EP1521779A1 - Composes se liant a l interferon-gamma, leur procede de preparation, et medicaments les contenant - Google Patents

Composes se liant a l interferon-gamma, leur procede de preparation, et medicaments les contenant

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Publication number
EP1521779A1
EP1521779A1 EP03760740A EP03760740A EP1521779A1 EP 1521779 A1 EP1521779 A1 EP 1521779A1 EP 03760740 A EP03760740 A EP 03760740A EP 03760740 A EP03760740 A EP 03760740A EP 1521779 A1 EP1521779 A1 EP 1521779A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
formula
interferon
group
compound according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03760740A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
David Bonnaffe
André Lubineau
Jocelyne Alais
Olivier Gavard
Anna Dilhas
Hugues Lortat-Jacob
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Sud
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Universite Paris Sud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Universite Paris Sud filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1521779A1 publication Critical patent/EP1521779A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to new compounds or neoglycoconjugates which bind to interferon-gamma.
  • the invention also relates to the process for the preparation of these compounds, the complexes formed by these compounds and interferon-gamma, and the medicaments comprising these compounds or complexes.
  • Interferon-gamma is a polypeptide comprising, for example, 143 amino acids in humans which is part of the family of cyto ines. Cytokines are mediators of cellular communication, which act according to a paracrine, autocrine or sometimes even endocrine process.
  • IFN ⁇ first characterized, on the basis of its antiviral activity, is involved in particular in the control of the immune response and during inflammation.
  • This cytokine is also cytotoxic or cytostatic for transformed cells and induces the synthesis of oxygen radicals. It regulates expression a large number of molecules in the pericellular space, in particular cell surface molecules, as well as a large number of compounds of the extracellular matrix. IFN ⁇ therefore plays an important role, among other things, in defense mechanisms, such as the immune response and inflammation, in cell growth and differentiation, in the phenomena of cell adhesion and migration (1).
  • Therapeutics linked to cytokines, such as IFN ⁇ consist either in administering this type of molecule, or, on the contrary, in inhibiting their activities.
  • IFN ⁇ Developing a therapy based on the use of IFN ⁇ poses technical problems important, linked in particular to its low half-life in vivo and its low bioavailability.
  • the obstacle of low bioavailability of IFN ⁇ can be overcome by using local application methods, but these methods do not allow deep organs to be reached systemically, moreover, the problem of low half - life in vivo remains intact.
  • such methods of local administration of IFN ⁇ mention may be made of the inhalation of IFN ⁇ for the treatment of lung cancer, its nebulization in the treatment of the allergic response, or its encapsulation in liposomes.
  • the cellular response to IFN ⁇ depends on the type of cells stimulated, the local concentration of IFN ⁇ and the other regulatory factors to which the cell is exposed concomitantly.
  • IFN ⁇ was also capable of binding to oligossacharides of the heparin or heparan sulphate (HS) type, with a high affinity (5 to 10 nM) (11) .
  • heparan sulfate effectively fixes IFN ⁇ , and this interaction controls the plasma elimination of the cytokine, its accumulation in various organs, and its location in the tissues.
  • the IFN ⁇ is eliminated by a biexponential process, during which 90% of the cytokine disappears from the blood circulation during the first 5 to 10 minutes, with a particularly short half-life time, similar 1 minute.
  • hepatocytes and endothelial cells - in the renal glomeruli or in the red pulp of the spleen (13).
  • heparin makes it possible to displace the cytokine accumulated in the tissues by endogenous HS, and therefore to reduce or suppress its activity.
  • a heparin molecule to protect IFN ⁇ and increase its bioavailability, or on the contrary to suppress its local action, raises difficulties which arise from the activities of heparin, itself, and , in particular, its anticoagulant properties.
  • HS heparan sulfates
  • the interaction site for IFN ⁇ was characterized. It consists of highly sulfated octasaccharide domains separated by a larger, less sulfated 7 kD domain.
  • Figure 1 shows a dimeric complex of IFN ⁇ and heparan sulfate.
  • the two octasaccharide domains are represented by bold lines in FIG. 1.
