EP1583560A1 - Composition pour le transport intracellulaire de macromolecules ou particules biologiques - Google Patents

Composition pour le transport intracellulaire de macromolecules ou particules biologiques

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EP1583560A1
EP1583560A1 EP03815710A EP03815710A EP1583560A1 EP 1583560 A1 EP1583560 A1 EP 1583560A1 EP 03815710 A EP03815710 A EP 03815710A EP 03815710 A EP03815710 A EP 03815710A EP 1583560 A1 EP1583560 A1 EP 1583560A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
cargo
transducing
composition
peptides
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03815710A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Alain Prochiantz
Edmond Dupont
Alain Joliot
Alain Trembleau
Michel Volovitch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Normale Superieure
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Normale Superieure filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1583560A1 publication Critical patent/EP1583560A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to new means of intracellular transfer of macromolecules or particles of interest.
  • polynucleotides into cells are currently essentially based on transfection techniques (calcium phosphate, electroporation), lipofection (liposomes, charged lipids) or viral infection (lentivirus, adenovirus, l virus). herpes, etc.) or on the use of nanoparticles.
  • transducing peptides More recently, it has been proposed to use transducing peptides.
  • This term denotes peptides comprising, or constituted by, a sequence called
  • transduction domain conferring on them the capacity to penetrate inside a living cell, independently of the presence of specific transporters or receptors.
  • Review articles concerning transducer peptides have been published recently by LIDGREN et al. ,
  • transducing peptides there may be mentioned in particular:
  • penetratins which are peptides derived from the third helix of a homeodomain; peptides of the penetratins family are described for example in the publications of JOLIOT et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1864-1868, (1991); DEROSSI et al. J. Biol. Chem. , 269, 14, 10444-10450, (1994); BRUGIDOU et al. Biophys. Biochem. Res. Co.
  • peptides derived from the HS22 protein VP22 are described for example by ELLIOTT and O'HARE Cell, 88, 223-233, (1997); peptides derived from a signal sequence conjugated to a nuclear localization sequence; such peptides are described for example by LIN et al. J. Biol. Chem., 270, 14255-14258, (1995); J. Biol. Chem., 271, 5305-5308, (1996), LIU et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11819-11824, (1996), MORRIS et al.
  • the transducing peptides can import into living cells, in particular animal cells, molecules or molecular complexes of varied nature (acids nucleic acids, proteins, peptides / nucleic acids, nucleotide analogs, liposomes).
  • EGUCHI et al. (J. Biol. Chem., 276, 28, 26204- 26210, 2001) constructed recombinant ⁇ phages expressing on their surface a chimeric protein comprising the TAT transducer peptide fused to the N-terminal end of the phage protein D , and containing a marker gene. They observed, after incubation of these phages with COS-1 cells in culture, an intracellular expression of the marker gene in a proportion of these cells of up to 30%.
  • transducer peptides such as the penetratins or the TAT peptides, lies in the need to couple by covalent bond (s) the transducer peptide and the cargo .
  • MPG peptides designed to bind by ionic or hydrophobic interactions either with nucleic acids or with proteins.
  • MPG is intended for the intracellular transport of nucleic acids
  • the other called Pep-1 (MORRIS et al., Nature
  • Biotech, 19, 1173-1176, 2001 is intended for the transport of proteins. It differs from MPG in the nature of the N-terminal hydrophobic region, which consists of a sequence rich in tryptophan, intended to allow addressing to the cell membrane and the formation of hydrophobic interactions with proteins.
  • peptides of 16 to 30 amino acids comprising two distinct successive domains: a hydrophobic domain, containing 3 to 5 tryptophan residues including at least one Trp-Trp pair, alternating with glutamic acid and threonine residues; a hydrophilic domain containing 4 or 5 consecutive basic residues (lysine or arginine), these two domains being optionally separated by a spacer domain containing a proline residue or a glutamine residue. Effective importation was only observed, however, in the case of peptides additionally carrying a cysteamine group.
  • the inventors have evaluated the capacity of these peptides to import cargoes of large size. For this purpose, they tested one of these peptides, using a ⁇ phage as cargo. They then found not only that this peptide was capable of importing the phage into an animal cell, but also that, contrary to what was previously assumed, the importation could be carried out without it being necessary to couple the peptide and the phage by covalent bond. In addition, the inventors found that the efficiency of this import was much higher than that observed by EGUCHI et al. with the transducing peptide TAT coupled by peptide bond to the N-terminus of protein D of phage ⁇ .
  • the penetratins have a transduction domain capable of adopting a secondary structure (in helix ⁇ or in ⁇ sheet) amphiphilic, having a face having hydrophobic residues, and a charged face comprising a tryptophan residue framed by 2 basic residues ensuring the interaction with the membranes and the formation of a reverse micelle allowing 1 ' internalization of the peptide in the cell.
  • the Ile, Trp, Phe residues at positions 3, 14, and 7 of the peptide sequence form in the ⁇ -helix a hydrophobic triplet; this hydrophobic triplet is distant from the charged zone constituted by the Lys residues (position 13 of the peptide sequence) and Arg
  • the subject of the present invention is a process for preparing a composition making it possible to introduce into a living cell, in particular a eukaryotic cell, and in particular an animal cell, a cargo ship constituted by a macromolecule or a molecular assembly (for example a particle), of size less than or equal to about 1 ⁇ in its largest dimension, said cargo having on its surface one or more hydrophobic domains, which method is characterized in that it comprises the adsorption on said hydrophobic domain (s), of at least one transducing peptide, with the exception of peptides described in PCT Application WO 02/10201.
