EP1537209A2 - Funktionelle korrektur der -786 c/t-varianz des humanen enos-gens - Google Patents

Funktionelle korrektur der -786 c/t-varianz des humanen enos-gens

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Publication number
EP1537209A2
EP1537209A2 EP03750346A EP03750346A EP1537209A2 EP 1537209 A2 EP1537209 A2 EP 1537209A2 EP 03750346 A EP03750346 A EP 03750346A EP 03750346 A EP03750346 A EP 03750346A EP 1537209 A2 EP1537209 A2 EP 1537209A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
sequence
seq
oligonucleotides
enos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03750346A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marco Cattaruzza
Markus Hecker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Avontec GmbH
Original Assignee
Avontec GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Avontec GmbH filed Critical Avontec GmbH
Publication of EP1537209A2 publication Critical patent/EP1537209A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to decoy oligonucleotides with the nucleic acid sequence according to SEQ FD NO: 1 to 34 and their use as medicaments.
  • the present invention further relates to a method for diagnosing the ⁇ 786 C / T variance in the eNOS gene.
  • a key goal of decoding the human genome is to identify disease-causing genes (due to the mode of action of their products) or disease-causing changes in the structure of these genes (polymorphisms) and to assign them to a clinical picture.
  • This means that causal therapy for a variety of diseases is within reach if one accepts that these are caused by a defined number of gene products that are expressed too strongly, too weakly or incorrectly.
  • the generally singular genetic defect (monogenetic disease) is already known for certain hereditary diseases (eg cystic fibrosis)
  • the situation for polygenetic diseases eg atherosclerosis
  • the coincidence of different genetic defects predestines the person concerned for the disease , but this only develops after exposure to certain environmental factors. Regardless of this, the targeted intervention in the expression of one or more genes offers the chance of cause-related and not merely symptom-related therapy, even in the case of polygenetic diseases.
  • Atherosclerosis with its primary complications of heart attack, cardiac and renal insufficiency and stroke, is responsible for more than 50% of all deaths in industrialized countries, with this trend continuing to increase. In 2020, atherosclerosis-related cardiovascular diseases will be the most common cause of death worldwide, not least because of increasing life expectancy. In addition to the suspected genetic predisposition, hypertension, hypercholesterolemia, smoking and diabetes (type I and II) are among the primary risk factors for atherosclerosis.
  • Atherosclerosis is a basic systemic disease that can manifest itself at any time in a previously unaffected vascular section.
  • Anti-inflammatory drugs such as glucocorticoids (e.g. prednisone), immune suppressants (e.g. cyclosporin A) and antimetabolites (e.g. azathioprine) sometimes have serious side effects.
  • glucocorticoids e.g. prednisone
  • immune suppressants e.g. cyclosporin A
  • antimetabolites e.g. azathioprine
  • myelotoxicity neurotoxicity
  • nephrotoxicity metabolic disorders up to the induction of diabetes mellitus, arterial hypertension, infections and malignancies.
  • chronic inflammatory or autoimmune diseases include chronic obstructive bronchitis and emphysema (summarized as chronic obstructive pulmonary cancer or COPD; prevalence in Germany 4-1%), psoriasis (2-3%>), rheumatoid arthritis (chronic polyarthritis; 0.8%) and insulin-dependent diabetes mellitus (type I; 0.5%).
  • COPD chronic obstructive bronchitis and emphysema
  • psoriasis (2-3%>
  • rheumatoid arthritis chronic polyarthritis
  • insulin-dependent diabetes mellitus type I; 0.5%).
  • the infiltration of these immune cells into the vascular wall also plays an important role in the pathogenesis of atherosclerosis.
  • Further examples of an overactivation of Thl cells are transplant rejection, contact dermatitis and persistent secondary diseases of bacterial or viral infections.
  • the object of the present invention is therefore to provide means for prevention, therapy or diagnosis of the diseases mentioned.
  • the object is achieved by the subject-matter defined in the patent claims.
  • FIG. 1 shows the sequence of the human nitrogen monoxide (NO) synthase (e ⁇ S) gene in the region of the T to C transition at position -786.
  • the underlined bases indicate the consensus binding sites for two known transcription factors.
  • WSS wall shear stress
  • FIG. 3 shows in a bar chart the restoration of the shear stress induction of the eNOS expression in cultured endothelial cells from donors with a ⁇ 786 C / C genotype, who for 4 hours with a C type (SEQ ID NO: 1) but not with a T- Type allele decoy oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) had been pretreated (concentration in the medium of 10 ⁇ mol / 1).
  • WSS wall shear stress
  • FIG. 5 shows in bar graphs the effects of IL-10 (2 ng / ml) induced increased eNOS expression on CD154-stimulated (2 ⁇ 10 5 mouse myeloma cells ml) de novo synthesis of IL-12 p40 on (A) mRNA and ( B) Protein level over 6 hours in IL-10 receptor-expressing cultured endothelial cells from donors with ⁇ 786 ⁇ / T or " ⁇ 786 C / T genotype and their modulation by blocking the eNOS activity by nitroarginine.
  • FIG. 6 shows in a bar graph the lack of inhibition of CD154-stimulated IL-12 p40 expression in IL-10 receptor-expressing cultured endothelial cells from donors with a ⁇ 786 C / C genotype and their restoration by pretreating the cells (4 hours, 10 ⁇ mol / 1) with the C-type allele decoy oligonucleotide (SEQ ID NO: 5).
  • SEQ ID NO: 5 the C-type allele decoy oligonucleotide
  • FIG. 7 shows an example of the results of the real-time PCR / fluorescence resonance energy transfer (FRET) / DNA melting curve analysis developed for genotyping for the three variants of the ⁇ 786 C / T polymorphism of the human
  • FIG. 8 shows schematically two variants of the real-time PCR / FRET / DNA melting curve analysis for diagnosing the " C / T variance in the eNOS gene.
  • the circled numbers stand for the SEQ ID NO of the anchor or detection samples according to the invention (FL , Fluorescein; LC 640, LC-Red 640).
  • the term "decoy oligonucleotide” or “cis-element decoy” as used herein denotes a double-stranded DNA molecule which has a sequence which corresponds to or is similar to the natural nuclear binding sequence of a DNA-binding protein or protein complex in the genome and to which the protein or the protein complex binds in the cell.
  • the cis element decoy thus acts as a molecule for the competitive inhibition (better neutralization) of the protein or protein complex, which expression of the eNOS, a gene with a proven important protective function, if the C / C genotype is present blocked and thus predisposes to the formation of the diseases and complications defined in the patent claims.
  • C / T variance used here denotes the presence of a heterozygous or homozygous T to C transition at position -786 of the human eNOS gene. Accordingly, the term “C / C genotype” used here is the homozygous T to C transition and the C / T genotype is the heterozygous T to C transition.
  • NO nitrogen monoxide
  • the synthesis of nitrogen monoxide (NO) by the endothelial cells of the vascular wall plays an important role in the regulation of organ blood flow. and in maintaining vascular wall integrity.
  • the latter effect of NO is based in particular on the inhibition of the proliferation of smooth vascular muscle cells.
  • NO inhibits the expression of chemokines and cell adhesion molecules in the endothelium. This suppresses the recruitment, activation and transmigration of leukocytes circulating in the blood in inflammatory processes.
  • NO u. a. played an important role in the prevention of atherosclerosis, which, according to current understanding, is a chronic recurrent inflammatory disease of the vascular wall.
  • endothelial NO synthase eNOS
  • the physiologically most important stimulus for the activity of the enzyme is a change in the wall shear stress. This is the viscous tension exerted by the flowing blood on the endothelial cells that line the arteries and veins inside.
  • an increase in the wall shear stress triggered by a constriction of the blood vessel or an increase in the blood flow, leads to an increase in the NO synthase activity and consequently to an NO-mediated vasodilation, ie an increase in the Organ perfusion.
  • Interleukin-10 is an important anti-inflammatory cytokine for chronic recurrent inflammatory diseases such as Psoriasis, rheumatoid arthritis or Crohn's disease, which are caused by excessive activation of type 1 T helper cells (Moore et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19, 683).
  • the infiltration and activation of Thl cells in the vascular wall also plays an important role in the pathogenesis of atherosclerosis (Daugherty and Rateri (2002) Circ. Res. 90, 1039).
  • IL-10 inhibits the formation of IL-12 in the antigen presenting cells communicating with the Thl cells.
  • endothelial cells are also able to express the MHC II molecules required for the antigen presentation on their surface and to release biologically active IL-12.
  • IL-12 itself is the most important factor for the differentiation of naive T helper cells to Thl cells and stimulates their proliferation (clonal expansion).
  • the synthesis of IL-12 in human endothelial cells can only be induced after costimulation via the CD40 receptor / CD40 ligand system (Lienenlüke et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864).
  • the endothelial cells usually express the receptor (CD40) and activated Thl cells the CD40 ligand (also known as CD154).
  • the human eNOS gene has a number of polymorphisms in which a single base is exchanged (SNP for single nucleotide polymorphism), including a T to C transition in the promoter of the gene at position -786 (FIG. 1).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • FIG. 1 Linkage analyzes show that this base exchange does not occur in isolation, but is always associated with an A to G transition at position -922 and a T to A transition at position -1486.
  • T to C transition at position -786 which has now been elucidated by the inventors, the functional significance of these polymorphisms is not yet known (Wattanapitayakul et al. (2000) Trends Pharmacol. Sci. 22, 361).
  • coronary heart disease refers to the (manifest) atherosclerosis formed in the coronary arteries, which leads to a progressive narrowing of the affected vessels.
  • the consequences of this circulatory disorder in the coronary arteries are (in order of severity in ascending order) the stable angina pectoris (the formation of bypass arteries, so-called collaterals, at least partially compensates for the atherosclerosis-related circulatory disorder, the patients only become symptomatic, for example, when they are under physical stress Chest pain), the unstable angina pectoris (increasing blood vessel congestion caused by blood clots (thrombosis), the patients already have chest pain at rest, about 25% of them suffer a myocardial infarction within 4 weeks), the myocardial infarction itself (total occlusion of a coronary artery by a blood clot ) as well as sudden cardiac death (severe circulatory disorders due to acute closure of one or more coronary arteries with cardiac arrhythmia, which lead to cardiac arrest
  • the coronary heart disease and the coronary insufficiency triggered by it is primarily responsible for the manifestation of a heart muscle weakness (heart failure).
  • coronary artery disease continues to be the leading cause of death in western industrialized nations.
  • the discovery of genetic risk factors for the development of coronary artery disease is of great socio-economic importance.
  • the very rare spontaneous cramping of one or more coronary arteries differs from CAD in that spontaneous cramping is the extreme form of dynamic coronary stenosis (eccentric stenosis with constriction of the plaque-free patient wall) with unstable angina pectoris.
  • CAD cardiovascular disease
  • vasospastic angina pectoris eccentric stenosis with constriction of the plaque-free patient wall
  • unstable angina pectoris eccentric stenosis with constriction of the plaque-free patient wall
  • .Patients with vasospastic angina pectoris are often smokers and usually have other vascular phenomena (migraines, Raynaud's disease).
  • the pathogenesis of vasospastic angina pectoris has not yet been clarified. Autonomic nervous system involvement is suspected.
  • the inventors were able to demonstrate that in cultured endothelial cells that had been isolated from the umbilical cord vein of donors with the C / C genotype, the typical increase in eNOS expression at mRNA as well as at protein level caused by an increase in wall shear stress does not occur ( Figure 2).
  • the transcription is controlled by proteins that bind to the starter region of a gene (promoter region).
  • the correct assembly of several of these transcription factors causes an activation of the RNA polymerase and initiates the transcription.
  • binding an incorrect transcription factor can prevent the formation of the transcriptosome and thus block the expression of the gene.
  • Decoy oligonucleotides mimic the sequence motif to which the target transcription factor binds in the starter region of its target gene (s) and neutralize it. As a result, the induction or repression of the transcription mediated by this transcription factor is prevented.
  • human endothelial cells express the receptor for IL-10 after exposure to various pro-inflammatory cytokines, ie under (simulated) inflammation conditions, as well as after treatment with vitamin D3.
  • the stimulation of the receptor ie incubation of the cells expressing IL-10 receptor - with IL-10, resulted in a significant increase in eNOS expression in the endothelial cells (FIG. 4); an effect that could be attributed to the activation of the transcription factor signal transducer and activator of transcription (STAT) -3 with the help of electrophoretic mobility shift analyzes and the use of appropriate decoy oligonucleotides.
  • IL-10 can develop its anti-inflammatory effect in Thl-weighted chronic inflammatory diseases, in particular the inhibition of IL-12 synthesis in the endothelial cells, by increasing the eNOS expression and the associated increased NO formation.
  • the STAT binding site in the promoter of the human eNOS gene, which is important for the IL-10 effect, is approximately 60 base pairs above the T to C transition at position -786.
  • ⁇ C / T polymorphism has an effect on the inducibility of eNOS expression by IL-10.
  • IL-10 exposure did not inhibit CD154-induced synthesis of IL-12 in these cells, but actually increased it (FIG. 6). Due to the spatial proximity, the formation of the transcriptosome in the region of the STAT binding site is inhibited by the inhibitory transcription factor binding at position -786.
  • the intra-articular application of a decoy oligonucleotide during the inflammatory flare can sustainably strengthen or enable the endogenous IL-10-mediated inhibition of the Thl cell response and thus weaken the inflammatory process and the associated cartilage destruction in the affected joint.
  • Thl-weighted chronic inflammatory diseases such as Crohn's disease
  • the tendency to show a significantly higher prevalence of the ⁇ 786 C / C genotype (Table 2).
  • the systemic application of a liposomally packaged decoy oligonucleotide is likely to provide the greatest therapeutic benefit.
  • the present invention therefore relates to the provision of a decoy oligonucleotide which is in is able to bind sequence-specifically to a protein or a protein complex (hereinafter referred to as "transcription factor” or “inhibitory transcription factor”).
  • the sequence of the decoy oligonucleotide used to prevent binding of the inhibitory transcription factor is the sequence to which the transcription factor binds in the promoter of the eNOS gene.
  • the cis-element decoy can also be larger than the 10-mer nucleus binding sequence and can be extended at the 5 'end and / or at the 3 J end.
  • Corresponding mutations in the area of the nucleus binding sequence eg 5'-CTAGCTGACT-3 ' lead to a complete loss of the binding of the transcription factor to the decoy oligonucleotide, visible from the lack of biological action (Table 3).
  • the present invention further relates to the provision of decoy oligonucleotides which are capable of binding to the transcription factor in a sequence-specific manner and which have one of the following sequences, only one strand of the decoy oligonucleotides being reproduced here and the complementary strand also being included :
  • the use of the decoy oligonucleotides or cis-element decoys according to the invention which contain a consensus core binding site for the inhibitory transcription factor represents the preferred method for specifically inhibiting the activity of this factor.
  • Squelching or also called neutralization
  • DNA fragments were used which contain specific binding sites for the transcription factor E2F (Mann et al. (1999) Lancet 354, 1493).
  • the present invention thus relates to a method for specifically inhibiting the activity of the inhibitory transcription factor which binds in the promoter region of the eNOS gene at position -786 ' , comprising the step of administering a decoy oligonucleotide according to the present invention.
  • the present invention further relates to the decoy oligonucleotides according to the invention as medicaments.
  • the present invention further relates to the use of the decoy oligonucleotides according to the invention for the manufacture of a medicament, in particular for the prevention or therapy of atherosclerosis and its secondary diseases (for example coronary heart disease with a heart attack and heart failure, cerebral circulatory disorders with a stroke or multi-infarct dementia, and peripheral arterial occlusive disease ), chronic inflammatory or autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (chronic polyarthritis), psoriasis including psoariasis arthritis, allergic contact eczema and atopic eczema (neurodermatitis), chronic inflammatory bowel diseases (especially Crohn's disease and ulcerative colitis), type I and II diabetes and the like Consequences (e.g.
  • diabetic nephropathy, retinopathy and vasculopathy multiple sclerosis, sarcoidosis, collagenosis and vasculitis (including glomerular epithitis), acute and chronic rejection transplanted organs, graft versus host disease (GVHD) and the ischemia / reperfusion damage of organs after a surgical intervention, the vasculopathy of venous bypasses, (pre-) eclampsia or pregnancy-induced hypertension, arterial hypertension and its secondary diseases (e.g.
  • left heart hypertrophy aneurysm formation with the risk of bulging hemorrhages and arteries) and arterioles
  • pulmonary hypertension chronic renal failure
  • chronic obstructive pulmonary diseases COPD
  • bacterial infections and their complications e.g. Helicobacter pylori gastritis, tuberculous pericarditis, Lyme disease with subsequent Borrelia arthritis or neuroborreliosis complications
  • complications infections with cytomegalovirus, hepatitis B and C herpes and HI (human immunodeficiency) yives such as portal hypertension and fibrosis or opportunistic infections, in particular Pneumocystis carinii pneumonia.
