WO2005003353A1

WO2005003353A1 - Cellules de brucella genetiquement modifiees et composition pharmaceutique les comprenant

Info

Publication number: WO2005003353A1
Application number: PCT/BE2004/000099
Authority: WO
Inventors: Jean-Jacques Letesson; Pascal Lestrate; Anne Tibor; David Fretin; Jacques Godfroid
Original assignee: Facultes Universitaires Notre-Dame De La Paix
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2005-01-13
Also published as: EP1493813A1; EP1664302A1

Abstract

La présente invention se rapporte à des cellules recombinantes de Brucella comprenant une modification génétique dans la séquence nucléotidique sauvage encodant une protéine flagellaire de Brucella et leurs applications thérapeutiques.

Description

CELLULES DE BRUCELLA GENETIQUEMENT MODIFIEES ET COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LES COMPRENANT

Objet de l'invention

[0001] La présente invention est relative à des cellules de Brucella génétiquement modifiées incluant une ou plusieurs modifications ^'génétiques dans les séquences nucléotidiques sauvages encodant des protéines flagellaires de Brucella importantes au niveau du cycle infectieux de ce micro-organisme chez les mammifères . [0002] La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant ces cellules de Brucella génétiquement modifiées et un procédé pour obtenir de telles cellules et une telle composition pharmaceutique.

Arrière-plan technologique à la base de 1 ' invention Brucella et brucellose [0003] Les bactéries du genre Brucella sont des coccobacilles gram-négatif qui appartiennent à la famille des α-Protéobactéries . Ce sont des pathogènes intracellulaires cultivables en milieu de laboratoire, mais dont on ne connaît pas de forme libre naturelle. Différentes espèces ont été définies en fonction de leur propension à être associées à un hôte particulier (pour revue (Moreno, (2002) ) . On distingue B . meli tensis chez les caprins, B. abortus chez les bovins, B. canis chez le chien, B . suis chez le porc, B . ovis chez les ovins et B . neotomae chez certains rongeurs. Deux nouvelles espèces associées aux mammifères marins sont en cours de description, B . cetaceae et B . pinnipediae (Cloec aert, (2001) ) . [0004] Chez les animaux, la brucellose est une maladie du système reproducteur induisant des avortements chez les femelles gestantes et des orchites chez les mâles. La transmission d'un animal à l'autre semble majoritairement due aux avortements qui libèrent un nombre élevé de bactéries dans l'environnement. La transmission à l'homme s'effectue soit par contact direct avec des avortons infectés, soit par consommation de produits laitiers non pasteurisés. Chez l'homme, seules les espèces meli tensis, suis, abortus et canis sont connues pour induire une infection systemique pouvant prendre des formes variées (méningites, endocardites, arthrites ...) et souvent associée à une fièvre ondulante, appelée fièvre de Malte. [0005] Les processus par lesquels Brucella infecte son hôte sont encore mal connus . Elle pourrait pénétrer passivement via des ruptures de l'intégrité de 1 ' épithélium, mais aussi en traversant les muqueuses respiratoires et/ou digestives. Une fois dans les tissus sous-jacents, la bactérie fera face au système immunitaire de son hôte. Pour s'en prémunir, Brucella a développé une stratégie originale qui consiste à se « cacher » au sein même de celui-ci. La bactérie utilise en effet les cellules phagocytaires comme première niche de réplication. Les cellules immunitaires deviendront donc des chevaux de Troie permettant la dissémination de la bactérie au sein de tout l'organisme. Chez les animaux, Brucella est le plus souvent associée aux tissus lymphoïdes , à la glande mammaire et aux organes reproducteurs. Chez les femelles gestantes, Brucella envahit les cellules du trophoblaste chorioallantoïque, qui constituent sa deuxième niche de réplication. La réplication massive de la bactérie au sein du réticulum endoplasmique rugueux (RER) va entraîner la nécrose cellulaire et l'ulcération de la membrane chorioallantoïque . L'infection se répandra alors dans les tissus fœtaux, provoquant in fine 1 ' avortement .

Les déterminants moléculaires de la virulence de Brucella [0006] La pathogénie induite par Brucella repose donc principalement sur sa capacité à se répliquer dans les cellules eucaryotes (phagocytaires et non-phagocytaires) . Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces processus ont fait l'objet de nombreuses études. Celles-ci, en utilisant des approches variées (délétion, mutagénèse transpositionnelle, DFI, STM...) dans divers modèles d'infections (macrophages de différentes espèces, cellules HeLa, souris BALB/C et C57 Black, chèvres ...) ont permis l'identification de plus de 200 gènes de virulence. L'analyse de ceux-ci permet d'inférer les étapes cruciales du cycle infectieux de Brucella . Celles-ci, pour plus de clarté, sont divisées en 6 classes (Mahan, (2000) Bellaire (2003) ; Porte (1999) ; Lopez-Goni (2002) Taminiau (2002) ; Delrue (2002) ; Fernandez-Prada (2003) Porte (2003) ; Tibor (2002) ; Guzman-Verri (2002)) : la satisfaction des besoins métaboliques, la réponse au stress, la régulation, l'invasion, la survie intracellulaire et les interactions de surfaces. [0007] De plus, Brucella est décrite comme non mobile mais, en 1998, S.Halling (Halling, S. 1998. Microb

Comp Genomics. 3(1) :21-9) a découvert 3 CDS homologues à des gènes flagellaires dans le génome de B . abortus .

Buts de l'invention [0008] La présente invention vise à caractériser des séquences génétiques spécifiques de Brucella dont la modification génétique permet de sélectionner des cellules de Brucella recombinantes présentant un pouvoir infectieux moindre (une virulence atténuée ou absente) et pouvant être utilisées comme alternative thérapeutique, en particulier alternative vaccinale des compositions vaccinales de l'état de la technique . [0009] La présente invention vise également à fournir un procédé pour l'obtention desdites cellules de Brucella recombinantes et ladite composition pharmaceutique de l'invention.

