EP1648221A1 - Obtention de plantes double-haploides par gynogenese chez les mais - Google Patents

Obtention de plantes double-haploides par gynogenese chez les mais

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Publication number
EP1648221A1
EP1648221A1 EP04767597A EP04767597A EP1648221A1 EP 1648221 A1 EP1648221 A1 EP 1648221A1 EP 04767597 A EP04767597 A EP 04767597A EP 04767597 A EP04767597 A EP 04767597A EP 1648221 A1 EP1648221 A1 EP 1648221A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
line
plants
haploids
haploid
gynogenetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04767597A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Bordes
Maurice Pollacsek
Michel Beckert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority to EP04767597A priority Critical patent/EP1648221A1/fr
Publication of EP1648221A1 publication Critical patent/EP1648221A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
    • A01H1/08—Methods for producing changes in chromosome number

Definitions

  • the present invention relates to obtaining double-haploid maize plants by gynogenesis in si tu.
  • Establishing pure lines by repeated inbreeding or inbred crossbreeding is a fundamental practice in breeding and variety creation.
  • One of the major constraints encountered when establishing pure lines resides in the time necessary (generally 8 to 10 generations) to obtain individuals with a high level of homozygosity.
  • the creation of double-haploid plants (DH) makes it possible to envisage a considerable simplification of the practices of selection and variety creation.
  • DH plants which are obtained by double chromosomes from haploid plants, have the distinction of being homozygous for their entire genome. Their use in seed selection makes it possible to considerably reduce the time to obtain new varieties and to quickly fix the best genotypes.
  • Androgenesis is the regeneration of whole plants from male sex cells, the microspores. Under certain conditions of in vitro culture, these microspores are capable of developing and differentiating to give haploid embryos. These embryos result in the production of haploid plants or, after spontaneous or artificial double chromosome (for example by treatment with colchicine), double-haploid plants.
  • Gynogenesis consists of the regeneration of whole plants from ova or unfertilized ovaries. Like androgenesis, it can be carried out by in vitro culture.
  • haploid embryo capable of giving birth to a seedling whose haploid genome is entirely of maternal origin
  • SARKAR and WCC Genetics, vol 54, pp. 453-464, 1966.
  • the development of haploid seedlings has been observed in many species (KIMBER and RILEY, Bot rev, 29, 480-531, 1963; MAGOON and KHANNA, Caryologia, 16, 191-235, 1963).
  • haploid plants was reported as early as 1929 (RANDOLPH, Proc. Natl. Acad. Sci., 18, 222-229, 1932).
  • these gynogenetic haploids are viable and have normal vegetative development.
  • Male plants are generally sterile; however, some of the female flowers are fertile and can be fertilized by pollen from diploid plants.
  • Doubling chromosomes occurs spontaneously only very rarely. However, it can be obtained artificially: the treatment of seedlings with colchicine makes it possible to obtain double- haploids in more than 50% of cases (DEIMLING et al., Vortr. Dez ⁇ chtg. Vol 38, 203-224, 1997). This treatment also makes it possible to restore male fertility in 30 to 60% of cases (BORDES et al., Agronomie, vol 17, pp. 291-297).
  • Gynogenesis in vivo (also called gynogenesis in si tu) has the potential advantage of being simpler to implement than in vitro techniques, and of being less dependent than these on the genotype of the starting material.
  • the very low frequency and the random nature of the spontaneous appearance of haploids prevent the use of this technique in varietal selection. It has been observed that the frequency of induction of gynogenetic haploids in maize was linked to the genetic background of the two plants brought together (CHASE, Agron. J., vol 44, pp. 263-267, 1952), and depended more particularly on the male pollen donor plant.
  • the first inducing line of gynogenetic haploids identified in corn is the “Stock 6” line, for which a rate of induction of gynogenetic haploids of up to 3.2% in self-pollination has been reported ( COE, Am. Nat., 93, 381-382, 1959).
  • the Stock 6 line was used as a basis for the development of new inducing lines, among which we will notably mention the inducing line WS14, for which an induction rate d 1.2 to 5.5 times greater than that of Stock 6 was obtained (LASHHERMES and BECKERT, Theor. Appl. Genêt., 76, 405-410, 1988) and the inducing line FIGH 1, descendant of the line WS14 (BORDES et al., Agronomie, 17, 291-297, 1997).
