EP1831358A2 - Verfahren zur herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen fettsäuren in transgenen organismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen fettsäuren in transgenen organismen

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Publication number
EP1831358A2
EP1831358A2 EP05821795A EP05821795A EP1831358A2 EP 1831358 A2 EP1831358 A2 EP 1831358A2 EP 05821795 A EP05821795 A EP 05821795A EP 05821795 A EP05821795 A EP 05821795A EP 1831358 A2 EP1831358 A2 EP 1831358A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
nucleic acid
acyl
fatty acids
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05821795A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Petra Cirpus
Jörg BAUER
Ernst Heinz
Amine Abbadi
Jelena Kirsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Priority to EP09179432.1A priority Critical patent/EP2180046B1/de
Publication of EP1831358A2 publication Critical patent/EP1831358A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing polyunsaturated fatty acids in an organism by introducing into the organism nucleic acids encoding polypeptides having acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity.
  • these nucleic acid sequences may optionally be used together with others
  • Nucleic acid sequences encoding polypeptides of the fatty acid or lipid metabolism are expressed in the transgenic organism.
  • the invention furthermore relates to the nucleic acid sequences according to the invention, nucleic acid constructs containing the nucleic acid sequences according to the invention, vectors comprising the nucleic acid sequences according to the invention and / or the nucleic acid constructs and transgenic organisms containing the aforementioned nucleic acid sequences, nucleic acid constructs and / or vectors.
  • Another part of the invention relates to oils, lipids and / or fatty acids prepared by the process according to the invention and their use.
  • Fatty acids and triglycerides find a variety of uses in the
  • polyunsaturated fatty acids are added to the baby formula to increase the nutritional value.
  • Polyunsaturated ⁇ -3 and ⁇ -6 fatty acids represent an important component of animal and human food. Due to the composition of human food that is customary today, an addition of polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids, which occur mainly in fish oils , to Food especially important.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • the polyunsaturated ⁇ -3 fatty acids are also considered to have a positive effect on the blood cholesterol level and thus on the possibility of preventing heart disease.
  • ⁇ -3 fatty acids By adding these ⁇ -3 fatty acids to the diet, the risk of heart disease, stroke or hypertension can be significantly reduced.
  • inflammatory, especially chronic inflammatory processes in the context of immunological diseases such as rheumatoid arthritis can be positively influenced by ⁇ -3-fatty acids. They are therefore added to foods, especially dietary foods, or are used in medicines.
  • ⁇ -6 fatty acids such as arachidonic acid tend to have a negative effect on these diseases in these rheumatic diseases due to our usual food composition.
  • ⁇ -3 and ⁇ -6 fatty acids are precursors of tissue hormones, the so-called eicosanoids such as the prostaglandins derived from dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid and eicosapentaenoic acid, and the thromboxanes and leukotrienes derived from arachidonic acid and eicosapentaenoic acid.
  • Eicosanoids which are formed from ⁇ -6 fatty acids (so-called PG 2 series), usually promote inflammatory reactions, while eicosanoids from ⁇ -3 fatty acids (so-called PG 3 series) have little or no pro-inflammatory effect.
  • polyunsaturated fatty acids are referred to as PUFAs, PUFAs, LCPUFAs or LCPUFAs
  • PUFA polyhydric fatty acid
  • PUFA long-chain unsaturated fatty acid
  • the free fatty acids are advantageously prepared by saponification.
  • Common natural sources of these fatty acids are fish such as herring, salmon, sardine, perch, eel, carp, trout, halibut, mackerel, zander or tuna, and algae.
  • ⁇ 6-desaturases are described in WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022, WO00 / 21557 and WO 99/27111, during their use for the production of fatty acids in transgenic organisms in WO98 / 46763, WO98 / 46764 and WO98 / 46765.
  • the expression of various desaturases as in WO99 / 64616 or WO98 / 46776 and formation of polyunsaturated fatty acids is also described and claimed.
  • microorganisms for the production of PUFAs are microorganisms such as Thraustochytrien- or Schizochytrien- strains, algae such as Phaeodactylum tricornutum or Crypthecodinium species, ciliates such as Stylonychia or Colpidium and fungi such as Mortierella, Entomophthora or Mucor.
  • Thraustochytrien- or Schizochytrien- strains such as Phaeodactylum tricornutum or Crypthecodinium species
  • ciliates such as Stylonychia or Colpidium
  • fungi such as Mortierella, Entomophthora or Mucor.
  • mutation and selection of strains with improved production of a particular molecule, such as polyunsaturated fatty acids is a time-consuming and difficult procedure.
  • microalgae such as Phaeodactylum and mosses such as Physcomitrella are unsaturated fatty acids such as linoleic acid or linolenic acid in the form of their acyl CoAs in several
  • LCPUFAs are present in microorganisms and lower plants either exclusively in the form of membrane lipids, as in Physcomitrella and Phaeodactylum, or are present in both membrane lipids and in triacylglycerides, as in Schizochytrium and Moriierella.
  • the incorporation of LCPUFAs into lipids and oils is catalyzed by various acyltransferases and transacylases already known for the incorporation of saturated and unsaturated fatty acids (Slabas (2001) J. Plant Physiology 158: 505-513; Frentzen (1998) Fat / Lipid 100: 161-166; Cases et al. (1998) Proc. Nat.
  • acyltransferases are enzymes of the so-called Kennedy pathway located on the cytoplasmic side of the endoplasmic reticulum membrane system, hereafter referred to as 'ER'.
  • 'ER' cytoplasmic side of the endoplasmic reticulum membrane system
  • membranes of the ER can be isolated as so-called 'microsomal fractions' from various organisms (Knutzon et al., (1995) Plant Physiology 109: 999-1006, Mishra & Kamisaka (2001) Biochemistry 355: 315-322, US 5968791).
  • ER-linked acyltransferases in the microsomal fraction use acyl-CoA as the activated form of the fatty acids.
  • Glycerol-3-phosphate acyltransferase catalyzes the incorporation of acyl groups at the sn-1 position of glycerol-3-phosphate.
  • l-Acylglycerol-3-phosphate acyltransferase (EC 2.3.1.51), also called lysophosphatidic acid acyltransferase, hereafter LPAAT, catalyzes the incorporation of acyl groups at the sn-2 position of lysophosphatidic acid, hereinafter abbreviated as LPA.
  • DAGAT diacylglycerol acyltransferase
  • PDAT phospholipid diacylglycerol acyltransferase
  • LPCAT lysophosphatidylcholine acyltransferase
  • LPCAT The enzymatic activity of a LPCAT was first described in rats (Land (1960) J. Biol. Chem. 235: 2233-2237). In plants, there exists a plastidic isoform of LPCAT (Akermoun et al., (2000) Biochemical Society Transactions 28: 713-715) and an ER-linked isoform (Tumaney and Rajasekharan (1999) Biochimica et Biophysica Acta 1439: 47-56; Stobart, Biochemical Society Transactions (2000) 28: 715-7718). LPCATs are involved in the biosynthesis and transacylation of polyunsaturated fatty acids in both animals and plants (Stymne and Stobart (1984) Biochem J.
  • LPCAT lysophospholipid acyltransferase
  • linoleic acid Cl 8: 2 and linolenic acid (Cl 8: 3).
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • genes encoding enzymes of the biosynthesis of LCPUFAs in oilseeds are advantageously introduced and expressed via genetic engineering methods. These are, for example, genes encoding a ⁇ 6-desaturase, ⁇ 6-elongase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ 5-elongase and ⁇ 4-desaturase.
  • ⁇ 6-desaturase genes from the moss Physcomitrella patens and ⁇ 6 elongase genes from P. patens and the nematode C. elegans have already been isolated.
  • SEQ ID NO: 5 which encode a polypeptide having an acyl-CoA3sophospholipid acyltransferase activity
  • nucleic acid sequences which can be deduced as a result of the degenerate genetic code from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5; or
  • the polyunsaturated fatty acids prepared in the process according to the invention contain at least two, advantageously three double bonds. Particularly advantageously, the fatty acids contain four or five double bonds.
  • Fatty acids produced in the process advantageously have 16, 18, 20 or 22 C atoms in the fatty acid chain. These fatty acids can be produced as the only product in the process or in a fatty acid mixture.
  • nucleic acid sequences used in the method of the invention are isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides having acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the process are advantageously bound in membrane lipids and / or triacylglycerides, but may also be present as free fatty acids or bound in the form of other fatty acid esters in the organisms. As stated, they may be present as "pure products" or else advantageously in the form of mixtures of different fatty acids or mixtures of different glycerides.
  • the different fatty acids bound in the triacylglycerides can be derived from short-chain fatty acids having 4 to 6 C atoms, medium-chain fatty acids having 8 to 12 C atoms or long-chain fatty acids having 14 to 24 C atoms; preference is given to long-chain fatty acids the long-chain C 18 , C 20 and / or C22 fatty acids (LCPUFAs).
  • fatty acid esters with polyunsaturated C 16 , C 18 , C 20 and / or C 22 fatty acid molecules having at least two double bonds in the fatty acid ester.
  • the fatty acid ester with polyunsaturated C 16 -, C 18 -, C 2 0 - and / or C22-fatty acid molecules can be isolated from the organisms which have been used for the production of the fatty acid ester, in the form of an oil or lipid, for example in the form of compounds such as sphingolipids , Phosphoglycerides, lipids, glycolipids such as glycosphingolipid, phospholipids such as phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol or diphosphatidylglycerol, monoacylglycerides, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters such as the acetyl-coenzymeA esters containing the polyunsaturated fatty acids having at least two, preferably three , Containing double bonds, to be
  • Fatty acids in the organisms in an approximate distribution of 80 to 90% by weight of triglycerides, 2 to 5% by weight of diglycerides, 5 to 10% by weight of monoglycerides, 1 to 5% by weight of free fatty acids, 2 to 8 Wt .-% phospholipids, wherein the sum of the various compounds to 100 wt .-% complements.
  • the LCPUFAs produced are present in a content of at least 3% by weight, advantageously at least 5% by weight, preferably at least 8% by weight, more preferably at least 10% by weight, most preferably at least 15% by weight, based on the total fatty acids in the transgenic organisms, advantageously a transgenic plant.
  • a content of at least 3% by weight advantageously at least 5% by weight, preferably at least 8% by weight, more preferably at least 10% by weight, most preferably at least 15% by weight, based on the total fatty acids in the transgenic organisms, advantageously a transgenic plant.
  • Hexadecadienoic acid (Cl 6: 2), linoleic acid (Cl 8: 2) or linolenic acid (Cl 8: 3) are passed through several reaction steps, the end products of the process fall as For example, arachidonic acid (ARA) or eicosapentaenoic acid (EPA) not as absolute pure products, but there are always low levels of precursors in the final product. If both linoleic acid and linolenic acid are present in the starting organism or in the starting plant, for example, the end products such as ARA and EPA are present as mixtures.
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the precursors should advantageously not more than 20 wt .-%, preferably not more than 15 wt .-%, more preferably not more than 10 wt .-%, most preferably not more than 5, 4, 3, 2, 1 wt .-%, based on the amount of the respective end product.
  • ARA or only EPA in the process according to the invention are advantageously bound as end products or prepared as free fatty acids. If both compounds (ARA + EPA) are prepared simultaneously, they are advantageously prepared in a ratio of at least 1: 2 (EPA: ARA), preferably of at least 1: 3, preferably of at least 1: 4, more preferably of at least 1: 5 ,
  • Fatty acid compositions can be prepared by the methods described above.
  • the fatty acids or fatty acid compositions from the organism such as the microorganisms or the plants or the culture medium in which or on which the organisms were grown, or from the organism and the culture medium in a known manner, for example via extraction,
  • organisms such as fungi such as Mortierella or Traustochytrium, yeasts such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces, mosses such as Physcomitrella or.
  • Ceratodon non-human animals such as Caenorhabditis, algae such as Crypthecodinium or Phaeodactylum or plants such as dicotyledonous or monocotyledonous plants in question.
  • organisms are used which belong to the oil-producing organisms, that is, which are used for the production of oils, such as mushrooms such as Mortierella or
  • Traustochytrium algae such as Crypthecodinium or Phaeodactylum or plants, especially oil crops containing high levels of lipid compounds such as peanut, canola, canola, sunflower, safflower (safflower), poppy, mustard, hemp, castor, olive, sesame, calendula, punica, Evening Primrose, Mullein, Thistle, Wild Rose, Hazelnut, Almond, Macadamia, avocado, Bay Leaf, Pumpkin, Linseed, Soya, Pistachios, Borage, Trees (Oil Palm, Coconut or Walnut) or Crops such as Corn, Wheat, Rye, Oats, Triticale, Rice , Barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solanaceous plants such as potato, tobacco, aubergine and tomato, Vicia species, pea, alfalfa or bush plants (coffee, cocoa, tea), Salix species and perennial grasses and forage crops.
  • lipid compounds such as peanut
  • Preferred plants according to the invention are oil crop plants, such as peanut, oilseed rape, canola, sunflower, safflower, poppy, mustard, hemp, castor, olive, calendula, punica, evening primrose, pumpkin, flax, soy, borage, trees (oil palm, coconut) , Particularly preferred are Cl 8: 2 and / or C18: 3 fatty acid-rich plants such as sunflower, safflower, tobacco, mullein, sesame, cotton, pumpkin, poppy, evening primrose, walnut, flax, hemp, thistle or safflower. Most preferred are plants such as safflower, sunflower, poppy, evening primrose, walnut, flax or hemp.
  • genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be used in combination with the inventive acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase in the process for producing polyunsaturated fatty acids; genes of the fatty acid or lipid metabolism are advantageously selected from the group consisting of acyl-CoA Dehydrogenase (s), acyl-carrier protein-desaturase (s), acyl-ACP-thioesterase (s), fatty acid acyltransferase (s), fatty acid synthase (s), fatty acid hydroxylase ( n), acetyl coenzyme A carboxylase (s), acyl coenzyme A oxidase (s), fatty acid desaturase (s), fatty acid
  • genes selected from the group of ⁇ -4-desaturases, ⁇ -5-desaturases, ⁇ -6-desaturases, ⁇ -8-desatuases, ⁇ -9-desaturases, ⁇ -12-desaturases, ⁇ -5-elongases , ⁇ 6-elongases or ⁇ 9-elongases in combination with the inventive acyl-CoAiLysophospholipid acyltransferase used in the inventive method.
  • nucleic acids used in the method according to the invention which code for polypeptides having acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity, advantageously in combination with nucleic acid sequences which are suitable for polypeptides of fatty acid or lipid metabolism with ⁇ -4-, ⁇ -5-, ⁇ Encode ⁇ 6- ⁇ , ⁇ -8-desaturase or ⁇ -5, ⁇ -6 or ⁇ -9-Elongasecrettician, a variety of polyunsaturated fatty acids can be prepared in the process according to the invention.
  • the organisms used for the process according to the invention such as the advantageous plants, it is possible to use mixtures of the various polyunsaturated ones
  • fatty acids or individual polyunsaturated fatty acids such as EPA or ARA in free or bound form.
  • Fatty acids are produced as fatty acids derived from C18: 2 fatty acids, such as GLA, DGLA or ARA or those derived from C18: 3 fatty acids, such as SDA, ETA or EPA.
  • GLA, DGLA and ARA are produced as fatty acids derived from C18: 2 fatty acids, such as GLA, DGLA or ARA or those derived from C18: 3 fatty acids, such as SDA, ETA or EPA.
  • SDA, ETA and EPA can be produced as products of the process which, like may be present as free fatty acids or bound.
  • lysophospholipid acyltransferase advantageous in combination with the ⁇ -5 and ⁇ -6-desaturase and the ⁇ -6 elongase, or the ⁇ -5 and ⁇ -8 Desaturase and the ⁇ -9 elongase or in combination with only the first two genes of the synthesis chain, ⁇ -6-desaturase and ⁇ -6 elongase or ⁇ -8-desaturase and ⁇ -9 elongase, can be in the aforementioned Organisms, advantageously in the aforementioned plants, selectively produce only individual products.
  • ⁇ -6-desaturase and ⁇ -6 elongase Due to the activity of ⁇ -6-desaturase and ⁇ -6 elongase, depending on the starting plant and unsaturated fatty acid, for example, GLA and DGLA or SDA and ETA are formed. Preference is given to DGLA or ETA or mixtures thereof. If, in addition, ⁇ 5-desaturase is introduced into the organisms, advantageously into the plant, ARA or EPA are also produced. This also applies to organisms in which the ⁇ -8-desaturase and ⁇ -9 elongase were previously introduced.
  • the nucleic acids used in the method according to the invention are advantageously derived from plants such as algae such as Isochrysis or Crypthecodinium, algae / diatoms such as Phaeodactylum, mosses such as Physcomitrella or Ceratodon or higher plants such as Primulaceae such as Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens or Osteospermum hyoseroides, microorganisms such as fungi Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor or Mortierella, yeasts or animals such as nematodes such as Caenorhabditis, insects or humans.
  • the nucleic acids are derived from fungi, animals or from plants such as algae or mosses, preferably from nematodes such as Caenorhabditis.
  • Nucleic acid sequences or their derivatives or homologs which code for polypeptides which still possess the enzymatic activity of the proteins encoded by the wild-type nucleic acid sequences. These sequences are individually or in combination with the coding for the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase nucleic acid sequence in expression constructs and used for introduction and expression in organisms. These expression constructs enable optimal synthesis of the polyunsaturated fatty acids produced in the process according to the invention.
  • the method further comprises the step of recovering a cell or a whole organism containing the nucleic acid sequences used in the method, wherein the cell and / or the organism with the nucleic acid sequence according to the invention, which for the acyl CoA: lysophospholipid acyltransferase, a gene construct or a vector as described below, alone or in combination with other nucleic acid sequences coding for proteins of the fatty acid or lipid metabolism is transformed.
  • this method further comprises the step of recovering the fine chemical from the culture.
  • the culture may be, for example, a fermentation culture, for example in the case of culturing microorganisms such as Mortierella, Saccharomyces or Traustochytrium, or a greenhouse or field crop of a plant.
  • the cell or organism thus produced is advantageously a cell of an oil-producing organism such as an oil crop such as peanut, canola, canola, flax, hemp, peanut, soybean, safflower, hemp, sunflower or borage.
  • cultivation is to be understood as cultivation on or in a nutrient medium or, in the case of the whole plant, cultivation on or in a substrate, for example in hydroponics, potting soil or on arable land.
  • a genetically linked to the nucleic acid sequence according to the invention genetic control sequence for example a promoter or c) (a) and (b)
  • modification may exemplarily be a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues.
  • Natural genetic environment means the natural genomic or chromosomal locus in the organ of origin or presence in a genomic library.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • non-natural, synthetic ("artificial") methods such as For example, a mutagenization is changed.
  • a mutagenization is changed.
  • Corresponding methods are described, for example, in US Pat. No. 5,565,350 or WO 00/15815.
  • transgenic organism or transgenic plant is to be understood as meaning that the nucleic acids used in the method are not in their natural position in the genome of an organism, wherein the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • transgene also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or that the regulatory sequences of the natural sequences have been altered. Is preferred Under transgenic to understand the expression of the nucleic acids according to the invention at unnatural site in the genome, that is, a homologous or preferably heterologous expression of the nucleic acids is present.
  • Preferred transgenic organisms are fungi such as Mortierella or plants such as oil crops.
  • all organisms which are able to synthesize fatty acids, especially unsaturated fatty acids, or which are suitable for the expression of recombinant genes are suitable in principle as organisms or host organisms for the nucleic acids, expression cassettes or vectors used in the method according to the invention.
  • plants such as Arabidopsis, Asteraceae such as calendula or crops such as soy, peanut, castor, sunflower, corn,
  • microorganisms such as fungi of the genus Mortierella, Saprolegnia or Pythium, bacteria such as the genus Escherichia, yeasts such as the genus Saccharomyces, cyanobacteria, ciliates, algae or protozoans such as Dinoflagellates called Crypthecodinium.
  • Organisms that can naturally synthesize oils in larger quantities such as fungi, e.g. Mortierella alpina, Pythium insidiosum or plants such as soybean, oilseed rape, coconut, oil palm, Klarbersafflor, flax, hemp, castor, calendula, peanut, cocoa or sunflower or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, particularly preferred are soy, flax, rape, Desirbersafflor, sunflower, Calendula, Morierella or Saccharomyces cerevisiae.
  • transgenic animals advantageously non-human animals such as C. elegans are suitable as host organisms in addition to the aforementioned transgenic organisms.
  • Transgenic plants which contain the polyunsaturated fatty acids synthesized in the process according to the invention can advantageously be marketed directly, without the synthesized oils, lipids or fatty acids having to be isolated.
  • Plants in the method according to the invention include whole plants and all plant tissues, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, calli, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • the seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
  • the compounds prepared in the process according to the invention can also be isolated from the organisms, advantageously plants, in the form of their oils, fats, lipids and / or free fatty acids. Because of this
  • Processed polyunsaturated fatty acids can be obtained by harvesting the organisms either from the culture in which they grow or from the field. This can be done by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils, fats, lipids and / or free fatty acids can be obtained by so-called cold striking or cold pressing without supplying heat by pressing.