  • decoy oligonucleotides according to the invention effectively neutralize the inhibitory transcription factor in vitro, it is crucial for the therapeutic effectiveness that the DNA molecule is quickly and sufficiently absorbed into the target cell.
  • the cis element decoy according to the invention should not exceed a certain length, since this is limiting for the transport into the target cell.
  • Any decoy oligonucleotide with a length of at least 10 bp is suitable up to a length of approximately 30 bp, preferably up to a length of approximately 27 base pairs, particularly preferably up to a length of approximately 23, particularly preferably with a length of 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, - 20, 21, 22 or 23 base pairs.
  • the decoy oligonucleotide according to the invention not only comprises the sense or forward sequence but also the complementary antisense or reverse sequence.
  • Preferred decoy oligonucleotides according to the invention have a 10-mer core binding sequence for the inhibitory transcription factor, as is contained in SEQ ID NO: 33.
  • the cis element decoy can also have a sequence that deviates from the above sequence and can be longer than a 10-mer.
  • the sequences as contained in SEQ JD NO: 1 to SEQ JD NO: 34 are particularly preferred. This list of the preferred sequences is not exhaustive. It will be apparent to those skilled in the art that a variety of sequences can be used as a transcription factor inhibitor as long as they meet the above conditions listed for the 10-mer consensus core binding sequence and an affinity for the transcription factor.
  • the affinity for the binding of a nucleic acid sequence to this transcription factor can be determined by using the Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191) can be determined.
  • ESA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • This test system is suitable for the quality control of nucleic acids intended for use in the method of the present invention or the determination of the optimal length of a binding site. It is also suitable for the identification of other sequences which are bound by the transcription factor.
  • the method of the present invention modulates the transcription of a gene or genes in such a way that the gene or genes, e.g. eNOS, are increasingly expressed.
  • Increased expression in the context of the present invention means that the transcription rate is increased in comparison to cells which are not treated with a decoy oligonucleotide according to the invention.
  • Such an increase can be determined, for example, by Northern blot (Sambrook et al., 1989) or RT-PCR (Sambrook et al., 1989).
  • Such an increase is typically at least a 2-fold, in particular at least a 5-fold, in particular at least a 10-fold inhibition of gene expression.
  • oligonucleotides are rapidly broken down in the cell by endo- and exonucleases, in particular DNases and RNases.
  • the nucleic acids can therefore be modified in order to stabilize them against degradation, so that a high concentration of the oligonucleotides is maintained in the cell over a longer period of time.
  • stabilization can be obtained by introducing one or more modified internucleotide linkages.
  • a successfully stabilized DNA oligonucleotide or decoy oligonucleotide does not necessarily contain a modification to every intemucleotide linkage.
  • the internucleotide bonds at the respective ends of both oligonucleotides of the cis-element decoy are preferably modified.
  • the last six, five, four, three, two or the last or one or more internucleotide linkages can be within the last six internucleotide linkages be modified.
  • various modifications of the internucleotide linkages can be introduced into the nucleic acid and the resulting decoy oligonucleotides can be tested for sequence-specific binding to the inhibitory transcription factor using the routine EMSA test system.
  • Modified cis-element decoys which still show sufficient binding can be selected, with sufficient binding meaning at least about 50% or at least about 75%, and particularly preferably about 100%, of the binding of the unmodified nucleic acid.
  • Cis-element decoys with modified internucleotide binding which still show sufficient binding, can be checked whether they are more stable in the cell than unmodified cis-element decoys.
  • the cells "transfected" with the cis-element decoys according to the invention are examined at various times for the amount of the cis-element decoys then still present.
  • a cis-element decoy marked with a fluorescent dye (eg Texas red) or a radioactively marked (eg 35 S) cis-element decoy is preferably used, followed by digital fluorescence microscopy or autoradiography or scintigraphy.
  • a successfully modified cis-element decoy has a half-life in the cell that is higher than that of an unmodified cis-element decoy, preferably at least about 48 hours, more preferably at least about 4 days, most preferably at least about 7 days.
  • Modified internucleotide-phosphate residues and / or non-phosphorus bridges in a nucleic acid that can be used in a method of the present invention include, for example, methylphosphonate, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, phosphate ester, while non-phosphorus internucleotide analogs , for example siloxane bridges, carbonate bridges, carboxymethyl ester bridges, acetamidate bridges and / or thioether bridges.
  • a further embodiment of the invention is the stabilization of nucleic acids by introducing structural features into the nucleic acid which increase the half-life of the nucleic acid.
  • Such structures containing hairpin and bell DNA are disclosed in US 5,683,985.
  • modified intemucleotide phosphate residues and / or non-phosphorus bridges can be introduced together with the structures mentioned. The resulting nucleic acids can be tested for binding and stability in the test system described above.
  • a cis-element decoy of the present invention is rapidly taken up into the cell. Adequate uptake is characterized by modulating the expression of one or more genes that are controlled by the target transcription factor (e.g. eNOS).
  • the cis-element decoy of the present invention preferably modulates the transcription of a gene or genes after about 4 hours of contact with the cell, more preferably after about 2 hours, after about 1 hour, after about 30 minutes and most preferably after about 10 minutes.
  • a typical mixture used in such an experiment contains 10 ⁇ mol / 1 cis-element decoy.
  • the diagnostic method according to the invention which preferably comprises a real-time PCR and subsequent melting curve analysis or a restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP analysis).
  • the diagnostic methods according to the invention in patients who have to undergo a surgical intervention in which, for example, the blood supply to one or more organs is briefly interrupted or one or more autologous vascular grafts are transferred (e.g. aortocoronary venous bypass surgery) during and during Following the surgical intervention, a treatment with the decoy oligonucleotides according to the invention and / or with drugs which increase the NO synthesis capacity of the vascular endothelium or increase the bioavailability of nitrogen monoxide in the organism, such as angiotensin conversion enzyme (ACE) inhibitors, HMG- CoA reductase inhibitors, antioxidants or Nitric oxide releasing vasodilators.
  • ACE angiotensin conversion enzyme
  • genotyping with the diagnostic methods according to the invention should also be carried out with donors of organs in order to transfer the graft between explantation and implantation (ie ex vivo) and / or the organ recipient for a period of at least 3 days, more preferably at least about 2 weeks most preferably to be treated for at least about 6 months with the decoy oligonucleotides according to the invention and / or the medicaments mentioned above.
  • the diagnostic methods according to the invention can be used to estimate the individual risk of a person to develop one of the diseases associated with the _786 C / T variance of the eNOS gene and the carriers of the ⁇ 786 C / C genotype in the sense of a prevention strategy , especially with a view to avoiding further risk factors.
  • the diagnostic methods according to the invention can be used to deliver carriers of the C / C genotype - as an alternative or in addition to the treatment with the decoy oligonucleotides according to the invention - to therapy with drugs which increase the NO synthesis capacity of the endothelial vessel or the bioavailability of Increase nitric oxide in the organism, such as Angiotensin conversion enzyme (ACE) inhibitors, HMG-CoA reductase inhibitors, antioxidants or nitric oxide releasing agents
  • ACE Angiotensin conversion enzyme
  • the present invention thus relates to methods for diagnosing a "786 C / T variance in the human eNOS gene, comprising the steps: adding DNA oligonucleotides to a patient's DNA sample, wherein a DNA oligonucleotide has a sequence that is upstream is the -786 position of the eNOS gene and corresponds to the sense strand, and another DNA oligonucleotide has a sequence that is downstream of the -786 position of the eNOS gene and corresponds to the antisense strand, performing a polymerase chain reaction (PCR), performing a D ⁇ A cleavage with a restriction enzyme which has a recognition sequence which is at least 4 nucleotides long and which contains the sequence 5'-CCGG-3 'but not the sequence 5'-CTGG-3', and detection of the DNA fragments obtained by DNA cleavage
  • the DNA oligonucleotides serve as primers for the PCR.
  • the eNOS sequence means the sequence listed under the GenBank Accession Number L10693 (gi: 348219), which is also referred to here as the sense strand and corresponds to the strand which contains the RNA sequence of the eiVOS gene product.
  • the start is labeled +1, so position -786 is upstream of the start point.
  • the antisense strand is the strand complementary to the sense strand, which is also referred to as the matrix.
  • the DNA oligonucleotides can have any length that is required for a PCR.
  • the DNA oligonucleotides can furthermore have such sequences from the eNOS gene or the 5 'region of the eNOS gene which allow a PCR to be carried out.
  • the primers must be spaced far enough apart so that the amplificates and the cleaved amplificates can be detected, but not to the extent that no more amplificates are generated.
  • the primers should be selected in such a way that DNA fragments with such a different size result from DNA cleavage and are easy to detect.
  • the primers preferably have the sequences according to SEQ JD NO: 35 and 36.
  • the restriction enzyme Hpall and the detection method are preferably agarose gel electrophoresis or capillary electrophoresis.
  • the present invention further relates to a kit for carrying out the method according to the invention, comprising the above DNA oligonucleotides (primers), reagents for carrying out a PCR, preferably including the Taq polymerase, a restriction enzyme and reagents for carrying out a DNA cleavage.
  • the present invention further relates to a method for the rapid determination of the " C / T variance of the human eNOS gene, comprising the following steps: addition of DNA oligonucleotides to a patient's DNA sample, wherein a DNA oligonucleotide has a sequence which is located upstream of the -786 position of the e ⁇ S gene and corresponds to the sense strand (primer 1), another fluorescent dye-modified DNA oligonucleotide has a sequence which comprises the -786 position of the eNOS gene and the sense or corresponds to the antisense strand and is complementary to the "786 C variant of the e / VCW gene promoter (detection sample), a further fluorescent dye-modified DNA oligonucleotide has a sequence which corresponds to the sense or antisense strand (anchor sample) and where the 3 'end of the anchor sample is 1-5 nucleotides upstream of the 5' end of the detection sample, if the anchor and
  • Primers 1 and 2 can be of any length required for PCR.
  • the primers can also have such sequences from the eNOS gene or the 5 'region of the eNOS gene which allow PCR to be carried out.
  • the primers must be spaced far enough apart so that it is possible to detect the amplified products and, if appropriate, the cleaved amplified products, but not to the extent that no more amplified products are produced.
  • Primer 1 preferably has the sequence 5'-CTGGGAACTGTAGTTTCCCTAG-3 'according to SEQ JD NO: 56 and primer 2 has the sequence 5'-ACCCTGTCATTCAGTGACGCAC-3' according to SEQ JD NO: 57.
  • Both the anchor sample and the detection sample used in the method are preferably complementary to the sense strand and have the sequence according to SEQ JD NO: 37 (5'- GGGTCAGCCGGCCAGGGAA-3 ') for the detection sample and the sequence according to SEQ JD NO: 38 ( 5'-AGCTTGATGCCCTGGTGGGAG-3 ') for the anchor sample.
  • the detection sample is covalently coupled to a fluorescent dye at the 3 'end (eg fluorescein, excitation wavelength 494 nm).
  • the anchor sample is covalently coupled at the 5 'end to a fluorescent dye that differs from that of the detection sample (eg LC Red-640, emission wavelength 640 nm).
  • the anchor sample is phosphorylated at the 3 'position of the last deoxyribose, preferably with PO 4 3 ⁇ .
  • the anchor sample has a melting temperature of 5-10 ° C above the melting point of the detection sample.
  • the dye combination is selected so that the excised dye of the detection sample is suitable for efficiently exciting the dye of the anchor sample using FRET so that it emits light of a defined wavelength as long as both samples are in close proximity to one another. Both the detection sample and the anchor sample are not suitable for PCR, since both are not enzymatic due to their chemical modifications in the 3 'or 5' position Allow chain extensions.
  • both the anchor sample and the detection sample used in the method are complementary to the antisense strand and have the sequence according to SEQ JD NO: 59 (5'-TTCCCTGGCCGGCTGA-3 ') for the detection sample and the sequence according to SEQ JD NO: 58 (5'-GCTCCCACCAGGGCATCAAGCT-3 ') for the anchor sample.
  • the detection sample is covalently coupled to a fluorescent dye (eg LC Red-640) at the 5 'end.
  • the anchor sample (SEQ JD NO: 58) is covalently coupled at the 3 'end to a fluorescent dye that differs from that of the detection sample (eg fluorescein).
  • the detection sample is also phosphorylated at the 3 'position of the last deoxyribose, preferably with PO 4 .
  • the anchor sample has a melting temperature of 5-10 ° C above the melting point of the detection sample.
  • the combination of dyes is selected so that the excised dye of the anchor sample is suitable to efficiently excite the dye of the detection sample by FRET in such a way that it emits light of a defined wavelength as long as both samples are in close proximity to one another.
  • the anchor sample preferably has a sequence according to SEQ LD NO: 38 or 58 and the detection sample has a sequence according to SEQ JD NO: 37 or 59.
  • DNA oligonucleotides for example, with other sequences are used as detection or anchor samples can be listed as specifically here.
  • the detection and anchor samples used in the method according to the invention do not necessarily have to bind the same strand, but for example the detection sample can bind the sense strand and the anchor sample the antisense strand or vice versa. In such a case, it is not necessary to select the sequences of the samples so that the samples are positioned in the immediate vicinity.
  • the above-described primers 1 and 2 and the detection After the PCR amplification, mediated by primers 1 and 2, of a fragment of the eiVOS 'prornoter which contains position -786 of the gene, the temperature of the mixture is raised so that all DNA double strands denature the temperature is lowered again so that detection and anchor samples can be scanned with the sense or Antisense strands of the amplified fragment hybridize, depending on whether the sample combination is complementary to the sense or antisense strand (see FIG. 8).
  • the melting curve is obtained by exciting the dye of the detection sample and continuously measuring the fluorescence of the anchor sample while increasing the temperature (for example about 0.1 ° C per second).
  • This takes advantage of the fact that the transfer of the excitation energy of the dye of the detection sample to that of the anchor sample only works as long as both samples have bound to the sense strand.
  • the T and the C variant by the temperature at which the detection sample melts off the sense strand, that is to say the FRET-induced fluorescence decreases significantly. This is the case for fragments of the ⁇ 786 T ⁇ variant due to the GT mismatch occurring about 12 ° C earlier than for sense strands of the
  • the melting curve is obtained by excitation of the dye of the anchor sample and continuous measurement of the fluorescence of the detection sample with a simultaneous increase in the temperature (for example about 0.1 ° C per second).
  • a simultaneous increase in the temperature for example about 0.1 ° C per second.
  • a fluorescence-based real-time PCR device (for example the LightCycler from Röche) is preferably used for the detection.
  • the person skilled in the art can see that not only the determination of a genotype in a PCR, but also the determination of more than one genotype in a PCR, in a so-called multiplex PCR, can be carried out simultaneously.
  • the present invention further relates to DNA oligonucleotides with the sequence according to SEQ JD NO: 35 to 38 and 56 to 59.
  • the present invention furthermore relates to a kit for carrying out the method according to the invention, comprising the above primers 1 and 2, two further DNA oligonucleotides (detection sample and anchor sample), reagents for carrying out a PCR, preferably including Taq polymerase, and reagents for carrying out a melting curve analysis ,
  • the present invention further relates to a method for modulating the transcription of at least one gene in cells, in particular in eNOS-expressing cells such as endothelial cells, epithelial cells of the lungs, kidneys and the female genitourinary tract, heart muscle cells, thrombocytes and neuronal cells (hippocampus), the method includes the step of contacting said cells with a mixture comprising one or more decoy oligonucleotides according to the invention which are capable of binding to the inhibitory transcription factor in a sequence-specific manner.
  • a preferred method is e.g. intra-articular injection of the nucleic acid-containing mixture into one or more joints in patients with rheumatoid arthritis.
  • the mixture containing the cis-element decoys according to the invention is brought into contact with the target cells (e.g. endothelial cells).
  • the goal of this contacting is to transfer the cis-element decoys that bind the inhibitory transcription factor to the target cell (e.g., the eNOS-expressing endothelial cell). Therefore, nucleic acid modification and / or additives or adjuvants known to increase membrane penetration can be used in the present invention (Uhlmann and Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).
  • a mixture according to the invention brought into contact with the target cells essentially contains only nucleic acid and buffer.
  • concentration range suitable for decoy oligonucleotides is 0.1 to 100 ⁇ mol / 1, preferably 0.5 to 25 ⁇ mol / 1 and particularly preferably 10 ⁇ mol / 1.
  • One or more suitable buffers can be added.
  • Such a buffer is a modified Ringer's solution containing 145 mmol / 1 Na + , 5 mmol 1 K + , 11 mmol / 1 Cl " , 2 mmol / 1 Ca 2+ , 1 mmol / 1 Mg 2+ , 10 mmol / 1 Hepes, 145 mmol / 1 isethionate, 10 mmol / 1 D-glucose, pH 6.5.
  • the mixture additionally contains at least one additive and / or auxiliary.
  • Additives and / or adjuvants such as lipids, cationic lipids, polymers, liposomes, nanoparticles, nucleic acid aptamers, peptides and proteins that are bound to DNA, or synthetic peptide-DNA molecules are intended, for example, to introduce nucleic acids into the cell to direct the mixture to only a subset of cells, to prevent degradation of the nucleic acid in the cell, and to facilitate storage of the nucleic acid mixture before use.
