EP1523550A2 - Immortalisierte dickdarmepithelzellen und ihre verwendung - Google Patents

Immortalisierte dickdarmepithelzellen und ihre verwendung

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Publication number
EP1523550A2
EP1523550A2 EP03771082A EP03771082A EP1523550A2 EP 1523550 A2 EP1523550 A2 EP 1523550A2 EP 03771082 A EP03771082 A EP 03771082A EP 03771082 A EP03771082 A EP 03771082A EP 1523550 A2 EP1523550 A2 EP 1523550A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
colon
epithelial cells
colon epithelial
cells
crypts
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03771082A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Pablo Steinberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Postdam
Original Assignee
Universitaet Postdam
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Postdam filed Critical Universitaet Postdam
Publication of EP1523550A2 publication Critical patent/EP1523550A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the invention relates to immortalized colon epithelial cells and cell lines and the use of the colon epithelial cell lines for the study of colon-relevant physiological processes and the development of colon cancer.
  • Numerous possibilities are known for examining physiological processes or processes of cancer development on cells.
  • One possibility is, for example, an examination of a living object.
  • An alternative is the investigation on cell cultures.
  • Cell cultures which are primary cultures and can be maintained in vitro for approximately one week at a 24 hour division. By definition, primary cultures are all in vitro cultivations of cells, tissues and organs that have been taken directly from the organism. A complete dissociation of the tissue or the organ is particularly necessary to obtain a cell culture.
  • Primary cultures or cell cultures of numerous cells are known in the prior art, for example cardiac muscle cells from chickens or from neonatal rat hearts, from fresh skin samples of human origin and from solid human tumors and the like. a.
  • cell cultures are known which are not primarily obtained and cultivated from the organism, but represent permanent cultures. There will be secondary cultures and Cell lines distinguished. Secondary cultures are cell strains that reach different generations from a primary culture. Cell lines are permanent viable cultures. Numerous cell lines have been established by various tumors. Cell lines are mostly uniform in their morphology and in their functional properties. Certain cell lines are characterized by selective growth properties that certain cell culture media with defined growth factors require; these cell lines are therefore valuable objects for the study of growth and differentiation processes, including the processes of malignant transformation. With the help of cell cultures, it is also possible to carry out special tests, such as tests for in vitro or in vivo toxicity, for testing acute cell toxicity, testing for cell viability or tests for measuring viability and normal and degenerate Growth.
  • special tests such as tests for in vitro or in vivo toxicity, for testing acute cell toxicity, testing for cell viability or tests for measuring viability and normal and degenerate Growth.
  • Cell cultures are also used to detect mutagenic substances. It is also possible to use cultivated cell lines for transfection, for example for transfection by means of electroporation or for cloning and for testing the proliferation rate.
  • cultivated cell lines for transfection, for example for transfection by means of electroporation or for cloning and for testing the proliferation rate.
  • examinations such as the proliferation control or the mutagenicity test in vitro in such a way that they allow as many conclusions as possible to be drawn about the in vivo behavior of the cells, it is necessary for certain types of tumor, such as liver cancer or colon cancer, healthy, untreated liver tissue or To establish colon cells or cell lines.
  • tumor such as liver cancer or colon cancer
  • colon cells or cell lines are available in the prior art for examining and monitoring the development of important tumors.
  • Colon cancer is one of the most common cancers in western industrialized countries. In the Federal Republic of Germany, an estimated 24,000 men and 28,000 women develop colon
  • the human colon tumor cells are already malignant transformed cells, so that they cannot be used to deal with the question of colon cancer;
  • the small intestine epithelial cells like the IEC-6 and IEC-18 cells, behave completely differently from colon colon epithelial cells as a cell culture, and (iii) the colon colon primary cell cultures have only a limited lifespan, usually 7 to 10 days, so that they not suitable for studying processes that take a long time, such as testing mutagenic substances or the development of cancer.
  • Lacy and Colony (1985) were able to show that the expression of carbonic anhydrase can only be detected in the colon cells at the time an organism is born. Whereas saccharase activity is present in fetal colon cells and is practically no longer measurable at birth. Furthermore, Guer and Verity (1990) found that NA + / K + -ATPase activity in fetal colon cells is very low and only increases sharply after birth. Takahashi et al. (1998) further disclosed that the IIß-hydroxysteroid dehydrogenase type II activity is hardly detectable in fetal colon cells up to the 40th week of pregnancy and only increases sharply after birth.
  • fetal human large bowel epithelial cells are much less sensitive to apoptosis-inducing agents, such as, compared to adult human large bowel epithelial cells.
  • the present invention solves this technical problem by providing non-tumorigenic adult human or rat colon epithelial cells, which are obtained by removing crypts containing colon epithelial cells from the colon tissue of untreated humans or rats, diluting and plating the crypts and the in- Contacting the crypts with a retrovirus comprising the gene for the -SV40 large T antigen, thereby infecting the colon epithelial cells with the retrovirus and recovering the non-tumorigenic adult colon epithelial cells.
  • the colon is removed from an untreated rat or a piece of the human colon.
  • the large intestine can then be cut into small pieces or broken up differently and incubated in suitable solutions known to those skilled in the art.
  • the solutions can be selected such that they complex calcium, for example, which leads in particular to the fact that the crypts of the large intestine sit very loosely in the tissue.
  • Crypts are folds on the epithelial surface of the colon that serve to enlarge the surface.
  • the crypts are jointly responsible for secretion and cell renewal. Since there are no villi in the large intestine - as in the small intestine - the crypts have an important function.
  • Retroviruses containing the sequence for the SV 40 large T antigen are then brought into contact with the crypts in such a way that the colon epithelial cells located in the crypts are infected with the retroviruses.
  • Retroviruses are particularly well suited for transfection because they have a high integration guarantee.
  • the integration can take place anywhere in the genome, but in particular only one copy is integrated without it being advantageous. ' there are major changes at the integration site. If the integration in each cell takes place at a different location : several cells can each emerge from a different genome. However, it can also be provided that the integration takes place at the same or similar location in the genome.
  • nucleic acid sequences are known to the person skilled in the art, for example microinjection, DNA transfer using the gene gun, either using microprojectiles or using macroprojectiles, or using cosmids or plasmids. These methods can be used in combination or in addition to the retroviral infection.
  • microinjection DNA transfer using the gene gun, either using microprojectiles or using macroprojectiles, or using cosmids or plasmids.
  • cosmids or plasmids can be used in combination or in addition to the retroviral infection.
  • SV 40 large T antigen in the genome of the. Colon epithelial cells
  • these cells are immortalized in the crypts.