  • the plant parts, especially the seeds, to be easier to digest they are first crushed, steamed or roasted. The pretreated seeds can then be pressed or extracted with solvents such as warm hexane. Subsequently, the solvent is removed again.
  • microorganisms these are, for example, extracted directly after the harvest, without further operations, or after digestion, extracted by various methods known to the person skilled in the art. In this way, more than 96% of the compounds produced in the process be isolated. Subsequently, the products thus obtained are further processed, that is refined. First of all, for example, the mucilages and turbid matter are removed. The so-called degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid, such as phosphoric acid. Subsequently, the free fatty acids are removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution. The product obtained is thoroughly washed with water to remove the lye remaining in the product and dried. In order to remove the dyes still contained in the product, the products are subjected to bleaching with, for example, bleaching earth or activated carbon. Finally, the product is deodorized, for example, with steam.
  • the PUFAs or LCPUFAs produced by this process are C 18 , C 20 or C 22 fatty acid molecules having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably three, four, five or six double bonds.
  • These C 18 -, C 2 0 - or C22-fatty acid molecules can be prepared from the organism in the form of an oil, lipid or a free fatty acid isolate. Suitable organisms are, for example, those mentioned above. Preferred organisms are transgenic plants.
  • One embodiment of the invention is therefore oils, lipids or fatty acids or fractions thereof prepared by the method described above, more preferably oils, lipids or a fatty acid composition comprising PUFAs derived from transgenic plants.
  • Another embodiment of the invention is the use of the oil, lipid, fatty acids and / or fatty acid composition in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • oil is understood as meaning a fatty acid mixture which contains unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s).
  • P refers in that the oil, lipid or fat contains a high proportion of polyunsaturated free or favorably esterified fatty acid (s), in particular linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, ⁇ -linolenic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid.
  • the proportion of unsaturated esterified fatty acids is about 30%, more preferred is a proportion of 50%, most preferred is a proportion of 60%, 70%, 80% or more.
  • the proportion of a fatty acid can be determined by gas chromatography, for example, after conversion of the fatty acids into the methyl esters by transesterification.
  • the oil, lipid or fat may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, eg calendulic acid, palmitic, palmitoleic, stearic, oleic acid, etc. In particular, depending on the starting organism, the proportion of the various fatty acids in the oil or fat may vary.
  • the polyunsaturated fatty acids having advantageously at least two double bonds produced in the process are, for example, sphingolipids, phosphoglycerides, lipids, glycolipids, phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol, triacylglycerol or other fatty acid esters.
  • the polyunsaturated fatty acids having advantageously at least two double bonds prepared in the process according to the invention can be added, for example, via a
  • Alkali treatment for example, with aqueous KOH or NaOH, or acid hydrolysis advantageously in the presence of an alcohol such as methanol or ethanol or release via an enzymatic cleavage and isolate, for example, phase separation and subsequent acidification with eg H 2 SO 4 .
  • the release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
  • the nucleic acids used in the method can either lie on a separate plasmid or be integrated into the genome of the host cell.
  • integration When integrated into the genome, integration may be at random or by such recombination as to replace the native gene with the incorporated copy, thereby modulating the production of the desired compound by the cell, or by using a gene in trans such that Gene having a functional expression unit, which contains at least one expression of a gene ensuring sequence and at least one polyadenylation of a functionally transcribed gene ensuring sequence is operably linked.
  • the nucleic acids are advantageously brought into the organisms via multi-expression cassettes or constructs for multiparallel expression, advantageously for multiparallel, seed-specific expression of genes in the plants.
  • Moose and algae are the only known plant systems that produce significant amounts of polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid (ARA) and / or eicosapentaenoic acid (EPA) and / or docosahexaenoic acid (DHA).
  • ARA arachidonic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Moose contain PUFAs in membrane lipids, while algae, algae-related organisms and some fungi also accumulate appreciable levels of PUFAs in the triacylglycerol fraction.
  • nucleic acid molecules isolated from strains which also accumulate PUFAs in the triacylglycerol fraction are particularly advantageous for the process of the invention and thus for modification of the lipid and PUFA production system in a host, in particular plants such as oilseed crops, for example oilseed rape. Canola, flax, hemp, soy, sunflower, borage. They are therefore advantageous for use in the process according to the invention.
  • Suitable substrates of the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases according to the invention are advantageously C 16 , C 18 , C 20 or C 22 fatty acids.
  • the polyunsaturated C 16 - or C 18 -fatty acids must first be desaturated by the enzymatic activity of a desaturase and then be extended by at least two carbon atoms via an elongase. After one round of elongation, this enzyme activity leads to C 18 or C 20 fatty acids, and after two or three elongation cycles to C 22 or C 2 4 fatty acids.
  • the activity of the desaturases and elongases used in the process of the invention preferably leads to C 18 -, C 2 0 - and / or C22-fatty acids, advantageously with at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably with three, four or five double bonds, especially preferably to C2 0 - and / or C22 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid molecule, preferably having three, four or five double bonds in the molecule.
  • Particularly preferred as products of the process according to the invention are dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid and / or docosahexaenoic acid.
  • the C 18 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid can be extended by the enzymatic activity according to the invention in the form of the free fatty acid or in the form of the esters, such as phospholipids, glycolipids, sphingolipids, phosphoglycerides, monoacylglycerol, diacylglycerol or triacylglycerol.
  • the preferred biosynthesis site of fatty acids, oils, lipids or fats in the advantageously used plants is, for example, the seed in general or cell layers of the seed, so that a seed-specific expression of the nucleic acids used in the method makes sense.
  • biosynthesis of fatty acids, oils or lipids need not be limited to the seed tissue, but also in all other parts of the plant - For example, in epidermis cells or in the tubers - can be made tissue-specific.
  • the amount of polyunsaturated fatty acids produced in the process can be at least 10%, preferably at least 15%, particularly preferably at least 20%, very particularly preferably at least 50%, and most preferably at least 100%, of the wild type of organisms which do not recombinantly contain the nucleic acids.
  • the polyunsaturated fatty acids produced in the organisms used in the process can in principle be increased in two ways.
  • the pool of free polyunsaturated fatty acids and / or the proportion of esterified polyunsaturated fatty acids produced by the process can be increased.
  • the process according to the invention increases the pool of esterified polyunsaturated fatty acids in the transgenic organisms.
  • microorganisms such as yeasts such as Saccharomyces or Schizosaccharomyces, fungi such as Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor or Traustochytrium, algae such as Isochrysis, Phaeodactylum or Crypthecodinium are used in the process according to the invention, these organisms are advantageously cultivated by fermentation in a manner known to those skilled in the art or bred.
  • Microorganisms are usually found in a liquid medium that is a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is, regulated during cultivation, or not.
  • the cultivation can be batchwise, semi-batchwise or continuous. Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the polyunsaturated fatty acids prepared can be isolated from the organisms by methods known to those skilled in the art, for example by extraction, distillation, crystallization, optionally salt precipitation and / or chromatography as described above. The organisms can be opened up for this purpose yet advantageous.
  • the method according to the invention when the host organisms are microorganisms, is advantageously at a temperature between 0 ° C to 95 ° C, preferably between 10 ° C to 85 ° C, more preferably between 15 ° C to 75 ° C, and most preferably carried out between 15 ° C to 45 ° C
  • the pH is advantageously maintained between pH 4 and 12, preferably between pH 6 and 9, more preferably between pH 7 and 8.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • a summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel (Bioreatechnik 1.
  • the culture medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various Microorganisms are included in the Manual of Method for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • these media which can be used according to the invention usually comprise one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • very good sources of carbon are glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar may also be added to the media via complex compounds, such as molasses or other by-products of sugar refining. It may also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible sources of carbon are oils and fats such. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and / or coconut oil, fatty acids such.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia in liquid or gaseous form or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean meal, soy protein, yeast extract, meat extract and others.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds which may be included in the media include the chloride, phosphate or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • sulfur-containing fine chemicals in particular methionine
  • inorganic sulfur-containing compounds such as sulfates, sulfites, dithionites, tetrathionates, thiosulfates, sulfides but also organic sulfur compounds, such as mercaptans and thiols can be used.
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts can be used as the phosphorus source.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the invention used for the cultivation of microorganisms
  • Fermentation media usually also contain other growth factors such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts are often derived from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor, and the like.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the exact composition of the media compounds will depend heavily on the particular experiment and will be decided on a case by case basis. Information on the media optimization are available from the textbook "Applied Microbiol Physiology, A Practical Approach” (Ed PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be from commercial providers such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, sterilized separately.
  • Media components may be present at the beginning of the culture or optionally added continuously or in batches.
  • the temperature of the culture is usually between 15 ° C and 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably 7.0.
  • the pH for cultivation can be controlled during cultivation by addition of basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • B. fatty acid polyglycol esters are used.
  • the medium can be selected selectively acting substances such. As antibiotics, are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. B. ambient air, registered in the culture. The culture is continued until a maximum of the desired product has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.
  • the fermentation broths thus obtained in particular containing polyunsaturated fatty acids, usually have a dry matter content of 7.5 to 25% by weight.
  • the fermentation broth can then be further processed.
  • the biomass can be wholly or partly by separation methods, such. As centrifugation, filtration, decantation or a combination of these methods are removed from the fermentation broth or completely left in it.
  • the biomass is worked up after separation.
  • the fermentation broth can also without cell separation with known methods such.
  • production or productivity are known in the art and include the concentration of the fermentation product (compounds of formula I) formed in a given period of time and fermentation volume (e.g., kg of product per hour per liter).
  • concentration of the fermentation product compounds of formula I
  • fermentation volume e.g., kg of product per hour per liter
  • Production includes the time it takes to reach a given production quantity (eg how long the cell needs to set up a specific throughput rate of a fine chemical).
  • yield or product / carbon yield is known in the art and includes the efficiency of converting the carbon source into the product (ie, the fine chemical). This is usually expressed, for example, as kg of product per kg of carbon source.
  • biosynthesis or biosynthetic pathway are known in the art and involve the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediates, for example in a multi-step and highly regulated process.
  • Degradation or degradation pathways are known in the art and involve the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), for example in a multi-step and highly regulated process.
  • metabolism is known in the art and includes the entirety of the biochemical reactions that take place in an organism.
  • the metabolism of a particular compound eg, the metabolism of a fatty acid
  • the fatty acids obtained in the process are also suitable as starting material for the chemical synthesis of further products of value.
  • they may be used in combination with each other or alone for the production of pharmaceuticals, foods, pet foods or cosmetics.
  • the invention furthermore relates to isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides with acyl CoAiLysophospholipid acyltransferase activity which specifically C 16 -, C 18 -, C 20 - or C 22 fatty acids reacted with at least one double bond in the fatty acid molecule, wherein said nucleic acid sequences are selected from the group consisting of:
  • nucleic acid sequences which, as a result of the degenerate genetic code, can be deduced from the coding sequence contained in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5,
  • nucleic acid sequences originate from a eukaryotic organism, more preferably from Ostreococcus tauri or Mantoniella squamata.
  • the nucleic acids used in the method are advantageously subjected to amplification and ligation in a known manner.
  • one is based on the protocol of Pfu DNA polymerase or a
  • the primers are selected on the basis of the sequence to be amplified. Conveniently, the primers should be chosen so that the amplificate comprises the entire codogenic sequence from the start to the stop codon.
  • the amplificate is conveniently analyzed. For example, the analysis can be carried out after gel electrophoretic separation in terms of quality and quantity.
  • the amplificate can be purified according to a standard protocol (e.g., Qiagen). An aliquot of the purified amplificate is then available for subsequent cloning. Suitable cloning vectors are well known to those skilled in the art. These include in particular vectors that are in microbial infections, etc.
  • T-DNA-mediated transformation various suitable for the T-DNA-mediated transformation, binary and co-integrated vector systems.
  • Such vector systems are usually characterized in that they contain at least the vir genes required for the Agrobacterium-mediated transformation as well as the T-DNA-limiting sequences (T-DNA border).
  • these vector systems also include other cis-regulatory regions, such as promoters and terminators and / or selection markers, with which appropriately transformed organisms can be identified.
  • binary systems are based on at least two vectors, one of them vir genes, but no T-DNA and a second T-DNA, but no carries vir gene.
  • these binary vectors include vectors of the series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen.
  • Preferably used according to the invention are pBin19, pBH01, pBinAR, pGPTV and pCAMBIA.
  • the vectors can first be linearized with restriction endonuclease (s) and then enzymatically modified in a suitable manner. The vector is then purified and an aliquot used for cloning. Upon cloning, the enzymatically cut and, if necessary, purified amplicon is cloned with similarly prepared vector fragments using ligase.
  • a particular nucleic acid construct or vector or plasmid construct can have one or more codogenic gene segments.
  • the codogenic gene segments in these constructs are functionally linked to regulatory sequences.
  • the regulatory sequences include, in particular, plant sequences such as the promoters and terminators described above.
  • the constructs can be advantageously in microorganisms, in particular Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens, stably propagate under selective conditions and allow transfer of heterologous DNA into plants or microorganisms.
  • nucleic acids used in the method can be introduced into organisms such as microorganisms or advantageously plants and thus used in plant transformation, such as those published in and cited herein: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Chapter 6/7, pp. 71-119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer to Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; Genes Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung and R.
  • nucleic acids used in the method, the inventive nucleic acids and nucleic acid constructs and / or vectors can thus be used for the genetic modification of a broad spectrum of organisms, advantageously on plants, so that they become better and / or more efficient producers of PUFAs.
  • acyl-CoA3 phospholipid acyltransferase protein of the invention can directly affect the yield, production and / or efficiency of production of a fine chemical in an oil crop or microorganism.
  • Acyltransferases, desaturases and / or elongases may be increased, so that larger amounts of the compounds produced are produced de novo because the Organisms lacked this activity and ability to biosynthesize prior to introduction of the corresponding gene (s).
  • the use of different divergent, ie different sequences on DNA sequence level may be advantageous or the use of promoters for gene expression, which allow a different time gene expression, for example, depending on the degree of ripeness of a seed or oil-storing tissue.
  • acyl-CoAlysophospholipid acyltransferase desaturase and / or elongase gene or several acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, desaturase and / or elongase genes alone or in combination with other genes into an organism or Not only can a cell increase the biosynthetic flux to the final product, but also increase or de novo the corresponding triacylglycerol composition.
  • the number or activity of other genes required to import nutrients needed for the biosynthesis of one or more fine chemicals may be increased, such that the concentration of these precursors, cofactors or intermediates within the cells or within the storage compartment, thereby further increasing the ability of the cells to produce PUFAs, as described below.
  • Fatty acids and lipids are desirable even as fine chemicals; by optimizing the activity or increasing the number of one or more acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, desaturases and / or elongases involved in the biosynthesis of these compounds or by disrupting the activity of one or more desaturases involved in the degradation of these compounds It may be possible to increase the yield, production and / or efficiency of the production of fatty acid and lipid molecules from organisms and, advantageously, from plants.
  • the isolated nucleic acid molecules used in the method according to the invention encode proteins or parts thereof, wherein the proteins or the individual protein or parts thereof contain an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, so that the protein or part thereof is an acyl
  • CoA maintains lysophospholipid acyltransferase activity.
  • the protein or portion thereof encoded by the nucleic acid molecule still has its essential enzymatic activity and has the ability to interfere in the metabolism of compounds necessary for building cell membranes or lipid bodies in organisms, advantageously in plants, or in the transport of To participate in molecules via these membranes.
  • the protein encoded by the nucleic acid molecules is at least about 40%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 70%, 80% or 90%, and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homologous to an amino acid sequence of the sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence
  • lysophospholipid acyltransferases used is to be understood as meaning that they are different from the proteins / enzymes encoded by the sequence with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 and their derivatives in the Comparative still have an enzymatic activity of at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30% and most preferably at least 40% and thus the metabolism of the structure of fatty acids in an organism, preferably a plant cell, necessary compounds or transport of molecules via membranes, denatured C 16, C 18, C 20 or C 24 carbon chains having double bonds in at least two, preferably three, four or five positions.
  • Nucleic acids useful in the method are derived from fungi or plants such as algae or mosses such as the genera Physcomitrella, Thraustochytrium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium or from nematodes such as Caenorhabditis, especially from the genera and species Physcomitrella patens,
  • Phytophthora infestans Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum or particularly advantageous from Ostreococcus tauri or Mantoniella squamata.
  • CoA encode lysophospholipid acyltransferases which hybridize to a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, e.g. under stringent conditions.
  • the nucleic acid sequences used in the method are advantageously introduced into the respective organism in an expression cassette which enables expression of the nucleic acids in organisms such as microorganisms or plants.
  • nucleic acid sequences coding for the inventive acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, the desaturases used and / or the elongases are advantageously linked functionally with one or more regulatory signals in order to increase gene expression.
  • These regulatory sequences are intended to allow the targeted expression of genes and proteins. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is expressed and / or overexpressed only after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences before the actual structural genes may still be present and possibly genetically altered, so that the natural regulation was switched off and the expression of genes was increased.
  • the gene construct may advantageously also contain one or more so-called "enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the acyl-CoAlysophospholipid acyltransferase genes as well as the advantageously used ⁇ -4-desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ -6-desaturase and / or ⁇ -8-desaturase genes and / or the ⁇ -5 elongase , ⁇ 6-elongase and / or ⁇ 9-
  • gene construct gene construct
  • This gene construct or gene constructs can be expressed together in the host organism.
  • the gene construct or the gene constructs can be inserted in one or more vectors and be present freely in the cell or else be inserted in the genome. It is advantageous for the insertion of further genes into the host genome when the genes to be expressed are present together in a gene construct.
  • the regulatory sequences or factors may, as described above, preferably positively influence the expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • a further embodiment of the invention are one or more gene constructs which contain one or more sequences which are defined by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or their derivatives and for polypeptides according to SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • the said acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases result in an exchange of the fatty acids between the mono-, di- and / or triglyceride pool of the cell and the CoA fatty acid ester pool, wherein the substrate advantageously one, two, three, four or five Double bonds and advantageously has 16, 18, 20, 22 or 24 carbon atoms in the fatty acid molecule.
  • Advantageous regulatory sequences for the novel process are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, TJ, T5, T3 , gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter and are advantageously used in Gram-negative bacteria.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, trp tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, TJ, T5, T3 , gal, trc, ara, SP6, ⁇ -PR or ⁇ -PL promoter and are advantageously used in Gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the Gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYCl, GAPDH, TEF, rp28, ADH or in the plant promoters CaMV / 35S (Franck et (1980) Cell 21: 285-294), PRP1 (Ward et al (1993) Plant Mol. Biol. 22), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos or in ubiquitin or phaseolin Promoter.
  • inducible promoters such as those described in EP-AO 388 186 (benzylsulfonamide-inducible), Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404 (tetracycline-inducible), EP-A-0 335 528 (abscisic acid-inducible) or WO 93/21334 (ethanol- or cyclohexenol-inducible) described promoters.
  • suitable plant promoters are the cytosolic FBPase promoter or potato ST-LSI promoter (Stockhaus et al., (1989) EMBO J.
  • promoters which allow expression in tissues involved in fatty acid biosynthesis.
  • seed-specific promoters such as the USP promoter according to the embodiment, but also other promoters such as the LeB4, DC3, phaseolin or napin promoter.
  • Further particularly advantageous promoters are seed-specific promoters which can be used for monocotyledonous or dicotyledonous plants and in US Pat. No.
  • promoters are suitable for example for monocots: lpt-2 or lpt-1 promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230), hordein promoter from barley and other suitable promoters described in WO 99/16890.
  • PUFA biosynthesis genes should advantageously be seed-specifically expressed in oilseeds.
  • seed-specific promoters can be used or promoters that are active in the embryo and / or in the endosperm.
  • seed-specific promoters can be isolated from both dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • Lpt2 and lptl (barley) (WO 95/15389 and WO95 / 23230), seed-specific promoters from rice, corn u. Wheat (WO 99/16890), Amy32b, Amy 6-6 and Aleurain (US 5,677,474), Bce4 (rape) (US 5,530,149), glycinin (soybean) (EP 571 741), phosphoenol
  • Plant gene expression can also be achieved via a chemically inducible promoter (see review in Gatz (1997) Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • each of the nucleic acids used in the process should be used for the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, the advantageous ⁇ -4-desaturase, ⁇ 5-desaturase, ⁇ 6-desaturase, ⁇ 8-desaturase and / or ⁇ 5-elongase, ⁇ 6-elongase and / or ⁇ -9 -Longase encode, under the control of its own, preferably a different promoter expressed as repetitive sequence motifs can lead to instability of the T-DNA or to recombination events.
  • Expression cassette is advantageously constructed so that a promoter is followed by a suitable interface for insertion of the nucleic acid to be expressed, which is advantageously in a polylinker and optionally followed by a terminator.
  • This sequence is repeated several times, preferably three, four or five times, so that up to five genes can be brought together in one construct and thus introduced into the transgenic plant for expression.
  • the sequence is repeated up to three times.
  • the nucleic acid sequences are inserted for expression via the appropriate interface, for example in the polylinker behind the promoter.
  • each nucleic acid sequence has its own promoter and optionally its own terminator. But it is also possible to have several
  • Nucleic acid sequences behind a promoter and possibly in front of a terminator to advertise are not of decisive importance, that is, a nucleic acid sequence may be inserted at the first or last position in the cassette, without this significantly affecting the expression.