  • Examples of peptides and proteins or synthetic peptide-DNA molecules are e.g. Antibodies, antibody fragments, ligands, adhesion molecules, all of which can be modified or unmodified.
  • Additives that stabilize the cis-element decoys in the cell are, for example, nucleic acid-condensing substances such as cationic polymers, poly-L-lysine or polyethyleneimine.
  • the mixture used in the method of the present invention is preferably applied topically by injection, infusion, catheter, pluronic gels, sustained-release polymers, or any other device that allows local access.
  • the ex vivo use of the mixture (infusion or incubation) used in the method of the present invention also allows local access.
  • genomic DNA was isolated from the blood of patients (approx. 2 ml) and this by means of PCR amplification and subsequent RFLP analysis (see below) for variance.
  • CHD coronary artery disease
  • RFLP analysis RFLP analysis
  • two existing collectives could be used.
  • anonymized (numerical code) DNA samples from patients in the rheumatism clinic of the University of Göttingen and the rheumatology department of the Freiburg University Hospital were tested for the variance.
  • Both groups offer a typical distribution of patients with rheumatoid arthritis, ie the affected people are approximately 80% female.
  • the age profile ranged from 20 years to 80 years with peaks in the number of patients at 35-40 years (early onset) and 60-70 years (late onset).
  • DNA from the umbilical artery of newborns from Göttingen and the surrounding area was used as a comparison collective for the distribution of genotypes. These samples were also anonymized and the children's parents had previously given a written declaration of consent for the corresponding use of the umbilical cord. Anonymous genomic DNA samples were available for the genotyping of patients with multiple sclerosis or Crohn's disease (Charite Berlin University Hospital, Institute of Neuro-Immunology and the University of Göttingen, Immunology Department).
  • the C variant of the human e / V ⁇ S gene promoter has an additional restriction interface for the restriction enzyme Hpa II and is therefore accessible to a classic restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP analysis).
  • RFLP analysis restriction fragment length polymorphism analysis
  • the above-mentioned variance is also available in real-time PCR followed by FRET analysis.
  • genomic DNA obtained from blood with the aid of the QIAamp DNA Mini-Kit from Qiagen, Hilden was used with the aid of OS promoter-specific primers (forward primer 5'-GAGTCTGGCCAACACAAATCC-3 '(SEQ JD NO : 35); reverse primer 5'-GACCTCTAGGGTCATGCAGGT-3 ') (SEQ JD NO: 36) by polymerase chain reaction (PCR) a DNA fragment (657 base pairs (bp); from position -1135 to -456 of the human eNOS gene) and then subjected to a specific hydrolysis by the restriction endonuclease Hpa JJ.
  • OS promoter-specific primers forward primer 5'-GAGTCTGGCCAACACAAATCC-3 '(SEQ JD NO : 35); reverse primer 5'-GACCTCTAGGGTCATGCAGGT-3 ') (SEQ JD NO: 36) by polymerase chain reaction (PCR) a DNA fragment (657 base pairs (bp); from position
  • the resulting DNA fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis. Depending on the genotype, 2 or 3 smaller DNA fragments result from the 657 bp fragment. While the T variant of the promoter has only one Hpa II interface in the section under consideration and thus breaks down into two fragments (284 bp and 373 bp) after hydrolysis by Hpa JJ, the additional interface of the C variant causes 3 fragments arise (46 bp - not detectable in the electrophoresis system used - 284 bp and 327 bp).
  • the three possible genotypes ( ⁇ C / C, T / T and C / T) were clearly identified by electrophoresis using the following fragment patterns: ⁇ 786 T / T: 284 and 373 bp; ⁇ 786 C / C: 284 and 327 bp; and _786 C / T: 284, 327 and 373 bp.
  • genomic DNA obtained from blood with the aid of the QIAamp DNA Mini-Kit from Qiagen, Hilden
  • eNO £ promoter-specific primers forward primer 5'-CTGGGAACTGTAGTTTCCCTAG-3 '(SEQ ID NO: 56 ); reverse primer 5'-ACCCTGTCATTCAGTGACGCAC-3 '(SEQ JD NO: 57) by PCR in a real-time PCR device (LightCycler from Röche) a DNA fragment (137 bp); from position - 848 to -711 des human eNOS gene, GenBank Accession ⁇ o. L10693) amplified.
  • Human endothelial cells were isolated from umbilical cord veins from previously genotyped donors by treatment with 1.6 U / ml dispase in Hepes-modified Tyrode solution for 30 min at 37 ° C. and on gelatin-coated 6-hole tissue culture dishes (2 mg / ml gelatin in 0.1 M HC1 for 30 minutes at ambient temperature) in 1.5 ml M199 medium (Gibco Life Technologies, Düsseldorf, Germany), containing 20%.
  • fetal calf semen 50 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, 10 U / ml nystatin, 5 mmol / 1 HEPES and 5 mmol / 1 TES, 1 ⁇ g / ml heparin and 40 ⁇ g / ml endothelial growth factor.
  • vWF von Willebrandt factor
  • FACS fluorometric detection
  • the mouse myeloma cell line P3xTBA7 (stably transfected with human CD40 ligand) and P3x63Ag8.653 (untransfected control cells) were in RPMI 1640 medium (Life Technologies) containing 10% fetal calf serum, 50 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin and 10 U / ml of nystatin.
  • the application of wall shear stress (generally 30 dyn / cm 2 for 24 to 36 hours) to the cultured endothelial cells was carried out using a cone-plate viscometer that can be placed in the incubator, as described in Schubert et al. (2000) Circ. Res. 87, 1188 described, with the exception of the dimension of the culture dishes (3.5 cm in contrast to 10.0 cm diameter).
  • cDNA amounts in the different samples 5 ⁇ l of the 1:10 diluted cDNA solution (corresponding to an RNA equivalent of 25-125 ng) of a PCR reaction (1 U Taq DNA polymerase ([Life Technologies] ) with specific primers for the constitutively expressed gene products glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) and ribosomal protein L32 (rpl32), using GAPDH and rpl32 as internal calibration standards.
  • GAPDH glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
  • rpl32 ribosomal protein L32
  • PCR products were contained on 1.5% agarose gels containing 0 , 1% ethidium bromide was separated and the intensity of the bands was determined densitometrically using a CCD camera system and the One-Dscan gel analysis software from Scanalytics (Billerica, MA, USA) in order to adjust the volume of the cDNA in subsequent PCR analyzes.
  • IL-12p40 -281 bp 30 cycles, 62 ° C, 5'-GTACTCCACATTCCTACTTCT-3 '(SEQ JD NO: 41), 5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3' (SEQ JD NO: 42) IL-10 receptor - 565 bp , 32 cycles, 59 ° C, 5'-GGACACCCATCCCAAATCAGTC-3 '(SEQ FD NO: 43), 5'-CACGGTGAAATACTGCCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 44)
  • GAPDH - 571 bp 19 cycles, 58 ° C, 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3 '(SEQ ID NO: 45), 5'- CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3' (SEQ JD NO: 46) rpl32 - 368 bp, 20 cycles, 60 ° C, S ⁇ -GTTCATCCGGCACCAGTCAG-S SEQ JD NO: 47), 5'- ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3 '(SEQ ID NO: 48)
  • NM 000603, 129 bp, position 1151 to 1279 were generated using the forward primer 5 '-GGATGTGGCTGTCTGCATGGAC-3' (SEQ JD NO: 60) and the reverse primer 5 ' -TGGTCCACGATGGTGACTTTG 3 '(SEQ JD NO: 61) amplified.
  • the cDNA for GAPDH GenBank Accession No. BT006893, 138 bp. Position 525 to 662
  • the program to amplify both gene products consisted of a 15 minute incubation at 95 ° C followed by 40 cycles of 5 s at 95 ° C, 25 s at 58 ° C and 10 s at 72 ° C.
  • the melting curve was programmed with a slope of 0.2 ° C / s from 65 to 95 ° C and the fluorescence intensity was measured after each cycle.
  • a standard curve for both gene products was used for the quantitative analysis serial dilutions of the corresponding PCR fragments (10 2 to 5xl0 8 copies / reaction) also measured.
  • the gene products were cloned into the plasmid pCR-TOPO (Invitrogen, Düsseldorf, Germany).
  • Double-stranded decoy oligonucleotides were derived from the complementary single-stranded phosphorothioate-linked oligonucleotides (Eurogentec, Cologne, Germany) as described in Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191.
  • the cultured human endothelial cells were pretreated for 4 hours with the respective decoy oligonucleotide in a concentration of 10 ⁇ mol / 1 and added to the incubation medium in the same concentration after changing the medium.
  • the single-stranded sequences of the oligonucleotides were as follows (underlined letters denote phosphorothioate-linked bases):
  • Decoy-Oligoukleotide shown in Table 3 to neutralize the transcription factor binding to position -786 of the eNOS-G ns.
  • the sequence of the STAT-3 decoy oligonucleotide corresponds to position -858 to -838 in the human eNOS gene.
  • Both STAT-1 and STAT-3 bind to the oligonucleotide SIE.
  • additional supershift analyzes were carried out with a monoclonal mouse anti-human supershift antibody (Santa Cmz biotechnology) (addition in a concentration of 10 ⁇ g / ml to the core extract for 1 hour at room temperature).
  • the human umbilical cord vein endothelial cells were subsequent freezing in liquid nitrogen and thawed at 37 ° C. Protein extracts were, as in Hecker et al. (1994) Biochem J. 299, 247. 20-30 ⁇ g protein were separated using a 10% polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions in the presence of SDS according to the standard protocol and transferred to a BioTrace TM polyvinylidene fluoride transfer membrane (Pall Corporation, Roßdorf, Germany). Monoclonal mouse anti-human antibodies (BD Pharmingen, Heidelberg, Germany; 1: 5000 and 1: 3000 dilution) were used for the immunological detection of the eNOS and the IL-10 receptor.
  • the protein bands were added after adding a peroxidase-coupled anti-mouse IgG (1: 3000, Sigma, Deisenhofen, Germany) using the chemiluminescence method (SuperSignal Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL, USA) and subsequent autoradiography ( Hyperfilm TM MP, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England).
  • IL-12 p40 ELISA The enzyme-linked antibody binding assay (ELISA) is a standard method for the quantitative analysis of proteins. As in Lienenlüke et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864 described for the detection of the IL-12 p40 subunit in the supernatant of the incubated human endothelial cells.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Decoy-Oligonukleotide mit der Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID NO:1 bis 34 sowie deren Verwendung als Arzneimittel. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der -786C/T-Varianz im eNOS-Gen.

Description

Funktionelle Korrektur der 786C/T-Varianz des humanen eNOS-Gens
Die vorliegende Erfindung betrifft Decoy-Oligonukleotide mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ FD NO:l bis 34 sowie deren Verwendung als Arzneimittel. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der ~786C/T- Varianz im eNOS-Gen.
Ein wesentliches Ziel der Dechiffrierung des menschlichen Genoms ist es, krankmachende Gene (aufgrund der Wirkungsweise ihrer Produkte) bzw. krankmachende Veränderungen in der Struktur dieser Gene (Polymorphismen) zu identifizieren und einem Krankheitsbild zuzuordnen. Damit rückt die Kausaltherapie einer Vielzahl von Erkrankungen in greifbare Nähe, wenn man akzeptiert, dass diese durch eine definierte Anzahl von zu stark, zu schwach oder fehlerhaft exprimierten Genprodukten verursacht sind. Während für bestimmte Erbkrankheiten (z.B. Mukoviszidose) der in der Regel singuläre Gendefekt (monogenetische Erkrankung) bereits bekannt ist, stellt sich die Situation für polygenetische Erkrankungen (z.B. Atherosklerose) wesentlich komplexer dar. So prädestiniert zwar das Zusammentreffen verschiedener Gendefekte die betroffenen Personen für die Erkrankung, diese entwickelt sich aber erst bei Exposition gegenüber bestimmten Umweltfaktoren. Ungeachtet dessen bietet der gezielte Eingriff in die Expression eines oder mehrerer Gene auch bei polygenetischen Erkrankungen die Chance einer Ursachen- und nicht lediglich symptombezogenen Therapie.
Die Atherosklerose mit ihren primären Folgeerkrankimgen Herzinfarkt, Herz- und Niereninsuffizienz sowie dem Schlaganfall ist in den Industrienationen für mehr als 50% aller Todesfälle verantwortlich, wobei diese Tendenz weiter zunimmt. Im Jahr 2020 werden Atherosklerose-bedingte Herz-Kreislauferkrankungen, nicht zuletzt aufgrund der steigenden Lebenserwartung, weltweit die häufigste Todesursache darstellen. Neben der vermuteten genetischen Prädisposition zählen Bluthochdruck, Hypercholesterolämie, Rauchen und Diabetes (Typ I und II) zu den primären Risikofaktoren der Atherosklerose. Diese können mit Ausnahme der Prädisposition und dem (Zigaretten)Rauchen medikamentös behandelt werden, wobei diese Behandlung in der Regel erst dann einsetzt, wenn die betroffenen Personen symptomatisch geworden sind, d.h. bereits manifeste atheromatöse Plaques in den Wänden der Arterien, insbesondere der Herzkranzgefäße, der Karotiden und Cerebralgefäße sowie den Nierengefäßen aufweisen. Oft bleibt als Therapieoption zur Vermeidung eines zerebralen, myokardialen oder renalen Infarktes nur die Aufdehnung der blockierten Arterien mit Hilfe eines Ballonkatheters mit und ohne anschließende Platzierung einer Gefäßstütze (Stent) oder die Bypass-Operation, bei der die blockierte Arterie mit Hilfe eines autologen Arterien- oder Venensegments umgangen wird. Ein Problem dieser Eingriffe ist neben der hohen Wiederverschlussrate des behandelten Gefäßes (circa 30%> für den Ballonkatheter/Stent nach 6-12 Monaten und circa 50% für den aortokoronaren Venenbypass nach 1-5 Jahren) die Tatsache, dass es- sich bei der Atherosklerose um eine systemische Grunderkrankung handelt, die sich jederzeit in einem zuvor noch nicht betroffenen Gefäßabschnitt manifestieren kann.
Ein noch größeres medizinisches Problem stellen, weniger im Hinblick auf die Mortalität sondern vielmehr die hiermit assoziierte Morbidität und die unter Umständen lebenslange Therapie betreffend, chronische Entzündungs- bzw. Autoimmunerkrankungen dar. Darüber hinaus verursachen die bei diesem Patientenkreis in der Regel systemisch verabreichten, stark wirksamen Entzündungshemmer wie Glukokortikoide (z.B. Prednison), Immi suppressiva (z.B. Cyclosporin A) und Antimetabolite (z.B. Azathioprin) zum Teil gravierende Nebenwirkungen. Hierzu zählen insbesondere Myelotoxizität, Neurotoxizität, Nephrotoxizität, Stoffwechselstörungen bis hin zur Induktion eines Diabetes mellitus, arterieller Hypertonus, Infektionen und Malignome. Beispielsweise entwickeln 25% der Patienten mit rheumatoider Arthritis, die mit dem Zytostatikum Methotrexat behandelt werden, innerhalb von 2 Jahren eine schwere Leberzirrhose. Zu den zahlenmäßig bedeutendsten, chronischen Entzündungs- bzw. Autoimmunerkrankungen zählen die chronisch obstruktive Bronchitis und das Lungenemphysem (zusammengefasst als chronisch obstruktive Lungenerkra kugen oder COPD; Prävalenz in Deutschland 4-1%), die Schuppenflechte (Psoriasis; 2-3%>), die rheumatoide Arthritis (chronische Polyarthritis; 0,8%) und der Insulin-abhängige Diabetes mellitus (Typ I; 0,5%). Diesen Erkrankungen liegt, mutmaßlich auf dem Boden verschiedener genetischer Prädispositionen, eine Immunregulationsstörung im Sinne einer übermäßigen Aktivierung von T-Helferzellen des Typs 1 (Thl) zugrunde.
Auch in der Pathogenese der Atherosklerose spielt die Infiltration dieser Immunzellen in die Gefäßwand eine wichtige Rolle. Weitere Beispiele für eine Überaktivierung von Thl -Zellen sind die Transplantatäbstoßung, die Kontaktdermatitis sowie persistierende Folgeerkrankungen bakterieller oder viraler Infektionen.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde Mittel für eine Prävention, Therapie oder Diagnostik der genannten Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert?
Figur 1 zeigt die Sequenz des humanen Stickstoffmonoxid(NO)-Synthase(e λS)-Gens im Bereich der T zu C Transition an Position -786. Die unterstrichenen Basen kennzeichnen die Konsensusbindungsstellen für zwei bekannte Transkriptionsfaktoren.
