EP1802652A1 - Souches de streptococcus thermophilus ami déficientes à post-acidification réduite - Google Patents

Souches de streptococcus thermophilus ami déficientes à post-acidification réduite

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EP1802652A1
EP1802652A1 EP05801557A EP05801557A EP1802652A1 EP 1802652 A1 EP1802652 A1 EP 1802652A1 EP 05801557 A EP05801557 A EP 05801557A EP 05801557 A EP05801557 A EP 05801557A EP 1802652 A1 EP1802652 A1 EP 1802652A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
strain
milk
ami
fermented food
acidification
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05801557A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Peggy Garault
Jean-Michel Faurie
Jérôme MENGAUD
Anne Druesne
Gaëlle QUERE-CHASSANG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Original Assignee
Gervais Danone SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA filed Critical Gervais Danone SA
Publication of EP1802652A1 publication Critical patent/EP1802652A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1238—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using specific L. bulgaricus or S. thermophilus microorganisms; using entrapped or encapsulated yoghurt bacteria; Physical or chemical treatment of L. bulgaricus or S. thermophilus cultures; Fermentation only with L. bulgaricus or only with S. thermophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the present invention relates to the field of lactic acid bacteria useful in the food industry.
  • the invention relates to natural strains of Streptococcus thermophilus, or natural variants of such strains, said strains or variants being AMI deficient in reduced post-acidification.
  • the invention also relates to the use of these strains for preparing fermented food products, as well as the fermented food products themselves.
  • lactic acid bacteria for the production of food products, especially dairy products, ferments involves various criteria, among which the acidifying activity and the formation of aromatic components which are responsible for the organoleptic properties of the product, as well as the production of thickening agents which play a role on texture and smoothness.
  • the acidifying activity is essentially characterized by three parameters: (i) the kinetics of acidification; (ii) the titratable acidity or the final fermentation pH which conditions the organoleptic properties of the product and its suitability for preservation; and (iii) the post-acidification which develops during the conservation of the product.
  • a high acidification speed makes it possible to reduce the period during which the preparation is sensitive to contaminants, and thus to reduce the risk of bacterial contamination.
  • Increasing the rate of acidification also improves the economics of the process by increasing the productivity and flexibility of industrial equipment.
  • the post-acidification properties of the strains are particularly important for the preservation of the products.
  • the fresh fermented products are generally stored at temperatures between approximately 4 ° C. and 8 ° C. for a period not usually exceeding 4 weeks.
  • the metabolic activity of bacteria is reduced by cold storage, it is not blocked. This remanent activity leads to the production of lactic acid from lactose, which results in a decrease in pH and an increase in acid taste which degrade the organoleptic properties of the product.
  • Phage resistance is a very important criterion in the choice of strains in order to reduce the risk of phage incidents in production, which are likely to block the whole production for decontamination, over more or less long periods.
  • French patent FR 2 725 212 describes a strain of S. thermophilus, deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM, Institut Pasteur, Paris, France) under the number I-1477, which exhibits rapid acidification kinetics allowing to reach a high degree of acidity, and which does not post-acidify during the conservation of fresh fermented dairy products.
  • S. thermophilus in milk The growth of S. thermophilus in milk is broken down into three growth phases:
  • the oligopeptide transport system in S. thermophilus is an ABC transporter (ATP-Binding Cassette) made up of a translocon of four proteins (AmiC, AmiD, AmiE and AmiF) and three binding proteins very homologous to each other (AmiA1, AmiA2 and AmiA3).
  • the growth in milk of mutants in which the transport system of the oligopeptides is altered is no longer optimal, which shows the importance of this transport system (Garault et al., 2002).
  • the Applicant has for the first time demonstrated natural strains and natural variants of strains of S. thermophilus, in which the oligopeptide transport system is at least partially altered. The Applicant has also shown that such strains and variants have particularly advantageous milk acidification properties.
  • the pH stabilizes at the end of fermentation for deficient AMI variants.
  • the first phase of growth in milk is not affected, and these variants can retain a first phase of relatively rapid acidification while having a second phase of much slower acidification. They can present an acidification curve having a strong slowing down at a pH higher than that for which acidification by a wild functional AMI strain is slowed down.
  • This “acidification tray”, at fermentation temperature is interesting insofar as it allows the fermented mass to be stored longer at fermentation temperature, without excessively acidification. This gives appreciable flexibility in the implementation of industrial processes. In fact, the time taken for the fermentation tanks to decut off is long, given their volume. The use of deficient AMI variants therefore makes it possible to limit the evolution of the pH of the fermented milk during the racking stage (cutting with cooling or direct packaging).
  • the pH threshold for which the acidification strongly slows down depends on the quantity of free amino acids and di- / tripeptides which can be transported by the AMI system and present in milk. It is therefore possible to control the stop pH of fermentation by modifying the content (quantitative and / or qualitative) of milk peptides.
  • the subject of the present invention is therefore a natural strain of S. thermophilus AMI deficient with reduced post-acidification, and its natural variants AMI deficient with similar milk acidification characteristics, as well as their cultures and fractions of biologically pure cultures.
  • said toxic analog may be chosen from aminopterin, triornithine and trilysine.
  • This analog will preferably be aminopterin.
  • a strain in accordance with the present invention is chosen from:
  • the advantage of using an AMI strain deficient compared to a functional AMI strain therefore lies in a reduction of 0.27 in the pH variation between the end of incubation and the end of life of the product.
  • the deficient AMI variants are obtained from a reference mother strain.
