EP1831397A1 - Verfahren zur bestimmung der funktion von nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten expressionsprodukten - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der funktion von nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten expressionsprodukten

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Publication number
EP1831397A1
EP1831397A1 EP05823073A EP05823073A EP1831397A1 EP 1831397 A1 EP1831397 A1 EP 1831397A1 EP 05823073 A EP05823073 A EP 05823073A EP 05823073 A EP05823073 A EP 05823073A EP 1831397 A1 EP1831397 A1 EP 1831397A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
host cell
rna
nucleic acid
cells
effects
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05823073A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ugur Sahin
Özlem TÜRECI
Carolin Bell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biontech SE
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universitaet Mainz filed Critical Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Publication of EP1831397A1 publication Critical patent/EP1831397A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters

Definitions

  • RNA interference RNA interference
  • RNAi RNA interference
  • 21 bp double-stranded RNA is introduced into cells that specifically interact with the target sequence. This activates a multiprotein complex that results in early degradation of transcribed mRNA before it can be translated (Hammond, SM et al., (2000) Nature 404, 293-296).
  • siRNA can be detected by activation of the interferon system, by induction of the double-stranded RNA-dependent protein kinase response (PKR) (Elbashir, SM et al., (2001) Nature 411 5 494-498, Caplen, NJ et al., (2001) Proc Acad., USA 98, 9742-9747) or by concentration-dependent stimulation or repression of non-targeted genes (Persengiev, SP et al. (2004) RNA 10, 12-18) also cause nonspecific effects.
  • PLR RNA-dependent protein kinase response
  • genes that are ectopically activated or overexpressed such as genes selectively expressed in tumors
  • transient transfectants as well as stably transfected cell clones can be produced.
  • the gene to be investigated can be introduced into cells by means of DNA plasmid constructs, but also by means of retro or adenoviral vectors. Furthermore, the expression of the introduced gene may be constitutive or controlled via a regulatable promoter. All forms of gene transfer used for this purpose have inherent disadvantages. Transient transfections with plasmids or viruses are very inefficient in most cell types (especially primary cells) and result in the transfection of variable subpopulation, which also does not allow a sufficiently accurate titration of the expression level.
  • the present invention relates to a method for the functional characterization of gene products, which is based on the transfer of in vitro transcribed, long-chain RNA.
  • Transfer of in vitro transcribed RNA into cells is an established method and is currently being tested particularly intensively in tumor immunology in order to introduce tumor antigens into antigen-presenting dendritic cells (DC) (Boczkowski, D. et al. (2000) Cancer Res. Heiser, A. et al., (2001) J. Immunol., 166, 2953-2960, Nair, SK et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16, 364-369).
  • DC antigen-presenting dendritic cells
  • the transfer of in vitro transcribed RNA has not been used for the systematic determination of gene function.
  • the invention generally relates to methods for the functional characterization of nucleic acids and / or expression products, in particular peptides and proteins.
  • the function of the examined nucleic acid and / or of the tested expression product may be completely unknown or one or more functions of the examined nucleic acid and / or of the tested expression product may be known, wherein the methods according to the invention in this embodiment aim at further Identify functions.
  • the invention relates to a method for assaying the effects of expression of a nucleic acid in a host cell, comprising the steps of: (a) introducing RNA derived from the nucleic acid into the host cell; and (b) examining effects on the host cell resulting from the introduction of the RNA into the host cell.
  • the methods according to the invention have particular advantages with respect to a short time expenditure, the possibility of an analysis of kinetics and an applicability in almost all cell systems.
  • introduction of the nucleic acid to be examined, e.g. a gene, in the form of RNA over the use of DNA constructs has the advantage that RNA for expression does not have to enter the cell nucleus, but only into the cytoplasm of the cells. Therefore, the RNA transfer is independent of the division activity of the cells to be transfected.
  • the transfection rates achievable with RNA are relatively high (Van Tendeloo, VF et al., (2001) Blood 98, 49-56, Saeboe-Larssen, S. et al., (2002) J.
  • RNA into cells is, according to the invention, ideal for a subsequent functional characterization on the basis of the following examples based on characteristics:
  • RNA transfer allows the introduction of gene products into all investigated eukaryotic cell types, including tumor cells and non-transformed primary cells (see Table 1)
  • RNA transfection shows little inherent changes in transfected cells with respect to their transcriptome.
  • the methods according to the invention are particularly suitable for simulating an ectopic expression of transcription factors, oncogenes or potential oncogenes in cells and cell lines and thus for a functional characterization of such genes.
  • the RNA introduced into the host cells is derived from an oncogene or potential oncogene.
  • the RNA to be introduced into a host cell is obtained by cloning the nucleic acid coding therefor and transcribing the cloned nucleic acid, preferably by in vitro transcription.
  • the promoter for transcriptional control may be any promoter for an RNA polymerase.
  • Specific examples of RNA polymerases are the Tl, T3 and SP6 RNA polymerases.
  • the in vitro transcription is controlled according to the invention by a T7 or SP6 promoter.
  • the RNA encoding nucleic acid is in association with a polyadenyl cassette.
  • the RNA obtained by expression of the nucleic acid, preferably by in vitro transcription preferably has a polyadenylation of a defined length.
  • the poly A strand has a length of 10 to 500, more preferably 30 to 300, even more preferably 65 to 200 and especially 100 to 150 adenosine residues. In a particularly preferred embodiment, the poly A strand has a length of about 120 adenosine residues.
  • the RNA to be introduced into a host cell has at its 5 'end a cap structure or a regulatory sequence which promotes translation in the host cell.
  • introducing the RNA into the host cell causes expression of the expression product encoded by the RNA.
  • the expression product may be selected from the group consisting of peptides, proteins, enzymes, antibodies and antigens.
  • RNA introduced into a host cell it is possible for functional studies to control the amount of RNA introduced into a host cell and thus the amount of expression product expressed in the host cell.
  • the RNA that is introduced into a host cell according to the invention is part of an RNA library.
  • the invention in this aspect also relates to a method for screening a group of different nucleic acids or variants of a nucleic acid (Def .: RNA library) for the appearance of RNA which, when introduced into a host cell, is capable of having a specific effect on the host cell or to control or influence a particular function of the host cell.
  • a nucleic acid Def .: RNA library
  • the invention relates to a method of finding a nucleic acid and / or a nucleic acid expression product having a particular effect / function, comprising the steps of: (a) introducing RNA into a host cell; (b) investigating effects on the host cell resulting from the introduction of the RNA into the host cell; and (c) identifying the RNA that causes the effects on the host cell.
  • This method may also include determining the nucleotide sequence of the RNA which causes the effects on the host cell. Such a determination of the nucleotide sequence can be carried out in a manner known per se, in particular by sequencing the original nucleic acid.
  • the methods of the invention include assaying and identifying effects on a host cell that result from introducing RNA into the host cell and optionally expressing the RNA in the host cell.
  • RNA into a host cell can have effects on this host cell. Accordingly there are various methods by which effects resulting from the introduction of RNA into a host cell can be investigated in the methods of the invention. Such methods include, but are not limited to, the determination of one or more of the following parameters: cell proliferation, cell death, cell migration, cell adhesion, altered resistance or altered sensitivity to drugs, aging of cells, production or inhibition of production of particular molecules, mRNA levels, protein expression levels , Protein activity levels, effects on protein phosphorylation, effects on protein or nucleic acid processing, effects on RNA stability, effects on signal transduction or second messengers.
  • the study of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell involves an examination of phenotypic and / or biochemical characteristics of the host cell.
  • the study of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell involves an investigation of the metabolism of the host cell.
  • an examination of the metabolism comprises an investigation of the accumulation of substrates or products from enzymatic reactions according to known methods.
  • Subtractive hybridization can be used to determine if the introduction of RNA into a host cell has an effect on the RNA expression profile of the host cell. For example, in this embodiment, RNA present in control cells is "subtracted" from RNA expressed by host cells into which RNA of interest has been introduced.
  • the study of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell involves a complementation analysis.
  • the function of a gene endogenously present in the host cell is replaced or enhanced by introducing RNA of interest into the host cell.
  • the study of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell involves an examination of phenotypic traits of the host cell, e.g. by methods involving a morphological, macroscopic or microscopic examination.
  • the host cells may also be exposed to further treatment or alteration of conditions prior to investigation of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell. Thus, in one embodiment, effects on cellular factors are temporarily examined.
  • the host cells may also be incorporated into an in vivo context, particularly an organism, to further determine a function of a nucleic acid and / or a nuclear acid expression product.
  • RNA of interest The study of effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell allows one or more functions to be identified which has a nucleic acid and / or an expression product in an organism from which said nucleic acid and / or the expression product is derived.
  • the methods of the invention also allow the identification of one or more cellular factors that are functionally related to the nucleic acid of interest and / or the expression product of interest. Such a group of cellular factors would exhibit increased expression upon introduction of the RNA of interest into a host cell. Another such group of cellular factors would have reduced expression upon introduction of the RNA of interest into a host cell.
  • the invention also provides means for identifying functional relationships between cellular factors and nucleic acids of interest and / or expression products.
  • the host cell be derived from the same organism as the nucleic acid under investigation and / or the expression product to be tested, i. the nucleic acid to be examined and / or the expression product to be examined is homologous to the host cell.
  • the nucleic acid to be examined and / or the expression product to be examined is heterologous to the host cell.
  • the nucleic acid of interest and / or the expression product of interest is at least initially assayed in a host cell known to naturally express the nucleic acid and / or the expression product.
  • heterologous nucleic acids and / or expression products in host cells, particularly mammalian cells. For example, it may be determined whether a particular sequence, e.g. from a fungus capable of acting as a substitution product for a mammalian sequence. If this is the case, the heterologous sequence can be used, for example, as a therapeutic substitution product for the mammalian sequence.
  • nucleic acid and / or an expression product may be desirable to test derivatives of a nucleic acid and / or an expression product for one or more functions in the methods of the invention. This makes it possible to alter a particular nucleic acid and / or a specific expression product and to test whether the modified nucleic acid and / or the altered expression product have one or more effects and / or functions of the original nucleic acid and / or of the original one Maintains expression product. In many cases, it may be desirable to produce derivatives of a nucleic acid and / or an expression product that retain one or more effects and / or functions of the original nucleic acid and / or the original expression product while having one or more effects and / or functions of the original Nucleic acid and / or the original expression product do not have.
  • high-throughput systems are used for carrying out the processes according to the invention.
  • the system may be computerized or robotically implemented as appropriate, and may also include the use of a plurality of compartments.
  • the compartments are arranged in a multiwell plate and the RNA and the host cells are preferably arranged in a plurality of compartments.
  • Effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell can be assayed by microarray methods and arrangements that are known.
  • transfection relates to the introduction of one or more nucleic acids into an organism or into a cell or cells derived therefrom.
  • the term "host cell” refers to any cell which is transformable or transfectable with an exogenous nucleic acid, in particular RNA.A nucleic acid can be present in the host cell in a single or multiple copies and is expressed in one embodiment in the host cell.
  • the term "host cells” encompasses prokaryotic and eukaryotic cells, in particular human and animal cells, plant cells and cells of microorganisms
  • Particularly preferred host cells used according to the invention are eukaryotic cells, in particular mammalian cells such as human, mouse, hamster, pig, goat and primate cells.
  • the cells can be derived from a variety of tissue types and include primary cells and cell lines.
  • Preferred host cells are those of human tissues, including, but not limited to, neuronal cells, brain cells, epithelial cells, connective tissue cells (such as fibroblasts and osteoblasts), blood cells (such as leukocytes, lymphocytes, monocytes and neutrophils, particularly dendritic cells, platelets), sensory cells, muscle cells , Lung cells, heart cells, liver cells, skin cells, pancreatic cells, breast cells, kidney cells, intestinal cells, gastric cells, colon cells, prostate cells, ovarian cells, germ cells and stem cells, which have the ability to differentiate into different cell types.
  • connective tissue cells such as fibroblasts and osteoblasts
  • blood cells such as leukocytes, lymphocytes, monocytes and neutrophils, particularly dendritic cells, platelets
  • sensory cells such as leukocytes, lymphocytes, monocytes and neutrophils, particularly dendritic cells, platelets
  • muscle cells Lung cells
  • heart cells liver cells
  • skin cells pancreatic cells
  • intestinal cells gastric cells
  • Cultivated cell lines can also be used.