Eléments caractéristiques de l'invention [0010] La présente invention est relative à des cellules de Brucella recombinantes comprenant une modification génétique dans une séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire ou une séquence nucleotidique régulatrice de la séquence nucleotidique sauvage encodant ladite protéine flagellaire. De préférence, les cellules de Brucella sont choisies parmi le groupe constitué par les espèces suivantes : Brucella eli tensis (particulièrement active chez les caprins Brucella abortus, chez les bovins ; Brucella canis, chez le chien ; - Brucella suis, chez le porc ; Brucella ovis, chez les ovins ; Brucella neotomae, active chez certains rongeurs) Brucella cetaceae, et Brucella pinnipediae .

Cette séquence sauvage est de préférence sélectionnée parmi le groupe constitué par les séquences SEQID N°l à SEQID N° 50. [0011] En particulier, lesdites séquences nucléotidiques ont été modifiées par une insertion, une délétion ou une substitution d'au moins un nucleotide dans la séquence nucleotidique sauvage, de manière à perdre le caractère infectieux (virulent) des cellules de Brucella . [0012] Un autre aspect de la présente invention concerne une composition vaccinale comprenant un véhicule ou un diluant pharmaceutique adéquat, les cellules de Brucella recombinantes de l'invention et éventuellement un ou plusieurs adjuvants pour induire une réponse immunitaire à l' encontre d'une souche de Brucella chez un mammifère, y compris 1 ' homme . [0013] Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la composition selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'infections induites par Brucella chez un animal, en particulier les caprins, les bovins, le chien, le porc, les ovins (en particulier le mouton) et éventuellement l'homme. [0014] Chez les animaux, de telles infections sont susceptibles de provoquer des avortements chez les femelles gestantes et des orchites chez les mâles . [0015] Les infections chez les mammifères sont également susceptibles d'infecter l'homme et provoquer une infection systématique pouvant prendre des formes variées, telles que méningites, endocardites, arthrites et souvent associée à une fièvre ondulante, appelée fièvre de Malte. [0016] La présente invention concerne également le procédé de traitement et/ou de prévention d'une infection induite chez un mammifère, y compris l'homme, comprenant l'administration d'une quantité suffisante de la composition pharmaceutique de l'invention pour prévenir ou traiter les symptômes de cette infection. [0017] Un dernier aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'une cellule de Brucella recombinante qui consiste à :

- identifier une séquence nucleotidique « virulente » et encodant une protéine flagellaire de Brucella, c'est-à- dire une séquence nucleotidique susceptible d'être impliquée dans le cycle infectieux de ce micro-organisme chez un mammifère, (y compris l'homme), cette séquence nucleotidique étant identifiée dans le génome d'une souche de Brucella par l'utilisation d'une séquence nucleotidique spécifique d'un motif de séquence nucleotidique encodant une protéine flagellaire, par exemple des motifs caractéristiques des séquences SEQID n° 1 à SEQID n° 50 identifiés chez Brucella melitensis, tel que une hybridation ou par amplification génétique avec une sonde ou une paire d'amorces (ayant de préférence une longueur supérieure à 12 nucléotides et qui présentent au moins 10 nucléotides identiques avec le motif d'une séquence encodant une protéine flagellaire) ; - induire une modification de cette séquence nucleotidique virulente encodant une protéine flagellaire de manière à rendre cette séquence avirulente ; et

- recueillir les souches de Brucella recombinantes (génétiquement modifiées) , ayant cette modification génétique (par exemple, par insertion d'une séquence génétique, par délétion d'une séquence génétique ou par modification d'au moins un nucleotide et éventuellement incorporer cette cellule de Brucella génétiquement modifiée comportant cette séquence nucleotidique avirulente encodant une protéine flagellaire dans une composition pharmaceutique, de préférence vaccinale, comprenant un ou plusieurs véhicules ou diluants pharmaceutiques adéquats pour une administration à un mammifère. [0018] Selon l'invention, les modifications génétiques ont été introduites dans des séquences nucléotidiques qui, de manière inattendue, encodent des protéines flagellaires de Brucella importantes au niveau du cycle infectieux de ce micro-organisme chez les mammifères. Ces séquences ont été choisies car elles représentent l'ensemble des protéines nécessaires à la biosynthèse de l'appareil de sécrétion des protéines flagellaires à l'ultra structure flagellaire proprement dite et au moteur ainsi que des protéines impliquées dans la régulation de l'expression de ces protéines. Par contre, aucune séquence codante apparentée au système de chemotactisme n'a été identifiée parmi ces séquences. [0019] De préférence, ces séquences sont impliquées dans les cycles infectieux chez la souris (en particulier les séquences fliC, flgE, motB, flgl, flhA, 2C2 et fliF identifiées respectivement par SEQID N°l, 10, 5, 40, 17, 18, 9 et 2. [0020] La présente invention englobe aussi les modifications génétiques des portions et des variants de ces séquences ou de leurs brins complémentaires. Des portions de séquences selon l'invention concernent des séquences nucléotidiques ou peptidiques présentant les mêmes caractéristiques antigéniques et immunogéniques que la portion complète, ainsi que des portions susceptibles également de provoquer des cycles infectieux chez des mammifères, en particulier chez le modèle de la souris. Des variants de ces séquences englobent des séquences présentant une forte homologie ou une forte identité de séquences avec les séquences de l'invention. [0021] De préférence, cette identité ou homologie de séquences est supérieure à 80%, de préférence supérieure à 85%, plus particulièrement supérieure à 95%, voire supérieure à 98 ou 99% avec la séquence nucleotidique ou peptidique complète choisie parmi le groupe constitué par les séquences SEQID N°l à SEQID N° 50 (BMEI0370 à 372, BMEII0150 à 170, BMEII1078 à 1089, BMEII1104 à 1117). [0022] Les variants de l'invention peuvent être des variants naturels (présents éventuellement dans< d'autres familles de souches ou dans d'autres espèces) ou des variants modifiés par les techniques de mutagènese ou par synthèse directe, mais conservant l'activité biologique du polypeptide de référence, en particulier ces propriétés antigeniques et immunogeniques. Les propriétés antigeniques pouvant être testées par des procédures standard (immunobloting) utilisant de préférence des sérums polyclonaux ou monoclonaux, en particulier dans les tests standard ELISA. [0023] Le terme "identité de séquence" ou "homologie de séquence" sont des termes bien connus de l'homme de l'art (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math 1998, Vol. 48, p. 1073). Une identité de séquences peut être calculée par l'homme de l'art en utilisant des techniques bien connues (Computational molecular biology, Lesk, A.MK, éd. Oxford University Press, New York 1988 ; Biocomputing : informatics and génome projects, Smith, D.W., éd. Académie Press, New York 1993; Computer Analysis of séquence data, part I,Griffin, A.M. , and Griffin, H. G., Humana Press, New Jersey 1994; Séquence analysis in molecular biology, von Heijne, G. , Académie Press 1987 and séquence analysis primer, Gribskov, M. and Devereux, J. éd.