  • said cargo is a protein or a particle having a surface of protein nature. It is also possible to use liposomes, nanoparticles, glycolipids, or any natural or artificial macromolecular combination as cargo.
  • said cargo is generally of size less than or equal to 500 nm in its largest dimension.
  • said transducing peptide is a peptide from the family of penetratins.
  • peptide of the penetratins family any peptide comprising a transduction domain capable of adopting an amphiphilic secondary structure (in ⁇ helix or in ⁇ sheet) having a face comprising hydrophobic residues allowing interaction with the cargo ship , and a face allowing interaction with the membranes, comprising a tryptophan residue surrounded by basic residues.
  • Fields of transduction which are particularly preferred for the implementation of the present invention are those in which X ⁇ o and X ⁇ 3 are basic amino acids.
  • penetratin derivatives for example some of the truncated or substituted penetratins described in PCT Application WO 00/01417, or PCT Application WO 00/29427. It is also possible to use a transducer peptide comprising, in addition to the transduction domain, one or more other functional domains; by way of example, mention will be made of the peptides comprising a transduction domain and a nuclear export sequence described in PCT application WO 02/39947.
  • the adsorption of the transducing peptide is carried out in a simple manner, by incubation for at least 15 minutes, preferably for 30 to 60 minutes, of said transducing peptide with the cargo.
  • Incubation can be carried out ex vivo or in vivo, in a very wide range of temperatures, generally between 15 and 40 ° C. It will preferably be carried out at ambient temperature, that is to say around 20 to 25 ° C, or at physiological temperatures (around 37 ° C), in a medium with neutral pH; it can be for example a culture medium for cells, or a NaCl solution (9 g / 1).
  • the transducer peptide / cargo molar ratio in the incubation medium depends in particular on the size of the cargo vessel, for example, in the case of a bacteriophage, a molar ratio corresponding to 1,000 to 500,000 peptide molecules per bacteriophage can be used.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising a freighter on the surface of which a transducer peptide is adsorbed, capable of being obtained by the process according to the invention.
  • the compositions according to the invention can be used immediately after their preparation; where appropriate, they can also be stored for at least 3 days in the incubation medium, at temperatures between approximately 4 ° C. and 37 ° C.
  • the present invention also relates to the use of compositions in accordance with the invention for introducing a cargo ship, as defined above, into a living cell.
  • the present invention thus relates to a method for introducing a cargo ship into a living cell, characterized in that it comprises bringing said cell into contact with a composition according to the invention comprising said cargo ship.
  • the process according to the invention can be carried out on cells in culture, by adding to the culture a composition according to the invention, and incubation for 1 to 14 hours, preferably for 2 to 6 hours.
  • the composition in accordance with the invention is used at a rate of 10,000 to 20,000 cargo / peptide transducer complexes per cell.
  • the process according to the invention can also be implemented in vivo, for example by injecting a composition according to the invention into an animal.
  • a subject of the present invention is also the use of a composition in accordance with the invention for obtaining a medicament, and in particular as a carrier of an active principle consisting of the cargo or contained in it .
  • the present invention has the advantage of making it possible to introduce into living cells any hydrophobic cargo ship or the surface of which has at least one hydrophobic domain, without it being necessary to carry out prior coupling by covalent bond between the cargo ship and the transducer peptide.
  • the present invention is of particular interest for introducing into cells living viral or pseudoviral particles, in particular bacteriophages, containing polynucleotides of interest which it is desired to express in said cells.
  • compositions in accordance with the invention from phage libraries containing polynucleotides coding for various polypeptides capable of modifying the behavior of certain cells (migration, proliferation, differentiation, etc.), and to use these compositions for bring these phage banks into tissues, in culture or in vivo, and identify regulatory sequences for these behaviors.
  • Lambda-ZAP-GFP and Lambda-ZAP-En2 allowed the infection of competent bacteria (strain
  • XLlBlue-MRF ', STRATAGENE XLlBlue-MRF ', STRATAGENE
  • the phagemids internal to the genomes of the recombinant Lambda phages were automatically excised by co-infection of XL1Blue-MRF 'bacteria with an auxiliary phage (ExAssist, STRATAGENE). After culture in a liquid medium, the bacteria still alive and the Lambda virions are destroyed by heating, and the recombinant filamentous phages are recovered.
  • the plasmid forms of these recombinant phagemids are recovered after infection of non-permissive bacteria for the replication of the filamentous phage (strain SOLR, STRATAGENE), and the functional integrity of the excised plasmids is verified by electroporation in COS cells. After this verification, the recombinant Lambda phages are amplified to reach a titer of at least 10 11 particles per ml, then concentrated with PEG, dialyzed against PBS supplemented with Ca ++ and Mg ++ , and stored at 4 ° C. .