  • these will be natural variants obtained for example by mutation and selection according to their acidifying properties. The techniques for doing this are known, as are the tests making it possible to control the acidifying properties (in particular Spinnier H. E., Corrieu G., 1989).
  • strains 1-3211, 1-3301, and I-3302 which are natural AMI variants deficient in functional AMI mother strains (see the experimental part below)
  • strain I-2774 was isolated and identified by the Applicant as being naturally AMI deficient.
  • the strains according to the invention are particularly advantageous for the preparation of fermented food products.
  • Such fermented food products are dairy or vegetable products.
  • dairy product in addition to milk, products derived from milk, such as cream, ice cream, butter, cheese, yogurt; secondary products, such as whey, casein; as well as any prepared food containing, as a main ingredient, milk or milk constituents (eg infant formula).
  • plant product is meant, inter alia, products obtained from a plant base such as, for example, fruit juices and vegetable juices including soybean juice, oat juice or rice juice.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a fermented food product in which a substrate is fermented with at least one living strain as described above.
  • said other strain of bacteria is a strain of lactic acid bacteria, such as Streptococcus spp. ; Lactobacillus spp., Including L. bulgaricus, L. acidophilus and L. casei; Lactococcus spp. and Bifidobacterium spp.
  • the substrate to be used in the context of the aforementioned process will be chosen from: milk substrates, in particular milk; substrates based on vegetable raw materials, such as fruits, cereals and soybeans.
  • milk substrates in particular milk
  • substrates based on vegetable raw materials such as fruits, cereals and soybeans.
  • the substrate is milk, natural or reconstituted milk, skimmed or not, or media based on milk or milk product (s). ;
  • the substrate is based on vegetable raw materials, fruit juices and / or vegetable juices.
  • the present invention further relates to fermented food products, the organoleptic properties of which are preserved during storage.
  • organoleptic properties retained during storage means here that the organoleptic properties of the products do not vary (or not significantly for the consumer) over time, at least until the expiry date (DLC) ) products, or even advantageously beyond this date.
  • such products comprise at least one living strain according to the invention.
  • analog means any modified version of an initial compound, here a protein or a peptide, said modified version may be natural or synthetic, in which one or more atoms, such as carbon, hydrogen, oxygen, or heteroatoms such as nitrogen, sulfur or halogen, have been added or removed from the structure of the initial compound, so as to obtain a new molecular compound.
  • a “derivative” within the meaning of the invention is any compound which presents a resemblance or a structural motif in common with a reference compound (protein or peptide).
  • This definition also includes, on the one hand, the compounds which, alone or with other compounds, may be precursors or intermediate products in the synthesis of a reference compound, by means of one or more chemical reactions, and on the other hand the compounds which can be formed from said reference compound, alone or with other compounds, via one or more chemical reactions.
  • “derivatives” above at least hydrolysates, in particular tryptic, of proteins and / or peptides, hydrolysate fractions, as well as mixtures of hydrolysates and / or hydrolysate fractions.
  • Table 1 lists the main functional peptides released by the hydrolysis of proteins in human milk and cow's milk.
  • Table 2 below lists the main physiological activities of the functional peptides from milk known to date.
  • the food products according to the invention are functional foods.
  • “functional food” is intended to denote a food product which advantageously affects one or more target functions of the organism, independently of its nutritional effects. This may therefore result in an improvement in the state of health and / or well-being and / or a reduction in the risks of occurrence of diseases in a consumer who ingests normal amounts of the said product.
  • activities of a “functional food” there may be mentioned in particular anti-cancer, immunostimulatory, bone health promoters, anti-stress, opioids, anti-hypertension activities, which improve the bioavailability of calcium, or anti-microbial.
  • Such functional foods can be intended for humans and / or animals.
  • the food products which are the subject of the invention are fresh products.
  • the food products targeted by the present invention are in particular chosen from: a drink; yogurt or dessert cream; a fermented milk or juice.
  • the culture of the strains according to the invention can also be used as a probiotic in human or animal food, or even as a lactic ferment, for example in the context of the process described above.
  • the present invention relates to the use of at least one natural strain of S. thermophilus AMI deficient with reduced post ⁇ acidification, and / or of one or more natural variants thereof, also AMI deficient (s) with reduced post-acidification, and / or their cultures and fractions of biologically pure cultures, for prepare fermented food products whose organoleptic properties are preserved during storage.
  • the sensitivity of the S. thermophilus strains to aminopterin was checked. To do this, 200 ⁇ g of aminopterin were deposited on a disc placed on a petri dish containing Elliker medium on which 100 ⁇ l of bacterial suspension were deposited. If the strain is sensitive, an inhibition diameter appears around the disc after an overnight incubation.
  • the mother strains 1-1630 deposited with the CNCM on 10/24/95
  • I-3299 deposited with the CNCM on 9/16/04
  • the strain 1-1630 does not have a wall protease, while the strain I-3299 in has one. These two strains therefore have very different growth properties.
  • the wild strain 1-2774 exhibits a natural resistance to aminopterin, reflecting its deficiency in the AMI transport system.
  • a range of aminopterin from 0 to 200 ⁇ g / mL was carried out in a chemically defined medium (MCDaa) adapted to the growth of S. thermophilus and containing the 20 free amino acids as a source of nitrogen. From a preculture produced in MCDaa, all the tubes in the range were seeded at 1%. After a three-day incubation at 37 ° C., 100 ⁇ L of each culture tube was used to make a bacterial mat on an agar of Elliker medium. A disc on which 200 ⁇ g of aminopterin are deposited was placed in the center of the box. The dishes were then incubated for three days at 37 ° C. anaerobically.
