EP1664302A1 - Cellules de brucella genetiquement modifiees et composition pharmaceutique les comprenant - Google Patents

Cellules de brucella genetiquement modifiees et composition pharmaceutique les comprenant

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EP1664302A1
EP1664302A1 EP04737682A EP04737682A EP1664302A1 EP 1664302 A1 EP1664302 A1 EP 1664302A1 EP 04737682 A EP04737682 A EP 04737682A EP 04737682 A EP04737682 A EP 04737682A EP 1664302 A1 EP1664302 A1 EP 1664302A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
brucella
flagellar
infection
nucleotide sequence
expression
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04737682A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Jacques Letesson
Pascal Lestrate
Anne Tibor
David Fretin
Jacques Godfroid
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Facultes Universitaires Notre Dame de la Paix
Original Assignee
Facultes Universitaires Notre Dame de la Paix
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Filing date
Publication date
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Priority to EP04737682A priority Critical patent/EP1664302A1/fr
Publication of EP1664302A1 publication Critical patent/EP1664302A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/23—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Brucella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to genetically modified Brucella cells including one or more modifications genetic in wild nucleotide sequences encoding the flagellar proteins of Brucella important in the infectious cycle of this organism in mammals.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising these genetically modified Brucella cells and a method for obtaining such cells and such a pharmaceutical composition.
  • Brucella and brucellosis The bacteria of the genus Brucella are gram-negative coccobacilli which belong to the family of ⁇ -Proteobacteria. These are intracellular pathogens that can be cultivated in the laboratory, but of which no natural free form is known. Different species have been defined according to their propensity to be associated with a particular host (for review (Moreno, (2002)). We distinguish B. meli tensis in goats, B. abortus in cattle, B. canis in dog, B. suis in pigs, B. ovis in sheep and B. neotomae in some rodents. Two new species associated with marine mammals are being described, B.
  • brucellosis is a disease of the reproductive system inducing abortions in pregnant females and orchitis in males. Transmission from one animal to another seems mainly due to abortions which release a high number of bacteria into the environment. Transmission to humans occurs either through direct contact with infected runts, or through consumption of unpasteurized dairy products. In humans, only the meli tensis, suis, abortus and canis species are known to induce a systemic infection which can take various forms (meningitis, endocarditis, arthritis, etc.) and often associated with undulating fever, called Malta fever. .
  • Brucella infects its host are still poorly understood. It could passively penetrate via ruptures of the integrity of the epithelium, but also by crossing the respiratory and / or digestive mucous membranes. Once in the underlying tissue, the bacteria will face the host's immune system. To guard against this, Brucella has developed an original strategy which consists in "hiding" within it. The bacterium uses phagocytic cells as the first replication niche. The immune cells will therefore become Trojans allowing the spread of the bacteria throughout the body. In animals, Brucella is most commonly associated with lymphoid tissue, the mammary gland, and the reproductive organs.
  • the pathogenesis induced by Brucella is therefore mainly based on its ability to replicate in eukaryotic cells (phagocytic and non-phagocytic).
  • the molecular mechanisms involved in these processes have been the subject of numerous studies. These, using various approaches (deletion, transpositional mutagenesis, DFI, STM ”) in various infection models (macrophages of different species, HeLa cells, BALB / C and C57 Black mice, goats ...) have enabled the identification of more than 200 virulence genes. Analysis of these makes it possible to infer the crucial stages of the Brucella infectious cycle.
  • Comp Genomics. 3 (1): 21-9) discovered 3 CDS homologous to flagellar genes in the B genome. abortus.
  • the present invention aims to characterize genetic sequences specific for Brucella, the genetic modification makes it possible to select recombinant Brucella cells having a lower infectious power (attenuated or absent virulence) and which can be used as a therapeutic alternative, in particular a vaccine alternative to the vaccine compositions of the prior art.
  • the present invention also aims to provide a method for obtaining said recombinant Brucella cells and said pharmaceutical composition of the invention.
  • the present invention relates to recombinant Brucella cells comprising a genetic modification in a wild nucleotide sequence encoding a flagellar protein or a nucleotide sequence regulating the wild nucleotide sequence encoding said flagellar protein.
  • the Brucella cells are chosen from the group consisting of the following species: Brucella eli tensis (particularly active in goats Brucella abortus, in cattle; Brucella canis, in dogs; - Brucella suis, in pigs; Brucella ovis, in sheep; Brucella neotomae, active in certain rodents) Brucella cetaceae, and Brucella pinnipediae.
  • Brucella eli tensis particularly active in goats Brucella abortus, in cattle
  • Brucella canis in dogs
  • Brucella suis in pigs
  • Brucella ovis in sheep
  • Brucella neotomae active in certain rodents
  • Brucella cetaceae and Brucella pinnipediae.
  • This wild-type sequence is preferably selected from the group consisting of the sequences SEQID No. 1 to SEQID No. 50.
  • said nucleotide sequences have been modified by an insertion, a deletion or a substitution of at least one nucleotide in the wild-type nucleotide sequence, so as to lose the infectious (virulent) character of the Brucella cells.
  • Another aspect of the present invention relates to a vaccine composition comprising a suitable pharmaceutical carrier or diluent, the recombinant Brucella cells of the invention and optionally one or more adjuvants to induce an immune response against a Brucella strain in a mammal, including humans.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the composition according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment or the prevention of infections induced by Brucella in an animal, in particular goats , cattle, dogs, pigs, sheep (especially sheep) and possibly humans.
  • infections are likely to cause abortions in pregnant females and orchitis in males.
  • Infections in mammals are also capable of infecting humans and causing a systematic infection which can take various forms, such as meningitis, endocarditis, arthritis and often associated with undulating fever, called Malta fever.
  • the present invention also relates to the method of treatment and / or prevention of an infection induced in a mammal, including man, comprising the administration of a sufficient amount of the pharmaceutical composition of the invention for prevent or treat the symptoms of this infection.
  • a last aspect of the present invention relates to a process for the preparation of a recombinant Brucella cell which consists in:
  • a “virulent” nucleotide sequence encoding a Brucella flagellar protein that is to say a nucleotide sequence capable of being involved in the infectious cycle of this microorganism in a mammal (including humans)
  • this nucleotide sequence being identified in the genome of a Brucella strain by the use of a nucleotide sequence specific for a nucleotide sequence motif encoding a flagellar protein, for example motifs characteristic of the sequences SEQID n ° 1 to SEQID No.
  • the recombinant Brucella strains collect the recombinant Brucella strains (genetically modified), having this genetic modification (for example, by insertion of a genetic sequence, by deletion of a genetic sequence or by modification of at least one nucleotide and possibly incorporate this cell of Genetically modified brucella comprising this avirulent nucleotide sequence encoding a flagellar protein in a pharmaceutical composition, preferably a vaccine composition, comprising one or more pharmaceutical carriers or diluents suitable for administration to a mammal.
  • the genetic modifications were introduced into nucleotide sequences which, unexpectedly, encode flagellar proteins of Brucella which are important in the infectious cycle of this microorganism in mammals.
  • sequences were chosen because they represent all of the proteins necessary for the biosynthesis of the secretory apparatus of flagellar proteins to the ultra flagellar structure proper and to the motor as well as proteins involved in the regulation of the expression of these proteins.
  • no coding sequence related to the chemotactic system was identified among these sequences.
  • these sequences are involved in the infectious cycles in mice (in particular the sequences fliC, flgE, motB, flgl, flhA, 2C2 and fliF identified respectively by SEQID N ° 1, 10, 5, 40, 17 , 18, 9 and 2.
  • the present invention also encompasses the genetic modifications of the portions and variants of these sequences or of their complementary strands
  • Sections of sequences according to the invention relate to nucleotide or peptide sequences having the same characteristics antigenic and immunogenic only the complete portion, as well as portions also capable of causing infectious cycles in mammals, in particular in the mouse model.
  • Variants of these sequences include sequences having a strong homology or a strong identity of sequences with the sequences of the invention [0021]
  • this identity or sequence homology is greater than 80 %, preferably greater than 85%, more particularly greater than 95%, or even greater than 98 or 99% with the nucleotide sequence or complete peptide chosen from the group consisting of the sequences SEQID No.