  • Another problem posed by the implementation of gynogenesis in si tu results in the differentiation of haploid individuals resulting from gynogenetic development and hybrid individuals resulting from normal fertilization and embryonic development processes.
  • PK6 a new inducing line, hereinafter called PK6, which allows the induction of gynogenetic haploids from female plants of very varied genotypes, with an induction rate much higher than that obtained with the inducing lines of prior art.
  • the PK6 line was deposited on 02/19/2003 according to the Budapest Treaty with the National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scottland, AB24 3 RY, Scotland, United Kingdom) under the access number NCIMB 41160.
  • the subject of the present invention is the use of a plant of the PK6 line, or of a derived line, as an inducer of gynogenetic haploids in corn.
  • the subject of the present invention is in particular a process for obtaining corn haploids by pollination of a female parent with the pollen of a parent inducing gynogenetic haploids and selection of the haploids resulting from this pollination, which process is characterized in that the parent inducing gynogenetic haploids belongs to the PK6 line or to a derived line.
  • the term “derived line” from PK6 is understood to mean any line derived from PK6 and having inherited the gynogenetic haploid induction properties from it. This includes in particular lines resulting from the introduction of a trait of interest, (in particular a marker allowing the differentiation of haploid plants and diploid plants) in the PK6 genome.
  • this character of interest can be carried out for example by the conventional techniques of introgression or transgenesis.
  • a line derived from PK6 mention may be made of the line PK6-cherry. This line results from the introduction into the PK6 line of the dominant “R-cherry” allele, the presence of which manifests itself at the seedling stage by a strong red coloration of the leaf joint (at the border of the ligule) of the first and sometimes from the second sheet. The absence of this red coloration makes it possible to distinguish the haploid seedlings.
  • the PK6-cherry line was deposited on 02/19/2003 according to the Budapest Treaty with the National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scottland, AB24 3 RY, Scotland, United Kingdom) under the access number NCIMB 41161.
  • NCIMB National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria
  • the selection of haploids can be carried out by methods known in themselves, for example on the basis of morphological criteria characteristic of haploidy, or on the observation of a recessive character of the female parent (for example liguleless, glossy, etc.).
  • this step of selecting the haploid seedlings can advantageously be carried out by detecting the absence of red coloration of the leaf joint. Sorting can be done visually when the seedling has developed 3 to 4 visible leaves, i.e. from 10 to 20 days after sowing, depending on the season.
  • the present invention also relates to a process for obtaining double haploid plants characterized in that it comprises the cultivation of haploids obtained at the end of the haploidization process according to the invention, and the implementation of a step of chromosomal doubling of these haploids.
  • the technique that can be used to perform the chromosomal doubling of haploids from gynogenesis in if you use a colchicine treatment is carried out by bringing the haploid seedling into contact (generally by soaking) with a 1.5 g / l solution of colchicine.
  • this treatment is carried out when the seedling has reached a stage of development of between 5 and 7 visible leaves.
  • the treated plants are put back in culture until the floral organs mature and one then operates a self-fertilization of these plants.
  • EXAMPLE 2 USE OF THE PK6 LINE AS A INDUCTIVE MALE LINE Pollination and obtaining haploid grains FI hybrid plants of various origins, as well as plants of two synthetic lines of corn are pollinated by inducers of PK6 haploids.
  • the plants used have either a toothed genotype (Table 1a) or a horny genotype (Table Ib). Pollination is carried out in isolation plots or manually. In both cases, it is recommended to castrate the material used as a female parent. This castration allows better fertilization success and avoids any pollution by the surrounding pollen during pollination operations. The grains from this pollination are examined to ensure the integrity of PK6 fertilization.
  • the PK6 line has a genetic system for coloring the aleurone layer of the grain (inherited from the WS14 line).
  • the presence of uncolored grains indicates an undesirable fertilization emanating either from a pollen outside the device, or from a pollen emitted by poorly castrated female plants.
  • the presence of grains of very contrasting coloration (yellow, orange, white ...) distributed in an anarchic manner compared to the blue-black of PK6 also indicates pollution by a foreign pollen.
  • this verification cannot be carried out when the female parent has a coloring inhibitor. This inhibition manifests itself, either by the total absence of blue coloration (total inhibition), or by a gradient of coloration of the grains going from blue to yellow (partial inhibition).
