin contenant le solvant, l'HMN.
Concernant les essais contenant l'hydrocarbure aromatique soufré, le DBT, solubilisé dans l'HMN, il y a une production importante de sulfure par rapport aux autres essais renfermant les différents hydrocarbures aliphatiques linéaires ou aromatiques polycycliques, et ceci pour les deux souches. De plus, la production de sulfure dans les essais avec DBT est en général beaucoup plus importante que celle des témoins contenant l'HMN uniquement. A ce stade de l'expérience, se basant sur la production de sulfure par les deux souches, on écarte l'hypothèse d'une éventuelle dégradation des hydrocarbures aliphatiques linéaires saturés (C 16) , et de celle de l'hydrocarbure aromatique polycyclique, le phénanthrène. Par contre, dans le cas des alcènes, de PHMN, le solvant utilisé, du DBT, et du naphtalène, les résultats obtenus permettent d'émettre l'hypothèse d'une oxydation de ces hydrocarbures . Cette hypothèse fondée sur un dosage de sulfure reste à confirmer, dans un premier temps, par un repiquage de ces essais sur ces mêmes hydrocarbures.
Tableau 1. Suivi de la production de sulfure, selon la technique de Cord-Ruwish, pour les cultures d'Archaeoglobus fulgidus et de la souche L-3
A. fulgidus Souche L-3
DO 480 Oj 1Oj 45 j 6Oj 7Oj ΔS tf-ti Oj 1Oj 45 j 6Oj 7Oj ΔS tf-ti
Témoin Lactate 1 0,3 4 3,5 3,3 3,9 3,6 0,3 4,1 1,8 2,5 4,7 4,4 2 0,5 5,8 3,8 3 3,7 3,2 0,2 2,9 3,2 3,1 4,3 4,1 3 0,5 8,6 4,3 3,1 3,7 3,2 0,6 1,6 1,7 1,3 1,4 1,4
Essai C16 1 0,7 0,1 0,6 0,6 1 0,3 0,6 1,4 0,4 0,7 0,7 0,1
2 0,8 0,3 0,4 0,5 0,5 -0,3 0,5 0,8 0,9 0,8 1,3 0,8
3 0,9 0,1 1,3 1,2 0,8 -0,1 0,9 0,4 0,4 0,2 0,6 -0,3
Essai C16:1 1 0,8 2,8 3,6 ND ND 2,8 ND ND ND ND ND ND
2 0,6 2,1 3,6 ND ND 3,0 ND ND ND ND ND ND
3 0,8 1,2 4,3 ND ND 3,5 ND ND ND ND ND ND
Essai Naphtalène 1 0,8 0,4 0,8 0,7 1,3 0,5 0,8 0,4 0,9 0,6 U 0,9
2 0,8 0,6 1,1 1,2 1,7 0,9 0,6 0,3 1 0,5 1,3 0,7
3 0,8 0,8 1,4 0,7 1,3 0,5 0,8 0,6 0,8 0,5 1,1 0,3
Essai Phénanthrène 1 1,1 1,6 0,8 1,5 0,4 0,4 0,5 0,4 0,5 0,1
2 0,8 0,9 0,5 0,9 0,1 0,9 1 0,5 0,6 -0,3
3 1,4 0,6 0,5 0,6 -0,8 0,3 0,8 0,3 0,8 0,5
Essai DBT 1 0,4 0,6 1,1 1,1 1,4 1 0,1 1,3 1 0,6 0,9 0,8
2 0,3 0,8 1,3 1,7 3 2,7 0 0,2 1,2 0,7 1,2 1,2
3 0,5 0,7 1,3 1,5 2,2 1,7 -0,1 0,7 1,4 1,1 1,4 1,5
Témoin HMN 1 0,4 0,8 0,8 0,9 1,3 0,9 0 0,9 0,7 0,6 1 1
2 1,1 0,8 1,1 0,7 0,9 -0,2 0 0,2 0,9 0,8 1,4 1,4
3 0,3 1 1,1 1,3 1,2 0,9 -0,1 0,4 0,9 1,3 1,9 2
Témoin sans substrat 1 0,6 0,8 0,7 0,8 0,2 -0,1 0,5 0,4 0,7 0,8
2 0,4 1 0,8 1 0,6 -0,1 0,5 0,2 0,7 0,8
3 0,7 0,7 1,2 1,1 0,4 -0,1 0,7 0,2 0,7 0,8
II.1.2. Confirmation des résultats par repiquage
Un repiquage a été effectué à partir de l'expérience précédente sur naphtalène, DBT solubilisés comme précédemment dans l'HMN, et sur HMN seul, pour les deux souches étudiées. Les tubes constituant l'inoculum ont été sélectionnés parmi les 3 tubes de l'expérience précédente sur la base des critères suivants : un dosage de sulfure selon Cord- Ruwislx, une détermination de la biomasse cellulaire à 580 nm confirmée par un comptage cellulaire , et des observations microscopiques révélant l'état des cellules (tableau T).