  • different promoters such as the USP, LegB4 or DC3 promoter and different terminators may be used in the expression cassette. But it is also possible to use only one type of promoter in the cassette. However, this can lead to unwanted recombination events.
  • the transcription of the introduced genes should advantageously be stopped by suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthetic genes (behind the stop codon).
  • suitable terminators at the 3 'end of the introduced biosynthetic genes can be used here, for example, the OCSl terminator.
  • the promoters different terminator sequences should be used for each gene.
  • the gene construct may, as described above, also include other genes to be introduced into the organisms. It is possible and advantageous to introduce into the host organisms regulatory genes, such as genes for inducers, repressors or enzymes, which intervene by their enzyme activity in the regulation of one or more genes of a biosynthetic pathway, and to express therein. These genes may be of heterologous or homologous origin. Furthermore, further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism can advantageously be contained in the nucleic acid construct or gene construct, or else these genes can be located on a further or several further nucleic acid constructs.
  • Fatty acid acyltransferase s
  • fatty acid synthase s
  • fatty acid hydroxylase s
  • acetyl coenzyme A carboxylase s
  • acyl coenzyme A oxidase s
  • fatty acid desaturase s
  • Fatty acid acetylenases lipoxygenases, triacylglycerol lipases, allene oxide synthases, hydroperoxide lyases or fatty acid elongase (s), or a combination of these genes.
  • nucleic acid sequences are biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism selected from the group of ⁇ -4-desaturase, ⁇ -5-desaturase, ⁇ -6-desaturase, ⁇ -8-desatuase, ⁇ -9-desaturase, ⁇ -12-desaturase, ⁇ -5 elongase, ⁇ -6 elongase or ⁇ -9 elongase genes.
  • the abovementioned desaturases can be used in combination with other elongases and desaturases in expression cassettes according to the invention and used for the transformation of plants with the aid of Agrobacterium.
  • the regulatory sequences or factors can, as described above, preferably positively influence the gene expression of the introduced genes and thereby increase them.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be done at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the expression cassettes can be used in principle directly for introduction into the plant or else be introduced into a vector.
  • These advantageous vectors contain the nucleic acids which code for acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases, or a nucleic acid construct which comprises the nucleic acid used alone or in combination with further biosynthesis genes of the fatty acid or lipid metabolism, such as ⁇ -4-.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors may autonomously replicate in a host cell into which they have been introduced (eg bacterial vectors of bacterial origin of replication). Other vectors are advantageously integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors may direct the expression of genes to which they are operably linked.
  • expression vectors used for Recombinant DNA recombinant techniques are the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass other forms of expression vectors, such as viral vectors that perform similar functions.
  • vector is also intended to encompass other vectors known to those skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, TMV, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • Gene construct in a form suitable for expression of the nucleic acids used in a host cell which means that the recombinant expression vectors comprise one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, which is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed, include.
  • "operatively linked" means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) such that expression of the nucleotide sequence is possible and they are linked together such that both sequences fulfill the predicted function ascribed to the sequence (eg in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers, and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), or see: Gruber and Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton , Florida, Ed .: Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, including references therein. regulatory sequences include those which direct the constitutive expression of a nucleotide sequence in many types of host cells and those which direct the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells under certain conditions. One skilled in the art will appreciate that the design of the expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the level of expression of the desired protein, etc.
  • acyl-CoAlysophospholipid acyltransferases desaturases and elongases in prokaryotic or eukaryotic cells. This is advantageous since intermediate steps of the vector construction are often carried out in microorganisms for the sake of simplicity.
  • acyl-CoA lysophospholipid acyltransferase, desaturase and / or elongase genes can be expressed in bacterial cells, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA, et al. (1992) "YEW 8: 423-488, van den Hondel, CAMJJ, et al.
  • Suitable host cells are further discussed in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • the recombinant expression vector may alternatively be transcribed and translated in vitro using, for example, T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
  • Typical fusion expression vectors include i.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc., Smith, DB, and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which glutathione-S Transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S Transferase
  • pTrc amann et al. (1988) Gene 69: 301-315
  • p ⁇ T 1 Id a coexpressed viral RNA polymerase
  • Polymerase is in the host strains BL21 (DE3) or HMS 174 (DE3) of a resident ⁇ prophage harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • vectors useful in prokaryotic organisms are known to those of skill in the art, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, the pBR series, such as pBR322, the pUC series, such as pUC18 or pUC19, the Ml13mp series, pKC30, ⁇ Rep4 , pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III 13-Bl, ⁇ gtl 1 or pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB10, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667.
  • the expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYeDesaturasecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Co ⁇ oration, San Diego, CA).
  • Vectors and methods for constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ.
  • yeast vectors are, for example, pAG-1, YEp6, YEp 13 or pEMBLYe23.
  • acyl-CoA lysophospholipid acyltransferases, desaturases and / or elongases can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the above vectors provide only a brief overview of possible suitable vectors.
  • Other plasmids are known in the art and are described, for example, in: Cloning Vectors (Eds.
  • the acyl-CoA lysophospholipid acyltransferases, desaturases and / or elongases can be found in unicellular plant cells (such as algae), see Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 and cited therein, and plant cells from higher plants (eg spermatophytes such as crops) are expressed.
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer to Higher Plauts; in: Transgenic Plauts, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds .: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • a plant expression cassette preferably contains regulatory sequences that can direct gene expression in plant cells and are operably linked so that each sequence can perform its function, such as termination of transcription, for example, polyadenylation signals.
  • Preferred polyadenylation signals are those derived from Agrobacterium tumefaciens T-DNA, such as the gene 3 of the Ti plasmid pTiACH5 known as octopine synthase (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) Or functional equivalents thereof, as well all other terminators functionally active in plants are suitable.
  • a plant expression cassette preferably contains other operably linked sequences, such as translation enhancers, for example the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which has the protein / RNA ratio increases (Gallie et al., (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • translation enhancers for example the overdrive sequence containing the 5'-untranslated tobacco mosaic virus leader sequence, which has the protein / RNA ratio increases (Gallie et al., (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
  • the gene to be expressed must be operably linked to a suitable promoter that performs gene expression in an upright, cell or tissue-specific manner.
  • suitable promoters are consumptive promoters (Benfey et al (1989) EMBO J. 8: 2195-2202), such as those derived from plant viruses, such as 35S CAMV (Franck et al., (1980) Cell 21: 285-294), 19S CaMV (see also US 5,352,605 and WO 84/02913) or plant promoters, such as the Rubisco small subunit described in US 4,962,028.
  • sequences for use in the functional compound in plant gene expression cassettes are targeting sequences used to direct the gene product into its corresponding cell compartment, for example, the vacuole, nucleus, all types of plastids, such as amyloplasts, chloroplasts, chromoplasts, extracellular Space necessary for mitochondria, the endoplasmic reticulum, oil bodies, peroxisomes and other compartments of plant cells (see review in Kermode (1996) Crit Rev. Plant Sci. 15: 4: 285-423 and references cited therein).
  • Plant gene expression can also be facilitated via a chemically inducible promoter as described above (see review in Gatz (1997) Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 48: 89-108).
  • Chemically inducible promoters are particularly useful when it is desired that gene expression be in a time-specific manner. Examples of such promoters are a salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a tetracycline-inducible Promoter (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404) and an ethanol-inducible promoter.
  • Promoters which respond to biotic or abiotic stress conditions are also suitable promoters, for example the pathogen-induced PRPl gene promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366), the heat-inducible hsp80 promoter Tomato (US 5,187,267), the potato inducible alpha-amylase promoter (WO 96/12814) or the wound-inducible pinII promoter (EP-A-0 375 091).
  • those promoters are preferred which bring about gene expression in tissues and organs in which the fatty acid, lipid and
  • Suitable promoters are the rapeseed napin promoter (US 5,608,152), the Viciafaba USP promoter (Baeumlein et al (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459-67), the Arabidopsis oleosin promoter (WO 98/45461), the Phaseolin promoter from Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), the
  • Brassica Bce4 promoter (WO 91/13980) or the legumin B4 promoter (LeB4; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2 (2): 233-9) as well as promoters expressing seed-specific expression in monocotyledonous plants such as Corn, barley, wheat, rye, rice, etc. bring.
  • Suitable promoters are the lpt2 or lpt1 gene promoter from barley (WO 95/15389 and WO 95/23230) or those described in WO 99/16890 (promoters from the barley hordein gene, the rice glutelin gene, the rice oryzine gene, the rice prolamin gene, the wheat gliadin gene, the wheat glutelin gene, the maize zein gene, the oat glutelin gene, the sorghum casirin gene, the Rye-secalin gene).
  • promoters which are the plastid specific
  • plastids are the compartment in which the precursors and some end products of lipid biosynthesis are synthesized.
  • suitable Promoters are the viral RNA polymerase promoter described in
  • the multiparallel expression of the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases used in the process may be desired alone or in combination with desaturases and / or elongases.
  • the introduction of such expression cassettes can be carried out via a simultaneous transformation of a plurality of individual expression constructs or preferably by combining a plurality of expression cassettes on a construct.
  • multiple vectors, each containing multiple expression cassettes can be transformed and transferred to the host cell.
  • Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques.
  • transformation and “transfection,” conjugation and transduction are intended to encompass a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acids (eg, DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE- Dextran-mediated transfection, lipofection, natural competence, chemically mediated transfer, electroporation or particle bombardment.
  • Suitable methods for transformation or transfection of host cells, including plant cells can be found in Sambrook and Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., CoId Spring Harbor Laboratory, Col. Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY, 2001) and other laboratory manuals, such as Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Eds: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
  • Host cells which are suitable in principle for receiving the nucleic acid according to the invention, the gene product according to the invention or the vector according to the invention are all prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the host organisms which are advantageously used are microorganisms, such as fungi or yeasts or plant cells, preferably plants or parts thereof.
  • Fungi, yeasts or plants are preferably used, more preferably plants, most preferably plants such as oilseed crops containing high levels of lipid compounds such as rapeseed, evening primrose, hemp, thistle, peanut, canola, flax, soybean, safflower, sunflower, borage , or plants such as corn, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, cotton, cassava, pepper, tagetes, solanaceous plants such as potato, tobacco, eggplant and tomato, vicia species, pea, alfalfa, bush plants (coffee, Cocoa, tea), Salix species, trees (oil plan, coconut) and perennial grasses and forage crops.
  • Particularly preferred plants according to the invention are oil crop plants, such as soybean, peanut, rapeseed, canola, flax, hemp, evening primrose, sunflower, safflower, trees (oil palm, coconut).
  • nucleic acid sequences encoding acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity polypeptides as described above, wherein the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases encoded by the nucleic acid sequences are C 16 , C 18 , C 20 or C 16 C 22 -fatty acids with at least one double bond in the fatty acid molecule implement.
  • nucleic acid sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, e) Nucleic acid sequences which can be derived as a result of the degenerate genetic code from the coding sequence contained in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and have at least 40% homology at the amino acid level with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and a Acyl-CoA: have lysophospholipid acyltransferase activity.
  • nucleic acid sequences of the invention are derived from organisms such as animals, ciliates, fungi, plants such as algae or dinoflagellates which are capable of synthesizing PUFAs.
  • the nucleic acid sequences according to the invention are derived from Ostreococcus tauri or Mantonella squamata.
  • nucleic acid (molecule) as used here, in an advantageous embodiment, furthermore comprises the untranslated sequence located at the 3 'and at the 5' end of the coding gene region: at least 500, preferably 200, particularly preferably 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least 100, preferably 50, more preferably 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably does not have sequences that naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived (eg, sequences located at the 5 'and 3' ends of the nucleic acid).
  • the isolated acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase molecule may be less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of nucleotide sequences naturally flanking the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived.
  • nucleic acid molecules used in the method for example a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or a part thereof, can be isolated using standard molecular biology techniques and the sequence information provided herein. It is also possible with the aid of comparative algorithms to identify, for example, a homologous sequence or homologous, conserved sequence regions at the DNA or amino acid level.
  • nucleic acid molecule comprising a complete sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or a part thereof can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers based on this sequence or portions thereof (For example, a nucleic acid molecule comprising the complete sequence or a portion thereof can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers prepared on the basis of this same sequence).
  • mRNA can be isolated from cells (eg, by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al., (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) and cDNA by reverse transcriptase (eg, Moloney MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL , Bethesda, MD, or AMV Reverse Transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL).
  • reverse transcriptase eg, Moloney MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL , Bethesda, MD, or AMV Reverse Transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification can be synthesized on the basis of one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 or with the aid of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • a nucleic acid of the invention may be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques. The thus amplified nucleic acid can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • homologs of the acyl-CoA3 phospholipid acyltransferase nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 used are allelic variants of at least about 40 to 60%, preferably at least about 60 to 70 %, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90% or 90 to 95%, and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homology to any of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 shown nucleotide sequences or their homologs, derivatives or analogs or parts thereof.
  • allelic variants comprise functional variants which can be obtained by deletion, insertion or substitution of nucleotides from / in the sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, but the intention is that the enzyme activity of the resulting proteins is substantially retained.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 also mean, for example, bacterial, fungal and plant homologs, truncated sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 also mean derivatives such as promoter variants.
  • the promoters upstream of the indicated nucleotide sequences may be modified by one or more nucleotide exchanges, insertion (s) and / or deletion (s), without, however, interfering with the functionality or activity of the promoters. It is also possible that the activity of the promoters is increased by modification of their sequence or that they are completely replaced by more active promoters, even from heterologous organisms.
  • nucleic acid molecules which code for proteins having acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity, which are involved in the metabolism of lipids and fatty acids, PUFA cofactors and enzymes or in the transport of lipophilic compounds via membranes, are used in the process according to the invention for modulating the production of PUFAs in transgenic organisms advantageous in plants such as maize, wheat, rye, oats, triticale, rice, barley, soybean, peanut, cotton, linum species such as oil or fiber kidney, Brassica species such as rapeseed, canola and turnip rape, pepper, sunflower, Borage, evening primrose and Tagetes, Solanacaen plants such as potato, tobacco, aubergine and tomato, Vicia species, pea, cassava, alfalfa, bush plants (coffee, cocoa, tea), Salix species, trees (oil palm, coconut) and perennials Grasses and forage crops, either directly (
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • the lipid synthesis can be divided into two sections: the synthesis of fatty acids and their binding to sn-glycerol-3-phosphate as well as the addition or modification of a polar head group.
  • Common lipids used in membranes include phospholipids, glycolipids, sphingolipids and phosphoglycerides.
  • Fatty acid synthesis begins with the conversion of acetyl-CoA into malonyl-CoA by the acetyl-CoA carboxylase or into acetyl-ACP by the acetyl transacylase. After a condensation reaction, these two product molecules together form acetoacetyl-ACP, which through a series of
  • the phospholipid-bound fatty acids thus produced must then be converted again for further elongations from the phospholipids into the fatty acid CoA ester pool.
  • these enzymes can transfer the elongated fatty acids again from the CoA esters to the phospholipids. This reaction sequence can optionally be repeated several times (see Fig. 4).
  • Precursors for the PUFA biosynthesis are, for example, oleic acid, linoleic acid and
  • Linolenic acid These C 18 -carbon fatty acids must be elongated 20 and C 22 to obtain fatty acids of eicosapentaenoic and docosa chain type on C.
  • desaturases such as the ⁇ -4-, ⁇ -5, ⁇ -6 and ⁇ -8-desaturases and / or the ⁇ -5, ⁇ - 6-, ⁇ -9 elongases may be obtained, extracted and used for various purposes in food, feed, cosmetic or pharmaceutical applications, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid, as well as various other long-chain PUFAs.
  • C 18 , C 20 , and / or C 22 fatty acids having at least two, advantageously at least three, four, five or six double bonds in the fatty acid molecule, preferably to C 20 -, and / or C 22 -fatty acids, may preferably be used with the abovementioned enzymes be prepared with advantageous three, four or five double bonds in the fatty acid molecule.
  • the desaturation can be carried out before or after elongation of the corresponding fatty acid.
  • the products of desaturase activities and possible further desaturation and elongation result in preferred PUFAs having a higher degree of desaturation, including a further elongation of C 20 to C 22 fatty acids, to fatty acids such as ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, arachidonic acid, stearidonic acid, Eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • Substrates of the acyl-CoA are C 16 , C 18 , C 20 or C 22 fatty acids, for example palmitic acid, palmitoleic acid, linoleic acid, ⁇ -linolenic acid, ⁇ -linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid, eicosatetraenoic acid or stearidonic acid.
  • Preferred substrates are linoleic acid, ⁇ -linolenic acid and / or ⁇ - Linolenic acid, dihomo- ⁇ -linolenic acid or arachidonic acid, eicosatetraenoic acid or eicosapentaenoic acid.
  • the C 18 , C 20 or C 22 fatty acids having at least two double bonds in the fatty acid are obtained in the novel process in the form of the free fatty acid or in the form of their esters, for example in the form of their glycerides.
  • glycolide is understood as meaning a glycerol (mono-, di- or triglyceride) esterified with one, two or three carboxylic acid residues.
  • glycolide is also meant a mixture of different glycerides.
  • the glyceride or glyceride mixture may contain other additives, e.g. contain free fatty acids, antioxidants, proteins, carbohydrates, vitamins and / or other substances.
  • a "glyceride” in the sense of the process according to the invention is also understood as meaning derivatives derived from glycerol.
  • these also include glycerophospholipids and glyceroglycolipids. Examples include the glycerophospholipids lecithin (phosphatidylcholine), cardiolipin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and Alkylacylglycerophospholipide called.
  • fatty acids must then be transported to various modification sites and incorporated into the triacylglycerol storage lipid.
  • Another important step in lipid synthesis is the transfer of fatty acids to the polar head groups, for example by glycerol-fatty acid acyltransferase (see Frentzen (1998) Lipid 100 (4-5): 161-166).
  • the PUFAs produced in the process comprise a group of molecules that are no longer able to (sufficiently) synthesize higher animals, and thus must (additionally) take up, although they are readily synthesized by other organisms such as bacteria.
  • acyl-CoA lysophospholipid acyltransferases
  • phospholipids are to be understood as meaning phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and / or phosphatidylinositol, advantageously phosphatidylcholine.
  • acyl-CoA ⁇ ssophospholipid acyltransferase nucleic acid sequence (s) in the sense of the invention comprises nucleic acid sequences which encode an acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase, in particular an acyl-CoA: lysophosphatidylcholine acyltransferase, and a coding region and optionally corresponding ones 5'- and 3'-untranslated sequence regions.
  • the invention also comprises nucleic acid molecules which differ from one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 (and parts thereof) due to the degenerate genetic code and thus the same acyl CoA: Lysophospholipid acyltransferase encode such as that encoded by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • acyl-CoA3sophospholipid acyltransferase nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 those skilled in the art will recognize that within a population, DNA sequence polymorphisms may exist that result in changes in the DNA sequence Amino acid sequences of the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferases can lead. These genetic polymorphisms in the acyl-CoA3sophospholipid acyltransferase gene may exist due to natural variation between individuals within a population.
  • Nucleic acid molecules useful in the method of the present invention can be isolated based on their homology to the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase nucleic acids disclosed herein using the sequences or a portion thereof as a hybridization probe according to standard hybridization techniques under stringent hybridization conditions.
  • isolated nucleic acid molecules can be used which are at least 15 nucleotides long and which hybridize under stringent conditions with the nucleic acid molecules which comprise a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • Nucleic acids of at least 25, 50, 100, 250 or more nucleotides may also be used.
  • hybridized under stringent conditions is intended to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences that are at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • the conditions are preferably such that sequences which are at least about 65%, preferably at least about 70%, and more preferably at least about 75% or more homologous, are usually hybridized to each other.
  • stringent conditions are known to those skilled in the art and can be found in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions are hybridizations in 6 x sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C, followed by one or more washes in 0.2 x SSC, 0.1% SDS at 50 to 65 ° C. It is known to the person skilled in the art that these hybridization conditions may differ with regard to the temperature and the concentration of the buffer, depending on the type of nucleic acid and, for example, whether organic solvents are present. The temperature is for example under "standard hybridization conditions" depending on the type of nucleic acid between 42 ° C and 58 ° C in aqueous buffer with a concentration of 0.1 to 5 x SSC (pH 7.2).
  • the temperature is about 42 ° C under standard conditions.
  • the hybridization conditions for DNA: DNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 20 ° C to 45 ° C, preferably between 30 ° C and 45 ° C.
  • the hybridization conditions for DNA: RNA hybrids are, for example, 0.1 x SSC and 30 ° C to 55 ° C, preferably between 45 ° C and 55 ° C.
  • the sequences are written among each other for optimal comparison (eg, gaps in the sequence of a protein or a nucleic acid inserted to create an optimal alignment with the other protein or nucleic acid).
  • the amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding an acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase that is homologous to a protein sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 may be prepared by introducing one or more nucleotide substitutions , additions or deletions into a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, such that one or more amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein. Mutations can be introduced into any of the sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • conservative amino acid substitutions are made on one or more of the predicted nonessential amino acid residues.
  • an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • families of amino acid residues have been defined with similar side chains.