Figur 2 zeigt in Balkendiagrammen die fehlende Stimulierbarkeit der eNOS-Expression auf (A) mRNA (n=8-12) und (B) Proteinebene (n=3) in kultivierten Endothelzellen, die aus der Nabelschnurvene von Spendern mit ~786C/C-Genotyp isoliert worden waren, im Vergleich zu Endothelzellen von Spendern mit _786C/T und insbesondere ~7S6T/T-Genotyp. Dargestellt ist die prozentuale Steigerung der Expression in Zellen, die für 24 Stunden (mRNA) bzw. 36 Stunden (Protein) in einem Kegel-Platte- Viskosimeter einer Wandschubspanung (WSS) von 30 dyn/cm2 ausgesetzt worden waren, im Vergleich zu Zellen desselben Spenders, die für diesen Zeitraum unter statischen Bedingungen inkubiert wurden (*P<0,05 im Vergleich zur statischen Kontrolle).
Figur 3 zeigt in einem Balkendiagramm die Wiederherstellung der Schubspannungsinduktion der eNOS-Expression in kultivierten Endothelzellen von Spendern mit ~786C/C-Genotyp, die für 4 Stunden mit einem C-Typ (SEQ ID NO:l) nicht aber mit einem T-Typ-Allel Decoy- Oligonukleotid (SEQ ID NO:3) vorbehandelt worden waren (Konzentration im Medium von 10 μmol/1). Dargestellt ist die prozentuale Steigerung der mRNA-Expression in Zellen, die für 24 Stunden in einem Kegel-Platte- Viskosimeter einer Wandschubspanung (WSS) von 30 dyn/cm2 ausgesetzt worden waren, im Vergleich zu Zellen desselben Spenders, die für diesen Zeitraum unter statischen Bedingungen inkubiert wurden (n=4; *P<0,05 im Vergleich zur statischen Kontrolle).
Figur 4 (A) zeigt in einer graphischen Darstellung und einer repräsentativen Western Blot- Analyse die zeitabhängige Induktion der eNOS-Expression auf mRNA (statistische Zusammenfassung, n=3-10, *P<0,05 vs. nicht stimulierte Zellen) und Proteinebene durch IL-10 (2 ng/ml) in kultivierten Endothelzellen von Spendern mit ~7S6T/T-Genotyp5 die zuvor 9 Stunden mit Vitamin D3 (10 nmol/1) vorbehandelt worden waren, um die Expression des IL-10 Rezeptors zu stimulieren. Fig. 4 (B) zeigt in einem Balkendiagramm die fehlende Induktion der eNOS- Expression durch IL-10 unter ansonsten identischen experimentellen Bedingungen in kultivierten Endothelzellen von Spendern mit C/C-Genotyp (statistische Zusammenfassung, n=6, *P<0,05 vs. nicht stimulierte Zellen).
Figur 5 zeigt in Balkendiagrammen die Auswirkungen der IL-10 (2 ng/ml) induzierten verstärkten eNOS-Expression auf die CD154-stimulierte (2xl05 Maus-Myelomzellen ml) de novo Synthese von IL-12 p40 auf (A) mRNA und (B) Proteinebene über 6 Stunden in IL-10 Rezeptor-exprimierenden kultivierten Endothelzellen von Spendern mit ~786τ/T bzw. "~786C/T- Genotyp sowie deren Modulation mittels Blockade der eNOS-Aktivität durch Nitroarginin. Statistische Zusammenfassungen der RT-PCR- Analysen (mit rpl32 als internem Standard; n=6) und ELISA-Daten (n=6-10; *P<0,05 vs. CD154-stimulierte Kontrollzellen).
Figur 6 zeigt in einem Balkendiagramm die fehlende Hemmung der CD154-stimulierten IL-12 p40-Expression in IL-10 Rezeptor-exprimierenden kultivierten Endothelzellen von Spendern mit ~786C/C-Genotyp sowie deren Restaurierung durch Vorbehandlung der Zellen (4 Stunden, 10 μmol/1) mit dem C-Typ-Allel Decoy-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 5). Statistische Zusammenfassung der RT-PCR-Analysen (mit rpl32 als internem Standard; n=7-15, *P<0,05 vs. CD 154-stimulierte Kontrollzellen).
Figur 7 zeigt in graphischen Darstellungen exemplarisch die Ergebnisse der für die Genotypisierung entwickelten Echtzeit-PCR/Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)/DNA- Schmelzkurven- Analytik für die drei Varianten des ~786C/T-Polymorphismus des humanen
Figur 8 zeigt schematisch zwei Varianten der Echtzeit-PCR/FRET/DNA-Schmelzkurven- Analytik zur Diagnose der " C/T- Varianz im eNOS-Gen. Die eingekreisten Zahlen stehen für die SEQ ID NO der erfindungsgemäßen Anker- bzw. Detektionsproben (FL, Fluorescein; LC 640, LC-Red 640). Der hier verwendete Ausdruck "Decoy-Oligonukleotid" oder "Cis-Element Decoy" bezeichnet ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das eine Sequenz aufweist, die der natürlichen Kernbindungssequenz eines DNA-bindenen Proteins oder Proteinkomplexes im Genom entspricht oder ähnelt und an die das Protein oder der Proteinkomplex in der Zelle bindet. Das Cis-Element Decoy wirkt im Sinne der vorliegenden Erfindung somit als Molekül zur kompetitiven Inhibierung (besser Neutralisierung) des Proteins oder Proteinkomplexes, das/der die Expression der eNOS, eines Gens mit einer nachgewiesenen wichtigen Schutzfunktion, bei Vorliegen des C/C-Genotyps blockiert und somit prädisponierend für die Ausbildung der in den Patentansprüchen definierten Erkrankungen und Komplikationen wirkt.
Der hier verwendete Begriff "C/T- Varianz" bezeichnet das Vorliegen einer heterozygoten oder homozygoten T zu C Transition an Position -786 des humanen eNOS-Gens. Demzufolge ist der hier verwendete Begriff "C/C-Genotyp" die homozygote T zu C Transition und der C/T-Genotyp die heterozygote T zu C Transition.
Die Synthese von Stickstoffmonoxid (NO) durch die Endothelzellen der Gefäßwand spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Organdurchblutun . und in der Aufrechterhaltung der Gefäßwandintegrität. Die letztgenannte Wirkung von NO beruht insbesondere auf der Hemmung der Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen. Darüber hinaus inhibiert NO die Expression von Chemokinen und Zelladhäsionsmolekülen im Endothel. Hierdurch wird bei entzündlichen Prozessen die Rekrutierung, Aktivierung und Transmigration von im Blut zirkulierenden Leukozyten unterdrückt. Insofern wird NO u. a. eine wichtige Rolle in der Prävention der Atherosklerose zugeschrieben, die nach heutigem Verständnis eine chronisch rezidivierende Entzündungserkrankung der Gefäßwand darstellt.
Die NO-Bildung in den Endothelzellen wird von der so genannten endothelialen NO-Synthase (eNOS) katalysiert, der physiologisch wichtigste Reiz für die Aktivität des Enzyms ist eine Veränderimg der Wandschubspannung. Das ist die durch das strömende Blut auf die Endothelzellen, welche die Arterien und Venen innen auskleiden, ausgeübte viskose Zugspannung. So führt ein Anstieg der Wandschubspannung, ausgelöst durch eine Konstriktion des Blutgefäßes oder einen Anstieg des Blutflusses, zu einer Steigerung der NO- Synthaseaktivität und infolgedessen zu einer NO-vermittelten Vasodilatation, d.h. Zunahme der Organdurchblutung. Neben dieser akuten Änderung der Enzymaktivität führt ein Anstieg der Wandschubspannung mittelfristig auch zu einer verstärkten Expression der NO-Synthase in den Endothelzellen. Bedingt durch die ständigen lokalen Änderungen der Wandschubspannung ist die schubspannungsinduzier e Induktion (besser Aufrechterhaltung) der NO-Synthase- Expression von entscheidender Bedeutung für die NO-Synthesekapazität des Gefäß endothels und damit für die strukturelle und funktionelle Integrität der Gefäßwand (Gimbrone et al. (2000) Ann. N. Y. Acad. Sei. 920, 230).
Interleukin-10 (IL-10) ist ein wichtiges anti-inflammatorisches Zytokin bei chronisch rezidivierenden Entzündungserkrankungen wie z.B. Psoriasis, rheumatoide Arthritis oder Morbus Crohn, die durch eine übermäßige Aktivierung von T Helferzellen des Typs 1 verursacht sind (Moore et al. (2001) Annu. Rev. Immunol. 19, 683). Auch in der Pathogenese der Atherosklerose spielt die Infiltration und Aktivierung von Thl-Zellen in der Gefäßwand eine wichtige Rolle (Daugherty und Rateri (2002) Circ. Res. 90, 1039). IL-10 hemmt die Bildung von IL-12 in den mit den Thl-Zellen kommunizierenden antigenpräsentierenden Zellen. Hierzu zählen insbesondere dendritische Zellen und Monozyten/Makrophagen; aber auch Endothelzellen sind in der Lage die für die Antigenpräsentation benötigten MHC II-Moleküle auf ihrer Oberfläche zu exprimieren und biologisch aktives IL-12 freizusetzen. IL-12 selbst ist der wichtigste Faktor für die Differenzierung von naiven T-Helferzellen zu Thl-Zellen und stimuliert deren Proliferation (klonale Expansion). Interessanterweise kann die Synthese von IL- 12 in humanen Endothelzellen nur nach Kostimulation über das CD40-Rezeptor/CD40-Ligand- Syste induziert werden (Lienenlüke et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864). Hierbei exprimieren die Endothelzellen in der Regel den Rezeptor (CD40) und aktivierte Thl-Zellen den CD40-Ligand (auch als CD154 bezeichnet).
Das humane eNOS-Gen weist eine Reihe von Polymorphismen auf, bei denen eine einzelne Base ausgetauscht ist (SNP für Single nncleotide polymorphism), so auch eine T zu C Transition im Promoter des Gens an Position -786 (Figur 1). Linkage-Analysen belegen, dass dieser Basenaustausch nicht isoliert vorkommt, sondern stets mit einer A zu G Transition an Position -922 und einer T zu A Transition an Position -1486 assoziiert ist. Die funktionelle Bedeutung dieser Polymorphismen ist mit Ausnahme der T zu C Transition an Position -786, die nun von den Erfindern aufgeklärt wurde, bisher nicht bekannt (Wattanapitayakul et al. (2000) Trends Pharmacol. Sei. 22, 361). Bemerkenswert ist, dass in Westeuropa ebenso wie in der kaukasischen Bevölkerung Nordamerikas 12-15% homozygote Träger der _786C-Variante sind, d.h. sie weisen den Genotyp _786C/C auf. Circa 48% sind heterozygot für diesen SNP, d.h. sie weisen den Genotyp _786C/T auf und circa 38% sind homozygote Träger der _78δT- Variante, d.h. sie weisen den Genotyp T/T auf. Weiterhin interessant ist, dass diese Mutation bei anderen Säugetieren (Hund, Maus, Ratte und Rind) offenbar nicht vorkommt, da an der entsprechenden Position im eiVcλS'-Promoter dieser Spezies eine Base fehlt.
Unter dem Begriff koronare Herzkrankheit, kurz KHK, versteht man die in den Herzkranzgefäßen (Koronararterien) gebildete (manifeste) Atherosklerose, die zu einer fortschreitenden Verengung der betroffenen Gefäße führt. Folgen dieser Durchblutungsstörung in den Herzkranzgefäßen sind (nach Schweregrad in aufsteigender Reihenfolge) die stabile Angina pectoris (durch die Bildung von Umgehungsarterien, so genannten Kollateralen, wird die Atherosklerose-bedingte Durchblutungsstörung zumindest teilweise kompensiert, die Patienten werden nur bei körperlicher Belastung symptomatisch z.B. Auftreten von Brustschmerzen), die instabile Angina pectoris (durch Blutgerinnsel (Thrombosen) verursachte zunehmende Gefäß einengung, die Patienten haben bereits in Ruhe Brustschmerzen, circa 25% von ihnen erleiden innerhalb von 4 Wochen einen Myokardinfarkt), der Myokardinfarkt selbst (Totalverschluss einer Herzkranzarterie durch ein Blutgerinnsel) sowie der plötzliche Herztod (schwere Durchblutungsstörungen durch Akutverschluss einer oder mehrerer Herzkranzgefäße mit Herzrhythmusstörungen, die zum Herzstillstand führen). Die koronare Herzkrankheit und die durch sie ausgelöste Koronarinsuffizienz (durch die Mangeldurchblutung hervorgerufene Unterversorgung des Herzmuskels mit Sauerstoff) ist auch primär verantwortlich für die Ausprägung einer Herzmuskelschwäche (Herzinsuffizienz). Insofern stellt die koronare Herzkrankheit nach wie vor die häufigste Todesursache in den westlichen Industrienationen dar. Insofern kommt der Aufdeckung von genetischen Risikofaktoren für die Entwicklung der koronaren Herzkrankheit eine große sozioökonomische Bedeutung zu.
Die sehr seltene spontane Verkrampfung einer oder mehrerer Herzkranzgefäße (auch als Koronarspasmus, vasospastische Angina pectoris oder Prinzmetal-Angina bezeichnet) unterscheidet sich von der KHK insofern, dass die spontane Verkrampflmg die Extremform einer dynamischen Koronarstenose (exzentrische Stenose mit Konstriktion der plaquefreien Gefäßwand) bei Patienten mit instabiler Angina pectoris darstellt. .Patienten mit vasospastischer Angina pectoris sind oft Raucher und haben meist noch andere vaskuläre Phänomene (Migräne, Morbus Raynaud). Die Pathogenese der vasosp astischen Angina pectoris ist noch nicht geklärt. Vermutet wird eine Beteiligung des autonomen Nervensystems.
Die Erfinder haben überraschenderweise gefunden, dass Träger des ~786C/C-Genotyρs des eNOS- Gens - unabhängig von den anderen primären Risikofaktoren für die Atherosklerose in den Herzkranzgefäßen, d.h.. Bluthochdruck, Hypercholesterolämie, Rauchen und Diabetes - von einer rascheren Progredienz der koronaren Herzkrankheit betroffen sind (Tabelle 1). So weisen 19,0% der KHK-positiven Patienten den ~786C/C-Genotyp auf, -aber nur 4,4% der KHK- negativen Patienten; die Häufigkeit des C/C-Genotyps in der Kontrollpopulation beträgt 11,8%. Demzufolge haben diese Patienten ein deutlich erhöhtes Risiko, frühzeitig einen unter Umständen tödlichen Herzinfarkt zu erleiden. Der Grund für die raschere Manifestierung der Atherosklerose bei den homozygoten Trägern des Gendefekts ist eine verminderte NO- Synthesekapazität der Endothelzellen.
So konnten die Erfinder nachweisen, dass in kultivierten Endothelzellen, die aus der Nabelschnurvene von Spendern mit dem C/C-Genotyp isoliert worden waren, die typische durch eine Erhöhung der Wandschubspannung hervorgemfene Steigerung der eNOS-Expression auf mRNA- ebenso wie auf Proteinebene ausbleibt (Figur 2). Die mittels konventioneller RT- PCR erhaltenen Daten für die Expression der eNOS mRNA konnten mit Hilfe einer quantitativen Echtzeit-PCR-Analyse vollumfänglich bestätigt werden (T/T-Genotyp 454+27%) der statischen Kontrolle, P<0,05; C/T-Genotyp 278+27%, P<0,05; C/C-Genotyp 116±26%; n=8- 12). In Endothelzellen von Spendern mit dem -78δC/C-Genotyp konnte dagegen eine deutliche Zunahme der eNOS-Expression durch Erhöhung der Wandschubspannung ausgelöst werden, wenn die Zellen mit einem 22 bp langen Decoy-Oligonukleotid, welches dem C-Typ (SEQ ID NO: 1) nicht aber dem T-Typ-Allel (SEQ ID NO: 3) des eVOS-Gens entspricht, vorbehandelt wurden (Figur 3). Auch diese mittels konventioneller RT-PCR erhobenen Befunde konnten mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-PCR-Analyse vollumfänglich bestätigt werden (WSS 117+27% der statistischen Kontrolle; WSS plus C-Typ Decoy-Oligonukleotid 324+30%, P<0,05; WSS plus T-Typ Decoy-Oligonukleotid 133+47%; n=4).
Die Transkription wird von Proteinen gesteuert, die sich an die Starterregion eines Gens (Promotorregion) binden. Die korrekte Zusammenlagerung mehrerer dieser Transkriptionsfaktoren (Transkriptosom) bewirkt eine Aktivierung der RNA-Polymerase und initiiert die Transkription. Andererseits kann die Bindung eines falschen Transkriptionsfaktors die Bildung des Transkriptosoms verhindern und damit die Expression des Gens blockieren. Decoy-Oligonukleotide imitieren das Sequenzmotiv, an welches sich der Ziel- Transkriptionsfaktor in der Starterregion seines (seiner) Zielgens (Zielgene) bindet, und neutralisieren diesen. Infolgedessen wird die durch diesen Transkriptionsfaktor vermittelte Induktion bzw. Repression der Transkription verhindert.
