EP1616185A2 - Procede de criblage de conditions operatoires d une reaction chimique de couplage et trousses pour la mise en oeuvre de ce procede - Google Patents

Procede de criblage de conditions operatoires d une reaction chimique de couplage et trousses pour la mise en oeuvre de ce procede

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Publication number
EP1616185A2
EP1616185A2 EP04758930A EP04758930A EP1616185A2 EP 1616185 A2 EP1616185 A2 EP 1616185A2 EP 04758930 A EP04758930 A EP 04758930A EP 04758930 A EP04758930 A EP 04758930A EP 1616185 A2 EP1616185 A2 EP 1616185A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibody
compound
reaction
coupling
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04758930A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric TARAN
Christophe Creminon
Pierre-Yves Renard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat à l'Énergie Atomique et Aux Énergies Alternatives
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1616185A2 publication Critical patent/EP1616185A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the present invention relates to a process for screening the operating conditions of a chemical coupling reaction, as well as to kits suitable for allowing the implementation of this process.
  • the method can be used to screen substances, such as catalysts or solvents, which one wishes to know if they are likely to be useful in a particular coupling reaction, but it can also be used to screen levels, for example temperature or pressure, concentrations, stoichiometric ratios or times such as the reaction time or the duration of stirring of the reaction medium, the influence of which on the yield of a coupling reaction is desired.
  • the method according to the invention is therefore likely to find numerous applications in the field of research, both fundamental and applied. Thus, for example, it can be used in fundamental studies aimed at a better understanding of the mechanisms of homogeneous or heterogeneous catalysis, whether it be chemical or biological.
  • it can be used to screen a library of mutated enzymes in order to improve the catalytic performance of a "wild" enzyme, or to screen biological media of known or unknown composition in order to identify the existence of a particular catalytic activity in these media.
  • the first compound is an aryl halide which is attached to a crosslinked polystyrene resin (Wang resin), while the second compound is an acrylate labeled with coumarin.
  • Wang resin crosslinked polystyrene resin
  • This latter type of process has two major drawbacks.
  • the catalysis is carried out in a heterogeneous medium.
  • a catalyst which exhibits a high catalytic activity in a heterogeneous medium can perfectly prove to be ineffective in a homogeneous medium.
  • the assessment of the catalysis is essentially qualitative, insofar as it is difficult to calculate the yield of the coupling reaction since this calculation would require knowing the grafting rate of the first compound on the solid support.
  • Yet another type of process is based on the fact that in the presence of an effective catalyst, the release of heat from a reaction takes place more quickly than in the presence of an ineffective catalyst.
  • it is possible to assess the efficiency of catalysts by measuring the temperature variation of the reaction media, either by calorimetry or by thermography by means of ultra-sensitive infrared cameras fixed above said reaction media.
  • An example of implementation of this type of process is illustrated in the publication by Blackmond et al. (Organic Process Research & Development, 1999, 3_ (4), 275-280, [5]) for the screening of catalysts useful in the Heck reaction.
  • the screening methods by thermal analysis have the defect of requiring heavy and expensive equipment. Furthermore, they do not allow a calculation of the reaction yield. Finally, they are not applicable to reactions which take place slowly and which, consequently, give off quantities of heat which are not detectable or sufficiently significant.
  • the present invention responds precisely to this need by providing a process for screening the operating conditions of a coupling reaction of at least two functional groups, which comprises the following steps: i) reacting together at least two compounds:
  • the coupling reaction the operating conditions of which are to be screened and which involves at least two functional groups, in this case Gi and G 2 , is carried out using as reagents, at at least two compounds which each have, at one end, one of these functional groups and, at the other end, the rest of a molecule, respectively Mi and M 2 , for which there is a specific antibody, respectively ACi and AC 2 , or, in the case of the second compound, a group capable of forming one or more covalent bonds with the antibody ACi specific for the molecule Mi in the presence of a coupling agent.
  • the concentration of the reaction medium in compound Z produced by the coupling reaction can / 092729
  • telomere binding molecule telomere binding molecule
  • Gi and G 2 correspond to the two functional groups which are at least engaged in the coupling reaction whose operating conditions are to be screened and are therefore chosen according to this reaction.
  • Coupling reactions involving two functional groups and for which the method according to the invention can be used are in particular the following intermolecular coupling reactions:
  • R-COOH or a carboxylic acid derivative such as, for example, an acid halide (R-CO-Hal), and an alcohol (R'-OH) to obtain an ester group (R-C0 2 R ');
  • Aldolization reactions such as those which consist in coupling two aldehydes (R-CHO) or two ketones (R-CO-R '), or in coupling an aldehyde and a ketone to obtain an aldol or a ketol, and their variants such as the nitro-aldolization reaction in which an aldehyde is coupled to a nitro compound (R ' ⁇ CH 2 -N0 2 ) to obtain a nitro-alcohol (R-CH (OH) -CH (N0 2 ) - R ');
  • Stille reaction which consists in coupling an organostannic compound (for example, Ar-SnBu 3 ) and an organic halide (for example, Ar'-Br), and its variants;
  • organostannic compound for example, Ar-SnBu 3
  • organic halide for example, Ar'-Br
  • Coupling reactions involving three functional groups are in particular the Mannich reaction which consists in coupling a compound having an active hydrogen with a non-enolizable aldehyde and a primary or secondary amine to obtain an aminomethylated compound, the Hantzsch reaction which consists in coupling a amine with an aldehyde and an oc-bromo ketone to obtain a pyrrole, and the reaction of Bossio et al.
  • Ei represents the rest of a molecule Mi for which there is a first specific antibody ACi
  • E 2 can represent the rest of a molecule M 2 for which has a second specific antibody AC2.
  • the molecules Mi and M are preferably haptens, that is to say small molecules which, after grafting on a vector such as a protein (bovine serum albumin, ⁇ -immunoglobulin, .. .) or a polysaccharide, are capable of inducing in animals the production of antibodies specifically directed against them.
  • a protein bovine serum albumin, ⁇ -immunoglobulin, .. .
  • a polysaccharide are capable of inducing in animals the production of antibodies specifically directed against them.
  • haptens can in particular be hydrocarbons such as naphthalene, anthracene, phenanthrene, bicyclo [2.2.2] octane, bicyclo- [2.2.2] heptane, 2, 2-dimethyl-3-methyl-4, 4-dimethylpentane, adamantane, perhydrophenalene and racene perhydroant, substituted by a reactive function, preferably carboxylic acid, ine or thiol, suitable for allowing, on the one hand, to graft them onto the vector and, on the other hand, to link them to the functional groups Gi and G 2 or to the spacer groups in the case where Xi and X 2 represent such groups.
  • hydrocarbons such as naphthalene, anthracene, phenanthrene, bicyclo [2.2.2] octane, bicyclo- [2.2.2] heptane, 2, 2-dimethyl-3-methyl-4, 4-dimethylpentane,
  • these hydrocarbons have the advantage of being relatively inert chemically.
  • these haptens can also be molecules other than hydrocarbons, in which case if, in the compounds E 1 -X 1 -G 1 and E 2 -X 2 --G 2 , the residues of these molecules contain one or more functional groups free capable of reacting to the operating conditions under which the coupling reaction is carried out, this or these functional groups should be protected by a suitably chosen protective group before carrying out the coupling reaction, that is to say prior to step i) of the process, then deprotected between steps i) and ii).
  • Ei in the compound Ei-Xi-Gi or E 2 in the compound E2-X2-G2 does it correspond to formula (III) below:
  • R 1 represents a hydrogen atom or a group protecting a amino function such as, for example, a tert-butyloxycarboxyl group (BOC) or a benzyl group.
  • Ei in the compound E 1 -X1-G 1 or E 2 in the compound E 2 -X 2 -G 2 corresponds to formula (IV) below:
  • R 2 represents a hydrogen atom or a group protecting an alcohol function such as, for example, a silyl group of the dimethyl tert-butylsilyl type, dihydropyran or also a benzyl, allyl or acetal group.
  • E 2 may not represent the remainder of a molecule M2, but a group capable of forming at least one covalent bond with the antibody ACi in the presence of a coupling agent, in which case this group is advantageously chosen from amine, carboxylic acid, aldehyde, thiol, phenol, alkenyl, azide groups and photoactivatable groups such as, for example, benzophenone and arylazide groups.
  • E2 is an amino or thiol group.
  • Ei and E 2 can be linked to the functional groups Gi and G 2 , either directly or via spacer groups.
  • These spacer groups which have the sole function of forming a bridge between, on the one hand, Ei and the functional group Gi and, on the other hand, between E 2 and the functional group G 2 , are either groups devoid of any functional group such as saturated hydrocarbon groups of the ethylene (- (CH 2 ) 2 -), propylene (- (CH 2 ) type 3 -), butylene (- (CH 2 ) 4 ⁇ ) or the like, either groups comprising one or more functional groups incapable of reacting to the operating conditions under which the coupling reaction is carried out, or even groups comprising one or more groups which are protected, prior to carrying out the coupling reaction, by an appropriate protective group.
  • said at least one immunological assay for compound Z is preferably a solid phase assay for reasons of simplicity of implementation.
  • step ii) comprises the following steps: ai) bringing the reaction medium obtained at reaction time t into contact with a solid phase on which the antibody ACi is immobilized , to obtain the binding of compound Z on this solid phase by immunological bonding between this antibody and the residue Ei of this compound; bi) bringing the solid phase into contact with a conjugate comprising the antibody AC2 coupled to a marker, in order to obtain the binding of this conjugate on this solid phase by immunological bonding between this antibody and the residue E 2 of compound Z attached to said solid phase; ci) measuring the amount of conjugate attached to the solid phase using the marker coupled to the antibody AC 2 ; and di) determining over a calibration range the concentration of compound Z of the reaction medium at said time
  • This assay therefore uses the two antibodies ACi and AC 2 , the antibody ACi being immobilized on the solid phase and the antibody AC2 being coupled to a marker.
  • step ii) comprises the steps following: a2) bringing the reaction medium obtained at reaction time t into contact with a solid phase on which the antibody ACi is immobilized, in order to obtain the fixing of compound Z on this solid phase by immunological bonding between this antibody and the remainder Ei of this compound; b 2 ) reacting a coupling agent with the antibody ACi immobilized on the solid phase and the group E2 of compound Z fixed on this solid phase, to obtain the formation of one or more covalent bonds between this antibody and this group; c 2 ) denaturing the immunological bond existing between the ACi antibody im
  • This assay only uses the ACi antibody but in two different forms: a first form in which it is immobilized on the solid phase and a second form in which it is coupled to a marker.
  • the coupling agent that is used in step b 2 ) can be a chemical reagent, in which case it should be bifunctional, that is to say that it comprises a first functional group capable of react with the E 2 group of the compound E 2 -X 2 -G 2 , and a second functional group, identical or different from the first, capable of reacting with the antibody ACi.
  • these functional groups may be a homo-bifunctional reagent such as glutaraldehyde, difluoro-dinitrobenzene, bis (maleimido) hexane or disuccinimidyl suberate, or a hetero reagent bifunctional such as N-succinimidyl-3-3- (2-pyridyl-dithio) propionate or succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate.
  • glutaraldehyde difluoro-dinitrobenzene
  • bis (maleimido) hexane or disuccinimidyl suberate or a hetero reagent bifunctional such as N-succinimidyl-3-3- (2-pyridyl-dithio) propionate or succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate.
  • glutaraldehyde or disuccinimidyl suberate are used.
  • the coupling agent can be irradiation, for example ultraviolet, in the case where E 2 represents a photoactivatable group.
  • step c 2 the denaturation of the immunological bond existing between the antibody ACi and the remainder Ei of compound Z can be carried out in conventional manner using an appropriate reagent, or alternatively under the action of ultrasound. or heat.