  • the molecules designated by A and B are fragments of depolymerization of heparin or of sparse sulfate. It may be recalled here that these molecules are characterized by very great structural heterogeneity, and that there is no method for obtaining molecules of this type of defined structure, from natural sources. The compound described in this document therefore in fact represents a mixture of molecules of various structures. Likewise for segment X which, depending on the case, may also be a fragment of depolymerization of heparan sulfate.
  • Such a molecule does not necessarily have C2 symmetry (the fragments A, X and B are "in lines", or oriented in the same direction, or else arranged in a "parallel” manner) and therefore does not respect the symmetry of the protein it's supposed to bind to.
  • these molecules are of animal origin and have the disadvantage of carrying possible transmissible infectious agents.
  • the object of the invention is to provide a molecule capable of binding to IFN ⁇ , which meets, among other things, the needs indicated above.
  • the object of the invention is also to provide a molecule capable of binding to IFN ⁇ , which does not have the drawbacks, limitations, defects and disadvantages of analogous molecules of the prior art, in particular heparin and which resolves the problems of the prior art.
  • X is a divalent spacer group of sufficient length to allow the two oligosaccharide fragments A and B to each bind to one of the peptide sequences 125 to 143 of the C-terminal ends of an interferon- ⁇ homodimer (IFN ⁇ )
  • n represents an integer from 0 to 10, for example and equal to 0.1, 2, 3, 4, or 5 and each R independently represents a hydrogen atom, an SO 3 "group , or a phosphate group, provided that no SO 3 "group is found in position 3 of the glucosamine units of compound (I).
  • all R's represent a group
  • the molecule according to the invention is new. It is not identical to any natural molecule, nor to any of the molecules synthesized in the prior art and in particular in application FR-A-2 736 832 (O-A-97/03700).
  • the molecule according to the invention has a specific structure due, first of all, to the fact that the two oligosaccharide groups, placed on either side of the spacer group X, are in an arrangement which can be qualified "symmetrical” or “antiparallel” with respect to the spacer arm, while both in the natural molecules of heparin and heparan sulfate, as in synthetic heparins and in similar molecules described in the prior art, both oligosaccharide groups are in a "parallel” or "asymmetrical” arrangement. These molecules therefore do not respect the symmetry of the protein on which they are capable of binding.
  • the natural molecules and the molecules of the prior art, whether they are heparin, heparan sulfate, or molecules analogous thereto ' are completely, completely asymmetrical, that is to say that they come in a form of type "1212", while the molecules of the invention are in an antiparallel form of type "1221", that is to say having a symmetry of type C2.
  • the molecules of the invention are fundamentally distinguished from natural molecules and molecules of the prior art by another essential structural characteristic in the sense that the molecules according to the invention do not contain a sulfate group in position 3 of the units glucosamine.
  • the molecules according to the invention therefore do not have one of the main drawbacks of the molecules of the prior art linked to their anticoagulant activity .
  • the molecule according to the invention which can be defined as being a "structural mimic" of heparan sulfate or heparin, in which heparin-type oligosaccharides are linked by a hydrophilic spacer (X) of modular length, is specifically binds to IFN ⁇ like HS.
  • the compound according to the invention therefore possesses, and even beyond, all the advantageous properties of heparin: namely, inter alia, the fact of protecting the IFN ⁇ molecule against attacks by proteases, the increase in bioavailability of IFN ⁇ , the ability to dissociate, by competition, an iFN ⁇ / heparan sulfate complex, without having the essential drawback: namely, the anticoagulant activity.
  • the molecules according to the invention are entirely synthetic molecules, unlike molecules of the prior art, represented, for example, by the document FR-A-2 736 832, in which the "terminal" oligosaccharide fragments are of natural origin, as in most cases, as the spacer arm.
  • the disadvantages presented by the molecules of document FR-A-2 736 832 have already been described above, in particular as regards the natural, animal origin of the fragments which constitute them.
  • the spacer group has a length o from 15 to 150 A, preferably from 33 to 50 A.
  • Affinity for the cytokine is optimal for a length of 33 to 50, for example 50 A.