  • the fact that the cells are located in particular in the crypts advantageously keeps their degree of differentiation. Immortalization enables an unlimited number of cell culture passages, ie the cells can divide almost indefinitely and are therefore available for long-term experiments of up to half a year or longer.
  • the Cre recombinase of a selected bacteriophage catalyzes a site-specific recombination between the so-called Loci-LoxP. Since a ligation step in the classic sense is missing, this method is advantageously very quick and error-free.
  • the protein Cre is a recombinant enzyme, a recombinase that recognizes and binds to a 34 base long DNA segment called LoxP sites. The Cre recombinase advantageously mediates a recombination between two LoxP sites.
  • the recombination event advantageously advantageously specifically removes the sequence between the LoxP sites.
  • the nucleic acid fragments to be examined cannot replicate themselves, they must be coupled with a suitable replicon.
  • Such replicons are particularly vectors or cloning vehicles.
  • Small plasmids and bacteriophages are suitable as vectors and can be modified in many ways in order to improve the introduction of recombinant DNA or RNA molecules into cells, preferably colon epithelial cells, and to facilitate the selection of successfully transformed cells.
  • Cre is an enzyme isolated from viruses that cuts the chromosomes into specific sections, which advantageously stimulates an exchange of these sections between the chromosomes.
  • the vector mentioned advantageously enables transient expression of the SV 40 large T antigen. It is also possible that the vector includes genes for herpes simplex virus thymidine kinase (TK). These genes can be flanked by LoxP sites, the substrate of the bacteriophage recombinase Cre. However, the retrovirus can also include genes for the Cre recombinase and selection markers. With the markers used, it is advantageously possible to use the cell line for more than one To grow year in culture.
  • TK herpes simplex virus thymidine kinase
  • the crypts and the colon epithelial cells located in them are brought into contact with the retroviruses after removal of the intestine or after removal from the intestine without further intermediate steps, in particular cultivation steps. It is therefore preferred to use fresh colon epithelial cells, di ⁇
  • the invention also relates to the use of the cells according to the invention for establishing a colon epithelial cell line.
  • the primary culture of the individual colon epithelial cells according to the invention becomes a cell line which consists of numerous sublines of the cells from which the primary culture was originally composed.
  • the proliferation and growth of cells 1 in a cell line in vitro including cultures of single cells . is accordingly according to the invention as. Called cell culture.
  • a cell line consists of numerous sublines of the cells from which the primary culture originally consisted. In cell cultures, the cells no longer organize themselves in the tissue.
  • a continuously growing culture that has a large number of population doubles behind it is referred to in the sense of the invention as an established cell culture.
  • the colon epithelial cells and / or the colon epithelial cell lines can be used for the screening of drugs.
  • the cells and cell lines according to the invention in addition to screening - for other combinatorial tests.
  • the cells can be a probe that integrates with solid phase assays or other target structures, or it is possible that the cell line is used as a target in a combinatorial test, using selected probes - e.g. B. phages or molecules - interacts.
  • the colon epithelial cells or the colon epithelial cell lines are used to examine the development of colon cancer, physiological, pathophysiological and / or toxic processes. With the colon cells or colon epithelial cell lines according to the invention, it is advantageously possible to investigate the development of colon cancer or other physiological processes over a long period of time using homogeneous cultures. In particular, it is possible
  • the colon epithelial cells or cell cells according to the invention are lines used for long-term cultures, preferably for culture periods of 6 to 12 months.
  • Physiological processes or processes of colon cancer usually take periods of several weeks, months or more.
  • Known cell cultures can be established for a few weeks with stable quality. Test series that require a longer time frame cannot be examined with these cell cultures.
  • the cells and cell lines of the colon epithelium according to the invention are able to carry out examinations on one and the same cell line which take longer than 1 year;
  • the cells of the invention and / or cell lines can • be preferably continued for the following applications used: (a) for the identification of metabolites formed after incubation of the substance with the cells and are located in the cell culture supernatant and in the cells'
  • Substances in the sense of the invention can be all biological, chemical but also physical material effects, such as. B. lohen, complex compounds, drugs, carbohydrates, lipids, proteins, mixtures of these, environmental substances, food components, radioactive radiation, X-rays and others. That is to say, a substance in the sense of the invention is any agent whose effect on the cells or on substances which in turn act on the cells is to be tested.
  • the colon epithelial cells and cell lines according to the invention have several advantages over the known cell lines. Numerous cell lines that are used to examine the processes in the colon area come from colon tumor cells. Such cells are already malignant and can no longer be used for attempts to develop and develop tumors.
  • the known colon primary cell cultures have a limited lifespan of approximately 14 days, so that they are not suitable for studying processes which take a long time. With the cells and cell lines according to the invention, a system is made available for the first time, which makes it possible to carry out experiments on non-tumorigenic adult cells from rats or humans which take a physiologically long period of time.
  • Another advantage of the cells and cell lines according to the invention is that the tissues or the organisms - namely Humans and rats - from which they are taken, do not need to be pretreated. This also largely maintains the degree of differentiation of the cells in the fresh tissue.
  • the cells or cell lines according to the invention can advantageously be kept in culture media which are easy to prepare. This cultivation of the cells in simple culture media enables them to be used to investigate transport processes and to metabolize foreign substances in test systems to test the mutagenicity or cytotoxicity 1 of basic chemicals, food ingredients, pollutants and medicinal products and to investigate the molecular basis of colon cancer use.
  • the invention also relates to a method for producing the colon epithelial cells and cell lines according to the invention, this method comprising the following steps:
  • the invention also relates to a kit which comprises at least one colon epithelial cell according to the invention.
  • This kit can be used, for example, as a diagnostic kit to carry out a proliferation control or a mutagenicity test. With this kit, colon-relevant physiological processes as well as tumor development in vitro can be researched.
  • Colon cell includes.
  • the Ijit according to the invention can of course comprise further constituents which are necessary, for example, to ensure the survival of the cell or to cultivate it.
  • the kit according to the invention can advantageously comprise substances which are suitable for researching colon-relevant physiological processes or the development of tumors in vitro.
  • the cells of the invention in the kit - essentially separated from each other - be stored, so it that for example, by a professional. Examination of tumor development under the conditions desired by them can be merged.
  • the kit according to the invention can further comprise biological, chemical and / or physical agents which serve the research of physiological and patnophysiological processes.
  • Such a physical means can be, for example, an optical device with which metabolic processes or the growth of the cells can be observed and determined.
  • Biological or chemical agents are e.g. B. nutrient media, other cells or cell cultures, toxins, buffer solutions, drugs to be examined, food components and the like.
  • the colon is removed from an untreated rat.
  • the data content is rinsed out with 0.15 M NaCl solution.