  • partially or completely differentiated cells are used, for example, if it is known that the nucleic acid of interest and / or the expression product of interest is normally expressed only in these cells.
  • the term "effects on a host cell resulting from the introduction of RNA into the host cell” encompasses any perceptible effects on a host cell which are attributable to the introduction of the RNA into the host cell, in particular effects on growth, development, the proliferation, heredity, biochemistry and / or phenotype of the host cell.
  • phenotype or "phenotypic trait” refers to the appearance of an organism or a host cell.
  • the phenotype excludes all internal and external Structures and functions.
  • the phenotype of an organism and the cells derived from it can change.
  • the external characteristics of an organism and the cells derived from it are determined by its genetic information (genotype), the phenotype depends on which genes are actually expressed (expression).
  • the term "function of a nucleic acid and / or a nucleic acid expression product in an organism or the cells derived therefrom" relates to the functional role that the nucleic acid and / or the nucleic acid expression product in an organism or in cells derived therefrom, preferably in the organism or In one embodiment, the term refers to the functional role of a nucleic acid and / or a nucleic acid expression product in carcinogenesis the effects that result in expression or lack of expression of the nucleic acid in the organism or in the cells derived therefrom.
  • Nucleic acid expression product may according to the invention mean that the nucleic acid and / or the nucleic acid expression product has only one or more functions, in the latter case one or more functions being investigated by the methods according to the invention.
  • nucleic acid relates to a particular nucleic acid sequence which is responsible for the production of one or more cellular products and / or for the achievement of one or more intercellular or intracellular functions, in particular the term refers to a DNA segment which is specific for a specific protein or encodes a functional or structural RNA molecule.
  • a nucleic acid according to the invention preferably ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA), which can be used for the production of RNA.
  • Nucleic acids according to the invention comprise genomic DNA, cDNA, mRNA, recombinantly produced and chemically synthesized molecules. According to the invention, a nucleic acid can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently circular closed molecule.
  • a nucleic acid in particular RNA, is derived according to the invention from another nucleic acid, if there is a certain degree of homology between the nucleic acids, i. the nucleic acids have significant direct or complementary matches in the sequence of their nucleotides.
  • a nucleic acid is further derived from another nucleic acid even if the former nucleic acid is a derivative of the second nucleic acid.
  • RNA derived from a nucleic acid means, in particular, that the RNA is a transcription product of the nucleic acid or of a nucleic acid derived therefrom and / or has a sequence which results in a translation in a protein expression product having the same sequence as a protein expression product that results from transcription and translation of the nucleic acid from which the RNA is derived.
  • derivatives of a nucleic acid is meant according to the invention that single or multiple nucleotide substitutions, deletions and / or additions are present in the nucleic acid Furthermore, the term “derivative” also includes a chemical derivatization of a nucleic acid on a nucleotide base, the sugar or the phosphate , The term “derivative” also includes nucleic acids containing non-naturally occurring nucleotides and nucleotide analogs.
  • One nucleic acid is "complementary" to another nucleic acid if the two sequences can hybridize to each other and form a stable duplex, preferably hybridizing under conditions allowing specific hybridization between polynucleotides (stringent conditions)
  • stringent conditions Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., 5 Eds., 2nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Eds. See, for example, hybridization at 65 ° C.
  • hybridization buffer 3.5 ⁇ SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin, 2, Wiley & Sons, Inc.
  • 5 mM NaH 2 PO 4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) SSC is 0.15 M sodium chloride / 0.15 M sodium citrate, pH 7.
  • the membrane to which the DNA has been transferred becomes e.g. in 2 x SSC at room temperature and then in 0.1 - 0.5 x SSC / 0.1 x SDS at temperatures up to 68 0 C washed.
  • Complementary nucleic acids according to the invention have at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98% or at least 99% identity of the nucleotides.
  • Expression control sequences or regulatory sequences which are functionally linked to a nucleic acid according to the invention may be homologous or heterologous with respect to the nucleic acid.
  • a coding sequence and a regulatory sequence are then "operably linked" if covalently linked such that the transcription or translation of the coding sequence is under the control or under the influence of the regulatory sequence Protein is to be translated, results in a functional connection of a regulatory sequence with the coding sequence, an induction of the regulatory sequence to a transcription of the coding sequence, without causing a frame shift in the coding sequence or an inability of the coding sequence, in the desired protein or peptide to be translated.
  • expression control sequence or “regulatory sequence” according to the invention comprises promoters, ribosome binding sequences and other control elements, which control the transcription of the gene or the translation of the derived RNA.
  • the expression control sequences are regulatable.
  • the precise structure of regulatory sequences may vary species-dependent or cell-type dependent, but generally includes 5 'non-transcribed and 5' and 3 'untranslated sequences involved in the initiation of transcription, such as TATA box, Capping sequence, CAAT sequence and the like.
  • 5 'untranscribed regulatory sequences include a promoter region that includes a promoter sequence for transcriptional control of the functionally linked gene. Regulatory sequences may also include enhancer sequences or upstream activator sequences.
  • a nucleic acid may be present in association with another nucleic acid encoding a polypeptide that directs a protein or polypeptide encoded by the nucleic acid to a particular target site.
  • a nucleic acid can be present in association with another nucleic acid which codes for a polypeptide which brings about a translocation or stabilization of the encoded protein or polypeptide on the cell membrane of the host cell or its compartmentalization into specific organelles of this cell.
  • a cloned nucleic acid according to the invention is present in a vector, wherein the vector optionally comprises a promoter which controls the expression of the nucleic acid.
  • the term "vector” is used in its most general meaning and encompasses any intermediary vehicle for a nucleic acid which, for example, makes it possible to introduce the nucleic acid into prokaryotic and / or eukaryotic cells and, if appropriate, to integrate it into a genome
  • An intermediate vehicle may be adapted for use in, for example, electroporation, microprojectile bombardment, liposomal delivery, Agrobacterium transfer, or insertion via DNA or RNA viruses
  • Vectors include plasmids , Phagemids or viral genomes.
  • RNA can be prepared according to the invention by in vitro transcription of a corresponding DNA template. It can also be modified by stabilizing sequences, capping and polyadenylation.
  • expression is used according to the invention in its most general meaning and includes the production of RNA or of RNA and proteins / polypeptides It also includes a partial expression of nucleic acids Furthermore, the expression can be transient or stable the term "expression” in particular the production of proteins / polypeptides.
  • “Derivatives” of an expression product include amino acid insertion variants, amino acid deletion variants and / or amino acid substitution variants.
  • Amino acid insertion variants include amino- and / or carboxy-terminal fusions, as well as insertions of single or multiple amino acids in a particular amino acid sequence.
  • amino acid sequence variants with an insertion one or more amino acid residues are introduced into a predetermined site in an amino acid sequence, although random insertion with appropriate screening of the resulting product is also possible.
  • Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence.
  • Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. Preferably, the modifications are at positions in the amino acid sequence that are not conserved between homologous proteins or polypeptides.
  • amino acids are replaced by others with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, side chain volume, and the like (conservative substitution).
  • conservative substitutions refer to the replacement of one amino acid with another, listed below in the same group as the substituted amino acid:
  • amino acid variants described above can be readily prepared by recombinant DNA manipulation. Techniques for introducing substitution mutations at predetermined sites into DNA having a known or partially known sequence are well known and include e.g. M13 mutagenesis. The manipulation of DNA sequences to produce proteins with substitutions, insertions or deletions is e.g. in Sambrook et. al. (1989).
  • “Derivatives” of proteins or polypeptides according to the invention also encompass single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules associated with the protein or polypeptide, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or polypeptides "also to all functional chemical equivalents of proteins or polypeptides.
  • a part or fragment of an expression product according to the invention preferably has a functional property of the expression product from which it is derived.
  • Such functional properties include interaction with antibodies, interaction with other polypeptides or proteins, selective binding of nucleic acids, and enzymatic activity.
  • a part or a fragment of a nucleic acid according to the invention preferably relates to a part of the nucleic acid which codes for a part or a fragment of an expression product as defined above.
  • nucleic acids can be used to introduce nucleic acids into cells according to the invention. Such methods include transfection of nucleic acid-CaPO 4 precipitates, transfection of nucleic acids associated with DEAE, transfection or infection with viruses carrying the nucleic acids of interest, Electroporation, liposome-mediated transfection and the like.
  • control of the nucleic acid to particular cells is preferred.
  • a carrier used to deliver a nucleic acid to a cell may have a bound targeting molecule.
  • a molecule such as an antibody specific for a surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell can be incorporated into or bound to the nucleic acid carrier.
  • proteins that bind to a surface membrane protein associated with endocytosis may be incorporated into the liposome formulation to facilitate targeting and / or uptake.
  • proteins include capsid proteins or fragments thereof that are specific for a particular cell type, antibodies to proteins that are internalized, proteins that target an intracellular site, and the like.
  • microarray refers to a template which is used to apply and bind biological material, such as nucleic acids, peptides or proteins, in high density and microarrays consist of or contain a solid carrier which allows large amounts of samples to be regulated Apply intervals so that they can be used for parallel experiments.
  • high density is used according to the invention in connection with arrays which have a high density of different samples, such as nucleic acid samples, and can thus answer a large number of questions.
  • the present invention will be described in detail by the following figures and examples, which are given by way of illustration only and not by way of limitation. On the basis of the description and the examples, further embodiments are available to the person skilled in the art which are likewise encompassed according to the invention.
  • Fig. 1 Representation of the eGFP vectors used - a. ⁇ GEM3Z eGFP tail and b. pSTI eGFP tail. These vectors were used as starting vectors for the further cloning.
  • Fig. 2 Western blot to demonstrate translation of eGFP IVT RNA 24h after transfection into 786-0 cells.
  • 20 ⁇ g of eGFP-pGEM3Z tail IVT RNA at 200V and 250 ⁇ F were transfected.
  • the primary antibody used was rabbit anti-GFP at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • Goat anti-rabbit HRP at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml was used as the secondary antibody.
  • the load control used was a mouse anti-ERK2 antibody at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml.
  • Goat anti-mouse HRP 1 5000 was diluted as a secondary antibody here.
  • Fig. 3 Representation of the FACS dot blot 24h after transfection of 1x10 7 786-0 cells with 20 ⁇ g eGFP IVT RNA, or after control transfection without RNA.
  • Fig. 6 Determination of the influence of time on the amount of transcript and protein after transfection of 2 ⁇ 10 7 786-0 cells with 20 ⁇ g eGFP IVT RNA or 2dGFP IVT RNA.
  • a. Determination of the relative amount of transcript using a quantitative RT-PCR analysis. Normalization was against non-transfected cells. To account for different cDNA qualities, an 18s-specific PCR was performed and the Values used for normalization
  • b Determination of the mean fluorescence intensity of eGFP using the FACS caliber.
  • Fig. 7 Determination of the influence of the amount of RNA on the eGFP protein level 24 h after transfection of 5x10 6 MCF-7 cells with eGFP IVT RNA. a. Representation of the measurement of the fluorescence intensity in the histogram blot compared to a non-transfected control, b. Representation of the mean fluorescence intensities.
  • Fig. 9 Relative transcript levels of VEGF and LDHA after transfection of 2x10 7 786-0 cells with 20 ⁇ g VHL IVT RNA over time. The relative transcript levels were determined in comparison to untransfected cells. Normalization was via 18s rRNA.
  • Fig. 10 Representation of the relative transcript levels after transfection of 1x10 7 MCF-7 cells with SYT, SSX2, SYT-SSXl 5 SYT-SSX2 or eGFP IVT RNA as control. Normalization was via HPRT. The relative transcript levels were determined in comparison to the cells transfected with eGFP IVT RNA.
  • Fig. 11 Illustration of the relative transcript levels of BMP7, EPHA4 and COL5A1 in synovial sarcomas compared to normal tissues from breast, lung, kidney, ovary, testis, liver, lymph nodes, thymus, spleen and adrenal gland. Normalization was via HPRT. The sarcoma tested assayed the expression of BMP-7 and COL5A1 as an osteosarcoma, while EPHA4 tested a synovial sarcoma that was not positive for SYT-SSX1 or SYT-SSX2. The pathological diagnosis is questionable due to the lack of translocation.