  • amino acids with basic side chains eg, lysine, Arginine, histidine
  • acidic side chains eg aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • nonpolar side chains eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, Methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains eg threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • a predicted nonessential amino acid residue in an acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase is thus preferably replaced by another amino acid residue from the same side chain family.
  • the mutations may be randomly introduced over all or part of the acyl-CoAi lysophospholipid acyltransferase coding sequence, eg, by saturation mutagenesis, and the resulting mutants screened by the acyl-CoAlysophospholipid acyltransferase activity described herein. to identify mutants that have retained the acyl-CoA: lysophospholipid acyltransferase activity.
  • the encoded protein can be recombinantly expressed and the activity of the protein can be determined, for example, using the assays described herein.
  • DNA modifying enzymes and molecular biology kits were purchased from AGS (Heidelberg), Amersham (Brunswick), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach / Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) and Stratagene (Amsterdam, The Netherlands). Unless otherwise stated, they were used according to the manufacturer's instructions.
  • T-120-Ot-LPCAT-XhoI ACT CGA GTC ACG AGT TGT TCA CGA GGC The positions of the primers used are shown in FIG.
  • the amplification of the OtLPCAT DNA was carried out in each case with 1 .mu.l thawed cells, 200 .mu.M dNTPs, 2.5 U T ⁇ ⁇ polymerase and 100 pmol of each primer in a total volume of 50 ul.
  • the conditions for the PCR were as follows: first denaturation at 95 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes and a final extension step at 72 ° C for 10 minutes.
  • Example 3 Cloning of Expression Plasmids for the Heterologous Expression of OtLPCAT in Yeasts
  • the corresponding primer pairs were selected to carry the yeast consensus high-efficiency translation sequence (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) adjacent to the start codon.
  • the amplification of OtLPCAT was carried out in each case with 1 .mu.l cDNA, 200 .mu.M dNTPs, 2.5 U Advantage-Volymerase and 100 pmol of each primer in a total volume of 50 ul.
  • the conditions for the PCR were as follows: first denaturation at 95 ° C for 5 minutes, followed by 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes and a final extension step at 72 ° C for 10 minutes.
  • the PCR products were incubated for 30 min at 21 0 C with the yeast expression vector pYES2.1 -TOPO (Invitrogen) according to manufacturer's instructions.
  • the PCR product is ligated by a T-overhang and activity of a topoisomerase (Invitrogen) in the vector.
  • transformation of E. coli DH5 ⁇ cells was then carried out.
  • Corresponding clones were identified by PCR, the plasmid DNA isolated using Qiagen DNAeasy kit and verified by sequencing. The sequence of the resulting plasmid pYES2.1 -OtLPCAT is shown in SEQ ID no. 7 indicated.
  • the correct sequence was then inserted into the S ⁇ cch ⁇ romyces Strain INVScI (Invitrogen) transformed by electroporation (1500V).
  • the empty vector pYES2.1 was transformed in parallel.
  • the yeasts were plated on complete minimal medium without uracil with 2% glucose. Cells which were capable of growth in the medium without uracil contained the corresponding plasmids pYES2.1 or pYES2.1-OtLPCAT. After selection, two transformants were selected for further functional expression.
  • pSUN300 is a derivative of the plasmid pPZP (Hajdukiewicz, P. et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 989-994).
  • pSUN-USP was generated from pSUN300 by inserting into pSUN300 a USP promoter as an EcoRI fragment.
  • the USP promoter corresponds to nucleotides 1-684 (Genbank Accession X56240), with part of the non-coding region of the USP gene contained in the promoter.
  • the 684 base pair promoter fragment was amplified using a commercial 17 standard primer (Stratagene) and a synthesized primer
  • the PCR fragment was rescored with EcoRI / SalI and inserted into the vector pSUN300 with OCS terminator.
  • the polyadenylation signal is that of the octopine synthase gene from the A. tumefaciens Ti plasmid (ocs terminator, Genbank Accession V00088) (De Greve, H. et al., (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 (6): 499-511).
  • the result was the plasmid with the name pSUN-USP.
  • the construct was used to transform Arabidopsis thaliana, rapeseed, tobacco and flaxseed.
  • Notl cleavage sites were inserted at the 5 'and 3' end of the coding sequence with the following primer pair:
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 ° C denaturation temperature: 1 min 94 ° C elongation temperature: 2 min 72 ° C number of cycles: 35
  • the PCR products were incubated for 16 h at 37 0 C with the restriction enzyme Notl.
  • the plant expression vector pSUN300-USP was incubated in the same way. Subsequently, the PCR products and the 7624 bp vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA fragments was carried out using Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer. Subsequently, vector and PCR products ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmid pSUN-OtLPCAT was verified by sequencing.
  • OtLPCAT The activity of OtLPCAT was determined after expression of OtLPCAT in yeasts and feeding of various fatty acids (Figure 2).
  • the double construct pESCLeu-PpD6-PSE1 was furthermore prepared which has the open reading frames of a ⁇ 6-desaturase (PpD6) and a ⁇ 6 elongase (PSE1) from Physcomitrella patens ( see DE 102 19 203), and together with either the empty vector pYES2.1 or the vector pYES2.1 -
  • OtLPCAT transformed OtLPCAT transformed.
  • the cloning of the construct pESCLeu-PpD6-PSE1 can be found in WO 2004/076617, the content of which is hereby incorporated by reference.
  • yeast cells from the major cultures were harvested by centrifugation (100 xg, 10 min, 20 ° C) and washed with 100 mM NaHCO 3 , pH 8.0 to remove residual medium and fatty acids.
  • fatty acid methyl esters FAMEs
  • FAMEs fatty acid methyl esters
  • FIG. 2A shows the conversion of the nutritious fatty acid 18: 2 A9 '12 to 20: 3 A8>11> 14 by yeasts which had been transformed with the plasmids pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2.1.
  • FIG. 2B shows the conversion into yeasts which, in addition to the plasmid pESCLeu-PpD6-PSE1, additionally contain the plasmid pYES2.1-OtLPCAT.
  • the fed substrate was abundant in all transgenic yeasts. Both transgenic yeasts showed a synthesis of 18: 3 ⁇ 6 ' 9 ' 12 and
  • Example 6 Cloning of acyltransferase genes from Mantoniella squamata By searching for conserved regions in the protein sequences of the previously isolated LPCAT from C. elegans (WO 2004/76617), it was possible to identify sequences with corresponding motifs in a Mantoniella sequence database (see FIG. 1). These are the following sequences:
  • a 2 1 culture of M ⁇ ntoniell ⁇ squ ⁇ m ⁇ t ⁇ was prepared in f / 2 medium (Guillard, RRL (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates.) In Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, WL and Chanley, MH), Plenum Press, New York, pp 29-60) for 14 days at a luminous intensity of 80 U / cm 2 .
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • the associated genomic DNAs were amplified by PCR.
  • the corresponding primer pairs were selected such that they contain the first 20 nucleotides at the 5 'end and the last 20 nucleotides at the 3' end (including stop codon) and at the 5 'end additionally the yeast consensus sequence for highly efficient translation ( Kozak (1986) Cell 44: 283-292).
  • the following primers were used:
  • MA LPCAT BamHI AGG ATC CAT GTC TTT TTA CCT CGT CAC CTT CAC C 3 ⁇ -113
  • MA LPCAT_XhoI ACT CGA GTC ACG AGT ACT TGA CAA GGC for the shorter form of LPCAT from Mantoniella squamata and
  • the amplification of the MsLPC AT-DNAs was carried out in each case with 1 .mu.l thawed cells, 200 .mu.M dNTPs, 2.5 U T ⁇ ⁇ -Polymerase and 100 pmol of each primer in a total volume of 50 ul.
  • the conditions for the PCR were as follows: first denaturation at 95 ° C for 5 minutes followed by 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes and a final extension step at 72 ° C for 10 minutes.
  • the corresponding primer pairs were selected to carry the yeast consensus high-efficiency translation sequence (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) adjacent to the start codon.
  • the amplification of the MsLPCATs was carried out in each case with 1 .mu.l cDNA, 200 .mu.M dNTPs, 2.5 U Advantage-Volymerase and 100 pmol of each primer in a total volume of 50 ul.
  • the conditions for the PCR were as follows: first denaturation at 95 ° C for 5 minutes followed by 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute and 72 ° C for 2 minutes and a final extension step at 72 ° C for 10 minutes.
  • the following oligonucleotides were used for the PCR reaction:
  • PCR products were incubated for 30 min at 21 0 C with the yeast expression vector pYES2.1 -TOPO (Invitrogen) according to manufacturer's instructions.
  • the PCR product is ligated by a T-overhang and activity of a topoisomerase (Invitrogen) in the vector.
  • transformation of E. coli DH5 ⁇ cells was then carried out.
  • Corresponding clones were identified by PCR, the plasmid DNA isolated using Qiagen DNAeasy kit and verified by sequencing.
  • the sequences of the resulting plasmids pYES2.1 -MsLPCATl 12 and pYES2.1 -MsLPCATl 18 are shown in SEQ ID Nos. 8 or 9 indicated.
  • composition of the PCR mixture (50 ⁇ l):
  • Annealing temperature 1 min 55 ° C denaturation temperature: 1 min 94 ° C elongation temperature: 2 min 72 ° C number of cycles: 35
  • the PCR products were incubated for 16 h at 37 0 C with the restriction enzyme Notl.
  • the plant expression vector pSUN300-USP was used in the same way incubated. Subsequently, the PCR products and the 7624 bp vector were separated by agarose gel electrophoresis and the corresponding DNA fragments were excised. The purification of the DNA fragments was carried out using Qiagen Gel Purification Kit according to the manufacturer. Subsequently, vector and PCR products were ligated. The Rapid Ligation Kit from Roche was used for this purpose. The resulting plasmids pSUN-MsLPCATl 12 and pSUN-MsLPCATl 18 were verified by sequencing.
  • the activity of the MsLPCATs could be determined after expression of the MsLPCATs in yeasts and feeding of various fatty acids ( Figures 3 A, B and C).
  • the construct pESCLeu-PpD6-PSE1 was introduced into the yeast together with either the empty vector pYES2.1 or the plasmid pYES2.1 -MsLPCATl 12 or pYES2.1 -MsLPCATl 18 here.
  • FIG. 3A shows the conversion of the fed fatty acid 18: 2 A9 '12 to 20: 3 A8> 11 ' 14 by yeasts which had been transformed with the plasmid pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2.1.
  • FIG. 3B shows the reaction in yeasts which, in addition to the plasmid pESCLeu-PpD6-PSE1, additionally contain the plasmid pYES2.1-MsLPCAT112.
  • FIG. 3C describes the fatty acid spectrum of yeasts which are associated with the
  • LCPUF A-specific acyltransferases in transgenic plants is advantageous in order to increase the LCPUF A content in these plants.
  • the acyltransferase cDNAs according to the invention were cloned into binary vectors (see Examples 4 and 8) and via Agrobacterium-mediated DNA transfer in
  • transgenic plants which already express the desaturases and elongases necessary for the synthesis of LCPUFAs and produce small amounts of these LCPUFAs.
  • Such plants are for example those in DE 102 19 203 which contain functional ⁇ 6-desaturase genes, ⁇ 6-elongase and ⁇ 5-desaturase and produce small amounts of ARA and EPA.
  • the resulting binary vectors with acyltransferase genes were transformed into Agrobacterium tumefaciens (Hofgen and Willmitzer (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9877).
  • the transformation of A thaliana was carried out by means of "floral dip" (Clough and Bent (1998) Plant Journal 16: 735-743), by N. tabacum on cocultivation of tobacco leaf pieces with transformed A. tumefaciens cells, of linseed and oilseed rape Cocultivation of hypocotyl pieces with transformed A. tumefaciens' cells. Corresponding methods are known to the person skilled in the art.
  • acyltransferase genes in transgenic Arabidopsis, tobacco, rapeseed and linseed plants was examined by Northern blot analysis. Selected plants were examined for their content of PUFAs in seed oil.
  • Agrobacterium-mediated plant transformation can be carried out using standard transformation and regeneration techniques (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd ed., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Central Signature: BTI 1 -P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
  • rape can be transformed by cotyledon or hypocotyl transformation (Moloney et al., (1989) Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91: 694-701).
  • the use of antibiotics for Agrobacterium and plant selection depends on the binary vector and Agrobacterium strain used for the transformation.
  • the rape selection will usually performed using kanamycin as a selectable plant marker.
  • the Agrobacterium-mediated gene transfer in flax (Linum usitatissimum) can be determined, for example, using a method described by Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285.
  • soy may be carried out using, for example, a technique described in EP-A-0 0424047 (Pioneer Hi-Bred International) or in EP-A-0 039 7687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo). Plant transformation using particle bombardment, polyethylene glycol mediated DNA uptake or via the silicon carbonate fiber technique is described, for example, by Freeling and Walbot "The Maize Handbook” (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer, New York.
  • TAG fatty acids or triacylglycerol
  • FAME fatty acid methyl ester
  • GC-MS gas-liquid chromatography-mass spectrometry
  • TLC thin-layer chromatography
  • the unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms by standard analytical methods such as GC, GC-MS or TLC as variously described by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition: Christie , OiIy Press, Dundee, 119-169; 1998, Gas Chromatography Mass Spectrometry Method, Lipids 33: 343-353).
  • the plant material to be analyzed may be broken up either by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or by other applicable methods. The material is then centrifuged after rupture. The sediment is then distilled in aqua. re-suspended, heated at 100 ° C for 10 min, cooled on ice and recentrifuged, followed by extraction into 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 h at 90 ° C resulting in hydrolyzed oil and lipid compounds. which give transmethylated lipids.
  • fatty acid methyl esters can then be extracted into petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 ° C and 240 ° C for 20 min and 5 min at 240 ° C are subjected.
  • the identity of the resulting fatty acid methyl esters can be defined using standards available from commercial sources (i.e., Sigma).
  • the seeds were taken up with 1% sodium methanolate in methanol and incubated for 20 min at RT (about 22 ° C). It was then washed with NaCl solution and taken up the FAME in 0.3 ml of heptane.
  • the samples were separated on a ZEBRON ZB Wax capillary column (30 m, 0.32 mm, 0.25 micron, Phenomenex) in a Hewlett Packard 6850 gas chromatograph with a flame ionization detector.
  • the furnace temperature was (hold 1 min) of 7O 0 C to 200 0 C at a rate of 20 ° C / min, then to 25O 0 C (5 hold min) at a rate of 5 ° C / min and finally to 26O 0 C programmed at a rate of 5 ° C / min.
  • the carrier gas was nitrogen employed (4.5 ml / min at 7O 0 C).
  • the fatty acids were identified by comparison with retention times of FAME standards (SIGMA).
  • acyl-CoA lysophopholipid acyltranserase
  • the biosynthetic pathway of the LCPUFAS is thus as follows:
  • Desaturases catalyze the introduction of double bonds into lipid-coupled fatty acids (s ⁇ -acyl-phosphatidylcholine), while the elongases exclusively catalyze the elongation of coenzyme A-esterified fatty acids (acyl-CoAs). According to this mechanism requires the alternating action of desaturases and
  • Elongases a constant exchange of acyl substrates between phospholipids and the acyl-CoA-pool and thus the existence of an additional activity, the acyl substrates in the respectively necessary substrate form, ie lipids (for desaturases) or CoA thioesters (for elongases) , convicted.
  • This exchange between acyl-CoA pool and phospholipids is facilitated by LCPUF
  • Fig. 1 Amino acid sequence comparison of OtLPCAT, MsLPCAT and CeLPCAT
  • Fig. 2 Fatty acid analysis of yeasts which had been transformed with the plasmids pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2.1 (A) or pLEU-PSE1 (Pp) _d6Des (Pp) and pYES2.1-OtLPCAT (B) Feeding with 18: 2 A9 '12 .
  • Fig. 3 Fatty acid analysis of yeasts infected with the plasmids pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2.1 (A), pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2.1 -MsLPCAT12 (B) and pESCLeu-PpD6-PSE1 and pYES2, respectively.
  • Fig. 4 Biosynthetic pathway of LCPUFAs

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einem Organismus, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide mit Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren. Vorteilhaft können diese Nukleinsäuresequenzen gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechels kodieren, in dem transgenen Organismus exprimiert werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Vektoren enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder die Nukleinsäurekonstrukte sowie transgene Organismen enthaltend die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren. Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und deren Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einem Organismus, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide mit Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren. Vorteilhaft können diese Nukleinsäuresequenzen gegebenenfalls zusammen mit weiteren
Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechels kodieren, in dem transgenen Organismus exprimiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Vektoren enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder die Nukleinsäurekonstrukte sowie transgene Organismen enthaltend die vorgenannten Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren.
Ein weiterer Teil der Erfindung betrifft Öle, Lipide und/oder Fettsäuren hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und deren Verwendung.
Fettsäuren und Triglyceride finden eine Vielzahl von Anwendungen in der
Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren der Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Mehrfach ungesättigte ω-3- und ω-6-Fettsäuren stellen dabei einen wichtigen Bestandteil der tierischen und menschlichen Nahrung dar. Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach ungesättigten ω-3 -Fettsäuren, die vor allem in Fischölen vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise der Babynahrung mehrfach ungesättigte ω-3 -Fettsäuren wie Docosahexaensäure (= DHA, C22:6Δ4'7'10'13'16'19) oder Eisosapentaensäure (= EPA, C20:5Δ5'8>11'14'17) zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Der ungesättigten Fettsäure DHA wird dabei ein positiver Effekt auf die Entwicklung des Gehirns zugeschrieben.
Den mehrfach ungesättigten ω-3 -Fettsäuren wird auch ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit der Prävention einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3 -Fettsäuren zur Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden. Auch entzündliche, speziell chronisch entzündliche Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch ω-3 -Fettsäuren positiv beeinflussen. Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ω-6-Fettsäuren wie Arachidonsäure haben bei diesen rheumatischen Erkrankungen aufgrund unserer üblichen Nahrungsmittelzusammensetzung eher einen negativen Effekt auf diese Krankheiten.
ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, und den Thromboxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten. Eicosanoide, die aus ω-6-Fettsäuren gebildet werden (sog. PG2-Serie), fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide aus ω-3 -Fettsäuren (sog. PG3- Serie) geringe oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben.
Im Folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (j>oly unsaturated fatty acid = PUFA; long chain j>oly unsaturated fatty acid = LCPUFA). Die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride werden hauptsächlich aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja oder Raps, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt. Höhere mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (= ARA, C20:4Δ5'8'π'14), Dihomo-γ-linolensäure (C20:3Δ8'π'14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5Δ7'10'13'16'19) lassen sich nicht aus Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färberdistel oder anderen isolieren. Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch sowie Algen.
Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Vergangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase und in WO 94/11516 wird eine Δ-12- Desaturase beansprucht. Weitere Desaturasen werden beispielsweise in EP-A- 0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-O 794 250, Stukey et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20144-20149, Wada et al. (1990) Nature 347: 200-203 oder Huang et al. (1999) Lipids 34: 649-659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al. (1981) Methods in Enzymol. 71: 12141-12147, Wang et al. (1988) Plant Physiol. Biochem. 26: 777- 792). In der Regel erfolgt die Charakterisierung membrangebundener Desaturasen - A -
durch Einbringung in einen geeigneten Organismus, der anschließend auf Enzymaktivität mittels Edukt- und Produktanalyse untersucht wird. Δ-6-Desaturasen sind in WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022, WO00/21557 und WO 99/27111 beschrieben, während deren Anwendung zur Produktion von Fettsäuren in transgenen Organismen in WO98/46763, WO98/46764 und WO98/46765 beschrieben ist. Dabei wird auch die Expression verschiedener Desaturasen wie in WO99/64616 oder WO98/46776 und Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren beschrieben und beansprucht. Bezüglich der Effektivität der Expression von Desaturasen und ihren Einfluss auf die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren ist anzumerken, dass durch Expression einer einzelnen Desaturase wie bisher beschrieben lediglich geringe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden wie z.B. γ-Linolensäure und Stearidonsäure erreicht wurden. Weiterhin wurde in der Regel ein Gemisch aus ω-3- und ω-6-Fettsäuren erhalten.
Besonders geeignete Mikroorganismen zur Herstellung von PUFAs sind Mikroorganismen wie Thraustochytrien- oder Schizochytrien- Stämme, Algen wie Phaeodactylum tricornutum oder Crypthecodinium- Arten, Ciliaten wie Stylonychia oder Colpidium und Pilze wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor. Durch Stammselektion ist eine Anzahl von Mutantenstämmen der entsprechenden Mikroorganismen entwickelt worden, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls wie den mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Deshalb werden, wann immer möglich, wie oben beschrieben gentechnologische Verfahren bevorzugt. Mit Hilfe der vorgenannten Mikroorganismen lassen sich jedoch nur begrenzte Mengen der gewünschten mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie DPA, EPA oder ARA herstellen, wobei diese in der Regel zudem je nach verwendetem Mikroorganismus als Fettsäuregemische aus beispielsweise EPA, DPA und DHA anfallen. Alternativ kann die Produktion von Feinchemikalien im großen Maßstab vorteilhaft in Pflanzen durchgeführt werden, die so entwickelt werden, dass sie die vorstehend genannten PUFAs herstellen. Besonders gut fiir diesen Zweck geeignete Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Canola, Lein, Soja, Sonnenblumen, Borretsch und Nachtkerze. Aber auch andere Nutzpflanzen, die Öle oder Lipide und Fettsäuren enthalten, sind gut geeignet, wie in der eingehenden Beschreibung dieser Erfindung erwähnt. Mittels herkömmlicher Züchtung ist eine Reihe von Mutantenpflanzen entwickelt worden, die ein Spektrum an wünschenswerten Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen produzieren. Die Selektion neuer Pflanzensorten mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls ist jedoch ein zeitaufwändiges und schwieriges Verfahren oder sogar unmöglich, wenn die Verbindung in der entsprechenden Pflanze nicht natürlich vorkommt, wie im Fall von mehrfach ungesättigten C18-, C20-und C22-Fettsäuren und Fettsäuren mit längeren Kohlenstoffketten.