  • This reagent can be chosen from acids such as HCl, bases such as NaOH, organic solvents such as, for example, alcohols of the methanol type, surfactants and mineral salts.
  • acids such as HCl
  • bases such as NaOH
  • organic solvents such as, for example, alcohols of the methanol type
  • surfactants and mineral salts can be chosen from acids such as HCl, bases such as NaOH, organic solvents such as, for example, alcohols of the methanol type, surfactants and mineral salts.
  • the ACi antibody and, where appropriate, the AC2 antibody can be polyclonal or monoclonal antibodies, even if, in general, it is preferred to use monoclonal antibodies because of their greater specificity;
  • the immobilization of the antibody ACi on the solid phase can be a passive or active immobilization; thus, this immobilization can be obtained by simple adsorption of said antibody on the surface of the solid phase, by covalent bond, by means of binding molecules such as the avidin-biotin system, or also by means of a polyhistidine tag.
  • the solid phase can be any of the solid phases conventionally used for immunological assays such as the wall of a tube or of a well of a microtitration plate, a membrane made of a plastic material such as polystyrene or nitrocellulose, glass beads, magnetic beads and, in general, any surface on which it is possible to fix, passively or actively, an antibody; and
  • the marker can be an isotope like iodine 125, chromium 51 or tritium, an enzyme like horseradish peroxidase, phosphatase alkaline, acetylcholine esterase or glucose oxidase, a luminescent marker such as pyrogallol, luminol or isoluminol, a fluorescent marker such as fluoroscéine, fluorescein isothiocyanate, rhodamine or cyanine, or a substance capable of react with avidin or streptavidin such as biotin and its structural analogs; in the latter case, avidin or streptavidin is itself labeled, for example by an enzyme or a fluorochrome.
  • an enzyme like horseradish peroxidase, phosphatase alkaline, acetylcholine esterase or glucose oxidase
  • a luminescent marker such as pyrogallol, luminol or isoluminol
  • the ACi antibody and, where appropriate, the AC 2 antibody are monoclonal antibodies;
  • the solid phase is the wall of a well of a microtiter plate;
  • the immobilization of the antibody ACi is carried out by passive adsorption of this antibody on the surface of this phase and the marker is an enzyme, in particular acetylcholine esterase, due to its "turn-over" (16,000 molecules of substrate hydrolyzed per second and per site) which gives the conjugates which contain it a high specific activity.
  • the process advantageously comprises an operation for diluting the reaction medium between steps i) and ii).
  • the effects of the candidate operating condition (s) on the coupling reaction are preferably evaluated in step iii) by determining the yield of this reaction from the concentration of compound Z in the reaction medium as determined. in step ii).
  • This yield can, for example, be calculated by applying the following formula:
  • the coupling reaction can consist in coupling two or more of two functional groups, the number of functional groups involved in this reaction being preferably equal to 2, 3 or 4.
  • step i) the compounds of formulas E1-X1-G1 and E 2 -X 2 -G 2 are reacted together to obtain the formation in the reaction medium of a compound Z which corresponds to the formula E1- X1-G1-G2-X2-E2 in which Xi, X 2 , Ei and E 2 have the same meaning as above and G1-G2 represents the group of atoms resulting from the coupling between said functional groups Gi and G2; while
  • step ii) the concentration of compound Z of the reaction medium is determined by a single immunoassay, which is preferably a solid phase assay of the "sandwich” type or of the "SPIE-IA” type as previously described.
  • step i) the compounds of formulas E1-X 1 -G 1 and E 2 -X 2 -G 2 are reacted with a third compound of formula E 3 -X 3 -G 3 in which X 3 represents a covalent bond or a third spacer group, identical or different from Xi and / or X 2 , while E 3 represents either the remainder of a third molecule M 3 different from Mi and M 2 and for which we have d a third specific AC 3 antibody, ie a group capable of forming a covalent bond with the ACi antibody in the presence of a coupling agent provided, however, that E 2 does not already represent such a group, in order to obtain the formation in the reaction medium of a compound Z corresponding to one of the formulas below:
  • step ii) the concentration of compound Z of the reaction medium is determined by two different immunoassays.
  • the first and second markers may be identical in the case where the two assays are carried out in parallel, but must be different in the case where they are carried out one after the other.
  • the first assay can be an assay of the "SPIE-IA" type which is carried out using the antibody ACi as previously described, in which case the second assay is an assay of the "sandwich” type which is carried out using the antibody AC2 or the antibody AC 3 coupled to a marker depending on whether, in the compounds E2-X2-G2 and E 3 -X 3 -G 3 , it is E 2 or E 3 which represents the suitable group to form one or more covalent bonds with the antibody ACi during the “SPIE-IA” assay. In all cases, the formation of the compound
  • step i) the compounds of formula E1-X1-G1 and E2-X2-G2 are reacted with a third compound of formula E 3 -X 3 -G 3 as defined above and a fourth compound of formula E4-X4-G4 in which X represents a covalent bond or a fourth spacer group, identical or different from Xi, X 2 and / or X 3 , while E4 represents either the remainder of a third molecule M 4 different from Mi, of M 2 and M 3 and for which there is a fourth specific AC 4 antibody, ie a group capable of forming a bond covalent with the antibody ACi in the presence of a coupling agent on the condition, however, that E 2 and E 3 do not already represent such a group, in order to obtain the formation in the reaction medium of a compound Z corresponding to one the following formulas:
  • step ii) the concentration of compound Z in the reaction medium is determined by three different immunoassays.
  • these assays can be carried out in parallel or one after the other and are preferably all three carried out in solid phase. It can be three dosages of the “sandwich” type or a dosage of the “SPIE-IA” type followed by two dosages of the “sandwich” type, the formation of compound Z in the reaction medium being, here again, guaranteed. by the agreement of the results obtained.
  • the candidate operating conditions are preferably chosen from the group consisting of solvents, catalysts, temperature levels, pressure levels, the use of ultrasound, concentrations
  • the method according to the invention can also be used to screen operating conditions of a single type such as, for example, catalysts or temperature levels or pressure levels, only to screen combinations of different types of operating conditions such as solvent / catalyst, solvent / catalyst / reaction time, temperature / pressure, catalyst / temperature / pressure, or the like.
  • the term "catalyst” means any agent which, by its mere presence within the reaction medium, is capable of accelerating the kinetics of a reaction.
  • This catalyst can also be a chemical catalyst such as, for example, an organic compound, an inorganic base, a metal, a metal salt, a metal oxide or hydride, an organometallic compound, a metal-ligand complex, a halide, or alternatively a combination of these, ..., that a biological catalyst, the latter being able to appear in very diverse forms, and in particular in the form of an organ, a tissue, a cell, a cell fraction, a cell organelle, an enzyme extract, a molecular complex or even a single molecule, for example an isolated and purified enzyme.
  • the method according to the invention has many advantages. Indeed: - it allows, as soon as there is at least one molecule capable of being grafted onto a functional group, either directly or via a spacer group, and at least one antibody capable of specifically recognizing and binding this molecule, of measuring the compound resulting from the coupling of two functional groups and this, whatever these; therefore, it suffices to have a few graftable molecules and a few antibodies specific for these molecules to be able to screen the operating conditions of very many coupling reactions by the method according to the invention;
  • the method according to the invention is therefore particularly well suited to carrying out "high throughput" screens.
  • the subject of the invention is also a kit or "kit” for the implementation of a method for screening the operating conditions of a coupling reaction of at least two functional groups, which comprises appropriate amounts:
  • a marker development reagent for example a substrate if the marker is an enzyme
  • the subject of the invention is also a kit or "kit” for the implementation of a process for screening the operating conditions of a coupling reaction of at least two functional groups, which comprises appropriate amounts:
  • this antibody being said antibody specific for the Mi molecule
  • the invention further relates to the use of a screening method or a kit as defined above for the screening, in particular at "high throughput", of catalysts useful in a coupling reaction between two functional groups.
  • the invention also comprises other provisions which Will emerge from the additional description which follows, which relates to examples of methods of implementing the method according to the invention which have made it possible to validate both its feasibility and its advantage for screening at "high speed" operating conditions.
  • FIG. 1 represents, in a schematic form, the different stages of a first mode of implementation of the screening method according to the invention.
  • FIG. 2 shows the results, in terms of reaction yields, expressed in%, of a screening of operating conditions carried out in accordance with the first embodiment of the method according to the invention illustrated in FIG. 1.
  • FIG. 3 represents, in a schematic form, the different stages of a second mode of implementation of the method according to the invention.
  • FIG. 4 shows the results, in terms of reaction yields, expressed in%, of a screening of operating conditions carried out in accordance with the second embodiment of the method according to the invention illustrated in FIG. 3.
  • the present example illustrates a first mode of implementation of the method according to the invention in which:
  • the screening relates to three types of operating conditions taken in combination, namely the type of solvent, the type of catalyst and the reaction time; and - the concentration of compound Z of the reaction media is determined by an ELISA assay in solid phase of the "sandwich" type.
  • Gi and E2-X 2 - 2 is carried out using: - two candidate solvents: tetra-ydro-furan (THF) and methylene chloride (CH2CI 2 );
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • KF triethylamine
  • TAA triethylamine
  • PYR pyridine
  • DIA di-isopropylamine
  • DVBCO diazabicyclo octane
  • DIEA diisopropylethylamine
  • DBU diazabicyclo undecene
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • NaOMe sodium methoxide
  • NaOH soda
  • K 2 C0 3 potassium carbonate
  • a conjugate comprising a monoclonal antibody directed against homovanillic acid (antibody H6-92; Kd: 10 "7 M), coupled to acetylcholine esterase (AChE), this conjugate being prepared and stored as described by Taran et al. in Clin Chem., 1997, 43 (2), 363-368 [8]; and
  • the development reagent which comprises a mixture of 7.5.10 "4 M acetylthiocholine iodide and 5.5 'dithiobis- (2-nitro) benzoic acid (Ellman's reagent) 2.5.10 " 4 M in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4), to measure the amount of H6-92 / AChE antibody conjugate attached to the solid phase.
  • the adsorption of the His-31 antibody on the surface of the walls of the wells of the microtitration plates was obtained by depositing 100 ⁇ l of a solution of this antibody at 5 ⁇ l / ml in 0.05 M phosphate buffer, ( pH 7.4) in each of these wells and leaving the plates for 18 hours at room temperature.
  • microtiter plates are placed in an incubator shaker, at a temperature of 40 ° C., and are maintained there for the desired reaction time. * Stopping the coupling and deprotection reaction (step B of Figure 1):
  • the coupling reaction is stopped and the protective groups are removed by adding 125 ⁇ l of pure trifluoroacetic acid (TFA) to the wells.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Each reaction medium is diluted by taking 10 ⁇ l of this medium and adding it to 1 ml of EIA buffer (0.1 M phosphate buffer; 0.15 M NaCl; BSA
  • the plate is stirred for 1 hour at room temperature, then washed 5 times with a washing buffer consisting of a 0.01 M phosphate buffer, pH
  • an Ellman unit being defined as the amount of enzyme capable of producing an increase in absorbance of one unit for one minute in one ml of Ellman reagent, for an optical path of one cm at 25 ° C (step F of Figure 1).
  • the plate is stirred for 3 hours at room temperature, then washed 5 times with the washing buffer (step G of FIG. 1).
  • FIG. 2 shows, for example, that when the nitro-aldolization reaction is carried out for 4 hours in THF, only diazabicyclo octane (DABCO) and dimethylaminopyridine (DMAP) make it possible to obtain a reaction yield greater than 50%, whereas, when carried out for the same time in CH 2 C1 2 , such a yield is only obtained in the presence of tetra-butylammonium fluoride (TBAF).
  • DABCO diazabicyclo octane
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • the screening relates to two types of operating conditions taken in combination, namely the type of solvent and the type of catalyst; and
  • the concentration of compound Z of the reaction media is determined by an immunoenzymatic assay in solid phase of the "SPIE-IA" type.