  • the transducing peptide used is a penetatin of sequence:
  • RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1) corresponding to helix 3 of the peptide pAntp
  • biotinylated penetatin is mixed with the recombinant phages, at a rate of 10 ⁇ g of peptide for 10 9 phage particles, in 50 to 100 ⁇ l of appropriate medium (DMEM / F12 medium (1: 1) or PBS-Dulbecco). The mixture is incubated at room temperature for 30 min.
  • EXAMPLE 2 INTRODUCTION OF PHAGES IN CULTIVATED CELLS
  • the cells used are dog kidney epithelial cells (MDCK).
  • the phages used are marked with fluorochrome
  • Cy3 (AMERSHAM) by covalent linkage of fluorochrome to capsid proteins, according to the manufacturer's instructions. They are then incubated in the presence of penetatin, as described in Example 1 above. As a negative control, phages labeled with fluorochrome Cy3 are used, incubated under the same conditions in the absence of penetatin.
  • the phage / penetatin preparation, or the control preparation is added to the cell culture or suspension medium (depending on whether the treated cells have already been seeded or whether they have just been dissociated) at the rate of 10,000 phages / cell, and left in contact with cells for 4 hours.
  • the cells are then washed and re-cultured in fresh medium, then fixed in 4% parafor aldehyde in PBS for 10 min at room temperature, rinsed in PBS and mounted in mounting medium for DAKO fluorescent specimens containing l ⁇ g / ml of DAPI
  • Figure 1 A control preparation with phage without penetatin
  • Figure 1 B phage / penetatin preparation
  • recombinant phages expressing GFP are administered to adult mice by infusion into the lateral ventricle of the brain.
  • the phages (6.5.10 8 pfu / ⁇ l solution) are dialyzed against 0.9% NaCl containing 10 M MgCl2 (for phage stability) at 4 ° C overnight.
  • the phage / penetatin mixture is produced: 70 ⁇ l of the dialysis phage solution against 0.9% NaCl (i.e. 6.5.10 10 pfu) + 3 ⁇ l of 9% Nacl + 27 ⁇ l of the stock solution of penetrine (i.e. 162 ⁇ g), or approximately 5 x 10 5 molecules of penetrine per phage particle.
  • AZET 1003D osmotic micro-pump
  • the entire micro-pump is immersed in 0.9% NaCl at 37 ° C for 4 hours in order to initiate the flow.
  • the pumps are placed in a subcutaneous pocket at the scapular region of the animal, and the cannula implanted in the lateral ventricle of the brain according to the following stereotaxic coordinates: lateral 0.8 mm, anteroposterior 0mm, dorso- ventral 2mm with respect to the Bregma of the skull taken as the origin of the coordinates.
  • the infusion is carried out for three days at a flow rate of I ⁇ l / hour.
  • the infused animals are then euthanized by anesthesia followed by an intracardiac perfusion of paraformaldehyde 4% in PBS; brains are removed and post-fixed overnight at 4 ° C in this fixative. The next day, they are cut with vibrato and into 50 ⁇ m thick frontal sections.
  • the sections are either observed immediately after mounting in mounting medium (DAKO + DAPI) in the case of direct fluorescence (GFP or CY3), or used for the immunodetection of the expressed heterologous protein by phage (in the case of phage expressing GFP or En2). Penetatin is detected by streptavidin coupled to fluorochrome Cy3 (IMMUNOTECH)
  • the sections are preincubated for approximately one hour in PBS buffer 5% SVF 0.25% Triton X-100 (PBST) at room temperature.
  • the antibodies are diluted in the same buffer, at 1/5000 for the anti-En2 polyclonal antibody, and at
  • the fluorescent streptavidin is diluted to 1 / 500th in the
  • FIGS. 2 A and 2 B represent markings on front sections 50 ⁇ m thick.
  • Figure 2A Detection of phage cy3 in the cerebral parenchyma of an adult mouse after infusion of the penetatin / phage mixture into the lateral ventricle.
  • Figure 2B Detection of GFP fluorescence in the cerebral parenchyma of an adult mouse after infusion of the penetatin / GFP phage mixture in the lateral ventricle
  • Figure 3 Co-localization of the engrailed 2 protein and penetatin in the brain parenchyma of an adult mouse after infusion of the penetatin / phage mixture coding for En 2.
  • Figure 3A Immunodetection of the Engrailed 2 protein encoded by the phage
  • Figure 3 B detection on the same section of penetatin using fluorescent streptavidin
  • Figures 3 D and 3 E are enlargements of Figures 3 A and 3 B respectively

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Abstract

L'invention concerne une composition comprenant une macromolécule ou une particule présentant à; sa surface un ou plusieurs domaines hydrophobes, sur le(s)quel(s) est adsorbé au moins un peptide transducteur. Cette composition est utilisable pour introduire ladite macromolécule ou particule dans des cellules vivantes.

Description

COMPOSITION POUR LE TRANSPORT INTRACELLULAIRE DE MACROMOLECULES OU PARTICULES BIOLOGIQUES.
La présente invention est relative à de nouveaux moyens de transfert intracellulaire de macromolécules ou de particules d'intérêt.
L'importation de macromolécules, et notamment de polynucléotides ou de protéines, dans des cellules animales vivantes constitue une approche de base, aussi bien pour la recherche fondamentale que dans le cadre de diverses applications, par exemple en thérapie génique.
L'une des difficultés majeures de cette approche résulte de la nécessité de transporter ces macromolécules à travers la membrane cellulaire.