  • a 4 cm long middle section of the intestine is then removed and cut open lengthways.
  • the middle part of the intestine is dissolved in 30 ml of a solution A (109 mM NaCl, 2.4 mM KC1, 1.5 mM KH 2 PO 4 , 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.5 mM EDTA, 10 mM glucose, 5 mM Glutamine; pH 7.4) at 37 ° C, 50 min and 100 revolutions / min.
  • the center piece is then concentrated in solution B (Dulbecco's modified Eagle Medium lOx, 500 ml fetal bovine serum, 5%; insulin, 0.25 units / ml; NaHC0 3 , 7.5%; glutamine, 2.99%; gentamycin, 25 ⁇ g / ml; penicillin / streptomycin, each 100 ⁇ g / ml).
  • the crypts which are located in the central part of the large intestine, are diluted in solution B and plated out in 12 or 24 well plates. Through the use of EDTA (ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt), the calcium complexes in the tissue and leads to the crypts only sitting loosely in the tissue. By slightly swiveling the middle part of the intestine in solution B, the crypts detach from the tissue and pass into solution B.
  • EDTA ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt
  • the sequence for da's SV 40 large T antigen (in the form of the vector LoxP-HyTK-large T) is introduced into the amphotropic packaging cell line PA317 and GP + envAml2.
  • This method is Liang-Ping Li et al. , Human Gene Therapy 8, pp. 1695-1700 (September 20, 1997) and thus included in the disclosure of this invention.
  • the packaging cell lines release retroviruses, which contain the sequence for the SV 40 large T antigen, into the culture supernatant. To immortalize the colon epithelial cells, portions of the supernatant are made of these Packing cell lines placed on the colon epithelial cells.
  • the retroviruses infect the colon epithelial cells and in the nucleus of the host cells, ie in this case the colon epithelial cells, the viral DNA is incorporated into the host genome of the colon epithelial cells.
  • the colon epithelial cells thus produce SV 40 i large T antigen after the viral infection, which leads to immortalization of the colon epithelial cells by complexing the cellular p53 and Rb protein.
  • the colon cells obtained in this way can be used for test systems to test the mutagenicity or cytotoxicity of chemicals and other molecular tests.
  • the immortalized human colon epithelial cells are in a serum-free cell culture medium, such as. B. described in US Pat. No. 6,395,542 B1, sown thinly.
  • a substance e.g. 0.05 or 0.1 ⁇ g

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Abstract

Es werden nicht-tumorigene adulte humane oder Ratten-Dick-darmepithelzellen vorgeschlagen, gewinnbar durch - Entnahme von Krypten, die Dickdarmepithelzellen enthalten, aus Dickdarmgewebe unbehandelter Men-schen oder Ratten,- Verdünnen und Ausplattieren der Krypten und- In-Kontakt-Bringen der Krypten mit einem Retro-virus, der das Gen für das SV 40 large T-Antigen umfasst, wodurch die Dickdarmepithelzellen mit dem Retrovirus infiziert und die nicht-tumorigenen adulten Dickdarmepithelzellen gewonnen werden.

Description

Iπ-mortalisierte Dickdarmepithelzellen und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft immortalisierte Dickdarmepithelzellen sowie -zelllinien und die Verwendung der Dickdarm- epithelzelllinien zum Studium dickdarmrelevanter physiologischer Prozesse und der Dickdarmkrebsentstehung. Es sind zahlreiche Möglichkeiten bekannt, an Zellen physiologische Prozesse oder Vorgänge der Krebsentstehung zu untersuchen. Eine Möglichkeit ist beispielsweise die Untersuchung am lebenden Objekt. Aus verschiedenen Gründen, wie mangelnder Reproduzierbarkeit oder ethischen Gesichts- punkten, wurde nach Alternativen zur Untersuchung an lebenden Versuchstieren gesucht . Eine Alternative ist die Untersuchung an Zellkulturen.
Beschrieben sind u,. a. Zellkulturen, die Primärkulturen darstellen und ungefähr eine Woche bei einer Teilungszeit von 24 Stunden in vitro gehalten werden können. Definitionsgemäß versteht man unter Primärkulturen alle in vitro Züchtungen von Zellen, Geweben und Organen, die direkt aus dem Organismus entnommen wurden. Für die Gewinnung einer Zellkultur ist insbesondere eine vollständige Dissoziation des Gewebes bzw. des Organs notwendig. Von zahlreichen Zellen sind im Stand der Technik Primärkulturen oder Zellkulturen bekannt, beispielsweise von Herzmuskelzellen der Hühnchen oder aus neonatalen Rattenherzen, aus frischen Hautproben menschlichen Ursprungs und aus soliden Human- tumoren u. a.
Weiterhin sind Zellkulturen bekannt, die nicht primär, aus dem Organismus , gewonnen und kultiviert werden, sondern Dauerkulturen darstellen. Es werden Sekundärkulturen und Zelllinien unterschieden. Sekundärkulturen sind Zellstämme, die von einer Primärkultur ausgehend verschiedene Generationen erreichen. Zelllinien sind permanente lebensfähige Kulturen. Zahlreiche Zelllinien wurden von verschiedenen Tumoren etabliert. Zelllinien sind meist einheitlich in ihrer Morphologie und in ihren funktioneilen Eigenschaften. Bestimmte Zelllinien zeichnen sich durch selektive Wachstumseigenschaften aus, die bestimmte Zellkulturmedien mit definierten Wachstumsfaktoren erfordern; diese Zelllinien sind deshalb für die Untersuchung von Wachstums- und Differenzierungsprozessen, einschließlich der Prozesse der malignen Transformation, wertvolle Untersuchungsobjekte. Mit Hilfe von Zellkulturen ist es weiterhin möglich, spezielle Untersuchungen durchzuführen, wie beispielsweise Versuche zur in vitro- oder in vivo Toxizität, zur Prüfung der akuten Zelltoxizität, der Testung auf die Lebensfähigkeit von Zellen bzw. Tests zur Messung der Lebensfähigkeit und des normalen und entarteten Wachstums . Weiterhin werden Zellkulturen zum Nachweis mutagener Substanzen eingesetzt. Es ist außerdem möglich, kultivierte Zelllinien zur Trans- fektion, beispielsweise zur Transfektion mittels Elektro- poration bzw. zur Klonierung sowie zur Testung der Pro- liferationsrate einzusetzen. Um Untersuchungen, wie die Proliferationskontrolle bzw. den Mutagenitatstest in vitro so durchzuführen, dass sie möglichst viele Rückschlüsse auf das in vivo Verhalten der Zellen zulassen, ist es erforderlich, für bestimmte Tumorarten, wie beispielsweise den Leberkrebs oder Dickdarmkrebs, gesunde, unbehandelte Lebergewebs- bzw. Dickdarmzellen oder Zelllinien zu etablieren. Für verschiedene Organe bzw. Gewebeteile liegen im Stand der Technik derartige Zellkulturen bzw. Zelllinien zur Untersuchung und zur Verlaufskontrolle der Entwicklung wichtiger Tumore vor. Der Dickdarmkrebs ist eine der häufigsten Krebsarten in den westlichen Industrieländern. In der Bundesrepublik erkranken schätzungsweise 24.000 Männer und 28.000 Frauen jährlich an Krebs des Dickdarms. Dickdarmkrebs tritt meist nach dem 50. Lebensjahr auf, wobei das Erkrankungsrisiko bis ins hohe Alter stetig ansteigt .