  • the compound E 1 -X 1 -G 1 corresponds to the formula (VII) below:
  • R is an ethyl group and R 'is a methyl group (L21); R and R 'are t-butyl groups (L22); R and R 'are 2, 6-diisopropylbenzene groups;
  • the method is implemented according to the following operating mode.
  • polypropylene microtiter plates are successively deposited in each of the wells (equal capacity: 300 ⁇ l / well) and under an inert atmosphere:
  • the plates are placed in an incubator shaker, at a temperature of 25 ° C., and are kept there for 24 hours.
  • the coupling reaction is stopped and the BOC groups are removed by adding 40 ⁇ l of pure TFA to each well.
  • the plates are stirred for 1 hour at room temperature.
  • reaction medium is diluted by taking 10 ⁇ l of this medium and adding it to 1 ml of EIA buffer contained in a well of a deep-weel plate (capacity: 2 ml / well).
  • 100 ⁇ l of each diluted reaction medium are deposited in a well of a microtitration plate, the wall of the wells of which has been previously coated with the His-76 antibody.
  • washing buffer consisting of a 0.01 M phosphate buffer, pH

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, et en particulier de catalyseurs utiles dans cette réaction de couplage, ainsi qu'à des trousses propres a permettre la mise en oeuvre de ce procédé. Applications recherche fondamentale et appliquée, en particulier dans les secteurs de la chimie, de l'agroalimentaire, de la pharmacie et de la protection de l'environnement, pour le développement ou l'optimisation des rendements de réactions de synthèse.

Description

PROCEDE DE CRIBLAGE DE CONDITIONS OPERATOIRES D'UNE
REACTION CHIMIQUE DE COUPLAGE ET TROUSSES POUR LA MISE
EN ŒUVRE DE CE PROCEDE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention se rapporte à un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction chimique de couplage, ainsi qu'à des trousses propres à permettre la mise en œuvre de ce procédé.
De façon plus précise, elle se rapporte à un procédé permettant de tester simultanément les effets de différentes conditions opératoires sur le rendement d'une réaction consistant à coupler au moins deux groupements fonctionnels en vue, par exemple, de sélectionner celle ou celles de ces conditions qui conduisent à une optimisation de ce rendement.
Ces conditions opératoires peuvent être aussi bien qualitatives que quantitatives. Ainsi, le procédé peut servir à cribler des substances, comme des catalyseurs ou des solvants, dont on souhaite savoir si elles sont susceptibles de présenter une utilité dans une réaction de couplage particulière, mais il peut également être employé pour cribler des niveaux, par exemple de température ou de pression, des concentrations, des rapports stœchio- métriques ou des durées comme la durée de réaction ou la durée d'agitation du milieu réactionnel, dont on souhaite connaître l'influence sur le rendement d'une réaction de couplage. Le procédé selon l'invention est donc susceptible de trouver de très nombreuses applications dans le domaine de la recherche, tant fondamentale qu' appliquée. Ainsi, par exemple, il peut être utilisé dans des études fondamentales visant à une meilleure compréhension des mécanismes de la catalyse homogène ou hétérogène et ce, qu'elle soit chimique ou biologique.
Il peut également être utilisé dans des études de recherche appliquée, en particulier dans les secteurs de la chimie, de 1 'agroalimentaire, de la pharmacie et de la protection de l'environnement, ayant pour objectif, soit de développer des catalyseurs plus performants ou plus aptes à répondre spécifiquement à des contraintes particulières, soit d'optimiser les rendements de réactions de synthèse ou les conditions expérimentales, en vue par exemple d'abaisser les coûts de mise en œuvre de ces réactions.
Notamment, il peut servir à cribler une banque d'enzymes mutées afin d'améliorer les performances catalytiques d'une enzyme "sauvage", ou à cribler des milieux biologiques de composition connue ou inconnue dans le but d'identifier l'existence d'une activité catalytique particulière dans ces milieux.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
En matière de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage, ce sont essentiellement des procédés destinés à cribler des catalyseurs qui ont été proposés jusqu'à présent. Ces procédés comprennent tous une étape consistant à faire réagir deux composés particuliers, représentatifs des familles de composés pour lesquelles la réaction de couplage est susceptible d'être utilisée, en présence des différents catalyseurs candidats, suivie d'une étape consistant à apprécier l'efficacité de ces catalyseurs sur ladite réaction.
Ainsi, on connaît, en premier lieu, des procédés qui visent à analyser, à l'issue de la réaction de couplage, la composition des milieux reactionnels par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) , ce qui implique qu'il faut d'abord les purifier, par exemple par filtration sur des colonnes de gel de silice. II s'agit donc de procédés lourds à mettre en œuvre, qui ne permettent d'effectuer qu'un nombre limité de tests par jour et qui sont, par conséquent, totalement inadaptés à un criblage à moyen ou haut débit . II existe, en second lieu, des procédés qui visent à employer, à l'issue de la réaction de couplage, un réactif chimique qui est capable de réagir, soit avec l'un des composés engagés dans cette réaction de couplage, soit avec le produit ou un sous- produit issu de ladite réaction, en générant un signal comme une coloration, une décoloration, l'émission d'une fluorescence ou d'une chimio-luminescence. A titre d'exemples, on peut citer : — le procédé décrit par Lavastre et Morken dans Angew. Chem. . Int . Ed. , 1999, 38(21), 3163-3165, [1] , pour le criblage de catalyseurs utiles dans une alkylation allylique et qui prévoit de détecter le 1- naphtol produit au cours de cette alkylation en le faisant réagir avec le sel de diazonium connu sous le nom de "Fast Red Violet LB", pour le faire virer à 1 ' orange vif ;
— celui décrit par Bôhm et Herrmann dans Eur. J. Org. Chem. , 2000, 3679-3681, [2], pour le criblage de catalyseurs utiles dans la réaction de Sonogashira et qui consiste à révéler le produit de cette réaction en l'oxydant par du KMnC , ce qui provoque une décoloration des milieux reactionnels ; et
- celui proposé par Lober et al . dans J. Δm. Chem. Soc , 2001, 123, 4366-4367, [3], pour le criblage de catalyseurs utiles dans 1 'hydroamination de 1,3-diènes par des arylamines comme l'aniline, et qui consiste à révéler l'aniline résiduelle en la faisant réagir avec du furfural en présence d'un acide, ce qui a pour effet de colorer en rouge les milieux reactionnels . Ce second type de procédés présente, lui, l'inconvénient de nécessiter des réactifs spécifiques de l'un des composés engagés dans la réaction de couplage ou du produit formé par cette réaction, ce qui limite son utilisation au criblage de réactions mettant en jeu des composés ou aboutissant à des produits pour lesquels de tels réactifs sont disponibles.
Il existe, encore, des procédés dans lesquels l'un des composés engagés dans la réaction de couplage est fixé sur un support solide, tandis que l'autre est marqué par une sonde fluorescente. Les deux composés étant mis à réagir, l'efficacité de la catalyse se traduit par la formation sur le support solide du produit issu de la réaction. Il convient alors de laver ce support pour éliminer la fraction des composés n'ayant pas réagi et de détecter le produit issu de la réaction par lecture de la fluorescence présente sur ledit support.
Un exemple de ces procédés est illustré dans l'article de Shaugnessy et al . ( J. Am. Chem. Soc , 1999, 121, 2123-2132, [4]) pour le criblage de catalyseurs utiles dans la réaction de Heck. Dans cet exemple, le premier composé est un halogénure d'aryle qui est fixé sur une résine de polystyrène réticulé (résine de Wang) , tandis que le second composé est un acrylate marqué par de la coumarine. Ce dernier type de procédés présente deux inconvénients majeurs. Tout d'abord, la catalyse est réalisée en milieu hétérogène. Or, on sait qu'un catalyseur qui manifeste une haute activité catalytique en milieu hétérogène peut parfaitement se révéler inefficace en milieu homogène. Par ailleurs, l'appréciation de la catalyse est essentiellement qualitative, dans la mesure où il est difficile de calculer le rendement de la réaction de couplage puisque ce calcul nécessiterait de connaître le taux de greffage du premier composé sur le support solide.
Un autre type encore de procédés est basé sur le fait qu'en présence d'un catalyseur efficace, le dégagement de chaleur d'une réaction s'effectue plus rapidement qu'en présence d'un catalyseur inefficace. Ainsi, il est possible d'apprécier l'efficacité de catalyseurs en mesurant la variation de température des milieux reactionnels, soit par calorimétrie, soit par thermographie au moyen de caméras à infrarouges ultrasensibles fixées au-dessus desdits milieux reactionnels . Un exemple de mise en œuvre de ce type de procédés est illustré dans la publication de Blackmond et al . ( Organic Process Research & Development, 1999, 3_(4), 275-280, [5]) pour le criblage de catalyseurs utiles dans la réaction de Heck. Les procédés de criblage par analyse thermique ont le défaut de nécessiter un matériel lourd et onéreux. Par ailleurs, ils ne permettent pas un calcul du rendement réactionnel. Enfin, ils ne sont pas applicables à des réactions qui se déroulent lentement et qui, de ce fait, dégagent des quantités de chaleur qui ne sont pas détectables ou suffisamment significatives .
Enfin, il a été proposé par Hinderling et C en dans Angew. Chem. Int . Ed. , 1999, 3_(15), 2253- 2256, [6], d'utiliser la spectrophotométrie de masse couplée à 1 'électropulvérisation pour effectuer le criblage de catalyseurs de polymérisation d'oléfines. Là également, il s'agit d'un procédé qui requiert un appareillage lourd et coûteux. II existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé qui permette de tester les effets de différentes conditions opératoires sur une réaction de couplage et, plus particulièrement, l'utilité potentielle de catalyseurs dans cette réaction, et qui, d'une manière générale, soit exempt de tous les inconvénients présentés par les procédés de criblage proposés jusqu'à présent.
EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention répond précisément à ce besoin en fournissant un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend les étapes suivantes : i) faire réagir ensemble au moins deux composés :
» un premier composé de formule Ei-Xi-Gi dans laquelle Gi représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur, tandis que Ei représente le reste d'une première molécule Mi pour laquelle on dispose d'un premier anticorps ACi spécifique, et
. « un deuxième composé de formule E2-X2--G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, tandis que E2 représente, soit le reste d'une deuxième molécule M2 différente de Mi et pour laquelle on dispose d'un deuxième anticorps AC2 spécifique, soit un groupe apte à former au moins une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage ; lesdits au moins deux composés étant mis à réagir en solution dans un solvant et dans des conditions opératoires prédéterminées dont l'une au moins est une condition opératoire candidate, pour obtenir un milieu réactionnel et la formation dans ce milieu d'un composé Z comprenant l'enchaînement Eι-Xι-Gι-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que Gι-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; ii) déterminer la concentration en composé Z du milieu réactionnel à un temps t de réaction prédéterminé, par au moins un dosage immunologique utilisant au moins l'anticorps ACi ; et iii) évaluer les effets de la ou des conditions opératoires candidates sur ladite réaction de couplage à l'aide de la concentration en composé Z ainsi déterminée.