Ce problème a fait l'objet de nombreuses recherches, qui ont abouti à la mise au point de différentes méthodes de transfert intracellulaire et de différents types de vecteurs.
Ainsi, l'introduction de polynucléotides dans les cellules repose actuellement pour l'essentiel sur des techniques de transfection (phosphate de calcium, électroporation) , de lipofection (liposomes, lipides chargés) ou d'infection virale (lentivirus, adénovirus, virus de l'herpès, etc.) ou sur l'utilisation de nanoparticules .
Plus récemment, il a été proposé d'utiliser des peptides transducteurs. On désigne sous ce terme des peptides comprenant, ou constitués par, une séquence dénommée
" domaine de transduction " leur conférant la capacité de pénétrer à l'intérieur d'une cellule vivante, indépendamment de la présence de transporteurs ou de récepteurs spécifiques. Des articles de revue concernant les peptides transducteurs ont été publiés récemment par LIDGREN et al . ,
TiPS, 21, 99-102, (2000) ; SCHWARZE et DOWDY TiPS, 21, 45-48,
(2000) ; SCHWARZE et al . Trends Cell. Bάol., 10, 290-295,
(2000) ; PROCHIANTZ Current Opinion in Cell Biology, 12, 400- 406, (2000) ; Cell-Penetrating Peptides. Processes and applications. Ed. Ulo Langel. CRC Press (2002). A titre d'exemples de peptides transducteurs, on citera en particulier :
- les pénétratines, qui sont des peptides dérivés de la troisième hélice d'un homéodomaine ; des peptides de la famille des pénétratines sont décrits par exemple dans les publications de JOLIOT et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1864-1868, (1991) ; DEROSSI et al . J. Biol. Chem. , 269, 14, 10444-10450, (1994) ; BRUGIDOU et al . Biophys . Biochem. Res. Co . , 214, 685-693, (1995), ainsi que dans le Brevet US 5888762, le Brevet US 6080724, ou la Demande PCT WO 00/01417 ; les peptides dérivés de la protéine Tat de HIVl, et en particulier du fragment 48-60 de ladite protéine ; de tels peptides sont décrits par exemple par FAWELL et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, 664-668, (1994) ou par VIVES et al . J. Biol. Chem., 272, 16010-16017,
(1997) .
- les peptides dérivés de la protéine VP22 de HSV ; de tels peptides sont décrits par exemple par ELLIOTT et O'HARE Cell, 88, 223-233, (1997) ; des peptides dérivés d'une séquence signal conjuguée à une séquence de localisation nucléaire ; de tels peptides sont décrits par exemple par LIN et al . J. Biol. Chem., 270, 14255-14258, (1995) ; J. Biol. Chem., 271, 5305- 5308, (1996), LIU et al . Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11819-11824, (1996), MORRIS et al . Nucleic Acids Res., 25, 2730-2736, (1997), CHALOIN et al . Biochemistry, 36, 11179- 11187, (1997) ; Biochem. Biophys. Res. Commun., 243, 601-608, (1998), ZHANG et al . Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9184- 9189, (1998) ;
- les transportanes qui sont dérivés d'une fusion entre une portion d'un neuropeptide, la galanine, et un peptide du venin de guêpe POOGA et al . , FASEB J. , 12, 67-77,
(1998) ; Ann. New York Acad. Sci., 863, 450-453, (1998). Les peptides transducteurs peuvent importer dans des cellules vivantes, notamment des cellules animales, des molécules ou complexes moléculaires de nature variée (acides nucléiques, protéines, peptides/acides nucléiques, analogues de nucléotides, liposomes) .
Ces molécules ou complexes moléculaires sont habituellement désignés sous le terme général de " cargos ". II a été rapporté que certains peptides transducteurs pouvaient importer des cargos de taille importante.
Ainsi, LEWIN et al. (Nat. Biotech, 18, 410-414, 2000) ont conjugué un dérivé du peptide transducteur TAT 48- 60 à des nanoparticules constituées d'un noyau d'oxyde de fer enrobé d'une enveloppe de dextrane, et ont observé que les nanoparticules ainsi modifiées (de diamètre 45 nm) étaient importées dans des cellules vivantes .
EGUCHI et al. (J. Biol. Chem., 276, 28, 26204- 26210, 2001) ont construit des phages λ recombinants exprimant à leur surface une protéine chimérique comprenant le peptide transducteur TAT fusionné à l'extrémité N- terminale de la protéine D du phage, et contenant un gène marqueur. Ils ont observé, après incubation de ces phages avec des cellules COS-1 en culture, une expression intracellulaire du gène marqueur dans une proportion de ces cellules pouvant aller jusqu'à 30%.
Il est toutefois généralement considéré que l'une des limitations majeures des peptides transducteurs mentionnés ci-dessus, tels que les pénétratines ou les peptides TAT, réside dans la nécessité de coupler par liaison (s) covalente(s) le peptide transducteur et le cargo.