In der Vergangenheit hat es daher nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der
Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen in verschiedenen Pflanzen mit einem geändertem Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. Bisher konnten jedoch längerkettige mehrfach ungesättigte C20- und/oder C22-Fettsäuren wie EPA oder ARA nicht in Pflanzen hergestellt werden.
Aber auch in anderen Organismen wie Mikroorganismen wie Algen oder Pilzen führten die gentechnischen Veränderungen des Fettsäurestoffwechselweges über das Einbringen und die Expression beispielsweise von Desaturasen nur zu relativ geringen Steigerungen der Produktivität in diesen Organismen. Ein Grund hierfür mag in dem sehr komplexen Fettsäurestoffwechsel liegen. So ist der Einbau von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Membranlipide und/oder in Triacylglyceride und deren Ab- und Umbau sehr komplex und bis heute biochemisch und speziell genetisch noch nicht vollständig aufgeklärt und verstanden.
Die Biosynthese von LCPUFAs und der Einbau von LCPUFAs in Membranen oder Triacylglyceride erfolgt über verschiedene Stoffwechselwege (Abbadi et al. (2001) European Journal of Lipid Science & Technology 103 : 106- 113 ). In Bakterien wie Vibrio und Mikroalgen wie Schizochytrium wird Malonyl-CoA über eine LCPUFA- produzierende Polyketidsynthase zu LCPUFAs umgesetzt (Metz et al. (2001) Science 293: 290-293; WO 00/42195; WO 98/27203; WO 98/55625). In Mikroalgen wie Phaeodactylum und Moosen wie Physcomitrella werden ungesättigte Fettsäuren wie Linolsäure oder Linolensäure in Form ihrer Acyl-CoAs in mehreren
Desaturierungs- und Elongationsschritten zu LCPUFAs umgesetzt (Zank et al. (2000) Biochemical Society Transactions 28: 654-658). Bei Säugetieren beinhaltet die Biosynthese von DHA zusätzlich zu Desaturierungs- und Elongationsschritten eine Kettenverkürzung über ß-Oxidation.
LCPUFAs liegen in Mikroorganismen und niederen Pflanzen entweder ausschließlich in Form von Membranlipiden vor, wie bei Physcomitrella und Phaeodactylum, oder sie sind sowohl in Membranlipiden als auch in Triacylglyceriden vorhanden, wie bei Schizochytrium und Moriierella. Der Einbau von LCPUFAs in Lipide und Öle wird durch verschiedene Acyltransferasen und Transacylasen katalysiert, die bereits bekannt für den Einbau von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren sind (Slabas (2001) J. Plant Physiology 158: 505-513; Frentzen (1998) Fett/Lipid 100: 161-166; Cases et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 95: 13018-13023). Bei den Acyltransferasen handelt sich um Enzyme des sogenannten Kennedy-Pathways, die an der cytoplasmatischen Seite des Membransystems des Endoplasmatischen Reticulums, nachfolgend als ,ER' bezeichnet, lokalisiert sind. Experimentell können Membranen des ER als sogenannte ,mikrosomale Fraktionen' aus verschiedenen Organismen isoliert werden (Knutzon et al. (1995) Plant Physiology 109: 999-1006; Mishra & Kamisaka (2001) Biochemistry 355: 315-322; US 5968791). Diese ER-gebundenen Acyltransferasen in der mikrosomalen Fraktion verwenden Acyl-CoA als aktivierte Form der Fettsäuren. Glycerin-3-phosphat-Acyltransferase, im folgenden GPAT genannt, katalysiert den Einbau von Acylgruppen an der sn-1 Position von Glycerin-3- phosphat. l-Acylglycerin-3-phosphat-Acyltransferase (E.C. 2.3.1.51), auch Lysophosphatidsäure-Acyltransferase, im Folgenden LPAAT genannt, katalysiert den Einbau von Acylgruppen an der sn-2 Position von Lysophosphatidsäure, nachfolgend als LPA abgekürzt. Nach Dephosphorylierung von Phosphatidsäure durch Phosphatidsäure-Phosphatase katalysiert Diacylglycerin-Acyltransferase, im Folgenden DAGAT genannt, den Einbau von Acylgruppen an der sn-3 -Position des Diacylglycerins. Neben diesen Enzymen des Kennedy-Pathways sind weitere Enzyme am Einbau von Fettsäuren in Triacylglyceride beteiligt, die Acylgruppen aus Membranlipiden in Triacylglyceride einbauen können, wie etwa die Phospholipid- Diacylglycerin-Acyltransferase, nachfolgend PDAT genannt, und die Lyso- phosphatidylcholin-Acyltransferase, nachfolgend LPCAT genannt.
Die enzymatische Aktivität einer LPCAT wurde erstmals in Ratten beschrieben (Land (1960) J. Biol. Chem. 235: 2233-2237). In Pflanzen existiert eine plastidäre Isoform der LPCAT (Akermoun et al. (2000) Biochemical Society Transactions 28: 713-715) sowie eine ER-gebundene Isoform (Tumaney und Rajasekharan (1999) Biochimica et Biophysica Acta 1439: 47-56; Fräser und Stobart, Biochemical Society Transactions (2000) 28: 715-7718). LPCATs sind in Tieren wie auch in Pflanzen an der Biosynthese und der Transacylierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren beteiligt (Stymne und Stobart (1984) Biochem. J. 223: 305-314; Stymne und Stobart (1987) in 'The Biochemistry of Plauts: a Comprehensive Treatise', Vol. 9 (Stumpf, P.K. ed.) pp. 175-214, Academic Press, New York). Eine wichtige Funktion der LPCAT oder allgemeiner gesagt einer Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferase, nachfolgend LPLAT genannt, bei der ATP-unabhängigen Synthese von Acyl-CoA aus Phospholipiden wurde von Yamashita et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 26745-26752 beschrieben.
Höhere Pflanzen enthalten mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Linolsäure (Cl 8:2) und Linolensäure (Cl 8:3). Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) kommen hingegen im Samenöl höherer Pflanzen gar nicht oder nur in Spuren vor (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Vegetales. Technique & Documentation - Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Es ist vorteilhaft, in höheren Pflanzen, bevorzugt in Ölsaaten wie Raps, Lein, Sonnenblume und Soja, LCPUFAs herzustellen, da auf diese Weise große Mengen qualitativ hochwertiger LCPUFAs für die Lebensmittelindustrie, die Tierernährung und für pharmazeutische Zwecke kostengünstig gewonnen werden können. Hierzu werden vorteilhaft über gentechnische Methoden Gene kodierend für Enzyme der Biosynthese von LCPUFAs in Ölsaaten eingeführt und exprimiert. Dies sind beispielsweise Gene kodierend für eine Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase, Δ-5- Desaturase, Δ-5-Elongase und Δ-4-Desaturase. Diese Gene können vorteilhaft aus Mikroorganismen, Tieren und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUFAs herstellen und in die Membranen oder Triacylglyceride einbauen. So konnten bereits Δ-6-Desaturase-Gene aus dem Moos Physcomitrella patens und Δ-6-Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden C. elegans isoliert werden.
Erste transgene Pflanzen, die Gene kodierend für Enzyme der LCPUF A-Biosynthese enthalten und exprimieren und LCPUFAs produzieren wurden in DE 102 19 203 (Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen) erstmals beschrieben. Diese Pflanzen produzieren allerdings LCPUFAs in Mengen, die für eine Aufarbeitung der in den Pflanzen enthaltenen Öle noch weiter optimiert werden müssen.
Um eine Anreicherung der Nahrung und des Futters mit diesen mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu ermöglichen, besteht daher ein großer Bedarf an einem einfachen, kostengünstigen Verfahren zur Herstellung dieser mehrfach ungesättigten Fettsäuren speziell in eukaryontischen Systemen.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einem eukaryontischen Organismus zu entwickeln. Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in einem Organismus gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe aus:
i) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder
SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, die für ein Polypeptid mit einer Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren; oder
ii) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz ableiten lassen; oder
iii) Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID
NO: 6 aufweisen und eine äquivalente Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferaseaktivität aufweisen,
in den Organismus, und
b) Kultivieren und Ernten des Organismus. Vorteilhaft enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens zwei, vorteilhaft drei Doppelbindungen. Besonders vorteilhaft enthalten die Fettsäuren vier oder fünf Doppelbindungen. Im Verfahren hergestellte Fettsäuren haben vorteilhaft 16-, 18-, 20- oder 22 C- Atome in der Fettsäurekette. Diese Fettsäuren können als einziges Produkt im Verfahren hergestellt werden oder in einem Fettsäuregemisch vorliegen.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren.
Die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind vorteilhaft in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen vorkommen. Dabei können sie wie gesagt als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vorliegen. Dabei lassen sich die in den Triacylglyceriden gebundenen verschiedenen Fettsäuren von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen ableiten, bevorzugt sind langkettige Fettsäuren, besonders bevorzugt sind die langkettigen C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuren (LCPUFAs).
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C16-, C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuremolekülen mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäureester hergestellt. Bevorzugt enthalten diese Fettsäuremoleküle drei, vier oder fünf Doppelbindungen und führen vorteilhaft zur Synthese von Hexadecadiensäure (C16:2Δ9'12), γ-Linolensäure (= GLA, C18:3Δ6'9'12), Stearidonsäure (= SDA, Cl 8:4 Δ6'9'12'15)5 Dihomo-γ-Linolensäure (= DGLA, 20:3 Δ8'π'14), Eicosatetraensäure (= ETA, C20:4Δ5'8>1 M4), Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) oder deren Mischungen, bevorzugt zur Synthese von EPA und/oder ARA.
Die Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C16-, C18-, C20- und/oder C22- Fettsäuremolekülen können aus den Organismen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids, beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Lipiden, Glykolipiden wie Glykosphingolipid, Phospholipiden wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceriden, Diacylglyceriden, Triacylglyceriden oder sonstigen Fettsäureestern wie den Acetyl-CoenzymA-Estern, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei, bevorzugt drei, Doppelbindungen enthalten, isoliert werden. Neben diesen Estern sind die mehrfach ungesättigten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden in anderen Verbindungen in den Organismen, vorteilhaft den Pflanzen, enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und freie
Fettsäuren) in den Organismen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceriden, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceriden, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceriden, 1 bis 5 Gew.-% freien Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipiden vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 8 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 10 Gew.-%, am meisten bevorzugt von mindestens 15 Gew.-%, bezogen auf die gesamten Fettsäuren in den transgenen Organismen, vorteilhaft einer transgenen Pflanze, hergestellt. Da im erfindungsgemäßen Verfahren ausgehend von den Verbindungen
Hexadecadiensäure (Cl 6:2), Linolsäure (Cl 8:2) bzw. Linolensäure (Cl 8:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Endprodukte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA) oder Eicosapentaensäure (EPA) nicht als absolute Reinprodukte an, sondern es sind immer auch geringe Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in dem Ausgangsorganismus bzw. in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA und EPA als Mischungen vor. Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 Gew.-%, am meisten bevorzugt nicht mehr als 5, 4, 3, 2, 1 Gew.-%, bezogen auf die Menge des jeweilige Endprodukts, betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ARA oder nur EPA im erfϊndungsgemäßen Verfahren gebunden oder als freie Fettsäuren hergestellt. Werden beide Verbindungen (ARA + EPA) gleichzeitig hergestellt, werden sie vorteilhaft in einem Verhältnis von mindestens 1 :2 (EPA: ARA), vorteilhaft von mindestens 1:3, bevorzugt von mindestens 1 :4, besonders bevorzugt von mindestens 1 :5 hergestellt.
Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäuren oder
Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Fettsäuren oder die Fettsäurezusammensetzungen aus dem Organismus wie den Mikroorganismen oder den Pflanzen oder dem Kulturmedium, in dem oder auf dem die Organismen angezogen wurden, oder aus dem Organismus und dem Kulturmedium in bekannter Weise beispielsweise über Extraktion,
Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft.
Als Organismus für die Herstellung im erfindungsgemäßen Verfahren kommen prinzipiell alle Organismen wie Pilze wie Mortierella oder Traustochytrium, Hefen wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, Moose wie Physcomitrella oder Ceratodon, nicht-humane Tiere wie Caenorhabditis, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum oder Pflanzen wie zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanzen in Frage. Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Organismen verwendet, die zu den Öl-produzierenden Organismen gehören, das heißt, die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Pilze wie Mortierella oder
Traustochytrium, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum oder Pflanzen, insbesondere Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix- Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind Cl 8:2- und/oder C18:3-Fettsäure-reiche Pflanzen wie Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel. Am meisten bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
Für das erfindungsgemäße beschriebene Verfahren ist es vorteilhaft, zusätzlich zu den unter Verfahrensschritt (a) eingebrachten Nukleinsäuren weitere Nukleinsäuren in den Organismus einzubringen, die für Enzyme des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels kodieren. Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit der erfinderischen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase im Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren verwendet werden, vorteilhaft werden Gene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A- Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure- Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) in Kombination mit der Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6- Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen oder Δ-9-Elongasen in Kombination mit der erfinderischen Acyl- CoAiLysophospholipid-Acyltransferase im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
Durch die enzymatische Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferaseaktivität kodieren, vorteilhaft in Kombination mit Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels mit Δ-4-, Δ-5-, Δ-6-, Δ-8-Desaturase- oder Δ-5-, Δ-6-oder Δ-9-Elongaseaktivität kodieren, können im erfindungsgemäßen Verfahren unterschiedlichste mehrfach ungesättigte Fettsäuren hergestellt werden. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Organismen wie den vorteilhaften Pflanzen lassen sich Mischungen der verschiedenen mehrfach ungesättigten
Fettsäuren oder einzelne mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie EPA oder ARA in freier oder gebundener Form herstellen. Je nachdem welche Fettsäurezusammensetzung in der Ausgangspflanze vorherrscht (Cl 8:2- oder Cl 8:3- Fettsäuren) entstehen so Fettsäuren, die sich von C18:2-Fettsäuren ableiten, wie GLA, DGLA oder ARA oder solche, die sich von C18:3-Fettsäuren ableiten, wie SDA, ETA oder EPA. Liegt in der für das Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur Linolsäure (= LA, C18:2Δ9'12) vor, so können als Produkte des Verfahrens nur GLA, DGLA und ARA entstehen, die als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Ist in der im Verfahren verwendeten Pflanze als ungesättigte Fettsäure nur α-Linolensäure (= ALA, C18:3Δ9'12'15) vorhanden, beispielsweise wie in Lein, so können als Produkte des Verfahrens nur SDA, ETA und EPA entstehen, die wie oben beschrieben als freie Fettsäuren oder gebunden vorliegen können. Durch Modifikation der Aktivität der an der Synthese beteiligten Enzyme Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase vorteilhaft in Kombination mit der Δ-5- und Δ-6-Desaturase sowie der Δ-6-Elongase, oder der Δ-5- und Δ- 8-Desaturase sowie der Δ-9-Elongase oder in Kombination mit nur den ersten beiden Genen der Synthesekette, Δ-6-Desaturase und Δ-6-Elongase oder Δ-8- Desaturase und Δ-9-Elongase, lassen sich in den vorgenannten Organismen, vorteilhaft in den vorgenannten Pflanzen, gezielt nur einzelne Produkte herstellen. Durch die Aktivität der Δ-6-Desaturase und Δ-6-Elongase entstehen je nach Ausgangspflanze und ungesättigter Fettsäure beispielsweise GLA und DGLA bzw. SDA und ETA. Bevorzugt entstehen DGLA bzw. ETA oder deren Mischungen. Wird zusätzlich die Δ-5-Desaturase in die Organismen, vorteilhaft in die Pflanze, eingebracht, so entstehen auch ARA oder EPA. Dies gilt auch für Organismen, in die vorher die Δ-8-Desaturase und Δ-9-Elongase eingebracht wurde.
Zur Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren ist es vorteilhaft, die Menge an Ausgangsprodukt für die Fettsäuresynthese zu steigern. Dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturaseaktivität kodiert, in den Organismus erreicht werden. Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden Organismen wie Raps, die einen hohen Ölsäuregehalt aufweisen. Da diese Organismen nur einen geringen Gehalt an Linolsäure auiweisen (Mikoklajczak et al., Journal of the American OiI Chemical Society 38: 1961, 678 - 681) ist die Verwendung einer Δ-12-Desaturase zur Herstellung des Ausgangsprodukts Linolsäure vorteilhaft.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren stammen vorteilhaft aus Pflanzen wie Algen wie Isochrysis oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen wie Phaeodactylum, Moosen wie Physcomitrella oder Ceratodon oder höheren Pflanzen wie den Primulaceae wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen wie Pilzen wie Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophtora, Entomophthora, Mucor oder Mortierella, Hefen oder Tieren wie Nematoden wie Caenorhabditis, Insekten oder dem Menschen. Vorteilhaft stammen die Nukleinsäuren aus Pilzen, Tieren oder aus Pflanzen wie Algen oder Moosen, bevorzugt aus Nematoden wie Caenorhabditis.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren die vorgenannten
Nukleinsäuresequenzen oder deren Derivate oder Homologe, die für Polypeptide kodieren, die noch die enzymatische Aktivität der durch die Wildtyp- Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteine besitzen, verwendet. Diese Sequenzen werden einzeln oder in Kombination mit der für die Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferase kodierenden Nukleinsäuresequenz in Expressionskonstrukte Moniert und zum Einbringen und zur Expression in Organismen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen eine optimale Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer Zelle oder eines ganzen Organismus, der die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei die Zelle und/oder der Organismus mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, die für die Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase kodiert, einem Genkonstrukt oder einem Vektor wie nachfolgend beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels kodieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Feinchemikalie aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Fermentationskultur, beispielsweise im Falle der Kultivierung von Mikroorganismen wie z.B. Mortierella, Saccharomyces oder Traustochytrium, oder um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln. Die so hergestellte Zelle oder der so hergestellte Organismus ist vorteilhaft eine Zelle eines Öl-produzierenden Organismus wie einer Ölfruchtpflanze wie beispielsweise Erdnuss, Raps, Canola, Lein, Hanf, Erdnuss, Soja, Safflower, Hanf, Sonnenblumen oder Borretsch.
Unter "Anzucht" ist beispielsweise im Falle von Pflanzenzellen, -geweben oder -organen die Kultivierung auf oder in einem Nährmedium oder im Falle der ganzen Pflanze die Kultivierung auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
"Transgen" bzw. "rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemäßen
Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren alle durch gentechnische Methoden zustande gekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder
a) die erfϊndungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder
b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor oder c) (a) und (b)
nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei es sich bei der Modifikation beispielhaft um eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste handeln kann.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen genomischen bzw. chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit dem entsprechenden Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase -Gen - wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise eine Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beispielsweise beschrieben in US 5,565,350 oder WO 00/15815.
Unter transgenem Organismus bzw. transgener Pflanze im Sinne der Erfindung ist wie vorgenannt zu verstehen, dass sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus befinden, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Transgen bedeutet aber auch wie genannt, dass sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus befinden, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder dass die Regulationssequenzen der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nichtnatürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind Pilze wie Mortierella oder Pflanzen wie Ölfruchtpflanzen.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die Expressionskassetten oder Vektoren eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind, Fettsäuren, speziell ungesättigte Fettsäuren, zu synthetisieren bzw. die für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais,
Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersafflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise der Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt sind
Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können, wie Pilze wie z.B. Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersafflor, Flachs, Hanf, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt sind Soja, Flachs, Raps, Färbersafflor, Sonnenblume, Calendula, Moriierella oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen neben den vorgenannten transgenen Organismen auch transgene Tiere, vorteilhaft nicht-humane Tiere wie beispielsweise C. elegans geeignet.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Verwendbare Expressionsstämme, z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen, sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119- 128.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden, ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzengewebe, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, zu verstehen, die sich von der transgenen Pflanze ableiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Organismen, vorteilhaft Pflanzen, in Form ihrer Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses
Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigte Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld gewinnen. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile, bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes Kaltschlagen oder Kaltpressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile, speziell die Samen, leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmem Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Im Falle von Mikroorganismen werden diese nach der Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert oder aber nach Aufschluss über verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base, beispielsweise Natronlauge, entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen, werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.
Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren produzierten PUFAs bzw. LCPUFAs C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Diese C18-, C20- oder C22-Fettsäuremoleküle lassen sich aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isolieren. Geeignete Organismen sind beispielsweise die vorstehend erwähnten. Bevorzugte Organismen sind transgene Pflanzen.