Ainsi, dans le procédé selon l'invention, la réaction de couplage, dont on veut cribler les conditions opératoires et qui met en jeu au minimum deux groupements fonctionnels, en l'espèce Gi et G2, est réalisée en utilisant comme réactifs, au moins deux composés qui comportent chacun, à une extrémité, l'un de ces groupements fonctionnels et, à l'autre extrémité, le reste d'une molécule, respectivement Mi et M2, pour laquelle on dispose d'un anticorps spécifique, respectivement ACi et AC2, ou, dans le cas du deuxième composé, un groupe apte à former une ou plusieurs liaisons covalentes avec l'anticorps ACi spécifique de la molécule Mi en présence d'un agent de couplage . La concentration du milieu réactionnel en composé Z produit par la réaction de couplage peut /092729
ainsi être aisément déterminée, à un temps t de réaction choisi, par au moins un dosage immunologique, ce dosage utilisant, soit uniquement l'anticorps ACi, soit les deux anticorps ACi et AC2. Une fois la concentration en composé Z connue, il est alors possible de déterminer par un calcul le rendement de la réaction de couplage et d'apprécier les effets des conditions opératoires dans lesquelles elle a été réalisée par la valeur de ce rendement. Ces effets peuvent, toutefois, être également appréciés en comparant ladite concentration à une ou plusieurs concentrations préalablement obtenues dans des conditions opératoires différentes et servant de valeurs de référence. Dans ce qui précède et ce qui suit, on entend :
— par "condition opératoire candidate", une condition opératoire dont on teste les effets sur la réaction de couplage ; — par "reste" d'une molécule Mi, la partie de cette molécule qui subsiste dans le composé de formule Ei-Xi-Gi lorsque ladite molécule est liée de façon covalente, soit au groupement fonctionnel Gi, soit au groupe espaceur, selon que Xi représente une liaison covalente ou un groupe espaceur ; de manière similaire, le "reste" d'une molécule respectivement M2, M3 ou M4 correspond à la partie de cette molécule qui subsiste dans le composé respectivement de formule E2- X2-G2, E3-X3-G3 ou E4-X4-G4 lorsqu e ladite molécule est liée de façon covalente, soit au groupement fonctionnel respectivement G2, G3 ou G4, soit au groupe espaceur selon que X2, X3 ou X représente une liaison covalente ou un groupe espaceur.
Par ailleurs, on entend par "anticorps spécifique" d'une molécule, un anticorps apte à reconnaître spécifiquement cette molécule et à se lier avec elle par une réaction immunologique antigène- anticorps .
Comme précédemment indiqué, dans les composés E1-X1-G1 et E2-X2-G2, Gi et G2 correspondent aux deux groupements fonctionnels qui sont au minimum engagés dans la réaction de couplage dont on veut cribler les conditions opératoires et sont donc choisis en fonction de cette réaction.
Des réactions de couplage impliquant deux groupements fonctionnels et pour lesquelles le procédé selon l'invention est susceptible d'être utilisé sont notamment les réactions de couplage intermoléculaires suivantes :
— les réactions d' estérification telles que celles qui consistent à coupler un acide carboxylique
(R-COOH) ou un dérivé d'acide carboxylique comme, par exemple, un halogénure d'acide (R-CO-Hal) , et un alcool (R'-OH) pour obtenir un groupe ester (R-C02R') ;
— les réactions d' amidification telles que celles qui consistent à coupler un acide carboxylique
(R-COOH) ou un dérivé d'acide carboxylique et une aminé primaire (R'-NH2) ou secondaire (R'-NH-R") pour obtenir un amide (R-CONH-R' ou R-CONR'-R") ;
— les réactions d'aldolisation telles que celles qui consistent à coupler deux aldéhydes (R-CHO) ou deux cétones (R-CO-R') , ou à coupler un aldéhyde et une cétone pour obtenir un aldol ou un cétol, et leurs variantes comme la réaction de nitro-aldolisation dans laquelle un aldéhyde est couplé à un composé nitré (R'~ CH2-N02) pour obtenir un nitro-alcool (R-CH (OH) -CH (N02) - R') ;
— la réaction de Heck qui consiste à coupler une oléfine (R'-CH=CH2) et un halogenure organique (R'-Hal) pour obtenir un alcène (R-CH=CH-R') , et ses variantes ; - la réaction de Baylis-Hillman qui consiste à coupler un alcène (R-CH=CH2) et un aldéhyde (R'-CHO) pour obtenir un alcool allylique (R'-C(CH2)- CH(OH)-R'), et ses variantes ;
— la réaction de Michael qui consiste en une addition entre un composé nucleophile et un composé insaturé accepteur d'électrons (par exemple, R-CH=CH2) , et ses variantes ;
— les réactions de métathèse comme celles qui consistent à coupler deux oléfines (par exemple, R- CH=CH2 et R'-CH=CH ) pour en obtenir une troisième (R-
CH=CH-R') ;
— la réaction de Diels-Alder qui consiste en une cycloaddition entre un diène et un diènophile ;
— la réaction de Sonogashira qui consiste à coupler un alcyne (R-C≡CH) et un halogenure d'aryle
(Ar-Hal) pour obtenir un arylalcyne (R-C≡C-Ar) , et ses variantes ;
— la réaction de Suzuki qui consiste à coupler un acide arylboronique (Ar-B(OH)2) et un halogenure d'aryle (Ar'-Hal) pour obtenir un diaryle (Ar-Ar') , et ses variantes ;
— la réaction de Kumada qui consiste à coupler un réactif de Grignard (R-Mg-Hal) et un halogenure d'alkyle, de vinyle ou d'aryle, et ses variantes ;
— la réaction de Stille qui consiste à coupler un composé organostannique (par exemple, Ar- SnBu3) et un halogenure organique (par exemple, Ar'-Br) , et ses variantes ;
— la réaction de Hiyama qui consiste à coupler un organosilane (par exemple, Ar-SiR3) et un halogenure organique (par exemple, Ar'-Br) , et ses variantes ; et — la réaction de Liebeskind-Srogl qui consiste à coupler un acide boronique (par exemple, Ar- B(OH)2) et un thiolester (R-CO-S-R') pour obtenir une cétone, et ses variantes.
Des réactions de couplage impliquant trois groupements fonctionnels sont notamment la réaction de Mannich qui consiste à coupler un composé ayant un hydrogène actif avec un aldéhyde non énolisable et une aminé primaire ou secondaire pour obtenir un composé aminométhylé, la réaction de Hantzsch qui consiste à coupler une aminé avec un aldéhyde et une oc-bromo cétone pour obtenir un pyrrole, et la réaction de Bossio et al . qui consiste à coupler un α-cétoaldéhyde avec un acide carboxylique et un iso-nitrile pour obtenir une oxazole, tandis qu'une réaction de couplage impliquant quatre groupements fonctionnels est, par exemple, la réaction de Ugi qui consiste à coupler un acide carboxylique, une aminé primaire, un composé carbonylé et un isocyanure pour obtenir un composé α- aminocarboxamide . Par ailleurs, dans les composés de formules
Ei-Xi-Gi et E2-X2-G2, Ei représente le reste d'une molécule Mi pour laquelle on dispose d'un premier anticorps spécifique ACi, tandis que E2 peut représenter le reste d'une molécule M2 pour laquelle on dispose d'un deuxième anticorps spécifique AC2.
Ces deux restes doivent présenter des propriétés antigéniques analogues à celles des molécules Mi et M dont ils sont issus, de manière à être reconnus respectivement par l'anticorps ACi et par l'anticorps AC2, et à former avec eux une liaison immunologique, mais ils ne doivent ni gêner le déroulement de la réaction de couplage, notamment par un encombrement stérique, ni interférer dans cette réaction. Aussi, les molécules Mi et M sont-elles, de préférence, des haptènes, c'est-à-dire des petites molécules qui, après greffage sur un vecteur tel qu'une protéine (sérum albumine bovine, γ-immunoglobuline, ...) ou un polysaccharide, sont aptes à induire chez l'animal la production d'anticorps spécifiquement dirigés contre elles.
Ces haptènes peuvent notamment être des hydrocarbures comme le naphthalène, 1 'anthracène, le phénanthrène, le bicyclo [2.2.2] octane, le bicyclo- [2.2.2]heptane, le 2, 2-diméthyl-3-méthyl-4, 4-diméthyl- pentane, 1 'adamantane, le perhydrophénalène et le perhydroant racène, substitués par une fonction réactive, de préférence acide carboxylique, a iné ou thiol, propre à permettre, d'une part, de les greffer sur le vecteur et, d'autre part, de les lier aux groupements fonctionnels Gi et G2 ou aux groupes espaceurs dans le cas où Xi et X2 représentent de tels groupes. De tels hydrocarbures présentent, en effet, l'avantage d'être relativement inertes sur le plan chimique . Toutefois, ces haptènes peuvent également être des molécules autres que des hydrocarbures auquel cas si, dans les composés E1-X1-G1 et E2-X2--G2, les restes de ces molécules comportent un ou plusieurs groupes fonctionnels libres susceptibles de réagir aux conditions opératoires dans lesquelles est réalisée la réaction de couplage, il convient que ce ou ces groupes fonctionnels soient protégés par un groupe protecteur convenablement choisi avant de procéder à la réaction de couplage, c'est-à-dire préalablement à l'étape i) du procédé, puis déprotégés entre les étapes i) et ii) .
Deux molécules se sont révélées constituer des haptènes particulièrement intéressants pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Il s'agit, d'une part, de l'histamine qui répond à la formule (I) ci- après :
(I) et pour laquelle il a été possible d'obtenir plusieurs anticorps monoclonaux présentant un Kd au moins égal à 10~8 M, et, d'autre part, de l'acide omovanillique qui répond à la formule (II) ci-après :
(II)
et pour lequel il a été possible d'obtenir plusieurs anticorps monoclonaux présentant un Kd au moins égal à 10"6 M.
Aussi, selon une première disposition préférée du procédé selon l'invention, Ei dans le composé Ei-Xi-Gi ou E2 dans le composé E2-X2-G2 répond-t- il à la formule (III) ci-après :
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur d'une fonction aminé comme, par exemple, un groupe tert-butyloxycarboxyle (BOC) ou un groupe benzyle.
Selon une autre disposition préférée du procédé selon l'invention, Ei dans le composé E1-X1-G1 ou E2 dans le composé E2-X2-G2 répond à la formule (IV) ci-après :
(IV)
dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur d'une fonction alcool comme, par exemple, un groupe silylé du type diméthyl tert- butylsilyle, le dihydropyrane ou encore un groupe benzyle, allyle ou acétal. Dans le composé E2-X2-G2, E2 peut ne pas représenter le reste d'une molécule M2, mais un groupe apte à former au moins une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage, auquel cas ce groupe est avantageusement choisi parmi les groupes aminé, acide carboxylique, aldéhyde, thiol, phénol, alkényle, azoture et les groupes photo- activables comme, par exemple, les groupes benzophenone et arylazide.
De préférence, E2 est un groupe aminé ou thiol.
Comme précédemment indiqué, dans les composés E1-X1-G1 et E2-X2-G2, Ei et E2 peuvent être liés aux groupements fonctionnels Gi et G2, soit directement, soit par l'intermédiaire de groupes espaceurs. Ces groupes espaceurs, qui n'ont, pour seule fonction, que celle de former un pont entre, d'une part, Ei et le groupement fonctionnel Gi et, d'autre part, entre E2 et le groupement fonctionnel G2, sont, soit des groupes dénués de tout groupement fonctionnel comme des groupes hydrocarbonés saturés du type éthylène (-(CH2)2-), propylène (-(CH2)3-), butylène (-(CH2)4~) ou analogues, soit des groupes comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels inaptes à réagir aux conditions opératoires dans lesquelles est réalisée la réaction de couplage, soit encore des groupes comportant un ou plusieurs groupements fonctionnels que l'on protège, préalablement à la réalisation de la réaction de couplage, par un groupement protecteur approprié .
Conformément à l'invention, ledit au moins un dosage immunologique du composé Z est, de préférence, un dosage en phase solide pour des raisons de simplicité de mise en œuvre.