Dans le but de s'affranchir de cette limitation, des peptides conçus pour se lier par interactions ioniques ou hydrophobes soit avec des acides nucléiques soit avec des protéines, ont été construits. L'un de ces peptides, dénommé MPG, est destiné au transport intracellulaire d'acides nucléiques (MORRIS et al., Nucl . Acids Res., 2730-2736, 1997 ; Nucl. Acids Res., 3510-3517, 1999) ; il comprend deux régions distinctes, séparés par un peptide de liaison : une région hydrophobe N-terminale dérivée de la séquence signal riche en glycine de la protéine gp41 de HIV1, permettant la fusion avec la membrane cellulaire, et une région hydrophile dérivée de la séquence de localisation nucléaire de l'antigène T de SV40, permettant l'interaction du peptide avec l'acide nucléique, et son adressage nucléaire. L'autre, dénommé Pep-1 (MORRIS et al., Nature
Biotech, 19, 1173-1176, 2001) est destiné au transport de protéines. Il diffère de MPG par la nature de la région hydrophobe N-terminale, qui est constituée par une séquence riche en tryptophane, destinée à permettre l'adressage à la membrane cellulaire et la formation d'interactions hydrophobes avec les protéines.
Ces deux types de peptides sont également décrits dans la demande PCT WO 02/10201, qui propose, de manière générale, d'utiliser pour importer des protéines dans des cellules vivantes des peptides de 16 à 30 acides aminés comprenant deux domaines successifs distincts : un domaine hydrophobe, contenant 3 à 5 résidus tryptophane dont au moins une paire Trp-Trp, alternant avec des résidus acide glutamique et thréonine ; un domaine hydrophile contenant 4 ou 5 résidus basiques (lysine ou arginine) consécutifs, ces deux domaines étant éventuellement séparés par un domaine espaceur contenant un résidu proline ou un résidu glutamine. Une importation efficace n'a été toutefois observée que dans le cas des peptides portant en outre un groupe cystéamine. Par ailleurs, dans le cadre de travaux sur les propriétés des peptides transducteurs de la famille des pénétratines les Inventeurs ont évalué la capacité de ces peptides à importer des cargos de taille importante. Dans ce but, ils ont testé l'un de ces peptides, en utilisant comme cargo un phage λ. Ils ont alors constaté non seulement que ce peptide était capable d' importer le phage dans une cellule animale, mais encore que, contrairement à ce que l'on supposait jusqu'à présent, l'importation pouvait s'effectuer sans qu'il soit nécessaire de coupler le peptide et le phage par liaison covalente. En outre les Inventeurs ont constaté que l'efficacité de cette importation était bien supérieure à celle observée par EGUCHI et al. avec le peptide transducteur TAT couplé par liaison peptidique à l'extrémité N-terminale de la protéine D du phage λ.
Pour expliquer ces résultats, surprenants au vu de la différence de structure entre les pénétratines et les peptides de la Demande PCT WO 02/10201, les Inventeurs proposent l'hypothèse suivante : les pénétratines ont un domaine de transduction capable d'adopter une structure secondaire (en hélice α ou en feuillet β) amphiphile, possédant une face présentant des résidus hydrophobes, et une face chargée comprenant un résidu tryptophane encadré par 2 résidus basiques assurant l'interaction avec les membranes et la formation d'une micelle inverse permettant 1' internalisation du peptide dans la cellule. Par exemple, dans le cas de la pénétratine-type pANTP, les résidus Ile, Trp, Phe en positions 3, 14, et 7 de la séquence peptidique, forment dans l'hélice α un triplet hydrophobe ; ce triplet hydrophobe est distant de la zone chargée constituée par les résidus Lys (position 13 de la séquence peptidique) et Arg
(position 10 de la séquence peptidique), qui dans l'hélice α encadrent le résidu Trp en position 6 de la séquence peptidique (DEROSSI et al. J. Biol. Chem, 271, p 18188-18193, 1996) .
Il est supposé que la face hydrophobe du domaine de transduction permet la formation d' interactions de force suffisante pour assurer une fixation stable du peptide transducteur au cargo. L'interaction avec la membrane se ferait par la face chargée du domaine de transduction ; le Trp encadré par deux acides aminés chargés peut s'insérer dans la membrane, (cette insertion a été observée par des études de fluorescence du tryptophane) , la déstabilisant et permettant le passage du vecteur et de son cargo.
La présente invention a pour objet un procédé pour préparer une composition permettant d'introduire dans une cellule vivante, en particulier une cellule eucaryote, et notamment une cellule animale, un cargo constitué par une macromolécule ou un assemblage moléculaire (par exemple une particule) , de taille inférieure ou égale à environ 1 μ dans sa plus grande dimension, ledit cargo présentant à sa surface un ou plusieurs domaines hydrophobes, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend l'adsorption sur le ou lesdits domaines hydrophobes, d'au moins un peptide transducteur, à l'exception des peptides décrits dans la Demande PCT WO 02/10201.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit cargo est une protéine ou une particule possédant une surface de nature protéique. II est également possible d'utiliser comme cargo des liposomes, des nanoparticules, des glycolipides, ou toute combinaison macromoléculaire naturelle ou artificielle.
Selon un autre mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit cargo est généralement de taille inférieure ou égale à 500 nm dans sa plus grande dimension.
Ceci englobe par exemple des particules virales ou pseudovirales, notamment des particules phagiques.
Selon encore un autre mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit peptide transducteur est un peptide de la famille des pénétratines.