Um dickdarmrelevante physiologische Prozesse und die Tumorentstehung in vitro zu erforschen, gibt es jedoch bisher kein adäquates Zellkultursystem. Damit sind Zelllinien gemeint, die über sehr lange Zeiträume, von 6 bis 12 Monaten, in Kultur gehalten werden können und zu vermehren sind. Als bekannte Alternativzellkultursysteme werden daher entweder Zelllinieh aus Dickdarmtumoren des Menschen, Zelllinien aus dem Dünndarm der Ratte, wie z. B. IEC-6 und IEC-18 Zellen, oder Dickdarmprimärzellkulturen, die ent- weder aus der Maus, der Ratte oder dem Menschen stammen, verwendet. Diese bekannten Zellkultursysteme zeigen aber erhebliche Nachteile und Limitierungen:
(i) die humanen Dickdarmtumorzellen stellen bereits maligne transformierte Zellen dar, so dass sie nicht zur Bearbeitung der Frage im Bereich der Dickdarm- krebsentstehung herangezogen werden können;
(ii) die DünndarmepithelZeilen, wie die IEC-6 und IEC-18 Zellen, verhalten sich als Zellkultur völlig anders als Dickdarmepithelzellen und (iii) die Dickdarmprimärzellkulturen haben nur .eine begrenzte Lebensdauer, in der Regel von 7 bis 10 Tagen, so dass sie zum Studium von Prozessen, die einen längeren Zeitraum in Anspruch nehmen, wie beispielsweise der Testung von mutagenen Substanzen oder der Krebsentstehung, nicht geeignet sind.
Es hat seitens der Fachwelt mehrere Versuche gegeben, nicht maligne Dickdarmepithelzellen aus dem Menschen bzw. aus den häufig genutzten Laborversuchstieren - den Ratten - zu isolieren und zu kultivieren. Bisherige Versuche führten nachteilhafterweise: dazu, dass z. B. Dickdarmepithelzell- kulturen etabliert wurden, die bei den üblichen Kulturtemperaturen, auf die zahlreiche Tests genormt sind - nämlich 37 °C - absterben. Weiterhin sind fötale Dickdarmepithelzellen als Kultur etabliert worden, die jedoch keine Rückschlüsse auf das Verhalten der adulten Zellen und somit •. keine Rückschlüsse auf den normalen Patienten zulassen.1 Der größte Nachteil von fötalen Zellen gegenüber adulten Zellen liegt darin, dass sich fötale Zellen hinsichtlich ihrer Ausstattung mit verschiedenen Enzymen und somit ihre Stoffwechselkapazität sehr stark von adulten Zellen unterscheiden. So konnten Lacy und Colony (1985) zeigen, dass die Expression der Carboanhydrase erst zum Zeitpunkt der Geburt eines Organismus in seinen Dickdarmzellen nachzuweisen ist. Wohingegen die Saccharase- Aktivität in fötalen Dickdarmzellen vorhanden und zum Zeitpunkt der Geburt praktisch nicht mehr messbar ist. Weiterhin haben Füller und Verity (1990) festgestellt, dass die NA+/K+-ATPase-Aktivität in fötalen Dickdarmzellen sehr gering ist und erst nach der Geburt stark ansteigt . Takahashi et al . (1998) offenbarten weiterhin, dass die llß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ II-Aktivität in fötalen Dickdarmzellen bis zur 40. Schwangerschaftswoche kaum nachweisbar ist, und erst nach der Geburt stark ansteigt. Außerdem ist bekannt, dass fötale Humandickdarmepithelzellen im Vergleich zu adulten Humandickdarmepithelzellen viel weniger empfindlich gegen Apoptose-induzierenden Agenzien wie z. B. Natriumbutyrat oder bestimmten Gallensäuren sind. Demgemäß ist es allgemeines Fachwissen, dass sich fötale und adulte Dickdarmepithelzellen in der Expression verschiedener Enzyme und somit auch im zellulären Stoffwechsel so deutlich unterscheiden, dass mit fötalen Zellen durchgeführte Versuche keine Rückschlüsse auf adulte Zellen zulassen. Aus diesem Grunde eignen sich fötale Dickdarmepithelzellen generell nicht zu Versuchen, die Rückschlüsse auf ;die Dickdarmepithelzellen in adulten Organismen geben sollen. Weiterhin sind im Stand der Technik Dickdarmzellen bekannt, die auf 33 °C optimiert sind. Durch die Optimierung auf 33 °C ist es nachteilhafterweise nicht möglich, Untersuchungen mit diesen Zellen bei ' einer Laborstandardtemper'atur von 37 °C durchzuführen. Sofern derartige Zellen in den zahlreichen, auf 37 °C normierten Tests zur Untersuchung von Stoffwechsel-physiologischen bzw. pathophysiologischen Prozessen eingesetzt werden, sind keine exakten .Aussagen bezüglich Wachstum- und StoffWechselaktivität möglich. Daher können derartig normierte Zellen nicht in den üblichen Laborroutinen eingesetzt werden. Insbesondere ist es nicht möglich, durch die Versuche mit diesen Zellen die in vivo Gesamtsituation in einer experimentellen Anordnung nachzubilden.