Tableau 2. Choix de l'inoculum pour le repiquage
"++" : Cellules en très bon état ; isolées ou en pairs.
"+" : Cellules en bon état.
"-" : La majorité des cellules ont atteint le stade de la lyse. nd : non déterminé
Les tubes ayant les valeurs de sulfure d'hydrogène les plus élevées présentent également des cellules bactériennes en grand nombre et en bon état et ont donc été choisis (cellules du tableau surlignées correspondent aux tubes choisis pour le repiquage).
Les tableaux 3 et 4 présentent les résultats de l'évolution de la production de sulfure suite au repiquage.
Pour ce repiquage, outre les essais renfermant l'hydrocarbure (DBT, naphtalène (Naph), HMN), et ensemencés avec l'inoculum choisis précédemment, des témoins abiotiques (témoins négatifs) contenant le substrat (hydrocarbure) mais non inoculés ont été confectionnés dans le but de quantifier la production de sulfure qui pourrait être due à des réactions chimiques entre les différents constituants du milieu. Dans ces témoins il n'y a pas eu d'évolution dans la concentration de sulfure sur une durée de 20 jours (tableau 4). Tableau 3. Suivi de Ia production de sulfure, selon Ia technique de Cord-Ruwish, pour les cultures d'A.fulgidus et de la souche L-3, pour Ie repiquage
A. fulyidus L-3
DO 480 O j 8 j 22 j 45 j ΔS tf-ti O j 8 j 22 j 45 j ΔS tf-ti
Témoin (+) Lactatel 0,5 0,3 0,3 0,2 -0,3 0,2 4,8 4,7 3,9 3,7
2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,1 0,1 6,1 8 10,6 10,5
Essai Naph i 0,2 0,5 1 ,5 0,8 0,6 0,3 0,6 0,8 1 ,3 1
Naph 2 0,2 0,8 1 ,4 2,2 2 0,2 0,5 0,9 0,9 0,7
Naph 3 0,2 0,4 0,5 1 ,6 1 ,4 0,2 0,4 0,5 0,7 0,5
Essai DBT 1 0,2 1,3 2,1 3,2 3 0,3 0,6 1 ,1 2 1 ,7
DBT 2 0,2 1,1 1 ,9 3,3 3,1 0,2 0,6 1 1 ,1 0,9
DBT 3 0,1 1,2 1 ,9 3,3 3,2 0,3 0,4 0,8 1 0,7
Essai HMN 1 nd 0,6 1 ,2 2 1,4 0,3 0,6 1 1 ,5 1,2
HMN 2 nd 1 2 3,5 2,5 0,2 0,5 0,9 1 ,2 1
HMN 3 nd 0,7 0,8 2,2 1,5 0,2 0,4 0,6 0,7 0,5
Tableau 4. Suivi de la production de sulfure dans les témoins négatifs (sans inoculum) des repiquages présentés dans le tableau 3
DO 480 O j 2O j
Témoin (-) DBT 1 0,3 0,3 DBT 2 0,4 0,3
Témoin (-) HMN 1 0,5 0,4 HMN 2 0,5 0,5
Témoin (-) Naph i 0,5 0,2 Naph 2 0,4 0,2
Pour Archaeoglobus fulgidus, la croissance sur les différents hydrocarbures testés se confirme. En effet, la vitesse de production de sulfure est importante pour les essais
10 contenant les hydrocarbures, DBT, naphtalène et HMN . En l'espace de 45 jours, la valeur de sulfure mesurée dans les essais où le substrat est le DBT, a dépassé 3 mM (tableau 3), alors que dans l'étape de criblage des hydrocarbures, la valeur de sulfure pour ces même essais et sur la même durée de temps n'a pas dépassé 1 mM (ΔS 45 j5 tableau 1). Donc, la production de sulfure a triplé sur une même période (45 jours).
