EP1525248A1 - Immobilisierungsschicht fur biosensoren - Google Patents

Immobilisierungsschicht fur biosensoren

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EP1525248A1
EP1525248A1 EP03753578A EP03753578A EP1525248A1 EP 1525248 A1 EP1525248 A1 EP 1525248A1 EP 03753578 A EP03753578 A EP 03753578A EP 03753578 A EP03753578 A EP 03753578A EP 1525248 A1 EP1525248 A1 EP 1525248A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
immobilization layer
layer according
immobilization
polyorganosiloxane
residue
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03753578A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Dieter Feucht
Manfred Stanzel
Jürgen STROPP
Heinrich Zeininger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens AG
Original Assignee
Siemens AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Siemens AG filed Critical Siemens AG
Publication of EP1525248A1 publication Critical patent/EP1525248A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G77/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule
    • C08G77/42—Block-or graft-polymers containing polysiloxane sequences
    • C08G77/46—Block-or graft-polymers containing polysiloxane sequences containing polyether sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G77/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule
    • C08G77/04—Polysiloxanes
    • C08G77/38—Polysiloxanes modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the present invention relates to an immobilization layer for biosensors and their use for the production of biosensory detection layers, in particular for the production of so-called DNA chips.
  • Detection systems are understood to be biological recognition molecules, such as antibodies, enzymes, nucleic acids and the like, which are bound to a carrier (transducer) via a so-called immobilization layer.
  • Detection systems are understood to be biological recognition molecules, such as antibodies, enzymes, nucleic acids and the like, which are bound to a carrier (transducer) via a so-called immobilization layer.
  • carrier transducer
  • Mainly calorimetric, piezoelectric, optical and electrochemical principles are used as transducers.
  • the detection systems or originally the immobilization layers, are usually immobilized in approximately two-dimensional layers on the transducer systems.
  • the immobilization can take place through covalent bonds, through affinity interaction but also through hydrophilic / hydrophobic interactions. For reasons of stability, covalent bonds are preferred, but the formation of stable complexes, such as Biotm / avidin, is also successfully used.
  • I. illner, E. Katz give a good overview of the structure of almost two-dimensional biological recognition layers: "Redox Protem layers on conductive supports - systems for bioelectronic applications" in Angew. CNEM. 2000, 112, 1230-69.
  • the biological function carriers ie the recognition molecules
  • alkoxysilanes which are known as contain linker groups, but are also immobilized using cyanuric chloride or carbodiide.
  • recognition molecules labeled with thioalkyl are used, which are immobilized on the transducer surface via sulfur-gold bonds in the form of so-called self-assembly layers.
  • An interesting approach to immobilizing nucleic acids on transducer surfaces is the photochemically supported synthesis of Affymetrix (Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis, SPA Fodor et al., Science 251, 767-773 (1991)).
  • WO 00/43539 describes the construction of a three-dimensional DNA recognition layer by immobilizing the DNA capture probes in the form of polymer brushes.
  • Timofeev et al. describes a chemically modified, radically crosslinked polyacrylamide which can be used, for example, for the immobilization of capture oligos (EN Timofeev et al., Regioselective Immobilization of Short Oligonucleotides to Acrylic Copolymer Gels, Nucleic Acids Research, 1966, Vol. 24, No. 16, 3142-3148).
  • amino or aldehyde groups are used as coupling groups in the hydrogel.
  • Aldehyde- or amino-functionalized scavenger oligos can be covalently immobilized on these coupling groups under reductive reaction conditions.
  • a radically crosslinkable polyorganosiloxane which additionally contains linker groups for coupling biological or chemical functional supports, is described by the applicant in EP 0 562 369 B1.
  • EP 0 562 372 B1 describes the production of enzyme-containing detection layers for biosensors based on the aforementioned functional polyorganosiloxanes.
  • the hydrophilicity of the immobilization layers produced in this way is subsequently increased in an additional process step by reacting part of the linker groups present in the matrix with, for example, an amino acid to such an extent that, for example, enzymes such as glucose oxidase are immobilized in the layer while maintaining their functionality can.
  • This subsequent improvement in the hydrophilicity of the immobilization layer is complex (reaction time several hours at 60 ° C., alkaline medium) and is therefore out of the question, in particular for the mass production of analytical biochips.