  • the spacer group consists of a carbon chain, preferably from 1 to 120 C, one or more of the carbon atoms of which are optionally replaced by a heteroatom chosen from N, S, P and O, an S0 group, or a aryl group, said carbon chain carrying, optionally, one or more anionic groups preferably chosen from sulphate, phosphate and carboxylic groups, etc.
  • the spacer group X is derived from a polyglycol chosen, preferably, from poly (alkylene glycol) of which the alkylene group comprises from 1 to 4 C, such as poly (ethylene glycol).
  • the spacer group will be able to respond to the
  • n is generally an integer from 5 to 32.
  • n and m have the meaning already given above.
  • the invention also relates to a process for preparing the compounds corresponding to formula (II), in which the radical coupling of two compounds is carried out water soluble precursors of oligosaccharides of formula (III):
  • n is an integer from 0 to 10, for example equal to 0, 1, 2, 3, 4 or 5
  • R 1 and R 2 represent a protecting group for the hydroxyl group chosen, preferably, from p-methoxybenzyl groups and benzyl, with a dithiol precursor compound of the spacer group of formula:
  • R 1 is preferably a p-methoxybenzyl group and R 2 is a benzyl group.
  • the water-soluble compound precursor of oligosaccharides whose formula is given above (III) is prepared by the following successive steps: a) a disaccharide of formula (V):
  • a disaccharide of formula (V), above is subjected to an isomerization of the allyl group to 1-propenyl, followed by a hydrolysis of the enol ether formed and an activation of the hydroxyl group in the form of trichloroacetamidate to give a “donor” disaccharide, of formula (VIb):
  • the disaccharide of formula (V) is preferably prepared by a coupling reaction between a compound of formula (VIII):
  • a preferred process for preparing the compound (XI) is to carry out the acetylation of the compound of formula:
  • the compound of formula (XI) is obtained with a very high yield, generally greater than or equal to 95%, and high purity since the furano derivatives are only present in trace amounts in a proportion generally close to or less at 2%.
  • the therapeutic uses of the compound according to the invention can use one but also several compounds according to the invention.
  • the invention further relates to the compound (I) and the preferred compounds (II), and (IIa) to (Ili) for use as a medicament, generally, the compound (I) and the compounds (II) and (IIa) to (Ili) being new.
  • the invention relates to the use of the compound (I) and of the compounds (II) and (IIa) to (IIi) in general for preparing a medicament.
  • the compounds according to the invention can be used to modulate, for example inhibit, the activity of exogenous or endogenous interferon- ⁇ .
  • the invention therefore also relates to the compound (I) and to the compounds (II) and (IIa) to (Ili) for use as a modulator, for example an inhibitor, that is to say reducing or suppressing activity endogenous or exogenous interferon- ⁇ .
  • a modulator for example an inhibitor, that is to say reducing or suppressing activity endogenous or exogenous interferon- ⁇ .
  • the invention relates, in addition, to compound (I) and to compounds (II) and (IIa) to (Ili) (alone (s): that is to say without other active principle of different structure) for a use in the treatment of diseases linked to, or characterized by the presence of proinflammatory cytokines such as IFN- ⁇ , these are for example autoimmune, inflammatory or degenerative diseases such as multiple sclerosis, glomerulonephritis, Crohn's disease and rheumatoid arthritis, transplant rejection, etc.
  • the invention thus also relates to compound (I) and to compounds (II) and (IIa to (II)) alone for use in a treatment which complements the immunosuppressive treatments used, for example, to avoid rejection of transplants.
  • the invention also relates to the use of (I) (alone) and of compounds (II) and (IIa) to (Ili) for preparing a medicament intended for the treatment of disorders, pathologies, related to the activity, in particular excessive endogenous or exogenous interferon- ⁇ and the use of (I) to prepare a medicament intended for the treatment of diseases linked to, or characterized by the presence of pro-inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ , it s 'acts for example " autoimmune, inflammatory, or degenerative diseases such as multiple sclerosis, glomerulonephritis, Crohn's disease, and rheumatoid arthritis, transplant rejection, etc.