On définit ici comme " peptide de la famille des pénétratines " tout peptide comprenant un domaine de transduction capable d'adopter une structure secondaire amphiphile (en hélice α ou en feuillet β) présentant une face comprenant des résidus hydrophobe permettant l'interaction avec le cargo, et une face permettant l'interaction avec les membranes, comprenant un résidu tryptophane encadré de résidus basiques.
Ceci englobe notamment les pénétratines décrites dans la demande PCT WO 00/01417, et plus particulièrement celles comprenant un domaine de transduction défini par l'une des formules ci-après :
Xl-X2-X3-X4~X5-X6~X7-X8-X9~Xl0~Xll-Xl2-Xl3-X-.4~Xl5_Xl6 ( I ) X;L6-Xl5~Xl4"'"Xl3~ l2-Xll-Xl0-X9~X8-X7-X6~ 5-X4- 3~ 2- --. ( là) dans laquelle X6 représente un résidu tryptophane, Xi, X2, X, X9, Xi5, Xi6, sont des acides aminés non-hydrophobes et X3, X, et Xχ, sont des acides aminés hydrophobes .
Des domaines de transduction particulièrement préférés pour la mise en œuvre de la présente invention sont ceux dans lesquels Xχo et Xχ3 sont des acides aminés basiques.
On peut également utiliser des dérivés de pénétratines, par exemple certaines des pénétratines tronquées ou substituées décrites dans la Demande PCT WO 00/01417, ou la Demande PCT WO 00/29427. On peut aussi utiliser un peptide transducteur comprenant, outre le domaine de transduction, un ou plusieurs autres domaines fonctionnels ; à titre d'exemple, on citera les peptides comprenant un domaine de transduction et une séquence d' export nucléaire décrits dans la Demande PCT WO 02/39947.
L'adsorption du peptide transducteur s'effectue de manière simple, par incubation pendant au moins 15 minutes, de préférence pendant 30 à 60 minutes, dudit peptide transducteur avec le cargo. L'incubation peut s'effectuer ex vivo ou in vivo, dans une gamme de températures très large, généralement comprise entre 15 et 40 °C. On opérera de préférence à température ambiante, c'est-à-dire aux environs de 20 à 25°C, ou aux températures physiologiques (aux environs de 37 °C), dans un milieu à pH neutre ; il peut s'agir par exemple d'un milieu de culture pour cellules, ou d'une solution de NaCl (9 g/1).
Le rapport molaire peptide transducteur/cargo dans le milieu d'incubation dépend notamment de la taille du cargo, par exemple, dans le cas d'un bacteriophage, on peut utiliser un rapport molaire correspondant à 1.000 à 500.000 molécules de peptide par bacteriophage.
La présente invention a également pour objet une composition comprenant un cargo à la surface duquel est adsorbé un peptide transducteur, susceptible d'être obtenue par le procédé conforme à l'invention. Les compositions conformes à l'invention peuvent être utilisées immédiatement après leur préparation ; le cas échéant, elles peuvent également être conservées pendant au moins 3 jours dans le milieu d'incubation, à des températures comprises entre 4°C et 37 °C environ.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de compositions conformes à l'invention pour introduire un cargo, tel que défini ci-dessus, dans une cellule vivante. En particulier la présente invention a ainsi pour objet un procédé pour introduire un cargo dans une cellule vivante, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de ladite cellule avec une composition conforme à l'invention comprenant ledit cargo. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre sur des cellules en culture, par addition à la culture d'une composition conforme à l'invention, et incubation pendant 1 à 14 heures, de préférence pendant 2 à 6 heures . De préférence, la composition conforme à l'invention est utilisée à raison de 10.000 à 20.000 complexes cargo/peptide transducteur par cellule.
Le procédé conforme à l'invention peut également être mis en œuvre in vivo, par exemple par injection d'une composition conforme à l'invention à un animal.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une composition conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament, et en particulier en tant que vecteur d'un principe actif constitué par le cargo ou contenu dans celui-ci.
La présente invention présente l'avantage de permettre d'introduire dans des cellules vivantes tout cargo hydrophobe ou dont la surface présente au moins un domaine hydrophobe, sans qu'il soit nécessaire d'effectuer un couplage préalable par liaison covalente entre le cargo et le peptide transducteur. La présente invention présente un intérêt tout particulier pour introduire dans des cellules vivantes des particules virales ou pseudovirales, notamment des bactériophages, renfermant des polynucléotides d'intérêt que l'on souhaite exprimer dans lesdites cellules.
Ces particules peuvent ainsi être utilisées par exemple comme vecteurs de thérapie génique, in vivo ou ex vivo . On peut également préparer des compositions conformes à l'invention à partir de banques de phages contenant des polynucléotides codant pour des polypeptides divers, susceptibles de modifier le comportement de certaines cellules (migration, prolifération, différenciation, etc.), et utiliser ces compositions pour faire entrer ces banques de phages dans des tissus, en culture ou in vivo, et identifier des séquences régulatrices de ces comportements .