  • the object of the present invention is thus the generation of a radically cross-linked, i.e. three-dimensional hydrophilic immobilization layer for biosensory applications, which can be produced easily and inexpensively and can therefore also be used for the production of analytical biochips.
  • the present invention accordingly relates to an immobilization layer for bion sensors, produced from a polyorganosiloxane, optionally with the addition of reaction crosslinkers / reaction mediators on a support material, the polyorganosiloxane corresponding to the following general structure: R1 -
  • Rl lower alkyl group with preferably 1 to 4 carbon atoms
  • the polyorganosiloxanes used to build up the immobilization layer are described in the parallel German patent application (number not yet known) and carry all the functions essential for the functioning of a biochip on the polysiloxane framework, namely crosslinker groups for forming the three-dimensional layer, linker groups for linking the recognition molecules and hydrophilic ones Groups to facilitate the penetration of the recognition molecules, their binding as well as the penetration of the molecules to be recognized and thus triggering a positive recognition reaction.
  • the epoxy-functional residue in the polyorganosiloxane used to form the immobilization layer is then preferably selected from the following groups:
  • the former being particularly preferred.
  • the photopolymerizable radical Z is preferably introduced by adding a photopolymerizable compound to an epoxy-functional radical E located on the siloxane chain.
  • the photopolymerizable compound is preferably an acrylic or methacrylic acid.
  • the hydrophilic radical H is preferably a polyalkylene glycol ether, in particular a polyethylene glycol ether compound.
  • the polyorganosiloxane used to produce the immobilization layer is selected from the following group:
  • reaction mediators such as tri (meth) acrylates
  • di- and monofunctional polyethylene glycol (meth) acrylates Radical initiators are used to start the crosslinking reaction.
  • a transducer system and subsequent thermal or photocrosslinking or photostructuring result in a water-swellable, functional polyorganosiloxane layer, into which biological or chemical recognition molecules for analytical or diagnostic applications are coupled using the existing linker groups while maintaining their functionality.
  • the mixtures can be applied with all modern coating technologies. However, spin coating and dispensing are preferred.
  • the polyorganosiloxanes or their mixture with crosslinking molecules and reaction mediators are adapted to the coating process.
  • a polymeric film former for spin coating, the additional use of a polymeric film former in the mixture can be considered. No further additives are required to produce submicron layers. It is also not necessary to add plasticizers. A solvent such as dimethylformamide or methyl ethyl ketone can be added to adjust the processing viscosity of the polyorganosiloxane mixture.
  • the polyorganosiloxane mixture is applied in solution, depending on the transducer dimensions, in drops of a size from a few ⁇ l to 1 nl and less.
  • high-boiling solvents which have a sufficiently long life for the drop at the tip of the dispensing cannula, are used in order to enable reproducible dosing and settling of the drop.
  • the boiling point of the solvent must not be too high to allow the solvent to evaporate sufficiently quickly from the settled drop. overall a tempering step to control the residual solvent content may be required.
  • dimethylformamide or 2,3-butanediol or mixtures thereof are preferably used for dispensing the mixture.
  • the polyorganosiloxane mixtures are applied in layer or spot form to transducer or carrier surfaces made of metal, glass, silicon, silicon dioxide, silicon nitride or plastic.
  • the coating of surfaces also includes the coating of inner surfaces of microchannels or nanotubes. The surfaces to be coated must always be coated with an adhesion promoter.
  • the polyorganosiloxane mixture is polymerized and crosslinked by thermal or UV initiation.
  • the layer can also be structured. Contact or proximity exposure is carried out through a mask.
  • the polyorganosiloxane mixture works here like a negative resist, i.e. polymerisation and crosslinking take place in the irradiated area. There is no reaction in the darkened areas.
  • the mixture here is detached from the substrate in a development step.
  • Auxiliary components such as polymeric film formers and non-crosslinked mixture components are removed from the crosslinked layer by extraction. Under certain circumstances, this can take place at the same time as the actual equipment step.
  • the biological or chemical recognition molecules are preferably applied to the immobilization layer from aqueous solution, from aqueous buffer solution or from mixtures of polar solvents with water. It is applied by dripping on or spotting on or dispensing.
  • the solution with the biological or chemical recognition molecules can also be brought to the crosslinked layer by transport through the fluidic system itself. Networked spots, which are surrounded by a protective ring, are advantageously used for the precise loading of measuring spots.