  • Fig. 12 Compilation of the genes that can be grouped by function, by transfection of MCF-7 cells with SSX2, SYT-SSXl or SYT-SSX2 compared to a control transfection with eGFP by at least a factor of 2 1 differentially are expressed at a significance criterion of 5%.
  • the values not specified are in the non-significant regulatory range, ie ⁇ 2 *.
  • the values given in the table are each the exponents for base two; the resulting number expresses the factor of differential expression.
  • Fig. 13 Representation of relative transcript levels in comparison to eGFP-transfected cells determined by Real-Time RT-PCR. Normalization was via HPRT. The standard deviation between the biological triplicates is given
  • the vectors were produced by cloning the respective coding sequence into the vector pGEM3Z (Invitrogen, San Diego, CA) or into the vector pCMV Script (Stratagene, Amsterdam, NL) as basis vectors.
  • the vector pGEM3Z has an SP6 promoter in front of the start codon, from which in vitro transcription is possible.
  • the vector pCMV Script contains at the same place a T7 promoter.
  • vector pGEM3Z a poly A strand of 120 bases was introduced via the Xhol interface. Directly behind the poly A strand, a restriction site was introduced that allowed linearization. This vector is referred to below as vector pGEM3Z Tail ( Figure Ia).
  • vector pCMV Script a poly A strand of 120 base pairs was introduced after the Sacl site. This vector is referred to below as vector pSTI Tail ( Figure Ib).
  • eGFP and the amplified from the respective tissues genes were ligated after purification and restriction with the respective vectors, and transformed into E. coli MRFL ".
  • the plasmids obtained were sequenced and analyzed the sequence.
  • the first step in the preparation of IVT RNA was the linearization of the respective plasmids.
  • the restriction enzymes Bpil were used for the vector pGEM3Z Tail and SapI used for the vector pSTI tail. Both cut only once in the vector, behind the inserted tail.
  • the enzyme was inactivated by phenol-chloroform precipitation and removed. For this purpose, an isovolume of a mixture of phenol and chloroform was added to the restriction mixture and mixed thoroughly. By brief centrifugation at 10,000 xg, the separation was carried out in a lower organic phase and in an upper aqueous phase containing the DNA. The latter was transferred to a new reaction vessel.
  • the aqueous phase was mixed with an iso-volume of pure chloroform to separate any residual phenol. After centrifugation, the aqueous phase was removed and precipitated by addition of two isovolumen of ethanol and 10% v / v 3M sodium acetate pH 4.5 at -20 ° C for 2 h.
  • the DNA was sedimented by centrifugation for 45 min at 10,000 x g at 4 ° C, washed with 70% ethanol to remove salts and taken up in a suitable volume of RNAse-free water. The successful and complete linearization was tested by gel electrophoresis. The concentration of DNA was determined photometrically at 260nm. To determine the purity of the DNA, the optical density at 280nm was also measured to give the OD260 / 280 quotient.
  • 10 ⁇ g of linearized DNA were used for in vitro transcription.
  • 40 ⁇ l of dNTPs, with 4/5 of the dGTP additionally provided with a cap structure, 10 ⁇ l of lOx buffer, 20 ⁇ l of DTT and 10 ⁇ l of T7 or SP6 polymerase were incubated for 2 h at 37 ° C.
  • the polymerases bind to their T7 or SP6 recognition sequences, which are 5 'of the ORF to be transcribed and synthesize the complementary RNA strand.
  • the IVT RNA was purified with the MegaClear kit. For this purpose, it was taken up in a binding buffer concentrate containing the necessary salts for optimal binding of the RNA to the silica membrane. The addition of ethanol removes water from the hydration shell of the RNA. The mixture was loaded on a silica column and centrifuged at 10,000 xg for 2 min. Here, the RNA bound to the column while impurities such as enzyme residues were washed out. After several washes, the purified RNA was eluted. The elution buffer was preheated to 95 ° C to allow more efficient elution. Quality control and quantification were carried out both by gel electrophoresis and photometry.
  • V ra is the transmembrane potential and f is a form factor that describes the influence of the cell on the extracellular field distribution.
  • fE ex describes the applied electric field, r the radius of the cell and ⁇ the angle to the externally applied electric field.
  • the factor f is often given as 1.5, but depends on many other factors.
  • the electroporation of the cells is successful when the applied electric field exceeds the capacity of the cell membrane, ie ⁇ V m is greater than a threshold ⁇ V S indicated by IV (Kinosita, K., Jr. and Tsong, TY (1977) Nature 268, 438-441). Since the construction of the cell membrane as a bilayer is a common feature of eukaryotic cells, this value varies little for different cell lines.
  • the bielectric breakdown of the transmembrane potential transiently forms hydrophilic pores through which water enters the cell, which molecules such as e.g. Biol 55, 3-28, Neumann, E. et al., (1999) Bioelectrochem., Bioenerg., 48, 3-16).
  • the adherent cells used Prior to electroporation, the adherent cells used were cultured to semi-confluency, washed with PBS, and detached from the cell culture flasks with trypsin. The cells were transferred to medium containing 10% FCS (fetal calf serum) and centrifuged at 500 xg for 8 min. The pellet was resuspended in serum-free medium X-Vivo and again centrifuged at 500 xg for 8 min. This washing process took place two more times to remove residues of FCS that would interfere with subsequent electroporation.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were adjusted to the desired cell density in 250 ⁇ l, transferred to the electroporation cuvettes and placed on ice. After adding the appropriate amount of in vitro transcribed RNA with thorough mixing, electroporation was performed at 200V and 250 ⁇ F. Subsequently, the cells were immediately transferred to the appropriate Nährrnedium and incubated at 37 0 C and 5% CO 2 .
  • Example 4 Establishment of experimental conditions and characterization of the experimental system
  • the expression vector eGFP-pGEM3Z Tail was used to establish the experimental conditions.
  • the 5 'RNA polymerase promoter SP6 allows in vitro expression of RNA.
  • the in vitro transcribed eGFP RNA was subsequently used to test the transfection efficiency of various cell types.
  • the determination of the transfection efficiency was carried out with the aid of the FACS caliber by determining the fluorescence intensity of the eFGP.
  • the determination of the amount of RNA in the cells was carried out by means of a quantitative RT-PCR. It could be shown that not only tumor cell lines with an efficiency of> 90%, but also primary dendritic cells can be transfected with an efficiency of 70-80% ( Figures 2 and 3 and Tab. 1).
  • Tab. 1 Transfection efficiencies of various cells determined after transfection of 5x10 cells with 20 ⁇ g eGFP IVT RNA. Measurement of the fluorescence intensity with the aid of the FACS caliber 24 h after transfection. Transfection conditions: electroporation at 200V and 250 ⁇ F In addition, it was possible to rule out an influence of the cell count on the transfection efficiency in a range between 2 ⁇ 10 6 - 2 ⁇ 10 7 cells (FIG. 4). Electroporation conditions also have no significant effect on transfection efficiency in the area tested ( Figure 5).
  • the methodological molecular changes were determined using a cDNA microarray. It was only after 8h and 24h molecular changes of proteasome-associated genes, heat-shock genes and apoptosis-associated genes are found (Table 2).
  • Table 2 Number of significantly regulated genes in 2x10 786-0 cells transfected with 20 ⁇ g eGFP IVT RNA compared to untransfected control cells. Only a regulation of> 2 or ⁇ 0.5 are significant changes.
  • IVT RNA To further explore the possibilities and limitations of transfecting cells with IVT RNA, several model genes were introduced into cells as heterologously expressed IVT RNA.
  • the coding region of these genes was amplified with the aid of cDNA from testis tissue and cloned into the vector system described for eGFP.
  • HIF 1- ⁇ and VHL diverse target genes are described whose expression was determined after transfection of a deficient cell line.
  • an increased expression of the target genes LDHA (lactate dehydrogenase A), VEGF (vascular endothelial growth factor 1 alpha) and Glut-1 (glucose transporter 1) was detected ( Figure 8).
  • the extent of their induction can be titrated by the amount of transferred HIF 1- ⁇ IVT RNA.
  • LDHA lactate dehydrogenase A
  • VEGF vascular endothelial growth factor 1 alpha
  • Glut-1 glucose transporter 1
  • HIFI binds directly to its consensus sequence in the promoter region of its target genes (Semenza, GX (2000) Genes Dev 14, 1983-1991, Semenza, GL (2000) J. Appl. Physiol 88, 1474-1480) and immediately initiates its transcription .
  • the pVHL von Hippel-Lindau protein upstream of HIF 1- ⁇ was selected as the second model gene.
  • pVHL belongs to the complex of ubiquitin ligase E3 and causes the degradation of the alpha subunit of HIFI.
  • Example 6 Identification of hitherto unknown functions for putative oncogenic transcripts using the example of SYT-SSX1 and SYT-SSX2.
  • RNA transfer should allow a rapid decoding of the tumor biological relevance of genes.
  • the fusion products of the SYT 5 genes were selected from a ubiquitously expressed gene, and SSX1 or SSX2, CG genes expressed only in testis and in tumors.
  • the reason for choosing this Genes on the one hand were the frequency of translocation t (X; 18) (pI 1.2; ql 1.2) (Clark, J. et al. (1994) Nat. Genet. 7, 502-508; Crew, AJ (1995 EMBO J. 14, 2333-2340) in over 90% of synovial sarcomas (Sreekantaiah, C. et al. (1994) Am. J.
  • the regulated genes that could be detected after transfection included, in particular, growth factors, neuronal genes, oncogenes or tumor-associated genes, but also those that play a role in cell cycle regulation or signal transduction (Figure 12).
  • the differential expression of some of these genes was verified by quantitative RT-PCR ( Figure 13, Figure 10). To demonstrate the functional relevance of these genes in synovial sarcomas, their expression was additionally determined in synovial sarcomas compared to normal tissues ( Figure 11).
  • SYT-SSX1 and SYT-S SX2 clearly demonstrated that the importance of a gene in carcinogenesis can be determined by RNA transfer and the subsequent determination of the molecular changes using Affymetrix oligonucleotide microarrays determine.
  • Direct and indirect target genes of the transfected gene are identified and contribute to an understanding of the function of the gene.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Untersuchung und Bestimmung der Funktion von Nukleinsäuresequenzen und Nukleinsäureexpressionsprodukten durch Einbringen von RNA in Wirtszellen.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Funktion von Nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten Expressionsprodukten
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Untersuchung und Bestimmung der Funktion von Nukleinsäuresequenzen und Nukleinsäureexpressionsprodukten durch Einbringen von RNA in Wirtszellen.
Hintergrund der Erfindung
Mit der Fertigstellung des ersten Entwurfs der Sequenzierung des humanen Genoms besteht die nächste Herausforderung darin, von der deskriptiven Genomforschung in die funktionelle Genforschung voranzuschreiten (Fields, S. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 96, 8825-8826).
Für das gezielte Ausschalten der Expression eines Gens hat sich in den letzten Jahren die Verwendung von Antisense-RNA oder RNAi (RNA Interferenz) durchgesetzt.
Antisense-RNA bindet nach den Regeln der Komplementarität sequenzspezifisch an die natürlich transkribierte mRNA ihrer Zielsequenz. Dieses Verfahren wurde zunächst in Prokaryoten beschrieben (Green, PJ. et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55, 569-597). Mittlerweile erlaubt es eine schnelle, transiente, posttranskriptionelle Silenzierung jedes beliebigen Gens in einer Vielzahl von eukaryotischen Zelltypen (Izant, J.G. und Weintraub, H. (1985) Science 229, 345-352) und wird vielseitig verwendet.
Bei RNAi (RNA Interferenz) wird kurze (-21 bp) doppelsträngige RNA in Zellen eingebracht, die spezifisch mit der Zielsequenz interagiert. Dadurch wird ein Multiprotein- Komplex aktiviert, der zum frühzeitigen Abbau von transkribierter mRNA führt, bevor diese translatiert werden kann (Hammond, S. M. et al. (2000) Nature 404, 293-296). Allerdings kann siRNA durch Aktivierung des Interferonsystems, durch Induktion der von doppelsträngiger RNA abhängigen Proteinkinase- Antwort (PKR) (Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 4115 494-498; Caplen, N.J. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98, 9742-9747) oder durch eine konzentrationsabhängige Stimulierung oder Repression von nicht-angesteuerten Genen (Persengiev, S.P. et al. (2004) RNA 10, 12-18) auch unspezifische Effekte hervorrufen.