Bei anderen bekannten Methoden zur Etablierung von Dickdarmepithelzellen ist es erforderlich, dass von den Zellen zunächst eine Kultur angelegt wird, was einen Zeitraum von ca. 10 Tagen beansprucht, so dass sich der Differenzierungsgrad der Zellen im Vergleich zu den Zellen im Frischgewebe stark verändert hat. Außerdem sterben in diesem langen Zeitraum Zellen ab; es werden hierbei auch die herausselektiert, die sich an die entsprechenden Zellkulturbedingungen angepasst haben. Ein objektives Bild über die in vivo GesamtSituation ist so nicht möglich, da die in vitro Kultur aus ausselektierten Zellen besteht. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine ausdifferenzierte Dickdarmzelle bzw. eine Dickdarmzelllinie bereitzustellen, die nicht transformiert bzw. maligne ist und die über Monate hinweg in Kulturen gehalten werden kann. Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung von nicht-tumorigenen adulten humanen oder Ratten-Dickdarmepithelzellen, die gewonnen werden durch die, Entnahme von Dickdarmepithelzellen enthaltenden Krypten aus dem Dickdarmgewebe unbehandelter Menschen oder Ratten, dem Verdünnen und Ausplattieren der Krypten und dem In-Kontakt-Bringen der Krypten mit einem Retrovirus, der das Gen für das -SV40 large T Antigen umfasst, wodurch die Dickdarmepithelzellen mit dem Retro- virus infiziert und, die nicht-tumorigenen adulten Dickdarmepithelzellen gewonnen werden.
Erfindungsgemäß wird; zunächst der Dickdarm aus einer unvorbehandelten Ratte bzw. ein Stück des Dickdarms des Menschen entnommen. Der Dickdarm kann dann in kleine Stücke geschnitten beziehungsweise anders zergliedert und in dem Fachmann bekannten geeigneten Lösungen inkubiert werden. Die Lösungen können so ausgewählt sein, dass sie beispielsweise Calcium komplexieren, was insbesondere dazu führt, dass die Krypten des Dickdarms sehr locker im Gewebe sitzen. Krypten sind Faltungen auf der Epitheloberfläche des Dickdarms, die der Vergrößerung der Oberfläche dienen. Die Krypten sind für die Sekretion und die Zellerneuerung mitverantwortlich. Da im Dickdarm keine Zotten - wie im Dünndarm - mehr vorkommen, haben die Krypten eine entsprechende wichtige Funktion. In diesen tubulδsen Epitheleinsenkungen befinden sich Dickdarmepithelzellen, die normal differenziert sind. Um die. Zellen aus den Krypten zu gewinnen, sind vorteilhafterweise keine weiteren Behandlungsschritte erforderlich, da die Krypten innerhalb von wenigen Stunden ' zerfallen und vereinzelte Dickdarmepithelzellen so freigegeben werden. Die gewonnenen Krypten, die ursprünglich einschichtig, hochprismatisch, lange, dicht nebeneinander stehende, unverzweigte, gerade Glandulae intestinales mit vielen Becherzellen darstellen, werden erfindungsgemäß verdünnt und ausplattiert. Das Ausplattieren kann beispielsweise in dem- Fachmann bekannten Mikrotiterplatten erfolgen. Anschließend werden Retroviren, die die Sequenz für das SV 40 large T-Antigen enthalten, mit den Krypten so in Kontakt gebracht, dass die in den Krypten befindlichen Dickdarmepithelzellen mit den Retroviren infiziert werden. Retroviren sind mit Vorteil für die Transfektion besonders gut geeignet, da sie eine hohe Integrationsgarantie aufweisen. Die Integration kann an einer beliebigen Stelle des Genoms erfolgen, es wird jedoch insbesondere nur eine Kopie integriert, ohne dass es vorteilhafterweise .' zu größeren Veränderungen am Integrationsort kommt. eil die Integration in jeder Zelle an einem anderen Ort : erfolgen kann, können mehrere Zellen jeweils aus einem ' unterschiedlichen Genom entstehen. Es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass die Integration jeweils am gleichen bzw. ähnlichen Ort im Genom erfolgt. Dem Fachmann sind weitere Methoden des Transfers von Nucleinsäuresequenzen bekannt, beispielsweise die Mikro- injektion, der DNA-Transfer mit der Genpistole, entweder mit Mikroprojektilen bzw. mit Makroprojektilen, bzw. mit Cosmiden oder Plasmiden. Diese Methoden können in Kombination oder Ergänzung zu der retroviralen Infektion eingesetzt werden.. Durch den Einbau des SV 40 large T- Antigens in das Genom der . Dickdarmepithelzellen werden diese Zellen in den Krypten immortalisiert. Dadurch, dass sich die Zellen insbesondere in den Krypten befinden, bleibt ihr Differenzierungsgrad vorteilhafterweise erhalten. Durch die Immortalisierung ist eine unbeschränkte Anzahl an Zellkultur-Passagen möglich, d.h., die Zellen können sich nahezu unbegrenzt teilen und stehen somit für Langzeitversuche von bis zu einem halben Jahr oder länger zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das
SV 40 large T-Antigen in den Vektor LoxP-HyTK-large T eingebracht. Eine vorteilhafte Methode, Nucleinsäure- Sequenzen oder Gene zu klonieren, ist die Cre-Lox -Methode . Die Cre-Rekombinase eines ausgewählten Bakteriophagen katalysiert eine ortsspezifische Rekombination zwischen den so genannten Loci-LoxP. Da ein Ligationsschritt im klassischen Sinne fehlt, ist diese Methode mit Vorteil sehr schnell und fehlerfrei. Das Protein Cre ist ein Rekombinationsenzym, eine Rekombinase, welches einen 34 Basen langen DNA-Abschnitt erkennt und bindet, die man als LoxP-Stellen bezeichnet. Die Cre-Rekombinase vermittelt vorteilhafter- weise eine Rekombination zwischen zwei LoxP-Stellen. Befinden sich diese beiden LoxP-Stellen auf einem DNA- Molekül und sind sie zudem noch gleichgesinnt, wird durch das Rekombinationsereignis die Sequenz zwischen den LoxP- Stellen vorteilhafterweise spezifisch entfernt. Da sich die zu untersuchenden Nucleinsäurefragmente nicht selbstständig replizieren können, müssen sie mit einem geeigneten Replikon gekoppelt werden. Solche Replikons sind insbesondere Vektoren oder Klonierungsvehikel . Kleine Plasmide und Bakteriophagen sind als Vektoren geeignet und können in vielfältiger Weise modifiziert werden, um die Einführung rekombinanter DNA- oder RNA-Moleküle in Zellen, vorzugsweise Dickdarmepithelzellen, zu verbessern und die Selektion erfolgreich transformierter Zellen zu erleichtern. Cre ist ein aus Viren isoliertes Enzym, das die Chromosomen in bestimmte Abschnitte