  • the variants of the invention may be natural variants (possibly present in ⁇ other families of strains or in other species) or variants modified by mutagenesis techniques or by direct synthesis, but retaining the biological activity of the reference polypeptide, in particular these antigenic and immunogenic properties.
  • the antigenic properties can be tested by standard procedures (immunobloting) preferably using polyclonal or monoclonal sera, in particular in standard ELISA tests.
  • sequence identity or “sequence homology” are terms well known to those skilled in the art (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 1998, Vol. 48 , p. 1073). Sequence identity can be calculated by those skilled in the art using well known techniques (Computational molecular biology, Lesk, A.MK, ed. Oxford University Press, New York 1988; Biocomputing: informatics and genome projects, Smith , DW, éd.
  • portions or fragments of the polypeptide and nucleotide sequences of the invention comprise important structural and functional sequences, in particular the sequences comprising alpha helices or beta planes, the loop-forming regions, the hydrophilic regions or the hydrophobic regions. and the portions comprising high epitope or linear or conformational antigenic indices.
  • FIG. 1 represents the monitoring of the expression of the fliF promoter by observation of the GFp fluorescence.
  • Figure 2 shows the analysis of the attenuation of flagellar mutants in the mouse model.
  • Figure 3 shows the expression of genes and flagellar proteins of -B-rucella depending on the growth phase.
  • Figure 4 shows the electron microscopic observation of the Brucella flagellum.
  • Figure 5 shows the measurement of the activity of the FliF promoter during a growth curve.
  • Figure 6 shows the CDS page analysis and western blotting of the expression of the elbow protein of the Brucella flagellum.
  • Figure 7 shows the expression of the elbow protein of the Brucella flagellum.
  • FIG. 8 represents the follow-up in ELISA of serology in 5 ewes injected with the mutant Flgl (F) and of the vaccine strain rev1 (R). Detailed description of the invention Characterization of the flagellar sequences
  • the inventors have demonstrated the expression of three sequences of the invention: fliF (BMEII0151) ex vivo and fliF (BME --- I0151), flgE (BMEII0159) and fliC ( BMEII0150) in vitro.
  • the expression of these three sequences which unexpectedly represent the different levels of the flagellar structure (the monomers of the MS ring, the elbow and the filament) was coordinated.
  • These various data make it possible to propose the existence of a functional flagellar regulon in Brucella.
  • the Brucella flagellar system is related to that of other rhizobiacs. Within this group, Brucella's closest relative is
  • flagellar CDS The technical difficulties linked to experimental infections have led the inventors to seek a condition for in vitro expression of flagellar CDS.
  • the expression of these CDS is concerted ( Figure 3).
  • Figure 3 The galactosidase activity of B. eli tensis 16M carrying a pfliF-lacZ translational fusion cultivated in a rich medium, shows that the fliF promoter is transiently expressed during the very start of the exponential phase
  • Brucella and others establish a scheme for the regulation of this system, a scheme which can itself be integrated with that of other systems involved in virulence.
  • Yersinia enteroli tica a phospholipase and probably other proteins involved in virulence are secreted by the apparatus for the export of flagellar proteins.
  • Brucella may secrete proteins involved in virulence. It is difficult to understand the interest for the bacterium to synthesize a filament knowing the important metabolic cost for the cell.
  • a secretory function would be an accessory function which the flagellar CDS could fulfill.
  • Other functions can be envisaged such as adhesion or else immunomodulatory properties.
  • Different criteria can be used for select the potentially secreted effectors: have a kinship with a eukaryotic CDS, be next to a small discomfort that can serve as a chaperone, not have a signal sequence.
  • a list of 72 CDS presenting homologies mainly with eukaryotic CDS was established. Most of these CDS are homologous to metabolic CDS and one can hardly predict a role for them in the infectious cycle, it is difficult to select them for later experiments.
  • Protein extracts can be produced on culture supernatants of a wild Brucella and of a strain disrupted for the secretory apparatus (the mutant flif or flhA for example) and a proteomic approach will allow the comparison of the two strains in order to identify these potential candidates.
  • 2C2 encodes an activator of the transcription of the fliF operon.
  • the expression of 2C2 (ftcR) is shown in Figures 5 and 6.
  • FIG. 5 represents the activity of the fliF promoter during a growth curve was compared (by assaying galactosidase activity) in a WT strain and in various mutants of transcriptional regulators suspected of being involved in regulation of the Brucella flagellar system.
  • the activity of pfliF is virtually zero in the 2C2 mutant (also called ftcR for flagellar two component regulator) and the Vjbr mutant (Vacuolar jacking brucella regulator).
  • the tetR mutant gives a reduction in activity.
  • the activity of the fliF promoter during a growth curve was compared (by assaying galactosidase activity) in a WT strain and in various mutants of transcriptional regulators suspected of being involved in the regulation of the flagellar system of Brucella.
  • the activity of pfliF is virtually zero in the 2C2 mutant (ftcR).
  • Brucella samples taken at the start of the exponential phase (4, 8 and 11 h of culture) were analyzed by SDS PAGE and western blotting with anti-elbow monomer antibodies (FlgE).
  • the regulator is generally in operon with its histidine kinase.
  • 2C2 is not located next to its histidine kinase.
  • the search for histidine kinase is therefore a key step to understanding the signal transduction pathway which leads to the activation of 2C2 (ftcR).
  • 23 histidine kinases have been predicted in the genome. It is therefore interesting to mutate them or to use them in a double hybrid screen. Once this kinase has been discovered, a general diagram of the expression of these two proteins and of phosphorylation can be established as a function of growth in liquid culture.
  • VjbR is also necessary for the induction of the fliF promoter ( Figure 7) and for the expression of FlgE and FliC. TetR also seems to have an effect on the activation of the fliF promoter ( Figure 5), but this requires confirmation.
  • the Brucella sigma factors that encoded by the ORF BMEI0371 is also involved in the regulation of the expression of FlgE and FliC. The deletion of this ORF indeed leads to an overexpression of these two proteins. It is hypothesized that this sigma factor regulates a flagellar repressor. The stage of the flagellar cascade at which this sigma factor intervenes remains to be determined.
  • This ORF is surrounded by a histidine kinase (BMEII0370) and a response regulator of two-component systems (BMEII0372) whose role in the expression of flagellar genes must be tested.
  • BMEII0370 histidine kinase
  • BMEII0372 response regulator of two-component systems
  • the initial use of the murine protection model will make it possible to analyze more conditions before possibly selecting certain mutants which will be analyzed subsequently in an infection model using the host species: sheep.
  • the coding sequence chosen is the flgl gene encoding a homolog of the flag ring P ring monomer, a ring located in the outer membrane and forming part of the basal body of a flagellar structure, number coding sequence in the genome of B. melitensis 16M: BMEII1084 (Coding sequence of 1074 nucleotides which encodes a predicted protein of 358 residues).
  • the mutated strain carries two incomplete copies of flgl.
  • PSKKan was obtained by cloning the gene conferring resistance to kanamycin (amplified by PCR from the plasmid pUC4K from Pharmacia with the primers kanamont (5 '-GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3') and kanaval (5 '-GGGGTTACACTAGAA) ) at the Seal site of the pSK-oriT -bla gene.
  • PSK-oriT is a derivative of pBluescriptSK (-) (Stratagene) described in Tibor et al, 2002, Infect and Immun, 70: 5540-6. The origin of replication fl of pBluescript was excised by Sspl restriction and replaced by a 0.76 kb Smal-SalI fragment containing the origin of RK2 transfer.
  • the vector pSKKAN containing the internal fragment insert of flgl was transferred from Escherichia coli S17-1 to B. melitensis 16M NalR by conjugation.
  • the vector is integrated into the Brucella genome, in the flgl gene, leading to two incomplete copies of this gene. Integrating candidates are resistant to kanamycin.
  • the site-specific integration was verified by Southern blot on the genomic DNA of integrating candidate clones restricted by HindIII with a probe corresponding to the gene conferring resistance to kanamycin. The known modification of the properties of the host, B.
  • melitensis 16M is an attenuation in the murine BALB / c model. Its foreseeable modification is its inability to express the flagellar proteins which are part of the outermost structures (in particular flagellin) and its inability to build a flagellar structure: we expect an unflagellated bacterium. Tests on cellular models in vitro
  • the plates are washed and incubated with an additional culture medium comprising 50 ⁇ g of gentamicin (Life Technologies) per ml to kill all the extra-cellular Brucella cells.