  • a tempering step may be necessary for the covalent coupling of the biological or chemical recognition molecules, which are provided with a coupling group that matches the linker group present in the crosslinked layer.
  • a climate chamber is used to prevent the polyorganosiloxane layer from drying out during the coupling reaction.
  • Aminoalkyl groups are particularly suitable for coupling to the epoxy linker groups.
  • the system according to the invention enables the construction of sensor arrays with biological recognition molecules in a three-dimensional matrix with a high integration density.

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Abstract

Immobilisierungsschicht für Biosensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan unter Zusatz von Reaktionsvernetzern/Reaktionsvermittlern auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht: (I), worin folgendes gilt: E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen; Z = (photo)polymerisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen; H = hydrophiler Rest; R<1>= Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen; R<2>= R<1 >oder H und m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L.

Description

Beschreibung
Im obilisierungsschicht für Biosensoren
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Immobilisierungsschicht für Biosensoren sowie ihre Verwendung zur Erzeugung von biosensorischen Erkennungsschichten, insbesondere zur Erzeugung von sogenannten DNA-Chips.
In der modernen biologischen Analysentechnik, aber auch in der medizinischen Diagnostik, werden in zunehmendem Maße Biosensoren eingesetzt, bei denen ein biologisches Erkennungssystem m t einem physikalischen Transducer verknüpft ist. Unter Erkennungssystemen versteht man biologische Erkennungsmo- lekule, wie Antikörper, Enzyme, Nuclemsauren und dergleichen, welche über eine sogenannte Immobilisierungsschicht an einem Trager (Transducer) gebunden sind. Als Transducer werden hauptsachlich kalorimetrische, piezoelektrische, optische und elektrochemische Prinzipien verwendet.
Die Erkennungssysteme, respektive ursprünglich die Immobilisierungsschichten, werden dabei meist in annähernd zwei- dimensionalen Schichten auf den Transducersystemen immobilisiert. Die Immobilisierung kann durch kovalente Bindungen, durch Äffinitatswechselwirkung aber auch durch hydrophil/ hydrophobe Wechselwirkungen erfolgen. Aus Stabilitatsgrunden werden kovalente Bindungen bevorzugt, jedoch kommt auch die Bildung stabiler Komplexe, wie zum Beispiel Biotm/Avidin, erfolgreich zum Einsatz. Einen guten Überblick über den Auf- bau annähernd zwei-dimensionaler biologischer Erkennungsschichten geben I. illner, E. Katz: "Redoxprotemschichten auf leitenden Tragern - Systeme für bioelektronische Anwendungen" in Angew. Cnem. 2000, 112, 1230-69.
Bei Transducer-Oberflachen, welche NH- oder OH-Gruppen enthalten, werden die biologischen Funktionstrager, d.h. die Er- kennungsmolekule, häufig durch Alkoxysilane, welche sogenann- te Linkergruppen enthalten, aber auch mit Hilfe von Cyanurch- lorid oder Carbodii id immobilisiert. Zur Ausrüstung goldhaltiger Transducer-Oberflächen werden mit Thioalkyl gelabelte Erkennungsmoleküle eingesetzt, die über Schwefel-Gold- Bindungen in Form von sogenannten Self-Assembly-Schichten auf der Transducer-Oberfläche immobilisiert werden. Ein interessanter Ansatz zur Immobilisierung von Nucleinsäuren auf Transducer-Oberflächen ist die photochemisch unterstützte Synthese von Affymetrix (Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis, S.P.A. Fodor et al., Science 251, 767-773 (1991)).
Zur Steigerung der Empfindlichkeit von Biosensoren sowie zur Optimierung der Reproduzierbarkeit der damit erhaltenen Mess- ergebnisse ist der Einsatz dreidimensionaler Immobilisierungsschichten für die biologischen Erkennungsmoleküle sinnvoll. Die Firma Schleicher & Schüll GmbH bietet unter dem Namen FAST™ Südes DNA-Chips an, in welchen die Fänger-Oligos in einer drei-dimensionalen Nitrocellulose-Membran immobili- siert sind (BioMolecular Screening, Catalog 2001, intern. Edit. Fa. Schleicher & Schüll) .