  • haploid seedlings Sowing is carried out from all the grains in 96-cell plates on a vermiculite support, at the rate of one grain per cell; the vermiculite is then covered with potting soil. Germination takes place in a greenhouse or under shelter; seedlings receive frequent watering. Sorting of haploid seedlings takes place after sowing, either on the basis of the expression of a recessive character present in the mother plant (glossy character; table la), or on that of their morphology (table Ib).
  • the selected haploid seedlings are transplanted individually into honeycombed plates with 51 cups on potting soil support.
  • Colchicine treatment is carried out on seedlings selected at the 5 to 6 ligulate leaf stage. The day before the treatment, the plants are not watered. After regrouping of the seedlings, the treatment is carried out by immersion of their base up to half of the sheath of the first leaf, in an aqueous solution of colchicine at 1.5 g / l.
  • the immersion is maintained for 3 hours and at room temperature (20 ° C) (under normal light conditions).
  • the young plants are then transplanted into pots in a peat / potting mix while waiting for the vegetation to take hold.
  • the viable plants are transferred, in winter in a greenhouse in 12-liter pots on a pozzolan + peat substrate or in the ground, and in summer in a plastic tunnel or in the field. They are sprinkled with a nutritious solution.
  • Self-fertilization As soon as the stigmas appear, self-fertilization is carried out which is repeated as long as there is emission of pollen. The repetition of this self-fertilization operation makes it possible to increase the chances of making an antherozoid coincide with a viable oosphere. On average 50% to 80% of plants produce pollen.
  • Percentage offspring (offspring obtained / number of haploid seedlings identified) x 100.
  • the progeny rate obtained from European horny material is on average lower than that obtained from American toothed material.
  • EXAMPLE 3 USE OF THE PK6-CHERRY LINE AS A INDUCTIVE MALE LINE Plants from a population of dentate corn of North American origin with a very large base (popl), and from subpopulations of popl obtained after different selection cycles (pop2 to pop5) (table lia), as well as single and double hybrids composed of elite lines of maize (F1890, 112F, F1899, 122F, F1808, F816) (table Ilb), for the agronomic value, are pollinated by PK6-cherry haploid inducers.
  • the PK6-cherry derivative line has average induction rates much higher than those of PK6. From fairly similar genetic material, the induction rates of haploids obtained from PK6-cherry (table 11a and 11b) are approximately double the rates obtained by PK6 (table 1a).
  • EXAMPLE 4 COMPARISON OF THE INDUCING PROPERTIES OF THE PK6 LINE AND OTHER MALE INDUCING PRIOR ART LINES

Landscapes

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de plantes de la lignée PK6 de maïs, ou d'une lignée dérivée, comme inducteurs d'haploïdes gynogénétiques chez le maïs.

Description

OBTENTION DE PLANTES DOUBLE-HAPLOÏDES PAR GYNOGENESE CHEZ LE MAÏS La présente invention concerne l'obtention de plants double-haploïdes de maïs par gynogenèse in si tu . L'établissement de lignées pures par autofécondations ou croisements consanguins répétés, constitue une pratique fondamentale en sélection et création variétale. L'une des contraintes majeures rencontrées lors de l'établissement de lignées pures réside dans le temps nécessaire (généralement 8 à 10 générations) pour obtenir des individus présentant un haut niveau d' homozygotie . La création de plantes double-haploïdes (DH) permet d' envisager une simplification considérable des pratiques de sélection et de création variétale. Les plantes DH, qui sont obtenues par doublement chromosomique à partir de plantes haploïdes, ont la particularité d'être homozygotes pour l'ensemble de leur génome. Leur utilisation en sélection semencière permet de diminuer considérablement le temps d'obtention de nouvelles variétés et de fixer rapidement les meilleurs génotypes. Elle permet notamment de déceler rapidement la présence éventuelle d'allèles défavorables récessifs . Les méthodes les plus fréquemment utilisées pour obtenir des plantes haploïdes ou double-haploïdes sont