  • the number of viable intracellular Brucella strains is determined after two hours or 48 hours of post-infection. The data are the average of three culture media and represent three experiments. Flgl flagellar mutants of B. meli tensis did not show any significant attenuation in these models of cell line infection.
  • mice Eight week old female mice are inoculated intraperitoneally with 0.1 ml of a suspension comprising 5 ⁇ 10 4 CFU of each bacterial strain (mutant flgl and 16M NalR of parent strain) cultured in the presence of PBS (each dose being confirmed retrospectively). After 8 and 12 weeks of inoculation, 5 mice from each treatment group are sacrificed. The survival rate of the bacteria is determined after homogenization of the mouse spleens in 2 ml of distilled water. Serial dilutions of the homogenates are cultured on TSA to determine the bacterial concentrations.
  • HeLa cells were infected with Brucella carrying the plasmid with the GFP reporter under the control of the fliF promoter and observed & after 24 h (A) or 48 hours (B) of infection. Labeling of S-LPS with an antibody detected by red fluorescence was also carried out on cells infected for 24 hours and demonstrates that all bacteria express GFP
  • a strain of B. meli tensis 16M carrying a plasmid or the GFP gene is under the control of the fliF promoter was used, while these bacteria cultivated on a bacteriological medium are non-fluorescent. They express GFP after 24 and 48 hours of infection of HeLa cells (FIG. 1a, 1b). At 24 hours, the expression of GFP and therefore the activity of the fliF promoter concerns almost all bacteria, as shown by the immunodetection of S-LPS from Brucella (FIG. These first data prove that the flagellar system is not cryptic and that it is required for the infectious cycle. On the other hand, at this stage, the hypothesis of reconversion into a type III secretion system remains posed.
  • Groups of BALB / c mice were infected intraperitoneally (IP) or with WT B. meli tensis 16M strain either by the flagellar mutants corresponding to the MS ring (fliF), to the P ring (flgl) and to the filament (fliC), which corresponds to the three levels of the flagellar structure.
  • flagellar CDSs are not exclusively converted into a secretion system since CDSs encoding flagellin (FlgC), the elbow monomer (FlgE) and the P ring (Flgl) are involved in the infectious cycle .
  • Another flagellar CDS (FlgF, stem monomer) is also involved in the infectious cycle, it was isolated during an STM screen performed in goats. Tests on pregnant sheep
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotide primers upflgl 5'-GCGCGCCTGAAGGACATC-3 ') (SEQID N ° 52) and lowflgl (5' -ACGGCGGTCGTGAAATCG- 3 ') (SEQID No. 53) of a fragment going from nucleotide 113 to nucleotide 635 of the coding phase flgl and here called amplicon flgl.
  • the flgl amplicon with a size of 533 base pairs was cloned at the EcoRV site of the vector pSKKan, generating the vector pSKKan-flgl.
  • the pSKKan was obtained by cloning the gene conferring resistance to kanamycin (amplified by PCR from the plasmid pUC4K from Pharmacia with the primers kanamont (5 '-GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3') (SEQID
  • PSK-oriT is a derivative of pBluescriptSK (-) (Stratagene) described in Tibor et al, 2002 (Infect and Immun, 70: 5540-6).
  • the origin of replication fl of pBluescript was excised by Sspl restriction and replaced by a 0.76 kb Smal-SalI fragment containing the origin of RK2 transfer.
  • the sequence of the amplicon flgl is the sequence SEQID No. 56.
  • the amplicon flgl encoding a homolog of the flag ring P ring monomer, ring located in the outer membrane and forming part of the basal body of 'a flagellar structure (coding sequence number in the genome of B. melitensis 16M: BMEII1084).
  • This coding sequence of 1074 nucleotides encodes a predicted protein of 358 residues.
  • the mutated strain carries two incomplete copies of flgl (SEQID No. 57).
  • sequence of the two incomplete copies is the sequences SEQID No. 58 and SEQID No. 59.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des cellules recombinantes de Brucella comprenant une modification génétique dans la séquence nucléotidique sauvage encodant une protéine flagellaire de Brucella et leurs applications thérapeutiques.

Description

CELLULES DE BRUCELLA GENETIQUEMENT MODIFIEES ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES COMPRENANT
Objet de l'invention
[0001] La présente invention est relative à des cellules de Brucella génétiquement modifiées incluant une ou plusieurs modifications 'génétiques dans les séquences nucléotidiques sauvages encodant des protéines flagellaires de Brucella importantes au niveau du cycle infectieux de ce micro-organisme chez les mammifères . [0002] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ces cellules de Brucella génétiquement modifiées et un procédé pour obtenir de telles cellules et une telle composition pharmaceutique.
Arrière-plan technologique à la base de 1 ' invention Brucella et brucellose [0003] Les bactéries du genre Brucella sont des coccobacilles gram-négatif qui appartiennent à la famille des α-Protéobactéries . Ce sont des pathogènes intracellulaires cultivables en milieu de laboratoire, mais dont on ne connaît pas de forme libre naturelle. Différentes espèces ont été définies en fonction de leur propension à être associées à un hôte particulier (pour revue (Moreno, (2002) ) . On distingue B . meli tensis chez les caprins, B. abortus chez les bovins, B. canis chez le chien, B . suis chez le porc, B . ovis chez les ovins et B . neotomae chez certains rongeurs. Deux nouvelles espèces associées aux mammifères marins sont en cours de description, B . cetaceae et B . pinnipediae (Cloec aert, (2001) ) . [0004] Chez les animaux, la brucellose est une maladie du système reproducteur induisant des avortements chez les femelles gestantes et des orchites chez les mâles. La transmission d'un animal à l'autre semble majoritairement due aux avortements qui libèrent un nombre élevé de bactéries dans l'environnement. La transmission à l'homme s'effectue soit par contact direct avec des avortons infectés, soit par consommation de produits laitiers non pasteurisés. Chez l'homme, seules les espèces meli tensis, suis, abortus et canis sont connues pour induire une infection systemique pouvant prendre des formes variées (méningites, endocardites, arthrites ...) et souvent associée à une fièvre ondulante, appelée fièvre de Malte. [0005] Les processus par lesquels Brucella infecte son hôte sont encore mal connus . Elle pourrait pénétrer passivement via des ruptures de l'intégrité de 1 ' épithélium, mais aussi en traversant les muqueuses respiratoires et/ou digestives. Une fois dans les tissus sous-jacents, la bactérie fera face au système immunitaire de son hôte. Pour s'en prémunir, Brucella a développé une stratégie originale qui consiste à se « cacher » au sein même de celui-ci. La bactérie utilise en effet les cellules phagocytaires comme première niche de réplication. Les cellules immunitaires deviendront donc des chevaux de Troie permettant la dissémination de la bactérie au sein de tout l'organisme. Chez les animaux, Brucella est le plus souvent associée aux tissus lymphoïdes , à la glande mammaire et aux organes reproducteurs. Chez les femelles gestantes, Brucella envahit les cellules du trophoblaste chorioallantoïque, qui constituent sa deuxième niche de réplication. La réplication massive de la bactérie au sein du réticulum endoplasmique rugueux (RER) va entraîner la nécrose cellulaire et l'ulcération de la membrane chorioallantoïque . L'infection se répandra alors dans les tissus fœtaux, provoquant in fine 1 ' avortement .
Les déterminants moléculaires de la virulence de Brucella [0006] La pathogénie induite par Brucella repose donc principalement sur sa capacité à se répliquer dans les cellules eucaryotes (phagocytaires et non-phagocytaires) . Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces processus ont fait l'objet de nombreuses études. Celles-ci, en utilisant des approches variées (délétion, mutagénèse transpositionnelle, DFI, STM...) dans divers modèles d'infections (macrophages de différentes espèces, cellules HeLa, souris BALB/C et C57 Black, chèvres ...) ont permis l'identification de plus de 200 gènes de virulence. L'analyse de ceux-ci permet d'inférer les étapes cruciales du cycle infectieux de Brucella . Celles-ci, pour plus de clarté, sont divisées en 6 classes (Mahan, (2000) Bellaire (2003) ; Porte (1999) ; Lopez-Goni (2002) Taminiau (2002) ; Delrue (2002) ; Fernandez-Prada (2003) Porte (2003) ; Tibor (2002) ; Guzman-Verri (2002)) : la satisfaction des besoins métaboliques, la réponse au stress, la régulation, l'invasion, la survie intracellulaire et les interactions de surfaces. [0007] De plus, Brucella est décrite comme non mobile mais, en 1998, S.Halling (Halling, S. 1998. Microb
Comp Genomics. 3(1) :21-9) a découvert 3 CDS homologues à des gènes flagellaires dans le génome de B . abortus .