Stockton Press, New York 1991) . [0024] De même, des méthodes pour caractériser une identité ou une similarité entre deux séquences génétiques peuvent utiliser les programmes informatiques connus, tels que les programmes Blast et G.C.G. [0025] Les portions ou fragments des séquences polypeptidiques et nucléotidiques de l'invention comprennent des séquences structurelles et fonctionnelles importantes, en particulier les séquences comprenant des hélices alpha ou des plans bêta, les régions formant des boucles, les régions hydrophiles ou les régions hydrophobes et les portions comprenant des index antigeniques épitopes ou linéaires ou conformationnels élevés.

Brève description des figures

[0026] La figure 1 représente le suivi de l'expression du promoteur fliF par observation de la fluorescence GFp. [0027] La figure 2 représente l'analyse de l'atténuation de mutants flagellaires dans le modèle murin. [0028] La figure 3 représente l'expression de gènes et de protéines flagellaires de -B-rucella dépendant de la phase de croissance. [0029] La figure 4 représente l'observation microscopique électronique du flagelle de Brucella . [0030] La figure 5 représente la mesure de l'activité du promoteur de FliF durant une courbe de croissance. [0031] La figure 6 représente l'analyse CDS page et western blotting de l'expression de la protéine du coude du flagelle de Brucella . [0032] La figure 7 représente l'expression de la protéine du coude du flagelle de Brucella . [0033] La figure 8 représente le suivi en ELISA de la sérologie chez 5 brebis injectées par le mutant Flgl (F) et de la souche vaccinale revl (R) . Description détaillée de l'invention Caractérisation des séquences flagellaires

[0034] A titre d'exemple, les inventeurs ont mis en évidence l'expression de trois séquences de l'invention : fliF (BMEII0151) ex vivo et de fliF (BME---I0151) , flgE (BMEII0159) et fliC (BMEII0150) in vitro. L'expression de ces trois séquences qui représentent de manière inattendue les différents niveaux de la structure flagellaire (les monomères de l'anneau MS, du coude et du filament) était coordonnée. Ces différentes données permettent de proposer l'existence d'un régulon flagellaire fonctionnel chez Brucella . [0035] Le système flagellaire de Brucella est apparenté à celui d'autres rhizobiacés. Au sein de ce groupe, le parent le plus proche de Brucella est

Mesorhizobium loti . Pour les CDS lagellaires, cette parenté est marquée à deux niveaux :

1. l' homologie de séquence, et

2. l'organisation de CDS au sein des loci . [0036] Un scénario évolutif est proposé par Moreno : l'ancêtre de Brucella serait une bactérie flagellée mobile vivant dans le sol (Moreno et al . , 2002). Cette bactérie est devenue progressivement un pathogène intracellulaire et s'est adaptée au mode de vie parasitaire. Au niveau flagellaire, elle perd son système chemotactique . Cet auteur émet l'hypothèse que les séquences flagellaires soient en fait des « fossiles » issus de ces ancêtres mobiles. Cette hypothèse semble peu vraisemblable. Par rapport à son ancêtre, Brucella a réduit son génome et malgré cela l'inventaire révèle que 1% de son matériel génétique est dédié aux CDS flagellaires, il est donc probable qu'elles aient une fonction. Pour d'autres auteurs, la parenté entre les systèmes flagellaires et les systèmes de sécrétion de type III laisse supposer que Brucella a en fait reconverti ces CDS flagellaires en un système de sécrétion (DelVecchio et al . , 2002) (Ugalde, 1999). L'inventaire des CDS que nous avons réalisé nous a amené à poser la question de l'existence transitoire d'un flagelle chez Brucella .