zerschneidet, wodurch vorteilhafterweise ein Austausch dieser Abschnitte zwischen den Chromosomen angeregt wird. Mit Vorteil ist durch den genannten Vektor eine transiente Expression des SV 40 large T-Antigens möglich. Es ist weiterhin möglich, dass der Vektor Gene für Herpes Simplex Virus Thymidinkinase (TK) umfasst . Diese Gene können von LoxP Sites flankiert werden, dem Substrat der Bakteriophagen Rekombinase Cre . Der Retrovirus kann jedoch auch Gene für die Cre Rekombinase und Selektionsmarker umfassen. Mit Vorteil ist es durch die eingesetzten Marker möglich, die Zelllinie für mehr als ein Jahr in der Kultur wachsen zu lassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Krypten und die in diesen befindlichen Dickdarmepithelzellen nach der Entnahme des Darmes bzw. nach der Entnahme aus dem Darm ohne weitere Zwischenschritte, insbesondere Kultiyierungsschritte, mit den Retroviren in Kontakt gebracht. Es ist also bevorzugt, frische Dickdarmepithelzellen, diβ| sich in den Krypten befinden, zu transfizieren. D.h., die gewonnenen Dickdarmepithelzellen werden insbesondere keinen weiteren Bearbeitungsschritten oder Kultivierungsschritten unterzogen, so dass ihre ursprüngliche Art der Differenzierung und Physiologie weitestgehend erhalten bleibt . Insbesondere werden die Dickdarmepithelzellen vor der Transfektion nicht kulti- viert. Mit Vorteil, werden so mögliche Veränderungen, die während der Kultivierung der Zellen auftreten können, unterbunden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungs- gemäßen Zellen zur Etablierung einer Dickdarmepithelzell- linie. Durch das Anlegen einer ersten Subkultur wird aus der Primärkultur der einzelnen erfindungsgemäßen Dickdarmepithelzellen eine Zelllinie, die aus zahlreichen Unterlinien der Zellen bestehen, aus denen sich die Primärkultur ursprünglich zusammensetzte. Die Vermehrung und das Wachstum von Zellen1 in einer Zelllinie in vitro einschließlich der Kulturen von Einzelzellen . wird demgemäß erfindungsgemäß als. Zellkultur bezeichnet. Eine Zelllinie besteht aus zahlreichen Unterlinien der Zellen, aus denen die Primärkultur ursprünglich bestand. In Zellkulturen organisieren sich die Zellen nicht mehr im Gewebe. Eine kontinuierlich wachsende Kultur, die eine große Anzahl von Populationsverdoppelungen hinter sich hat, wird im Sinne der Erfindung als etablierte Zellkultur bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Dickdarm- epithelzellen und/oder die Dickdarmepithelzelllinien zum Screening von Arzneimitteln verwendet werden. Insbesondere ist es möglich, die Dickdarmzellen als biologische Zielstrukturen zeitnah mit Mitteln in Kontakt zu bringen, die pathogene oder nicht-pathogene Veränderungen hervorrufen; durch den Zusatz von Arzneimitteln oder Arzneimittelkandidaten können so zum einen die Wechselwirkungen dieser Substanzen untersucht werden und zum anderen ist es möglich, zu bestimmen, ob die Arzneimittel die nicht-patho- genen und die pathogenen Veränderungen der Dickdarmzellen modifizieren können. Selbstverständlich ist es möglich, die erfindungsgemäßen Zellen und Zelllinien - neben dem Screening - auch für andere kombinatorische Testungen zu verwenden. Hierbei . können die Zellen beispielsweise eine Sonde sein, die mit Festphasenassays oder anderen ZielStrukturen integriert, oder es ist möglich, dass die Zelllinie als Target in einem kombinatorischen Test verwendet wird, wobei sie mit ausgewählten Sonden - z. B. Phagen oder Molekülen - wechselwirkt . In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dienen die Dickdarmepithelzellen bzw. die Dickdarmepithelzelllinien zur Untersuchung der Dickdarmkrebsentstehung, physiologischer, pathophysiologischer und/oder toxischer Prozesse. Mit den erfindungsgemäßen Dickdarmzellen bzw. Dickdarmepithelzelllinien ist es vorteilhafterweise möglich, über einen langen Zeitraum mit homogenen Kulturen die Entstehung von Dickdarmkrebs bzw. andere physiologische Prozesse zu untersuchen. Es ist insbesondere möglich, die
Mutagenität oder Zytotoxizität von Grundchemikalien, Lebensmittelinhaltsstoffen, Schadstoffen und Arzneimitteln mit Hilfe der Dickdarmepithelzellen bzw. der -zelllinien zu testen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die erfindύngsgemäßen' Dickdarmepithelzellen bzw. -zell- linien für Langzeitkulturen verwendet, vorzugsweise für Kulturzeiten von 6 bis 12 Monaten. Physiologische Prozesse bzw. Vorgänge der Dickdarmkrebsentstehung nehmen in der Regel Zeiträume von mehreren Wochen, Monaten oder mehr ein. Bekannte Zellkulturen können für wenige Wochen stabil mit gleich bleibender Qualität etabliert werden. Test.reih.en, die einen größeren zeitlichen Rahmen verlangen, sind mit diesen Zellkulturen nicht zu untersuchen. Die erfindungsgemäßen Zellen und Zelllinien des Dickdarmepithels ge- statten Untersuchungen an ein und derselben Zelllinie, die länger als 1 Jahr in Anspruch nehmen;
!
Die erfindungsgemäßen Zellen und/oder Zelllinien können • bevorzugt weiterhin für folgende Anwendungsgebiete eingesetzt werden: (a) zur Identifizierung von Metaboliten, die nach Inkubation eines Stoffes mit den Zellen entstanden sind und sich im Zellkulturüberstand bzw. in den Zellen befinden, '
(b) zur Identifizierung von Stoffen, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme induzieren,
(c) zur Bestimmung von zeilvermittelter Mutagenität von Stoffen in Bakterien,
(d) zur Bestimmung der zellvermittelten Mutagenität . von Stoffen in Säugetierzellkulturen, (e) zur Bestimmung der kovalenten Bindung von Stoffen bzw. deren Metaboliten an Nucleinsäuren (DNA,RNA) und Proteinen in den Zellen,
(f) zur Bestimmung .einer DNA-Schädigung in den Zellen nach Inkubation der Zellen mit einem Stoff, (g) zur Bestimmung der Zytotoxizität eines Stoffes,
(h) zur Bestimmung der Induktion von' Apoptose in den Zellen nach Inkubation der Zellen mit einem Stoff,
(i) zur Bestimmung des polarisierten Transports von Stoffen,
(j) zur Charakterisierung von Transportproteinen in der Zelle und/oder
(k) zur Modulierung der Expression (Hemmung, Aktivierung, Induktion) von Transportproteinen durch einen Stoff.