15 Concernant FHMN, qui lors de l'étape de criblage a été utilisé en tant que témoin, la production de sulfure au cours du repiquage a atteint 1,8 mM en moyenne, ainsi, par rapport à la première expérience, la production de sulfure a, en moyenne, triplé et même plus et elle est aussi, plus rapide. D'une manière générale, les productions de sulfure sont plus rapides lors du repiquage par
20 rapport à la première expérience. Ainsi, la souche semble s'adapter aux hydrocarbures comme source de carbone et d'énergie. Comparant les essais où le substrat est le DBT, solubilisé dans PHMN, par rapport aux essais contenant uniquement le solvant FHMN , la production de sulfure en présence de DBT est supérieure à celle obtenue en absence de DBT (Tableau 3).
• Ainsi, dans ces expériences, la production de sulfure semble être liée à la dégradation de l'HMN. De plus, la différence de production de sulfure entre les deux types d'essais précédents (essais avec HMN, essais avec DBT solubilisé dans l'HMN) laisse présager une dégradation du DBT.
Les hydrocarbures aliphatiques saturés et ramifiés ont été considérés longtemps comme des molécules récalcitrantes à la dégradation en absence d'oxygène. En effet, d'après la littérature, uniquement deux travaux démontrent la dégradation anaérobie du pristane, un hydrocarbure aliphatique linéaire saturé et ramifié tout comme l'HMN, en conditions de dénitrification (Bregnard et al., 1997 ) ou de méthanogenèse (Grossi et al., 2000). Les productions de sulfure en présence de naphtalène, solubilisé dans l'HMN3 étant plus faibles que celles obtenues avec l'HMN seul, la dégradation du naphtalène semble improbable. La suite du travail a été focalisée sur le DBT et l'HMN.
Pour la souche L-3, une production de sulfure sur DBT, naphtalène et HMN est également obtenue, cependant pour cette souche, le phénomène ne s'est pas accéléré suite au repiquage (tableau 1 et 3).
II.2. Etude quantitative de Ia dégradation d'hydrocarbures (DBT, HMN)
Des expériences ont été réalisées pour établir l'équation stœchiométrique de la dégradation des hydrocarbures dans le cas de la souche de collection uniquement. Ainsi, les concentrations en hydrocarbures ont été dosées aux temps initial et final, tout comme les concentrations en thiosulfate. De plus, l'augmentation de la biomasse a été suivie par l'augmentation de la population microbienne en se basant sur la méthode du nombre le plus probable (NPP).
De sorte à pouvoir quantifier avec précision les hydrocarbures, les bouchons de caoutchouc épais ont été recouverts d'un film de téflon, une matière inerte qui évite toute perte de l'hydrocarbure par absorption ou adsorption. Les hydrocarbures ont été ajoutés à raison de :
- pour le DBT : 10 mg de DBT dissout dans 0,5 ml d'HMN, 0.5 ml de cette solution sont additionnés aux essais ;
- pour l'HMN : 6 μl d'HMN / 10 ml de milieu de culture. Les essais préparés sont inoculés avec le repiquage précédent Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau.
Quelques résultats :
Après 7 semaines d'incubation :
Partie de l'expérience qui montre l'absence de croissance sur Extrait de Levure. Les productions de biomasse comme de sulfure sont liées à la présence des hydrocarbures.
Suite de l'expérience : pour le dosage des sulfures ont finalement été obtenus au bout de 75 jours :
T : 0,5 mM (essais 1.3) HMN : environ 6 mM (essai 2) DBT : environ 9,5 mM (essai 4)
II.3. Expériences complémentaires de la dégradation d'hydrocarbures (DBT, HMN)
Des expériences complémentaires de la dégradation d'hydrocarbures ont été réalisées, et ceci dans le but de caractériser cette dégradation.