  • MCDaa chemically defined medium
  • a preculture was carried out in sterilized milk with autolysate of yeast seeded at 1%, incubated for 18 h at 42 ° C. Then, the ferment was carried out in 100 m L of milk sterilized with autolysate incubated at 42 0 C and stopped by placing in ice water when the acidity of 8O 0 D was reached. The ferment was stored at 4 ° C. until the initiation of the acidification monitoring. For the initiation of acidification monitoring, 250 ml of milk were inoculated at 1% with the ferment of S. thermophilus.
  • CINAC for acidification monitoring Automatic system for measuring acidifying activity developed by G. Corrieu LGMPA, YSEBAERT brand
  • Alaco 7014 whey protein hydrolyzate, NZMP Gmbh,
  • MPH 955 casein hydrolyzate, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14
  • FSD 6441 whey protein hydrolyzate, NZMP Gmbh, Siemens
  • MPH 917 casein hydrolyzate, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14
  • WPH 926 whey protein hydrolyzate, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Germany.
  • C 12 milk protein hydrolyzate, DMV international NCB Laan 80, PO BOX 13 5460, Ba Zeghel, Netherlands.
  • MPH 910 casein hydrolyzate, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Germany.
  • the strain 1-3301 has kinetics whose latency is shorter in the presence of ingredient N3.
  • the pH obtained at the end of fermentation is higher the higher the ingredient N3 in the medium.
  • the deficient AMI strain makes it possible to have a pH difference (delta) of 0.29 between the pH at the end of incubation and the pH of the product at the end of life, while the mother strain gives rise to a pH delta 0.56.
  • the advantage of using the deficient AMI strain is 0.27 pH unit if we compare the ⁇ pH under these conditions.
  • the functional AMI mother strain 1-1630 (deposited at the CNCM on 10/24/95) is clearly stimulated by the addition of ingredient N3 in milk, while the deficient AMI strain which derives from it is not. not.
  • the peptides of the hydrolyzate N3 can be used by the mother strain, but are not used by the deficient AMI strain. 11.7. Acidification kinetics performed with different ingredients with the AMI deficiency strain 1-3211
  • the hydrolyzates MPH955 and WPH926 best stimulate the fermentation of the AMI strain deficient in milk. These are also the two hydrolysates with the highest levels of small peptides and free amino acids.

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Abstract

La présente invention concerne des souches naturelles de Streptococcus thermophilus AMI déficientes à post-acidification réduite. L'invention vise également l'utilisation de ces souches pour préparer des produits alimentaires fermentes, ainsi que les produits alimentaires fermentes eux-mêmes.

Description

SOUCHES DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS AMI DEFICIENTES A POST-ACIDIFICATION REDUITE
La présente invention se rapporte au domaine des bactéries lactiques utiles dans l'industrie agro-alimentaire.
Plus précisément, l'invention concerne des souches naturelles de Streptococcus thermophilus, ou des variants naturels de telles souches, lesdites souches ou variants étant AMI déficients à post-acidification réduite. L'invention vise également l'utilisation de ces souches pour préparer des produits alimentaires fermentes, ainsi que les produits alimentaires fermentes eux-mêmes.
Le choix des bactéries lactiques pour la production de produits alimentaires, notamment laitiers, fermentes fait intervenir différents critères, parmi lesquels l'activité acidifiante et la formation de composants aromatiques qui sont responsables des propriétés organoleptiques du produit, ainsi que la production d'agents épaississants qui jouent un rôle sur la texture et l'onctuosité.
L'activité acidifiante se caractérise essentiellement par trois paramètres : (i) la cinétique d'acidification ; (ii) l'acidité titrable ou le pH final de fermentation qui conditionne les propriétés organoleptiques du produit et son aptitude à la conservation ; et (iii) la post-acidification qui se développe au cours de la conservation du produit. Une vitesse d'acidification élevée permet de réduire la période durant laquelle la préparation est sensible aux contaminants, et de diminuer ainsi le risque de contamination bactérienne.
L'augmentation de la vitesse d'acidification améliore également l'économie du procédé en augmentant la productivité et la flexibilité du matériel industriel. Les propriétés de post-acidification des souches sont particulièrement importantes pour la conservation des produits. En effet, les produits frais fermentes sont généralement conservés à des températures comprises entre environ 40C et 80C pendant une durée n'excédant pas habituellement 4 semaines. Or, si l'activité métabolique des bactéries est réduite par la conservation au froid, elle n'en est pas pour autant bloquée. Cette activité rémanente entraîne la production d'acide lactique à partir du lactose, ce qui a pour conséquence une diminution du pH et une augmentation de la saveur acide qui dégradent les propriétés organoleptiques du produit.
De plus, outre les critères retenus pour leur contribution à la qualité du produit, d'autres éléments plus spécifiquement liés au procédé interviennent dans le choix des souches, par exemple la température de fermentation, la vitesse d'acidification et la résistance aux phages.
La résistance aux phages est un critère très important dans le choix des souches afin de diminuer le risque d'incidents phagiques en production, lesquels sont susceptibles de bloquer pour décontamination l'ensemble de la production, sur des périodes plus ou moins longues.
Le brevet français FR 2 725 212 décrit une souche de S. thermophilus, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, Paris, France) sous le n° I- 1477, qui présente une cinétique d'acidification rapide permettant d'atteindre un degré d'acidité élevé, et qui ne post-acidifie pas au cours de la conservation des produits laitiers frais fermentes.