Selon un premier mode de mise en œuvre préféré du procédé selon l'invention, E2 correspondant, dans le composé E2-X2 _G2, au reste d'une molécule M2, ledit au moins un dosage immunologique du composé Z est un dosage de type "sandwich" (ou à deux sites) et l'étape ii) comprend les étapes suivantes : ai) mettre le milieu réactionnel obtenu au temps t de réaction en contact avec une phase solide sur laquelle est immobilisé l'anticorps ACi, pour obtenir la fixation du composé Z sur cette phase solide par liaison immunologique entre cet anticorps et le reste Ei de ce composé ; bi) mettre la phase solide en contact avec un conjugué comprenant l'anticorps AC2 couplé à un marqueur, pour obtenir la fixation de ce conjugué sur cette phase solide par liaison immunologique entre cet anticorps et le reste E2 du composé Z fixé sur ladite phase solide ; ci) mesurer la quantité de conjugué fixé sur la phase solide à 1 ' aide du marqueur couplé à l'anticorps AC2 ; et di) déterminer sur une gamme d'étalonnage la concentration en composé Z du milieu réactionnel audit temps t à partir de la quantité de conjugué ainsi mesurée ; ladite étape ii) comprenant, de plus, une ou plusieurs opérations de lavage de la phase solide entre les étapes ai) et bi) , et entre les étapes bi) et ci) .
Ce dosage utilise donc les deux anticorps ACi et AC2, l'anticorps ACi étant immobilisé sur la phase solide et l'anticorps AC2 étant couplé à un marqueur .
Selon un autre mode de mise en œuvre préféré du procédé selon l'invention, E2 correspondant, dans le composé E2-X2-G2, à un groupe apte à former au moins une liaison covalente avec l'anticorps ACi, ledit au moins un dosage immunologique du composé Z est un dosage de type "SPIE-IA" (Solid-Phase Epitope ImmunoAssay) tel que décrit dans US-A-5, 476, 770 [7], et l'étape ii) comprend les étapes suivantes : a2) mettre le milieu réactionnel obtenu au temps t de réaction en contact avec une phase solide sur laquelle est immobilisé l'anticorps ACi, pour obtenir la fixation du composé Z sur cette phase solide par liaison immunologique entre cet anticorps et le reste Ei de ce composé ; b2) faire réagir un agent de couplage avec l'anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et le groupe E2 du composé Z fixé sur cette phase solide, pour obtenir la formation d'une ou plusieurs liaisons covalentes entre cet anticorps et ce groupe ; c2) dénaturer la liaison immunologique existant entre l'anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et le reste Ei du composé Z fixé sur cette phase solide, pour libérer ce reste de cette phase solide ; d2) mettre la phase solide en contact avec un conjugué comprenant l'anticorps ACi couplé à un marqueur, pour obtenir la fixation de ce conjugué par liaison immunologique entre ledit anticorps et le reste Ei du composé Z ainsi libéré ; e2) mesurer la quantité de conjugué fixé sur la phase solide à l'aide du marqueur couplé à 1 ' anticorps ACi et f2) déterminer sur une gamme d'étalonnage la concentration en composé Z du milieu réactionnel audit temps t_ à partir de la quantité de conjugué ainsi mesurée ; ladite étape ii) comprenant, de plus, une ou plusieurs opérations de lavage de la phase solide entre les étapes a2) et b2) , b2) et c2) , c2) et d2) , et entre les étapes d2) et e2) .
Ce dosage n'utilise, lui, que l'anticorps ACi mais sous deux formes différentes : une première forme dans laquelle il est immobilisé sur la phase solide et une deuxième forme dans laquelle il est couplé à un marqueur. L'agent de couplage que l'on utilise à l'étape b2) peut être un réactif chimique, auquel cas il convient qu'il soit bifonctionnel, c'est-à-dire qu'il comprenne un premier groupe fonctionnel apte à réagir avec le groupe E2 du composé E2-X2-G2, et un deuxième groupe fonctionnel, identique ou différent du premier, apte à réagir avec l'anticorps ACi.
Selon que ces groupes fonctionnels sont identiques ou différents, il peut s'agir d'un réactif homo-bifonctionnel comme le glutaraldéhyde, le difluoro-dinitrobenzene, le bis- (maleimido) hexane ou le disuccinimidyl subérate, ou d'un réactif hétéro- bifonctionnel comme le N-succinimidyl-3-3- (2-pyridyl- dithio) propionate ou le succinimidyl-4- (N-maléimido- méthyl) -cyclohexane-1-carboxylate.
De préférence, on utilise le glutaraldéhyde ou le disuccinimidyl subérate.
En variante, l'agent de couplage peut être une irradiation, par exemple ultra-violette, dans le cas où E2 représente un groupe photo-activable.
A l'étape c2) , la dénaturation de la liaison immunologique existant entre l'anticorps ACi et le reste Ei du composé Z peut être effectuée de façon classique au moyen d'un réactif approprié, ou encore sous l'action d'ultrasons ou de la chaleur.
Ce réactif peut être choisi parmi les acides comme HC1, les bases comme NaOH, les solvants organiques comme, par exemple, les alcools du type méthanol, les agents tensioactifs et les sels minéraux. Quelle que soit la technique choisie pour doser le composé Z : - l'anticorps ACi et, le cas échéant, l'anticorps AC2 peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, même si, d'une manière générale, on préfère utiliser des anticorps monoclonaux en raison de leur plus grande spécificité ;
- l'immobilisation de l'anticorps ACi sur la phase solide peut être une immobilisation passive ou active ; ainsi, cette immobilisation peut être obtenue par simple adsorption dudit anticorps à la surface de la phase solide, par liaison covalente, par l'intermédiaire de molécules de liaison comme le système avidine-biotine, ou encore par l'intermédiaire d'une étiquette polyhistidine associée au complexe nickel ou cuivre/NTA (acide nitrilo triacétique) ; lorsque l'anticorps ACi est un anticorps monoclonal, son immobilisation sur la phase solide peut être également obtenue par l'intermédiaire d'un anticorps polyclonal préalablement adsorbé à la surface de cette phase solide ; — la phase solide peut être l'une quelconque des phases solides classiquement employées pour les dosages immunologiques comme la paroi d'un tube ou d'un puits d'un plaque de microtitration, une membrane constituée d'un matériau plastique comme le polystyrène ou la nitrocellulose, des billes de verre, des billes magnétiques et, de manière générale, toute surface sur laquelle il est possible de fixer, de manière passive ou active, un anticorps ; et
- le marqueur peut être un isotope comme l'iode 125, le chrome 51 ou le tritium, une enzyme comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, 1 ' acétylcholine estérase ou la glucose oxydase, un marqueur luminescent comme le pyrogallol, le luminol ou 1 ' isoluminol, un marqueur fluorescent comme la fluoroscéine, 1 'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou la cyanine, ou encore une substance capable de réagir avec 1 ' avidine ou la streptavidine comme la biotine et ses analogues structuraux ; dans ce dernier cas, l' avidine ou la streptavidine est elle-même marquée, par exemple par une enzyme ou un fluorochrome.
De préférence, l'anticorps ACi et, le cas échéant, l'anticorps AC2 sont des anticorps monoclonaux ; la phase solide est la paroi d'un puits d'une plaque de microtitration ; l'immobilisation de l'anticorps ACi est réalisée par adsorption passive de cet anticorps à la surface de cette phase et le marqueur est une enzyme, notamment 1 'acétylcholine estérase, en raison de son "turn-over" (16 000 molécules de substrat hydrolysées par seconde et par site) qui confère aux conjugués qui la renferment une forte activité spécifique.
Conformément à l'invention, le procédé comprend, avantageusement, une opération de dilution du milieu réactionnel entre les étapes i) et ii) . Par ailleurs, les effets de la ou des conditions opératoires candidates sur la réaction de couplage sont, de préférence, évalués à l'étape iii) en déterminant le rendement de cette réaction à partir de la concentration en composé Z du milieu réactionnel telle que déterminée à l'étape ii) . Ce rendement peut, par exemple, être calculé en appliquant la formule suivante :
dans laquelle :
• [Z] est la concentration en composé Z du milieu réactionnel telle que déterminée à l'étape ii) et f est le facteur de dilution de ce milieu dans le cas où ce dernier a été soumis à une dilution entre l'étape i) et l'étape ii) , tandis que
• [Ei-Xi-Gi] est la concentration initiale en composé Ei-Xi-Gi du milieu réactionnel.
Comme précédemment indiqué, la réaction de couplage, dont on souhaite cribler les conditions opératoires, peut consister à coupler deux ou plus de deux groupements fonctionnels, le nombre de groupements fonctionnels mis en jeu dans cette réaction étant, de préférence, égal à 2, 3 ou 4.
Lorsque la réaction de couplage consiste à coupler deux groupements fonctionnels Gi et G2, alors :
— à l'étape i) , on fait réagir ensemble les composés de formules E1-X1-G1 et E2-X2-G2 pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z qui répond à la formule E1-X1-G1-G2-X2-E2 dans laquelle Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment et G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage entre lesdits groupements fonctionnels Gi et G2 ; tandis que
— à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par un seul dosage immunologique, lequel est, de préférence, un dosage en phase solide de type "sandwich" ou de type "SPIE-IA" tel que précédemment décrit.
Lorsque la réaction de couplage consiste à coupler trois groupements fonctionnels Gi, G2 et G3, alors :
— à l'étape i) , on fait réagir les composés de formules E1-X1-G1 et E2-X2-G2 avec un troisième composé de formule E3-X3-G3 dans laquelle X3 représente une liaison covalente ou un troisième groupe espaceur, identique ou différent de Xi et/ou de X2, tandis que E3 représente, soit le reste d'une troisième molécule M3 différente de Mi et de M2 et pour laquelle on dispose d'un troisième anticorps AC3 spécifique, soit un groupe apte à former une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage à condition toutefois que E2 ne représente pas déjà un tel groupe, pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z répondant à l'une des formules ci- après :
dans lesquelles Xx, X2, X3, Ei, E2 et E3 ont la même signification que précédemment et
représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits groupements fonctionnels Gi, G2 et G3 ; tandis que
— à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par deux dosages immunologiques différents.
Ces dosages, qui peuvent être conduits en parallèle, c'est-à-dire sur deux échantillons différents du milieu réactionnel, ou l'un à la suite de l'autre sur le même échantillon du milieu réactionnel, sont préférentiellement tous deux effectués en phase solide. Ainsi, il peut s'agir de deux dosages de type "sandwich" que l'on réalise en utilisant :
— pour le premier dosage, l'anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et l'anticorps AC2 couplé à un premier marqueur, et — pour le deuxième dosage, l'anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et l'anticorps AC3 couplé à un deuxième marqueur, les premier et deuxième marqueurs pouvant être identiques dans le cas où les deux dosages sont conduits en parallèle, mais devant être différents dans le cas où ils sont conduits l'un à la suite de l'autre. En variante, le premier dosage peut être un dosage de type "SPIE-IA" que l'on réalise en utilisant l'anticorps ACi comme précédemment décrit, auquel cas le deuxième dosage est un dosage de type "sandwich" que l'on réalise en utilisant l'anticorps AC2 ou l'anticorps AC3 couplé à un marqueur selon que, dans les composés E2-X2-G2 et E3-X3-G3, c'est E2 ou E3 qui représente le groupe apte à former une ou plusieurs liaisons covalentes avec l'anticorps ACi au cours du dosage "SPIE-IA". Dans tous les cas, la formation du composé
Z dans le milieu réactionnel est garantie par la concordance des concentrations en ce composé telles que déterminées par les deux dosages.
Lorsque la réaction de couplage consiste à coupler quatre groupements fonctionnels Gi, G2, G3 et G4, alors :
- à l'étape i) , on fait réagir les composés de formule E1-X1-G1 et E2-X2-G2 avec un troisième composé de formule E3-X3-G3 telle que précédemment définie et un quatrième composé de formule E4-X4-G4 dans laquelle X représente une liaison covalente ou un quatrième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, X2 et/ou X3, tandis que E4 représente soit le reste d'une troisième molécule M4 différente de Mi, de M2 et de M3 et pour laquelle on dispose d'un quatrième anticorps AC4 spécifique, soit un groupe apte à former une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage à la condition toutefois que E2 et E3 ne représentent pas déjà un tel groupe, pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z répondant à l'une des formules ci-après :
E, X. -x. - E,
G2 X2 E2
dans lesquelles Xi, X2, X3, X4, Ei, E2, E3 et E4 ont la même signification que précédemment et
représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits groupements fonctionnels Gi, G2, G3 et G ; tandis que
- à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par trois dosages immunologiques différents.