Durch die oben beschriebenen Verfahren einer Verwendung von Antisense-RNA oder RNAi wird die Translation unterbunden und diese Verfahren führen daher zu einem loss of function von Genen.
Für eine funktionelle Charakterisierung bestimmter Gene, insbesondere Gene, die ektop aktiviert oder überexprimiert sind, wie selektiv in Tumoren exprimierte Gene, ist es jedoch zielführender die Auswirkungen eines gain of function zu simulieren.
Auch hier stehen eine Reihe von Techniken des Gentransfers zur Verfügung. So können transiente Transfektanden wie auch stabil transfizierte Zellklone hergestellt werden. Das zu untersuchende Gen kann mittels DNA-Plasmidkonstrukten aber auch mit Hilfe von retro- oder adenoviralen Vektoren in Zellen eingebracht werden. Ferner kann die Expression des eingebrachten Gens konstitutiv sein oder über einen regulierbaren Promotor gesteuert werden. Alle für diesen Zweck genutzten Formen des Gentransfers haben systeminhärente Nachteile. Transiente Transfektionen mit Plasmiden oder Viren sind bei den meisten Zelltypen (insbesondere Primärzellen) sehr ineffizient und resultieren in der Transfektion von variablen Subpopulation, die zudem keine ausreichend genaue Titration der Expressionshöhe ermöglicht. Da aber ein- und dasselbe Genprodukt in unterschiedlichen Zellen bzw. selbst in denselben Zellen in unterschiedlicher Konzentration variable Funktionen ausüben kann, ist die Aussagekraft dieser technischen Ansätze sehr limitiert. Ein weiteres nicht zu unterschätzendes Problem ist, dass Transfektionen mit Plasmiden erst verzögert zu einer Transkription fuhren. Die Zeit bis zur Transkription ist von der Zellzyklusphase abhängig, in der die Zellen transfiziert wurden, und entsprechend bei Zellpopulationen sehr variabel. Die Folge ist eine nicht-synchronisierte Transkription und Expression. Eine Alternative stellen stabil transfizierte Zellen dar. Die Herstellung stabil transfizierter Zelllinien ist allerdings sehr zeitaufwendig und nicht für alle Zellsysteme effizient durchführbar. So können die meisten frisch isolierten Zellen eines Säugetierorganismus nicht stabil transfiziert werden. Ein weiterer Nachteil ist, das die Anreicherung von transfizierten Zellen nach Transfektion z.B. durch Einsatz von Antibiotika oder durch physikalische Maßnahmen (z.B. Zellsorting) zur Selektion von Subpopulation führt, die sich unabhängig vom eingeführten Genprodukt in vielen Merkmalen vom ursprünglichen Zelltyp unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die funktionelle Charakterisierung von Genprodukten, welches auf dem Transfer von in vitro transkribierter, langkettiger RNA beruht. Transfer von in vitro transkribierter RNA in Zellen ist eine etablierte Methode und wird derzeit besonders intensiv in der Tumorimmunologie erprobt, um Tumorantigene in Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DC) einzubringen (Boczkowski, D. et al. (2000) Cancer Res. 60, 1028-1034; Heiser, A. et al. (2001) J. Immunol. 166, 2953-2960; Nair, S.K. et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16, 364-369). Dagegen ist der Transfer von in vitro transkribierter RNA für die systematische Bestimmung der Genfunktion bisher nicht genutzt worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur funktionellen Charakterisierung von Nukleinsäuren und/oder Expressionsprodukten, insbesondere Peptiden und Proteinen. In den erfindungsgemäßen Verfahren kann die Funktion der untersuchten Nukleinsäure und/oder des untersuchten Expressionsprodukts gänzlich unbekannt sein oder eine oder mehrere Funktionen der untersuchten Nukleinsäure und/oder des untersuchten Expressionsprodukts kann/können bekannt sein, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren in dieser Ausführungsform darauf abzielen, weitere Funktionen zu identifizieren.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung der Wirkungen der Expression einer Nukleinsäure in einer Wirtszelle, umfassend die Schritte: (a) Einbringen von RNA, die von der Nukleinsäure abgeleitet ist, in die Wirtszelle; und (b) Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens der RNA in die Wirtszelle ergeben.
Die Wirkungen auf die Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens der RNA in die Wirtszelle ergeben, können Aufschluss über die Funktion der Nukleinsäure und/oder des Expressionsprodukts geben. Somit betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Untersuchung der Funktion einer Nukleinsäure und/oder eines Nukleinsäureexpressionsprodukts in einem Organismus, umfassend die Schritte: (a) Einbringen von RNA, die von der Nukleinsäure abgeleitet ist und/oder für einen Teil oder die gesamte Sequenz des Expressionsprodukts kodiert, in eine Wirtszelle; (b) Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens der RNA in die Wirtszelle ergeben; und (c) Identifizierung einer oder mehrerer Funktionen der Nukleinsäure und/oder des Expressionsprodukts basierend auf den in Schritt (b) festgestellten Wirkungen auf die Wirtszelle.
Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen insbesondere Vorteile bezüglich eines geringen Zeitaufwands, der Möglichkeit einer Analyse von Kinetiken und einer Anwendbarkeit in nahezu allen Zellsystemen auf. Insbesondere weist ein Einbringen der zu untersuchenden Nukleinsäure, z.B. eines Gens, in Form von RNA gegenüber einer Verwendung von DNA- Konstrukten den Vorteil auf, dass RNA für eine Expression nicht in den Zellkern, sondern lediglich in das Zytoplasma der Zellen gelangen muss. Daher ist der RNA-Transfer unabhängig von der Teilungsaktivität der zu transfizierenden Zellen. Weiterhin sind die mit RNA erreichbaren Transfektionsraten relativ hoch (Van Tendeloo, V.F. et al. (2001) Blood 98, 49-56; Saeboe-Larssen, S. et al. (2002) J. Immunol. Methods 259, 191-203) und die erzielten Proteinmengen entsprechen denen bei physiologischer Expression. Kinetische Untersuchungen lassen sich sehr gut durchführen, weil innerhalb weniger Stunden bereits translatiertes Protein nachweisbar ist und funktionell relevant wird (Van Meirvenne, S. et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9, 787-797).
Der Transfer von RNA in Zellen ist erfindungsgemäß ideal für eine nachfolgende funktionelle Charakterisierung aufgrund folgender anhand von Beispielen belegter Charakteristika:
• RNA-Transfer erlaubt das Einbringen von Genprodukten in alle untersuchten eukaryontischen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen und nicht-transformierte Primärzellen (s. Tabelle 1)
• Transfektionsraten liegen sehr hoch, bei vielen Zelltypen sogar >90%, damit besteht keine Notwendigkeit zur Selektion. • Die Expressionshöhe ist durch die Menge der für die Transfektion eingesetzten RNA sehr gut zu titrieren. Dadurch können die Auswirkungen verschiedener Expressionshöhen in den Zellen simuliert werden.
• Nach Transfektion findet sofort eine synchronisierte Translation statt, die es erlaubt biologische Nachfolgeeffekte in ihrer zeitlichen Abfolge sensitiv zu erfassen.
• Die RNA-Transfektion zeigt geringe Methoden-inhärente Veränderungen transfizierter Zellen bezüglich ihres Transkriptoms.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere für eine Simulierung einer ektopen Expression von Transkriptionsfaktoren, Onkogenen oder potentiellen Onkogenen in Zellen und Zelllinien und somit für eine funktionelle Charakterisierung solcher Gene. In diesen Fällen ist die RNA, die in die Wirtszellen eingebracht wird, von einem Onkogen oder potentiellen Onkogen abgeleitet.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren wird die RNA, die in eine Wirtszelle eingebracht werden soll, durch Klonierung der dafür kodierenden Nukleinsäure und Transkription der klonierten Nukleinsäure, vorzugsweise durch in vitro Transkription, erhalten. Der Promoter für eine Steuerung der Transkription kann ein jeglicher Promoter für eine RNA-Polymerase sein. Bestimmte Beispiele von RNA-Polymerasen sind die Tl-, T3- und SP6-RNA-Polymerasen. Vorzugsweise wird die in vitro Transkription erfindungsgemäß durch einen T7- oder SP6-Promotor gesteuert.
In bestimmten Ausführungsformen liegt die für die RNA kodierende Nukleinsäure in Verbindung mit einer Polyadenylkassette vor. In diesen Ausführungsformen weist die durch Expression der Nukleinsäure, vorzugsweise durch in vitro Transkription, erhaltene RNA vorzugsweise eine Polyadenylierung einer definierten Länge auf. Vorzugsweise weist der Poly-A-Strang eine Länge von 10 bis 500, mehr bevorzugt 30 bis 300, noch mehr bevorzugt 65 bis 200 und insbesondere 100 bis 150 Adenosinresten auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Poly-A-Strang eine Länge von ungefähr 120 Adenosinresten auf.
In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen weist die RNA, die in eine Wirtszelle eingebracht werden soll, an ihrem 5 '-Ende eine Cap-Struktur oder eine regulatorische Sequenz auf, welche die Translation in der Wirtszelle fördert. In besonders bevorzugten Ausfuhrungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren bewirkt das Einbringen der RNA in die Wirtszelle eine Expression des durch die RNA kodierten Expressionsprodukts. Das Expressionsprodukt kann dabei in bestimmten erfindungsgemäßen Ausfuhrungsformen aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Enzymen, Antikörpern und Antigenen ausgewählt sein.
Erfindungsgemäß ist es für die funktionellen Untersuchungen möglich, die Menge von RNA, die in eine Wirtszelle eingebracht wird, und somit die Menge des in der Wirtszelle exprimierten Expressionsprodukts zu steuern.
In bestimmten Ausführungsformen ist die RNA, die erfindungsgemäß in eine Wirtszelle eingebracht wird, Teil einer RNA-Bibliothek. Die Erfindung betrifft in diesem Aspekt auch ein Verfahren zum Screening einer Gruppe verschiedener Nukleinsäuren oder Varianten einer Nukleinsäure (Def.: RNA-Bibliothek) auf das Auftreten von RNA, die bei Einbringen in eine Wirtszelle in der Lage ist, eine bestimmte Wirkung auf die Wirtszelle zu erzeugen bzw. eine bestimmte Funktion der Wirtszelle zu steuern oder zu beeinflussen.
Somit betrifft die Erfindung in diesem Aspekt ein Verfahren zum Auffinden einer Nukleinsäure und/oder eines Nukleinsäureexpressionsprodukts mit einer bestimmten Wirkung/Funktion, umfassend die Schritte: (a) Einbringen von RNA in eine Wirtszelle; (b) Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens der RNA in die Wirtszelle ergeben; und (c) Identifizierung der RNA, welche die Wirkungen auf die Wirtszelle verursacht. Dieses Verfahren kann auch eine Bestimmung der Nukleotidsequenz der RNA, welche die Wirkungen auf die Wirtszelle verursacht, umfassen. Eine solche Bestimmung der Nukleotidsequenz kann in an sich bekannter Weise erfolgen, insbesondere durch Sequenzierung der ursprünglichen Nukleinsäure.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen eine Untersuchung und Identifizierung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund eines Einbringens von RNA in die Wirtszelle und gegebenenfalls Expression der RNA in der Wirtszelle ergeben.
Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass es viele Möglichkeiten gibt, wie das Einbringen von RNA in eine Wirtszelle Wirkungen auf diese Wirtszelle haben kann. Dementsprechend gibt es verschiedene Verfahren, mittels derer Wirkungen, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in eine Wirtszelle ergeben, in den erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden können. Solche Verfahren umfassen in nicht begrenzender Weise die Bestimmung eines oder mehrerer der folgenden Parameter: Zellproliferation, Zelltod, Zellmigration, Zelladhäsion, veränderter Resistenz bzw. veränderte Sensitivität für Pharmaka, Alterung von Zellen, Produktion oder Hemmung der Produktion bestimmter Moleküle, mRNA-Mengen, Proteinexpressionsmengen, Proteinaktivitätsniveaus, Wirkungen auf eine Proteinphosphorylierung, Wirkungen auf eine Protein- oder Nukleinsäureprozessierung, Wirkungen auf RNA-Stabilität, Wirkungen auf Signaltransduktion oder Second Messenger.