  • pro-inflammatory cytokines such as IFN- ⁇
  • the invention also relates to the use of a compound (I) and of compounds (II) and (IIa) to (Ili) for preparing a medicament intended for a treatment complementary to the immunosuppressive treatments used, for example, to avoid rejection of transplants.
  • the invention further relates to a medicament containing a compound (or more compounds) of formula (I) or of formula (II) or (IIa) to (Ili), alone (s) (i.e. - say without other active compound); to a composition containing the compound (or more compounds) of formula (I), (II), (IIa) to (Ili), alone (s) and a pharmaceutically acceptable vehicle for use in the treatment of diseases linked to or characterized by the presence of pro-inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ (these are example of autoimmune, inflammatory, or degenerative diseases such as multiple sclerosis, glomerulonephritis, Crohn's disease and rheumatoid arthritis, transplant rejection, etc .; to a composition containing the compound (or more compounds) of formula (I), (II), (IIa) to (Ili) alone and a pharmaceutically acceptable vehicle for use in a treatment complementary to the immunosuppressive treatments used, for example example, to avoid rejection of transplants
  • interferon-gamma is a proinflammatory cytokine, the presence of which characterizes a certain number of pathologies linked to inflammation. In such situations, it is useful to suppress or reduce the biological activity of the endogenous interferon-gamma. In animals, experimental models have proven the advantage of such a strategy (inhibition of interferon-gamma) using inhibiting monoclonal antibodies, or a soluble form of the cytokine receptor. As an example, we can cite autoimmune or degenerative diseases (multiple sclerosis,
  • interferon-gamma can be an effective complement to the immunosuppressive treatments for example by cyclosporine used for example to avoid rejection of grafts.
  • Medicines containing the compound (or compounds) (I) alone (s) can be administered in doses which can be determined beforehand by routine experiments, depending in particular on the desired effect. These doses can range, for example, from 0.1 to 200 mg per individual per day, preferably from 1 to 50 mg.
  • the invention further relates to a medicament containing, in addition to the compound (I) or the preferred compounds (II) from (IIa to (II)), interferon- ⁇ .
  • Such a medicament contains in combination the compound (I) and the interferon- ⁇ , preferably at a rate of
  • the compound (I) e.g., 0.05 to 1 mg of interferon- ⁇ and from 1 to 50 equivalents of compound (I).
  • the compound (I) e.g., 0.05 to 1 mg of interferon- ⁇ and from 1 to 50 equivalents of compound (I).
  • the compound (I) e.g., 0.05 to 1 mg of interferon- ⁇ and from 1 to 50 equivalents of compound (I).
  • the compound (I) e.g.
  • interferon- ⁇ is preferably in the form of a complex of the compound (I) and the interferon- ⁇ . Said complex makes it possible to increase the bioavailability of the cytokine and protects it from proteolytic degradations.
  • the compound (I) prevents the capture of interferon- ⁇ by endogenous sparse sulfate molecules, present, for example, in the extracellular matrix and on the surface of many cells, and therefore allows its maintenance and transport in general traffic.
  • the compound (I) protects the interferon- ⁇ against degradations capable of reducing or canceling its activity, and it makes it possible to maintain the interferon- ⁇ in its most active form, until the moment of its action on competent cells.
  • the invention therefore relates to: the complex of compound (I) (or (IIa) to (Ili)) and of interferon- ⁇ for use as a medicament.
  • this complex is new and its therapeutic use has never been mentioned; the complex, above, for use as an immunostimulant.
  • Immunostimulatory effects include, for example, the antiproliferative effect in cancers and the activation of immune defenses in infectious diseases, for example viral, bacterial or parasitic, or the ability to block the synthesis of collagen in fibrosis of organs, etc.
  • the invention will therefore relate to the above complex for use in the treatment of a disease chosen from cancer, infectious diseases, for example viral, bacterial or parasitic, and organ fibrosis.
  • the invention relates generally to a medicament containing said complex, as well as the use of the complex for the treatment of a disease, as mentioned above.
  • the invention also relates to the use of the complex, in general, to prepare a medicament and, in particular, to the use of the complex to prepare a medicament intended for the treatment of a disease, as mentioned above.