Une autre souche de S. thermophilus (déposée le 30 décembre 1994 auprès de la CNCM sous le numéro 1-1520) est décrite dans le brevet français FR 2 771 600 comme ayant une capacité de post- acidification réduite. II n'est toutefois pas avantageux d'utiliser de telles souches pour fabriquer des aliments fonctionnels (i.e., des aliments qui ont un effet bénéfique sur une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme) comprenant notamment des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt à base de protéines et/ou peptides. Ces souches restent en effet capables de métaboliser (c'est-à-dire de dégrader afin d'utiliser comme sources d'azote) les protéines et/ou peptides, y compris les protéines et/ou peptides fonctionnels d'intérêt, que l'on entend bien évidemment préserver. C'est pourquoi, il est important pour l'industrie agro-alimentaire de disposer de bactéries fermentaires présentant à la fois : (i) une excellente viabilité ; (ii) une activité post-acidifiante très faible ou quasiment nulle ; et (iii) une capacité à métaboliser les protéines et/ou peptides, également très faible ou quasiment nulle. L'industrie agro-alimentaire doit en outre tenir compte d'une quatrième contrainte lorsqu'elle développe des produits, destinés à l'alimentation humaine et/ou animale, dans lesquels sont incorporés des microorganismes, plus particulièrement des microorganismes vivants. Les organismes (ici, microorganismes) génétiquement modifiés (OGM ou mutants) suscitent généralement un sentiment de crainte et d'appréhension chez les consommateurs. Cette image négative dont souffrent les OGM est telle que le public a tendance à « boycotter » les aliments contenant des OGM. Aussi, dans un contexte où les consommateurs exigent toujours plus de transparence quant au contenu des produits alimentaires qui leur sont proposés et quant à l'origine des ingrédients que ces produits contiennent, les industriels préfèrent proposer des produits sans OGM. Il est donc essentiel que les produits alimentaires issus de l'industrie et contenant des microorganismes soient préparés en utilisant exclusivement des souches naturelles ou des variants naturels de souches naturelles. C'est précisément à l'ensemble des contraintes mentionnées ci- dessus que répond la présente invention, en proposant des souches naturelles de S. thermophilus, ou des variants naturels de telles souches, lesdites souches ou variants étant AMI déficients à post-acidification réduite.
La croissance de S. thermophilus dans le lait se décompose en trois phases de croissance :
- une première phase de croissance exponentielle, qui ne dépend pas des caséines du lait ; - une deuxième phase de croissance dite "de transition" ; et
- une troisième phase de croissance exponentielle, sans doute limitée par le transport des peptides (Letort et al., 2002).
Le système de transport des oligopeptides chez S. thermophilus est un transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) constitué d'un translocon de quatre protéines (AmiC, AmiD, AmiE et AmiF) et de trois protéines de liaison très homologues entre elles (AmiA1 , AmiA2 et AmiA3). La croissance dans le lait de mutants chez lesquels le système de transport des oligopeptides est altéré n'est plus optimale, ce qui montre l'importance de ce système de transport (Garault et al., 2002). Dans le cadre de la présente invention, la Demanderesse a pour la première fois mis en évidence des souches naturelles et des variants naturels de souches de S. thermophilus, chez lesquels le système de transport des oligopeptides est au moins partiellement altéré. La Demanderesse a en outre montré que de telles souches et variants ont des propriétés d'acidification du lait particulièrement intéressantes.
D'une part, le pH se stabilise en fin de fermentation pour les variants AMI déficients. En effet, la première phase de croissance en lait n'est pas affectée, et ces variants peuvent conserver une première phase d'acidification relativement rapide tout en ayant une deuxième phase d'acidification beaucoup plus lente. Ils peuvent présenter une courbe d'acidification ayant un fort ralentissement à un pH supérieur à celui pour lequel l'acidification par une souche sauvage AMI fonctionnelle est ralentie. Ce « plateau d'acidification », à température de fermentation, est intéressant dans la mesure où il permet de stocker plus longtemps à température de fermentation la masse fermentée, et ce, sans acidification trop importante. Ceci confère une souplesse appréciable à la mise en oeuvre des procédés industriels. En effet, les temps de décaillage des cuves de fermentation sont longs compte-tenu de leur volume. L'utilisation de variants AMI déficients permet donc de limiter l'évolution du pH du lait fermenté au cours de l'étape du soutirage (décaillage avec refroidissement ou conditionnement direct).
D'autre part, le seuil de pH pour lequel l'acidification ralentit fortement dépend de la quantité d'acides aminés libres et de di-/tripeptides pouvant être transportés par le système AMI et présents dans le lait. Il est donc possible de piloter le pH d'arrêt de la fermentation en modifiant la teneur (quantitative et/ou qualitative) en peptides du lait.
La présente invention a donc pour objets une souche naturelle de S. thermophilus AMI déficiente à post-acidification réduite, et ses variants naturels AMI déficients ayant des caractéristiques d'acidification du lait similaires, ainsi que leurs cultures et fractions de cultures biologiquement pures.