Là également, ces dosages peuvent être conduits en parallèle ou les uns à la suite des autres et sont preferentiellement tous trois effectués en phase solide. Il peut s'agir de trois dosages de type "sandwich" ou d'un dosage de type "SPIE-IA" suivi de deux dosages de type "sandwich", la formation du composé Z dans le milieu réactionnel étant, là encore, garantie par la concordance des résultats obtenus.
Conformément à l'invention, les conditions opératoires candidates sont, de préférence, choisies dans le groupe constitué par les solvants, les catalyseurs, les niveaux de température, les niveaux de pression, l'utilisation d'ultrasons, les concentrations
(des substances mises à réagir et/ou du catalyseur) , les rapports stœchiométriques (entre ces substances) , les durées de réaction et leurs combinaisons. Ainsi, le procédé selon l'invention peut aussi bien être utilisé pour cribler des conditions opératoires d'un seul type comme, par exemple, des catalyseurs ou des niveaux de température ou des niveaux de pression, que pour cribler des combinaisons de conditions opératoires de types différents comme des combinaisons solvant/catalyseur, solvant/catalyseur/ durée de la réaction, température/pression, catalyseur/ température/pression, ou analogues.
Dans ce qui précède et ce qui suit, on entend par "catalyseur", tout agent qui, par sa seule présence au sein du milieu réactionnel, est apte à accélérer la cinétique d'une réaction. Ce catalyseur peut être aussi bien un catalyseur chimique comme, par exemple, un composé organique, une base inorganique, un métal, un sel métallique, un oxyde ou hydrure métallique, un composé organométallique, un complexe métal-ligand, un halogenure, ou encore une combinaison de ceux-ci, ..., qu'un catalyseur biologique, ce dernier pouvant se présenter sous des formes très diverses, et notamment sous la forme d'un organe, d'un tissu, d'une cellule, d'une fraction cellulaire, d'un organite cellulaire, d'un extrait enzymatique, d'un complexe moléculaire ou encore d'une simple molécule, par exemple une enzyme isolée et purifiée.
Le procédé selon l'invention présente de nombreux avantages . En effet : - il permet, dès lors que l'on dispose d'au moins une molécule apte à être greffée sur un groupement fonctionnel, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un groupe espaceur, et d'au moins un anticorps capable de reconnaître spécifiquement cette molécule et de se lier avec elle, de doser le composé résultant du couplage de deux groupements fonctionnels et ce, quels que soient ces derniers ; de ce fait, il suffit de disposer de quelques molécules greffables et de quelques anticorps spécifiques de ces molécules pour être en mesure de cribler les conditions opératoires de très nombreuses réactions de couplage par le procédé selon l'invention ;
— il permet de tester simultanément différents types de conditions opératoires, soit en parallèle, soit en combinaison, et ce, qu'il s'agisse de conditions qualitatives ou quantitatives ;
— il est compatible avec tous les systèmes catalytiques, qu'ils soient chimiques ou biologiques ;
— il ne nécessite aucune opération de purification des milieux reactionnels obtenus à l'issue de la réaction de couplage ;
— il permet d'apprécier les effets des conditions opératoires de manière quantitative, en donnant accès au rendement de la réaction de couplage ;
— il est très sensible, puisqu'il s'est révélé permettre la détection d'une concentration en composé Z jusqu'à 10~9 M, ce qui permet de le mettre en œuvre en utilisant des microvolumes de réactifs et de solvants ;
— il est reproductible ; — il est simple à mettre en œuvre et ne requiert aucun équipement coûteux et/ou difficilement disponible ;
— il permet de réaliser des criblages à une cadence élevée ; ainsi, sa mise en œuvre sur un automate relativement simple, c'est-à-dire un automate assurant les lavages de la phase solide, une distribution du substrat du marqueur enzymatique et la lecture de la réaction enzyme/substrat, mais n'assurant pas une distribution des autres réactifs, a permis à un seul expérimentateur de réaliser un millier de tests par jour. Cette cadence est donc susceptible d'être multipliée par un facteur 10 (soit 10 000 tests/jour) par l'utilisation d'appareils permettant une automatisation complète du procédé selon l'invention.
Le procédé selon l'invention est donc particulièrement bien adapté à la réalisation de criblages à "haut débit".
L'invention a aussi pour objet une trousse ou "kit" pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend des quantités appropriées :
- d'au moins deux composés destinés à réagir ensemble :
• un premier composé de formule Ei-Xi-Gi dans laquelle Gi représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur et Ei représente le reste d'une première molécule Mi ; et
• un deuxième composé de formule E2-X2-G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, et E2 représente le reste d'une deuxième molécule M2 différente de Mi ; - d'au moins deux anticorps : • un premier anticorps ACi spécifique de la première molécule Mi, cet anticorps étant éventuellement fixé sur une pluralité de phases solides ; et • un deuxième anticorps AC2 spécifique de la deuxième molécule M2, cet anticorps étant couplé à un marqueur ;
— d'un composé Z comprenant l'enchaînement Eι-Xι-Gι-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que Gι-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; et éventuellement :
— d'un réactif de révélation du marqueur, par exemple un substrat si le marqueur est une enzyme ; et
— de tampons convenablement choisis (tampons de dilution, tampons de rinçage, ...) .
L'invention a encore pour objet une trousse ou "kit" pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend des quantités appropriées :
— d'au moins deux composés destinés à réagir ensemble :
• un premier composé de formule E1-X1-G1 dans laquelle Gi représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur et Ei représente le reste d'une première molécule Mi ; et • un deuxième composé de formule E2-X2-G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, et E2 représente un groupe apte à former une ou plusieurs liaisons covalentes avec un anticorps spécifique de la molécule Mi en présence d'un agent de couplage ;
- d'au moins un anticorps, cet anticorps étant ledit anticorps spécifique de la molécule Mi ;
- d'un conjugué comprenant ledit anticorps spécifique de la molécule Mi couplé à un marqueur ;
- d'un composé Z comprenant l'enchaînement E1-X1-G1-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ex et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; et éventuellement :
- d'un réactif de révélation du marqueur, - d'un agent de couplage,
- d'un réactif apte à dénaturer une liaison immunologique, et
- de tampons convenablement choisis. L'invention a, en outre, pour objet l'utilisation d'un procédé de criblage ou d'une trousse tel que précédemment défini pour le criblage, en particulier à "haut débit", de catalyseurs utiles dans une réaction de couplage entre deux groupements fonctionnels . Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples de modes de mise en œuvre du procédé selon l'invention ayant permis de valider à la fois sa faisabilité et son intérêt pour le criblage à "haut débit" de conditions opératoires.
Ce complément de description est donné à titre illustratif, et en aucun cas limitatif, et se réfère aux dessins annexés.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 représente, sous une forme schématique, les différentes étapes d'un premier mode de mise en œuvre du procédé de criblage selon 1 ' invention.
La figure 2 montre les résultats, en termes de rendements reactionnels, exprimés en %, d'un criblage de conditions opératoires réalisé conformément au premier mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention illustré sur la figure 1.
La figure 3 représente, sous une forme schématique, les différentes étapes d'un second mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention.
La figure 4 montre les résultats, en termes de rendements reactionnels, exprimés en %, d'un criblage de conditions opératoires réalisé conformément au second mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention illustré sur la figure 3. EXEMPLES DE MODES DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON L'INVENTION
EXEMPLE 1 :
Le présent exemple illustre un premier mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention dans lequel :
— la réaction de couplage est la réaction de nitro-aldolisation qui s'écrit :
- le criblage porte sur trois types de conditions opératoires prises en combinaison, à savoir le type de solvant, le type de catalyseur et le temps de réaction ; et — la concentration en composé Z des milieux reactionnels est déterminée par un dosage ELISA en phase solide de type "sandwich".
Le composé Ei-Xi-Gi répond à la formule (V) ci-apres
(V)
et résulte du couplage de l'acide 6-nitrocaproïque avec l'histamine. Le composé E2-X2-G2 répond, lui, à la formule (VI) ci-après :
(VI)
et résulte du couplage du N- (2-amino-éthyl) -3- (4- formylphényl) propionamide avec l'acide homovanillique .
La réaction de couplage des composés E1-X1-
Gi et E2-X2- 2 est réalisée en utilisant : — deux solvants candidats : le tétra ydro- furanne (THF) et le chlorure de méthylène (CH2CI2) ;
— douze catalyseurs candidats : le fluorure de tétrabutylammonium (TBAF) , le fluorure de potassium
(KF) , la triéthylamine (TEA) , la pyridine (PYR) , la di- isopropylamine (DIA) , le diazabicyclo octane (DABCO) , la diisopropyléthylamine (DIEA) , le diazabicyclo undec- ène (DBU) , la diméthylaminopyridine (DMAP) , le méthoxyde de sodium (NaOMe) , la soude (NaOH) et le carbonate de potassium (K2C03) , et — quatre temps de réaction candidats :
30 minutes, 1 heure, 4 heures et 12 heures.
Le dosage immuno-enzymatique du composé Z
(de formule E1-X1-G1-G2-X2-E2) produit par la réaction de couplage est réalisé en utilisant : — un anticorps monoclonal dirigé contre l'histamine (anticorps His-31 ; Kd : 10~9 M) , qui a été immobilisé sur les parois des puits de plaques de microtitration en polystyrène (de capacité égale à 300 μl/puits) par "coating", c'est-à-dire par adsorption passive de cet anticorps à la surface de polystyrène ;
— un conjugué comprenant un anticorps monoclonal dirigé contre l'acide homovanillique (anticorps H6-92 ; Kd : 10"7 M), couplé à l' acétylcholine estérase (AChE) , ce conjugué étant préparé et stocké comme décrit par Taran et al . dans Clin . Chem. , 1997, 43(2), 363-368 [8] ; et
— le réactif de révélation, qui comprend un mélange d'iodure d' acétylthiocholine 7,5.10"4 M et d'acide 5, 5 ' -dithiobis- (2-nitro)benzoîque (réactif d'Ellman) 2,5.10"4 M dans du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4), pour mesurer la quantité de conjugué anticorps H6-92/AChE fixé sur la phase solide. L' adsorption de l'anticorps His-31 à la surface des parois des puits des plaques de microtitration a été obtenue en déposant 100 μl d'une solution de cet anticorps à 5 μl/ml dans du tampon phosphate 0,05 M, (pH 7,4) dans chacun de ces puits et en laissant les plaques pendant 18 heures à température ambiante. A la suite de quoi, les puits ont été lavés et saturés par 300 μl de tampon EIA, et les plaques ont été recouvertes de scotch et stockées à 4°C jusqu'à leur utilisation. Le procédé, dont les différentes étapes sont schématisées sur la figure 1, est mis en œuvre selon le mode opératoire suivant.
1) Mode opératoire :
* Réaction de couplage (étape A de la figure
D
Après avoir protégé la fonction aminé secondaire portée par le cycle azoté du reste de l'histamine présent dans le composé Ei-Xi-Gi (reste Ei) par un groupe BOC (GPi sur la figure 1) , et la fonction hydroxyle portée par le cycle du reste de l'acide homovanillique présent dans le composé E2-X2-G2 (reste E2) , par un groupe dimethyl tert-butylsilyle (GP2 sur la figure 2) , on dépose successivement, dans chacun des puits de plaques de microtitration en polypropylene (capacité : 300 μl/ puits) :
- 50 μl d'une solution organique 5 mM du composé E1-X-G1, - 50 μl d'une solution organique 5 mM du composé G2-Y-E2, et
- 25 μl d'une solution organique 1 mM d'un catalyseur candidat, un seul et même solvant (THF ou CH2C12) étant utilisé dans chaque puits.