Buts de l'invention [0008] La présente invention vise à caractériser des séquences génétiques spécifiques de Brucella dont la modification génétique permet de sélectionner des cellules de Brucella recombinantes présentant un pouvoir infectieux moindre (une virulence atténuée ou absente) et pouvant être utilisées comme alternative thérapeutique, en particulier alternative vaccinale des compositions vaccinales de l'état de la technique . [0009] La présente invention vise également à fournir un procédé pour l'obtention desdites cellules de Brucella recombinantes et ladite composition pharmaceutique de l'invention.
Eléments caractéristiques de l'invention [0010] La présente invention est relative à des cellules de Brucella recombinantes comprenant une modification génétique dans une séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire ou une séquence nucleotidique régulatrice de la séquence nucleotidique sauvage encodant ladite protéine flagellaire. De préférence, les cellules de Brucella sont choisies parmi le groupe constitué par les espèces suivantes : Brucella eli tensis (particulièrement active chez les caprins Brucella abortus, chez les bovins ; Brucella canis, chez le chien ; - Brucella suis, chez le porc ; Brucella ovis, chez les ovins ; Brucella neotomae, active chez certains rongeurs) Brucella cetaceae, et Brucella pinnipediae .
Cette séquence sauvage est de préférence sélectionnée parmi le groupe constitué par les séquences SEQID N°l à SEQID N° 50. [0011] En particulier, lesdites séquences nucléotidiques ont été modifiées par une insertion, une délétion ou une substitution d'au moins un nucleotide dans la séquence nucleotidique sauvage, de manière à perdre le caractère infectieux (virulent) des cellules de Brucella . [0012] Un autre aspect de la présente invention concerne une composition vaccinale comprenant un véhicule ou un diluant pharmaceutique adéquat, les cellules de Brucella recombinantes de l'invention et éventuellement un ou plusieurs adjuvants pour induire une réponse immunitaire à l' encontre d'une souche de Brucella chez un mammifère, y compris 1 ' homme . [0013] Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la composition selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'infections induites par Brucella chez un animal, en particulier les caprins, les bovins, le chien, le porc, les ovins (en particulier le mouton) et éventuellement l'homme. [0014] Chez les animaux, de telles infections sont susceptibles de provoquer des avortements chez les femelles gestantes et des orchites chez les mâles . [0015] Les infections chez les mammifères sont également susceptibles d'infecter l'homme et provoquer une infection systématique pouvant prendre des formes variées, telles que méningites, endocardites, arthrites et souvent associée à une fièvre ondulante, appelée fièvre de Malte. [0016] La présente invention concerne également le procédé de traitement et/ou de prévention d'une infection induite chez un mammifère, y compris l'homme, comprenant l'administration d'une quantité suffisante de la composition pharmaceutique de l'invention pour prévenir ou traiter les symptômes de cette infection. [0017] Un dernier aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'une cellule de Brucella recombinante qui consiste à :
- identifier une séquence nucleotidique « virulente » et encodant une protéine flagellaire de Brucella, c'est-à- dire une séquence nucleotidique susceptible d'être impliquée dans le cycle infectieux de ce micro-organisme chez un mammifère, (y compris l'homme), cette séquence nucleotidique étant identifiée dans le génome d'une souche de Brucella par l'utilisation d'une séquence nucleotidique spécifique d'un motif de séquence nucleotidique encodant une protéine flagellaire, par exemple des motifs caractéristiques des séquences SEQID n° 1 à SEQID n° 50 identifiés chez Brucella melitensis, tel que une hybridation ou par amplification génétique avec une sonde ou une paire d'amorces (ayant de préférence une longueur supérieure à 12 nucléotides et qui présentent au moins 10 nucléotides identiques avec le motif d'une séquence encodant une protéine flagellaire) ; - induire une modification de cette séquence nucleotidique virulente encodant une protéine flagellaire de manière à rendre cette séquence avirulente ; et
- recueillir les souches de Brucella recombinantes (génétiquement modifiées) , ayant cette modification génétique (par exemple, par insertion d'une séquence génétique, par délétion d'une séquence génétique ou par modification d'au moins un nucleotide et éventuellement incorporer cette cellule de Brucella génétiquement modifiée comportant cette séquence nucleotidique avirulente encodant une protéine flagellaire dans une composition pharmaceutique, de préférence vaccinale, comprenant un ou plusieurs véhicules ou diluants pharmaceutiques adéquats pour une administration à un mammifère. [0018] Selon l'invention, les modifications génétiques ont été introduites dans des séquences nucléotidiques qui, de manière inattendue, encodent des protéines flagellaires de Brucella importantes au niveau du cycle infectieux de ce micro-organisme chez les mammifères. Ces séquences ont été choisies car elles représentent l'ensemble des protéines nécessaires à la biosynthèse de l'appareil de sécrétion des protéines flagellaires à l'ultra structure flagellaire proprement dite et au moteur ainsi que des protéines impliquées dans la régulation de l'expression de ces protéines. Par contre, aucune séquence codante apparentée au système de chemotactisme n'a été identifiée parmi ces séquences. [0019] De préférence, ces séquences sont impliquées dans les cycles infectieux chez la souris (en particulier les séquences fliC, flgE, motB, flgl, flhA, 2C2 et fliF identifiées respectivement par SEQID N°l, 10, 5, 40, 17, 18, 9 et 2. [0020] La présente invention englobe aussi les modifications génétiques des portions et des variants de ces séquences ou de leurs brins complémentaires. Des portions de séquences selon l'invention concernent des séquences nucléotidiques ou peptidiques présentant les mêmes caractéristiques antigéniques et immunogéniques que la portion complète, ainsi que des portions susceptibles également de provoquer des cycles infectieux chez des mammifères, en particulier chez le modèle de la souris. Des variants de ces séquences englobent des séquences présentant une forte homologie ou une forte identité de séquences avec les séquences de l'invention. [0021] De préférence, cette identité ou homologie de séquences est supérieure à 80%, de préférence supérieure à 85%, plus particulièrement supérieure à 95%, voire supérieure à 98 ou 99% avec la séquence nucleotidique ou peptidique complète choisie parmi le groupe constitué par les séquences SEQID N°l à SEQID N° 50 (BMEI0370 à 372, BMEII0150 à 170, BMEII1078 à 1089, BMEII1104 à 1117). [0022] Les variants de l'invention peuvent être des variants naturels (présents éventuellement dans< d'autres familles de souches ou dans d'autres espèces) ou des variants modifiés par les techniques de mutagènese ou par synthèse directe, mais conservant l'activité biologique du polypeptide de référence, en particulier ces propriétés antigeniques et immunogeniques. Les propriétés antigeniques pouvant être testées par des procédures standard (immunobloting) utilisant de préférence des sérums polyclonaux ou monoclonaux, en particulier dans les tests standard ELISA. [0023] Le terme "identité de séquence" ou "homologie de séquence" sont des termes bien connus de l'homme de l'art (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 1998, Vol. 48, p. 1073). Une identité de séquences peut être calculée par l'homme de l'art en utilisant des techniques bien connues (Computational molecular biology, Lesk, A.MK, éd. Oxford University Press, New York 1988 ; Biocomputing : informatics and génome projects, Smith, D.W., éd. Académie Press, New York 1993; Computer Analysis of séquence data, part I,Griffin, A.M. , and Griffin, H. G., Humana Press, New Jersey 1994; Séquence analysis in molecular biology, von Heijne, G. , Académie Press 1987 and séquence analysis primer, Gribskov, M. and Devereux, J. éd.