Au sens de la présente invention, on entend par « souche naturelle AMI déficiente » ou « variant naturel AMI déficient », une souche ou un variant dont la croissance est stimulée par un mélange d'acides aminés libres, et non par un mélange constitué uniquement d'oligopeptides. Par « variants naturels ayant des caractéristiques d'acidification du lait similaires », on entend désigner des souches obtenues sans manipulation génétique, à partir d'une souche naturelle de référence, les souches ainsi obtenues étant, comme la souche de référence, à post-acidification réduite. Dans le présent contexte, on utilisera les termes « variant » ou « variant naturel » pour désigner une souche obtenue principalement par mutation et sélection à partir de la souche de référence ; tandis que le terme « mutant » sera plus spécifiquement réservé à une souche obtenue par des techniques de mutagénèse dirigée, notamment par transformation génétique à l'aide de vecteurs, appliquées à la souche de référence. Selon un mode de réalisation, la souche naturelle et/ou le variant naturel sont résistants à un analogue toxique d'oligopeptides transporté par le système de transport des oligopeptides AMI.
En particulier, ledit analogue toxique pourra être choisi parmi l'aminoptérine, la triornithine et la trilysine. Cet analogue sera de préférence l'aminoptérine.
On qualifiera ici de « résistance à l'aminoptérine », le fait que l'on observe, en présence d'un disque de papier imbibé de 200 μg d'aminoptérine, un diamètre d'inhibition inférieur ou égal à environ 2 cm, de préférence inférieur ou égal à environ 1 ,8 cm, sur une boite encemencée par 100 μl de suspension bactérienne saturée.
Une telle définition sera étendue mutatis mutandis par l'homme du métier à d'autres analogues toxiques d'oligopeptides transportés par le système AMI à la lumière de ses connaissances générales. Ainsi, l'homme du métier sera à même de faire varier les valeurs maximales des diamètres d'inhibition de manière appropriée en fonction des analogues toxiques considérés.
De préférence, une souche conforme à la présente invention est choisie parmi :
- la souche déposée à la CNCM le 10 mai 2004 sous le numéro 1-3211 ; - la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I- 3301 ;
- la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302 ;
- la souche déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774.
A titre d'exemple de caractéristiques acidifiantes intéressantes au sens de la présente invention, et comme le montrent les exemples suivants, on précisera que la souche AMI déficiente I-3302
(variant de la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 déposée à la CNCM le 16/09/04) permet d'obtenir une variation de pH de 0,29 entre le pH de fin d'incubation et le pH du produit en fin de vie, tandis que la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 donne lieu à une variation de pH de 0,56 entre ces deux temps. En ce cas, l'avantage d'utiliser une souche AMI déficiente par rapport à une souche AMI fonctionnelle réside donc dans une réduction de 0,27 de la variation de pH entre la fin d'incubation et la fin de vie du produit.
Comme indiqué supra, les variants AMI déficients sont obtenus à partir d'une souche-mère de référence. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, il s'agira de variants naturels obtenus par exemple par mutation et sélection selon leurs propriétés acidifiantes. Les techniques pour ce faire sont connues, de même que les tests permettant de contrôler les propriétés acidifiantes (notamment Spinnier H. E., Corrieu G., 1989). A la différence des souches 1-3211 , 1-3301 , et I-3302, qui sont des variants naturels AMI déficients de souches-mères AMI fonctionnelles (voir la partie expérimentale ci-après), la souche I-2774 a été isolée et identifiée par la Demanderesse comme étant naturellement AMI déficiente. Les souches selon l'invention sont particulièrement intéressantes pour la préparation de produits alimentaires fermentes.
De manière préférée, de tels produits alimentaires fermentes sont des produits laitiers ou végétaux.
Par « produit laitier », on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait (par exemple des laits infantiles). Par « produit végétal », on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz.
En outre, les définitions ci-dessus de « produit laitier » et « produit végétal » œuvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple.
Ainsi, la présente invention concerne également un procédé de préparation d'un produit alimentaire fermenté dans lequel un substrat est mis en fermentation avec au moins une souche vivante telle que décrite supra.
Il est avantageux de prévoir, dans ce procédé, l'utilisation d'une association d'une ou plusieurs souches bactériennes telles que décrites précédemment, avec notamment au moins une autre souche de bactérie vivante. Avantageusement, ladite autre souche de bactérie est une souche de bactérie lactique, telle que Streptococcus spp. ; Lactobacillus spp., notamment L. bulgaricus, L. acidophilus et L. casei ; Lactococcus spp. et Bifidobacterium spp.
De préférence, on choisira le substrat à mettre en œuvre dans le cadre du procédé susmentionné parmi : les substrats lactés, notamment le lait ; les substrats à base de matières premières végétales, telles les fruits, les céréales et le soja. On pourra ainsi notamment envisager :
- si le substrat est lacté, le lait naturel ou reconstitué, écrémé ou non, ou bien des milieux à base de lait ou de produit(s) d'origine laitière. ; et
- si le substrat est à base de matières premières végétales, des jus de fruits et/ou des jus végétaux.
Le substrat peut en outre avantageusement comporter des éléments couramment utilisés dans l'industrie agro-alimentaire pour la préparation de produits fermentes, notamment de desserts lactés, en particulier des éléments solides tels que des fruits, pépites de chocolat ou céréales par exemple, mais également des produits additionnels sucrés ou chocolatés liquides.
La présente invention concerne en outre des produits alimentaires fermentes, dont les propriétés organoleptiques sont conservées au cours du stockage. L'expression « propriétés organoleptiques conservées au cours du stockage » signifie ici que les propriétés organoleptiques des produits ne varient pas (ou pas de manière significative pour le consommateur) au cours du temps, au moins jusqu'à la date limite de consommation (DLC) des produits, voire avantageusement au-delà de cette date.