Vorzugsweise umfasst die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Untersuchung von phänotypischen und/oder biochemischen Merkmalen der Wirtszelle.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Untersuchung des Protein-Expressionsprofils (Proteomanalyse) und/oder eine Untersuchung des RNA-Expressionsprofils (Transkriptomanalyse) der Wirtszelle.
In weiteren Ausführungsformen umfasst die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Untersuchung des Stoffwechsels der Wirtszelle. Vorzugsweise umfasst eine Untersuchung des Stoffwechsels eine Untersuchung der Anhäufung von Substraten oder Produkten aus enzymatischen Reaktionen gemäß bekannter Verfahren.
In anderen Ausführungsformen umfasst eine Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Untersuchung der Regulation von Genen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle im Vergleich mit einer Zelle, in welche die RNA nicht eingebracht wurde (Transferkontrolle) bzw. im Vergleich mit einer Zelle, in die eine für die Funktion irrelevante RNA (Negativkontrolle) bzw. eine die Funktion vermittelnde RNA (Positivkontrolle) eingebracht wurde. Diese Zellen dienen als Kontrollen bzw. als Bezugsgrößen. Diese Zellen entsprechen vorzugsweise der verwendeten Wirtszelle.
Eine subtraktive Hybridisierung kann verwendet werden, um zu ermitteln, ob das Einbringen von RNA in eine Wirtszelle eine Wirkung auf das RNA-Expressionsprofil der Wirtszelle umfasst. Li dieser Ausfuhrungsform wird beispielsweise in Kontrollzellen vorhandene RNA von RNA „subtrahiert", die von Wirtszellen exprimiert wird, in die interessierende RNA eingebracht wurde.
In einer weiteren Ausfuhrungsform umfasst die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Komplementationsanalyse. In dieser Ausführungsform wird die Funktion eines endogen in der Wirtszelle vorhandenen Gens durch Einbringen von interessierender RNA in die Wirtszelle ersetzt oder verstärkt.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, eine Untersuchung von phänotypischen Merkmalen der Wirtszelle, z.B. durch Verfahren, die eine morphologische, makroskopische oder mikroskopische Untersuchung beinhalten.
Die Wirtszellen können auch einer weiteren Behandlung oder Veränderung von Bedingungen vor einer Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, ausgesetzt werden. Somit werden in einer Ausführungsform Wirkungen auf zelluläre Faktoren temporär untersucht. Die Wirtszellen können auch in einen in vivo Zusammenhang, insbesondere einen Organismus, eingebunden werden, um eine Funktion einer Nukleinsäure und/oder eines Nuklemsäureexpressionsprodukts weiter zu bestimmen.
Die Untersuchung von Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, erlaubt die Identifizierung einer oder mehrerer Funktionen, die eine Nukleinsäure und/oder ein Expressionsprodukt in einem Organismus hat, von dem diese Nukleinsäure und/oder das Expressionsprodukt abgeleitet ist. Die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben auch die Identifizierung eines oder mehrerer zellulärer Faktoren, die funktionell mit der interessierenden Nukleinsäure und/oder dem interessierenden Expressionsprodukt in Beziehung stehen. Eine solche Gruppe zellulärer Faktoren würde eine gesteigerte Expression bei Einbringen der interessierenden RNA in eine Wirtszelle aufweisen. Eine andere solche Gruppe zellulärer Faktoren würde eine verringerte Expression bei Einbringen der interessierenden RNA in eine Wirtszelle aufweisen. Somit stellt die Erfindung auch Mittel für die Identifizierung funktioneller Beziehungen zwischen zellulären Faktoren und interessierenden Nukleinsäuren und/oder Expressionsprodukten bereit.
In bestimmten Ausführungsformen ist bevorzugt, dass die Wirtszelle von dem gleichen Organismus wie die zu untersuchende Nukleinsäure und/oder das zu untersuchende Expressionsprodukt abgeleitet ist, d.h. die zu untersuchende Nukleinsäure und/oder das zu untersuchende Expressionsprodukt ist homolog zu der Wirtszelle. Jedoch ist möglich, dass die zu untersuchende Nukleinsäure und/oder das zu untersuchende Expressionsprodukt heterolog zu der Wirtszelle ist.
Vorzugsweise wird die interessierende Nukleinsäure und/oder das interessierende Expressionsprodukt zumindest anfänglich in einer Wirtszelle untersucht, von der bekannt ist, dass sie natürlicherweise die Nukleinsäure und/oder das Expressionsprodukt exprimiert.
In bestimmten Ausführungsformen kann es jedoch erwünscht sein, heterologe Nukleinsäuren und/oder Expressionsprodukte in Wirtszellen, insbesondere Säugerzellen, zu testen. So kann beispielsweise ermittelt werden, ob eine bestimmte Sequenz, z.B. aus einem Pilz, in der Lage ist, als Substitutionsprodukt für eine Säugersequenz zu fungieren. Wenn dies der Fall ist, kann die heterologe Sequenz beispielsweise als therapeutisches Substitutionsprodukt für die Säugersequenz verwendet werden.
Des weiteren kann es erwünscht sein, Derivate einer Nukleinsäure und/oder eines Expressionsprodukts auf eine oder mehrere Funktionen in den erfindungsgemäßen Verfahren zu testen. Dies ermöglicht eine Veränderung einer bestimmten Nukleinsäure und/oder eines bestimmten Expressionsprodukts und ein Testen, ob die veränderte Nukleinsäure und/oder das veränderte Expressionsprodukt eine oder mehrere Wirkungen und/oder Funktionen der ursprünglichen Nukleinsäure und/oder des ursprünglichen Expressionsprodukts beibehält. In vielen Fällen kann es erwünscht sein, Derivate einer Nukleinsäure und/oder eines Expressionsprodukts herzustellen, die eine oder mehrere Wirkungen und/oder Funktionen der ursprünglichen Nukleinsäure und/oder des ursprünglichen Expressionsprodukts beibehalten, während sie eine oder mehrere Wirkungen und/oder Funktionen der ursprünglichen Nukleinsäure und/oder des ursprünglichen Expressionsprodukts nicht aufweisen.
In bestimmten erfindungsgemäßen Ausfuhrungsformen werden Hochdurchsatzsysteme für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. In einer Ausfuhrungsform dieses Aspekts kann das System gegebenenfalls computerisiert oder Roboter-implementiert sein und kann auch die Verwendung einer Vielzahl von Kompartimenten umfassen. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Kompartimente in einer Multiwell- Platte angeordnet und die RNA und die Wirtszellen sind vorzugsweise in einer Vielzahl von Kompartimenten angeordnet.
Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben, können mit Hilfe von Mikroarray- Verfahren und Anordnungen untersucht werden, die bekannt sind.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß können Standardverfahren für eine Herstellung von rekombinanten Nukleinsäuren, Kultivierung von Zellen und Einbringen von Nukleinsäuren, insbesondere RNA, in Zellen, insbesondere Elektroporation und Lipofektion, verwendet werden. Enzymatische Reaktionen und Aufreinigungsverfahren erfolgen gemäß Herstellerangaben oder in an sich bekannter Weise.
Der Begriff „Organismus" betrifft erfindungsgemäß jede biologische Einheit, die fähig ist, sich zu vermehren oder genetisches Material zu übertragen und umfasst Pflanzen und Tiere, Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen, Pilze und Viren.
Der Begriff „Transfektion" betrifft erfindungsgemäß das Einbringen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einen Organismus oder in eine von diesem abgeleitete Zelle oder Zellen. Der Begriff „Wirtszelle" betrifft erfindungsgemäß jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure, insbesondere RNA, transformierbar oder transfizierbar ist. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer einzigen oder in mehreren Kopien vorliegen und wird in einer Ausfuhrungsform in der Wirtszelle exprimiert.
Der Begriff „Wirtszellen" umfasst erfindungsgemäß prokaryontische und eukaryontische Zellen, insbesondere menschliche und tierische Zellen, Pflanzenzellen und Zellen von Mikroorganismen. Besonders bevorzugte erfindungsgemäß verwendete Wirtszellen sind eukaryontische Zellen, insbesondere Säugerzellen wie Zellen aus Mensch, Maus, Hamster, Schwein, Ziege und Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen abgeleitet sein und umfassen primäre Zellen und Zelllinien.
Bevorzugte Wirtszellen sind diejenigen von menschlichen Geweben, einschließlich in nicht begrenzender Weise neuronale Zellen, Gehirnzellen, Epithelzellen, Bindegewebszellen (wie Fibroblasten und Osteoblasten), Blutzellen (wie Leukocyten, Lymphocyten, Monocyten und Neutrophile, insbesondere dendritische Zellen, Thrombozyten), sensorische Zellen, Muskelzellen, Lungenzellen, Herzzellen, Leberzellen, Hautzellen, Pankreaszellen, Brustzellen, Nierenzellen, Darmzellen, Magenzellen, Dickdarmzellen, Prostatazellen, Ovarialzellen, Keimzellen und Stammzellen, welche die Fähigkeit haben sich in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren.
Kultivierte Zelllinien können auch verwendet werden. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden teilweise oder vollständig differenzierte Zellen verwendet, beispielsweise, wenn bekannt ist, dass die interessierende Nukleinsäure und/oder das interessierende Expressionsprodukt normalerweise nur in diesen Zellen exprimiert wird.
Der Begriff „Wirkungen auf eine Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens von RNA in die Wirtszelle ergeben" umfasst erfindungsgemäß jegliche wahrnehmbare Auswirkungen auf eine Wirtszelle, die auf das Einbringen der RNA in die Wirtszelle zurückzufuhren sind, insbesondere Auswirkungen auf das Wachstum, die Entwicklung, die Vermehrung, die Vererbung, die Biochemie und/oder den Phänotyp der Wirtszelle.
Der Begriff „Phänotyp" oder „phänotypisches Merkmal" betrifft das Erscheinungsbild eines Organismus oder einer Wirtszelle. Der Phänotyp schließt alle inneren und äußeren Strukturen und Funktionen ein. Im Laufe der individuellen Entwicklung kann sich der Phänotyp eines Organismus und der von diesem abstammenden Zellen ändern. Zwar sind die äußeren Merkmale eines Organismus und der von diesem abstammenden Zellen durch seine genetischen Informationen festgelegt (Genotyp), der Phänotyp ist jedoch davon abhängig, welche Gene tatsächlich ausgeprägt werden (Expression).
Der Begriff „Biochemie" oder „biochemisches Merkmal" betrifft den Stoffwechsel und Stofftransport eines Organismus oder einer von diesem abstammenden Zelle.
Der Begriff „Funktion einer Nukleinsäure und/oder eines Nukleinsäureexpressionsprodukts in einem Organismus oder der von diesem abstammenden Zellen" betrifft erfindungsgemäß die funktionelle Rolle, die die Nukleinsäure und/oder das Nukleinsäureexpressionsprodukt in einem Organismus oder in von diesem abstammenden Zellen, vorzugsweise in dem Organismus oder in dem von diesem abstammenden Zellen, von dem die Nukleinsäure und/oder das Nukleinsäureexpressionsprodukt abgeleitet ist, einnimmt. In einer Ausführungsform betrifft der Begriff die funktionelle Rolle einer Nukleinsäure und/oder eines Nukleinsäureexpressionsprodukts bei der Karzinogenese. In Bezug auf eine Nukleinsäure betrifft der Begriff insbesondere die Wirkungen, die eine Expression bzw. fehlende Expression der Nukleinsäure in dem Organismus oder in dem von diesem abstammenden Zellen zur Folge hat.
Der Begriff „Funktion einer Nukleinsäure und/oder eines
Nukleinsäureexpressionsprodukts" kann erfindungsgemäß bedeuten, dass die Nukleinsäure und/oder das Nukleinsäureexpressionsprodukt nur eine Funktion oder mehrere Funktionen aufweist, wobei im letzteren Fall eine oder mehrere Funktionen durch die erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden.