In der WO 00/43539 ist der Aufbau einer dreidimensionalen DNA-Erkennungsschicht durch Immobilisierung der DNA-Fänger- Sonden in Form von Polymer-Brushes beschrieben.
Von Timofeev et al. wird ein chemisch modifiziertes, radikalisch vernetztes Polyacrylamid beschrieben, das zum Beispiel für die Immobilisierung von Fänger-Oligos eingesetzt werden kann (E. N. Timofeev et al., Regioselective Immobilization of Short Oligonucleotides to Acrylic Copolymer Gels, Nucleic Acids Research, 1966, Vol.24, No. 16, 3142-3148). Hier werden als Kopplungsgruppen im Hydrogel Amino- oder Aldehydgruppen verwendet. Aldehyd- bzw. Amino-funktionalisierte Fänger- Oligos können an diese Kopplungsgruppen unter reduktiven Reaktionsbedingungen kovalent immobilisiert werden. Das bedeutet aber, dass neben der eigentlichen Kopplungsreaktion zwi- sehen A ino- und Aldehydgruppe, bzw. umgekehrt, ein zusätzlicher Reduktionsschritt unter Einsatz von Reduktionsmitteln erforderlich ist. Weitere von Timofeev et al. beschriebene Methoden zur chemischen Aktivierung des vernetzten Polyacry- lamids erfordern ebenfalls zusätzliche Reaktionsschritte in der Polymermatrix.
Ein radikalisch vernetzbares Polyorganosiloxan, das zusätzlich Linkergruppen zur Ankopplung biologischer oder chemi- scher Funktionsträger enthält, ist durch die Anmelderin in der EP 0 562 369 Bl beschrieben. In der parallelen EP 0 562 372 Bl ist die Herstellung .enzymhaltiger Erkennungsschichten für Biosensoren auf Basis der vorgenannten funktio- nellen Polyorganosiloxane beschrieben. Die Hydrophilie der damit erzeugten Immobilisierungsschichten wird in einem zusätzlichen Prozessschritt durch Umsetzung eines Teils der in der Matrix vorhandenen Linkergruppen mit zum Beispiel einer Aminosäure nachträglich so weit erhöht, dass zum Beispiel Enzyme, wie Glucoseoxidase, unter Erhalt ihrer Funktionsfähig- keit in der Schicht immobilisiert werden können. Diese nachträgliche Verbesserung der Hydrophilie der Immobilisierungsschicht ist aufwendig (Reaktionszeit mehrere Stunden bei 60°C, alkalisches Medium) und kommt somit insbesondere für die Massenherstellung von analytischen Biochips nicht in Frage.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Erzeugung einer radikalisch vernetzten, d.h. dreidimensionalen hydrophilen Immobilisierungsschicht für biosensorische Anwendungen, welche einfach und kostengünstig erzeugbar und daher auch zur Herstellung analytischer Biochips verwendbar sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge eine Immobilisierungsschicht für Bionsensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan, gegebenenfalls unter Zusatz von Reaktions- vernetzern/Reak-tionsvermittlern auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht: R1 —
worin folgendes gilt:
E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen;
Z = (photo) polymerisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen;
H = hydrophiler Rest;
Rl= Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen;
R2= R1 oder H und m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L
Die für den Aufbau der Immobilisierungsschicht verwendeten Polyorganosiloxane sind in der parallelen deutschen Patentanmeldung (Nummer noch nicht bekannt) beschrieben und tragen alle für das Funktionieren eines Biochips wesentlichen Funktionen an dem Polysiloxangerüst, nämlich Vernetzergruppen zur Ausbildung der dreidimensionalen Schicht, Linkergruppen zur Anbindung der Erkennungsmoleküle und hydrophile Gruppen, um das Eindringen der Erkennungsmoleküle, deren Anbindung sowie das Eindringen der zu erkennenden Moleküle und damit die Auslösung einer positiven Erkennungsreaktion zu erleichtern. Durch gezielte Planung des Aufbaues der vernetzbaren, hydrophilen Immobilisierungsschicht auf Basis dieser Polyorganosiloxane lassen sich in einem weiten Bereich Hydrophilie und auch Vernetzungsdichte der Immobilisierungsschicht steuern. Diese Steuerbarkeit lässt sich durch den Zusatz sogenannter Vernetzermoleküle bzw. Reaktionsvermittler weiter optimieren .
Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 10. Danach wird der epoxyfunktionelle Rest in dem zur Ausbildung der Immobilisierungsschicht verwendeten Polyorganosiloxan vorzugsweise aus den folgenden Gruppen ausgewählt:
-(ChUr-O -CH^-CH—CH, —-(CH, 2)'.2 -CH—CH
\ / 2 O O
-CH—CH(CH3)—CH—O—CH—CH--CH2
O
-CH—CH(CH3)-COO—CH—CH—CH2
0
wobei die Erstere ganz besonders bevorzugt wird.
Der photopolymerisierbare Rest Z wird vorzugsweise durch Addition einer photopolymerisierbaren Verbindung an einen an der Siloxankette befindlichen epoxyfunktionellen Rest E eingeführt. Die photopolymerisierbare Verbindung ist vorzugsweise eine Acryl- oder Methacrylsäure .
Der hydrophile Rest H ist vorzugsweise ein Polyalkylenglyco- lether-, insbesondere eine Polyethylenglycoletherverbindung. Insbesondere wird das zur Erzeugung der Immobilisierungsschicht verwendete Polyorganosiloxan aus der folgenden Gruppe ausgewählt :
CH. CH. CH,
CH, CH. CH.
O O o
CH2 CH2 CH
HO- -CH HC CH
0
CH2 C O H2
O CH
O-
-CH.
H3C
mit
m + n + o + p + r 150 = L m = 90-120 o = 20-30 p = 5-20 q = 1-2 r = 5-20 , H3C • CH,
CH2 CH2 C — O O O
CH2 CH. CH2 HO- -CH HC CH2
O CH. O
H.
CH.
O--
"CH,
H3C
mit
m + n + o + p + r = 150 = L m = 90-100 n = 20-30
0 = 5
P = 5-20 q = 3-4 r = 15-20 s = 1-9, vorzugsweise 9
R = H, CH3
oder CH, CH, CH, CH3 CH. CH, CH,
H3C— Si—O- Si — O Si — 0 Si — O Si — O Si — 0 Si— CH,
CH, CH2 Jo .CH. l_CH2 _ip H CH, CH.
CH. CH, CH.
CH, CH. CH.
0 O CH2
CH2 CH2 O
HO— CH HC CH2
0
CH2 C HC— OH H2
O CH2
O-
0 CH2
CH2
H3C CH2 q
O
CH,
mit
m + n + o + p + r = 150 = L m = 90-100 n = 30 o = 5 p = 10-25 q = 1-10, vorzugsweise 1-4 r = 0-5.
Wie bereits erwähnt, können zur Steigerung der Steuerbarkeit der Hydrophilie und/oder Vernetzungsdichte zusätzliche Reaktionsvermittler verwendet werden, wie Tri- (meth) -acrylate, di- und monofunktionelle Polyethylenglycol (meth) acrylate. Zum Starten der Vernetzungsreaktion werden Radikalinitiatoren eingesetzt.
Nach Applikation der Polyorganosiloxan-Mischung auf ein
Transducersystem und anschließende thermische bzw. Photovernetzung oder Photostrukturierung wird eine mit Wasser quellbare, funktionelle Polyorganosiloxanschicht erhalten, in die unter Verwendung der vorhandenen Linkergruppen biologische oder chemische Erkennungsmoleküle für analytische oder diagnostische Anwendungen unter Erhalt ihrer Funktionsfähigkeit eingekuppelt werden. Grundsätzlich können die Mischungen mit allen modernen Beschichtungstechnologien appliziert werden. Bevorzugt werden jedoch Spin-Coating sowie Dispensieren. Hierbei werden die Polyorganosiloxane bzw. deren Mischung mit Vernetzermolekülen und Reaktionsvermittlern an das Beschich- tungsverfahren angepasst.
Für Spin-Coating kann die zusätzliche Verwendung eines poly- meren Filmbildners in der Mischung in Betracht gezogen werden. Zur Erzeugung von Submikrometer-Schichten sind keine weiteren Zusätze erforderlich. Auch ist ein Zusatz von Weichmachern nicht erforderlich. Zur Einstellung der Verarbeitungsviskosität der Polyorganosiloxan-Mischung kann ein Löse- mittel, wie zum Beispiel Dimethylformamid oder Methylethylke- ton, zugesetzt werden.