In V. saphena-Segmenten von Patienten, die sich einer aortokoronaren Bypass-Operation unterziehen mussten, zeigte sich des weiteren, das die endothelabhängige NO-vermittelte Vasodilatation bei Individuen mit ~786C/C-Genotyp (n=13), unabhängig von dem Vorhandensein der primären Risikofaktoren für die Atherosklerose, deutlich schwächer ausgeprägt ist (Maximalantwort auf Acetylcholin um 35%> vermindert, P<0,05) als bei Trägern der beiden anderen Genotypen (n=41 bzw. 45). Dieser Befund stützt die Hypothese, dass die mangelnde schubspannungsinduzierte Aufrechterhaltung der eNOS-Expression bei den homozygoten Trägern des Gendefekts die NO-Synthesekapazität des Gefäß endothels limitiert und insofern der Manifestation der Atherosklerose Vorschub leistet.
Ferner haben die Erfinder gefunden, dass humane Endothelzellen nach Exposition gegenüber verschiedenen pro-inflammatorischen Zytokinen, d.h. unter (simulierten) Entzündungsbedingungen, ebenso wie nach Behandlung mit Vitamin D3, den Rezeptor für IL-10 exprimieren. Die Stimulation des Rezeptors, d.h. Inkubation der IL-10 Rezeptor exprimierenden Zellen - mit IL-10, resultierte in einer deutlichen Steigerung der eNOS-Expression in den Endothelzellen (Figur 4); ein Effekt, der mit Hilfe von elektrophoretischen Mobilitätsshift- Analysen und dem Einsatz entsprechender Decoy-Oligonukleotide auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 zurückgeführt werden konnte. Eine funktionelle Konsequenz dieser IL-10-vermittelten Steigerung der eNOS- Expression war die Hemmung der CD154-induzierten Neusynthese von IL-12 in den Endothelzellen (Figur 5), die NO-sensitiv ist (Modulation durch den NO-Synthase-Inhibitor Nitroarginin). Demnach kann IL-10 seine anti-inflammatorische Wirkung bei Thl-gewichteten chronischen Entzündungserkrankungen, insbesondere die Hemmung der IL-12-Synthese in den Endothelzellen, durch eine Steigerung der eNOS-Expression und der damit assoziierten verstärkten NO-Bildung entfalten. Die für den IL-10-Effekt wichtige STAT-Bindungsstelle im Promoter des humanen eNOS-Gens liegt circa 60 Basenpaare oberhalb der T zu C Transition an Position -786. Die Erfinder konnten zeigen, dass der ~ C/T-Polymorphismus einen Effekt auf die Induzierbarkeit der eNOS- Expression durch IL-10 hat. So kam es in Endothelzellen von Spendern mit -786C/C-Genotyp - trotz Vitamin D3 -Induktion der IL-10 Rezeptor-Expression - zu keiner Steigerung der eNOS- Expression durch LL-10 (Figur 4). Darüber hinaus hemmte die IL-10-Exposition die CD154- induzierte Synthese von IL-12 in diesen Zellen nicht, sondern verstärkte diese sogar (Figur 6). Bedingt durch die räumliche Nähe kommt es zu einer Hemmung der Bildung des Transkriptosoms im Bereich der STAT-Bindungsstelle durch den an Position -786 bindenden inhibitorischen Transkriptionsfaktor. Experimentelle Daten belegen, dass dieses Defizit, d.h. die fehlende Induktion der eNOS-Expression durch IL-10 und infolgedessen die fehlende IL-10- vermittelte Hemmung der IL-12-Synthese, durch Vorbehandlung der Endothelzellen mit dem zuvor beschriebenen C-Typ-Allel Decoy-Oligonukleotid (SEQ LD NO: 1 und SEQ ID NO: 5) vollständig kompensiert werden kann (Figur 6). Eine weitere vergleichende Genotypisierung im Zusammenhang mit der fehlenden Induzierbarkeit der eNOS-Expression durch IL-10 zeigt, dass kaukasische Patienten mit rheumatoider Arthritis eine deutlich höhere Prävalenz des _786C/C-Genotyps aufweisen als in der Normalbevölkerung (17,0% im Vergleich zu 11,8%, Tabelle 2). Bei diesen Patienten kann beispielsweise die intraartikuläre Applikation eines Decoy-Oligonukleotids während des Entzündungsschubs die endogene IL-10-vermittelte Hemmung der Thl -Zellantwort nachhaltig verstärken bzw. erst ermöglichen und so den Entzündungsprozess und die damit assoziierte Knorpeldestruktion im betroffenen Gelenk abschwächen. Auch für andere Thl-gewichtete chronische Entzündungserkrankungen wie dem Morbus Crohn zeigt sich eine in der Tendenz deutlich höhere Prävalenz des ~786C/C-Genotyps (Tabelle 2). Bei Erkrankungen dieses Typs liefert die systemische Applikation eines liposomal verpackten Decoy-Oligonukleotids wahrscheinlich den größtmöglichen therapeutischem Nutzen. Weitere
Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich bei den in den Patentansprüchen zusätzlich definierten Erkrankungen bzw. Komplikationen, wobei Atemwegserkrankungen insbesondere einer inhalativen Therapie mit den erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotiden, Hauterkrankungen insbesondere einer topischen Therapie und explantierte Organe bzw. Blutgefäße einer Inkubationsbehandlung ex vivo, d.h. außerhalb des Empfängerorganismus, zugänglich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Bereitstellung eines Decoy-Oligonukleotids, das in der Lage ist, sequenzspezifisch an ein Protein oder einen Proteinkomplex (im nachfolgenden als "Transkriptionsfaktor" oder "inhibitorischer Transkriptionsfaktor" bezeichnet) zu binden. Die Sequenz des Decoy-Oligonukleotids, das zur Verhinderung der Bindung des inhibitorischen Transkriptionsfaktors verwendet wird, ist die Sequenz, an die der Transkriptionsfaktor im Promoter des eNOS-Gens bindet. Das erfindungsgemäße Cis-Element Decoy weist folgende 10- mer Konsensus-Kernbindungssequenz auf: S^-CTBBCYGBCT-S' (SEQ LD NO: 33) wobei Y=C oder T und B=C, G oder T bedeutet. Das Cis-Element Decoy kann ferner größer als die 10-mer Kernbindungssequenz sein und am 5'-Ende und/oder am 3J-Ende verlängert werden. Entsprechende Mutationen im Bereich der Kernbindungssequenz (z.B. 5'-CTAGCTGACT-3') führen zu einem kompletten Verlust der Bindung des Transkriptionsfaktors an das Decoy- Oligonukleotid, sichtbar an der fehlenden biologischen Wirkung (Tabelle 3).
Femer betrifft die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Decoy-Oligonukleotiden, die in der Lage sind, sequenzspezifisch an den Transkriptionsfaktor zu binden und eine der folgenden Sequenzen haben, wobei hier nur jeweils ein Strang der Decoy-Oligonukleotide wiedergegeben ist und der komplementäre Strang ebenfalls umfasst ist:
S^AGCTCTTCCCTGGCCGGCTGAC-S' (SEQ ID NO: 1),
S'-AGCTCTTCCCTGGCTGGCTGAC-S ' (SEQ ID NO: 3), 5' :TTCCCTGGCCGGCTGACCCTGC-3' (SEQ ID NO: 5),
S^-CTTCCCTGGCTGGCTGACCCTGC-S' (SEQ ID NO: 7),
S^-GCTCTTCCCTGGCCGGCTG-S ' (SEQ ID NO: 9),
S^-CAAGCTCTTCCCTGGCCGG-S' (SEQ ID NO: 11),
5^-TCTTCCCTGGCCGGCTGAC -3' (SEQ ID NO: 13), S^-CTGGCCGGCTGACCCTGCC-S' (SEQ ID NO: 15),
S'-TCCCTGGCCGGCTGAC-S' (SEQ LD NO: 17),
5Λ-CTGGCCGGCT-3' (SEQ LD NO: 19),
5λ-CTGGCTGGCT-3' (SEQ LD NO: 21),
5Λ-TCCCTGGCYGGCTGAC-3' (SEQ ID NO: 23), wobei Y=C oder T bedeutet, 5λ-CTGGCYGGCTGAC-3 ' (SEQ JD NO: 25), wobei Y=C oder T bedeutet,
S -TCCCTBBCYGBCTGAC-S ' (SEQ ID NO: 27) mit Y=C oder T und B=C, G oder T,
S^-CCCTBBCYGBCTG-S ' (SEQ ID NO: 29) mit Y=C oder T und B=C, G oder T,
S^-CTBBCYGBCTGAC-S' (SEQ JD NO: 31) mit Y=C oder T und B=C, G oder T, und
5λ-CTBBCYGBCT-3' (SEQ JD NO: 33) mit Y=C oder T und B=C, G oder T. Insofern stellt die Verwendung der erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotide oder Cis- Element Decoys, die eine Konsensus-Kernbindungsstelle für den inhibitorischen Transkriptionsfaktor enthalten, das bevorzugte Verfahren zur spezifischen Inhibierung der Aktivität dieses Faktors dar. Die exogene Zufuhr einer großen Zahl von Transkriptionsfaktor- Bindungsstellen zu einer Zelle, insbesondere in viel höherer Zahl als im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der die Mehrzahl eines bestimmten Transkriptionsfaktors spezifisch an das jeweilige Cis-Element Decoy und nicht an seine endogenen Zliel-Bindungsstellen bindet. Dieser Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre endogene Bindungsstelle wird auch als Squenching bezeichnet. Squelching (oder auch Neutralisation genannt) von Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Cis-Element Decoys wurde u. a. erfolgreich bei Patienten eingesetzt, um ein übermäßiges Wachstum von glatten Gefäßmuskelzellen in aortokoronaren Venenbypässen zu inhibieren. Dabei wurden DNA- Fragmente verwendet, die spezifische Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor E2F enthalten (Mann et al. (1999) Lancet 354, 1493). Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur spezifischen Inhibierung der Aktivität des inhibitorischen Transkriptionsfaktors, der im Promotorbereich des eNOS-Gens an Position -786' bindet, umfassend den Schritt der Verabreichung eines Decoy-Oligonukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotide als Arzneimittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Decoy- Oligonukleotide zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Prävention oder Therapie der Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen (z.B. koronare Herzkrankheit mit Herzinfarkt und Herzinsuffizienz, zerebrale Durchblutungsstörungen mit Schlaganfall bzw. Multiinfarkt- Demenz sowie die periphere arterielle Verschlusskrankheit), chronischen Entzündungs- bzw. Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis (chronische Polyarthritis), Schuppenflechte einschließlich Psoariasis-Arthritis, allergisches Kontaktekzem und atopisches Ekzem (Neurodermitis), chronisch entzündliche Darmerkrankungen (insbesondere Morbus Crohn und Colitis ulcerosa), Diabetes Typ I und II und deren Folgeerkrankungen (z.B. diabetische Nephropathie, Retinopathie und Vaskulopathie), der multiplen Sklerose, von Sarkoidosen, Kollagenosen und Vaskulitiden (einschließlich Glo erulonephritiden), der akuten und chronischen Abstoßung transplantierter Organe, der graft versus host disease (GVHD) sowie dem Ischämie/Reperfusionsschaden von Organen im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff, der Vaskulopathie von Venenbypässen, der (Prä-)Eklampsie bzw. schwangerschaftsinduzierten Hypertonie, der arteriellen Hypertonie und ihren Folgeerkrankungen (z.B. Linksherzhypertrophie, Aneurysmenbildung mit der Gefahr von Massenblutungen und dem Gefäßwandumbau von Arterien und Arteriolen), der pulmonalen Hypertonie, der chronischen Niereninsuffizienz, chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD), bakteriellen Infektionen und ihren Folgeerkrankungen (z.B. Helicobacter pylori-Gastritis, tuberkulöse Perikarditis, Lyme-Borreliose mit nachfolgender Borrelien-Arthritis bzw. Neuroborreliose), sowie postinfektiöse Komplikationen von Infektionen mit Cytomegalie-, Hepatitis B- und C-, Herpes- und HI (human immunodeficiency)-Yiven wie z.B. portale Hypertonie und Fibröse bzw. opportunistische Infektionen, insbesondere Pneumocystis-carinii-Pneumonie.
Abgesehen von der grundsätzlichen Voraussetzung, dass die erfindungsgemäßen Decoy- Oligonukleotide den inhibitorischen Transkriptionsfaktor in vitro effektiv neutralisieren, ist es für die therapeutische Wirksamkeit entscheidend, dass das DNA-Molekül schnell und in einem ausreichenden Umfang in die Zielzelle aufgenommen wird. Darüber hinaus sollte das erfindungsgemäße Cis-Element Decoy eine bestimmte Länge nicht- überschreiten, da dies für den Transport in die Zielzelle limitierend ist. Geeignet ist jedes Decoy-Oligonukleotid mit einer Länge von mindestens 10 bp (Konsensus-Kernbindungssequenz) bis zu einer Länge von etwa 30 bp, vorzugsweise bis zu einer Länge von etwa 27 Basenpaaren, besonders bevorzugt bis zu einer Länge von etwa 23, insbesondere bevorzugt mit einer Länge von 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,- 20, 21, 22 oder 23 Basenpaaren.
Da das Cis-Element Decoy eine doppelsträngige Nukleinsäure ist, umfasst das erfindungsgemäße Decoy-Oligonukleotid jeweils nicht nur die Sense- oder Forward-Sequenz sondern auch die komplementäre Antisense- oder Reverse-Sequenz. Bevorzugte erfindungsgemäße Decoy-Oligonukleotide weisen eine 10-mer-Kernbindungssequenz für den inhibitorischen Transkriptionsfaktor auf, wie sie in SEQ ID NO:33 enthalten ist. Das Cis- Element Decoy kann jedoch auch eine zur vorstehenden Sequenz abweichende Sequenz aufweisen und länger als ein 10-mer sein. Besonders bevorzugt sind die Sequenzen wie sie in SEQ JD NO:l bis SEQ JD NO:34 enthalten sind. Diese Aufzählung der bevorzugten Sequenzen ist nicht abschließend. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass eine Vielzahl von Sequenzen als Inhibitor für den Transkriptionsfaktor verwendet werden können, solange sie die vorstehend aufgeführten Bedingungen der 10-mer Konsensus-Kernbindungssequenz und eine Affinität zu dem Transkriptionsfaktor aufweisen.
Die Affinität der Bindung einer Nukleinsäuresequenz an diesen Transkriptionsfaktor kann durch die Verwendung des Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191) bestimmt werden. Dieses Testsystem ist für die Qualitätskontrolle von Nukleinsäuren, die für die Verwendung in der Methode der gegenwärtigen Erfindung gedacht sind, oder die Bestimmungen der optimalen Länge einer Bindungsstelle geeignet. Sie ist auch für die Identifizierung von anderen Sequenzen, die durch den Transkriptionsfaktor gebunden werden, geeignet.
Die Methode der vorliegenden Erfindung moduliert die Transkription eines Gens oder von Genen in einer solchen Weise, dass das Gen oder die Gene, z.B. eNOS, vermehrt exprimiert werden. Vermehrte Expression im Rahmen der gegenwärtigen Erfindung bedeutet, dass die Transkriptionsrate gesteigert ist im Vergleich zu Zellen, die nicht mit einem erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotid behandelt werden. Solch eine Steigerung kann beispielsweise durch Northern Blot (Sambrook et al., 1989) oder RT-PCR (Sambrook et al., 1989) bestimmt werden. Typischerweise ist eine solche Steigerung zumindest eine 2-fache, besonders zumindest eine 5- fache, insbesondere zumindest eine 10-fache Enthemmung der Genexpression.
Oligonukleotide werden in der Regel schnell durch Endo- und Exonukleasen, im besonderen DNasen und RNasen in der Zelle abgebaut. Deshalb können die Nukleinsäuren modifiziert werden, um sie gegen den Abbau zu stabilisieren, so dass über einen längeren Zeitraum eine hohe Konzentration der Oligonukleotide in der Zelle beibehalten wird. Typischerweise kann eine solche Stabilisierung durch die Einführung einer oder mehrerer modifizierter Internukleotidbindungen erhalten werden.
Ein erfolgreich stabilisiertes DNA-Oligonukleotid oder Decoy-Oligonukleotid enthält nicht notwendigerweise eine Modifikation an jeder Intemukleotidbindung. Vorzugsweise sind die Internukleotidbindungen an den jeweiligen Enden beider Oligonukleotide des Cis-Element Decoys modifiziert. Dabei können die letzten sechs, fünf, vier, drei, zwei oder die letzte oder eine oder mehrere Internukleotidbindungen innerhalb der letzten sechs Internukleotidbindungen modifiziert sein. Ferner können verschiedene Modifikationen der Internukleotidbindungen in die Nukleinsäure eingeführt werden und die daraus entstehenden Decoy-Oligonukleotide auf sequenzspezifische Bindung an den inhibitorischen Transkriptionsfaktor, unter Verwendung des Routine EMSA-Testsystems, getestet werden. Dieses Testsystem erlaubt die Bestimmung der Bindungskonstante des Cis-Element Decoys und so die Bestimmung, ob die Affinität durch die Modifikation verändert wurde. Modifizierte Cis-Element Decoys, die noch eine ausreichende Bindung zeigen, können ausgewählt werden, wobei eine ausreichende Bindung zumindest etwa 50%) oder zumindest etwa 75%, und besonders bevorzugt etwa 100%> der Bindung der unmodifizierten Nukleinsäure bedeutet.