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs, illustrant la mise en œuvre de la présente invention, pour introduire des phages dans des cellules vivantes. EXEMPLE 1 : ABSORPTION D'UN PEPTIDE TRANSDUCTEUR SUR DES BACTERIOPHAGES IAMDA
Préparation des phages :
Le gène de la protéine autofluorescente EGFP
(CLONTECH) ou celui de 1 ' homéoprotéine En2 (Engrailed2) de poulet (LOGAN et al., 1992, Dev Genetics 13: 345-358) ont été placés sous le contrôle du promoteur CMV et en amont de la séquence de polyadénylation de SV40, dans un plasmide dérivé de pBK-CMV (STRATAGENE) possédant un site EcoRI unique en amont du promoteur CMV, et un site Sali unique en aval du signal de polyadénylation. La fonctionnalité de ces constructions a été vérifiée par électroporation et expression transitoire en cellules COS, et détection de 1 ' autofluorescence de la GFP ou détection im unocytochimique de la protéine Engrailed 2 à l'aide d'un anticorps polyclonal dirigé contre cette protéine (don du Dr S. SAULE, UMR 146, Institut Curie, OrsayJ ). Le fragment encadré par les deux sites uniques
(EcoRI et Sali) a ensuite été transféré dans le génome du phage La bda-ZAP (STRATAGENE) , entre les sites EcoRI et Xhol, et l'ADN recombinant a été encapsidé in vi tro à l'aide des réactifs GIGAPACK PLUS (STRATAGENE) . Les phages résultants
(respectivement dénommés Lambda-ZAP-GFP et Lambda-ZAP-En2) ont permis l'infection de bactéries compétentes (souche
XLlBlue-MRF' , STRATAGENE), puis ont été titrés et stockés après un premier tour d'amplification. Pour contrôler la qualité des recombinants obtenus, les phagemides internes aux génomes des phages Lambda recombinants ont été excisés automatiquement par co-infection de bactéries XLlBlue-MRF' avec un phage auxilliaire (ExAssist, STRATAGENE) . Après culture en milieu liquide, les bactéries encore vivantes et les virions Lambda sont détruits par chauffage, et on récupère les phages filamenteux recombinants. Les formes plasmidiques de ces phagemides recombinants sont récupérées après infection de bactéries non permissives pour la réplication du phage filamenteux (souche SOLR, STRATAGENE) , et l'intégrité fonctionnelle des plasmides excisés est vérifiée par électroporation dans les cellules COS. Après cette vérification, les phages Lambda recombinants sont amplifiés pour atteindre un titre d'au moins 1011 particules par ml, puis concentrés au PEG, dialyses contre du PBS additionné de Ca++ et de Mg++, et stockés à 4°C.
Adsorption du peptide transducteur :
Le peptide transducteur utilisé est une pénétratine de séquence :
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:l) correspondant à l'hélice 3 du peptide pAntp
(homéodomaine de la protéine Antennapedia de drosophile) .
La pénétratine biotinylée est mélangée aux phages recombinants, à raison de 10 μg de peptide pour 109 particules phagiques, dans 50 à 100 μl de milieu approprié (milieu DMEM/F12 (1:1) ou PBS-Dulbecco) . Le mélange est incubé à température de la pièce pendant 30 min. EXEMPLE 2 : INTRODUCTION DE PHAGES DANS DES CELLULES EN CULTURE
Les cellules utilisées sont des cellules épithéliales de rein de chien (MDCK) . Les phages utilisés sont marqués au fluorochrome
Cy3 (AMERSHAM) par liaison covalente du fluorochrome aux protéines de capside, selon les instructions du fabricant. Ils sont ensuite incubés en présence de pénétratine, comme décrit à l'exemple 1 ci-dessus. A titre de contrôle négatif, on utilise des phages marqués au fluorochrome Cy3, incubés dans les mêmes conditions en l'absence de pénétratine.
La préparation phages/pénétratine, ou la préparation témoin est ajoutée au milieu de culture ou de suspension des cellules (selon que les cellules traitées ont déjà été ensemencées ou qu'elles viennent d'être dissociées) à raison de 10.000 phages/cellule, et laissée au contact des cellules pendant 4 heures .
Les cellules sont ensuite lavées et remises en culture dans du milieu frais, puis fixées dans du parafor aldéhyde 4% en PBS durant 10 min à température ambiante, rincées en PBS et montées dans du milieu de montage pour spécimens fluorescents DAKO contenant lμg/ml de DAPI
(4 ' -6-diamidino-2-phénylindole) . Elles sont ensuite observées sous un microscope confocal à épifluorescence type Leica TCS. Les images sont analysées et traitées à l'aide du logiciel
PHOTOSHOP d'Adobe.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1 : Figure 1 A : préparation témoin avec phage sans pénétratine Figure 1 B : préparation phage/pénétratine
On observe une importante fluorescence intracellulaire chez les cellules ayant reçu la préparation phages/pénétratine. En revanche, dans le cas des cellules n'ayant reçu que la préparation de phages, aucune fluorescence n'est observée. EXEMPLE 3: INTRODUCTION DE PHAGES LAMBDA IN VIVO DANS DES CELLULES DE CERVEAU DE SOURIS
Différentes préparations phages/pénétratine
(phages recombinants exprimant la GFP ; phages recombinants exprimant En2 ; phages marqués au fluorochrome Cy3) sont administrées à des souris adultes par infusion dans le ventricule latéral du cerveau.