Les plaques de microtitration sont placées dans un agitateur incubateur, à une température de 40 °C, et y sont maintenues le temps de réaction désiré. * Arrêt de la réaction de couplage et déprotection (étape B de la figure 1) :
La réaction de couplage est stoppée et les groupements protecteurs sont enlevés par addition de 125 μl d'acide trifluoroacétique (TFA) pur dans les puits. Les plaques sont agitées pendant 15 minutes à température ambiante.
* Dilution des milieux reactionnels (étape C de la figure 1) :
Chaque milieu réactionnel est dilué en prélevant 10 μl de ce milieu et en l'ajoutant à 1 ml de tampon EIA (tampon phosphate 0,1 M ; NaCl 0,15 M; BSA
0,1% ; azoture de sodium 0,01% ; pH 7,4) contenu dans un puits de plaques deep-weel (capacité : 2 ml/puits) .
Cette opération est répétée deux fois en sorte que chaque milieu réactionnel est dilué 106 fois.
* Dosage du composé Z : 50 μl de chaque milieu réactionnel dilué sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitration dont la paroi des puits est revêtue de l'anticorps His-31 (étape D de la figure 1) .
La plaque est agitée pendant 1 heure à température ambiante, puis lavée 5 fois par un tampon de lavage consistant en un tampon phosphate 0,01 M, pH
7,4, contenant 0,05% de Tween 20 (étape E de la figure D •
Puis, on dépose, dans chaque puits, 50 μl d'une solution du conjugué H6-92/AChE à 5 unités
Ellman/ml (UE) , une unité Ellman étant définie comme la quantité d'enzyme apte à produire une augmentation d'absorbance d'une unité pendant une minute dans un ml de réactif Ellman, pour un chemin optique d'un cm à 25°C (étape F de la figure 1) . La plaque est agitée pendant 3 heures à température ambiante, puis lavée 5 fois par le tampon de lavage (étape G de la figure 1) .
200 μl de réactif de révélation (RV) sont alors introduits dans chaque puits . La plaque est agitée pendant 1 heure à température ambiante au terme de laquelle on mesure la densité optique (DO) à 414 nm du milieu contenu dans chaque puits au moyen d'un lecteur automatique.
A partir des valeurs de DO ainsi obtenues, on détermine, pour chaque milieu réactionnel, sa concentration en composé Z, par référence à une gamme étalon (qui permet de relier une valeur d'absorbance à une concentration en composé Z) , puis le rendement de la réaction de nitro-aldolisation au moyen de la formule de calcul du rendement précédemment mentionnée.
2) Résultats :
Les résultats sont présentés sur la figure 2, sous la forme d'une matrice dans laquelle les rendements reactionnels (exprimés en %) sont symbolisés par des ronds blancs, gris clair, gris moyen ou gris foncé, selon qu'ils sont compris entre 0 et 10%, entre 10 et 30%, entre 30 et 50% ou entre 50 et 70%.
Ces ronds sont répartis sur 8 lignes correspondant chacune à un temps de réaction candidat, et sur 12 colonnes correspondant chacune à un catalyseur candidat, les 4 lignes supérieures regroupant les rendements des réactions réalisées dans le THF, et les 4 lignes inférieures regroupant les rendements des réactions réalisées dans le CH2CI2. La figure 2 montre, par exemple, que lorsque la réaction de nitro-aldolisation est effectuée pendant 4 heures dans du THF, seuls le diazabicyclo octane (DABCO) et la diméthylaminopyridine (DMAP) permettent d'obtenir un rendement réactionnel supérieur à 50%, alors que, lorsqu'elle est réalisée pendant le même temps dans du CH2C12, un tel rendement n'est obtenu qu'en présence de fluorure de tétra-butylammonium (TBAF) .
EXEMPLE 2 :
Cet exemple illustre un deuxième mode de mise en œuvre du procédé selon l'invention dans lequel :
- la réaction de couplage est la réaction de Sonogashira qui s'écrit :
— le criblage porte sur deux types de conditions opératoires prises en combinaison, à savoir le type de solvant et le type de catalyseur ; et
- la concentration en composé Z des milieux reactionnels est déterminée par un dosage immuno- enzymatique en phase solide de type "SPIE-IA". Dans cet exemple, le composé E1-X1-G1 répond à la formule (VII) ci-après :
(VII)
et résulte du couplage de l'acide 5-hexynoïque avec 1 'histamine .
Le composé E2-X2-G2 répond, lui, à la formule (VIII) ci-après :
(VIII)
La réaction de couplage des composés Ei-Xi- Gi et E2-X2_G2 est réalisée en utilisant :
- trois solvants candidats : le dimethyl- formamide (DMF) , le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le THF ;
— une banque de catalyseurs préparée in si tu et dans laquelle chaque catalyseur correspond à une combinaison entre :
(1) un complexe métallique M choisi parmi les complexes Ml à M7 suivants : Ml : Pd2dba3 M2 : Pd(PPh3)4 M3 : Pd(OAc)2 M4 : PdCl2(PPh3)2 M5 : PdCl2 (C6H5CN) 2 M6 : Pd(NH3)4(N03)2 M7 : Ni (acac) , et (2) un ligand L choisi parmi les 23 ligands suivants : • les ligands Ll à L12 répondant à la formule PR3 dans laquelle R est respectivement un groupe n- butyle, n-octyle, t-butyle, -CH2-CH=CH2, -CH2OH, -CH2CH2CH2OH, -N(CH3)2, phényle, o-tolyle, -CH=CH2, o,p-di-OCH3C6H3 et o-furyle ; • les ligands L13 à L17 répondant à la formule R2P(CH2)nPR2 dans laquelle R est un groupe méthyle et n est égal à 1 ou 2 (L13, L14) , R est un groupe phényle et n est égal à 1, 2 ou 4 (L15, L16, L17) ; o le ligand L18 ou ligand DIOP de formule :
• les complexes d'arsenic L19 et L20 de formule AsPh3 et (Ph2) As (CH2) 2As (Ph2) ;
• les imidazoliums L21 à L23 répondant à la formule :
dans laquelle R est un groupe éthyle et R' est un groupe méthyle (L21) ; R et R' sont des groupes t-butyle (L22) ; R et R' sont des groupes 2, 6-diisopropylbenzene ;
(3) en présence d'une base choisie parmi la diiso- propyléthylamine (DIEA) et le tert-butoxyde de potassium (tBuOK) , et de sels de cuivre choisis parmi l'iodure de cuivre (Cul) et le triflate de cuivre
(CuOTf) .
Le dosage immuno-enzymatique du composé Z (de formule E1-X1-G1-G2-X2-E2) produit par la réaction de couplage est réalisé en utilisant :
— un anticorps monoclonal dirigé contre l'histamine (anticorps His-76 ; Kd : 10-8 M), qui a été immobilisé sur la paroi des puits de plaques de microtitration en polystyrène (capacité : 300 μl/puits) par "coating", selon une technique analogue à celle décrite dans 1 ' exemple 1 ;
— un conjugué comprenant cet anticorps couplé à l'AChE ; et
— le réactif de révélation décrit dans l'exemple 1 pour mesurer la quantité de conjugué His-
76/AChE fixé sur la phase solide.
Le procédé, dont les différentes étapes sont schématisées sur la figure 3, est mis en œuvre selon le mode opératoire suivant.
1) Mode opératoire :
* Réaction de couplage (étape A de la figure 3) :
Après avoir protégé la fonction aminé portée par le cycle azoté du reste de l'histamine présent dans le composé E1-X1-G1 (reste Ei) A et la fonction aminé du composé E2-X2-G2 par des groupes BOC
(GP sur la figure 3) , on dépose successivement, dans chacun des puits de plaques de microtitration en polypropylene (capacité égale : 300 μl/puits) et sous atmosphère inerte :
- 5 μl d'un solvant ou d'une solution organique 16 mM d'un complexe métallique M,
- 5 μl d'un solvant ou d'une solution organique 32 mM d'un ligand L, — 25 μl d'une solution organique comprenant le composé E2-X2-G2 à 160 M, un sel de cuivre à 6,4 mM, une base à 480 mM, et
- 5 μl d'une solution organique 800 mM du composé E1-X1-G1, un seul et même solvant (DMF, DMSO ou THF) étant utilisé pour chaque puits.
Les plaques sont placées dans un agitateur incubateur, à une température de 25°C, et y sont maintenues 24 heures.
* Arrêt de la réaction de couplage et déprotection (étape B de la figure 3) :
La réaction de couplage est stoppée et les groupements BOC sont enlevés par addition de 40 μl de TFA pur dans chaque puits. Les plaques sont agitées pendant 1 heure à température ambiante.
* Dilution des milieux reactionnels (étape C de la figure 3) : Chaque milieu réactionnel est dilué en prélevant 10 μl de ce milieu et en l'ajoutant à 1 ml de tampon EIA contenu dans un puits d'une plaque deep-weel (capacité : 2 ml/puits) .
Cette opération est répétée deux fois en sorte que chaque milieu réactionnel est dilué 106 fois.
* Dosage du composé Z :
100 μl de chaque milieu réactionnel dilué sont déposés dans un puits d'une plaque de microtitration dont la paroi des puits a été préalablement revêtue de l'anticorps His-76.
Les plaques sont agitées pendant 1 heure à température ambiante, puis lavées 5 fois par du tampon de lavage consistant en un tampon phosphate 0,01 M, pH
7,4, contenant 0,05% de Tween® 20 (étape D de la figure 3) .
Puis, on ajoute, dans chaque puits, 100 μl d'un tampon borate 0,1 M (pH 9) et 10 μl d'une solution de subérate de disuccinimidyle (DSS) à 10 mg/ml dans du DMF. Les plaques sont agitées pendant 15 minutes à température ambiante, puis lavées 5 fois par le tampon de lavage (étape E de la figure 3) .
On dépose alors, dans chaque puits, 150 μl de NaOH IN que l'on laisse agir 5 minutes à température ambiante. A l'issue de quoi, les plaques sont lavées 5 fois par le tampon de lavage (étape F de la figure 3) .
On introduit, dans chaque puits, 100 μl d'une solution du conjugué His-76/AChE à une unité
Ellman/ml et les plaques sont agitées pendant 1 heure à température ambiante, puis lavées 5 fois par le tampon de lavage (étape G de la figure 3) . Pour mesurer la quantité du conjugué s 'étant fixé sur la phase solide, on procède comme dans l'exemple 1, la mesure de la densité optique (DO) à 414 nm étant réalisée après 30 minutes ou 1 heure de réaction enzymatique.
A partir des valeurs de DO ainsi obtenues, on détermine, pour chaque milieu réactionnel, sa concentration en composé Z, par référence à une gamme étalon, puis le rendement de la réaction de Sonogashira par la même formule que celle utilisée dans l'exemple 1 ci-avant.
2) Résultats :
A titre illustratif, une partie des résultats est présentée sur la figure 4, sous la forme d'une matrice dans laquelle les rendements reactionnels
(exprimés en %) sont symbolisés par des ronds allant du blanc au gris foncé, selon qu'ils sont compris entre 0 et 10%, entre 10 et 20%, entre 20 et 30%, entre 30 et 40% ou entre 40 et 50%.
Ces ronds sont répartis sur 8 lignes qui correspondent pour la première, à l'absence de complexe métallique M (ligne MO) et pour les 7 autres, à l'un des complexes métalliques Ml à M7, et sur 24 colonnes qui correspondent pour la première, à l'absence de ligand L (colonne L0) et pour les 23 autres, aux ligands Ll à L23.