basées sur l' androgenèse ou sur la gynogenèse. L' androgenèse consiste en la régénération de plantes entières à partir de cellules sexuelles mâles, les microspores. Dans certaines conditions de culture in vi tro, ces microspores sont capables de se développer et de se différencier pour donner des embryons haploïdes. Ces embryons aboutissent à la production de plantes haploïdes ou, après doublement chromosomique spontané ou artificiel (par exemple par traitement à la colchicine) , de plantes double-haploïdes. La gynogenèse consiste en la régénération de plantes entières à partir d' ovules ou d' ovaires non fécondés. Comme l' androgenèse, elle peut s'effectuer par culture in vi tro . Toutefois, elle peut également intervenir spontanément in vivo, à la suite d'une anomalie du déroulement du processus de fécondation. Il sera brièvement rappelé que chez les angiospermes, il se produit normalement une double fécondation. Le grain de pollen produit deux cellules gamétiques mâles. L'une féconde l'ovule pour former le zygote diploïde qui produira l'embryon ; l'autre fusionne avec le noyau du sac embryonnaire, déjà habituellement diploïde, pour former une cellule triploïde qui produira l' albumen. Dans certains cas, la formation du zygote ne se produit pas, mais des divisions cellulaires de l'ovule sont toutefois initiées, aboutissant à un embryon haploïde capable de donner naissance à une plantule dont le génome haploïde est entièrement d'origine maternelle (SARKAR et COE, Genetics, vol 54, pp. 453-464, 1966). Le développement de plantules haploïdes a été observé chez de nombreuses espèces (KIMBER et RILEY, Bot rev, 29, 480-531, 1963 ; MAGOON et KHANNA, Caryologia, 16, 191-235, 1963). Chez le maïs, l'existence de plants haploïdes a été rapportée dès 1929 (RANDOLPH, Proc . Natl. Acad. Sci., 18, 222-229, 1932). Chez le maïs, ces haploïdes gynogénétiques sont viables et ont un développement végétatif normal. Les plants mâles sont généralement stériles ; cependant, certaines des fleurs femelles sont fertiles et peuvent être fécondées par du pollen de plantes diploïdes. Le doublement chromosomique n' intervient spontanément que très rarement. Toutefois, il peut être obtenu artificiellement : le traitement des plantules par la colchicine permet d' obtenir des plantules double- haploïdes dans plus de 50% des cas (DEIMLING et al., Vortr. Pflanzenzϋchtg. Vol 38, 203-224, 1997) . Ce traitement permet également de restaurer la fertilité mâle dans 30 à 60 % des cas (BORDES et al., Agronomie, vol 17, pp. 291-297) . La gynogenèse in vivo (également dénommée gynogenèse in si tu) présente l'avantage potentiel d'être plus simple à mettre en œuvre que les techniques in vi tro, et d'être moins dépendante que celles-ci du génotype du matériel de départ. Cependant, la très faible fréquence et le caractère aléatoire de l'apparition spontanée d'haploïdes font obstacle à l'utilisation de cette technique en sélection variétale. Il a été observé que la f équence d' induction d'haploïdes gynogenetiques chez le maïs était liée au fond génétique des deux plantes mises en présence (CHASE, Agron. J., vol 44, pp. 263-267, 1952), et dépendait plus particulièrement de la plante mâle donneuse de pollen. Des plantes dont le pollen est capable d'induire la formation d'haploïdes gynogenetiques in situ à une fréquence significativement plus élevée que celle observée dans les populations naturelles de maïs, ont été identifiées. Ces plantes sont dites : « inductrices » d'haploïdes gynogenetiques. La première lignée inductrice d'haploïdes gynogenetiques mise en évidence chez le maïs est la lignée « Stock 6 », pour laquelle un taux d'induction d'haploïdes gynogenetiques pouvant aller jusqu'à 3,2% en auto-pollinisation a été rapporté (COE, Am. Nat . , 93, 381-382, 1959) . Dans le but d' améliorer le taux d' induction d'haploïdes, la lignée Stock 6 a servi de base à l'élaboration de nouvelles lignées inductrices, parmi lesquelles on citera notamment la lignée inductrice WS14, pour laquelle un taux d'induction d'haploïdes de 1,2 à 5,5 fois supérieur à celui de Stock 6 a été obtenu (LASHHERMES et BECKERT, Theor. Appl . Genêt., 76, 405-410, 1988) et la lignée inductrice FIGH 1, descendante de la lignée WS14 (BORDES et al., Agronomie, 17, 291-297, 1997) . Un autre