Selon un mode de réalisation, de tels produits comprennent au moins une souche vivante conforme à l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, les produits alimentaires fermentes selon l'invention sont susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus.
De manière préférée, les produits alimentaires fermentes selon l'invention contiennent au moins un ingrédient alimentaire bioactif (ou ingrédient alimentaire fonctionnel), notamment choisi parmi des protéines, des peptides, des analogues ou des dérivés de ceux-ci. L'expression « ingrédient alimentaire bioactif ou fonctionnel » désigne un ingrédient qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Ainsi, l'effet d'un tel ingrédient peut être une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit ingrédient.
Cette définition peut être étendue à l'aliment ou au produit contenant un tel ingrédient, ledit aliment ou produit pouvant dès lors être lui-même qualifié de bioactif ou fonctionnel. On entend par « analogue », n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire.
Un « dérivé » au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques. Sont ainsi couverts par la définition de « dérivés » ci-dessus au moins les hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats.
Parmi les ingrédients alimentaires bioactifs susceptibles d'être utilisés dans les produits alimentaires fermentes selon la présente invention, on peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, le peptide 91-100 de la caséine αsi (voir le brevet européen EP 0 714 910), le peptide C6- αsi 194-199 (voir le brevet américain US 6 514 941 ), le peptide C7-β177- 183 (voir le brevet américain US 6 514 941 ), le peptide C12-αsi23-34 (voir le brevet US américain 6 514 941 ), les caséinophosphopeptides, l'α- casomorphine, la caséine α exorphine, la casokinine, la β-casomorphine, les caséinomacropeptides (CMP) et les glycomacropeptides (GMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les β-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-GIn (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-GIn-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), He- Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N°17 de septembre 1998).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.
Tableau 1
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes (**) H: lait humain / V: lait de vache
Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour. Tableau 2
Tableau 2 (suite)
Tableau 2 (suite)
Tableau 2 (suite)
Avantageusement, les produits alimentaires selon l'invention sont des aliments fonctionnels.
Comme indiqué brièvement supra, par « aliment fonctionnel », on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un « aliment fonctionnel », on citera notamment des activités anti-cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore anti¬ microbiennes. De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux.
Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires objets de l'invention sont des produits frais.
Selon un autre mode de réalisation, les produits alimentaires visés par la présente invention sont notamment choisis parmi : une boisson ; un yoghourt ou une crème dessert ; un lait ou un jus fermenté.
La culture des souches selon l'invention, pures ou en association avec d'autres souches, peut également être utilisée comme probiotique dans l'alimentation humaine ou animale, ou encore comme ferment lactique, par exemple dans le cadre du procédé décrit plus haut.
En outre, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins une souche naturelle de S. thermophilus AMI déficiente à post¬ acidification réduite, et/ou d'un ou plusieurs variants naturels de celle- ci, également AMI déficient(s) à post-acidification réduite, et/ou de leurs cultures et fractions de cultures biologiquement pures, pour préparer des produits alimentaires fermentes dont les propriétés organoleptiques sont conservées au cours du stockage.
La présente invention est illustrée par les figures suivantes :
- Figure 1 : courbes de cinétiques d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 et de la souche AMI déficiente 1-3301.
Lait : lait sans hydrolysat de caséine ; lait + N3 0,2 g/L : lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 (ref 211693, Difco, USA) par litre de lait.
- Figure 2 : courbes de cinétiques d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 et de la souche AMI déficiente I-3302. Lait : lait sans hydrolysat de caséine ; lait + N3 0,2 g/L : lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait.
- Figure 3 : courbes de cinétiques d'acidification de la souche AMI déficiente 1-3301 en présence de quantités variables d'ingrédient N3. Lait : lait sans hydrolysat de caséine ; lait + 0,05 N3 : lait additionné de 0,05 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,1 N3 : lait additionné de 0,1 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,2 N3 : lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,4 N3 : lait additionné de 0,4 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,8 N3 : lait additionné de 0,8 g d'ingrédient N3 par litre de lait. - Figure 4 : courbes de cinétiques d'acidification de la souche AMI déficiente I-3302 en présence de quantités variables d'ingrédient N3. Lait : lait sans hydrolysat de caséine ; lait + 0,05 N3 : lait additionné de 0,05 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,1 N3 : lait additionné de 0,1 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,2 N3 : lait additionné de 0,2 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,4 N3 : lait additionné de 0,4 g d'ingrédient N3 par litre de lait ; lait + 0,8 N3 : lait additionné de 0,8 g d'ingrédient N3 par litre de lait.
- Figure 5 : courbes de cinétiques d'acidification obtenues à partir de la fermentation du lait après addition d'acides aminés avec la souche- mère AMI fonctionnelle 1-1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95) et la souche AMI déficiente 1-3211. Nom de la souche sans autres précisions : fermentation en lait ; nom de la souche + aa : fermentation réalisée en lait additionné de 20 acides aminés (correspondant au 1/40eme de la quantité déterminée pour le milieu chimiquement défini adapté à S. thermophilus (Letort et a/., 2001 ).
- Figure 6 : courbes de cinétiques obtenues en lait additionné d'ingrédient N3.
- Figure 7 : courbes de cinétiques d'acidification réalisées avec différents mélanges d'ingrédients. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples figurant dans la partie expérimentale ci-après et donnés à titre purement illustratif.