Eine Ausführungsform der Erfindung sind deshalb Öle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt worden sind, besonders bevorzugt Öle, Lipide oder eine Fettsäurezusammensetzung, die PUFAs umfassen und von transgenen Pflanzen herrühren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids, der Fettsäuren und/oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure aufweist. Vorzugsweise beträgt der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30 %, besonders bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, am meisten bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 % oder mehr. Der Anteil an einer Fettsäure kann z.B. nach Überführung der Fettsäuren in die Methylester durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Calendulasäure, Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangsorganismus der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen handelt es sich beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester.
Aus den im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit vorteilhaft mindestens zwei Doppelbindungen lassen sich die enthaltenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine
Alkalibehandlung, beispielsweise mit wässriger KOH oder NaOH, oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und über beispielsweise Phasentrennung und anschließende Ansäuerung mit z.B. H2SO4 isolieren. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren können nach Einbringung in einen Organismus, vorteilhaft eine Pflanzenzelle bzw. Pflanze, entweder auf einem separaten Plasmid liegen oder in das Genom der Wirtszelle integriert sein. Bei Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren über Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression in die Organismen, vorteilhaft zur multiparallelen samenspezifischen Expression von Genen in die Pflanzen, gebracht.
Moose und Algen sind die einzigen bekannten Pflanzensysteme, die erhebliche Mengen an mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäure (ARA) und/oder Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) herstellen. Moose enthalten PUFAs in Membranlipiden, während Algen, algenverwandte Organismen und einige Pilze auch nennenswerte Mengen an PUFAs in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren. Daher eignen sich Nukleinsäuremoleküle, die aus solchen Stämmen isoliert werden, die PUFAs auch in der Triacylglycerolfraktion akkumulieren, besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren und damit zur Modifikation des Lipid- und PUFA-Produktionssystems in einem Wirt, insbesondere Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, beispielsweise Raps, Canola, Lein, Hanf, Soja, Sonnenblumen, Borretsch. Sie sind deshalb vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar.
Als Substrate der erfindungsgemäßen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen werden vorteilhaft C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren verwendet. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen langkettiger PUFAs müssen die mehrfach ungesättigten C16- oder C18-Fettsäuren zunächst durch die enzymatische Aktivität einer Desaturase desaturiert und anschließend über eine Elongase um mindestens zwei Kohlenstoffatome verlängert werden. Nach einer Elongationsrunde führt diese Enzymaktivität zu C18- oder C20-Fettsäuren, und nach zwei oder drei Elongationsrunden zu C22- oder C24-Fettsäuren. Die Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Desaturasen und Elongasen führt vorzugsweise zu C18-, C20- und/oder C22-Fettsäuren, vorteilhaft mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders bevorzugt zu C20- und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise mit drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Molekül. Nachdem eine erste Desaturierung und die Verlängerung stattgefunden hat, können weitere Desaturierungsschritte wie z.B. eine solche in Δ-5-Position erfolgen. Besonders bevorzugt als Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure. Die C18- Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure können durch die erfindungsgemäße enzymatische Aktivität in Form der freien Fettsäure oder in Form der Ester, wie Phospholipiden, Glykolipiden, Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Monoacylglycerin, Diacylglycerin oder Triacylglycerin, verlängert werden.
Der bevorzugte Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen, Lipiden oder Fetten in den vorteilhaft verwendeten Pflanzen ist beispielsweise der Samen im Allgemeinen oder Zellschichten des Samens, so dass eine samenspezifische Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sinnvoll ist. Es ist jedoch nahe liegend, dass die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe beschränkt sein muss, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, die für Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen kodieren, kann im Verfahren die Menge der hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren mindestens um 10 % , bevorzugt mindestens um 15 %, besonders bevorzugt mindestens um 20 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 50 % und am meisten bevorzugt um mindestens 100% gegenüber dem Wildtyp der Organismen, die die Nukleinsäuren nicht rekombinant enthalten, erhöht werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren verwendeten Organismen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann vorteilhaft der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Organismen erhöht.
Werden im erfindungsgemäßen Verfahren als Organismen Mikroorganismen wie Hefen wie Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, Pilze wie Mortierella, Aspergillus, Phytophtora, Entomophthora, Mucor oder Traustochytrium, Algen wie Isochrysis, Phaeodactylum oder Crypthecodinium verwendet, so werden diese Organismen vorteilhaft fermentativ in einer dem Fachmann bekannten Weise angezogen bzw. gezüchtet.
Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie
Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH- Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden, oder nicht. Die Anzucht kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren können nach dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise über Extraktion, Destillation, Kristallisation, ggf. Salzfällung und/oder Chromatographie wie oben beschrieben aus den Organismen isoliert werden. Die Organismen können dazu vorher noch vorteilhaft aufgeschlossen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird, wenn es sich bei den Wirtsorganismen um Mikroorganismen handelt, vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0 °C bis 95 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 85 °C, besonders bevorzugt zwischen 15 °C bis 75 °C, und am meisten bevorzugt zwischen 15 °C bis 45 °C durchgeführt
Der pH-Wert wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 6 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 7 und 8 gehalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.
Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methode für General Bacteriology" der American Society für Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen wie oben beschrieben gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galaktose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Zellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung, zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und/oder Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und/oder Linolsäure, Alkohole und/oder Polyalkohole wie z. B. Glycerin, Methanol und/oder Ethanol und/oder organische Säuren wie z. B. Essigsäure und/oder Milchsäure.
Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak in flüssiger Form oder Gasform oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphat- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.
Als Schwefelquelle für die Herstellung von schwefelhaltigen Feinchemikalien, insbesondere von Methionin, können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium- Salze verwendet werden.
Dem Medium können Chelatbildner zugegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.
Die erfindungsgemäß zur Kultivierung von Mikroorganismen eingesetzten
Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig aus komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Informationen über die Medienoptimierung sind erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche
Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlweise kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH- Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH- Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder sauren Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die so erhaltenen, insbesondere mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthaltenden, Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.- %. Die Fermentationsbrühe kann anschließend weiterverarbeitet werden. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder eine Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Vorteilhaft wird die Biomasse nach Abtrennung aufgearbeitet.
Die Fermentationsbrühe kann aber auch ohne Zellabtrennung mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration eingedickt beziehungsweise aufkonzentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann schließlich zur Gewinnung der darin enthaltenen Fettsäuren aufgearbeitet werden.
Die Begriffe Produktion oder Produktivität sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (Verbindungen der Formel I), das in einer bestimmten Zeitspanne und einem bestimmten Fermentationsvolumen gebildet wird (z.B. kg Produkt pro Stunde pro Liter). Der Begriff Effizienz der
Produktion umfasst die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (z.B. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt). Der Begriff Ausbeute oder Produkt/Kohlenstoff- Ausbeute ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie). Dies wird gewöhnlich beispielsweise ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Erhöhen der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe Biosynthese oder Biosyntheseweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Die Begriffe Abbau oder Abbauweg sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) beispielsweise in einem Mehrschritt- und stark regulierten Prozess. Der Begriff Stoffwechsel ist im Fachgebiet bekannt und umfasst die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Stoffwechsel einer bestimmten Verbindung (z.B. der Stoffwechsel einer Fettsäure) umfasst dann die Gesamtheit der Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Die im Verfahren gewonnenen Fettsäuren eignen sich auch als Ausgangsmaterial für die chemische Synthese von weiteren Wertprodukten. Sie können beispielsweise in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmazeutika, Nahrungsmitteln, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren, die spezifisch C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül umsetzen, wobei die Nukleinsäuresequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthaltenen kodierenden Sequenz ableiten lassen,
c) Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 aufweisen und eine Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferaseaktivität aufweisen.
Vorteilhaft stammen die oben genannten Nukleinsäuresequenzen aus einem eukaryontischen Organismus, besonders bevorzugt aus Ostreococcus tauri oder Mantoniella squamata.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase- Aktivität oder für Proteine des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels kodieren, werden vorteilhaft in einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), die die Expression der Nukleinsäuren in einem Organismus, vorteilhaft einer Pflanze oder einem Mikroorganismus, ermöglicht, eingebracht.
Zum Einbringen werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu-DNA-Polymerase oder eines
Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches vor. Die Primer werden in Anlehnung an die zu amplifizierende Sequenz gewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann die Analyse nach gelelektrophoretischer Auftrennung hinsichtlich Qualität und Quantität erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung. Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen
Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilze gewährleisten und die gleichzeitig die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA- vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA-begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatoren und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir- Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden pBinl9, pBHOl, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten unter Einsatz von Ligase Moniert. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie die oben beschriebenen Promotoren und Terminatoren. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere Escherichia coli und Agrobacterium tumefaciens, unter selektiven Bedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen.
Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und Nukleinsäurekonstrukte in Organismen wie Mikroorganismen oder vorteilhaft Pflanzen eingebracht werden und damit bei der Pflanzentransformation verwendet werden, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71 - 119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205-225). Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die erfinderischen Nukleinsäuren und Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Organismen, vorteilhaft an Pflanzen, verwenden, so dass diese bessere und/oder effizientere Produzenten von PUFAs werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie in einer Ölfruchtpflanze oder einem Mikroorganismus direkt beeinflussen kann. Die Anzahl oder Aktivität des Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase-Proteins oder -Gens sowie von Genkombinationen von Acyl-CoA:Lysophospholipid-
Acyltransferasen, Desaturasen und/oder Elongasen kann erhöht sein, so dass größere Mengen der produzierten Verbindungen de novo hergestellt werden, weil den Organismen diese Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren zur Genexpression, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglichen.
Durch das Einbringen eines Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase-, Desaturase- und/oder Elongase-Gens oder mehrerer Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferase-, Desaturase- und/oder Elongase-Gene allein oder in Kombination mit anderen Genen in einen Organismus bzw. eine Zelle kann nicht nur der Biosynthesefluss zum Endprodukt erhöht, sondern auch die entsprechende Triacylglycerin-Zusammensetzung erhöht oder de novo geschaffen werden. Ebenso kann die Anzahl oder Aktivität anderer Gene, die am Import von Nährstoffen, die zur Biosynthese einer oder mehrerer Feinchemikalien (z.B. Fettsäuren, polaren und neutralen Lipiden) benötigt werden, erhöht sein, so dass die Konzentration dieser Vorläufer, Cofaktoren oder Zwischenverbindungen innerhalb der Zellen oder innerhalb des Speicherkompartiments erhöht ist, wodurch die Fähigkeit der Zellen zur Produktion von PUFAs, wie im folgenden beschrieben, weiter gesteigert wird. Fettsäuren und Lipide sind selbst als Feinchemikalien wünschenswert; durch Optimierung der Aktivität oder Erhöhung der Anzahl einer oder mehrerer Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, Desaturasen und/oder Elongasen, die an der Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind, oder durch Zerstören der Aktivität einer oder mehrerer Desaturasen, die am Abbau dieser Verbindungen beteiligt sind, kann es möglich sein, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Fettsäure- und Lipidmolekülen aus Organismen und vorteilhaft aus Pflanzen zu steigern. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten isolierten Nukleinsäuremoleküle kodieren für Proteine oder Teile von diesen, wobei die Proteine oder das einzelne Protein oder Teile davon eine Aminosäuresequenz enthalten, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 ist, so dass das Protein oder der Teil davon eine Acyl-
CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase-Aktivität beibehält. Vorzugsweise hat das Protein oder der Teil davon, das/der von dem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, noch seine wesentliche enzymatische Aktivität und besitzt die Fähigkeit, am Stoffwechsel von zum Aufbau von Zellmembranen oder Lipidkörperchen in Organismen, vorteilhaft in Pflanzen, notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über diese Membranen teilzunehmen. Vorteilhaft ist das von den Nukleinsäuremolekülen kodierte Protein zu mindestens etwa 40 %, vorzugsweise zu mindestens etwa 60 %,besonders bevorzugt zu mindestens etwa 70 %, 80 % oder 90 % und am meisten bevorzugt zu mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr homolog zu einer Aminosäuresequenz der Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6. Im Sinne der Erfindung ist unter Homologie oder homolog Identität oder identisch zu verstehen.
Unter wesentlicher enzymatischer Aktivität der verwendeten Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen ist zu verstehen, dass sie gegenüber den durch die Sequenz mit SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 und deren Derivate kodierten Proteinen/Enzymen im Vergleich noch eine enzymatische Aktivität von mindestens 10 %, bevorzugt mindestens 20 %, besonders bevorzugt mindestens 30 % und ganz besonders bevorzugt mindestens 40 % aufweisen und damit am Stoffwechsel von zum Aufbau von Fettsäuren in einem Organismus, vorteilhaft einer Pflanzenzelle, notwendigen Verbindungen oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können, wobei desaturierte C 16-, C 18-, C20- oder C24-Kohlenstoffketten mit Doppelbindungen an mindestens zwei, vorteilhaft drei, vier oder fünf Stellen gemeint sind. Vorteilhaft im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen aus Pilzen oder Pflanzen wie Algen oder Moosen wie den Gattungen Physcomitrella, Thraustochytrium, Phytophtora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium oder aus Nematoden wie Caenorhabditis, speziell aus den Gattungen und Arten Physcomitrella patens,
Phytophtora infestans, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum oder besonders vorteilhaft aus Ostreococcus tauri oder Mantoniella squamata.
Alternativ können die verwendeten isolierten Nukleotidsequenzen für Acyl-
CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen kodieren, die an eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 hybridisieren, z.B. unter stringenten Bedingungen.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in Organismen wie Mikroorganismen oder Pflanzen ermöglicht, in den jeweiligen Organismus eingebracht.
Dabei werden die für die erfinderischen Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferasen, die verwendeten Desaturasen und/oder die Elongasen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Die Expressionskassette (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt) kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder deren Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "Enhancer- Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 '-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase-Gene sowie die vorteilhaft verwendeten Δ-4-Desaturase-, Δ5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase- und/oder Δ-8- Desaturase-Gene und/oder die Δ-5-Elongase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-9-
Elongase-Gene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte kann/können zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene in das Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Expression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind ein oder mehrere Genkonstrukte, die eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder deren Derivate definiert sind und für Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 kodieren. Die genannten Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen führen dabei zu einem Austausch der Fettsäuren zwischen dem Mono-, Di- und/oder Triglyceridpool der Zelle und dem CoA-Fettsäureester-Pool, wobei das Substrat vorteilhaft ein, zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen und vorteilhaft 16, 18, 20, 22 oder 24 Kohlenstoffatome im Fettsäuremolekül aufweist. Gleiches gilt für ihre Homologen, Derivate oder Analoga, die funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen, vorteilhafterweise zur Steigerung der Genexpression, verbunden sind.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren wie dem cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, TJ-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotor vor und werden vorteilhafterweise in Gram-negativen Bakterien angewendet. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen liegen beispielsweise in den Gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADCl, MFa, AC, P-60, CYCl, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294), PRPl (Ward et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 22), SSU, OCS, Iib4, usp, STLSl, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-O 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397^404 (Tetracyclin-induzierbar), EP-A-O 335 528 (Abszisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8: 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase- Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangs-nr. U87999) oder der in EP-A-O 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren wie der ausführungsgemäße USP-Promotor, aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3-, Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608, 152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4- Promotor aus Brassica), Baeumlein et al. (1992) Plant J. 2 (2): 233-239 (LeB4- Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen: lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890. Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden bzw. Promotoren, die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samen- spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im Folgenden sind vorteilhafte bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia fabd) (Bäumlein et al. (1991) Mol. Gen Genet. 225(3)), Napin (Raps) (US 5,608,152), Acyl-Carrier Protein (Raps) (US 5,315,001 und WO 92/18634), Oleosin (Arabidopsis thalianä) (WO 98/45461 und WO 93/20216), Phaseolin (Phaseolus vulgaris) (US 5,504,200), Bce4 (WO 91/13980), Leguminosen B4 (LegB4- Promotor) (Bäumlein et al. (1992) Plant J. 2 (2): 233-9), Lpt2 und lptl(Gerste) (WO 95/15389 und WO95/23230), Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen (WO 99/16890), Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain (US 5,677,474), Bce4 (Raps) (US 5,530,149), Glycinin (Soja) (EP 571 741), Phosphoenol-
Pyruvatcarboxylase (Soja) (JP 06/62870), ADRl 2-2 (Soja) (WO 98/08962), Isocitratlyase (Raps) (US 5,689,040) oder α-Amylase (Gerste) (EP 781 849).
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erreichen (siehe eine Übersicht in Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generationen sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, die vorteilhafte Δ-4-Desaturase, die Δ-5-Desaturase, die Δ-6-Desaturase, die Δ-8- Desaturase und/oder die Δ-5-Elongase, die Δ-6-Elongase und/oder die Δ-9-Elongase kodieren, unter der Kontrolle eines eigenen, bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zur Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen fuhren können. Die
Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt, die vorteilhaft in einem Polylinker liegt und der gegebenenfalls ein Terminator folgt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach, bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich, mehrere
Nukleinsäuresequenzen hinter einen Promotor und ggf. vor einen Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt, eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4- oder DC3 -Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen.
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3 '-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. der OCSl -Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten für jedes Gen auch unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft wird als Biosynthesegen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl- ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure- Acyl-Transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl- Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure- Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) oder eine Kombination dieser Gene verwendet. Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen sind Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ- 9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-9- Elongasegene.
Dabei können die vorgenannten Desaturasen in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in erfindungsgemäße Expressionskassetten Moniert und zur Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterium eingesetzt werden. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektor eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferasen kodieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, das die verwendete Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6- Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ- 6-Elongase- und/oder Δ-9-Elongasegene enthält. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzliche DNA- Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die unten beschriebenen Nukleinsäuren oder das oben beschriebene
Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfassen. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie so aneinander gebunden sind, dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins, usw. abhängen kann.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen, Desaturasen und Elongasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheit halber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase-, Desaturase- und/oder Elongase-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus- Expressionsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in füamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb., S. 1-28,
Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology.l, 3:239-251), Ciliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Cohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Art Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem
Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572, sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plauts, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7 -Promotor-Regulationssequenzen und T7 -Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konsumtive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions- Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. co/ϊ-Εxpressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) und pΕT 1 Id (Studier et al.. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression vom pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac- Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 1 Id- Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnlO-lac-Fusions-Promotor, die von einer koexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale
Polymerase wird in den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS 174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die Ml 13mp- Reihe, pKC30, ρRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN- IHl 13-Bl, λgtl 1 or pBdCI, in Streptomyces pIJlOl, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBl 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.
Bei einer weiteren Ausfuhrungsform ist der Εxpressionsvektor ein Hefe-Εxpressions- vektor. Beispiele ftir Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113- 123) sowie pYES2 (Invitrogen Coφoration, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, PJ. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396-428: Academic Press: San Diego). Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEp 13 oder pEMBLYe23.
Alternativ können die Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, Desaturasen und/oder Elongasen in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus- Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus- Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39). Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook und Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 2001.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die Acyl-CoA:Lyso- phospholipid-Acyltransferasen, Desaturasen und/oder Elongasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plauts; in: Transgenic Plauts, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T- DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet. Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive- Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader- Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA- Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
Das zu exprimierende Gen muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression aufrechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konsumtive Promotoren (Benfey et al. (1989) EMBO J. 8: 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294), 19S CaMV (siehe auch US 5,352,605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting- Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment, beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Piastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen, notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode (1996) Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4: 285-423 und darin zitierte Literatur stellen).
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2: 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRPl-Gen- Promotor (Ward et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 22: 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alphaamylase- Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinll- Promotor (EP-A-O 375 091).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und
Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Viciafaba (Baeumlein et al. (1991) Mol Gen Genet. 225 (3):459-67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der
Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2 (2): 233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, usw. herbeiführen. Geeignete Promotoren sind der lpt2- oder lpt1 -Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis- Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin- Gen, dem Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen- Secalin-Gen).
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische
Expression herbeiführen, da Piastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerase-Promotor, beschrieben in
WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, der in
WO 99/46394 beschrieben ist.
Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen allein oder in Kombination mit Desaturasen und/oder Elongasen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren, die jeweils mehrere Expressionskassetten enthalten, transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.
Vektor-DNA lässt sich in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", Konjugation und Transduktion, wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäuren (z.B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook und Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 3. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 2001) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen Genproduktes oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Die vorteilhafterweise verwendeten Wirtsorganismen sind Mikroorganismen, wie Pilze oder Hefen oder Pflanzenzellen, vorzugsweise Pflanzen oder Teile davon. Pilze, Hefen oder Pflanzen werden vorzugsweise verwendet, besonders bevorzugt Pflanzen, ganz besonders bevorzugt Pflanzen, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Raps, Nachtkerze, Hanf, Distel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia- Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix- Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuss) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Soja, Erdnuß, Raps, Canola, Lein, Hanf, Nachtkerze, Sonnenblume, Safflor, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind wie oben beschrieben isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferaseaktivität kodieren, wobei die durch die Nukleinsäuresequenzen kodierten Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen spezifisch C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer Doppelbindungen im Fettsäuremolekül umsetzen.
Vorteilhafte isolierte Nukleinsäuresequenzen sind Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
d) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, e) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthaltenen kodierenden Sequenz ableiten lassen
f) Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz aufweisen und eine Acyl-CoA:Lysophospholipid- Acyltransferaseaktivität aufweisen.