Conditions d'expression in vitro

[0037] Les difficultés techniques liées aux infections expérimentales ont amené les inventeurs à rechercher une condition d'expression in vi tro des CDS flagellaires. Les inventeurs ont évalué l'expression des CDS flagellaires en fonction du stade d'une culture liquide et ont constaté l'expression de la flagelline, du monomère du coude et de l'anneau MS à faible densité de population. De plus, l'expression de ces CDS est concertée (figure 3) . A- L'activité galactosidase de B . eli tensis 16M portant une fusion traductionelle pfliF-lacZ cultivée en milieu riche, montre que le promoteur de fliF est exprimé de manière transitoire durant le tout début de la phase exponentielle

B- Western blot réalisé sur des extraits totaux de culots de B . meli tensis récoltés le long d'une courbe de croissance. Des polyséra spécifiques de FlgE (monomère du coude) et de FliC (flagelline) nous ont permis de visualiser les monomères respectifs du coude et du filaments en début de phase exponentielle (4, 8 et 12 heures) alors que ces deux protéines ne sont plus détectées à des temps plus longs. [0038] Quand on cultive en milieu riche B . meli tensis 16M portant une fusion traductionelle pfliF- lacZ sur un plasmide, le dosage de l'activité galactosidase montre que le promoteur de fliF est exprimé de manière transitoire durant le tout début de la phase exponentielle (figure 3A) . Suite à cette démonstration de l'expression de la partie basale d'un flagelle, nous avons voulu déterminer si les parties distales (coude, filament) étaient aussi exprimées dans ces conditions. Dans ce but. Un western blot a été réalisé sur des extraits totaux de culots de B . meli tensis récoltés le long d'une courbe de croissance. Des polyséra spécifiques de FlgE (monomère du coude) et de FliC (flagelline) nous ont permis de visualiser les monomères respectifs du coude et du filaments en début de phase exponentielle (4, 8 et 12 heures) alors que ces deux protéines ne sont plus détectées à des temps plus longs, ce qui est en accord avec les données d'expression du promoteur de fliF (figure 3B) .

[0039] La détection des protéines correspondant au monomère du coude et du filament rend vraisemblable le fait que Brucella assemble une structure flagellaire complète.

[0040] Une des particularités de Brucella est qu'elle est à ce jour la seule bactérie qui exprime des CDS flagellaires et qui ne possède pas de système de chemotactisme . A long terme, il existe deux perspectives d'une part comprendre la fonction de ce système chez

Brucella et d'autres part établir un schéma de la régulation de ce système, schéma qui pourra lui-même être intégré à celui d'autres systèmes impliqués dans la virulence .

Observation du flagelle [0041] Comme représenté à la figure 4, l'observation au microscope électronique à transmission du flagelle de Brucella montre après coloration négative sans (5a et 5b) et avec (5c et 5d) marquage à l'or colloïdal du S-LPS au moyen d'un anticorps monoclonal spécifique de l'épitope M. Les barres représentent 1 micron (A et B) , 0,5 micron (C) , 0, 2 micron (D) . [0042] L'observation en microscopie électronique à transmission de B . meli tensis récoltées en début de phase exponentielle et colorée négativement révèle l'existence d'un flagelle polaire. Un marquage à l'or colloïdal de la chaîne 0 du LPS de B . meli tensis sur ces coupes montre qu'il s'agit bien de Brucella et que le flagelle est entouré d'une membrane externe, comme c'est décrit chez d'autres bactéries Vibrio cholerae, Helicobacter sp . et Bdellovibrio sp . (Fuerst (1988) , Hernandez (1994) , Thomashow (1985)).

Fonction du flagelle

La plus évidente fonction de ces gènes est de permettre à la bactérie de trouver son hôte. Chez Brucella l'absence de système chemotactique donne peu de poids à cette hypothèse. Néanmoins chez certaines bactéries la création de souches mutantes non chemotactiques conduit à une augmentation de la virulence dans des modèles d'infection. On peut donc supposer que Brucella ait perdu son système chemotactique mais qu'elle soit néanmoins mobile.

Chez Yersinia enteroli tica, une phospholipase et probablement d'autres protéines impliquées dans la virulence sont sécrétées par l'appareil d'exportation des protéines flagellaires. Il est possible que Brucella sécrète des protéines impliquées dans la virulence. Il est difficile de comprendre l'intérêt pour la bactérie de synthétiser un filament connaissant le coût métabolique important pour la cellule. Une fonction sécrétrice serait une fonction accessoire que pourrait remplir les CDS flagellaires. [0043] D'autres fonctions peuvent être envisagées telle que l'adhésion ou bien des propriétés immunomodulatrices . [0044] Différents critères peuvent être retenus pour sélectionner les effecteurs potentiellement sécrétés : avoir une parenté avec un CDS eucaryotique, être à côté d'un petit gêne pouvant servir de chaperonne, ne pas posséder une séquence signal. Une liste de 72 CDS présentant des homologies principalement avec des CDS eucaryotes a été établie. La plupart de ces CDS sont homologues à des CDS métaboliques et l'on peut difficilement leur prédire un rôle dans le cycle infectieux, il est difficile d'en sélectionner pour des expériences ultérieures.

[0045] Une deuxième approche expérimentale est donc plus recommandable . Des extraits protéiques peuvent êtres réalisés sur des surnageants de culture d'une Brucella sauvage et d'une souche disruptée pour l'appareil de sécrétion (le mutant flif ou flhA par exemple) et une approche protéomique permettra la comparaison des deux souches afin d'identifier ces éventuels candidats.

Régulation de l'expression du système L'enclenchement de la cascade : chez les bactéries pathogènes, la régulation de l'expression des gènes flagellaires est une étape importante dans la pathogénie. Certaines bactéries co-régulent leurs facteurs de virulence et leur flagelle (Akerley et al . , 1995) . Les systèmes flagellaires sont très immunogenes et coûteux en énergie. La stratégie adoptée par certaines bactéries sera donc de réprimer leurs gènes flagellaires lors de l'entrée dans l'hôte tout en activant l'expression de facteur de virulence, c'est par exemple le cas pour Bordetella . Pour d'autres par contre ces systèmes seront absolument nécessaires pour accomplir le cycle de vie dans l'hôte. C'est par exemple le cas pour Legionella . Le gène 2C2 (BMEII0158 (ftcR) ) encode un régulateur des systèmes à deux composants. Dans ces. systèmes, en réponse à un stimulus une histidine kinase s' autophosphoryle et transmet ce phosphate à un régulateur de réponse dont le rôle sera de moduler l'expression de certains gènes en réponse à ce stimulus. 2C2 encode un activateur de la transcription de l'opéron fliF. L'expression du 2C2 (ftcR) est représentée dans les figures 5 et 6.