problème posé par la mise en œuvre de la gynogenèse in si tu résulte dans la différenciation des individus haploïdes résultant du développement gynogénétique et des individus hybrides résultant des processus de fécondation et de développement embryonnaire normaux. Il a été proposé d'utiliser dans ce but des marqueurs de coloration du grain. A titre d'exemple, on citera le « Purple Embryo Marker » décrit par CHASE et NANDA (Maize Gen . Coop., News Letter, 39, 59-60, 1965). Ce marqueur dominant se traduit par une coloration violet pourpre des grains. Lorsqu'il est présent dans le génome du mâle inducteur, les grains résultant d'une fécondation normale présentent un embryon et un endosperme colorés ; en revanche, chez les grains résultant du développement gynogénétique, seul l' endosperme est coloré. Un autre système de marquage du grain, décrit par COE et SARKAR, (J. of Heredity, vol 55, pp.231-233, 1964), associe un parent femelle possédant un marqueur de coloration (CC) et un mâle inducteur possédant un allèle inhibiteur de cette coloration (CICI). Chez les grains issus d'une fécondation normale, ni l'embryon ni l' endosperme ne sont colorés ; chez les grains résultant du développement gynogénétique, seul l'embryon est coloré. Il subsiste différents problèmes liés à l'utilisation de ces marqueurs pour l'identification des plants haploïdes. Notamment, l'expression de ces marqueurs est fortement influencée par le génotype du parent femelle, ou même par le processus général de maturation du grain. Cette perturbation de l'expression est susceptible d'entraîner une évaluation incorrecte de la ploïdie des individus isolés. On effectue donc fréquemment une sélection au stade de la plantule en complément de la sélection au stade du grain, ou à la place de celle-ci. Cette sélection peut se faire sur la base de l'observation d'une morphologie caractéristique des plants haploïdes (feuilles plus étroites, plus claires, striées, ports érigés ). Il a également été proposé d'utiliser des marqueurs récessifs présents dans le génome du parent femelle. On citera par exemple le marqueur récessif « liguleless », qui se traduit par une absence de ligules au niveau des feuilles (EMERSON., Nebraska . Agric . Exp. Stn . Annu . Rep . , 1912a, vol 25, pp. 81-88; EMERSON., Am . Breeders ' . Assoc . Annu . Rep . , 1912b, vol 8, pp. 385-399) et le marqueur récessif « glossy », qui se traduit par un aspect brillant de la surface des feuilles des jeunes plants, au lieu de la glaucescence bleutée observée chez les plants normaux (BORDES et al., Agronomie, 1997, vol 17, pp. 291-297). Lorsque ces marqueurs sont présents dans le génome du parent femelle, ils permettent de différencier les plantules haploïdes présentant le marqueur récessif, par exemple le caractère « glossy », des plantules hybrides qui ne le présentent pas. Toutefois, l'utilisation de ce type de marqueurs récessifs peut nécessiter, préalablement à l'induction de la gynogenèse, l'introduction du marqueur récessif dans le génome de la lignée destinée à être utilisée comme parent femelle, si celle-ci ne le possède pas déjà. Les Inventeurs ont développé une nouvelle lignée inductrice, dénommée ci-après PK6, qui permet l'induction d'haploïdes gynogenetiques à partir de plantes femelles de génotypes très variés, avec un taux d'induction très supérieur à celui obtenu avec les lignées inductrices de l'art antérieur. La lignée PK6 a été déposée le 19/02/2003 selon le traité de Budapest auprès de la National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scottland, AB24 3 RY, Scotland, Royaume-Uni) sous le numéro d'accès NCIMB 41160. La présente invention a pour objet l'utilisation d'une plante de la lignée PK6, ou d'une lignée dérivée, en tant qu'inducteur d'haploïdes gynogenetiques chez le maïs. La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'obtention d'haploïdes de maïs par pollinisation d'un parent femelle avec le pollen d'un parent inducteur d'haploïdes gynogenetiques et sélection des haploïdes issus de cette pollinisation, lequel procédé est caractérisé en ce que le parent inducteur d'haploïdes gynogenetiques appartient à la lignée PK6 ou à une lignée dérivée. On entend par « lignée dérivée » de PK6, toute lignée issue de PK6 et ayant hérité les propriétés d'induction