Les résultats présentés sur la figure 4 sont ceux obtenus en utilisant le DMF comme solvant, la DIEA comme base, l'iodure de cuivre comme sel de cuivre, 2% de métal M et 4% de ligand L. On peut remarquer à la lumière de ces résultats que deux ligands (L12 et L19) s'avèrent les plus efficaces lorsqu'ils sont combinés au palladium.
BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend les étapes suivantes : i) faire réagir ensemble au moins deux composés :
• un premier composé de formule Ei-Xi-Gi dans laquelle Gi représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur, tandis que Ei représente le reste d'une première molécule Mi pour laquelle on dispose d'un premier anticorps ACi spécifique, et
• un deuxième composé de formule E2-X2 _G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, tandis que E2 représente, soit le reste d'une deuxième molécule M2 différente de Mi et pour laquelle on dispose d'un deuxième anticorps AC2 spécifique, soit un groupe apte à former au moins une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage ; lesdits au moins deux composés étant mis à réagir en solution dans un solvant et dans des conditions opératoires prédéterminées dont l'une au moins est une condition opératoire candidate, pour obtenir un milieu réactionnel et la formation dans ce milieu d'un composé Z comprenant l'enchaînement E1-X1-G1-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; ii) déterminer la concentration en composé
Z du milieu réactionnel à un temps t de réaction prédéterminé, par au moins un dosage immunologique utilisant au moins l'anticorps ACi ; et iii) évaluer les effets de la ou des conditions opératoires candidates sur ladite réaction de couplage à l'aide de la concentration en composé Z ainsi déterminée.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la réaction de couplage est choisie dans le groupe constitué par les réactions d'estérification, les réactions d'amidification, les réactions d' aldolisation et de nitro-aldolisation, la réaction de Heck, la réaction de Baylis-Hillman, la réaction de Michael, les réactions de métathèse, la réaction de Diels-Alder, la réaction de Sonogashira, la réaction de Suzuki, la réaction de Kumada, la réaction de Stille, la réaction de Hiyama, la réaction de Liebeskind-Srogl, la réaction de Mannich, la réaction de Hantzsch, la réaction de Bossio et al . , la réaction de Ugi et leurs variantes .
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel Ei ou E2 représente le reste de l'histamine.
. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel Ei ou E2 représente le reste de l'acide homovanillique.
5. Procédé selon la revendication 3, dans lequel Ei ou E2 répond à la formule (III) ci-après :
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel Ei ou E2 répond à la formule (IV) ci-après :
(iv)
dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement protecteur.
7. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel E2 représente un groupe choisi parmi les groupes aminé, acide carboxylique, aldéhyde, thiol, phénol, alkényle, azoture et les groupes photo-activables .
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel E2 représente un groupe aminé ou thiol.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ledit au moins un dosage immunologique du composé Z est un dosage en phase solide.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications l à 6, dans lequel, E2 correspondant au reste d'une molécule M2, l'étape ii) comprend les étapes suivantes : ai) mettre le milieu réactionnel obtenu au temps t de réaction en contact avec une phase solide sur laquelle est immobilisé le premier anticorps ACi, pour obtenir la fixation du composé Z sur cette phase solide par liaison immunologique entre cet anticorps et le reste Ei de ce composé ; bi) mettre la phase solide en contact avec un conjugué comprenant le deuxième anticorps AC2 couplé à un marqueur, pour obtenir la fixation de ce conjugué sur cette phase solide par liaison immunologique entre le deuxième anticorps AC2 et le reste E2 du composé Z fixé sur ladite phase solide ;
Ci) mesurer la quantité de conjugué fixé sur la phase solide à l'aide du marqueur couplé à
1 ' anticorps AC2 ; et di) déterminer sur une gamme d'étalonnage la concentration en composé Z du milieu réactionnel audit temps t. à partir de la quantité de conjugué ainsi mesurée ; ladite étape ii) comprenant, de plus, une ou plusieurs opérations de lavage de la phase solide entre les étapes ai) et bi) , et entre les étapes bi) et ci) .
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 7 ou 8, dans lequel, E2 correspondant à un groupe apte à former au moins une liaison covalente avec le premier anticorps ACi, l'étape ii) comprend les étapes suivantes : a2) mettre le milieu réactionnel obtenu au temps t de réaction en contact avec une phase solide sur laquelle est immobilisé le premier anticorps ACi, pour obtenir la fixation du composé Z sur cette phase solide par liaison immunologique entre cet anticorps et le reste Ei de ce composé ; 2) faire réagir un agent de couplage avec le premier anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et le groupe E2 du composé Z fixé sur cette phase solide, pour obtenir la formation d'une ou plusieurs liaisons covalentes entre cet anticorps et ce groupe ; C2) dénaturer la liaison immunologique existant entre le premier anticorps ACi immobilisé sur la phase solide et le reste E2 du composé Z fixé sur cette phase solide, pour libérer ce reste de cette phase solide ; d2) mettre la phase solide en contact avec un conjugué comprenant le premier anticorps ACi couplé à un marqueur, pour obtenir la fixation de ce conjugué sur cette phase solide par liaison immunologique entre ledit anticorps et le reste Ei du composé E1-X-G1G2-Y-E2 ainsi libéré ; e2) mesurer la quantité de conjugué fixé sur la phase solide à l'aide du marqueur couplé à 1 ' anticorps ACi ; et f∑) déterminer sur une gamme d'étalonnage la concentration en composé Z du milieu réactionnel audit temps t à partir de la quantité de conjugué ainsi mesurée ; ladite étape ii) comprenant, de plus, une ou plusieurs opérations de lavage de la phase solide entre les étapes a2) et b2) , b2) et c2) , C2 et d2) , et entre les étapes d2) et e∑) •
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier anticorps ACi est un anticorps monoclonal.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ou 10, dans lequel le deuxième anticorps AC2 est un anticorps monoclonal.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la phase solide est la paroi d'un puits d'une plaque de microtitration sur laquelle est adsorbé le premier anticorps ACi.
15. Procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, dans lequel le marqueur est une enzyme, de préférence, 1 ' acétylcholine estérase.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, qui comprend une opération de dilution du milieu réactionnel entre les étapes i) et ii) .
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on détermine le rendement de la réaction de couplage à partir de la concentration en composé Z du milieu réactionnel.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la réaction de couplage consiste à coupler 2, 3 ou 4 groupements fonctionnels .
19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel la réaction de couplage consiste à coupler deux groupements fonctionnels Gi et G2, et dans lequel :
— à l'étape i) , on fait réagir ensemble les composés de formules E1-X1-G1 et E2-X2-G2 pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z qui répond à la formule Eι-Xι-Gι-G2-X2-E2 dans laquelle Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment et G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage entre lesdits groupements fonctionnels Gi et G2 ; tandis que — à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par un seul dosage immunologique.
20. Procédé selon la revendication 18, dans lequel la réaction de couplage consiste à coupler trois groupements fonctionnels Gi, G2 et G3, et dans lequel :
— à l'étape i) , on fait réagir les composés de formules E1-X3.-G1 et E2-X2-G2 avec un troisième composé de formule E3-X3-G3 dans laquelle X3 représente une liaison covalente ou un troisième groupe espaceur, identique ou différent de Xi et/ou de X2, tandis que E3 représente, soit le reste d'une troisième molécule M3 différente de Mi et de M2 et pour laquelle on dispose d'un troisième anticorps AC3 spécifique, soit un groupe apte à former une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage à condition toutefois que E2 ne représente pas déjà un tel groupe, pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z répondant à l'une des formules ci- après :
dans lesquelles Xi, X2, X3, Ei, E2 et E3 ont la même signification que précédemment et
représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits groupements fonctionnels Gi, G2 et G3 ; tandis que
— à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par deux dosages immunologiques différents.
21. Procédé selon la revendication 18, dans lequel la réaction de couplage consiste à coupler quatre groupements fonctionnels Gi, G2, G3 et G4, et dans lequel :
— à l'étape i) , on fait réagir les composés de formule E1-X1-G1 et E2-X2-G2 avec un troisième composé de formule E3-X3-G3 telle que précédemment définie et un quatrième composé de formule E4-X4-G4 dans laquelle X représente une liaison covalente ou un quatrième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, X2 et/ou X3, tandis que E4 représente soit le reste d'une troisième molécule M différente de Mi, de M2 et de M3 et pour laquelle on dispose d'un quatrième anticorps AC4 spécifique, soit un groupe apte à former une liaison covalente avec l'anticorps ACi en présence d'un agent de couplage à la condition toutefois que E2 et E3 ne représentent pas déjà un tel groupe, pour obtenir la formation dans le milieu réactionnel d'un composé Z répondant à l'une des formules ci-après :
dans lesquelles Xi, X2, X3, X4, Ei, E2, E3 et E4 ont la même signification que précédemment et
représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits groupements fonctionnels Gi, G2, G3 et G4 ; tandis que
— à l'étape ii) , la concentration en composé Z du milieu réactionnel est déterminée par trois dosages immunologiques différents.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la ou les conditions opératoires candidates sont choisies dans le groupe constitué par les solvants, les catalyseurs, les niveaux de température, les niveaux de pression, l'utilisation d'ultrasons, les concentrations, les rapports stœchiometriques, les durées de réaction et leurs combinaisons.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la ou les conditions opératoires candidates sont des catalyseurs.
24. Trousse ou "kit" pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend des quantités appropriées : - d'au moins deux composés destinés à réagir ensemble :
• un premier composé de formule E1-X1-G1 dans laquelle Gx représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur et Ei représente le reste d'une première molécule Mi ; et
• un deuxième composé de formule E2-X2-G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xχr et E2 représente le reste d'une deuxième molécule M2 différente de Mi ;
- d'au moins deux anticorps : ° un premier anticorps ACi spécifique de la première molécule Mi, cet anticorps étant éventuellement fixé sur une pluralité de phases solides ; et
• un deuxième anticorps AC2 spécifique de la deuxième molécule M2, cet anticorps étant couplé à un marqueur ;
— d'un composé Z comprenant l'enchaînement E1-X1-G1-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; et éventuellement :
- d'un réactif de révélation du marqueur, par exemple un substrat si le marqueur est une enzyme ; et
— de tampons convenablement choisis.
25. Trousse ou "kit" pour la mise en œuvre d'un procédé de criblage de conditions opératoires d'une réaction de couplage d'au moins deux groupements fonctionnels, qui comprend des quantités appropriées :
— d'au moins deux composés destinés à réagir ensemble :
• un premier composé de formule Ei-Xi-Gi dans laquelle Gi représente un premier desdits au moins deux groupements fonctionnels, Xi représente une liaison covalente ou un premier groupe espaceur et Ei représente le reste d'une première molécule Mi ; et
• un deuxième composé de formule E2-X2_G2 dans laquelle G2 représente un deuxième desdits au moins deux groupements fonctionnels, X2 représente une liaison covalente ou un deuxième groupe espaceur, identique ou différent de Xi, et E2 représente un groupe apte à former une ou plusieurs liaisons covalentes avec un anticorps spécifique de la molécule Mi en présence d'un agent de couplage ;
— d'au moins un anticorps, cet anticorps étant ledit anticorps spécifique de la molécule Mi ;
— d'un conjugué comprenant ledit anticorps spécifique de la molécule Mi couplé à un marqueur ; - d'un composé Z comprenant l'enchaînement
E1-X1-G1-G2-X2-E2 dans lequel Xi, X2, Ei et E2 ont la même signification que précédemment, tandis que G1-G2 représente le groupe d'atomes résultant du couplage desdits au moins deux groupements fonctionnels ; et éventuellement :
— d'un réactif de révélation du marqueur, — d'un agent de couplage,
— d'un réactif apte à dénaturer une liaison immunologique, et
— de tampons convenablement choisis.
26. Utilisation d'un procédé de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 ou d'une trousse ou "kit" selon la revendication 24 ou la revendication 25, pour le criblage, en particulier à "haut débit", de catalyseurs utiles dans une réaction de couplage entre deux groupements fonctionnels.
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