Stockton Press, New York 1991) . [0024] De même, des méthodes pour caractériser une identité ou une similarité entre deux séquences génétiques peuvent utiliser les programmes informatiques connus, tels que les programmes Blast et G.C.G. [0025] Les portions ou fragments des séquences polypeptidiques et nucléotidiques de l'invention comprennent des séquences structurelles et fonctionnelles importantes, en particulier les séquences comprenant des hélices alpha ou des plans bêta, les régions formant des boucles, les régions hydrophiles ou les régions hydrophobes et les portions comprenant des index antigeniques épitopes ou linéaires ou conformationnels élevés.
Brève description des figures
[0026] La figure 1 représente le suivi de l'expression du promoteur fliF par observation de la fluorescence GFp. [0027] La figure 2 représente l'analyse de l'atténuation de mutants flagellaires dans le modèle murin. [0028] La figure 3 représente l'expression de gènes et de protéines flagellaires de -B-rucella dépendant de la phase de croissance. [0029] La figure 4 représente l'observation microscopique électronique du flagelle de Brucella . [0030] La figure 5 représente la mesure de l'activité du promoteur de FliF durant une courbe de croissance. [0031] La figure 6 représente l'analyse CDS page et western blotting de l'expression de la protéine du coude du flagelle de Brucella . [0032] La figure 7 représente l'expression de la protéine du coude du flagelle de Brucella . [0033] La figure 8 représente le suivi en ELISA de la sérologie chez 5 brebis injectées par le mutant Flgl (F) et de la souche vaccinale revl (R) . Description détaillée de l'invention Caractérisation des séquences flagellaires
[0034] A titre d'exemple, les inventeurs ont mis en évidence l'expression de trois séquences de l'invention : fliF (BMEII0151) ex vivo et de fliF (BME---I0151) , flgE (BMEII0159) et fliC (BMEII0150) in vitro. L'expression de ces trois séquences qui représentent de manière inattendue les différents niveaux de la structure flagellaire (les monomères de l'anneau MS, du coude et du filament) était coordonnée. Ces différentes données permettent de proposer l'existence d'un régulon flagellaire fonctionnel chez Brucella . [0035] Le système flagellaire de Brucella est apparenté à celui d'autres rhizobiacés. Au sein de ce groupe, le parent le plus proche de Brucella est
Mesorhizobium loti . Pour les CDS lagellaires, cette parenté est marquée à deux niveaux :
1. l' homologie de séquence, et
2. l'organisation de CDS au sein des loci . [0036] Un scénario évolutif est proposé par Moreno : l'ancêtre de Brucella serait une bactérie flagellée mobile vivant dans le sol (Moreno et al . , 2002). Cette bactérie est devenue progressivement un pathogène intracellulaire et s'est adaptée au mode de vie parasitaire. Au niveau flagellaire, elle perd son système chemotactique . Cet auteur émet l'hypothèse que les séquences flagellaires soient en fait des « fossiles » issus de ces ancêtres mobiles. Cette hypothèse semble peu vraisemblable. Par rapport à son ancêtre, Brucella a réduit son génome et malgré cela l'inventaire révèle que 1% de son matériel génétique est dédié aux CDS flagellaires, il est donc probable qu'elles aient une fonction. Pour d'autres auteurs, la parenté entre les systèmes flagellaires et les systèmes de sécrétion de type III laisse supposer que Brucella a en fait reconverti ces CDS flagellaires en un système de sécrétion (DelVecchio et al . , 2002) (Ugalde, 1999). L'inventaire des CDS que nous avons réalisé nous a amené à poser la question de l'existence transitoire d'un flagelle chez Brucella .
Conditions d'expression in vitro
[0037] Les difficultés techniques liées aux infections expérimentales ont amené les inventeurs à rechercher une condition d'expression in vi tro des CDS flagellaires. Les inventeurs ont évalué l'expression des CDS flagellaires en fonction du stade d'une culture liquide et ont constaté l'expression de la flagelline, du monomère du coude et de l'anneau MS à faible densité de population. De plus, l'expression de ces CDS est concertée (figure 3) . A- L'activité galactosidase de B . eli tensis 16M portant une fusion traductionelle pfliF-lacZ cultivée en milieu riche, montre que le promoteur de fliF est exprimé de manière transitoire durant le tout début de la phase exponentielle
B- Western blot réalisé sur des extraits totaux de culots de B . meli tensis récoltés le long d'une courbe de croissance. Des polyséra spécifiques de FlgE (monomère du coude) et de FliC (flagelline) nous ont permis de visualiser les monomères respectifs du coude et du filaments en début de phase exponentielle (4, 8 et 12 heures) alors que ces deux protéines ne sont plus détectées à des temps plus longs. [0038] Quand on cultive en milieu riche B . meli tensis 16M portant une fusion traductionelle pfliF- lacZ sur un plasmide, le dosage de l'activité galactosidase montre que le promoteur de fliF est exprimé de manière transitoire durant le tout début de la phase exponentielle (figure 3A) . Suite à cette démonstration de l'expression de la partie basale d'un flagelle, nous avons voulu déterminer si les parties distales (coude, filament) étaient aussi exprimées dans ces conditions. Dans ce but. Un western blot a été réalisé sur des extraits totaux de culots de B . meli tensis récoltés le long d'une courbe de croissance. Des polyséra spécifiques de FlgE (monomère du coude) et de FliC (flagelline) nous ont permis de visualiser les monomères respectifs du coude et du filaments en début de phase exponentielle (4, 8 et 12 heures) alors que ces deux protéines ne sont plus détectées à des temps plus longs, ce qui est en accord avec les données d'expression du promoteur de fliF (figure 3B) .
[0039] La détection des protéines correspondant au monomère du coude et du filament rend vraisemblable le fait que Brucella assemble une structure flagellaire complète.
[0040] Une des particularités de Brucella est qu'elle est à ce jour la seule bactérie qui exprime des CDS flagellaires et qui ne possède pas de système de chemotactisme . A long terme, il existe deux perspectives d'une part comprendre la fonction de ce système chez
Brucella et d'autres part établir un schéma de la régulation de ce système, schéma qui pourra lui-même être intégré à celui d'autres systèmes impliqués dans la virulence .
Observation du flagelle [0041] Comme représenté à la figure 4, l'observation au microscope électronique à transmission du flagelle de Brucella montre après coloration négative sans (5a et 5b) et avec (5c et 5d) marquage à l'or colloïdal du S-LPS au moyen d'un anticorps monoclonal spécifique de l'épitope M. Les barres représentent 1 micron (A et B) , 0,5 micron (C) , 0, 2 micron (D) . [0042] L'observation en microscopie électronique à transmission de B . meli tensis récoltées en début de phase exponentielle et colorée négativement révèle l'existence d'un flagelle polaire. Un marquage à l'or colloïdal de la chaîne 0 du LPS de B . meli tensis sur ces coupes montre qu'il s'agit bien de Brucella et que le flagelle est entouré d'une membrane externe, comme c'est décrit chez d'autres bactéries Vibrio cholerae, Helicobacter sp . et Bdellovibrio sp . (Fuerst (1988) , Hernandez (1994) , Thomashow (1985)).
Fonction du flagelle
La plus évidente fonction de ces gènes est de permettre à la bactérie de trouver son hôte. Chez Brucella l'absence de système chemotactique donne peu de poids à cette hypothèse. Néanmoins chez certaines bactéries la création de souches mutantes non chemotactiques conduit à une augmentation de la virulence dans des modèles d'infection. On peut donc supposer que Brucella ait perdu son système chemotactique mais qu'elle soit néanmoins mobile.
Chez Yersinia enteroli tica, une phospholipase et probablement d'autres protéines impliquées dans la virulence sont sécrétées par l'appareil d'exportation des protéines flagellaires. Il est possible que Brucella sécrète des protéines impliquées dans la virulence. Il est difficile de comprendre l'intérêt pour la bactérie de synthétiser un filament connaissant le coût métabolique important pour la cellule. Une fonction sécrétrice serait une fonction accessoire que pourrait remplir les CDS flagellaires. [0043] D'autres fonctions peuvent être envisagées telle que l'adhésion ou bien des propriétés immunomodulatrices . [0044] Différents critères peuvent être retenus pour sélectionner les effecteurs potentiellement sécrétés : avoir une parenté avec un CDS eucaryotique, être à côté d'un petit gêne pouvant servir de chaperonne, ne pas posséder une séquence signal. Une liste de 72 CDS présentant des homologies principalement avec des CDS eucaryotes a été établie. La plupart de ces CDS sont homologues à des CDS métaboliques et l'on peut difficilement leur prédire un rôle dans le cycle infectieux, il est difficile d'en sélectionner pour des expériences ultérieures.