Cis-Element Decoys mit modifizierter Internukleotidbindung, die immer noch ausreichende Bindung zeigen, können überprüft werden, ob sie stabiler in der Zelle sind als unmodifizierte Cis-Element Decoys. Die mit den erfindungsgemäßen Cis-Element Decoys "transfizierten" Zellen werden zu verschiedenen Zeitpunkten auf die Menge der dann noch vorhandenen Cis- Element Decoys untersucht. Dabei wird vorzugsweise ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Texas-Rot) markiertes Cis-Element Decoy oder ein radioaktiv markiertes (z.B. 35S) Cis-Element Decoy eingesetzt mit anschließender digitaler Fluoreszenzmikroskopie bzw. Autoradiographie oder Szintigraphie. Ein erfolgreich modifiziertes Cis-Element Decoy hat eine Halbwertzeit in der Zelle, die höher ist als die eines unmodifizierten Cis-Element Decoys, vorzugsweise von zumindest etwa 48 Stunden, mehr bevorzugt von zumindest etwa 4 Tagen, am meisten bevorzugt von mindestens etwa 7 Tagen.
Geeignete modifizierte Internukleotidbindimgen sind in Uhlmann und Peyman ((1990) Chem. Rev. 90, 544) zusammengefasst. Modifizierte Internukleotid-Phosphat-Reste und/oder Nicht- Phosphor-Brücken in einer Nukleinsäure, die in einer Methode der gegenwärtigen Erfindung eingesetzt werden können, enthalten zum Beispiel Methylphosphonat, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Phosphoramidat, Phosphatester, während Nicht-Phosphor-Internukleotid- Analoge, beispielsweise Siloxan-Brücken, Carbonat-Brücken, Carboxymethylester-Brücken, Acetamidat-Brücken und/oder Thioether-Brücken enthalten. Bei der Verwendung Phosphorothioat-modifizierter Internukleotidbindungen sollten diese vorzugsweise nicht zwischen den Basen Cytosin und Guanin liegen, da dies zu einer Aktivierung der Zielzellen des Cis-Element Decoys im Sinne einer entzündlichen Reaktion führen kann. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Stabilisierung von Nukleinsäuren durch die Einführung straktureller Merkmale in die Nukleinsäure, welche die Halbwertzeit der Nukleinsäure erhöhen. Solche Strukturen, die Haarnadel- und Glocken-DNA enthalten, sind in US 5,683,985 offenbart. Gleichzeitig können modifizierte Intemukleotid-Phosphat-Reste und/oder Nicht-Phosphor-Brücken, zusammen mit den genannten Strukturen, eingeführt werden. Die sich daraus ergebenden Nukleinsäuren können im oben beschriebenen Testsystem auf Bindung und Stabilität geprüft werden.
Ein Cis-Element Decoy der vorliegenden Erfindung wird schnell in die Zelle aufgenommen. Eine ausreichende Aufnahme ist durch die Modulation der Expression von einem oder mehreren Genen, die einer Kontrolle durch den Ziel-Transkriptionsfaktor unterliegen, charakterisiert (z.B. eNOS). Das Cis-Element Decoy der vorliegenden Erfindung moduliert in bevorzugter Weise die Transkription von einem Gen oder Genen nach etwa 4 Stunden der Berührung mit der Zelle, mehr bevorzugt nach etwa 2 Stunden, nach etwa 1 Stunde, nach etwa 30 Minuten und am meisten bevorzugt nach etwa 10 Minuten. Eine typische Mischung, die in so einem Versuch eingesetzt wird, enthält 10 μmol/1 Cis-Element Decoy.
Um die Wirksamkeit der therapeutischen Decoy-Oligonukleotide sicher zu stellen, ist es wünschenswert die Patienten vor Verabreichung der Decoy-Oligonukleotide auf die ~786C/T- Varianz, d.h. auf die heterozygote oder homozygote Trägerschaft der C- Variante des eNOS- Gens, zu untersuchen bzw. zu diagnostizieren, wobei das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren verwendet wird, das vorzugsweise eine Echtzeit-PCR und nachfolgende Schmelzkurven-Analyse oder eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse (RFLP-Analyse) umfaßt.
Femer ist es wünschenswert die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren bei Patienten zu verwenden, die sich einem operativen Eingriff unterziehen müssen, bei dem beispielsweise die Blutversorgung eines oder mehrerer Organe kurzfristig unterbrochen wird oder eines oder mehrere autologe Gefäßtransplantate übertragen werden (z.B. aortokoronare Venenbypasschirurgie), um während und im Anschluss an den operativen Eingriff eine Behandlung mit den erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotiden und/oder mit Arzneimitteln durchzuführen, welche die NO-Synthesekapazität des Gefäßendothels steigern bzw. die Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid im Organismus erhöhen wie z.B. Angiotensin- Konversionsenzym (ACE)-Inhibitoren, HMG-CoA-Reduktase-rnhibitoren, Antioxidantien oder Stickstoffmonoxid-freisetzende Vasodilatatoren. Femer soll die Genotypisierung mit den erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren auch bei Spendern von Organen durchgeführt werden, um das Transplantat zwischen Explantation und Implantation (d.h. ex vivo) und/oder den Organempfänger für einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen, mehr bevorzugt von zumindest etwa 2 Wochen, am meisten bevorzugt von mindestens etwa 6 Monaten mit den erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotiden und/oder den oben genannten Arzneimitteln zu behandeln.
Femer können die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren dazu verwendet werden, das individuelle Risiko einer Person abzuschätzen, an einer der mit der _786C/T- Varianz des eNOS- Gens assoziierten Krankheiten zu erkranken und die Träger des ~786C/C-Genotyps im Sinne einer Präventionsstrategie, insbesondere im Hinblick auf die Vermeidung weiterer Riskofaktoren, zu beraten.
Femer können die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren dazu verwendet werden, Träger des C/C-Genotyps - alternativ oder zusätzlich zu der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Decoy-Oligonukleotiden - einer Therapie mit Arzneimitteln zuzuführen, welche die NO- Synthesekapazität des Gefäß endothels steigern bzw. die Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid im Organismus erhöhen, wie z.B. Angiotensin-Konversionsenzym (ACE) -Inhibitoren, HMG- CoA-Reduktase-Inliibitoren, Antioxidantien oder Stickstoffmonoxid-freisetzende
Vasodilatatoren.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren zur Diagnose einer "786C/T- Varianz im humanen eNOS-Gen, umfassend die Schritte: Zugabe von DNA-Oligonukleotiden zu einer Patienten-DNA-Probe, wobei ein DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromaufwärts der -786-Position des eNOS-Gens liegt und dem Sense-Strang entspricht und ein weiteres DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der -786-Position des eNOS-Gens liegt und dem Antisense-Strang entspricht, Durchführen einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR), Durchführen einer DΝA-Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens 4 Nukleotide lang ist und die Sequenz 5'-CCGG-3' aber nicht die Sequenz 5'-CTGG-3' enthält, und Nachweisen der durch die DNA-Spaltung erhaltenen DNA-Fragmente. Die DNA-Oligonukleotide dienen als Primer für die PCR. Mit der eNOS-Sequenz ist die unter der GenBank Accession Number L10693 (gi:348219) aufgeführte Sequenz gemeint, die hier auch als Sense-Strang bezeichnet wird und dem Strang entspricht, der die RNA-Sequenz des eiVOS-Genproduktes enthält. Der Start wird mit +1 bezeichnet, entsprechend liegt die Position -786 vor dem Startpunkt stromaufwärts. Als Antisense-Strang wird der zum Sense-Strang komplementäre Strang bezeichnet, der auch als Matrize bezeichnet wird.
Die DNA-Oligonukleotide (Primer) können jede Länge aufweisen, die für eine PCR erforderlich ist. Die DNA-Oligonukleotide können femer solche Sequenzen aus dem eNOS-Gens oder dem 5'-Bereich des eNOS-Gens aufweisen, die die Durchführung einer PCR erlauben. Dazu müssen die Primer weit genug auseinander liegen, so dass ein Nachweis der Amplifikate und der gespaltenen Amplifikate möglich ist, aber nicht soweit, dass kein Amplifikat mehr erzeugt wird. Femer sollten die Primer so ausgewählt werden, dass bei einer DNA-Spaltung DNA-Fragmente mit einer derart unterschiedlichen Größe entstehen, die einfach nachzuweisen sind. Vorzugsweise haben die Primer die Sequenzen gemäß SEQ JD NO: 35 und 36. Vorzugsweise ist das Restriktionsenzym Hpall und das Nachweisverfahren eine Agarose-Gelelektrophorese oder eine Kapillarelektrophorese.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend die vorstehenden DNA-Oligonukleotide (Primer), Reagenzien zur Durchführung einer PCR vorzugsweise einschließlich der Taq-Polymerase, ein Restriktionsenzym und Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Spaltung.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer ein Verfahren zur schnellen Bestimmung des " C/T- Varianz des humanen eNOS-Gens, umfassend folgende Schritte: Zugabe von DNA- Oligonukleotiden zu einer Patienten-DNA-Probe, wobei ein DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromaufwärts der -786-Position des e λS-Gens liegt und dem Sense-Strang entspricht (Primer 1), ein weiteres Fluoreszenzfarbstoff-modifiziertes DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die die -786-Position des eNOS-Gens umfasst und dem Sense- oder Antisense-Strang entspricht und zur "786C- Variante des e/VCW-Genpromotors komplementär ist (Detektionsprobe), ein weiteres Fluoreszenzfarbstoff-modifiziertes DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die dem Sense- oder Antisense-Strang entspricht (Ankerprobe) und wobei das 3 '-Ende der Ankerprobe 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 5 '-Ende der Detektionsprobe liegt, wenn die Anker- und Detektionsprobe jeweils dem Sense-Strang entspricht, und wobei das 5'- Ende der Ankerprobe 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 3 '-Ende der Detektionsprobe liegt, wenn die Anker- und Detektionsprobe jeweils dem Antisense-Strang entspricht, und ein weiteres DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der -786-Position des eNOS- Gens liegt und dem Antisense-Strang entspricht (Primer 2), Durchführen einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und Nachweis der " C- und/oder' " T- Variante mittels einer Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-(FRET)-gestützten DNA-Schmelzkurven-Analyse (Figur 7).
Die Primer 1 und 2 köimen jede Länge aufweisen, die für eine PCR erforderlich ist. Die Primer können fe er solche Sequenzen aus dem eNOS-Gen oder dem 5'-Bereich des eNOS-Gsns aufweisen, die die Durchführung einer PCR erlauben. Dazu müssen die Primer weit genug auseinander liegen, so dass ein Nachweis der Amplifikate und gegebenenfalls der gespaltenen Amplifikate möglich ist, aber nicht soweit, dass kein Amplifikat mehr erzeugt wird. Vorzugsweise besitzt Primer 1 die Sequenz 5'-CTGGGAACTGTAGTTTCCCTAG-3' gemäß SEQ JD NO: 56 und Primer 2 die Sequenz 5'-ACCCTGTCATTCAGTGACGCAC-3' gemäß SEQ JD NO: 57.
Vorzugsweise sind sowohl die im Verfahren verwendete Anker- als auch die Detektionsprobe zum Sense-Strang komplementär und weisen die Sequenz gemäß SEQ JD NO: 37 (5'- GGGTCAGCCGGCCAGGGAA-3') für die Detektionsprobe und die Sequenz gemäß SEQ JD NO: 38 (5'-AGCTTGATGCCCTGGTGGGAG-3') für die Ankerprobe auf. Die Detektionsprobe ist am 3 '-Ende kovalent mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt (z.B. Fluorescein, Anregungswellenlänge 494 nm). Die Ankerprobe ist am 5 '-Ende kovalent mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, der sich von dem der Detektionsprobe unterscheidet (z.B. LC Red-640, Emissionswellenlänge 640 nm). Femer ist die Ankerprobe an 3 '-Position der letzten Desoxyribose phosphoryliert, vorzugsweise mit PO4 3~\ Die Ankerprobe weist eine Schmelztemperatur von 5-10°C über dem Schmelzpunkt der Detektionsprobe auf. Die Farbstoffkombination ist so gewählt, dass der exzitierte Farbstoff der Detektionsprobe geeignet ist, den Farbstoff der Ankerprobe effizient so durch FRET anzuregen, dass er Licht einer definierten Wellenlänge emittiert solange beide Proben in unmittelbarer Nähe zueinander sind. Sowohl die Detektionsprobe als auch die Ankerprobe sind nicht für die PCR geeignet, da beide durch ihre chemischen Modifikationen in der 3'- bzw. 5'-Position keine enzymatische Kettenverlängenmg erlauben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind sowohl die im Verfahren verwendete Anker- als auch die Detektionsprobe zum Antisense-Strang komplementär und weisen die Sequenz gemäß SEQ JD NO: 59 (5'-TTCCCTGGCCGGCTGA-3') für die Detektionsprobe und die Sequenz gemäß SEQ JD NO: 58 (5'-GCTCCCACCAGGGCATCAAGCT-3') für die Ankerprobe auf. Die Detektionsprobe ist am 5 '-Ende kovalent mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. LC Red-640) gekoppelt. Die Ankerprobe (SEQ JD NO: 58) ist am 3 '-Ende kovalent mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, der sich von dem der Detektionsprobe unterscheidet (z.B. Fluorescein). Femer ist die Detektionsprobe an 3 '-Position der letzten Desoxyribose phosphoryliert, vorzugsweise mit PO4 . Die Ankerprobe weist eine Schmelztemperatur von 5- 10°C über dem Schmelzpunkt der Detektionsprobe auf. Die Farbstoffkombination ist so gewählt, dass der exzitierte Farbstoff der Ankerprobe geeignet ist, den Farbstoff der Detektionsprobe effizient so durch FRET anzuregen, dass er Licht einer definierten Wellenlänge emittiert solange beide Proben in unmittelbarer Nähe zueinander sind.
Vorzugsweise hat die Ankerprobe demnach eine Sequenz gemäß SEQ LD NO: 38 oder 58 und die Detektionsprobe eine Sequenz gemäß SEQ JD NO: 37 oder 59. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass DNA-Oligonukleotide beispielsweise mit anderen Sequenzen als Detektions- bzw. Ankerproben verwendet werden können als die hier spezifisch aufgeführten. Femer müssen die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Detektions- und Ankerproben nicht notwendigerweise den gleichen Strang binden sondern beispielsweise die Detektionsprobe kann den Sense-Strang und die Ankerprobe den Antisense-Strang binden oder umgekehrt. Es ist in einem solchen Fall nicht notwendig, dass die Sequenzen der Proben so gewählt werden, dass die Proben in unmittelbarer Nachbarschaft positioniert sind.
Für die Bestimmung der "786C/T-Varianz des humanen eNOS-Gens einer Patientenprobe werden in einen PCR- Ansatz neben den für die PCR notwendigen Reagenzien und die zu untersuchende Patienten-DNA außerdem die vorstehend beschriebenen Primer 1 und 2 und die Detektions- und Ankerprobe gegeben. Nach der durch die Primer 1 und 2 vermittelten PCR-Amplifikation eines Fragmentes des eiVOS'-Prornoters, welches die Position -786 des Gens enthält, wird die Temperatur des Ansatzes so erhöht, das alle DNA-Doppelstränge denaturieren. Hierauf wird die Temperatur wieder erniedrigt, so dass Detektions- und Ankerproben mit den Sense- bzw. Antisense-Strängen des amplifizierten Fragmentes hybridisieren, abhängig davon ob die Probenkombination zu dem Sense- oder Antisense-Strang komplemantär ist (siehe Fig. 8).
Nun wird beispielsweise bei den Proben gemäß SEQ JD NO:37 und 38, die komplementär zum Sense-Strang sind, die Schmelzkurve durch Anregung des Farbstoffes der Detektionsprobe und kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz der Ankerprobe bei gleichzeitiger Erhöhung der Temperatur (z.B. etwa 0,1°C pro Sekunde) aufgenommen. Hierbei wird ausgenutzt, dass die Übertragung der Anregungsenergie des Farbstoffes der Detektionsprobe auf den der Ankerprobe nur so lange funktioniert, wie beide Proben an den Sense-Strang gebunden haben. Eine Unterscheidung der T- von der C- Variante erfolgt über die Temperatur, bei der die Detektionsprobe vom Sense-Strang abschmilzt, also die FRET-induzierte Fluoreszenz deutlich abnimmt. Dies ist für die Detektionsprobe bei Fragmenten der ~786T~ Variante aufgrund des auftretenden G-T-Mismatches circa 12°C früher der Fall als bei Sense-Strängen der
"786C-Variante.