Une première expérience a été réalisée avec A. fulgidus dans le but d'étudier l'effet du sulfate en tant qu'accepteur d'électrons à la place du thiosulfate utilisé précédemment. Dans les essais réalisés, en présence d'hydrocarbure (DBT, HMN) et de sulfate, il n'y a pas de croissance microbienne. Ceci explique qu'au fond des océans où le sulfate est abondant par rapport au thiosulfate qui lui est minoritaire, le phénomène de dégradation du DBT ou de PHMN ne peut pas se faire spontanément .
Une autre expérience a été réalisée dans le but de confirmer l'absence de capacité de dégradation d'hydrocarbures aliphatiques linéaires saturés et non ramifiés par A. fulgidus ; ainsi, des essais contenant le thiosulfate et un mélange d'hydrocarbures aliphatiques linéaires, undécane (CI l) et tétradécane (C14), et inoculés avec l'inoculum provenant du repiquage dont le substrat est l'HMN, ont été confectionnés. Le mélange d'hydrocarbures aliphatiques a été additionné dans les essais à raison de 4 μl de Cl 1 et 4 μl de C14 dans 10 ml de milieu de culture. Un dosage du thiosulfate a été réalisé au temps initial et au temps final.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d' archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles pour la mise en oeuvre d'un procédé de dégradation en conditions anaérobie d'hydrocarbures aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou non, ou d'hydrocarbures aromatiques, le cas échéant soufrés.
2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle les archéobactéries sont choisies parmi les espèces appartenant au genre Archaeoglobus, et notamment parmi les espèces suivantes : - Archaeoglobus fulgidus,
- Archaeoglobus profondus,
- Archaeoglobus veneficus.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les archéobactéries sont choisies parmi les Archaeoglobus fulgidus suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus DSM 4304,
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3), - Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4).
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle les hydrocarbures sont choisis parmi : les alcanes, et notamment les alcanes ramifiés dont la chaîne linéaire comporte de 5 à
20 atomes de carbone, notamment l'heptaméthylnonane (HMN) ou le prystane, les alcènes, et notamment les alcènes linéaires dont la chaîne comporte de 1 à 20, notamment de 1 à 16 atomes de carbone,
- les composés aromatiques et notamment le dibenzothiophène (DBT), le benzène, le toluène, le naphtalène ou le phénanthrène.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle le sulfate ou le thiosulfate est utilisé comme accepteur d'électrons, les hydrocarbures aliphatiques (saturés ou non, ramifiés ou linéaires) et aromatiques sont utilisés comme dormeur d'électrons, et la production de H2S en présence d'hydrocarbures est supérieure ou égale à environ 1 mM, et notamment à environ 4 mM.
6. Procédé de dégradation en conditions anaérobies d'hydrocarbures aliphatiques linéaires ou ramifiés, saturés ou non, ou d'hydrocarbures aromatiques, le cas échéant soufrés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdits hydrocarbures avec " des archéobactéries sulfato-réductrices thermophiles telles que définies ci-dessus, le cas échéant après addition dans le milieu réactionnel de sulfate ou de thiosulfate utilisé comme accepteur d'électrons, et desdits hydrocarbures utilisés comme donneurs d'électrons.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les archéobactéries sont choisies parmi les espèces appartenant au genre Archaeoglobus, et notamment parmi les espèces suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus,
- Archaeoglobus profondus,
- Archaeoglobus veneficus.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que les archéobactéries sont choisies parmi les Archaeoglobus fulgidus suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus DSM 4304,
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3), - Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4).
9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que les hydrocarbures sont choisis parmi : les alcanes, et notamment les alcanes ramifiés dont la chaîne linéaire comporte de 5 à 20 atomes de carbone, notamment Pheptaméthylnonane (HMN) ou le prystane,
- les alcènes, et notamment les alcènes linéaires dont la chaîne comporte de 1 à 20, notamment de 1 à 16 atomes de carbone,
- les composés aromatiques et notamment le dibenzothiophène (DBT), le benzène, le toluène, le naphtalène ou le phénanthrène .