[0045] Une deuxième approche expérimentale est donc plus recommandable . Des extraits protéiques peuvent êtres réalisés sur des surnageants de culture d'une Brucella sauvage et d'une souche disruptée pour l'appareil de sécrétion (le mutant flif ou flhA par exemple) et une approche protéomique permettra la comparaison des deux souches afin d'identifier ces éventuels candidats.
Régulation de l'expression du système L'enclenchement de la cascade : chez les bactéries pathogènes, la régulation de l'expression des gènes flagellaires est une étape importante dans la pathogénie. Certaines bactéries co-régulent leurs facteurs de virulence et leur flagelle (Akerley et al . , 1995) . Les systèmes flagellaires sont très immunogenes et coûteux en énergie. La stratégie adoptée par certaines bactéries sera donc de réprimer leurs gènes flagellaires lors de l'entrée dans l'hôte tout en activant l'expression de facteur de virulence, c'est par exemple le cas pour Bordetella . Pour d'autres par contre ces systèmes seront absolument nécessaires pour accomplir le cycle de vie dans l'hôte. C'est par exemple le cas pour Legionella . Le gène 2C2 (BMEII0158 (ftcR) ) encode un régulateur des systèmes à deux composants. Dans ces. systèmes, en réponse à un stimulus une histidine kinase s' autophosphoryle et transmet ce phosphate à un régulateur de réponse dont le rôle sera de moduler l'expression de certains gènes en réponse à ce stimulus. 2C2 encode un activateur de la transcription de l'opéron fliF. L'expression du 2C2 (ftcR) est représentée dans les figures 5 et 6.
[0046] La figure 5 représente l'activité du promoteur de fliF durant une courbe de croissance a été comparée (par dosage de l'activité galactosidase) dans une souche WT et dans divers mutants de régulateurs transcriptionnels suspectés d'être impliqués dans la régulation du système flagellaire de Brucella . L'activité de pfliF est virtuellement nulle chez le mutant 2C2 (appelé aussi ftcR pour flagellar two component regulator) et le mutant Vjbr (Vacuolar jacking brucella regulator) . Le mutant tetR donne quant à lui une réduction de l'activité. [0047] L'activité du promoteur de fliF durant une courbe de croissance a été comparé (par dosage de l'activité galactosidase) dans une souche WT et dans divers mutants de régulateurs transcriptionnel suspectés d'être impliqués dans la régulation du système flagellaire de Brucella . L'activité de pfliF est virtuellement nulle chez le mutant 2C2 (ftcR) . [0048] Des échantillons de Brucella prélevés en début de phase exponentielle ( 4, 8 et 11 h de culture) ont été analysés par SDS PAGE et western blotting avec des anticorps anti monomère du coude ( FlgE) . Alors que le coude est exprimé par la souche sauvege, et par le mutant exprimant la copie du gène ftcR en trans ( mutant complémenté ftcrpMRftcR) il n'y a aucune expression de cette protéine dans le mutant 2C2 ( ftcR) . [0049] Pour comprendre cette régulation dans le cas du CDS 2C2 (ftcR) chez Brucella, il semble important dans un premier temps de muter l'aspartate 59 qui est le site de phosphorylation prédit. Deux types de mutations sont possibles : supprimer le site de phosphorylation en remplaçant l'aspartate par un glutamate et observer dans cette souche s'il y a toujours transcription des CDS flagellaires ou bien mimer une phosphorylation constitutive en mutant l'aspartate en asparagine et également conserver l'effet sur les CDS flagellaires. On peut également envisager la production d'anticorps dirigé contre le 2C2 (ftcR) afin d'évaluer la présence de ce régulateur au cours d'une croissance en culture liquide car on ne peut exclure une régulation par protéolyse. La purification de la protéine et des expériences de protection à la DNAse sur le promoteur de flif permettraient d'identifier la séquence cible de ce régulateur, ce qui par la suite donnerait la possibilité d'une analyse bioinformatique du génome et ainsi de trouver d'autres CDS régulés par 2C2 (ftcR) . [0050] Dans les systèmes à deux composants décrits le régulateur est en général en opéron avec son histidine kinase. Le 2C2 n'est pas localisé à côté de son histidine kinase. Dans un second temps la recherche de l'histidine kinase est donc une étape clef pour comprendre la voie de transduction du signal qui conduit à l'activation de 2C2 (ftcR) . 23 histidines kinases ont été prédites dans le génome. Il est donc intéressant de les muter ou bien de les utiliser dans un crible double hybride. Une fois cette kinase découverte, un schéma général de l'expression de ces deux protéines et de la phosphorylation peut être établi en fonction de croissance en culture liquide. Une fois ce schéma établi, il faut effectuer des liens entre les phénotypes observés (expression en phase de latence, en cellule) et les acteurs moléculaires identifiés et éventuellement établir un modèle de l'expression des CDS flagellaires. D'autres acteurs sont certainement importants pour . ce système de régulation. Chez Sinorhizobium meliloti , le CDS occupant la place du 2C2 (ftcR) dans le locus flagellaire est impliqué dans la régulation des CDS flagellaires. Ce CDS est lui-même régulé par VisN/VisR. [0051] La figure 7 représente l'expression de la protéine du coude (40 kDa) chez les mutants ArpoHl , ΔrpoN, ArpoV et ArpoE et la WT après 4h (souches en phase de latence) et 8h de croissance (souches en début de phase exponentielle) . Le mutant pd : z ftcR a été utilisé comme contrôle négatif et la protéine recombinante étiquetée et purifiée du coude comme contrôle positif (FlgE = 42 KDa) . Dans chaque puits, nous avons déposé 20 ul d'échantillons d'une D06oo=6. [0052] Chez Brucella à la place de ce dernier locus, on retrouve les CDS VjbR (BMEII1116) et TetR (BMEII1117) . VjbR est également nécessaire à l'induction du promoteur de fliF (figure 7) et à l'expression de FlgE et de FliC. TetR semble aussi avoir un effet sur l'activation du promoteur de fliF (figure 5) , mais cela nécessite confirmation. Parmi les facteurs sigma de Brucella, celui encodé par l'ORF BMEI0371 est également impliqué dans la régulation de l'expression de FlgE et de FliC. La délétion de cette ORF entraîne en effet une sur-expression de ces deux protéines. On émet l'hypothèse que ce facteur sigma régulerait un répresseur flagellaire. Le stade de la cascade flagellaire auquel ce facteur sigma intervient reste à déterminer. [0053] Cette ORF est entourée d'une histidine kinase (BMEII0370) et d'un régulateur de réponse de systèmes à deux composants (BMEII0372) dont le rôle dans l'expression des gênes flagellaires doit être testé. [0054] Étant donné l'expression à faible densité de population, un effet répresseur d'un système de type quorum sensing peut être envisagé. Des tests en milieu conditionné (c'est-à-dire du milieu dans lequel on a déjà fait croître des bactéries) ou du milieu contenant les phéromones isolées de culture de Brucella permettraient de mettre en évidence un lien entre le quorum sensing et le système flagellaire . [0055] Chez Caulobacter cresentus, l'expression du régulon flagellaire est dépendante du régulateur CtrA
(Bellefontaine et al . , 2002). Un homologue fonctionnel de ce régulateur est présent chez Brucella . sp . Néanmoins il est peu probable qu'il soit impliqué dans le système flagellaire puisque la séquence consensus de liaison (TTAAN7TTAA) du régulateur a été identifiée et qu'elle ne se retrouve devant aucun CDS flagellaire.