d'haploïdes gynogenetiques de celle-ci. Ceci inclut en particulier des lignées résultant de l'introduction d'un caractère d'intérêt, (notamment un marqueur permettant la différenciation des plants haploïdes et des plants diploïdes) dans le génome de PK6. L'introduction de ce caractère d'intérêt peut s'effectuer par exemple par les techniques classiques d' introgression ou de transgenèse. A titre d'exemple de lignée dérivée de PK6, on citera la lignée PK6-cherry. Cette lignée résulte de l'introduction dans la lignée PK6 de l'allèle dominant « R-cherry », dont la présence se manifeste au stade plantule par une forte coloration rouge du joint foliaire (à la limite de la ligule) de la première et parfois de la seconde feuille. L'absence de cette coloration rouge permet de distinguer les plantules haploïdes. La lignée PK6-cherry a été déposée le 19/02/2003 selon le traité de Budapest auprès de la National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scottland, AB24 3 RY, Scotland, Royaume-Uni) sous le numéro d'accès NCIMB 41161. Dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention, la sélection des haploïdes peut s'effectuer par des méthodes connues en elles-mêmes, par exemple sur la base de critères morphologiques caractéristiques de l'haploïdie, ou sur l'observation d'un caractère récessif du parent femelle (par exemple liguleless, glossy, etc.). Lorsque la plante inductrice appartient à la lignée PK6-cherry, cette étape de sélection des plantules haploïdes pourra avantageusement être mise en œuvre en détectant l'absence de coloration rouge du joint foliaire. Le tri peut se faire visuellement lorsque la plantule a développé 3 à 4 feuilles visibles, soit à partir de 10 à 20 jours après le semis, selon la saison. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de plantes double haploïdes caractérisé en ce qu'il comprend la culture des haploïdes obtenus à l'issue du procédé d' haploïdisation conforme à l'invention, et la mise en œuvre d'une étape de doublement chromosomique de ces haploïdes. La technique utilisable pour effectuer le doublement chromosomique d'haploïdes issus de la gynogenèse in si tu utilise un traitement à la colchicine. Ce traitement est effectué par mise en contact de la plantule haploïde (généralement par trempage) avec une solution de colchicine à 1,5 g/1. Avantageusement, ce traitement est effectué lorsque la plantule a atteint un stade de développement compris entre 5 et 7 feuilles visibles . A l'issue du traitement de doublement chromosomique, les plantes traitées sont remises en culture jusqu'à maturation des organes floraux et l'on opère alors une autofécondation de ces plantes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les caractéristiques des lignées PK6 et PK6-cherry et leur utilisation selon l'invention, pour l'obtention de plantes double-haploïdes. EXEMPLE 1: CARACTERISTIQUES DES LIGNEES PK6 ET PK6-CHERRY Description détaillée de PK6
EXEMPLE 2 : UTILISATION DE LA LIGNEE PK6 COMME LIGNEE MALE INDUCTRICE Pollinisation et obtention des grains haploïdes Des plants hybrides FI d'origines variées, ainsi que des plants de deux lignées synthétiques de maïs sont pollinisés par des inducteurs d'haploïdes PK6. Les plants utilisés présentent, soit un génotype denté (tableau la) , soit un génotype corné (tableau Ib) . La pollinisation est effectuée en parcelle d' isolement ou manuellement. Dans les deux cas, il est recommandé d'effectuer une castration du matériel utilisé comme parent femelle. Cette castration permet une meilleure réussite des fécondations et évite toute pollution par le pollen environnant lors des opérations de pollinisation. Les grains issus de cette pollinisation sont examinés afin de s'assurer de l'intégrité de la fécondation par PK6. En effet, la lignée PK6 possède un système génétique de coloration de la couche à aleurone du grain (hérité de la lignée WS14). La présence de grains non colorés indique une fécondation indésirable émanant, soit d'un pollen extérieur au dispositif, soit d'un pollen émis par des plantes femelles mal castrées. La présence de grains de coloration très contrastée (jaunes, orangés, blancs ...) distribués de façon anarchique par rapport au bleu-noir de PK6 indique également une pollution par un pollen étranger. Toutefois, cette