10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que la production de H2S en présence d'hydrocarbures est supérieure ou égale à environ 1 mM, et notamment à environ 4 mM.
11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que la quantité caractérisé en ce que la quantité d' archéobactéries utilisée est d'environ 1 g/L (poids humide) pour environ 2 mM d'hydrocarbures.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que le temps de contact entre les archéobactéries et les hydrocarbures est d'environl5 jours.
13. Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de récupération des cellules, et le cas échéant de purification de lipides membranaires.
14. Archéobactéries choisies parmi les espèces appartenant au genre Àrchaeoglobus suivantes :
- Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3465 déposée le 22 juin 2005 (souche L3), - Archaeoglobus fulgidus CNCM 1-3469 déposée le 30 juin 2005 (souche L4).
Tableau 1. Suivi de la production de sulfure, selon la technique de Cord-Ruwish, pour les cultures d'Archaeoglobus fulgidus et de la souche L-3
A. fulgidus Souche L-3
DO 480 Oj 1Oj 45 j 6Oj 7Oj ΔS tf-ti Oj 1Oj 45 j 6Oj 7Oj ΔS tf-ti
Témoin Lactate 1 0,3 4 3,5 3,3 3,9 3,6 0,3 4,1 1,8 2,5 4,7 4,4 2 0,5 5,8 3,8 3 3,7 3,2 0,2 2,9 3,2 3,1 4,3 4,1 3 0,5 8,6 4,3 3,1 3,7 3,2 0,6 1,6 1,7 1,3 1,4 1,4
Essai C16 1 0,7 0,1 0,6 0,6 1 0,3 0,6 1,4 0,4 0,7 0,7 0,1
2 0,8 0,3 0,4 0,5 0,5 -0,3 0,5 0,8 0,9 0,8 1,3 0,8
3 0,9 0,1 1,3 1,2 0,8 -0,1 0,9 0,4 0,4 0,2 0,6 -0,3
Essai C16:1 1 0,8 2,8 3,6 ND ND 2,8 ND ND ND ND ND ND
2 0,6 2,1 3,6 ND ND 3,0 ND ND ND ND ND ND
3 0,8 1,2 4,3 ND ND 3,5 ND ND ND ND ND ND
Essai Naphtalène 1 0,8 0,4 0,8 0,7 1,3 0,5 0,8 0,4 0,9 0,6 U 0,9
2 0,8 0,6 1,1 1,2 1,7 0,9 0,6 0,3 1 0,5 1,3 0,7
3 0,8 0,8 1,4 0,7 1,3 0,5 0,8 0,6 0,8 0,5 1,1 0,3
Essai Phénanthrène 1 1,1 1,6 0,8 1,5 0,4 0,4 0,5 0,4 0,5 0,1
2 0,8 0,9 0,5 0,9 0,1 0,9 1 0,5 0,6 -0,3
3 1,4 0,6 0,5 0,6 -0,8 0,3 0,8 0,3 0,8 0,5
Essai DBT 1 0,4 0,6 1,1 1,1 1,4 1 0,1 1,3 1 0,6 0,9 0,8
2 0,3 0,8 1,3 1,7 3 2,7 0 0,2 1,2 0,7 1,2 1,2
3 0,5 0,7 1,3 1,5 2,2 1,7 -0,1 0,7 1,4 1,1 1,4 1,5
Témoin HMN 1 0,4 0,8 0,8 0,9 1,3 0,9 0 0,9 0,7 0,6 1 1
2 1,1 0,8 1,1 0,7 0,9 -0,2 0 0,2 0,9 0,8 1,4 1,4
3 0,3 1 1,1 1,3 1,2 0,9 -0,1 0,4 0,9 1,3 1,9 2
Témoin sans substrat 1 0,6 0,8 0,7 0,8 0,2 -0,1 0,5 0,4 0,7 0,8
2 0,4 1 0,8 1 0,6 -0,1 0,5 0,2 0,7 0,8
3 0,7 0,7 1,2 1,1 0,4 -0,1 0,7 0,2 0,7 0,8
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