Der Begriff „Gen" betrifft erfindungsgemäß eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die für die Produktion eines oder mehrerer zellulärer Produkte und/oder für das Erreichen einer oder mehrerer interzellulärer oder intrazellulärer Funktionen verantwortlich ist. Insbesondere betrifft der Begriff einen DNA- Abschnitt, welcher für ein spezifisches Protein oder ein funktionelles bzw. strukturelles RNA-Molekül kodiert. Eine Nukleinsäure ist erfindungsgemäß vorzugsweise Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA), die zur Herstellung von RNA genutzt werden kann. Nukleinsäuren umfassen erfindungsgemäß genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen.
Eine Nukleinsäure, insbesondere RNA, ist erfindungsgemäß von einer anderen Nukleinsäure abgeleitet, wenn zwischen den Nukleinsäuren ein gewisser Grad an Homologie vorhanden ist, d.h. die Nukleinsäuren in der Abfolge ihrer Nukleotide signifikante direkte oder komplementäre Übereinstimmungen aufweisen. Eine Nukleinsäure ist ferner auch dann von einer anderen Nukleinsäure abgeleitet, wenn die erstere Nukleinsäure ein Derivat der zweiten Nukleinsäure ist. Der Begriff „RNA, die von einer Nukleinsäure abgeleitet ist" bedeutet insbesondere, dass die RNA ein Transkriptionsprodukt der Nukleinsäure bzw. einer davon abgeleiteten Nukleinsäure ist und/oder eine Sequenz aufweist, die bei einer Translation in einem Proteinexpressionsprodukt resultiert, das die gleiche Sequenz aufweist wie ein Proteinexpressionsprodukt, das aufgrund einer Transkription und Translation der Nukleinsäure entsteht, von der die RNA abgeleitet ist.
Mit „Derivat" einer Nukleinsäure ist erfindungsgemäß gemeint, dass einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen in der Nukleinsäure vorliegen. Weiterhin umfasst der Begriff „Derivat" auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat. Der Begriff „Derivat" umfasst auch Nukleinsäuren, die nicht in der Natur vorkommende Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Eine Nukleinsäure kann erfindungsgemäß isoliert sein. Der Begriff „isolierte Nukleinsäure" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifϊziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung produziert wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gelelektrophoretische Auftrennung oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die für eine Manipulierung durch rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung steht. Eine Nukleinsäure ist dann zu einer anderen Nukleinsäure „komplementär", wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und ein stabiles Duplex eingehen können, wobei die Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, die eine spezifische Hybridisierung zwischen Polynukleotiden erlauben (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind beispielsweise in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.5 Hrsg., 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., New York beschrieben und betreffen beispielsweise die Hybridisierung bei 650C in Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH2PO4 (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid/ 0,15 M Natriumeitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde beispielsweise in 2 x SSC bei Raumtemperatur und sodann in 0,1 - 0,5 x SSC/ 0,1 x SDS bei Temperaturen bis 680C gewaschen.
Komplementäre Nukleinsäuren weisen erfindungsgemäß mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% und vorzugsweise mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Identität der Nukleotide auf.
Expressionskontrollsequenzen oder regulatorische Sequenzen, die erfindungsgemäß funktionell mit einer Nukleinsäure verbunden sind, können in Bezug zu der Nukleinsäure homolog oder heterolog sein. Eine kodierende Sequenz und eine regulatorische Sequenz sind dann „funktionell" miteinander verbunden, falls sie derart kovalent miteinander verknüpft sind, dass die Transkription oder Translation der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle oder unter dem Einfluss der regulatorischen Sequenz steht. Falls die kodierende Sequenz in ein funktionelles Protein translatiert werden soll, führt bei einer funktionellen Verbindung einer regulatorischen Sequenz mit der kodierenden Sequenz eine Induktion der regulatorischen Sequenz zu einer Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einer Leserasterverschiebung in der kodierenden Sequenz oder zu einem Unvermögen der kodierenden Sequenz kommt, in das gewünschte Protein oder Peptid translatiert zu werden.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz" oder „regulatorische Sequenz" umfasst erfindungsgemäß Promotoren, ribosombindende Sequenzen und andere Kontrollelemente, welche die Transkription des Gens oder die Translation der abgeleiteten RNA steuern. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die Expressionskontrollsequenzen regulierbar. Die genaue Struktur von regulatorischen Sequenzen kann speziesabhängig oder zelltypusabhängig variieren, umfasst jedoch im allgemeinen 5'-nicht- transkribierte und 5' und 3'- nicht-translatierte Sequenzen, die an der Initiation der Transkription bzw. Translation beteiligt sind wie TATA-Box, Capping-Sequenz, CAAT- Sequenz und ähnliches. Insbesondere umfassen 5'-nicht-transkribierte Regulationssequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für eine transkriptionelle Kontrolle des funktionell verbundenen Gens einschließt. Regulatorische Sequenzen können auch Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.
Des weiteren kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das ein Protein oder Polypeptid, das durch die Nukleinsäure kodiert wird, zu einem bestimmten Zielort steuert. Insbesondere kann eine Nukleinsäure erfindungsgemäß in Verbindung mit einer anderen Nukleinsäure vorliegen, die für ein Polypeptid kodiert, das eine Translokation oder Stabilisierung des kodierten Proteins oder Polypeptids auf der Zellmembran der Wirtszelle oder seine Kompartimentalisierung in bestimmte Organellen dieser Zelle herbeiführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine klonierte Nukleinsäure erfindungsgemäß in einem Vektor vorhanden, wobei der Vektor gegebenenfalls einen Promotor umfasst, der die Expression der Nukleinsäure steuert. Der Begriff „Vektor" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst jegliche intermediäre Vehikel für eine Nukleinsäure, die es z.B. ermöglichen die Nukleinsäure in prokaryontische und/oder in eukaryontische Zellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuss, bei der liposomalen Verabreichung, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA- Viren angepasst sein. Vektoren umfassen Plasmide, Phagemide oder Virusgenome.
Rekombinante RNA kann erfindungsgemäß durch in vitro Transkription von einer entsprechenden DNA-Matritze hergestellt werden. Sie kann des weiteren durch stabilisierende Sequenzen, Capping und PoIy- Adenylierung modifiziert werden. Der Begriff „Expression" wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Proteinen/Polypeptiden. Er umfasst auch eine teilweise Expression von Nukleinsäuren. Des weiteren kann die Expression transient oder stabil erfolgen. In Bezug auf RNA betrifft der Begriff „Expression" insbesondere die Produktion von Proteinen/Polypeptiden.
„Derivate" eines Expressionsprodukts, insbesondere eines Proteins oder Polypeptids oder einer Aminosäuresequenz im Sinne dieser Erfindung umfassen Aminosäure- Insertionsvarianten, Aminosäure-Deletionsvarianten und/oder Aminosäure-Substitutionsvarianten.
Aminosäure-Insertionsvarianten umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, sowie Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren in einer bestimmten Aminosäuresequenz. Bei Aminosäure-Sequenzvarianten mit einer Insertion werden ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in einer Aminosäuresequenz eingebracht, obwohl eine zufällige Insertion mit geeignetem Screening des resultierenden Produkts auch möglich ist. Aminosäure-Deletionsvarianten sind durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure- Substitutionsvarianten zeichnen sich dadurch aus, dass wenigstens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle eingefügt wird. Vorzugsweise befinden sich die Modifikationen an Positionen in der Aminosäuresequenz, die zwischen homologen Proteinen oder Polypeptiden nicht konserviert sind. Vorzugsweise werden Aminosäuren durch andere mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, Volumen der Seitenkette und ähnliches (konservative Substitution). Konservative Substitutionen betreffen beispielsweise den Austausch einer Aminosäure durch eine andere, nachstehend in derselben Gruppe wie die substituierte Aminosäure aufgeführte Aminosäure:
1. kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: AIa, Ser, Thr (Pro, GIy)
2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, GIu, GIn
3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, VaI (Cys)
5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp. Drei Reste sind aufgrund ihrer besonderen Rolle für die Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. GIy ist der einzige Rest ohne eine Seitenkette und verleiht der Kette somit Flexibilität. Pro besitzt eine ungewöhnliche Geometrie, die zur starken Veränderung der Polypeptidstruktur führen kann. Cys kann mit einem weiteren Cys intra- oder intermolekulare Disulfidbrücken bilden.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten können leicht mit Hilfe von rekombinanter DNA-Manipulation hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA einzubringen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und umfassen z.B. M13-Mutagenese. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.
„Derivate" von Proteinen oder Polypeptiden umfassen erfindungsgemäß auch einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Protein oder Polypeptid assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide. Ferner erstreckt sich der Begriff „Derivat" auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der Proteine oder Polypeptide.
Ein Teil oder Fragment eines Expressionsprodukts weist erfindungsgemäß vorzugsweise eine funktionelle Eigenschaft des Expressionsprodukts auf, aus dem es abgeleitet ist. Solche funktionellen Eigenschaften umfassen die Interaktion mit Antikörpern, die Interaktion mit anderen Polypeptiden oder Proteinen, die selektive Bindung von Nukleinsäuren und eine enzymatische Aktivität.
Ein Teil oder ein Fragment einer Nukleinsäure betrifft erfindungsgemäß vorzugsweise einen Teil der Nukleinsäure, der für einen Teil oder ein Fragment eines Expressionsprodukts wie vorstehend definiert kodiert.
Verschiedene Verfahren können eingesetzt werden, um erfindungsgemäß Nukleinsäuren in Zellen einzubringen. Solche Verfahren umfassen die Transfektion von Nukleinsäure- CaPθ4-Präzipitaten, die Transfektion von Nukleinsäuren, die mit DEAE assoziiert sind, die Transfektion oder Infektion mit Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, Elektroporation, die Liposomen-vermittelte Transfektion und ähnliches. In bestimmten Ausfuhrungsformen ist eine Steuerung der Nukleinsäure an bestimmte Zellen bevorzugt. In solchen Ausfuhrungsformen kann ein Träger, der für die Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle (z.B. ein Retrovirus oder ein Liposom) eingesetzt wird, ein gebundenes Zielsteuerungsmolekül aufweisen. Zum Beispiel kann ein Molekül wie ein Antikörper, der für ein Oberflächenmembran-Protein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Falls ein Einbringen einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht ist, können Proteine, die an ein Oberflächenmembran-Protein binden, das mit der Endozytose assoziiert ist, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um eine Zielsteuerung und/oder Aufnahme zu ermöglichen. Solche Proteine umfassen Kapsid-Proteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörper gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die eine intrazelluläre Stelle ansteuern und ähnliches.
Der Begriff „Komplementationsanalyse" betrifft erfindungsgemäß eine Untersuchung von Wirkungen, die in einem Organismus oder einer Zelle erzeugt werden, wenn eine Nukleinsäure in diesen Organismus oder in diese Zelle eingebracht wird, nachdem ein bestimmtes Gen deletiert oder mutiert wurde, so dass es nicht mehr vollständig in seiner normalen Rolle funktionsfähig ist. Wenn ein komplementäres Gen oder dessen Expressionsprodukte in den Organismus oder die Zelle mit einem deletierten oder mutierten Gen eingebracht werden, sind sie vorzugsweise in der Lage, die Funktion des Gens wiederherzustellen.
Der Begriff „Mikroarray" betrifft erfindungsgemäß eine Vorlage, welche benutzt wird, um biologisches Material wie z.B. Nukleinsäuren, Peptide oder Proteine in hoher Dichte aufzutragen und zu binden. Mikroarrays bestehen aus oder beinhalten eine feste Trägersubstanz die es erlaubt, große Mengen an Proben in geregelten Abständen aufzubringen, so dass diese für parallele Experimente genutzt werden können.
Der Begriff „High Density" wird erfindungsgemäß in Zusammenhang mit Arrays benutzt, welche eine hohe Dichte an verschiedenen Proben, wie Nukleinsäureproben, aufweisen und somit eine Vielzahl an Fragestellungen beantworten können. Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Abbildungen und Beispiele ausführlich beschrieben, die ausschließlich der Erläuterung dienen und nicht begrenzend zu verstehen sind. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausfuhrungsformen zugänglich, die ebenfalls erfmdungsgemäß umfasst sind.
Abbildungen:
Abb. 1 : Darstellung der verwendeten eGFP-Vektoren - a. ρGEM3Z eGFP Tail und b. pSTI eGFP Tail. Diese Vektoren wurden als Ausgangsvektoren für die weiteren Klonierungen genutzt.