[0046] La figure 5 représente l'activité du promoteur de fliF durant une courbe de croissance a été comparée (par dosage de l'activité galactosidase) dans une souche WT et dans divers mutants de régulateurs transcriptionnels suspectés d'être impliqués dans la régulation du système flagellaire de Brucella . L'activité de pfliF est virtuellement nulle chez le mutant 2C2 (appelé aussi ftcR pour flagellar two component regulator) et le mutant Vjbr (Vacuolar jacking brucella regulator) . Le mutant tetR donne quant à lui une réduction de l'activité. [0047] L'activité du promoteur de fliF durant une courbe de croissance a été comparé (par dosage de l'activité galactosidase) dans une souche WT et dans divers mutants de régulateurs transcriptionnel suspectés d'être impliqués dans la régulation du système flagellaire de Brucella . L'activité de pfliF est virtuellement nulle chez le mutant 2C2 (ftcR) . [0048] Des échantillons de Brucella prélevés en début de phase exponentielle ( 4, 8 et 11 h de culture) ont été analysés par SDS PAGE et western blotting avec des anticorps anti monomère du coude ( FlgE) . Alors que le coude est exprimé par la souche sauvege, et par le mutant exprimant la copie du gène ftcR en trans ( mutant complémenté ftcrpMRftcR) il n'y a aucune expression de cette protéine dans le mutant 2C2 ( ftcR) . [0049] Pour comprendre cette régulation dans le cas du CDS 2C2 (ftcR) chez Brucella, il semble important dans un premier temps de muter l'aspartate 59 qui est le site de phosphorylation prédit. Deux types de mutations sont possibles : supprimer le site de phosphorylation en remplaçant l'aspartate par un glutamate et observer dans cette souche s'il y a toujours transcription des CDS flagellaires ou bien mimer une phosphorylation constitutive en mutant l'aspartate en asparagine et également conserver l'effet sur les CDS flagellaires. On peut également envisager la production d'anticorps dirigé contre le 2C2 (ftcR) afin d'évaluer la présence de ce régulateur au cours d'une croissance en culture liquide car on ne peut exclure une régulation par protéolyse. La purification de la protéine et des expériences de protection à la DNAse sur le promoteur de flif permettraient d'identifier la séquence cible de ce régulateur, ce qui par la suite donnerait la possibilité d'une analyse bioinformatique du génome et ainsi de trouver d'autres CDS régulés par 2C2 (ftcR) . [0050] Dans les systèmes à deux composants décrits le régulateur est en général en opéron avec son histidine kinase. Le 2C2 n'est pas localisé à côté de son histidine kinase. Dans un second temps la recherche de l'histidine kinase est donc une étape clef pour comprendre la voie de transduction du signal qui conduit à l'activation de 2C2 (ftcR) . 23 histidines kinases ont été prédites dans le génome. Il est donc intéressant de les muter ou bien de les utiliser dans un crible double hybride. Une fois cette kinase découverte, un schéma général de l'expression de ces deux protéines et de la phosphorylation peut être établi en fonction de croissance en culture liquide. Une fois ce schéma établi, il faut effectuer des liens entre les phénotypes observés (expression en phase de latence, en cellule) et les acteurs moléculaires identifiés et éventuellement établir un modèle de l'expression des CDS flagellaires. D'autres acteurs sont certainement importants pour . ce système de régulation. Chez Sinorhizobium meliloti , le CDS occupant la place du 2C2 (ftcR) dans le locus flagellaire est impliqué dans la régulation des CDS flagellaires. Ce CDS est lui-même régulé par VisN/VisR. [0051] La figure 7 représente l'expression de la protéine du coude (40 kDa) chez les mutants ArpoHl , ΔrpoN, ArpoV et ArpoE et la WT après 4h (souches en phase de latence) et 8h de croissance (souches en début de phase exponentielle) . Le mutant pd : z ftcR a été utilisé comme contrôle négatif et la protéine recombinante étiquetée et purifiée du coude comme contrôle positif (FlgE = 42 KDa) . Dans chaque puits, nous avons déposé 20 ul d'échantillons d'une D0₆oo=6. [0052] Chez Brucella à la place de ce dernier locus, on retrouve les CDS VjbR (BMEII1116) et TetR (BMEII1117) . VjbR est également nécessaire à l'induction du promoteur de fliF (figure 7) et à l'expression de FlgE et de FliC. TetR semble aussi avoir un effet sur l'activation du promoteur de fliF (figure 5) , mais cela nécessite confirmation. Parmi les facteurs sigma de Brucella, celui encodé par l'ORF BMEI0371 est également impliqué dans la régulation de l'expression de FlgE et de FliC. La délétion de cette ORF entraîne en effet une sur-expression de ces deux protéines. On émet l'hypothèse que ce facteur sigma régulerait un répresseur flagellaire. Le stade de la cascade flagellaire auquel ce facteur sigma intervient reste à déterminer. [0053] Cette ORF est entourée d'une histidine kinase (BMEII0370) et d'un régulateur de réponse de systèmes à deux composants (BMEII0372) dont le rôle dans l'expression des gênes flagellaires doit être testé. [0054] Étant donné l'expression à faible densité de population, un effet répresseur d'un système de type quorum sensing peut être envisagé. Des tests en milieu conditionné (c'est-à-dire du milieu dans lequel on a déjà fait croître des bactéries) ou du milieu contenant les phéromones isolées de culture de Brucella permettraient de mettre en évidence un lien entre le quorum sensing et le système flagellaire . [0055] Chez Caulobacter cresentus, l'expression du régulon flagellaire est dépendante du régulateur CtrA

(Bellefontaine et al . , 2002). Un homologue fonctionnel de ce régulateur est présent chez Brucella . sp . Néanmoins il est peu probable qu'il soit impliqué dans le système flagellaire puisque la séquence consensus de liaison (TTAAN7TTAA) du régulateur a été identifiée et qu'elle ne se retrouve devant aucun CDS flagellaire.