Le contrôle interne de l'expression. [0056] Au cours de ce travail les inventeurs ont mis en évidence que l'expression de. trois CDS est concertée. Sur base de l'analyse génomique, 13 unités de transcription dans les locus flagellaires sont prédites. Cette prédiction est à vérifier expérimentalement, soit par RT-PCR ou par des systèmes rapporteurs. Des tests de complémentation de ces mutants sont effectués pour détecter d'éventuels effets polaires sur les gènes situés en aval de la mutation de délétion. Les mutants fliF (BMEII0151) et 2C2 (BMEII0158) ont été complémentés par une copie plasmidique sauvage des gènes correspondants exprimés sous le contrôle de leur propre promoteur . [0057] Les inventeurs ont également identifié lors de cet inventaire un homologue de flbT (BMEII0163) . Chez Caulobacter crescentus , FlbT est un répresseur traductionnel qui contrôle l'expression de la flagelline.
Si le CDS de Brucella est un homologue fonctionnel de FlbT, une souche délétée de ce gène devrait exprimer de la flagelline de manière constitutive. [0058] Sur base des considérations développées ci- dessus et considérant les données préliminaires concernant l'atténuation de la virulence de mutants flagellaires dans le modèle souris, il est intéressant de valider à plus large échelle et sur une cinétique plus étendue leur atténuation en souris et par la même occasion d'examiner leur potentialité comme souche vaccinale protectrice à 1' encontre d'un challenge infectieux.
[0059] L'utilisation initiale du modèle murin de protection permettra d'analyser plus de conditions avant d'éventuellement sélectionner certains mutants qui seront analysés par la suite dans un modèle d' infection faisant appel à l'espèce hôte : le mouton.
Construction du mutant flgl de B. meli tensis [0060] La séquence codante choisie est le gène flgl encodant un homologue du monomère du P ring du flagelle, anneau localisé dans la membrane externe et faisant partie du corps basai d'une structure flagellaire, numéro de séquence codante dans le génome de B. melitensis 16M : BMEII1084 (Séquence codante de 1074 nucléotides qui encode une protéine prédite de 358 résidus) . La souche mutée porte deux copies incomplètes de flgl.
Origine de l'ADN et caractérisation [0061] Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) sur l'ADN génomique isolé du donneur 1 (B. melitensis 16M) avec les amorces oligonucléotidiques upflgl (5' -GCGCGCCTGAAGGACATC-3 ' ) et lowflgl (5' -ACGGCGGTCGTGAAATCG-3' ) d'un fragment allant du nucleotide 113 au nucleotide 635 de la phase codante flgl et nommé ici amplicon flgl [0062] L' amplicon flgl d'une taille de 533 paires de bases a été clon au site EcoRV du vecteur pSKKan, générant le vecteur pSKKan-flgl. Le clonage de l' insert a été vérifié par séquençage. Le pSKKan a été obtenu par clonage du gène conférant la résistance à la kanamycine (amplifié par PCR à partir du plasmide pUC4K de Pharmacia avec les amorces kanamont (5' -GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3 ' ) et kanaval (5 ' -GGGGTGACCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3 ' ) ) au site Seal du gène -bla du pSK-oriT. Le pSK-oriT est un dérivé du pBluescriptSK(-) (Stratagene) décrit dans Tibor et al, 2002, Infect and Immun, 70:5540-6. L'origine de réplication fl du pBluescript a été excisée par restriction Sspl et remplacée par un fragment de 0,76 kb Smal-Sall contenant l'origine de transfert RK2.
Obtention et description du mutant [0063] Le vecteur pSKKAN contenant l' insert fragment interne de flgl (nommé pSKKan-flgl) a été transféré d'Escherichia coli S17-1 à B. melitensis 16M NalR par conjugaison. Le vecteur est intégré dans le génome de Brucella, dans le gène flgl, conduisant à deux copies incomplètes de ce gène. Les candidats intégrants sont résistants à la kanamycine. L'intégration site-spécifique a été vérifiée par Southern blot sur de l'ADN génomique de clones candidats intégrants restreints par HindIII avec une sonde correspondant au gène conférant la résistance à la kanamycine . [0064] La modification connue des propriétés de l'hôte, B. melitensis 16M est une atténuation dans le modèle murin BALB/c. Sa modification prévisible est son incapacité à exprimer les protéines flagellaires faisant partie des structures les plus externes (notamment la flagelline) et son incapacité à construire une structure flagellaire : on s'attend à une bactérie non-flagellée. Tests sur des modèles cellulaires in vitro
Tests de protection sur souris Exemple 1 [0065] La survie des souches de Brucella a été évaluée sur des lignées de cellules immortalisées issues de macrophages d'origine péritonéale bovines (Stabel et Stabel , 1995) et dans des cellules cancéreuses HeLa par la procédure décrite par Delrue et al . (2001) . Brièvement, les souches de Brucella sont mises en croissance en phase logarithmique pour 18 h en 2YT en présence d'antibiotiques appropriés et additionnées aux cellules à des taux d'infection de 200 à 300 par milieu de culture cellulaire. Les plaques de culture sont centrifugées pendant 5 minutes pour les macrophages et pendant 10 minutes pour les cellules HeLa à 1000 tours par minute à température ambiante et placées en atmosphère 5% C02 a 37°C. Après une heure, les plaques sont lavées et incubées avec un milieu de culture supplémentaire comprenant 50μg de gentamicin (Life Technologies) par ml pour tuer toutes les cellules de Brucella extra-cellulaires. Le nombre de souches de Brucella intracellulaires viables est déterminé après deux heures ou 48 h de post-infection. Les données sont la moyenne de trois milieux de culture et représentent trois expériences. [0066] Les mutants flagellaires flgl de B . meli tensis ne montrent aucune atténuation significative dans ces modèles d'infection de lignées cellulaires.
Des souris femelles de huit semaines sont inoculées de manière intra-péritonéale avec 0,1 ml d'une suspension comprenant 5 x 104 CFU de chaque souche bactérienne (mutant flgl et 16M NalR de souche parente) cultivée en présence de PBS (chaque dose étant confirmée rétrospectivement) . Après 8 et 12 semaines d' inoculation, 5 souris de chaque groupe de traitement sont sacrifiées. Le taux de survie des bactéries est déterminé après homogenisation des rates des souris dans 2ml d'eau distillée. Des dilutions en série des homogénats sont mises en culture sur TSA pour déterminer les concentrations bactériennes.
Essai 1 : en moyenne CFU par rate : n=5 (SD)
Essai 2 : moyenne logarithmique CFU par rate n=4 (SD)
[0067] Une femelle de huit semaines a été inoculée de manière intra-péritonéale avec 0,1 ml d'une suspension contenant environ 5 x 104 CFU du mutant flgl mutant cultivé en présence de PBS (les doses exactes ont été rétrospectivement confirmées) (PBS était utilisé comme contrôle négatif. A huit semaines, après inoculation, 4 souris de chaque traitement mise en présence de B . meli tensis 16M par inoculation intra-péritonéale de 1 x 104 CFU ont été sacrifiées quatre semaines après pour collecter les rates (12 semaines de post-vaccination) . Le taux de survie des bactéries a été déterminé après homogenisation des rates de souris dans 2 ml d'eau distillée. Les dilutions en série des homogénats ont été mises en culture sur TSA et sur TSA contenant la kanamycine pour déterminer la concentration de bactéries de la souche parente (sensible à la kanamycine) et de la souche mutée (résistante à la kanamycine) .