Abb. 2: Western Blot zum Nachweis der Translation der eGFP IVT RNA 24h nach Transfektion in 786-0 Zellen. Transfiziert wurden 20μg eGFP-pGEM3Z Tail IVT RNA mit 200V und 250 μF. Als primärer Antikörper wurde rabbit anti-GFP in einer Konzentration von 1 μg/ml verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde goat anti-rabbit HRP in einer Konzentration von 0,5μg/ml verwendet. Als Beladungskontrolle wurde ein mouse anti- ERK2 Antikörper in einer Konzentration von 0,2 μg/ml verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde hier goat anti-mouse HRP 1 :5000 verdünnt.
Abb. 3: Darstellung des FACS Dot Blots 24h nach Transfektion von 1x107 786-0 Zellen mit 20μg eGFP IVT RNA, bzw. nach Kontrolltransfektion ohne RNA.
Abb. 4: Ermittlung des Einflusses der Zellzahl auf die Elektroporationseffizienz durch Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität von eGFP. Transfiziert wurden 20 μg eGFP- pGEM3Z Tail IVT RNA in die angegebene Anzahl von K562-Zellen. Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Transfektion für 24h. Die Ermittlung der mittleren Fluoreszenz- intensitäten erfolgte mit Hilfe des FACS-Kalibur.
Abb. 5: Ermittlung des Einflusses der Elektroporationsbedingungen auf die Elektroporationseffizienz und die mittlere Fluoreszenzintensität. Transfektion von 20μg eGFP IVT RNA in MCF7-Zellen. Kultivierung der Zellen erfolgte nach Transfektion für 24h. Die Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit Hilfe des FACS- Kalibur.
Abb. 6: Ermittlung des Einflusses der Zeit auf die Transkript- und Proteinmenge nach Transfektion von 2xlO7 786-0-Zellen mit 20μg eGFP IVT RNA bzw. 2dGFP IVT RNA. a. Ermittlung der relativen Transkriptmenge anhand einer quantitativen RT-PCR Analyse. Die Normalisierung erfolgte gegen nicht transfizierte Zellen. Zur Berücksichtigung unterschiedlicher cDNA-Qualitäten wurde eine 18s-spezifϊsche PCR durchgeführt und die Werte zur Normalisierung verwendet, b. Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität von eGFP mit Hilfe des FACS-Kalibur.
Abb. 7: Ermittlung des Einflusses der RNA-Menge auf das eGFP-Proteinlevel 24h nach Transfektion von 5x106 MCF-7-Zellen mit eGFP IVT RNA. a. Darstellung der Messung der Fluoreszenzintensität im Histogrammblot im Vergleich zu einer nicht transfizierten Kontrolle, b. Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensitäten.
Abb. 8: Quantitative Bestimmung der relativen Transkriptmenge von HIF 1-α, LDHA, VEGF und Glut-1 24h nach Transfektion von 2xlO7 786-0 Zellen mittels Real-Time RT- PCR. Darstellung der relativen Expression im Vergleich zu einer eGFP transfizierten Kontrolle.
Abb. 9: Relative Transkriptmenge von VEGF und LDHA nach Transfektion von 2x107 786-0 Zellen mit 20μg VHL IVT RNA im zeitlichen Verlauf. Die Ermittlung der relativen Transkriptmengen erfolgte im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen. Die Normalisierung erfolgte über 18s rRNA.
Abb. 10: Darstellung der relativen Transkriptmengen nach Transfektion von 1x107 MCF-7 Zellen mit SYT, SSX2, SYT-SSXl5 SYT-SSX2 oder eGFP IVT RNA als Kontrolle. Die Normalisierung erfolgte über HPRT. Die relativen Transkriptmengen wurden im Vergleich zu den mit eGFP IVT RNA transfizierten Zellen ermittelt.
Abb. 11 : Darstellung der relativen Transkriptmengen von BMP7, EPHA4 und COL5A1 in Synovialsarkomen im Vergleich zu Normalgeweben aus Mamma, Lunge, Niere, Ovar, Testis, Leber, Lymphknoten, Thymus, Milz und Nebenniere. Die Normalisierung erfolgte über HPRT. Bei dem getesteten Sarkom handelt es sich bei Bestimmung der Expression von BMP-7 und COL5A1 um ein Osteosarkom, während für die Untersuchung von EPHA4 ein Synovialsarkom getestet wurde, welches nicht positiv für SYT-SSXl oder SYT-SSX2 war. Die pathologische Diagnose ist aufgrund der fehlenden Translokation fraglich.
Abb. 12: Zusammenstellung der Gene, die sich anhand ihrer Funktion gruppieren lassen, die durch Transfektion von MCF-7 Zellen mit SSX2, SYT-SSXl oder SYT-SSX2 im Vergleich zu einer Kontrolltransfektion mit eGFP mindestens um den Faktor 21 differentiell exprimiert werden bei einem Signifikanzkriterium von 5%. Die nicht angegebenen Werte liegen im nicht signifikanten Regulationsbereicht d.h. <2*. Bei den in der Tabelle angegebenen Werten handelt es sich jeweils um die Exponenten zur Basis zwei; die sich ergebende Zahl drückt den Faktor der differentiellen Expression aus.
Abb. 13: Darstellung der relativen Transkriptmengen im Vergleich zu eGFP-transfizierten Zellen ermittelt mittels Real-Time RT-PCR. Die Normalisierung erfolgte über HPRT. Die Standardabweichung zwischen den biologischen Triplikaten ist angegeben
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung von Vektoren
Die Herstellung der Vektoren erfolgte durch Klonierung der jeweiligen kodierenden Sequenz in den Vektor pGEM3Z (Invitrogen, San Diego, CA) bzw. in den Vektor pCMV Script (Stratagene, Amsterdam, NL) als Basisvektoren.
Der Vektor pGEM3Z hat einen SP6-Promotor vor dem Startkodon, von dem aus eine in vitro Transkription möglich ist. Der Vektor pCMV Script enthält an gleicher Stelle einen T7-Promotor.
Ausgehend von diesen Basisvektoren wurden umfangreiche Modifizierungen eingeführt, die für die Herstellung von poly-adenylierter in vitro transkribierter (IVT) RNA nötig sind.
In den Vektor pGEM3Z wurde ein Poly-A-Strang von 120 Basen über die Xhol- Schnittstelle eingeführt. Direkt hinter den Poly-A-Strang wurde eine Restriktionsschnittstelle eingeführt, die eine Linearisierung ermöglichte. Dieser Vektor wird im Folgenden als Vektor pGEM3Z Tail bezeichnet (Abb. Ia).
In den Vektor pCMV Script wurde ein Poly-A-Strang von 120 Basenpaaren hinter der Sacl-Schnittstelle eingeführt. Dieser Vektor wird im Folgenden als Vektor pSTI Tail bezeichnet (Abb. Ib).
eGFP bzw. die aus den jeweiligen Geweben amplifizierten Gene wurden nach Aufreinigung und Restriktion mit den jeweiligen Vektoren ligiert und in E. coli MRFl" transformiert. Die erhaltenen Plasmide wurden sequenziert und die Sequenz analysiert.
Beispiel 2: Herstellung von IVT RNA
Der erste Schritt zur Herstellung von IVT RNA bestand in der Linearisierung der jeweiligen Plasmide. Es wurden die Restriktionsenzyme Bpil für den Vektor pGEM3Z Tail und SapI für den Vektor pSTI Tail verwendet. Beide schneiden nur einmal im Vektor und zwar hinter dem eingefügten Tail. Nach der Linearisierung wurde das Enzym durch Phenol-Chloroform-Fällung inaktiviert und entfernt. Hierzu wurde dem Restriktionsansatz ein Isovolumen eines Gemisches aus Phenol und Chloroform zugegeben und gründlich gemischt. Durch kurze Zentrifugation bei 10.000 x g erfolgte die Trennung in eine untere organische Phase und in eine obere wässrige Phase, die die DNA enthält. Letztere wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nun wurde die wässrigen Phase mit einem Isovolumen reinen Chloroforms gemischt, um eventuelle Rückstände von Phenol abzutrennen. Nach Zentrifugieren wurde die wässrige Phase abgenommen und durch Zugabe von zwei Isovolumen Ethanol und 10% v/v 3M Natriumacetat pH 4,5 bei -20°C 2h ausgefällt.
Die DNA wurde durch Zentrifugation für 45min bei 10.000 x g bei 4°C sedimentiert, mit 70%igem Ethanol zur Entfernung von Salzen gewaschen und in einem geeigneten Volumen RNAse-freiem Wasser aufgenommen. Die erfolgreiche und vollständige Linearisierung wurde gelelektrophoretisch geprüft. Die Konzentration der DNA wurde photometrisch bei 260nm bestimmt. Zur Bestimmung der Reinheit der DNA wurde außerdem die optische Dichte bei 280nm zur Bildung des OD260/280 Quotienten gemessen.
lOμg linearisierte DNA wurden für die in vitro Transkription eingesetzt. Hierzu wurden 40μl dNTPs, wobei 4/5 des dGTPs zusätzlich mit einer Cap-Struktur versehen waren, lOμl lOx-Puffer, 20μl DTT und lOμl T7- bzw. SP6-Polymerase für 2h bei 37°C inkubiert. Die Polymerasen binden dabei an ihre T7- bzw. SP6- Erkennungssequenzen, die 5' von dem zu transkribierenden ORF liegen und synthetisieren den komplementären RNA-Strang.
Die IVT RNA wurde mit dem MegaClear Kit aufgereinigt. Hierzu wurde sie in einem Bindungspufferkonzentrat aufgenommen, das die nötigen Salze für eine optimale Bindung der RNA an die Silikamembran enthält. Die Zugabe von Ethanol entzieht der Hydrathülle der RNA Wasser. Das Gemisch wurde auf eine Silikasäule geladen und bei 10.000 x g für 2min zentrifugiert. Hierbei band die RNA an die Säule, während Verunreinigungen wie z.B. Enzymreste ausgewaschen wurden. Nach mehreren Waschschritten wurde die gereinigte RNA eluiert. Der Elutionspuffer wurde, um eine effizientere Elution zu ermöglichen, vorher auf 95°C erhitzt. Die Qualitätskontrolle und die Quantifizierung erfolgten sowohl gelelektrophoretisch als auch photometrisch.
Beispiel 3: Elektroporation von Zellen
Das Prinzip der Elektroporation beruht darauf, dass das Transmembranpotential der Zellen durch einen kurzzeitigen Stromstoß gestört wird. Die Veränderung des Transmembranpotentials durch einen externen Stimulus wird durch folgende Gleichung beschrieben:
ΔVm = fEextr cos φ
Vra ist das Transmembranpotential und f ist ein Formfaktor, der den Einfluss der Zelle auf die extrazelluläre Feldverteilung beschreibt. fEex beschreibt das angelegte elektrische Feld, r den Radius der Zelle und φ den Winkel zu dem extern angelegten elektrischen Feld. Der Faktor f wird häufig mit 1,5 angegeben, ist allerdings von vielen anderen Einflüssen abhängig. Die Elektroporation der Zellen ist erfolgreich, wenn das angelegte elektrische Feld die Kapazität der Zellmembran übersteigt, d.h. ΔVm ist größer als ein Schwellenwert ΔVS, der mit IV angegeben wird (Kinosita, K., Jr. und Tsong, T. Y. (1977) Nature 268, 438-441). Da der Aufbau der Zellmembran als Bilayer ein gemeinsames Merkmal eukaryotischer Zellen ist, variiert dieser Wert wenig für verschiedene Zelllinien.
Durch den bielektrischen Zusammenbruch des Transmembranpotentials werden transient hydrophile Poren gebildet, durch die Wasser in die Zelle eindringt, welches Moleküle wie z.B. Nukleinsäuren in die Zellen transportiert (Weaver, J.C. (1995) Methods Mol. Biol. 55, 3-28; Neumann, E. et al. (1999) Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3-16).
Vor der Elektroporation wurden die verwendeten adhärenten Zellen bis zur semi- Konfluenz kultiviert, mit PBS gewaschen und mit Trypsin von den Zellkulturflaschen abgelöst. Die Zellen wurden in Medium mit 10% FCS (fetales Kälberserum) überführt und 8min bei 500 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in dem serumfreien Medium X- Vivo resuspendiert und wiederum 8min bei 500 x g zentrifugiert. Dieser Waschvorgang erfolgte noch zwei weitere Male um Reste von FCS zu entfernen, die die nachfolgende Elektroporation stören würden.