Le contrôle interne de l'expression. [0056] Au cours de ce travail les inventeurs ont mis en évidence que l'expression de. trois CDS est concertée. Sur base de l'analyse génomique, 13 unités de transcription dans les locus flagellaires sont prédites. Cette prédiction est à vérifier expérimentalement, soit par RT-PCR ou par des systèmes rapporteurs. Des tests de complémentation de ces mutants sont effectués pour détecter d'éventuels effets polaires sur les gènes situés en aval de la mutation de délétion. Les mutants fliF (BMEII0151) et 2C2 (BMEII0158) ont été complémentés par une copie plasmidique sauvage des gènes correspondants exprimés sous le contrôle de leur propre promoteur . [0057] Les inventeurs ont également identifié lors de cet inventaire un homologue de flbT (BMEII0163) . Chez Caulobacter crescentus , FlbT est un répresseur traductionnel qui contrôle l'expression de la flagelline.

Si le CDS de Brucella est un homologue fonctionnel de FlbT, une souche délétée de ce gène devrait exprimer de la flagelline de manière constitutive. [0058] Sur base des considérations développées ci- dessus et considérant les données préliminaires concernant l'atténuation de la virulence de mutants flagellaires dans le modèle souris, il est intéressant de valider à plus large échelle et sur une cinétique plus étendue leur atténuation en souris et par la même occasion d'examiner leur potentialité comme souche vaccinale protectrice à 1' encontre d'un challenge infectieux.

[0059] L'utilisation initiale du modèle murin de protection permettra d'analyser plus de conditions avant d'éventuellement sélectionner certains mutants qui seront analysés par la suite dans un modèle d' infection faisant appel à l'espèce hôte : le mouton.

Construction du mutant flgl de B. meli tensis [0060] La séquence codante choisie est le gène flgl encodant un homologue du monomère du P ring du flagelle, anneau localisé dans la membrane externe et faisant partie du corps basai d'une structure flagellaire, numéro de séquence codante dans le génome de B. melitensis 16M : BMEII1084 (Séquence codante de 1074 nucléotides qui encode une protéine prédite de 358 résidus) . La souche mutée porte deux copies incomplètes de flgl.

Origine de l'ADN et caractérisation [0061] Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) sur l'ADN génomique isolé du donneur 1 (B. melitensis 16M) avec les amorces oligonucléotidiques upflgl (5' -GCGCGCCTGAAGGACATC-3 ' ) et lowflgl (5' -ACGGCGGTCGTGAAATCG-3' ) d'un fragment allant du nucleotide 113 au nucleotide 635 de la phase codante flgl et nommé ici amplicon flgl [0062] L' amplicon flgl d'une taille de 533 paires de bases a été clon au site EcoRV du vecteur pSKKan, générant le vecteur pSKKan-flgl. Le clonage de l' insert a été vérifié par séquençage. Le pSKKan a été obtenu par clonage du gène conférant la résistance à la kanamycine (amplifié par PCR à partir du plasmide pUC4K de Pharmacia avec les amorces kanamont (5' -GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3 ' ) et kanaval (5 ' -GGGGTGACCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3 ' ) ) au site Seal du gène -bla du pSK-oriT. Le pSK-oriT est un dérivé du pBluescriptSK(-) (Stratagene) décrit dans Tibor et al, 2002, Infect and Immun, 70:5540-6. L'origine de réplication fl du pBluescript a été excisée par restriction Sspl et remplacée par un fragment de 0,76 kb Smal-Sall contenant l'origine de transfert RK2.

Obtention et description du mutant [0063] Le vecteur pSKKAN contenant l' insert fragment interne de flgl (nommé pSKKan-flgl) a été transféré d'Escherichia coli S17-1 à B. melitensis 16M NalR par conjugaison. Le vecteur est intégré dans le génome de Brucella, dans le gène flgl, conduisant à deux copies incomplètes de ce gène. Les candidats intégrants sont résistants à la kanamycine. L'intégration site-spécifique a été vérifiée par Southern blot sur de l'ADN génomique de clones candidats intégrants restreints par HindIII avec une sonde correspondant au gène conférant la résistance à la kanamycine . [0064] La modification connue des propriétés de l'hôte, B. melitensis 16M est une atténuation dans le modèle murin BALB/c. Sa modification prévisible est son incapacité à exprimer les protéines flagellaires faisant partie des structures les plus externes (notamment la flagelline) et son incapacité à construire une structure flagellaire : on s'attend à une bactérie non-flagellée. Tests sur des modèles cellulaires in vitro

Tests de protection sur souris Exemple 1 [0065] La survie des souches de Brucella a été évaluée sur des lignées de cellules immortalisées issues de macrophages d'origine péritonéale bovines (Stabel et Stabel , 1995) et dans des cellules cancéreuses HeLa par la procédure décrite par Delrue et al . (2001) . Brièvement, les souches de Brucella sont mises en croissance en phase logarithmique pour 18 h en 2YT en présence d'antibiotiques appropriés et additionnées aux cellules à des taux d'infection de 200 à 300 par milieu de culture cellulaire. Les plaques de culture sont centrifugées pendant 5 minutes pour les macrophages et pendant 10 minutes pour les cellules HeLa à 1000 tours par minute à température ambiante et placées en atmosphère 5% C0₂ a 37°C. Après une heure, les plaques sont lavées et incubées avec un milieu de culture supplémentaire comprenant 50μg de gentamicin (Life Technologies) par ml pour tuer toutes les cellules de Brucella extra-cellulaires. Le nombre de souches de Brucella intracellulaires viables est déterminé après deux heures ou 48 h de post-infection. Les données sont la moyenne de trois milieux de culture et représentent trois expériences. [0066] Les mutants flagellaires flgl de B . meli tensis ne montrent aucune atténuation significative dans ces modèles d'infection de lignées cellulaires.