  • the invention further relates to a composition containing said complex and a pharmaceutically acceptable vehicle for use in the treatment of a disease selected from cancer, infectious diseases, for example viral, bacterial or parasitic, and fibrosis of organs.
  • the spacer group consists essentially of a polyglycol, in particular of a polyethylene glycol.
  • FIG. 1 represents an IFN ⁇ / HS dimer complex or molecule according to the invention
  • FIG. 2 is a graph which gives the% inhibition I for different molecules according to the invention defined by the length L of the spacer arm o (in A) and of the number of saccharides of the oligosaccharide groups (tetra, hexa 5 or octasaccharide ).
  • the compounds according to the invention can be defined as structural mimics of heparin or heparan sulfate or also as neoglycoconjugates corresponding, in particular, to formula (II). 0
  • tetra with octasaccharides, of the heparin type are linked by a hydrophilic spacer of modular length, for example a polyglycol type spacer.
  • the molecules according to the invention bind specifically to IFN ⁇ , in the manner of Heparan-Sulphate, as described in FIG. 1.
  • L-Iduronic acid which is a rare sugar that cannot be isolated in sufficient quantity from natural sources for synthetic needs.
  • R '- CH CH 2 5a, 8a, 9a
  • L-Iduronic acid is a rare sugar that it is impossible to isolate in sufficient quantity from natural sources for synthetic needs. It is therefore essential to have effective methods for preparing derivatives of this compound (25). Although the addition of organometallic to aldehyde 12 (26) is postponed to occur with a very low diastereoselectivity (27), a study has been undertaken within the framework of the invention. nucleophiles precursors of carboxylate groups on this compound (diagram 4).
  • This methodology was also applied in part to the glucuronic synthon 14a, and made it possible to prepare a glucuronic acid donor having protective groups close to 26.
  • the acceptor disaccharide 25 is easily prepared by oxidative cleavage of the paramethoxybenzyl group by DDQ: dichlorodycyanoquinone.
  • the donor disaccharide 26 (29) is, for its part, prepared by isomerization of the allyl to 1-propenyl with an iridium-based catalyst, (30), then hydrolysis of the ethenol ether, thus formed, catalyzed by mercury salts, which allows the release of the anomeric position, which is then activated in the form of trichloroacetimidate (scheme 9).
  • the protected oligosaccharides are transformed into partially deprotected and water-soluble compounds by: deacetylation, reduction of the azido function, sulfation, then saponification (diagram 11).
  • This device uses an optical detection system, the surface plasmon resonance phenomenon, to measure the concentration of molecules that have reacted on the surface of a biosensor ("sensor chip").
  • Biotinilated heparin is immobilized on a "sensor chip” previously activated with streptavidin. It is then possible to measure the interaction of IFN ⁇ , injected in continuous flow on the surface of this sensor, with the immobilized heparin. The interaction between heparin and IFN ⁇ causes a change in mass at the surface of the sensor, which is recorded as a function of time.
  • the IFN ⁇ is previously incubated with the various synthesized products, then the complexes are injected onto the surface of the biosensor. The capacity of the products tested is then measured to inhibit the interaction of IFN ⁇ / heparin.
  • the synthesis of compounds according to the invention is described: namely, neoglycoconjugates fixing the interferon, in which the group or spacer arm is derived from poly (ethylene glycol) s of variable lengths and the two oligosaccharides of ends are constituted by trisulfated disaccharides.
  • the starting product of the synthesis is compound 8 ⁇ , prepared according to LUBINEAU A.; ESCHER S.; ALAIS J.; BONNAFFE D., Tetrahedron Lett. 1997, 38, 4,087 - 4,090, that is to say according to the following operating mode 1: Operating mode 1:
  • glucosamine hydrochloride is peracetylated in a mixture of acetic anhydride (20 equivalents) and pyridine (30 equivalents). After evaporation of the reagents and coevaporation with toluene, the mixture is crystallized from an ethyl acetate / petroleum ether mixture to yield peracetylated glucosamine with a yield of 90%. The crystals recovered are treated with 1.1 equivalent of hydrazine acetate in anydre THF (concentration 0.3 M) for 20 h at 20 ° C.