Bei der Schichtbildung durch Dispensieren wird die Polyorganosiloxan-Mischung in Lösung je nach Transducerabmessung in Tropfen in einer Größe von einigen μl bis zu 1 nl und weniger aufgebracht. Für das Dispensieren werden hochsiedende Lösemittel, die ausreichend lange Lebensdauer des Tropfens an der Spitze der Dispensierkanüle aufweisen, verwendet, um ein reproduzierbares Dosieren und Absetzen des Tropfens zu ermögli- chen . Andererseits darf der Siedepunkt des Lösemittels nicht zu hoch sein, um ein ausreichend rasches Abdampfen des Lösungsmittels aus dem abgesetzten Tropfen zu ermöglichen. Ge- gebenenfalls ist hier ein Temperschritt zur Steuerung des Gehaltes an Restlösemittel erforderlich. Erfindungsgemäß kommt für das Dispensieren der Mischung vorzugsweise Dimethylformamid oder 2, 3-Butandiol oder Mischungen daraus zum Einsatz.
Erfindungsgemäß werden die Polyorganosiloxan-Mischungen in Schicht- oder Spotform auf Transducer- oder Trägeroberflächen aus Metall, Glas, Siliciu , Siliciumdioxid, Siliciumnitrid oder Kunststoff aufgebracht. Es können auch Oberflächen mit Topographie, die aus unterschiedlichen Materialen bestehen, wie zum Beispiel Interdigitalelektrodenarrays auf Siliciumnitrid, als Passivierung beschichtet werden. Die Beschichtung von Flächen schließt auch die Beschichtung innerer Oberflächen von Mikrokanälen oder Nanotubes ein. Die zu beschichten- den Oberflächen sind gegebenen alls mit einem Haftvermittler zu beschichten.
Die Polymerisation und Vernetzung der Polyorganosiloxan- Mischung erfolgt durch thermische oder UV-Initiierung. Bei ÜV-Initiierung kann auch eine Strukturierung der Schicht durch . Kontakt- bzw. Proximity-Belichtung durch eine Maske erfolgen. Die Polyorganosiloxan-Mischung arbeitet hier wie ein Negativresist, d.h. im bestrahlten Bereich wird polymerisiert und vernetzt. In den abgedunkelten Bereichen findet keine Re- aktion statt. Die hier befindliche Mischung wird in einem Entwicklungsschritt wieder vom Substrat abgelöst.
Hilfskomponenten, wie polymere Filmbildner sowie nicht vernetzte Mischungsanteile werden durch Extraktion aus der ver- netzten Schicht entfernt. Das kann unter Umständen zeitgleich mit dem eigentlichen Ausrüstungsschritt erfolgen.
Die biologischen oder chemischen Erkennungsmoleküle werden vorzugsweise aus wässriger Lösung, aus wässriger Pufferlösung oder aus Gemischen polarer Lösungsmittel mit Wasser auf die Immobilisierungsschicht aufgebracht. Das Aufbringen erfolgt durch Auftropfen oder Aufspoten bzw. Aufdispensieren . In Na- notubes oder Mikrokanälen kann das Heranbringen der Lösung mit den biologischen oder chemischen Erkennungsmolekülen an die vernetzte Schicht auch durch den Transport durch das flu- idische System selbst erfolgen. Für die zielgenaue Beladung von Messspots werden vorteilhafterweise vernetzte Spots verwendet, die von einem Schutzring umgeben sind.
Für das kovalente Ankoppeln der biologischen oder chemischen Erkennungsmoleküle, die mit einer zur in der vernetzten Schicht vorhandenen Linkergruppe passenden Kopplungsgruppe versehen sind, kann, je nach Reaktivität, ein Temperschritt erforderlich sein. Um das Austrocknen der Polyorganosiloxan- schicht während der Kopplungsreaktion zu verhindern, wird in einer Klimakammer gearbeitet. Besonders geeignet für die An- kopplung an die Epoxidlinkergruppen sind Aminoalkylgruppen.
Das erfindungsgemäße System ermöglicht den Aufbau von Sensor- arrays mit biologischen Erkennungsmolekülen in einer dreidimensionalen Matrix in hoher Integrationsdichte.