Des souris femelles de huit semaines sont inoculées de manière intra-péritonéale avec 0,1 ml d'une suspension comprenant 5 x 10⁴ CFU de chaque souche bactérienne (mutant flgl et 16M NalR de souche parente) cultivée en présence de PBS (chaque dose étant confirmée rétrospectivement) . Après 8 et 12 semaines d' inoculation, 5 souris de chaque groupe de traitement sont sacrifiées. Le taux de survie des bactéries est déterminé après homogenisation des rates des souris dans 2ml d'eau distillée. Des dilutions en série des homogénats sont mises en culture sur TSA pour déterminer les concentrations bactériennes.

Essai 1 : en moyenne CFU par rate : n=5 (SD)

Essai 2 : moyenne logarithmique CFU par rate n=4 (SD)

[0067] Une femelle de huit semaines a été inoculée de manière intra-péritonéale avec 0,1 ml d'une suspension contenant environ 5 x 10⁴ CFU du mutant flgl mutant cultivé en présence de PBS (les doses exactes ont été rétrospectivement confirmées) (PBS était utilisé comme contrôle négatif. A huit semaines, après inoculation, 4 souris de chaque traitement mise en présence de B . meli tensis 16M par inoculation intra-péritonéale de 1 x 10⁴ CFU ont été sacrifiées quatre semaines après pour collecter les rates (12 semaines de post-vaccination) . Le taux de survie des bactéries a été déterminé après homogenisation des rates de souris dans 2 ml d'eau distillée. Les dilutions en série des homogénats ont été mises en culture sur TSA et sur TSA contenant la kanamycine pour déterminer la concentration de bactéries de la souche parente (sensible à la kanamycine) et de la souche mutée (résistante à la kanamycine) .

Exemple 2 [0068] Un mutant dans le CDS fliF a été isolé lors d'un crible STM. Ce mutant est atténué chez la souris (P. Lestrate & al. 2003) . La virulence de la souche parentale B. melitensis 16M et du mutant transpositionnel fliF chez la souris BALB/σ est obtenue par l'infection de la rate après injection intrapéritonéale de 10⁴ brucellae. (Les valeurs sont la moyenne plus ou moins l'écart type (n=4) ) . De même lors d'un crible d'expression différentielle de la GFP mené chez B . suis dans des macrophages murins, un clone possédant la région amont du CDS fliF a été isolé. Ce résultat a été confirmé chez B . meli tensis dans deux autres types cellulaires (une lignée de macrophages bovins et des cellules HeLa) (figure 1) . [0069] Des cellules HeLa ont été infectées avec des Brucella portant le plasmide avec le rapporteur GFP sous contrôle du promoteur de fliF et observées &après 24h (A) ou 48 heures (B) d'infection. [0070] Un marquage du S-LPS avec un anticorps détecté par une fluorescence rouge a également été réalisé sur des cellules infectées depuis 24 heures et démontre que toutes les bactéries expriment la GFP

[0071] Une souche de B. meli tensis 16M portant un plasmide ou le gène de la GFP est sous contrôle du promoteur de fliF a été utilisée, alors que ces bactéries cultivées sur milieu bactériologique sont non fluorescentes. Elles expriment la GFP après 24 et 48 heures d'infection de cellules HeLa (figure la, lb) . A 24 heures, l'expression de la GFP et donc l'activité du promoteur de fliF concerne quasi toutes les bactéries comme le montre 1' immunodétection du S-LPS de Brucella (figure le) . [0072] Ces premières données prouvent que le système flagellaire n'est pas cryptique et qu'il est requis pour le cycle infectieux. Par contre, à ce stade, l'hypothèse de la reconversion en un système de sécrétion de type III reste posée . [0073] Cependant, d'autres CDS flagellaires sont requis pour le cycle infectieux de B . meli tensis . Des mutants pour des CDS de 1 'ultrastructure flagellaire et du moteur (fliC (BMEII0150) , flgE (BMEII0159) , flgl (BMEII1084) , otB (BMEII0154) ) et pour des CDS du système de sécrétion ( flhA (BMEII0166 -167 ') ) ont été créés (figure 2). [0074] Les souris ont été infectées avec 104 brucella par voie IP. Sur la figure 2, les valeurs (CFU/rate) représentent la moyenne plus ou moins la déviation standard des 4 souris :

A- souris infectées avec la souche 16M et les mutants fliF, flgl and fliC et analysées après 1, 4, 8 et 12 semaines d'infection. B- souris infectées avec la souche 16M et les mutants fliF, flhA, motB and flgE et analysées après 4semaines d' infection. [0075] Des groupes de souris BALB/c ont été infectés par voie intrapéritoneale (I.P.) soit avec la WT B . meli tensis 16M strain soit par les mutants flagellaires correspondant au MS ring ( fliF) , au P ring (flgl) et au filament (fliC) , ce qui correspond aux trois niveaux de la structure flagellaire. Les souris ont été sacrifiées après 1, 4, 8 et 12 semaines d'infection pour déterminer le nombre de CFU dans leur rate .