vérification ne peut pas être réalisée lorsque le parent femelle possède un inhibiteur de coloration. Cette inhibition se manifeste, soit par l'absence totale de coloration bleue (inhibition totale), soit par un gradient de coloration des grains allant du bleu au jaune (inhibition partielle) . Obtention des plantules haploïdes Des semis sont effectués à partir de la totalité des grains dans des plaquettes à 96 alvéoles sur un support de vermiculite, à raison d'un grain par alvéole ; la vermiculite est ensuite recouverte de terreau. La germination s'effectue en serre ou sous abri ; les semis reçoivent des arrosages fréquents. Le tri des plantules haploïdes s'effectue après le semis, soit sur la base de l'expression d'un caractère récessif présent chez la plante mère (caractère glossy ; tableau la) , soit sur celle de leur morphologie (tableau Ib) . Les résultats observés sont résumés dans les Tableaux la et Ib ci-après : Le pourcentage d' induction est calculé selon la formule suivante : Pourcentage d'induction = (nombre d'haploïdes identifiés/nombre de grains germes) * 100 Doublement chromosomique et culture des plantes traitées Les plantules haploïdes sélectionnées sont repiquées individuellement dans des plaques alvéolées à 51 godets sur support terreau. Le traitement par la colchicine s'effectue sur les plantules sélectionnées au stade 5 à 6 feuilles ligulées. Le jour précédent le traitement, les plantes ne sont pas arrosées. Après regroupement des plantules, le traitement s'effectue par immersion de leur base jusqu'à la moitié de la gaine de la première feuille, dans une solution aqueuse de colchicine à l,5g/l. L'immersion est maintenue durant 3 heures et à température ambiante (20 °C) (en condition de luminosité normale) . Les jeunes plantes sont ensuite repiquées en pots dans un mélange tourbe/terreau en attente de prise de végétation. Les plantes viables sont transférées, l'hiver sous serre en pots de 12 litres sur substrat de pouzzolane + tourbe ou en pleine terre, et l'été sous tunnel plastique ou au champ. Elles sont arrosées avec une solution nutritive. Autofécondation Dès l'apparition des stigmates, on réalise une autofécondation que l'on répète tant qu'il y a émission de pollen. La répétition de cette opération d' autofécondation permet d'augmenter les chances de faire coïncider un anthérozoïde et une oosphère viable. En moyenne 50% à 80% des plantes produisent du pollen. La présence du pollen constitue un indicateur d'un doublement chromosomique réussi au niveau de la panicule (il n'existe pas d'indicateur au niveau des ovules) . En l'absence de stress importants, il y a production de grains dans 20 à 60 % des cas alors qu'une plante haploïde émet presque systématiquement des soies. Pour éviter l'attaque des pucerons et la pourriture des grains, il est souhaitable d'ouvrir les spathes trois semaines après la dernière autofécondation. Le nombre moyen de grains par épi est relativement faible (3 à 10) et peut varier de 1 à 50. Les résultats sont résumés dans les Tableaux la et Ib. La descendance obtenue représente le nombre de plantes produisant un épi. Le pourcentage de descendance est calculé selon la formule suivante :
Pourcentage descendance = (descendance obtenue/ nombre de plantules haploïdes identifiées) x 100.
Tableau la Génotypes "Dentés" : identification des haploïdes avec le caractère glossy
Matériel génétique Plantules Plantes Pourcentage Descendance Pourcentage pollinisé haploïdes germées d'induction obtenue descendance par la lignée PK 6 identifiées
ALDGT13 x F1819 1152 77,00 6,7 19 24,7 F1819 x F816 288 30,00 10,4 3 10,0
ALD6T13 x F1891 1632 85,00 5,2 8 9,4 F1819 x F1891 1536 32,00 2, 1 13 40,6 F1891 x F1853 480 20,00 4,2 8 40,0 F1891 x F1854 1478 81,00 5,5 9 11 ,1 SAF6 x F1800 384 20,00 5,2 2 10,0 SAF6 x F1819 672 66,00 9,8 5 7,6 SAF8 x F1819 3072 164,00 5,3 50 30,5 SAF17 x F1819 2880 200,00 6,9 12 6,0 Pop Dentée 1 672 38,00 5,7 3 7,9 Pop Dentée 2 2304 117,00 5, 1 9 7,7 LPOl x F1819 2880 64,00 2,2 15 23,4 LPOl x F1891 768 42,00 5,5 2 4,8 Moyenne 1442,7 74,0 5,7 11,3 16,7 Tableau Ib
Malgré un pourcentage identique de plantes produisant du pollen, le taux de descendance obtenu à partir de matériel corné européen est en moyenne inférieur à celui obtenu à partir du matériel denté américain .