PARTIE EXPERIMENTALE
I. Matériels et Méthodes:
1.1. Obtention de variants AMI déficients :
a) Evaluation de la biodiversité de la résistance à l'aminoptérine chez
S. thermophilus
Dans un premier temps, la sensibilité des souches de S. thermophilus à l'aminoptérine a été vérifiée. Pour ce faire, 200 μg d'aminoptérine ont été déposés sur un disque placé sur une boîte de pétri contenant du milieu Elliker sur lequel ont été déposés 100 μl_ de suspension bactérienne. Si la souche est sensible, un diamètre d'inhibition apparaît autour du disque après une incubation d'une nuit. Les souches-mères 1-1630 (déposée auprès de la CNCM le 24/10/95) et I- 3299 (déposée auprès de la CNCM le 16/09/04) ont été sélectionnées car elles possèdent des propriétés de texture intéressantes. La souche 1-1630 ne possède pas de protéase de paroi, tandis que la souche I-3299 en possède une. Ces deux souches ont donc des propriétés de croissance très différentes.
Tableau 3
Une sensibilité différente a été observée en fonction des souches.
Dans le tableau 3, les variants AMI déficients obtenus sont indiqués en gris dans les cadres grisés, le cas échéant, en association avec leur souche-mère respective.
La résistance à l'aminoptérine est plus forte pour les variants que pour la souche-mère correspondante.
La souche sauvage 1-2774 présente une résistance naturelle à l'aminoptérine, traduisant sa déficience dans le système de transport AMI.
b) Obtention des variants AMI déficients Les protocoles de sélection de variants déficients pour le transport des peptides, utilisant un analogue peptidique toxique, ont déjà été décrits (Higgins et Gibson, 1986).
Brièvement, une gamme d'aminoptérine allant de 0 à 200 μg/mL a été réalisée en milieu chimiquement défini (MCDaa) adapté à la croissance de S. thermophilus et contenant les 20 acides aminés libres comme source d'azote. A partir d'une préculture réalisée en MCDaa, tous les tubes de la gamme ont été ensemencés à 1%. Après une incubation de trois jours à 370C, 100 μL de chaque tube de culture ont servi à réaliser un tapis bactérien sur une gélose de milieu Elliker. Un disque sur lequel sont déposés 200 μg d'aminoptérine a été placé au centre de la boîte. Les boîtes ont ensuite été incubées trois jours à 370C en anaérobiose. La présence de clones dans la zone d'inhibition a ensuite été observée, et une vingtaine de clones ont été prélevés afin d'ensemencer 5 mL de milieu Elliker. Les clones qui sont repartis dans ce milieu et ont donné une suspension bactérienne après 16H00 d'incubation à 370C ont permis la réalisation d'un tapis à la surface d'une gélose de milieu Elliker sur lequel a été déposé un disque imprégné de 200 μg d'aminoptérine. Tous les clones obtenus ont ensuite été testés en fermentation dans du lait. La cinétique d'acidification a fourni une information quant à la capacité de ces variants à acidifier le lait.
1.2. Préparation du lait :
Le lait a été reconstitué avec 120 g de poudre de lait écrémé, dans 930 mL d'eau. Après 30 minutes d'hydratation, le lait a été pasteurisé 30 minutes à 950C.
L'ingrédient N3 a été ajouté à partir d'une solution à 10 % réalisée dans de l'eau puis stérilisée par filtration à 0,22 μm. Les autres ingrédients testés ont été ajoutés au lait avant la pasteurisation.
La solution d'acides aminés a été réalisée dans l'eau puis stérilisée par filtration à 0,22 μm. 1.3. Préparation des ferments pour la réalisation des suivis d'acidification :
Une préculture a été réalisée dans du lait stérilisé avec autolysat de levure ensemencé à 1%, incubée 18h à 420C. Ensuite, le ferment a été réalisé dans 100 m L de lait stérilisé avec autolysat incubé à 420C et arrêté en le plaçant dans l'eau glacée quand l'acidité de 8O0D était atteinte. Le ferment était conservé à 40C jusqu'au lancement du suivi d'acidification. Pour le lancement du suivi d'acidification, 250 ml_ de lait ont été ensemencés à 1 % avec le ferment de S. thermophilus.
1.4. Matériels :
N3 : protéose peptone N°3, réf R211693, Difco, USA (hydrolysat de caséine contenant des peptides et, principalement, des acides aminés libres)
Poudre de lait: Milex 240, ArIa Food Ingrédients
Autolysat de levure: extrait de levure, ref AEB171109, AES Laboratoires
CINAC pour le suivi d'acidification : Système automatique de mesure de l'activité acidifiante développé par G. Corrieu LGMPA, marque YSEBAERT
Alaco 7014 : hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh,
Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne.
MPH 955 : hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14
D-25462, Rellingen, Allemagne. DSE 6441 : hydrolysat de protéine de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemens
Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne.
MPH 917 : hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14
D-25462, Rellingen, Allemagne.
WPH 926 : hydrolysat de protéine de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne.
MPH 948 : hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14
D-25462, Rellingen, Allemagne. C 12 : hydrolysat de protéine de lait, DMV international NCB Laan 80, P.O. BOX 13 5460, Ba Zeghel, Pays-Bas.
MPH 910 : hydrolysat de caséine, NZMP Gmbh, Siemens Strasse, 6-14 D-25462, Rellingen, Allemagne.