[0076] Après une semaine d'infection, aucun des mutants ne montre d'atténuation par rapport à la souche sauvage (16M) (figure 2a) . Par contre, au fur et à mesure que l'infection progresse le nombre de CFU dans la rate des mutants fliF, flgl et fliC devient significativement inférieur à celui que l'on retrouve dans les souris infectée avec la souche sauvage . [0077] La plupart des souris infectées avec les mutants se sont débarrassées des bactéries après 12 semaines d'infection. [0078] Comme confirmation, une nouvelle infection a été réalisée avec d'autres mutants (flhA, motB, flgE, et fliF) et les souris ont été sacrifiées après 4 semaines. A nouveau, tous les mutants sont atténués par rapport à la souche sauvage (figure 2b) . [0079] Ces données indiquent que ces gènes flagellaires et la structure flagellaire qu' ils encodent sont requis pour l'établissement d'une infection chronique chez la souris. [0080] En conclusion, les CDS flagellaires ne sont pas exclusivement reconvertis en un système de sécrétion puisque des CDS encodant la flagelline (FlgC) , le monomère du coude (FlgE) et l'anneau P (Flgl) sont impliqués dans le cycle infectieux. Un autre CDS flagellaire (FlgF, monomère de la tige) est également impliqué dans le cycle infectieux, il a été isolé lors d'un crible STM réalisé chez la chèvre . Tests sur brebis gestantes

Informations sur le croisement et le transfert génétique

[0081] Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) sur l'ADN génomique isolé du donneur 1 avec les amorces oligonucléotidiques upflgl (5'-GCGCGCCTGAAGGACATC-3' ) (SEQID N° 52) et lowflgl (5' -ACGGCGGTCGTGAAATCG-3' ) (SEQID N° 53) d'un fragment allant du nucleotide 113 au nucleotide 635 de la phase codante flgl et nommé ici amplicon flgl. [0082] L' amplicon flgl d'une taille de 533 paires de bases a été clone au site EcoRV du vecteur pSKKan, générant le vecteur pSKKan-flgl. Le pSKKan a été obtenu par clonage du gène conférant la résistance à la kanamycine (amplifié par PCR à partir du plas ide pUC4K de Pharmacia avec les amorces kanamont (5' -GGGCATGCGGAAAGCCACGTTGTGTCT-3 ' ) (SEQID

N° 54 and kanaval (5' -GGGGTGACCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3 ' ) (SEQID N° 55) au site Seal du gène bla du pSK-oriT. Le pSK- oriT est un dérivé du pBluescriptSK(-) (Stratagene) décrit dans Tibor et al, 2002 (Infect and Immun, 70:5540-6). L'origine de réplication fl du pBluescript a été exciseéé par restriction Sspl et remplacée par un fragment de 0,76 kb Smal-Sall contenant l'origine de transfert RK2. [0083] La séquence de l' amplicon flgl est la séquence SEQID N° 56. [0084] L' amplicon flgl, encodant un homologue du monomère du P ring du flagelle, anneau localisé dans la membrane externe et faisant partie du corps basai d'une structure flagellaire (numéro de séquence codante dans le génome de B. melitensis 16M : BMEII1084) . Cette séquence codante de 1074 nucléotides encode une protéine prédite de 358 résidus. La souche mutée porte deux copies incomplètes de flgl (SEQID N° 57) .

[0085] La séquence des deux copies incomplètes sont les séquences SEQID N° 58 et SEQID N° 59.

Analyse de la virulence résiduelle en brebis gestantes [0086] 2 groupes de 5 brebis ont été synchronisés et inséminés. Au jour 90 de la gestation un groupe à reçu

1x10 CFU de la souche vaccinale Revl (Ovirev^® de la firme Vétoquinol) par voie conjonctivale dans 100 microlitres. 5 autres animaux ont reçu une dose correspondante d'un mutant flagellaire (Flgl BMEII 1084) de la souche B.melitensis

16M. L'inoculum a été contrôlé et correspond bien à la dose attendue . [0087] Une parturition normale s'est déroulée pour tous les animaux 7 à 8 semaines après cette infection, aucun avortement n'a été constaté. Tous les animaux ont montré une seroconversion et sont restés séropositifs en

ELISA jusqu'à leur euthanasie. [0088] Toutes les tentatives d'isolement de Brucella sur milieu de Farrel ont été infructueuses, que ce soit à partir de la brebis ou de l'agneau. [0089] Bien que ces données soient préliminaires, il est intéressant de constater que le mutant flgl réalisé sur un background sauvage n'a pas induit d'avortement et qu'il n'a pas été possible de détecter d'excrétion bactérienne alors que tous les animaux ont bien été infectés d'après les résultats sérologiques (figure 8) . Références

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Claims

REVENDICATIONS 1. Cellules recombinantes de Brucella comprenant une modification génétique dans la séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire ou une séquence nucleotidique régulatrice de ladite séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire.

2. Cellules de Brucella selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi le groupe constitué par les souches de Brucella meli tensis, B. abortus, B. canis, B. suis, B. ovis, B. neotomae , B. cetaceae et -B. pinnipediae .

3. Cellules de Brucella selon la revendication 1 ou 2 dont la séquence nucleotidique sauvage encodant une protéine flagellaire est choisie parmi le groupe constitué par la séquence d'identification SEQID N°l à la séquence d'identification SEQID N°50.

4. Cellules de Brucella selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la modification génétique consiste en une insertion, une déletion ou une modification d'au moins un nucleotide de la séquence nucleotidique.

5. Composition vaccinale comprenant un véhicule ou un diluant pharmaceutique adéquat et les cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

6. Utilisation de la composition selon la revendication 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention d'infections induites par Brucella chez un mammifère, y compris l'homme.

7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'infection induite par Brucella est choisie parmi le groupe constitué par un avortement chez une femelle gestante ou une orchite chez un mâle une méningite, une endocardite et/ou une arthrite.

8. Procédé de traitement et/ou de prévention d'une infection induite chez un mammifère, y compris l'homme, comprenant l'administration d'une quantité suffisante de la composition pharmaceutique selon la revendication 5 pour prévenir ou traiter les symptômes induits par cette infection.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les symptômes induits par l'infection sont choisi parmi le groupe constitué par un avortement chez une femelle gestante ou une orchite chez un mâle, une méningite, une endocardite et/ou une arthrite.