Die oben genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen stammen aus Organismen, wie Tieren, Ciliaten, Pilzen, Pflanzen wie Algen oder Dinoflagellaten, die PUFAs synthetisieren können. Bevorzugt stammen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen aus Ostreococcus tauri oder Mantonella squamata.
Der Begriff "Nukleinsäure(molekül)", wie hier verwendet, umfasst in einer vorteilhaften Ausfuhrungsform zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des kodierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens 500, bevorzugt 200, besonders bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 '-Endes des kodierenden Bereichs und mindestens 100, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 '-Endes des kodierenden Genbereichs. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, welche die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (z.B. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden). Bei verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasemolekül zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt, flankieren.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder eines Teils davon, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridisierungssonde in Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 2001) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z.B. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und cDNA mittels Reverser Transkriptase (z.B. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL) herstellen. Synthetische Oligonukleotidprimer zur Amplifizierung mittels Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleinsäuresequenzen oder mit Hilfe der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor Moniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
Homologe der verwendeten Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase- Nukleinsäuresequenzen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 bedeutet beispielsweise allelische Varianten mit mindestens etwa 40 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 % oder 90 bis 95 % und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Homologie zu einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenzen oder ihren Homologen, Derivaten oder Analoga oder Teilen davon. Weiterhin umfasst sind isolierte Nukleinsäuremoleküle einer Nukleotidsequenz, die an eine der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenzen oder einen Teil davon hybridisiert, z.B. unter stringenten Bedingungen. Allelische Varianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus/in der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz erhalten lassen, wobei aber die Absicht ist, dass die Enzymaktivität der dadurch entstehenden Proteine im Wesentlichen beibehalten wird.
Homologe der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 bedeuten beispielsweise auch bakterielle, Pilz- und Pflanzenhomologe, verkürzte Sequenzen, einzelsträngige DNA oder RNA der kodierenden und nicht-kodierenden DNA- Sequenz. Homologe der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 bedeuten auch Derivate, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren stromaufwärts der angegebenen Nukleotidsequenzen können durch einen oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) modifiziert werden, ohne dass jedoch die Funktionalität oder Aktivität der Promotoren gestört wird. Es ist weiterhin möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht ist oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar aus heterologen Organismen, ersetzt werden.
Die vorgenannten Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren, die am Stoffwechsel von Lipiden und Fettsäuren, PUFA-Cofaktoren und Enzymen oder am Transport lipophiler Verbindungen über Membranen beteiligt sind, werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur Modulation der Produktion von PUFAs in transgenen Organismen vorteilhaft in Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Linum Arten wie Öl- oder Faserlein, Brassica- Arten, wie Raps, Canola und Rübsen, Pfeffer, Sonnenblume, Borretsch, Nachtkerze und Tagetes, Solanacaen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia- Arten, Erbse, Maniok, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss) und ausdauernden Gräsern und Futterfeldfrüchten, entweder direkt (z.B. wenn die Überexpression oder Optimierung eines Fettsäurebiosynthese-Proteins einen direkten Einfluss auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der Fettsäure aus modifizierten Organismen hat) verwendet und/oder können eine indirekte Auswirkung haben, die dennoch zu einer Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der PUFAs oder einer Abnahme unerwünschter Verbindungen führt (z.B. wenn die Modulation des Stoffwechsels von Lipiden und Fettsäuren, Cofaktoren und Enzymen zu Veränderungen der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion oder der Zusammensetzung der gewünschten Verbindungen innerhalb der Zellen fuhrt, was wiederum die Produktion einer oder mehrerer Fettsäuren beeinflussen kann).
Die Kombination verschiedener Vorläufermoleküle und Biosyntheseenzyme führt zur Herstellung verschiedener Fettsäuremoleküle, was eine entscheidende Auswirkung auf die Zusammensetzung der Lipide hat, da mehrfach ungesättigte Fettsäuren (= PUFAs) nicht nur in Triacylglycerin, sondern auch in Membranlipide eingebaut werden.
Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3 -Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glykolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl- CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl- ACP, das über eine Reihe von
Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Sahnonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612-636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeier et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522- 542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten, an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend wieder für weitere Elongationen aus den Phospholipiden in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen die erfindungsgemäßen Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA- Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden (siehe Abb. 4).
Vorläufer für die PUFA-Biosynthese sind beispielsweise Ölsäure, Linol- und
Linolensäure. Diese C18-Kohlenstoff-Fettsäuren müssen auf C20 und C22 verlängert werden, damit Fettsäuren vom Eicosa- und Docosa-Kettentyp erhalten werden. Mit Hilfe der im Verfahren verwendeten Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen, vorteilhaft in Kombination mit Desaturasen wie der Δ-4-, Δ-5-, Δ-6- und Δ-8- Desaturasen und/oder der Δ-5-, Δ-6-, Δ-9-Elongasen können Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure oder Docosahexaensäure sowie verschiedene andere langkettige PUFAs erhalten, extrahiert und für verschiedene Zwecke bei Nahrungsmittel-, Futter-, Kosmetik- oder pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden. Mit den genannten Enzymen können vorzugsweise C18-, C20-, und/oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei, vorteilhaft mindestens drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, vorzugsweise zu C20-, und/oder C22-Fettsäuren mit vorteilhaft drei, vier oder fünf Doppelbindungen im Fettsäuremolekül hergestellt werden. Die Desaturierung kann vor oder nach Elongation der entsprechenden Fettsäure erfolgen. Daher führen die Produkte der Desaturaseaktivitäten und der möglichen weiteren Desaturierung und Elongation zu bevorzugten PUFAs mit höherem Desaturierungsgrad, einschließlich einer weiteren Elongation von C20 zu C22-Fettsäuren, zu Fettsäuren wie γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Substrate der Acyl-CoA:Lyso- phospholipid-Acyltransferasen im erfindungsgemäßen Verfahren sind C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren wie zum Beispiel Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure, γ- Linolensäure, α-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Eicosatetraensäure oder Stearidonsäure. Bevorzugte Substrate sind Linolsäure, γ-Linolensäure und/oder α- Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure bzw. Arachidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure. Die C18-, C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen in der Fettsäure fallen im erfindungsgemäßen Verfahren in Form der freien Fettsäure oder in Form ihrer Ester beispielsweise in Form ihrer Glyceride an.
Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin (Mono-, Di- oder Triglycerid) verstanden. Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.
Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfϊndungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglykolipide. Beispielhaft seien hier die Glycerophospholipide Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide genannt.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen (1998) Lipid 100(4-5): 161-166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin- Speicherung und -Assemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney (1997) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19: 149-166; Ohlrogge und Browse (1995) Plant Cell 7: 957-970; Shanklin und Cahoon (1998) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 611-641; Voelker (1996) Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18: 111-13; Gerhardt, (1992) Prog. Lipid R. 31: 397-417; Gühnemann- Schäfer & Kindl (1995) Biochim. Biophys Acta 1256: 181- 186; Kunau et al. (1995) Prog. Lipid Res. 34: 267-342; Stymne et al. (1993) in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plauts, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists; 150-158, Murphy & Ross (1998) Plant Journal 13(1): 1-16.
Die im Verfahren hergestellten PUFAs umfassen eine Gruppe von Molekülen, die höhere Tiere nicht mehr (ausreichend) synthetisieren können und somit (zusätzlich) aufnehmen müssen, obwohl sie leicht von anderen Organismen wie Bakterien synthetisiert werden.
Der Begriff "Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen" im Sinne der Erfindung umfasst Proteine, die am Transfer der an Phospholipide gebundenen Fettsäuren in den CoA-Ester-Pool und vice versa teilnehmen, sowie ihre Homologe, Derivate oder Analoga. Unter Phospholipiden im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, und/oder Phosphatidylinositol, vorteilhafterweise Phosphatidylcholin. Der Begriff Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase- Nukleinsäuresequenz(en) im Sinne der Erfindung umfasst Nukleinsäuresequenzen, die eine Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, insbesondere eine Acyl- CoA:Lysophospatidylcholin-Acyltransferase, kodieren und eine kodierende Region und ggf. entsprechende 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzbereiche umfassen können.
Bei einer weiteren Ausführungsform kodieren Derivate des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, das wiedergegeben ist in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, Proteine mit mindestens 40 %, vorteilhaft etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 % und besonders bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 90 bis 95 % und am meisten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Homologie (= Identität) zu einer vollständigen Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6. Die Homologie wird über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für die Sequenzvergleiche kann das
Programm PiIeUp verwendet werden (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 und Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489), die im GCG Software-Packet (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)) enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm BestFit über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 8, Length Weight: 2.
Die Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit die gleiche Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase kodieren wie diejenige, die von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenzen kodiert wird.
Zusätzlich zu den in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 gezeigten Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase-Nukleotidsequenzen erkennt der Fachmann, dass innerhalb einer Population DNA-Sequenzpolymorphismen existieren können, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen führen können. Diese genetischen Polymorphismen im Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase-Gen können aufgrund von natürlicher Variation zwischen Individuen innerhalb einer Population existieren. Diese natürlichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase- Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktionelle Aktivität der Acyl- CoAiLysophospholipid-Acyltransferasen nicht verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Nukleinsäuremoleküle können auf der Grundlage ihrer Homologie zu den hier offenbarten Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase-Nukleinsäuren unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard- Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die mindestens 15 Nukleotide lang sind und die unter stringenten Bedingungen mit den Nukleinsäuremolekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 umfassen, hybridisieren. Es können auch Nukleinsäuren mit mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden verwendet werden. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, bevorzugt mindestens etwa 70 % und besonders bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 x Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodium citrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass sich diese Hybridisierungsbedingungen je nach dem Typ der Nukleinsäure und je nachdem, ob beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden können. Die Temperatur liegt beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im oben genannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50 % Formamid, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook und Russell, "Molecular Cloning", CoId Spring Harbor Laboratory, 2001; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford
University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Aminosäuresequenzen (z.B. einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6) oder von zwei Nukleinsäuresequenzen (z.B. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5) werden die Sequenzen zum optimalen Vergleich untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. Aminosäure- oder Nukleinsäure-'Ηomologie", wie hier verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d.h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100). Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen. Die verwendeten Programme bzw. Algorithmen sind oben angegeben.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für eine Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyl- transferase kodiert, die zu einer Proteinsequenz der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 homolog ist, kann durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingebracht werden. Mutationen können in eine der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird ein Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausfuhrungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase-kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können nach der hier beschriebenen Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Acyl-CoA:Lyso- phospholipid-Acyltransferase- Aktivität beibehalten haben. Nach der Mutagenese einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert und die Aktivität des Proteins kann z.B. unter Verwendung der hier beschriebenen Tests bestimmt werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1 : Allgemeine Verfahren
a) Allgemeine Klonierungsverfahren: Klonierungsverfahren wie beispielsweise Restriktionsspaltungen, Agarose- Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Verbindung von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli- und Hefe-Zellen, Anzucht von Bakterien und Sequenzanalyse rekombinanter DNA, wurden durchgeführt wie beschrieben in Sambrook und Russell (2001) (CoId Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0- 87969-309-6) oder Kaiser, Michaelis und Mitchell (1994) "Methods in Yeast Genetics" (CoId Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3).
b) Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht anders angegeben, in p. A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, im nachstehenden Text als H2O bezeichnet, aus einer Milli-Q-Wassersystem- Wasserreinigungsanlage (Millipore, Eschborn) hergestellt. Restriktionsendonukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden bezogen von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Pharmacia (Freiburg), Qiagen (Hilden) und Stratagene (Amsterdam, Niederlande). Wenn nicht anders angegeben, wurden sie nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Beispiel 2: Klonierung eines Acyltransferase-Gens aus Ostreococcus tauri
Durch Suche nach konservierten Bereichen in den Proteinsequenzen der bereits vorher isolierten LPCAT aus C. elegans (WO 2004/76617) konnte eine Sequenz mit entsprechenden Motiven in einer Ctoreococcus-Sequenzdatenbank (genomische Sequenzen) identifiziert werden (siehe Abb. 1). Es handelt sich dabei um die folgende Sequenz:
Die Klonierung des für dieses Protein kodierenden Gens wurde wie folgt durchgeführt:
40 ml einer Ostreococcus fauπ-Kultur in der stationären Phase wurden abzentrifugiert, in 100 μl Aqua bidest resuspendiert und bei -20°C gelagert. Mit Hilfe des PCR- Verfahrens wurden die zugehörigen genomischen DNAs amplifiziert. Die entsprechenden Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die ersten 20 Nukleotide am 5 '-Ende bzw. die letzten 20 Nukleotide am 3 '-Ende (inklusive Stopcodon) sowie am 5 '-Ende zusätzlich die Hefe-Konsensus-Sequenz für hocheffiziente Translation (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) trugen.
Folgende Primer wurden verwendet:
5 -119-Ot-LPC AT: ATG CTG GTC GCG CGC GTC CGA GC
T - 120-Ot-LPCAT-XhoI: ACT CGA GTC ACG AGT TGT TCA CGA GGC Die Positionen der verwendeten Primer sind in Abb. 1 angegeben.
Die Amplifizierung der OtLPCAT-DNA wurde jeweils mit 1 μl aufgetauten Zellen, 200 μM dNTPs, 2,5 U Tα^-Polymerase und 100 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten sowie ein letzter Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten. Beispiel 3 : Klonierung von Expressionsplasmiden zur heterologen Expression der OtLPCAT in Hefen
Die entsprechenden Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die Hefe- Konsensus- Sequenz für hocheffiziente Translation (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) neben dem Startcodon trugen. Die Amplifizierung der OtLPCAT wurde jeweils mit 1 μL cDNA, 200 μM dNTPs, 2,5 U Advantage-Volymerase und 100 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten sowie ein letzter Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten.
Für die Klonierung der Sequenz zur heterologen Expression in Hefen wurden folgende Oligonukleotide in der PCR-Reaktion verwendet:
*F=forward primer, R=reverse primer
Die PCR-Produkte wurden für 30 min bei 21 0C mit dem Hefe-Expressionsvektor pYES2.1 -TOPO (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben inkubiert. Das PCR-Produkt wird dabei durch einen T-Überhang und Aktivität einer Topoisomerase (Invitrogen) in den Vektor ligiert. Nach der Inkubation erfolgte dann die Transformation von E. coli DH5α-Zellen. Entsprechende Klone wurden durch PCR identifiziert, die Plasmid-DNA mittels Qiagen DNAeasy-Kit isoliert und durch Sequenzierung verifiziert. Die Sequenz des resultierenden Plasmids pYES2.1 -OtLPCAT ist in SEQ ID No. 7 angegeben. Die korrekte Sequenz wurde dann in den Sαcchαromyces- Stamm INVScI (Invitrogen) durch Elektroporation (1500 V) transformiert. Zur Kontrolle wurde der leere Vektor pYES2.1 parallel transformiert. Anschließend wurden die Hefen auf Komplett-Minimalmedium ohne Uracil mit 2 % Glucose ausplattiert. Zellen, die ohne Uracil im Medium wachstumsfähig waren, enthielten die entsprechenden Plasmide pYES2.1 oder pYES2.1 -OtLPCAT. Nach der Selektion wurden je zwei Transformanten zur weiteren funktionellen Expression ausgewählt.
Beispiel 4: Klonierung von OtLPCAT-Expressionsplasmiden zur Samenspezifischen Expression in Pflanzen
Für die Transformation von Pflanzen wurde ein Vektor auf der Basis von pSUN-USP erzeugt.
pSUN300 ist ein Derivat des Plasmides pPZP (Hajdukiewicz, P. et al.(1994) Plant Mol. Biol. 25: 989-994). pSUN-USP entstand aus pSUN300, indem in pSUN300 ein USP-Promotor als EcoRI- Fragment inseriert wurde. Der USP-Promotor entspricht den Nukleotiden 1-684 (Genbank Accession X56240), wobei ein Teil der nichtkodierenden Region des USP-Gens im Promotor enthalten ist. Das 684 Basenpaare große Promotorfragment wurde mittels eines käuflichen 17- Standardprimers (Stratagene) und eines synthetisierten Primers
(5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3')
über eine PCR-Reaktion nach Standardmethoden amplifiziert.
Das PCR-Fragment wurde mit EcoRI/Sall nachgeschnitten und in den Vektor pSUN300 mit OCS Terminator eingesetzt. Das Polyadenylierungssignal ist das des Octopinsynthase-Gens aus dem A. tumefaciens Ti-Plasmid (ocs-Terminator, Genbank Accession V00088) (De Greve,H. et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 (6): 499-511 ). Es entstand das Plasmid mit der Bezeichnung pSUN-USP. Das Konstrukt wurde zur Transformation von Arabidopsis thaliana, Raps, Tabak und Leinsamen verwendet.
Für die Klonierung der Ot-LPCAT in pSUN-USP wurden mit folgendem Primerpaar Notl- Schnittstellen am 5'- und 3'-Ende der kodierenden Sequenz eingefügt:
pSUN-OtLPCAT
Forward: 5 ' -GCGGCCGCACC ATGCTGGTCGCGCGCGTCCG Reverse: 3 ' -GCGGCCGCTCACGAGTTGTTCACGAGGC
Zusammensetzung des PCR- Ansatzes (50 μl):
5,00 μl Template cDNA 5,00 μl 1 Ox Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25 mM MgCl2 5,00 μl 2mM dNTP 1,25 μl je Primer (10 pmol/μL) 0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)
Reaktionsbedingungen der PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C Elongationstemperatur: 2 min 72°C Anzahl der Zyklen: 35
Die PCR-Produkte wurden für 16 h bei 37 0C mit dem Restriktionsenzym Notl inkubiert. Der Pflanzen-Expressionsvektor pSUN300-USP wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden die PCR-Produkte sowie der 7624 bp große Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA- Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA-Fragmente erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkte ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pSUN-OtLPCAT wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 5: Funktionelle Charakterisierung der OtLPCAT
Die Aktivität der OtLPCAT konnte nach Expression der OtLPCAT in Hefen und Fütterung verschiedener Fettsäuren ermittelt werden (Abb. 2).
Da die Expression der OtLPCAT zu einem effizienten Austausch der Acyl- Substrate führen sollte, wurde weiterhin das Doppelkonstrukt pESCLeu-PpD6-PSEl hergestellt, das die offenen Leserahmen einer Δ6-Desaturase (PpD6) und einer Δ6- Elongase (PSEl) aus Physcomitrella patens (siehe DE 102 19 203) beinhaltet, und zusammen mit entweder dem Leervektor pYES2.1 oder dem Vektor pYES2.1 -
OtLPCAT transformiert. Die Klonierung des Konstrukts pESCLeu-PpD6-PSEl kann der WO 2004/076617 entnommen werden, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Analysetechniken zur Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung von Organismen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie,
Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman (1985) Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH Weinheim; Fallon, A. et al. (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) "Product recovery andpurification" in: Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III, S. 469-714, VCH Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Für die Expression der OtLPCAT wurden zunächst Vorkulturen aus jeweils 2 ml CMdum-Flüssigmedium mit 2% (w/v) Raffinose, aber ohne Uracil und Leucin mit den ausgewählten Transformanten angeimpft und 2 Tage bei 30°C, 200rpm inkubiert. 5 ml CMdum-Flüssigmedium (ohne Uracil und Leucin) mit 2% Raffinose, 1% (v/v) Tergitol NP-40 und 250 μM Linolsäure (18:2Δ9'12) oder Linolensäure (18:3Δ9'12'15) wurden dann mit den Vorkulturen auf eine OD600 von 0,08 angeimpft. Die Expression wurde bei einer OD600 von 0,2-0,4 durch die Zugabe von 2% (w/v) Galaktose induziert. Die Kulturen wurden für weitere 48 h bei 20°C inkubiert.
Die Hefezellen aus den Hauptkulturen wurden durch Zentrifugation (100 x g, 10 min, 20°C) geerntet und mit 100 mM NaHCO3, pH 8,0 gewaschen, um restliches Medium und Fettsäuren zu entfernen. Aus den Hefe-Zellsedimenten wurden durch saure Methanolyse Fettsäuremethylester (FAMEs) hergestellt. Hierzu wurden die Zellsedimente mit 2 ml IN methanolischer Schwefelsäure und 2% (v/v)
Dimethoxypropan für 1 h bei 80°C inkubiert. Die FAMEs wurden zweimal mit Petrolether (PE) extrahiert. Zur Entfernung nicht-derivatisierter Fettsäuren wurden die organischen Phasen je einmal mit 2 ml 100 mM NaHCO3, pH 8,0 und 2 ml Aqua dest. gewaschen. Anschließend wurden die PE-Phasen mit Na2SO4 getrocknet, unter Argon eingedampft und in 100 μl PE aufgenommen. Die Proben wurden auf einer DB-23 -Kapillarsäule (30 m, 0,25 mm, 0,25 μm, Agilent) in einem Hewlett-Packard 6850-Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor getrennt. Die Bedingungen für die GLC- Analyse waren wie folgt: Die Ofentemperatur wurde von 50°C bis 250°C mit einer Rate 5°C/min und schließlich 10 min bei 250°C (halten) programmiert.
Die Identifikation der Signale erfolgte durch Vergleiche der Retentionszeiten mit entsprechenden Fettsäurestandards (Sigma). Die Methodik ist beschrieben zum Beispiel in Napier and Michaelson (2001) Lipids 36(8): 761-766; Sayanova et al. (2001) Journal of Experimental Botany 52(360): 1581-1585; Sperling et al.(2001) Arch. Biochem. Biophys. 388(2): 293-298 und Michaelson et al. (1998) FEBS Letters 439(3): 215-218.