Femer wird nun beispielsweise bei den Proben gemäß SEQ JD NO:58 und 59, die komplementär zum Antisense-Strang sind, die Schmelzkurve durch Anregung des Farbstoffes der Ankerprobe und kontinuierlicher Messung der Fluoreszenz der Detektionsprobe bei gleichzeitiger Erhöhung der Temperatur (z.B. etwa 0,1°C pro Sekunde) aufgenommen. Hierbei wird ausgenutzt, dass die Übertragung der Anregungsenergie des Farbstoffes der Ankerprobe auf den der Detektionsprobe nur so lange funktioniert, wie beide Proben an den Antisense-Strang gebunden haben. Eine Unterscheidung der ~786T- von der ~786C- Variante erfolgt über die Temperatur, bei der die Detektionsprobe vom Antisense-Strang abschmilzt, also die FRET-induzierte Fluoreszenz deutlich abnimmt. Dies ist für die Detektionsprobe bei Fragmenten der "786T-Variante aufgrund des auftretenden C-A-Mismatches circa 12°C früher der Fall als bei Antisense-Strängen der -786C-Variante.
Für den Nachweis wird vorzugsweise ein Fluoreszenz-basierendes Echtzeit-PCR-Gerät (z.B. der LightCycler der Firma Röche) verwendet. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass nicht nur die Bestimmung eines Genotpyps in einer PCR, sondern auch gleichzeitig die Bestimmung von mehr als einem Genotyp in einer PCR, in einer sogenannten Multiplex-PCR, durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft femer DNA-Oligonukleotide mit der Sequenz gemäß SEQ JD NO: 35 bis 38 und 56 bis 59.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend die vorstehenden Primer 1 und 2, zwei weitere DNA-Oligonukleotide (Detektionsprobe und Ankerprobe), Reagenzien zur Durchführung einer PCR vorzugsweise einschließlich der Taq-Polymerase, und Reagenzien zur Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer ein Verfahren zur Modulation der Transkription von mindestens einem Gen in Zellen, insbesondere in eNOS-exprimierenden Zellen wie Endothelzellen, Epithelzellen der Lungen, Nieren und des weiblichen Urogenitaltraktes, Herzmuskelzellen, Thrombozyten und neuronale Zellen (Hippocampus), wobei die Methode den Schritt der Kontaktierung der genannten Zellen mit einer Mischung, enthaltend eine oder mehrere erfindungsgemäße Decoy-Oligonukleotide, die in der Lage sind, sequenzspezifisch an den inhibitorischen Transkriptionsfaktor zu binden, umfasst. Ein bevorzugtes Verfahren ist z.B. die intraartikuläre Injektion der Nukleinsäurehaltigen Mischung in ein oder mehrere Gelenke bei Patienten mit rheumatoider Arthritis.
Die Mischung enthaltend die erfindungsgemäßen Cis-Element Decoys wird mit den Zielzellen (z.B. Endothelzellen) in Berührung gebracht. Das Ziel dieses In-Berührung-Bringens ist die Übertragung der Cis-Element Decoys, die den inhibitorischen Transkritionsfaktor binden, in die Zielzelle (d.h. zum Beispiel die eNOS-exprimierende Endothelzelle). Deshalb können Nukleinsäure-Modifikation und/oder Zusatzstoffe oder Hilfsstoffe, von denen bekannt ist, dass sie die Durchdringung von Membranen erhöhen, im Rahmen der gegenwärtigen Erfindung benutzt werden (Uhlmann und Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 544).
Eine mit den Zielzellen in Berührung gebrachte Mischimg gemäß der Erfindung enthält in einer bevorzugten Ausführungsform im Wesentlichen nur Nukleinsäure und Puffer. Der für Decoy- Oligonukleotide geeignete Konzentrationsbereich liegt bei 0,1 bis 100 μmol/1, vorzugsweise bei 0,5 bis 25 μmol/1 und besonders bevorzugt bei 10 μmol/1. Es können ein oder mehrere geeignete Puffer zugesetzt werden. Ein Beispiel eines solchen Puffers ist eine modifizierte Ringer-Lösung enthaltend 145 mmol/1 Na+, 5 mmol 1 K+, 11 mmol/1 Cl", 2 mmol/1 Ca2+, 1 mmol/1 Mg2+, 10 mmol/1 Hepes, 145 mmol/1 Isethionat, 10 mmol/1 D-Glucose, pH 6,5.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält die Mischung zusätzlich mindestens einen Zusatzstoff und/oder Hilfsstoff. Zusatzstoffe und/oder Hilfsstoffe wie Lipide, kationische Lipide, Polymere, Liposomen, Nanopartikel, Nukleinsäure-Aptamere, Peptide und Proteine, die an DNA gebunden sind, oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle sind beabsichtigt, um beispielsweise die Einbringung von Nukleinsäuren in die Zelle zu erhöhen, um die Mischung auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten, um den Abbau der Nukleinsäure in der Zelle zu verhindern, und um die Lagerung der Nukleinsäuremischung vor der Verwendung zu erleichtem. Beispiele für Peptide und Proteine oder synthetische Peptid-DNA-Moleküle sind z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Liganden, Adhäsionsmoleküle, die alle modifiziert oder unmodifiziert sein können.
Zusatzstoffe, die die Cis-Element Decoys in der Zelle stabilisieren, sind beispielsweise Nukleinsäure-kondensierende Substanzen wie kationische Polymere, Poly-L-Lysin oder Polyethylenimin.
Die Mischung, die in dem Verfahren der gegenwärtigen Erfindung eingesetzt wird, wird bevorzugt lokal angewendet durch Injektion, Infusion, Katheter, pluronische Gele, Polymere, die anhaltend Medikamente freisetzen, oder jede andere Vorrichtung, die lokalen Zugang ermöglicht. Auch die ex vivo Anwendung der Mischung (Infusion bzw. Inkubation), verwendet im Verfahren der gegenwärtigen Erfindung, erlaubt einen lokalen Zugang.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung und beschränken in keiner Weise den Umfang der Erfindung.
1. Patienten
Für die Analyse der Häufigkeitsverteilung der _786C/T-Varianz des eNOS-Gens bei koronarer Herzkrankheit (KHK), rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose oder Morbus Crohn wurde aus Blut von Patienten (circa 2 ml) genomische DNA isoliert und diese mittels PCR-Amplifikation und nachfolgender RFLP-Analyse (s. u.) auf die Varianz hin untersucht. Bei der Analyse von Patienten mit rheumatoider Arthritis konnte auf zwei bereits vorhandene Kollektive zurückgegriffen werden. Hierbei konnten anonymisierte (Zahlencode) DNA-Proben von Patientinnen und Patienten der Rheuma-Ambulanz der Universität Göttingen und der Abteilung Rheumatologie des Universitätsklinikums Freiburg auf die Varianz gestestet werden. Beide Kollektive bieten eine typische Verteilimg von Patientinnen und Patienten mit rheumatoider Arthritis, d.h. die betroffenen Personen sind zu etwa 80% weiblich. Das Altersprofil reichte von 20 Jahren bis zu 80 Jahren mit Häufungen (peaks) der Patientenzahlen bei 35-40 Jahren (early onset) und 60-70 Jahren (late onset).
Für die Analyse der " C/T-Varianz des e/VÖS-Gens bei koronarer Herzkrankheit wurden Blutproben während der Durchführung einer Herzkatheteruntersuchung entnommen. Auf diese Weise konnte das Vorliegen der Erkrankung eindeutig festgestellt bzw. ausgeschlossen werden. Alle Patienten wurden vor der Blutabnahme mündlich und schriftlich aufgeklärt und hatten der Verwendung ihrer Blutproben schriftlich zugestimmt. Die Genotypisierung erfolgte in anonymisierter Form (Zahlenkodierung), Alter, Diagnose, Geschlecht und Risikofaktorprofil der zugehörigen Personen wurden nach erfolgter Analyse mitgeteilt. Für die statistische Analyse der Genotypverteilung wurden Individuen bis 64 Jahre herangezogen. Die Verteilung der bereits bekannten primären Risikofaktoren für KHK (Hypertonie, Diabetes mellitus, Zigarettenrauchen und Hypercholesterinämie) war unabhängig vom Genotyp der jeweiligen Patienten.
Tabelle 1
-7S6 C/T-Polymorphismus des eNOS-Geas bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit. OR, odds ratio im Vergleich zum Kontrollkollektiv. Kontrollpersonen, DNA aus Nabelschnüren.
Als Vergleichskollektiv zur Genotypverteilung wurde DNA aus der Nabelschnurarterie von Neugeborenen aus Göttingen und Umgebung (im Umkreis von circa 70 km) verwendet. Auch diese Proben waren anonymisiert und die Eltern der Kinder hatten zuvor eine schriftliche Einverständniserklärung für die entsprechende Verwendung der Nabelschnur abgegeben. Für die Genotypisierung der Patienten mit multipler Sklerose bzw. Morbus Crohn standen anonymisierte genomische DNA-Proben zur Verfügung (Universitätsklinikum Charite Berlin, Institut für Neuroi munologie und Universität Göttingen, Abteilung Immunologie).
Tabelle 2
-786, C/T-Polymorphismus des e/YQS'-Gens bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und Morbus
Crohn. OR, odds ratio. Kontrollpersonen, DNA aus Nabelschnüren.
2. Genotypisierung
Die C-Variante des humanen e/VÖS-Genpromotors besitzt im Vergleich zur T- Variante eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle für das Restriktionsenzym Hpa II und ist somit einer klassischen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Anabyse (RFLP-Analyse) zugänglich. Alternativ ist die oben genannte Varianz auch einer Echtzeit-PCR gefolgt von einer FRET- Analyse zugänglich.
RFLP-Analyse
Für die RFLP-Analyse wurden aus genomischer DNA (aus Blut mit Hilfe des QIAamp DNA Mini-Kits von Qiagen, Hilden gewonnen) mit Hilfe e OS-Promotor-spezifischer Primer (Vor- wärtsprimer 5'-GAGTCTGGCCAACACAAATCC-3' (SEQ JD NO: 35); umgekehrter Primer 5'-GACCTCTAGGGTCATGCAGGT-3') (SEQ JD NO: 36) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein DNA-Fragment (657 Basenpaaren (bp); von Position -1135 bis -456 des humanen eNOS-Gens) amplifiziert und anschließend einer spezifischen Hydrolyse durch die Restrik- tionsendonuklease Hpa JJ unterworfen. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Je nach Genotyp entstehen aus dem 657 bp-Fragment 2 oder 3 kleinere DNA-Fragmente. Während die T- Variante des Promoters im betrachteten Ab- schnitt nur eine Hpa II-Schnittstelle besitzt und so nach Hydrolyse durch Hpa JJ in zwei Fragmente (284 bp und 373 bp) zerfällt, bewirkt die zusätzliche Schnittstelle der C-Variante, dass 3 Fragmente entstehen (46 bp - im verwendeten Elektrophoresesystem nicht detektierbar - 284 bp und 327 bp). Insofern ließen sich die drei möglichen Genotypen (~ C/C, T/T und C/T) nach Elektrophorese durch folgende Fragmentmuster eindeutig identifizie- ren: ~786T/T: 284 und 373 bp; ~786C/C: 284 und 327 bp; und _786C/T: 284, 327 und 373 bp.
FRET-Analyse
Für die FRET-Analyse wurden aus genomischer DNA (aus Blut mit Hilfe des QIAamp DNA Mini-Kits von Qiagen, Hilden gewonnen) mit Hilfe eNO£-Promotor-spezifischer Primer (Vorwärtsprimer 5'-CTGGGAACTGTAGTTTCCCTAG-3' (SEQ ID NO: 56); umgekehrter Primer 5'-ACCCTGTCATTCAGTGACGCAC-3' (SEQ JD NO: 57) durch PCR in einem Echtzeit-PCR-Gerät (LightCycler der Firma Röche) ein DNA-Fragment (137 bp); von Position - 848 bis -711 des humanen eNOS-Gens, GenBank Accession Νo. L10693) amplifiziert. Nach der PCR-Amplifikation wurde mit Hilfe der vor der PCR zugegebenen Ankerprobe (SEQ ID NO: 58) und Detektionsprobe (SEQ JD NO: 59) eine Schmelzkurve aufgenommen, die den Fluoreszenzresonanzenergie-Transfer vom Fluoreszenzfarbstoff der Ankerprobe (Fluorescein) auf den der Detektionsprobe (LC-Red 640) aufnahm. T-Allele konnten aufgrund ihres Schmelzpunktes (circa 48°C) eindeutig von C-Allelen (Schmelzpunkt circa 60°C) unterschieden werden.
3. Zellkultur
Humane Endothelzellen wurden durch Behandlung mit 1,6 U/ml Dispase in Hepes-modifizierter Tyrodelösung für 30 Min. bei 37°C aus Nabelschnurvenen von zuvor genotypisierten Spendern isoliert und auf Gelatine-beschichteten 6-Loch-Gewebekulturschalen (2 mg/ml Gelatine in 0,1 M HC1 für 30 Min. bei Umgebungstemperatur) in 1,5 ml M199 Medium (Gibco Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland), enthaltend 20%. fötales Kälbersemm, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 10 U/ml Nystatin, 5 mmol/1 HEPES und 5 mmol/1 TES, 1 μg/ml Heparin und 40 μg/ml endothelialer Wachstumsfaktor, kultiviert. Sie wurden durch ihre typische Pflasterstein-Morphologie, positive Immunfärbung für von Willebrandt-Faktor (vWF) und fluorimetrischen Nachweis (FACS) von PECAM-1 (CD31) sowie negative Immunfarbung für glattmuskuläres α-Actin (Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191) identifiziert.
Die Maus-Myelomzelllinie P3xTBA7 (stabil mit humanem CD40-Liganden transfiziert) und P3x63Ag8.653 (nicht transfizierte Kontrollzellen) wurden in RPMI 1640 Medium (Life Technologies), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 10 U/ml Nystatin kultiviert. Die Applikation von Wandschubspannung (in der Regel 30 dyn/cm2 für 24 bis 36 Stunden) bei den kultivierten Endothelzellen wurde mit Hilfe eines im Brutschrank platzierbaren Kegel-Platte- Viskosimeters wie in Schubert et al. (2000) Circ. Res. 87, 1188 beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Dimension der Kulturschalen (3,5 cm im Gegensatz zu 10,0 cm Durchmesser).
4. RT-PCR-Analyse Konventionelle RT-PCR
Die zelluläre Gesamt-RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert, daran anschließend wurde eine cDNA-Synthese mit 1-5 μg RNA und 200 U Superscript™ II Reverser Transkriptase (Life Technologies) in einem Gesamtvolumen von 20 μl entsprechend der Herstelleranleitung durchgeführt. Für den Abgleich der cDNA-Mengen in den verschiedenen Proben wurden 5 μl der 1:10 verdünnten cDNA-Lösung (entsprechend einem RNA-Äquivalent von 25-125 ng) einer PCR-Reaktion (1 U Taq DNA-Polymerase ([Life Technologies]) mit spezifischen Primern für die konstitutiv exprimierten Genprodukte Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und ribosomales Protein L32 (rpl32) unterworfen. GAPDH und rpl32 dienten hierbei als interne Kalibrierungs-Standards. Die PCR- Produkte wurden auf 1,5% Agarose-Gelen enthaltend 0,1 % Ethidiumbromid separiert und die Intensität der Banden wurde densitometrisch mit einem CCD-Kamerasystem und der One-Dscan Gelanalyse-Software von Scanalytics (Billerica, MA, USA) bestimmt, um in nachfolgenden PCR- Analysen das Volumen der cDNA anzupassen.
Alle PCR-Reaktionen wurden einzeln für jedes Primerpaar in einem lizenzierten Thermocycler (PC-Personal Cycler, Biometra, Göttingen) durchgeführt. Die individuellen PCR-Bedingungen waren wie folgt: eNOS - Produktgröße 581 bp, 30 Zyklen, Anlagerungstemperatur 58°C, Vorwärtsprimer 5'- GGAACCTGTGTGACCCTC-3'(SEQ JD NO: 39), umgekehrter Primer 5'-CCACGTCATACT- CATCCA-3'(SEQ JD NO: 40)
IL-12p40 -281 bp, 30 Zyklen, 62°C, 5'-GTACTCCACATTCCTACTTCT-3'(SEQ JD NO: 41), 5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3'(SEQ JD NO: 42) IL-10 Rezeptor - 565 bp, 32 Zyklen, 59°C, 5'-GGACACCCATCCCAAATCAGTC-3'(SEQ FD NO: 43), 5'-CACGGTGAAATACTGCCTGGTG-3'(SEQ ID NO: 44)
GAPDH - 571 bp, 19 Zyklen, 58°C, 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCG-3'(SEQ ID NO: 45), 5'- CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3 '(SEQ JD NO: 46) rpl32 - 368 bp, 20 Zyklen, 60°C, S^-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-S SEQ JD NO: 47), 5'- ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3 '(SEQ ID NO: 48)
Alle Amplifikate wurden durch DNA-Sequenzierung (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Pharmacia, Freiburg, Deutschland) mit nachfolgendem Abgleich mit den entsprechenden Gensequenzen (Referenz: GenBank, NCBI, Bethesda, USA) eindeutig identifiziert.