A J-l avant l'infusion, les phages (solution à 6,5.108 pfu/μl) sont dialyses contre du NaCl 0,9% contenant 10 M de MgC12 (pour la stabilité du phage) à 4°C durant la nuit. Le jour de l'infusion, on réalise le mélange phage/pénétratine : 70μl de la solution de phages dialyses contre du NaCl 0,9% (soit 6,5.1010 pfu) + 3μl de Nacl 9% + 27 μl de la solution stock de pénétratine (soit 162 μg) , soit environ 5 x 105 molécules de pénétratine par particule de phage. lOOμl de mélange sont chargés dans une micro-pompe osmotique (ALZET 1003D) reliée par un cathéter à une canule qui sera implantée dans le ventricule latéral. L'ensemble de la micro-pompe est plongé dans du NaCl 0,9% à 37°C pendant 4 heures afin d'en amorcer le débit.
Les pompes sont placées dans une poche sous- cutanée au niveau de la région scapulaire de l'animal, et la canule implantée dans le ventricule latéral du cerveau selon les coordonnées stéréotaxiques suivantes : latéral 0,8 mm, antéro-postérieur 0mm, dorso-ventral 2mm par rapport au Bregma du crâne pris comme origine des coordonnées.
L'infusion est effectuée durant trois jours à un débit de Iμl/heure. Les animaux infusés sont ensuite euthanasiés par anesthésie suivie d'une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde 4% en PBS ; les cerveaux sont prélevés et post-fixes la nuit à 4°C dans ce fixateur. Le lendemain, ils sont découpés au vibrato e en coupes frontales de 50μm d'épaisseur.
Les coupes sont soit observées immédiatement après montage dans du milieu de montage (DAKO+DAPI) dans le cas d'une fluorescence directe (GFP ou CY3), soit utilisées pour l' immunodétection de la protéine hétérologue exprimée par le phage (dans le cas du phage exprimant la GFP ou En2) . La pénétratine est détectée par une streptavidine couplée au fluorochrome Cy3 (IMMUNOTECH)
Pour l' immunodétection, et/ou la détection de la pénétratine, les coupes sont préincubées environ une heure dans du tampon PBS 5% SVF 0,25% Triton X-100 (PBST) à température ambiante. Les anticorps sont dilués dans le même tampon, au 1/5000 pour l'anticorps polyclonal anti-En2, et au
1/500 pour l'anticorps polyclonal l'anti-GFP (SANTA-CRUZ) , et incubés avec les coupes la nuit à 4°C. Les coupes sont ensuite rincées 3x15min dans du tampon PBS ; un anticorps secondaire fluorescent anti-i munoglobulines de lapin couplé au FITC (JACKSON) est ensuite ajouté après dilution au l/500ème en PBST. Pour la détection de la pénétratine, la streptavidine fluorescente est diluée au l/500ème dans le
PBST.
Après incubation d'une heure à température ambiante, et trois rinçages de 15 min dans du PBS, les coupes sont montées en milieu DAKO+DAPI, et observées en microscopie confocale à épifluroescence .
Les résultats sont illustrés par les Figures 2 et 3 :
Les figures 2 A et 2 B représentent des marquages sur des coupes frontales de 50μm d'épaisseur.
Figure 2 A : Détection de phage cy3 dans le parenchyme cérébral d'une souris adulte après infusion du mélange pénétratine/phage dans le ventricule latéral.
Figure 2 B : détection d'une fluorescence GFP dans le parenchyme cérébral d'une souris adulte après infusion du mélange pénétratine/phage GFP dans le ventricule latéral
Figure 3 : Colocalisation de la protéine engrailed 2 et de la pénétratine dans le parenchyme cérébral d'une souris adulte après infusion du mélange pénétratine/phage codant pour En 2. Figure 3 A : immunodétection de la protéine Engrailed 2 codée par le phage
Figure 3 B : détection sur la même coupe de la pénétratine à l'aide de streptavidine fluorescente Les figures 3 D et 3 E sont respectivement des agrandissements des figures 3 A et 3 B

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour préparer une composition permettant d'introduire dans une cellule vivante, un cargo constitué par une macromolécule ou un assemblage moléculaire de taille inférieure ou égale à environ 1 μm dans sa plus grande dimension et présentant à sa surface un ou plusieurs domaines hydrophobes, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend l'adsorption sur le ou lesdits domaines hydrophobes, d'au moins un peptide transducteur, à l'exception des peptides transducteurs de 16 à 30 acides aminés comprenant un domaine hydrophobe contenant 3 à 5 résidus tryptophane dont au moins une paire Trp-Trp, alternant avec des résidus acide glutamique et thréonine, et un domaine hydrophile contenant 4 ou 5 résidus basiques consécutifs.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le cargo est une protéine ou une particule possédant une surface de nature protéique.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le cargo est une particule virale ou pseudovirale.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le cargo est un bacteriophage.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le peptide transducteur est un peptide de la famille des pénétratines.
6) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'adsorption du peptide transducteur est effectuée par incubation pendant au moins 15 minutes dudit peptide transducteur avec le cargo. 7) Composition comprenant un cargo à la surface duquel est adsorbé un peptide transducteur, susceptible d' être obtenue par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6.
8) Utilisation d'une composition selon la revendication 7 pour introduire ledit cargo dans une cellule vivante en culture. 9) Utilisation d'une composition selon la revendication 7 pour l'obtention d'un médicament.
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