Stoffe im Sinne der Erfindung können sämtliche biologische, chemische aber auch physikalische stoffliche Einwirkungen sein, wie z. B. lohen, Komplexverbindungen, Arzneimittel, Kohlenhydrate, Lipide, Proteine, Gemische aus diesen, UmweltSubstanzen, Nahrungsmittelbestandteile, radioaktive Strahlung, Röntgenstrahlung und andere. Das' heißt, ein Stoff im Sinne der Erfindung ist jedes Agens, dessen Wirkung auf die Zellen bzw. auf Substanzen, die wiederum auf die Zellen wirken, geprüft werden soll.
Die erfindungsgemäßen Dickdarmepithelzellen und -zelllinien weisen gegenüber den bekannten Zelllinien mehrere Vorteile auf. Zahlreiche Zelllinien, die zur Untersuchung der Abläufe im Dickdarmbereich verwendet werden, stammen aus Dickdarmtumorzellen. Derartige Zellen sind bereits maligne und können nicht mehr für Versuche der Tumorentstehung und -Verlaufsentwicklung eingesetzt werden. Die bekannten Dickdarmprimärzellkulturen haben eine begrenzte Lebensdauer von ungefähr 14 Tagen, so dass sie zum Studium von Prozessen, die einen längeren Zeitraum in Anspruch nehmen, nicht geeignet sind. Mit den erfindungsgemäßen Zellen und Zelllinien wird erstmals ein System zur Verfügung gestellt, was es gestattet, an nicht-tumorigenen adulten Zellen aus Ratten bzw. Menschen Versuche vorzunehmen, die einen physiologisch langen Zeitraum in Anspruch nehmen. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Zellen und Zell- linien ist, dass die Gewebe bzw. die Organismen - nämlich Mensch und Ratte -, aus denen sie entnommen werden, nicht vorbehandelt werden müssen. Auch hierdurch wird der Differenzierungsgrad der Zellen im Frischgewebe weitest- gehend erhalten. Die: erfindungsgemäßen Zellen oder Zell- linien können mit Vorteil in einfach herzustellenden Kulturmedien gehalten werden. Diese Kultivierung der Zellen in einfachen Kulturmedien ermöglicht es, sie zur Untersuchung von Transportprozessen und zur Verstoffwechselung von Fremdstoffen in Testsystemen zur Prüfung der Mutagenität bzw. Zytotoxizität1 von Grundchemikalien, Lebensmittelinhaltsstoffen, Schadstoffen und Arzneimitteln und für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der Dickdarmkrebs- entstehung zu verwenden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Dickdarmepithelzellen und Zelllinien, wobei dieses Verfahren folgende Schritte umfasst:
Entnahme von Krypten, die Dickdarmepithelzellen enthalten, aus Dickdarmgewebe unbehandelter Menschen oder Ratten, - Verdünnen und Ausplattieren der Krypten und
In-Kontakt-Bringen der Krypten mit einem Retrovirus, der das Gen für das SV 40 large T-Antigen umfasst, wodurch die Dickdarmepithelzellen mit dem Retrovirus infiziert und die nicht-tumorigenen adulten Dickdarmepithelzellen gewonnen werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der mindestens eine erfindungsgemäße Dickdarmepithelzelle umfasst. Dieser Kit kann beispielsweise als Diagnose-Kit verwendet werden, um eine Proliferationskontrolle bzw. einen Mutagenitatstest durchzuführen. Mit diesem Kit können dickdarmrelevante physiologische Prozesse aber auch die Tumorentstehung in vitro erforscht werden. Im Sinne der Erfindung ist unter einem Kit jede Anordnung, Vorrichtung bzw. Zellsuspension oder Zellkultur zu verstehen, die mindestens eine erfindungsgemäße . Dickdarmzelle umfasst. Der erfindungsgemäße Ijit kann selbstverständlich weitere Bestandteile umfassen, die beispielsweise zur Überlebenssicherung der Zelle bzw. zu ihrer Kultivierung notwendig sind. Außerdem kann der erfindungsgemäße Kit mit Vorteil Substanzen umfassen, die geeignet sind, dickdarmrelevante physiologische Prozesse oder die Tumorentstehung in vitro zu erforschen. Hierzu ist es beispielsweise bevorzugt, dass Substanzen, die' zur Erforschung der Tumorentstehung in vitro geeignet sind, mit den erfindungsgemäßen Zellen in dem Kit - im Wesentlichen von einander getrennt - aufbewahrt werden, so dass sie beispielsweise von einem Fachmann zu .Untersuchung der Tumorentstehung unter den von ihnen gewünschten Bedingungen zusammengeführt werden können. Der erfindungsgemäße Kit kann weiterhin biologische, chemische und/oder physikalische Mittel umfassen, die der Forschung physiologischer und patnophysiologischer Prozesse dienen. Bei einem solchen physikalischen Mittel kann es sich beispielsweise um eine optische Vorrichtung handeln, mit der Stoffwechselvorgänge oder das Wachstum der Zellen beobachtet und bestimmt, werden können. Biologische bzw. chemische Mittel sind z. B. Nährmedien, andere Zellen oder Zellkulturen, Toxine, Pufferlösungen, zu untersuchende Arzneimittel, Nahrungsbestandteile und dergleichen mehr.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Ausführungs- beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein. Beispiel 1
Gewinnung der nicht-tumorigenen immortalisierten Dickdarmepithelzellen
Zunächst wird aus einer unvorbehandelten Ratte der Dickdarm entnommen. Der Datminhalt wird mit 0,15 M NaCl-Lδsung ausgespült . Anschließend wird ein Darmmittelstück von 4 cm Länge entnommen und der Länge nach aufgeschnitten. Das Darmmittelstück wird in 30 ml einer Lösung A (109 mM NaCl, 2,4 mM KC1, 1,5 mM KH2P04, 4,3 mM Na2HP04, 1,5 mM EDTA, 10 mM Glucose, 5 mM Glutamin; pH 7,4) bei 37 °C, 50 min und 100 Umdrehungen/min inkubiert. Anschließend wird das Mittelstück in Lösung B (Dulbecco's modified Eagle Medium lOx konzentriert, 500 ml fötales Rinderserum, 5%; Insulin, 0,25 Einheiten/ml; NaHC03, 7,5%; Glutamin, 2,99%; Gentamycin, 25 μg/ml; Penicillin/Streptomycin, jeweils 100 μg/ml) geschwenkt. Die Krypten, die sich im Dickdarmmittel- stück befinden, werden in Lösung B verdünnt und in 12 bzw. 24 Well-Platten ausplattiert. Durch den Einsatz von EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäure-Dinatriumsalz) komplexiert das Calcium im Gewebe und führt dazu, dass die Krypten nur noch locker im Gewebe sitzen. Durch das leichte Schwenken des Darmmittelstückes in der Lösung B lösen sich die Krypten aus dem Gewebe und gehen in die Lösung B über.