EXEMPLE 3: UTILISATION DE LA LIGNEE PK6-CHERRY COMME LIGNEE MALE INDUCTRICE Des plants issus d'une population de maïs dentée d' origine nord américaine à base très large (popl) , et de sous-populations de popl obtenues après différents cycles de sélection (pop2 à pop5) (tableau lia), ainsi que d'hybrides simples et doubles composés de lignées élites de maïs (F1890, 112F, F1899, 122F, F1808, F816) (tableau Ilb) , pour la valeur agronomique, sont pollinisés par des inducteurs d'haploïdes PK6-cherry. La pollinisation et la récolte des grains, ainsi qu'un premier tri des haploïdes potentiels sur la base de la coloration du grain sont effectués comme indiqué dans l'exemple 2. Des semis sont réalisés à partir de la totalité des grains comme indiqué dans 1' exemple 2. Le tri des plantules s'effectue dès le stade 3 à 4 feuilles visibles. Les plantules diploïdes présentent une nette coloration rouge du joint foliaire au niveau de la première feuille. Cette coloration du joint foliaire est également visible parfois au niveau de la seconde feuille. En revanche, les plantules haploïdes possèdent un joint foliaire vert. Les résultats sont résumés dans les Tableaux lia et Ilb. Le pourcentage d' induction est déterminé comme suit : Pourcentage d'induction = (nombre d'haploïdes identifiés/nombre de grains germes) x 100. Tableau lia
Tableau Ilb
La lignée dérivée PK6-cherry présente des taux d'induction moyens très supérieurs à ceux de PK6. A partir de matériel génétique assez similaire, les taux d'induction d'haploïdes obtenus à partir de PK6-cherry (tableau lia et Ilb) sont d'environ le double des taux obtenus par PK6 (tableau la) .
EXEMPLE 4: COMPARAISON DES PROPRIETES INDUCTRICES DE LA LIGNEE PK6 ET D'AUTRES LIGNEES MALES INDUCTRICES DE L'ART ANTERIEUR Des plants femelles de différentes lignées de maïs sont pollinisés par des mâles inducteurs d'haploïdes gynogenetiques des lignées Stock6, S14, FIGH1 ou PK6. La pollinisation, la récolte des grains, et la sélection des plants haploïdes s'effectuent comme décrit dans l'exemple 2. Le pourcentage d' induction est calculé selon la formule suivante : Pourcentage d'induction = (nombre d'haploïdes identifiés/nombre de grains semés) * 100 Les résultats sont illustrés dans le Tableau
II I . Tableau III
Ces résultats montrent que la fréquence moyenne d'induction d'haploïdes gynogenetiques obtenue avec la lignée PK 6 est plus de 2 fois supérieure à celle obtenue avec la lignée inductrice la plus efficace décrite dans l'art antérieur, à savoir WS14.

Claims

REVENDICATIONS 1) Procédé d'obtention d'haploïdes de maïs, comprenant une étape de pollinisation du matériel femelle par une plante d'une lignée inductrice d'haploïdes gynogenetiques et une étape de sélection des haploïdes induits par cette pollinisation, caractérisé en ce que la lignée inductrice d'haploïdes gynogenetiques correspond à la lignée PK6, déposée le 19/02/2003 auprès de la NCIMB sous le numéro d'accès NCIMB 41160, ou à une lignée dérivée. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite lignée dérivée est la lignée PK6-cherry déposée le 19/02/2003 auprès de la NCIMB sous le numéro d'accès NCIMB 41161. 3) Procédé d'obtention de double-haploïdes de maïs, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de doublement chromosomique de plantes haploïdes obtenues par le procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'étape de doublement chromosomique comprend un traitement à la colchicine. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d' autofecondation des plantes ayant subi l'étape de doublement chromosomique. 6) Utilisation de la lignée PK6 ou d'une lignée dérivée en tant que lignée inductrice d'haploïdes gynogenetiques chez le maïs. 7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite lignée dérivée est la lignée PK6-cherry.
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