Claims

Patentansprüche
Immobilisierungsschicht für Biosensoren, hergestellt aus einem Polyorganosiloxan, gegebenenfalls unter Zusatz von Reaktionsver-netzern/Reaktionsvermittlern, auf einem Trägermaterial, wobei das Polyorganosiloxan der folgenden allgemeinen Struktur entspricht:
R1 R1 R1
(
R1 — Si — O - Si— O- — Si-R1 R1 R1 tu R1
worin folgendes gilt:
E = epoxyfunktioneller Rest mit 4 bis 20 C-Atomen;
Z = (photo) poly erisierbarer Rest mit 8 bis 40 C-Atomen;
H = hydrophiler Rest;
Rl= Niederalkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 4 C-Atomen;
R2= R1 oder H und m + n + o + p + r = 50 bis 200 = L
Immobilisierungsschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der epoxyfunktionelle Rest aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
(CH,)r-O— CH - CH — CH, (CH,)r-CH— CH
2 \ / 2 \ /
O O
-CH— CH(CH3)— CH— O— CH— CH— CH2
O — CH— CH(CH3)-COO— CH— C CHH — CH2 \
O
3. Immobilisierungsschicht nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der epoxyfunktionelle Rest E
(CH2)— O— CH— CH— CH2
O
ist .
4. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der (foto) poly e- risierbare Rest Z durch Addition einer (foto) polymerisier- baren Verbindung an wenigstens einen an der Siloxankette befindlichen Rest E erhältlich ist.
5. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die (foto) polymeri- sierbare Verbindung eine Acryl- oder Methacrylsäure ist.
6. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der hydrophile Rest H eine Polyalkylenglycolether-, insbesondere eine Polye- thy-lenglycoletherverbindung, ist .
7. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Polyorganosiloxan aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
CH, CH. CH, CH, CH3 CH. CH,
H3C— Si- 0- Si — O Si — O Si — O Si — o- -Si- Si — CH.
CH, CH. .CH, L_CH2 JP _H CH, CH,
CH. CH. CH,
CH, CH. CH,
O O 0
CH2 CH2 CH2
CH HC CH2
O
CH2 C O
H2
O CH,
O
-CH,
H3C
mit
m + n + o + p r = 150 m = 90-120 n = 20-30 o = 5 p = 5-20 q = 1-2 r = 5-20, CH, CH, CH3 CH3 CH, CH, CH,
H30 -SI¬ Si — O -Si — O Si — O Si — O Si — O Si — CH,
CH, CH. .CH2 . CH, -1P _lr CH, J CH,
CH2 CH2 CHR CH2 CH2 O 0 O
CH2 CH. CH2 HO— CH HC CH2
O CH. C O H.
O CH. o-
-CH,
H3C mit
m + n + o + p + r = 150 = L m = 90-100 n = 20-30
0 = 5
P = 5-20 q = 3-4 r = 15-20 s = 1-9, vorzugsweise 9
R = H,CH3
oder CH, CH3 CH3 CH, CH, CH, CH,
H3C- -Si- Si — O Si — -Si- Si— 0- Si — O 4 Si CH,
CH, CH2 J o LCH2 CH, LH CH, CH. CH, CH2 CH2
CH, CH2 CH2
0 ό CH2
CH2 CH, O
HO CH HC CH2
CH2 HC —OH 0 CH2
O: O
— — CH, CH,
H, c
CH,
O
CH,
mit
m + n + o + p + r = 150 = L m = 90-100 n = 30 o = 5 p = 10-25 q = 1-10, vorzugsweise 1-4 r = 0-5.
8. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsver- netzer unter den Tri (meth) -acrylaten und den di- und monofunktionalen Polyalkylenglycol (meth) -acrylaren ausgewählt sind. Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zu deren Aufbau Radikalinitiatoren verwendet werden.
10 Immobilisierungsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie auf Transducer- oder Trägeroberflächen aus Metall, Glas, Silici- um, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Kunststoff oder auf Oberflächen mit Topographie durch thermische Vernetzung, fotochemische Vernetzung bzw. Strukturierung hergestellt
11. Verwendung der Immobilisierungsschicht nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von biosensori- sehen Erkennungsschichten durch (kovalentes) Einkuppeln bzw. Immobilisieren von chemischen oder biologischen Erkennungsmolekülen .
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Erkennungsmoleküle Fänger-
Oligonucleotide sind.
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