Echtzeit-PCR
Der Echtzeit-PCR-Nachweis der eNOS mRNA-Expression wurde im Wesentlichen wie von Wagner et al. (2003), J. Immunol. 170, 1462 beschrieben durchgeführt. Fünf μl cDNA (M-MLV Reverse Transcriptase; Promega, Mannheim, Deutschland) entsprechend 10 ng Gesamt-RNA wurde für jede PCR-Reaktion verwendet, die mithilfe des QuantiTect SYBR Green PCR-Kits der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) und einem LightCycler (Röche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) durchgeführt wurde. Die eNOS-spezifischen mRNA-Fragmente (GenBank Accession No. NM 000603, 129 bp, Position 1151 bis 1279) wurden mithilfe des Vorwärtsprimers 5 '-GGATGTGGCTGTCTGCATGGAC-3 ' (SEQ JD NO: 60) und des umgekehrten Primers 5 '-TGGTCCACGATGGTGACTTTGG-3 ' (SEQ JD NO: 61) amplifiziert. Zur Normalisierung wurde parallel die cDNA für GAPDH (GenBank Accession No. BT006893, 138 bp. Position 525 bis 662) amplifiziert (Vorwärtsprimer 5'- GACCACAGTCCATGCCATCACTGC-3' (SEQ JD NO: 62); umgekehrter Primer 5'- ATGACCTTGCCCACAGCCTTGG-3' (SEQ ID NO: 63)). Das Programm zur Amplifizierung beider Genprodukte bestand aus einer 15minütigen Inkubation bei 95°C gefolgt von 40 Zyklen mit 5 s bei 95°C, 25 s bei 58°C und 10 s bei 72°C. Die Schmelzkurve wurde mit einer Steigung von 0,2°C/s von 65 bis 95°C programmiert und die Fluoreszenzintensität nach jedem Zyklus gemessen. Für die quantitative Analyse wurde eine Standardkurve für beide Genprodukte mit seriellen Verdünnungen der entsprechenden PCR-Fragmente (102 bis 5xl08 Kopien/Reaktion) mit gemessen. Dazu wurden die Genprodukte in das Plasmid pCR-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) kloniert.
5. Decoy-Oligonukleotid-Technik
Doppelsträngige Decoy-Oligonukleotide wurden von den komplementären einzelsträngigen Phosphorothioat-verbundenen Oligonukleotiden (Eurogentec, Köln, Deutschland) wie bei Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191 beschrieben hergestellt. Die kultivierten humanen Endothelzellen wurden für 4 Stunden mit dem jeweiligen Decoy-Oligonukleotid in einer Konzentration von 10 μmol/1 vorbehandelt und nach dem Mediumwechsel dem Inkubationsmedium in derselben Konzentration zugesetzt. Die einzelsträngigen Sequenzen der Oligonukleotide waren wie folgt (unterstrichene Buchstaben kennzeichnen Phosphorothioat-verbundene Basen):
STAT-3 5'-CCTGCATTCTGGGAACTGTAG-3' (SEQ JD NO: 49), STAT-3 mutated 5'-CCTGTATGCCGTGAGCTATAG-3', (SEQ JD NO: 50)
sowie die in Tabelle 3 abgebildeten Decoy-Oligoukleotide zur Neutralisierung des an die Position -786 des eNOS-G ns bindenden Traskriptionsfaktors. Die Sequenz des STAT-3 Decoy- Oligonukleotids entspricht der Position -858 bis -838 im humanen eNOS-Gen.
Tabelle 3
Restaurierung der inhibitorischen Wirkimg von IL-10 auf die CD154-induzierte IL-12 p40 mRNA-Expression (ausgedrückt in % der IL-12 p40 mRNA-Expression in CD154-stimulierten Kontrollzellen; Mittelwert ± S.E. von n individuellen Experimenten) in humanen kultivierten Endothelzellen von Spendern mit ~786C/C-Genotyp durch verschiedene Cis-Element Decoys (angegeben ist jeweils nur ein Strang der Decoy-Oligonukleotide sowie die entsprechende Position im Promoter des humanen eNOS-Gens). Bezugsgröße ist CD154-induzierte IL-12 p40 mRNA-Expression nach IL-10-Zusatz in Endothelzellen mit "786T/T-Genotyp (55±2% der Kontrolle, n=6; vollständige Restaurierung) bzw. _786C/C-Genotyp (136+16% der Kontrolle, n=21; kein Effekt).
SEQ Position Sequenz (5"-> 3') IL-12 p40 n
ID NO (%) 1 -800/-779 AGCTCTTCCCTGGCCGGCTGAC 32 + 8 7
3 -800/-779/T AGCTCTTCCCTGGCTGGCTGAC 60 + 10 7
5 -79S/-774 CTTCCCTGGCCGGCTGACCCTGC 48 + 7 5
7 -796/-774/T CTTCCCTGGCTGGCTGACCCTGC 61 2
9 -799/-781 GCTCTTCCCTGGCCGGCTG 65 2
11 -802/-784 CAAGCTCTTCCCTGGCCGG 83 2
13 -797/-779 TCTTCCCTGGCCGGCTGAC 41 + 7 5
15 -791/-773 CTGGCCGGCTGACCCTGCC 65 2
17 -794/-779 TCCCTGGCCGGCTGAC 30 2
19 -791/-782 CTGGCCGGCT 13 + 9 3
21 -791/-782/T CTGGCTGGCT 47 + 20 3
51 -788/-770 GCCGGCTGACCCTGCCTCA 105 1
52 künstlich/T TCTTCCCTAGCTGACTGAC 136 + 25 5
53 künstlich TCCCTGACCGACTCAG 80 + 21 3
54 künstlich/T TCCCTAGCTGACTGAC 90 1
6. Elektrophoretische Mobilitätsshift-Analyse (EMSA)
Die nuklearen Extrakte und [3 P] -markierten doppelsträngigen Konsensus-Oligonukleotide (Santa C z Biotechnologie, Heidelberg, Deutschland), nicht-denaturierende Polyacrylamid- Gelelektrophorese, Autoradiographie und Supershift-Analyse wurden wie bei Krzesz et al. (1999) FEBS Lett. 453, 191 beschrieben durchgeführt. Dabei wurden die folgenden Decoy- Oligonukleotide (einzelsträngige Sequenz, Kembindungssequenz ist unterstrichen) verwendet:
STAT-3 5 '-CCTGCATTCTGGGAACTGTAG-3 ' (SEQ JD NO: 49)
SIE 5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTCTACA-3 ' (SEQ JD NO: 55)
An das Oligonukleotid SIE binden sowohl STAT-1 wie STAT-3. Insofern wurden zusätzlich Supershift-Analysen mit einem monoklonalen Maus-Anti-Human Supershift-Antikörper (Santa Cmz Biotechnologie) durchgeführt (Zugabe in einer Konzentration von 10 μg/ml zum Kemextrakt für 1 Stunde bei Raumtemperatur).
7. Western Blot-Analyse
Die humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen wurden durch fünfmaliges aufein- anderfolgendes Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37°C aufgeschlossen. Protein-Extrakte wurden wie bei Hecker et al. (1994) Biochem J. 299, 247 beschrieben hergestellt. 20-30 μg Protein wurden mit Hilfe einer 10%igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen in der Gegenwart von SDS nach Standardprotokoll aufgetrennt und auf eine BioTrace™ Polyvinylidene Fluoride Transfermembran (Pall Corporation, Roßdorf, Deutschland) transferiert. Zum immulologischen Nachweis der eNOS und des IL-10 Rezeptors wurden monoklonale Maus-Anti-Human- Antikörper (BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland; 1:5000 bzw. 1:3000 Verdünnung) verwendet. Die Proteinbanden wurden nach Hinzufügen eines Peroxidase-gekoppelten-Anti-Maus-IgG (1:3000, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mit Hilfe der Chemilumineszenz-Methode (SuperSignal Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL, USA) und nachfolgender Autoradiographie (Hyperfilm™ MP, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England) nachgewiesen. Der Auftrag und Transfer gleicher Proteinmengen wurde nach „Strippen" der Transfermembran (5 Minuten 0,2 N NaOH, nachfolgend 3 x 10 Minuten Waschen mit H2O) durch Nachweis gleicher Proteinbanden von ß-Aktm mit einem monoklonalen primären Antikörper und einem Peroxidase-gekopplelten Anti-Maus IgG (beide von Sigma-Aldrich, 1:3000 Verdünnung) gezeigt.
8. IL-12 p40 ELISA Der Enzym-gekoppelte Antikörper-Bindungs-Assay (ELISA) ist eine Standardmethode zur quantitativen Analyse von Proteinen. Er wurde wie in Lienenlüke et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2864 beschrieben zum Nachweis der IL-12 p40-Untereinheit im Überstand der inkubierten humanen Endothelzellen eingesetzt.
9. Statistische Analyse
Wenn nicht anders angezeigt, sind alle Daten in den Figuren als Mittelwert ± SEM von n Experimenten angegeben. Die statistische Auswertung wurde mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Dunnett Post-Test durchgeführt. Ein P-Wert <0.05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.

Claims

Patentansprüche
1. Decoy-Oligonukleotide mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ JD NO:l bis 34.
2. Decoy-Oligonukleotide nach Ansprach 1 als Arzneimittel.
3. Decoy-Oligonukleotide nach Anspruch 1 zur Herstellung eines A-zneimittels zur Prävention oder Therapie von Atherosklerose, der koronaren Herzkrankheit, von Herzinfarkt, Herzinsuffizienz, zerebralen Durchblutungsstörungen, Schlaganfall und Multiinfarkt-Demenz, der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, von chronischen
Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen, der rheumatoiden Arthritis (chronische Polyarthritis), der Schuppenflechte einschließlich Psoariasis-Arthritis, von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, von Diabetes Typ I und II, der diabetischen Nephropathie, Retinopathie und Vaskulopathie, von multipler Sklerose, von Sarkoidosen, Kollagenosen und Vaskulitiden einschließlich
Glomemlonephritiden, der akuten und chronischen Abstoßung transplantierter Organe, der graft versus host disease (GVHD) sowie dem Ischämie/Reperfusionsschaden von Organen im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff, der Vaskulopathie von Venenbypässen, von (Prä-)Eklampsie und schwangerschaftsinduzierter Hypertonie, der arteriellen Hypertonie, Linksherzhypertrophie, Aneurysmenbildung mit der Gefahr von Massenblutungen und dem Gefäßwandumbau, von pulmonaler Hypertonie, von chronischer Niereninsuffizienz, von chronisch obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD), von bakteriellen Infektionen, Helicobacter pylori-Gastritis, tuberkulöse Perikarditis, Lyme-Borreliose mit nachfolgender Borrelien-Arthritis imd Neuroborreliose, und von postinfektiösen Komplikationen nach Infektion mit Cytomegalie-, Hepatitis B- und C-, Herpes- und HI (human immunodeßciencyyViren wie z.B. portale Hypertonie, Fibröse und opportunistischen Infektionen wie z.B. der Pneumocystis-carinii-Pneumonie.
4. Verfahren zur Diagnose einer ~786C/T- Varianz im eNOS-Gen, umfassend die folgenden Schritte: a) Zugabe von DNA-Oligonukleotiden zu einer Patienten-DNA- oder cDNA-Probe, wobei ein DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromaufwärts der -786-Position liegt und dem Sense-Strang des eNOS-Gens entspricht und ein weiteres DNA- Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der -786-Position liegt und dem Antisense-Strang des eNOS-Gens entspricht, b) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), c) Durchführen einer DNA-Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens 4 Nukleotide lang ist und die Sequenz 5'-
CCGG-3' aber nicht die Sequenz 5'-CTGG-3' enthält, und d) Nachweisen der durch die DNA-Spaltung erhaltenen DNA-Fragmente.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei nach Schritt a) der Schritt a') Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff-modifizierten DNA-Oligonukleotiden, wobei ein erstes DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die die -786-Position des eNOS- Gens umfasst und dem Sense- oder Antisense-Strang entspricht und zur -786 C- Variante des e/VOS-Genpromotors komplementär ist, und ein zweites DNA- Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die dem Sense- oder Antisense-Strang entspricht, wobei das 3 '-Ende des zweiten DNA-Oligonukleotids 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 5 '-Ende des ersten DNA-Oligonukleotids liegt, wenn die Sequenzen der DNA-Oligonukleotide dem Sense-Strang entsprechen, und wobei das 5 '-Ende des zweiten DNA-Oligonukleotids 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 3 '-Ende des ersten DNA-Oligonukleotids liegt, wenn die Sequenzen der DNA-Oligonukleotide dem Antisense-Strang entsprechen, eingefügt wird und an Stelle von Schritt c) und d) der Schritt e) Nachweis der -786 C- oder -786 T- Variante mittels einer Fluoreszenzresonanz- Energietransfer-(FRET)-gestützten DNA-Schmelzkurven- Analyse durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Ansprach 4 oder 5, wobei die DNA-Oligonukleotide in Schritt a) Sequenzen gemäß SEQ JD NO: 35 und 36 oder 56 und 57 aufweisen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Fluofeszenzfarbstoff-modifizierten DNA-Oligonukleotide in Schritt a') Sequenzen gemäß SEQ JD NO: 37 und 38 oder SEQ
JD NO: 58 und 59 aufweisen.
8. Verfahren nach Ansprach 4 oder 6, wobei das Restriktionsenzym HpaT ist.
9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 4 bis 8, umfassend DNA- Oligonukleotide, wobei ein DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromaufwärts der -786-Position dem Sense-Strang des eNOS-Gens entspricht und ein weiteres DNA- Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die stromabwärts der -786-Position dem Antisense-
Strang des eNOS-Gens entspricht, gegebenenfalls Fluoreszenzfarbstoff-modifizierte DNA- Oligonukleotide, wobei ein erstes DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die die -786-Position des eNOS-Gens umfasst und dem Sense- oder- Antisense-Strang entspricht und zur —786 C- Variante des eNOS-Genpromotors komplementär ist, und ein zweites DNA-Oligonukleotid eine Sequenz aufweist, die dem Sense- oder Antisense-Strang entspricht, wobei das 3 '-Ende des zweiten DNA-Oligonukleotids 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 5 '-Ende des ersten DNA-Oligonukleotids liegt, wenn die Sequenzen der DNA-Oligonukleotide dem Sense-Strang entsprechen, und wobei das 5 '-Ende des zweiten DNA-Oligonukleotids 1-5 Nukleotide stromaufwärts vom 3 '-Ende des ersten DNA-Oligonukleotids liegt, wenn die Sequenzen der DNA-Oligonukleotide dem
Antisense-Strang entsprechen, Reagenzien zur Durchführung einer PCR und entweder ein Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz aufweist, die mindestens 4 Nukleotide lang ist und die Sequenz 5'-CCGG-3' aber nicht die Sequenz 5'-CTGG-3' enthält und Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Spaltung, oder Reagenzien zur Durchführung einer Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-(FRET)-gestützten DNA-Schmelzkurven-
Analyse.
10. DNA-Oligonukleotide mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 35 bis 40 sowie 56 bis 61.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012625A2 (en) * 2004-07-22 2006-02-02 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Stat3 decoy oligonucleotides and uses therefor
EP3199635B1 (de) 2007-05-11 2019-02-06 Adynxx, Inc. Genexpression und schmerzen
US8466187B2 (en) 2007-09-18 2013-06-18 Thermolife International, Llc Amino acid compositions
US12612370B2 (en) 2011-03-02 2026-04-28 Thermolife International, Llc Amino acid compositions
CN104487096B (zh) 2012-05-10 2020-09-15 埃迪恩克斯股份有限公司 用于活性成分递送的配制物
AU2015301491A1 (en) 2014-08-15 2017-02-02 Adynxx, Inc. Oligonucleotide decoys for the treatment of pain
AU2021377897A1 (en) 2020-11-12 2024-09-12 Thermolife International, Llc Methods of increasing blood oxygen saturation
US11865139B2 (en) 2020-11-12 2024-01-09 Thermolife International, Llc Method of treating migraines and headaches
KR20230145103A (ko) 2021-02-11 2023-10-17 써모라이프 인터내셔널, 엘엘씨 산화질소 기체의 투여 방법
CN116298310A (zh) * 2023-02-17 2023-06-23 青岛阜外心血管病医院有限公司 检测标志物的试剂在制备用于诊断和/或预测慢性阻塞性肺疾病的产品中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0732929B1 (de) * 1993-10-29 2008-05-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutische verwendung von cis-element-fallen in vivo
WO1999065928A2 (en) * 1998-06-19 1999-12-23 Genzyme Corporation Polynucleotide population isolated from non-metastatic and metastatic breast tumor tissues
WO2001053537A2 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Dzgenes, Llc Nitric oxide synthase gene diagnostic polymorphisms

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004027062A2 *

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