II. Résultats :
11.1. Cinétique d'acidification de la souche-mère AMI fonctionnelle I-3299 et de souches AMI déficientes qui en dérivent, en présence ou non d'ingrédient N3
On observe, sur les figures 1 et 2, que la souche-mère AMI fonctionnelle I- 3299 présente la même cinétique en présence ou en absence d'ingrédient N3 dans le lait. En revanche, les souches AMI déficientes présentent des cinétiques différentes.
11.2. Cinétique d'acidification avec des quantités variables d'ingrédient N3. souche AMI déficiente 1-3301
La souche 1-3301 a une cinétique dont la latence est plus courte en présence d'ingrédient N3. En outre, le pH obtenu en fin de fermentation est d'autant plus élevé qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu.
11.3. Cinétique d'acidification avec des quantités variables d'ingrédient N3. souche AMI déficiente I-3302
La cinétique d'acidification est d'autant plus rapide qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu. En outre, le pH obtenu en fin de cinétique est d'autant plus bas qu'il y a d'ingrédient N3 dans le milieu. 11.4. Résultats de post-acidification en souche pure (par comparaison avec la souche-mère 1-3299)
Tableau 4
La souche AMI déficiente permet d'avoir une différence (delta) de pH de 0,29 entre le pH de fin d'incubation et le pH du produit en fin de vie, alors que la souche-mère donne lieu à un delta de pH de 0,56. L'avantage d'utiliser la souche AMI déficiente est de 0,27 unité pH si l'on compare les δpH dans ces conditions.
11.5. Cinétiques d'acidification obtenues à partir de la fermentation du lait après addition d'acides aminés avec la souche-mère AMI fonctionnelle I- 1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95) et la souche AMI déficiente 1-3211 qui en dérive.
La stimulation produite par l'addition d'acides aminés libres dans le lait est la même pour la souche-mère et la souche AMI déficiente. Ce résultat semble logique dans la mesure où les acides aminés libres représentent la seule source d'azote disponible dans ces conditions pour les deux souches.
11.6. Cinétiques obtenues en lait additionné d'ingrédient N3
La souche-mère AMI fonctionnelle 1-1630 (déposée à la CNCM le 24/10/95), est clairement stimulée par l'addition d'ingrédient N3 dans le lait, alors que la souche AMI déficiente qui en dérive ne l'est pas. Les peptides de l'hydrolysat N3 sont utilisables par la souche-mère, mais ne le sont pas par la souche AMI déficiente. 11.7. Cinétiques d'acidification réalisées avec différents ingrédients avec la souche AMI déficience 1-3211
Les hydrolysats MPH955 et WPH926 stimulent le mieux la fermentation de la souche AMI déficiente dans le lait. Ce sont également les deux hydrolysats dont les teneurs en petits peptides et acides aminés libres sont les plus élevées.
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Souche naturelle de Streptococcus thermophilus AMI déficiente à post-acidification réduite, et ses variants naturels AMI déficients ayant des caractéristiques d'acidification du lait similaires, ainsi que leurs cultures et fractions de cultures biologiquement pures.
2. Souche selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est résistante à un analogue toxique d'oligopeptides transporté par le système AMI.
3. Souche selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit analogue toxique est l'aminoptérine.
4. Souche selon la revendication 3, caractérisée en ce que le diamètre d'inhibition observé en présence d'un disque de papier imbibé de 200 μg d'aminoptérine est inférieur ou égal à environ 2 cm, de préférence inférieur ou égal à environ 1 ,8 cm, sur une boite encemencée par 100 μl de suspension bactérienne saturée.
5. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi :
- la souche déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ;
- la souche déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ; - la souche déposée à la CNCM Ie16/09/04 sous le numéro I-3302 ;
- la souche déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774.
6. Souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits variants naturels AMI déficients sont obtenus par mutation et sélection de leurs propriétés acidifiantes.
7. Procédé de préparation d'un produit alimentaire fermenté dans lequel un substrat est mis en fermentation avec au moins une souche vivante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la fermentation est effectuée en présence d'au moins une autre souche de bactérie vivante.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite autre souche de bactérie est une bactérie lactique.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite bactérie lactique est choisie parmi : Streptococcus spp. ; Lactobacillus spp, notamment L. bulgaricus, L. acidophilus et L. casei ; Lactococcus spp. et Bifidobacterium spp.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que ledit substrat est choisi parmi : les substrats lactés, notamment le lait ; les substrats à base de matières premières végétales, telles les fruits, les céréales et le soja.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que ledit substrat contient des éléments solides.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que lesdits éléments solides sont choisis parmi : les fruits, les produits chocolatés et les céréales.
14. Produit alimentaire fermenté comprenant au moins une souche vivante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
15. Produit alimentaire fermenté susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13.
16. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il est un produit laitier ou végétal.
17. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce qu'il contient au moins un ingrédient alimentaire bioactif.
18. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ingrédient alimentaire bioactif est choisi parmi des protéines, des peptides, des analogues ou des dérivés de ceux-ci.
19. Produit alimentaire fermenté selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il est un aliment fonctionnel.
20. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisé en ce qu'il est un produit frais.
21. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : une boisson ; un yoghourt ou une crème dessert ; un lait ou un jus fermenté.
22. Produit alimentaire fermenté selon l'une quelconque des revendications 14 à 21 , caractérisé en ce que ses propriétés organoleptiques sont conservées au cours du stockage.
23. Utilisation d'au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme ferment lactique.
24. Utilisation d'au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme probiotique dans l'alimentation humaine ou animale.
25. Utilisation d'au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour préparer des produits alimentaires fermentes dont les propriétés organoleptiques sont conservées au cours du stockage.
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