Exemple 2 [0068] Un mutant dans le CDS fliF a été isolé lors d'un crible STM. Ce mutant est atténué chez la souris (P. Lestrate & al. 2003) . La virulence de la souche parentale B. melitensis 16M et du mutant transpositionnel fliF chez la souris BALB/σ est obtenue par l'infection de la rate après injection intrapéritonéale de 104 brucellae. (Les valeurs sont la moyenne plus ou moins l'écart type (n=4) ) . De même lors d'un crible d'expression différentielle de la GFP mené chez B . suis dans des macrophages murins, un clone possédant la région amont du CDS fliF a été isolé. Ce résultat a été confirmé chez B . meli tensis dans deux autres types cellulaires (une lignée de macrophages bovins et des cellules HeLa) (figure 1) . [0069] Des cellules HeLa ont été infectées avec des Brucella portant le plasmide avec le rapporteur GFP sous contrôle du promoteur de fliF et observées &après 24h (A) ou 48 heures (B) d'infection. [0070] Un marquage du S-LPS avec un anticorps détecté par une fluorescence rouge a également été réalisé sur des cellules infectées depuis 24 heures et démontre que toutes les bactéries expriment la GFP
[0071] Une souche de B. meli tensis 16M portant un plasmide ou le gène de la GFP est sous contrôle du promoteur de fliF a été utilisée, alors que ces bactéries cultivées sur milieu bactériologique sont non fluorescentes. Elles expriment la GFP après 24 et 48 heures d'infection de cellules HeLa (figure la, lb) . A 24 heures, l'expression de la GFP et donc l'activité du promoteur de fliF concerne quasi toutes les bactéries comme le montre 1' immunodétection du S-LPS de Brucella (figure le) . [0072] Ces premières données prouvent que le système flagellaire n'est pas cryptique et qu'il est requis pour le cycle infectieux. Par contre, à ce stade, l'hypothèse de la reconversion en un système de sécrétion de type III reste posée . [0073] Cependant, d'autres CDS flagellaires sont requis pour le cycle infectieux de B . meli tensis . Des mutants pour des CDS de 1 'ultrastructure flagellaire et du moteur (fliC (BMEII0150) , flgE (BMEII0159) , flgl (BMEII1084) , otB (BMEII0154) ) et pour des CDS du système de sécrétion ( flhA (BMEII0166 -167 ') ) ont été créés (figure 2). [0074] Les souris ont été infectées avec 104 brucella par voie IP. Sur la figure 2, les valeurs (CFU/rate) représentent la moyenne plus ou moins la déviation standard des 4 souris :
A- souris infectées avec la souche 16M et les mutants fliF, flgl and fliC et analysées après 1, 4, 8 et 12 semaines d'infection. B- souris infectées avec la souche 16M et les mutants fliF, flhA, motB and flgE et analysées après 4semaines d' infection. [0075] Des groupes de souris BALB/c ont été infectés par voie intrapéritoneale (I.P.) soit avec la WT B . meli tensis 16M strain soit par les mutants flagellaires correspondant au MS ring ( fliF) , au P ring (flgl) et au filament (fliC) , ce qui correspond aux trois niveaux de la structure flagellaire. Les souris ont été sacrifiées après 1, 4, 8 et 12 semaines d'infection pour déterminer le nombre de CFU dans leur rate .
[0076] Après une semaine d'infection, aucun des mutants ne montre d'atténuation par rapport à la souche sauvage (16M) (figure 2a) . Par contre, au fur et à mesure que l'infection progresse le nombre de CFU dans la rate des mutants fliF, flgl et fliC devient significativement inférieur à celui que l'on retrouve dans les souris infectée avec la souche sauvage . [0077] La plupart des souris infectées avec les mutants se sont débarrassées des bactéries après 12 semaines d'infection. [0078] Comme confirmation, une nouvelle infection a été réalisée avec d'autres mutants (flhA, motB, flgE, et fliF) et les souris ont été sacrifiées après 4 semaines. A nouveau, tous les mutants sont atténués par rapport à la souche sauvage (figure 2b) . [0079] Ces données indiquent que ces gènes flagellaires et la structure flagellaire qu' ils encodent sont requis pour l'établissement d'une infection chronique chez la souris. [0080] En conclusion, les CDS flagellaires ne sont pas exclusivement reconvertis en un système de sécrétion puisque des CDS encodant la flagelline (FlgC) , le monomère du coude (FlgE) et l'anneau P (Flgl) sont impliqués dans le cycle infectieux. Un autre CDS flagellaire (FlgF, monomère de la tige) est également impliqué dans le cycle infectieux, il a été isolé lors d'un crible STM réalisé chez la chèvre . Tests sur brebis gestantes
Informations sur le croisement et le transfert génétique
[0081] Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) sur l'ADN génomique isolé du donneur 1 avec les amorces oligonucléotidiques upflgl (5'-GCGCGCCTGAAGGACATC-3' ) (SEQID N° 52) et lowflgl (5' -ACGGCGGTCGTGAAATCG-3' ) (SEQID N° 53) d'un fragment allant du nucleotide 113 au nucleotide 635 de la phase codante flgl et nommé ici amplicon flgl. [0082] L' amplicon flgl d'une taille de 533 paires de bases a été clone au site EcoRV du vecteur pSKKan, générant le vecteur pSKKan-flgl. Le pSKKan a été obtenu par clonage du gène conférant la résistance à la kanamycine (amplifié par PCR à partir du plas ide pUC4K de Pharmacia avec les amorces kanamont (5' -GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3 ' ) (SEQID
N° 54 and kanaval (5' -GGGGTGACCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3 ' ) (SEQID N° 55) au site Seal du gène bla du pSK-oriT. Le pSK- oriT est un dérivé du pBluescriptSK(-) (Stratagene) décrit dans Tibor et al, 2002 (Infect and Immun, 70:5540-6). L'origine de réplication fl du pBluescript a été exciseéé par restriction Sspl et remplacée par un fragment de 0,76 kb Smal-Sall contenant l'origine de transfert RK2. [0083] La séquence de l' amplicon flgl est la séquence SEQID N° 56. [0084] L' amplicon flgl, encodant un homologue du monomère du P ring du flagelle, anneau localisé dans la membrane externe et faisant partie du corps basai d'une structure flagellaire (numéro de séquence codante dans le génome de B. melitensis 16M : BMEII1084) . Cette séquence codante de 1074 nucléotides encode une protéine prédite de 358 résidus. La souche mutée porte deux copies incomplètes de flgl (SEQID N° 57) .
[0085] La séquence des deux copies incomplètes sont les séquences SEQID N° 58 et SEQID N° 59.
Analyse de la virulence résiduelle en brebis gestantes [0086] 2 groupes de 5 brebis ont été synchronisés et inséminés. Au jour 90 de la gestation un groupe à reçu
1x10 CFU de la souche vaccinale Revl (Ovirev® de la firme Vétoquinol) par voie conjonctivale dans 100 microlitres. 5 autres animaux ont reçu une dose correspondante d'un mutant flagellaire (Flgl BMEII 1084) de la souche B.melitensis
16M. L'inoculum a été contrôlé et correspond bien à la dose attendue . [0087] Une parturition normale s'est déroulée pour tous les animaux 7 à 8 semaines après cette infection, aucun avortement n'a été constaté. Tous les animaux ont montré une seroconversion et sont restés séropositifs en
ELISA jusqu'à leur euthanasie. [0088] Toutes les tentatives d'isolement de Brucella sur milieu de Farrel ont été infructueuses, que ce soit à partir de la brebis ou de l'agneau. [0089] Bien que ces données soient préliminaires, il est intéressant de constater que le mutant flgl réalisé sur un background sauvage n'a pas induit d'avortement et qu'il n'a pas été possible de détecter d'excrétion bactérienne alors que tous les animaux ont bien été infectés d'après les résultats sérologiques (figure 8) . Références
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Claims

REVENDICATIONS 1. Cellules recombinantes de Brucella comprenant une modification génétique dans la séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire ou une séquence nucleotidique régulatrice de ladite séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire.
2. Cellules de Brucella selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le groupe constitué par les souches de Brucella meli tensis, B. abortus, B. canis, B. suis, B. ovis, B. neotomae , B. cetaceae et -B. pinnipediae .
3. Cellules de Brucella selon la revendication 1 ou 2 dont la séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire est choisie parmi le groupe constitué par la séquence d'identification SEQID N°l à la séquence d'identification SEQID N°50.
4. Cellules de Brucella selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la modification génétique consiste en une insertion, une déletion ou une modification d'au moins un nucleotide de la séquence nucleotidique.
5. Composition vaccinale comprenant un véhicule ou un diluant pharmaceutique adéquat et les cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Utilisation de la composition selon la revendication 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'infections induites par Brucella chez un mammifère, y compris l'homme.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'infection induite par Brucella est choisie parmi le groupe constitué par un avortement chez une femelle gestante ou une orchite chez un mâle une méningite, une endocardite et/ou une arthrite.
8. Procédé de traitement et/ou de prévention d'une infection induite chez un mammifère, y compris l'homme, comprenant l'administration d'une quantité suffisante de la composition pharmaceutique selon la revendication 5 pour prévenir ou traiter les symptômes induits par cette infection.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les symptômes induits par l'infection sont choisi parmi le groupe constitué par un avortement chez une femelle gestante ou une orchite chez un mâle, une méningite, une endocardite et/ou une arthrite.
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