Abb. 2A zeigt die Umsetzung der gefutterten Fettsäure 18:2A9'12 zu 20:3A8>11>14 durch Hefen, die mit den Plasmiden pESCLeu-PpD6-PSEl undpYES2.1 transformiert worden waren. Im Vergleich dazu zeigt Abb. 2B die Umsetzung in Hefen, die neben dem Plasmid pESCLeu-PpD6-PSEl zusätzlich das Plasmid pYES2.1 -OtLPCAT enthalten. Das gefütterte Substrat war in großen Mengen in allen transgenen Hefen nachzuweisen. Beide transgenen Hefen zeigten eine Synthese von 18:3Δ6'9'12 und
20:3 Δ 8>11'14, den Produkten der Δ-6-Desaturase- und Δ-6-Elongase-Reaktionen. Dies bedeutet, dass die Gene PpD6 und PSEl funktionell exprimiert werden konnten.
In den Kontroll-Hefen, die mit den Vektoren pESCLeu-PpD6-PSEl undpYes2.1 transformiert wurden, war der Anteil von 20:3Δ8>11'14, zu dem 18:3Δ6'9'12 durch PSEl elongiert wird, wesentlich niedriger als in den Hefen, die zusätzlich die OtLPCAT exprimieren. Tatsächlich konnte die Elongation von 18:3Δ6'9'12 durch die zusätzliche Expression von OtLPCAT um 150% verbessert werden (Abb. 2B). Diese signifikante Erhöhung des LCPUF A-Gehalts ist nur wie folgt zu erklären: die exogen gefütterte Fettsäure (18:2Δ9>12) wird zunächst in Phospholipide eingebaut und dort von der Δ-6-Desaturase zu 18:3Δ6'9'12 desaturiert. Erst nach Reäquilibrierung mit dem Acyl-CoA-Pool kann 18:3Δ6'9'12 durch die Elongase zu 20:3Δ8'π'14-CoA elongiert und dann wieder in die Lipide eingebaut werden. Die OtLPCAT ist in der Lage, die in Phospholipide eingebauten Δ6-desaturierten Acylgruppen sehr effizient in CoA- Thioester zurückzuverwandeln. Dadurch wird auch die Elongation der gefütterten Fettsäure 18:2Δ9'12 verbessert (Abb. 2B).
Beispiel 6: Klonierung von Acyltransferase-Genen aus Mantoniella squamata Durch Suche nach konservierten Bereichen in den Proteinsequenzen der bereits vorher isolierten LPCAT aus C. elegans (WO 2004/76617) konnten Sequenzen mit entsprechenden Motiven in einer Mantoniella-Sequenzάatenbank identifiziert werden (siehe Abb. 1). Es handelt sich dabei um die folgenden Sequenzen:
Die Klonierung der für diese Proteine kodierenden Gene wurde wie folgt durchgeführt:
Eine 2 1-Kultur von Mαntoniellα squαmαtα wurde in f/2 Medium (Guillard, R.R.L. (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In Culture of Marine Invertebrate Animals (Eds. Smith, W.L. and Chanley, M.H.), Plenum Press, New York, pp 29-60) für 14 Tage bei einer Lichtstärke von 80 E/cm2 angezogen.
Nach Zentrifugation der Zellen wurde mit Hilfe des RNAeasy Kits der Firma Qiagen (Valencia, CA, US) RNA nach Herstellerangaben isoliert. Die mRNA wurde mit dem Marathon cDNA Amplification-Kit (BD Biosciences) revers transkribiert und entsprechend den Herstellerangaben Adaptoren ligiert. Die cDNA-Bank wurde dann für die PCR zur Klonierung von Expressionsplasmiden mittels 5'- und 3'-RACE (rapid amplification of cDNA ends) verwendet.
Die zugehörigen genomischen DNAs wurden durch PCR amplifiziert. Die entsprechenden Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die ersten 20 Nukleotide am 5 '-Ende bzw. die letzten 20 Nukleotide am 3 '-Ende (inklusive Stopcodon) sowie am 5 '-Ende zusätzlich die Hefe-Konsensus-Sequenz für hocheffiziente Translation (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) trugen. Folgende Primer wurden verwendet:
5^-112-MA-LPCAT-BamHI: AGG ATC CAT GTC TTT TTA CCT CGT CAC CTT CAC C 3^-113-MA-LPCAT_XhoI: ACT CGA GTC ACG AGT ACT TGA CAA GGC für die kürzere Form der LPCAT aus Mantoniella squamata und
5^-118-MA-LPCAT: ATG TCG AGG TCG ACG GTA TCG AT
3^-113-MA-LPCAT_XhoI: ACT CGA GTC ACG AGT ACT TGA CAA GGC für die längere Form der LPCAT aus Mantoniella squamata.
Die Positionen der verwendeten Primer sind in Abb. 1 angegeben.
Die Amplifizierung der MsLPC AT-DN As wurde jeweils mit 1 μl aufgetauten Zellen, 200 μM dNTPs, 2,5 U Tα^-Polymerase und 100 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten sowie einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten.
Beispiel 7: Klonierung von Expressionsplasmiden zur heterologen Expression von MsLPCAT in Hefen
Die entsprechenden Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die Hefe- Konsensus- Sequenz für hocheffiziente Translation (Kozak (1986) Cell 44: 283-292) neben dem Startcodon trugen. Die Amplifizierung der MsLPCATs wurde jeweils mit 1 μL cDNA, 200 μM dNTPs, 2,5 U Advantage-Volymerase und 100 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: erste Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten sowie einem letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten. Für die Klonierung der Sequenz zur heterologen Expression in Hefen wurden folgende Oligonukleotide für die PCR-Reaktion verwendet:
*F=forward primer, R=reverse primer
Die PCR-Produkte wurden für 30 min bei 21 0C mit dem Hefe-Expressionsvektor pYES2.1 -TOPO (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben inkubiert. Das PCR-Produkt wird dabei durch einen T-Überhang und Aktivität einer Topoisomerase (Invitrogen) in den Vektor ligiert. Nach der Inkubation erfolgte dann die Transformation von E. coli DH5α-Zellen. Entsprechende Klone wurden durch PCR identifiziert, die Plasmid-DNA mittels Qiagen DNAeasy-Kit isoliert und durch Sequenzierung verifiziert. Die Sequenzen der resultierenden Plasmide pYES2.1 -MsLPCATl 12 bzw. pYES2.1 -MsLPCATl 18 sind in den SEQ ID Nos. 8 bzw. 9 angegeben. Die korrekte Sequenz wurde dann in den Saccharomyces -Stamm INVScI (Invitrogen) durch Elektroporation (1500 V) transformiert. Zur Kontrolle wurde der leere Vektor pYES2.1 parallel transformiert. Anschließend wurden die Hefen auf Komplett- Minimalmedium ohne Uracil mit 2 % Glucose ausplattiert. Zellen, die ohne Uracil im Medium wachstumsfähig waren, enthielten die entsprechenden Plasmide pYES2.1, pYES2.1 -MsLPCATl 12 oder pYES2.1 -MsLPCATl 18. Nach der Selektion wurden je zwei Transformanten zur weiteren funktionellen Expression ausgewählt. Beispiel 8: Klonierung von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in Pflanzen
Für die Transformation von Pflanzen wurde ein weiterer Vektor auf der Basis von pSUN-USP (siehe Beispiel 4) erzeugt. Dazu wurden mit folgenden Primerpaaren Notl- Schnittstellen am 5' und 3 '-Ende der kodierenden Sequenzen eingefügt:
pSUN-MsLPCAT112
Forward: 5 ' -GCGGCCGCACCATGTCTTTTTACCTCGTCAC
Reverse: 3 ' -GCGGCCGCTCACGAGTACTTGACAAGGC
pSUN-MsLPCAT118 Forward: 5'-GCGGCCGCACCATGTCGAGGTCGACGGTATC Reverse: 3 ' -GCGGCCGCTCACGAGTACTTGACAAGGC
Zusammensetzung des PCR- Ansatzes (50 μl):
5,00 μl Template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25 mM MgCl2 5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl je Primer (10 pmol/μL)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech )
Reaktionsbedingungen der PCR:
Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C Elongationstemperatur: 2 min 72°C Anzahl der Zyklen: 35
Die PCR-Produkte wurden für 16 h bei 37 0C mit dem Restriktionsenzym Notl inkubiert. Der Pflanzen-Expressionsvektor pSUN300-USP wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden die PCR-Produkte sowie der 7624 bp große Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA- Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA-Fragmente erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkte ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Die entstandenen Plasmide pSUN-MsLPCATl 12 und pSUN-MsLPCATl 18 wurden durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 9: Funktionelle Charakterisierung der MsLPCATs
Die Aktivität der MsLPCATs konnte nach Expression der MsLPCATs in Hefen und Fütterung verschiedener Fettsäuren ermittelt werden (Fig. 3 A, B und C). Wie in Beispiel 5 wurde auch hier das Konstrukt pESCLeu-PpD6-PSEl zusammen mit entweder dem Leervektor pYES2.1 oder dem Plasmid pYES2.1 -MsLPCATl 12 bzw. pYES2.1 -MsLPCATl 18 in die Hefen eingebracht.
Die Expression der MsLPCATs erfolgte wie in Beispiel 5 für die OtLPCAT beschrieben.
Figur 3A zeigt die Umsetzung der gefütterten Fettsäure 18:2A9'12 zu 20:3A8>11'14 durch Hefen, die mit dem Plasmid pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 transformiert worden waren. Im Vergleich dazu zeigt Figur 3B die Umsetzung in Hefen, die neben dem Plasmid pESCLeu-PpD6-PSEl zusätzlich das Plasmid pYES2.1-MsLPCAT112 enthalten. Figur 3 C beschreibt das Fettsäurespektrum von Hefen, die mit den
Plasmiden pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 -MsLPCATl 18 transformiert worden waren. Das gefütterte Substrat Linolsäure (18:2) war in großen Mengen in allen transgenen Hefen nachzuweisen. Alle transgenen Hefen zeigten eine Synthese von 18:3Δ6'9'12 und 20:3 Δ 8'π'14, den Produkten der Δ-6- Desaturase- und Δ-6-Elongase- Reaktionen. Dies bedeutet, dass die Gene PpD6 und Psel funktional exprimiert werden konnten. In den Kontroll-Hefen, die mit den Vektoren pESCLeu-PpD6-PSEl/pYES2.1 transformiert wurden, war der Anteil von 20:3Δ8>11'14, zu dem 18:3Δ6'9'12 durch PSEl elongiert wird, wesentlich niedriger als in den Hefen, die zusätzlich eine der beiden MsLPCATs exprimieren. Tatsächlich konnte die Elongation von 18:3Δ6'9'12 durch die zusätzliche Expression einer MsLPCAT um 70% (MsLPCATl 12) bzw. 160 % (MsLPCATl 18) verbessert werden (Abb. 3B, C). Diese signifikante Erhöhung des LCPUF A-Gehalts ist nur wie folgt zu erklären: die exogen gefütterte Fettsäure (18:2Δ9>12) wird zunächst in Phospholipide eingebaut und dort von der Δ-6- Desaturase zu 18:3Δ6'9'12 desaturiert. Erst nach Reäquilibrierung mit dem Acyl-CoA- Pool kann 18:3Δ6'9'12 durch die Elongase zu 20:3Δ8'π'14-CoA elongiert und dann wieder in die Lipide eingebaut werden. Die MsLPCATs sind in der Lage, die Δ6- desaturierten Acylgruppen sehr effizient in CoA-Thioester zurückzuverwandeln. Dabei wird auch die Elongation der gefütterten Fettsäuren 18:2Δ9'12 verbessert (Abb. 3B, C).
Beispiel 10: Pflanzentransformation und Expression von PUF A-spezifischen Acyltransferasen in Pflanzen
Die Expression von LCPUF A-spezifischen Acyltransferasen in transgenen Pflanzen ist vorteilhaft, um den LCPUF A-Gehalt in diesen Pflanzen zu erhöhen. Dazu wurden die erfindungsgemäßen Acyltransferase-cDNAs in binäre Vektoren Moniert (siehe Beispiele 4 und 8) und über Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer in
Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Linum usitatissimum übertragen. Die Expression der Acyltransferase-cDNA stand dabei unter der Kontrolle des samenspezifischen USP-Promotors (Konstruktion des binären Plasmids pSUN300- USP siehe Beispiel 4).
Besonders bevorzugt sind hierbei transgene Pflanzen, die bereits die für die Synthese von LCPUFAs notwendigen Desaturasen und Elongasen exprimieren und geringe Mengen dieser LCPUFAs herstellen. Solche Pflanzen sind beispielsweise die in DE 102 19 203 beschriebenen, die funktionelle Gene für die Δ-6-Desaturase, die Δ-6- Elongase und die Δ-5-Desaturase enthalten und geringe Mengen an ARA und EPA produzieren.
Die entstandenen binären Vektoren mit Acyltransferasegenen wurden in Agrobacterium tumefaciens transformiert (Höfgen und Willmitzer (1988) Nucl. Acids Res. 16: 9877). Die Transformation von A thaliana erfolgte mittels "floral dip" (Clough und Bent (1998) Plant Journal 16: 735 - 743), die von N. tabacum über Cokultivierung von Tabakblattstückchen mit transformierten A. tumefaciens -Zellen, die von Lein und Raps durch Kokultivierung von Hypokotylstücken mit transformierten A. tumefaciens '-Zellen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Die Expression der Acyltransferase-Gene in transgenen Arabidopsis-, Tabak-, Raps- und Leinpflanzen wurde durch Northern-Blot Analyse untersucht. Ausgewählte Pflanzen wurden auf ihren Gehalt an PUFAs im Samenöl untersucht.
Die Agrobacterium- vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BTl 1 -P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al. (1989) Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al. (1989) Plant Physiol. 91 : 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacteriumstamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt. Der Agrobacterium- vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich beispielsweise unter Verwendung einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285 beschriebenen Technik durchfuhren.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung beispielsweise einer in EP-A- O 0424047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-O 0397687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss, Polyethylenglycol- vermittelter DNA- Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser- Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York.
Für den Nachweis von Fettsäuren in Pflanzen werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
So kann die Analyse von Fettsäuren oder Triacylglycerin (= TAG, Abkürzungen in Klammern angegeben) z.B. mittels Fettsäuremethylester (= FAME), Gas- Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (= GC-MS) oder Dünnschichtchromatographie (TLC) erfolgen. Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren wie GC, GC- MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, OiIy Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie- Massenspektrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353) erbracht werden.
Das zu analysierende Pflanzenmaterial kann dazu entweder durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material wird dann anschließend nach dem Aufbrechen zentrifugiert. Das Sediment wird danach in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester können anschließend in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen werden. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester lassen sich unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definieren.
Bei Fettsäuren, für die keine Standards verfügbar sind, kann die Identität über Derivatisierung und anschließende GC-MS-Analyse gezeigt werden. Beispielsweise erfolgt die Lokalisierung von Fettsäuren mit Dreifachbindung über GC-MS nach Derivatisierung mit 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998, siehe oben).
Fettsäureanalyse in Pflanzen Die Gesamt-Fettsäuren wurden aus Pflanzensamen extrahiert und mittels Gaschromatographie analysiert.
Die Samen wurden mit 1 % Natriummethanolat in Methanol aufgenommen und 20 min bei RT (ca. 22 °C) inkubiert. Anschließend wurde mit NaCl-Lösung gewaschen und die FAME in 0,3 ml Heptan aufgenommen.
Die Proben wurden auf einer ZEBRON-ZB-Wax-Kapillarsäule (30 m, 0,32 mm, 0,25 mikro m; Phenomenex) in einem Hewlett Packard-6850-Gaschromatograph mit einem Flammenionisationsdetektor aufgetrennt. Die Ofentemperatur wurde von 7O0C (1 min halten) bis 2000C mit einer Rate von 20°C/min, dann auf 25O0C (5 min halten) mit einer Rate von 5°C/min und schließlich auf 26O0C mit einer Rate von 5°C/min programmiert. Als Trägergas wurde Stickstoff verwendet (4,5 ml/min bei 7O0C). Die Fettsäuren wurden durch Vergleich mit Retentionszeiten von FAME-Standards (SIGMA) identifiziert.
Aus den hier vorliegenden Arbeiten lässt sich die Funktion der Acyl-CoA:Lyso- phopholipid-Acyltranserase wie in Abb. 4 dargestellt ableiten. Der Biosynthese-Weg der LCPUFAS stellt sich damit wie folgt dar:
Desaturasen katalysieren die Einführung von Doppelbindungen in lipidgekoppelte Fettsäuren (s^-Acyl-Phosphatidylcholin), während die Elongasen exklusiv die Elongation Coenzym A-veresterter Fettsäuren (Acyl-CoAs) katalysieren. Nach diesem Mechanismus erfordert die alternierende Wirkung von Desaturasen und
Elongasen einen ständigen Austausch von Acyl-Substraten zwischen Phospholipiden und dem Acyl-CoA-Pool und somit die Existenz einer zusätzlichen Aktivität, die die Acyl-Substrate in die jeweils notwendige Substratform, d.h. Lipide (für Desaturasen) oder CoA-Thioester (für Elongasen), überführt. Dieser Austausch zwischen Acyl- CoA Pool und Phospholipiden wird durch LCPUF A-spezifische Acyl-CoA:Lyso- phopholipid-Acyltranserasen ermöglicht. Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausfuhrungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.
Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1: Aminosäure-Sequenzvergleich von OtLPCAT, MsLPCAT und CeLPCAT
Abb. 2: Fettsäureanalyse von Hefen, die mit den Plasmiden pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 (A) bzw. pLEU-PSEl(Pp)_d6Des(Pp) und pYES2.1 -OtLPCAT (B) transformiert worden waren, nach Fütterung mit 18:2A9'12.
Abb. 3: Fettsäureanalyse von Hefen, die mit dne Plasmiden pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 (A), pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 -MsLPCATl 12 (B) bzw. pESCLeu-PpD6-PSEl und pYES2.1 -MsLPCATl 12 (C) transformiert worden waren, nach Fütterung mit 18:2A9'12.
Abb. 4: Biosyntheseweg von LCPUFAs

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Acyl-CoA:Lyso- phospholipid-Acyltransferaseaktivität kodieren, wobei die durch die Nukleinsäuresequenzen kodierten Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen spezifisch C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens einer Doppelbindung im Fettsäuremolekül umsetzen und wobei die Nukleinsäuresequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthaltenen kodierenden Sequenz ableiten lassen, und
c) Derivaten der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die fiir Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 zeigen und eine Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferase- aktivität aufweisen.
2. Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, wobei die Sequenz aus einem
Eukaryont stammt.
3. Aminosäuresequenz, die von einer isolierten Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 kodiert wird.
4. Genkonstrukt, enthaltend eine isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist.
5. Genkonstrukt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche
Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure- Acyl-Transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n),
Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) .
6. Genkonstrukt nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche
Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthält, ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8- Desaturase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6- Elongase- oder Δ-9-Elongasegene.
7. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder ein
Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
8. Transgener nicht-humaner Organismus, enthaltend mindestens eine
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, ein Genkonstrukt nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder einen Vektor nach Anspruch 7.
9. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 8, wobei der
Organismus ein Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze ist.
10. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Organismus eine Pflanze ist.
11. Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in einem Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in den Organismus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
i) Nukleinsäuresequenzen mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Sequenz, die für ein Polypeptid mit einer Acyl-CoA^ysophospholipid-Acyltransferaseaktivität kodiert; oder
ii) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 enthaltenen kodierenden Sequenz ableiten lassen; oder
iii) Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz in den Organismus, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz kodieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 zeigen und eine äquivalente Acyl-CoAiLysophospholipid-Acyltransferase- aktivität aufweisen; und
b) Kultivieren und Ernten des Organismus.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu den unter Schritt a) genannten
Nukleinsäuresequenzen weitere Nukleinsäuresequenzen in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA- Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl- ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Fettsäure-
Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure- Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid- Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n) kodieren.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu den unter Schritt a) von Anspruch 11 genannten Nukleinsäuresequenzen und ggf. den in Anspruch 12 genannten Nukleinsäuresequenzen weitere Nukleinsäuresequenzen in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen,
Δ-8-Desaturasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6- Elongasen oder Δ-9-Elongasen kodieren.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat der Acyl- CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen C16-, C18-, C20- oder C22-Fettsäuren verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isoliert werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren C18-, C20- oder C22-Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Molekül sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahren eine mehrfach ungesättigte
Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, Eisosapentaensäure, Docosapentaensäure und Docosahexaensäure hergestellt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus ein Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus eine transgene Pflanze ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die transgene Pflanze eine Ölfruchtpflanze ist.
21. Öl, Lipide oder Fettsäuren oder eine Fraktion davon, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20.
22. Öl-, Lipid- oder Fettsäurezusammensetzung, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20 umfasst und aus transgenen Pflanzen stammt.
23. Verwendung von Öl, Lipiden oder Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20 oder einer Öl-, Lipid- oder
Fettsäurezusammensetzung nach Anspruch 22 in Futter, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.
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