Nach dem Waschen wurden die Zellen in 250μl auf die gewünschte Zelldichte eingestellt, in die Elektroporationsküvetten überführt und auf Eis gestellt. Nach Zugabe der entsprechenden Menge in vitro transkribierter RNA unter gründlichem Mischen wurde die Elektroporation bei 200V und 250μF durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen sofort in das adäquate Nährrnedium überführt und bei 370C und 5% CO2 inkubiert.
Beispiel 4: Etablierung der experimentellen Bedingungen und Charakterisierung des experimentellen Systems
Für die Etablierung der experimentellen Bedingungen wurde der Expressionsvektor eGFP- pGEM3Z Tail verwendet. Der 5'gelegene RNA-Polymerase-Promoter SP6 erlaubt eine in vitro Expression von RNA.
Die in vitro transkribierte eGFP RNA wurde im Folgenden dazu verwendet, die Transfektionseffizienz diverser Zelltypen zu testen. Die Bestimmung der Transfektionseffizienz erfolgte mit Hilfe des FACS-Kalibur über die Ermittlung der Fluoreszenzintensität des eFGP. Die Ermittlung der RNA-Menge in den Zellen erfolgte mit Hilfe einer quantitativen RT-PCR. Es konnte gezeigt werden, dass nicht nur Tumorzelllinien mit einer Effizienz von >90%, sondern auch primäre dendritische Zellen mit einer Effizienz von 70-80% transfiziert werden können (Abb. 2 und 3 und Tab. 1).
Tab. 1 : Transfektionseffizienzen diverser Zellen ermittelt nach Transfektion von 5x10 Zellen mit 20μg eGFP IVT RNA. Messung der Fluoreszenzintensität mit Hilfe des FACS-Kalibur 24h nach Transfektion. Transfektionsbedingungen: Elektroporation bei 200V und 250μF Des Weiteren konnte ein Einfluss der Zellzahl auf die TransfektionsefFizienz in einem Bereich zwischen 2x106 - 2x107 Zellen ausgeschlossen werden (Abb. 4). Auch die Elektroporationsbedingungen haben in dem getesteten Bereich keinen entscheidenden Einfluss auf die Transfektionseffizienz (Abb. 5).
Die Stabilität der RNA konnte über einen Zeitraum von 24h gezeigt werden (Abb. 6a) während das Protein, abhängig von seiner Halbwertszeit über einen Zeitraum von 48-72h in den Zellen nachgewiesen werden kann (Abb. 6b).
Eine direkte Abhängigkeit zwischen transfizierter RNA-Menge und zur Verfügung stehender Proteinmenge konnte gezeigt werden (Abb. 7).
Die methodenbedingten molekularen Veränderungen wurden mit Hilfe eines cDNA- Mikroarrays bestimmt. Es konnten nur nach 8h und 24h molekulare Veränderungen von Proteasom-assoziierten Genen, heat-shock-Genen und Apoptose-assoziierten Genen festgestellt werden (Tab. 2).
Tab. 2: Anzahl signifikant regulierter Gene in 2xlO 786-0 Zellen, die mit 20μg eGFP IVT RNA transfiziert wurden, im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrollzellen. Nur bei einer Regulation von >2 bzw. <0,5 handelt es sich um signifikante Veränderungen.
Die Aktivierung des Interferonsystems, die nach Einsatz von siRNA beschrieben ist (Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411, 494-498; Caplen, NJ. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 98, 9742-9747), bleibt aus.
Beispiel 5: IVT RNA Transfektion von Modellgenen
Um die Möglichkeiten und Beschränkungen der Transfektion von Zellen mit IVT RNA noch eingehender zu untersuchen, wurden verschiedene Modellgene als heterolog exprimierte IVT RNA in Zellen eingebracht. Als Modellgene wurden die gut charakterisierten Gene HIF 1-α (hypoxia inducible factor) und VHL (von-Hippel Lindau) verwendet. Der kodierende Bereich dieser Gene wurde mit Hilfe von cDNA aus Testisgewebe amplifiziert und in das für eGFP beschriebene Vektorsystem Moniert.
Für HIF 1-α und VHL sind diverse Zielgene beschrieben, deren Expression nach Transfektion einer defizienten Zelllinie bestimmt wurde. Nach Transfektion des Transkriptionsfaktors HIF 1-α ließ sich eine erhöhte Expression der Zielgene LDHA (Lactatdehydrogenase A), VEGF (vascular endothelial growth factor 1 alpha) und Glut-1 (Glucosetransporter 1) nachweisen (Abb. 8). Das Ausmaß ihrer Induktion lässt sich durch die Menge von transferierter HIF 1-α IVT RNA titrieren. Durch Transfer des Transkriptionsfaktors HIF 1-α ist eine robuste Regulation seiner Zielgene möglich. Durch Titration der Menge eingesetzter IVT RNA lassen sich auch die Transkriptmengen der durch HIFl-α induzierten Gene titrieren.
Die molekularen Effekte eines Transkriptionsfaktors sind nahezu direkt und unmittelbar nachweisbar. So bindet HIFI direkt an seine Consensussequenz im Promotorbereich seiner Zielgene (Semenza, GX. (2000) Genes Dev. 14, 1983-1991; Semenza, G.L. (2000) J. Appl. Physiol 88, 1474-1480) und initiiert unmittelbar deren Transkription. Um zu untersuchen, ob auch indirekte und sekundäre Effekte durch den IVT RNA Transfer manifestiert werden können, wurde das dem HIF 1-α vorgeschaltete pVHL (von-Hippel-Lindau) Protein als zweites Modellgen ausgewählt. pVHL gehört zu dem Komplex der Ubiquitin Ligase E3 und bewirkt die Degradation der alpha-Untereinheit von HIFI. Damit führt eine erhöhte Expression von VHL zu einer verminderten Konzentration von HIFI in den Zellen und damit verbunden zu einer verminderten Expression von HIFI -Zielgenen. Die zeitabhängige Abnahme der Expression von VEGF und LDHA konnte nach Transfektion von Zellen mit VHL eindeutig nachgewiesen werden (Abb. 9).
Beispiel 6: Identifikation bisher unbekannter Funktionen für putatitive onkogene Transkripte am Beispiel von SYT-SSXl und SYT-SSX2.
Die Methode des RNA-Transfers sollte eine rasche Entschlüsselung der tumorbiologischen Relevanz von Genen ermöglichen. Zur Verifizierung wurden die Fusionsprodukte der Gene SYT5 einem ubiquitär exprimierten Gen, und SSXl oder SSX2, CG-Genen, die nur in Testis und in Tumoren exprimiert werden, ausgewählt. Der Grund für die Auswahl dieser Gene war auf der einen Seite die Häufigkeit der Translokation t(X;18)(pl 1.2;ql 1.2) (Clark, J. et al. (1994) Nat. Genet. 7, 502-508; Crew, AJ. (1995) EMBO J. 14, 2333-2340) in über 90% der Synovialsarkome (Sreekantaiah,C. et al. (1994) Am. J. Pathol. 144, 1121-1134), was auf eine Relevanz bei der Biologie des Tumors und somit auf ein onkogenes Potential schließen lässt. Auf der anderen Seite enthalten die Fusionsprodukte eine transkriptions- aktivierende QPGY-Domäne, so dass unmittelbare molekulare Veränderungen als Folge der Translokation zu erwarten sind. Molekulare Effekte der Translokation und ihre Bedeutung in der Entstehung und Etablierung des Tumors sind bisher weitestgehend unbekannt. Die durch die Transfektion von SYT-SSXl und SYT-SSX2 IVT RNA ausgelösten molekularen Veränderungen wurden mit Hilfe von Affymetrix Oligonucleotid Mikroarrays analysiert. Nach Transfektion der Zellen mit SYT-SSXl und SYT-SSX2 konnte die erhöhte Expression von zahlreichen Genen nachgewiesen werden. Zu den regulierten Genen, die nach Transfektion nachgewiesen werden konnten, zählten vor allem Wachstumsfaktoren, neuronale Gene, Onkogene bzw. tumor-assoziierte Gene, aber auch solche, die eine Rolle in der Zellzyklusregulation oder der Signaltransduktion spielen (Abb. 12). Die differentielle Expression einiger dieser Gene wurde mit Hilfe einer quantitativen RT-PCR verifiziert (Abb. 13; Abb. 10). Zum Nachweis der funktionellen Relevanz dieser Gene in Synovialsarkomen wurde ihre Expression zusätzlich in Synovialsarkomen im Vergleich zu Normalgeweben bestimmt (Abb. 11).
Am Beispiel der Transfektion von SYT-SSXl und SYT-S SX2 konnte eindeutig gezeigt werden, dass es mit Hilfe des RNA-Transfers und der nachfolgenden Bestimmung der molekularen Veränderungen mit Hilfe von Affymetrix Oligonucleotid Mikroarrays möglich ist, die Bedeutsamkeit eines Gens in der Karzinogenese zu bestimmen. Direkte und indirekte Zielgene des transfizierten Gens werden ermittelt und tragen zu einem Verständnis der Funktion des Gens bei.
In Kombination mit den pharmakokinetischen Charakteristiken von IVT RNA bedeutet dies eine hervorragende Grundlage zur Entschlüsselung von Signaltransduktionskaskaden. Die Erstellung von Genexpressionsprofilen zu verschiedenen Zeitpunkten und ihre Analyse mit adäquaten Programmen sollte erlauben, durch Verlaufsdarstellung definierter Gencluster, sequentiell aktivierte Kaskaden von regulierten Genen aufzudecken. Somit ließe sich mit der Methode des RNA-Transfers die funktionelle Bedeutsamkeit bislang wenig charakterisierter Gene in der Karzinogenese aufklären. Außerdem lassen sich durch den anschließenden Transfer neu identifizierter Zielgene direkte und indirekte Effekte des transfizierten Gens aufdecken.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Untersuchung der Funktion einer Nukleinsäure und/oder eines Nukleinsäureexpressionsprodukts in einem Organismus, umfassend die Schritte:
(a) Einbringen von RNA5 die von der Nukleinsäure abgeleitet ist und/oder für einen Teil oder die gesamte Sequenz des Expressionsprodukts kodiert, in eine Wirtszelle;
(b) Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle, die sich aufgrund des Einbringens der RNA in die Wirtszelle ergeben; und
(c) Identifizierung einer oder mehrerer Funktionen der Nukleinsäure und/oder des Expressionsprodukts basierend auf den in Schritt (b) festgestellten Wirkungen auf die Wirtszelle.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die RNA durch Klonierung der dafür kodierenden Nukleinsäure und in vitro Transkription erhalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die in vitro Transkription durch einen T7- , T3 oder SP6-Promotor gesteuert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Nukleinsäure in Kombination mit einer Polyadenylkassette vorliegt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die RNA eine Polyadenylierung einer definierten Länge aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die RNA eine Cap-Struktur aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Einbringen der RNA in die Wirtszelle eine Expression des durch die RNA kodierten Expressionsprodukts bewirkt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Expressionsprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Enzymen, Hormonen und Antikörpern .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Untersuchung von phänotypischen und/oder biochemischen Merkmalen der Wirtszelle umfasst.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Untersuchung des Protein-Expressionsprofils (Proteomanalyse) der Wirtszelle umfasst.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Untersuchung des RNA-Expressionsprofils (Transkriptomanalyse) der Wirtszelle umfasst.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Untersuchung des Stoffwechsels der Wirtszelle umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Untersuchung des Stoffwechsels eine Untersuchung der Anhäufung von Substraten oder Produkten von enzymatischen Reaktionen umfasst.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Untersuchung der Regulation von Genen umfasst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle im Vergleich mit einer Zelle erfolgt, in die die RNA nicht eingebracht wurde.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle eine Komplementationsanalyse umfasst.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Wirtszelle eine pro- oder eukaryontische Zelle ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Einbringen von RNA in die Wirtszelle mit Hilfe von Elektroporation oder Liposomen erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Untersuchung von Wirkungen auf die Wirtszelle mit Hilfe einer High-Density-Microarray- Anordnung erfolgt.
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