Die Sequenz für da's SV 40 large T-Antigen (in Form des Vektors LoxP-HyTK-large T) wird in die amphotrope Verpackungszelllinie PA317 und GP+envAml2 eingebracht. Diese Methode ist Liang-Ping Li et al . , Human Gene Therapy 8, S. 1695-1700 (September 20, 1997) erläutert und somit in den Offenbarungsgehalt dieser Erfindung mit aufgenommen. Die Verpackungszelllinien setzen Retroviren, die die Sequenz für das SV 40 large T-Antigen enthalten, in den Kulturüberstand frei. Um die Dickdarmepithelzellen zu immortalisieren, werden Portionen des Überstandes dieser Verpackungszelllinien auf die Dickdarmepithelzellen gegeben. Die Retroviren infizieren die Dickdarmepithelzellen und im Kern der Wirtszellen, d.h. in diesem Fall der Dickdarmepithelzellen, wird die virale DNA ins Wirtsgenom der Dickdarmepithelzellen inkorporiert. Somit produzieren die Dickdarmepithelzellen nach der viralen Infektion SV 40 i large T-Antigen, das durch Komplexierung des zellulären p53 und Rb-Proteins zur Immortalisierung der Dickdarmepithelzellen führt. Die so gewonnenen Dickdarmzellen können für TestSysteme zur Prüfung der Mutagenität bzw. Zytotoxizität von Chemikalien und anderer molekularer Untersuchungen benutzt werden.
Beispiel 2
Chemisch-induzierte ' Transformation von immortalisierten Dickdarmepithelzellen
Die immortalisierten Humandickdarmepithelzellen werden in einem serum-freien Zellkulturmedium, wie z. B. in der Patentschrift US 6,395,542 Bl beschrieben, dünn ausgesät. Wenn die Zellen die Hälfte der Petrischale bedeckt haben, werden sie mit einem Stoff (z. B. 0,05 bzw. 0,1 μg
Benzo [c] henanthren-Dihydrodiolepoxid/ml Zellkulturmedium) behandelt. Als Lösungsmittel dient Dimethylsulfoxid
(Endkonzentration im Zellkulturmedium: 0,005 %) . Nach 30 min wird der Zellkulturüberstand abgesaugt und durch frisches Zellkulturmedium ersetzt . Die Zellen werden dann bis zu vier Wochen subkultiviert. Falls sie innerhalb dieser vier Wochen . keine Anzeichen einer malignen Transformation zeigen (z. B. durch die Aufhebung der Zeil- Zeil-Kontaktinhibition bedingte Fähigkeit der Zellen, übereinander zu wachsen und Herde zu bilden) , werden sie erneut chemisch behandelt . Die Behandlungen werden so lange wiederholt, bis die Anzeichen einer malignen Transformation der Zellen (s. o.) lichtmikroskopisch sichtbar werden. Anschließend muss die Tumorigenität der Zellen sowohl im Reagenzglas (z. B. im Weichagar-Assay) als auch im Ganztier (z. B. in Nacktmäusen) verifiziert werden.
Literaturnachweis : Füller PJ, Verity (1990) - Colonic sodium-potassium adenosine triphosphate subunit gene expression: onotgeny and regulation by ■ adrenocortial steroids . Endocrinology 127: 32-38 j
Haza AI, Glinghammar B, Grandien A, Rafter J (2000) Effect of colonic luminal components on induction of apoptosis in human colonic cell lines. Nutr Cancer 36: 79- 89
Lacroix B, Kedinger M, Simon-Assmann P, Rousset M. , Zweibaum A, Haffen: K (1984) - Developmental pattern of brush border enzymes in the human fetal colon. Correlation with some morphogenetic events . Early Hum Dev 9: 95-103
Lacy ER, Colony PC (1985) - Localization of carbonic anhydrase activity in the developing rat colon. Gastroenterology 89(1): 138-150 Takahashi K, Sasano H, Fukushima K, Hirasawa G, Miura H, Sasaki I, Matsuno S, Krozowski ZS, Nagura H (1998) - llß- Hydroxysteroid dehydrogenase type II in human colon: a new marker of fetal development and differentiation in neoplasms . Anticancer Res 18: 3381-3388.

Claims

Patentansprüche
1. Nicht-tumorigene adulte humane oder Ratten-Dickdarmepithelzellen, gewinnbar durch
Entnahme von Krypten, die Dickdarmepithelzellen enthalten, aus Dickdarmgewebe .unbehandelter Menschen oder Ratten, - Verdünnen und Ausplattieren der Krypten und
In-Kontakt-Bringen der Krypten mit einem Retrovirus, der das Gen für das SV 40 large T-Antigen umfasst, wodurch die Dickdarmepithelzellen mit dem Retrovirus infiziert und die nicht-tumorigenen adulten Dickdarmepithelzellen gewonnen werden.
2. Dickdarmepithelzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das SV 40 large T-Antigen in ..den Vektor LoxP-HyTK- large T eingebracht ist .
3. Dickdarmepithelzellen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Krypten nach Entnahme ohne weitere Zwischen- schritte, insbesondere Kultivierungsschritte, mit den Retroviren inkubiert sind.
4. Dickdarmepithelzelllinie, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Dickdarmepithelzellen nach einem der Ansprüche •1 bis 3 umfasst.
5. Verwendung der Dickdarmepithelzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Etablierung einer Dickdarm- epithelzelllinie .
6. Verwendung der Dickdarmepithelzellen und/oder Dickdarmepithelzelllinien nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Screening von Arzneimitteln.
7. Verwendung der Dickdarmepithelzellen und/oder Dick- darmepithelzelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Untersuchung der Dickdarmkrebsentstehung, physio- logischer, pathophysiologischer und/oder toxischer Prozesse.
8. Verwendung nach Anspruch 7, in einer Langzeitkultur, vorzugsweise in einer Langzeitkultur mit einer Dauer von 6 bis 12 Monaten.
9. Verfahren zur Herstellung nicht-tumoriger adulter humaner oder Ratten-Dickdarmepithelzellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst
Entnahme von Krypten, die Dickdarmepithelzellen enthalten, aus Dickdarmgewebe unbehandelter Menschen oder Ratten,
Verdünnen und Ausplattieren der Krypten und - In-Kontakt-Bringen der Krypten mit einem Retrovirus, der das Gen für das SV 40 large T-Antigen umfasst, wodurch die Dickdarmepithelzellen mit dem Retrovirus infiziert und die nicht-tumorigenen adulten Dickdarmepithelzellen gewonnen werden.
10. Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er eine nicht-tumorige adulte humane oder Ratten-Dickdarmepithelzelle und/oder -zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1-4 umfasst.
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