  • the THF is then evaporated at room temperature under reduced pressure, the residue coevaporated with toluene and the residual oil directly chromatographed on silica gel with an AcOEt / petroleum ether / CH 2 Cl 2 mixture (8/1/1 to 8 / 0/2).
  • the free compound in the anomeric position is obtained with 75% yield. It is then dissolved in the necessary volume of CH 2 C1 2 to have a concentration of 0.5 M and added dropwise to a mixture of tetrabutylammonium bromide (2 eq.), NaH (1.5 eq) and allyl bromide (20 eq.) Cools to -20 ° C. The temperature is then allowed to rise to 20 ° C.
  • Compound 8a ⁇ is treated with eight equivalents of Ba (OH) 2 in water at 100 ° C overnight, the pH is then lowered to 3 by adding sulfuric acid, the mixture centrifuged to precipitate barium sulfate , the supernatant collected, then evaporated under reduced pressure and coevaporated with water to remove the acetic acid formed.
  • Salt 18 is neutralized with potassium carbonate and directly treated with TfN 3 , following the protocol described in ALPER PB; HUNG SC; ONG CH, Tetrahedron Lett. 1996, 37, 6 029-6032, that is to say according to the following procedure 2: Procedure 2: 15 equivalents of NaN 3 are dissolved in the minimum of water necessary and cooled to 0 ° C.
  • the resulting solution is deposited on silica gel 70-200 ⁇ by evaporation and the compound 19 eluted with a MeOH / CH 2 Cl 2 8/2 mixture.
  • the residue is dissolved in anhydrous acetonitrile and treated with benzaldehyde dimethylacetal in the presence of camphorsulfonic acid. After two hours at room temperature, the solution is neutralized by adding an aqueous solution of sodium bicarbonate and the compound extracted with diethyl ether. After purification by chromatography on silica gel (petroleum ether / AcOEt), the compound 20 is treated with benzyl bromide in the presence of NaH in DMF. After dilution with diethyl ether, washing of the organic phase with water and evaporation, the residue is treated at 50 ° C., with a 60% acetic acid solution, for two hours.
  • derivative 17 is prepared according to LUBINEAU A.; GAVARD O.; ALAIS J.; BONNAFFE D., Tetrahedron Lett. 2000, 307 - 311, that is to say according to the following operating mode 3: Operating mode 3:
  • a solution of tris-phenylthiomethyl-lithium is prepared in the following manner: 1.2 equivalents (relative to the aldehyde) of tris-phenylthiomethane are dissolved in the quantity of THF necessary to obtain a concentration of 0.8 M, the temperature is lowered to -78 ° C and the mixture put under mechanical stirring, then 1.1 equivalents (relative to the aldehyde) of n-butyllithium in solution in hexane are added. A yellow precipitate appears and stirring is continued at -78 ° C for 1 h 30. The aldehyde, dissolved in THF (0.6 M concentration) is then added dropwise. The mixture is stirred at -78 ° C.
  • Tris-phénylethioorthoester 13c obtained above is dissolved in the volume of methanol necessary to obtain a concentration of 0.05 M was then added l / 10th volume of water and / 10th volume of dichloromethane and then 1.7 CuO equivalents and 4 CuCl 2 equivalents. After one hour at room temperature, the mixture is filtered through Celite 545 and evaporated at room temperature under reduced pressure. The residue is taken up in CH 2 C1 2 and the organic phase is washed with a saturated NaCl solution, filtered through phase separator paper and evaporated. The mixture is purified by chromatography on silica (eluent: petroleum ether / AcOEt 8/2 to 5/5), product 14 is thus obtained with a yield of 94%.
  • the product 14 is then treated with a 90% trifluoroacetic acid solution for 30 minutes at room temperature (initial concentration of the reagent: 0.35 M).
  • the reaction medium is evaporated under reduced pressure and then coevaporated twice with water. An oil is thus obtained which crystallizes.
  • These crystals of compound 15 are suspended in dichloromethane (concentration 0.2 M) and the temperature is lowered to -40 ° C, 9 equivalents of pyridine, 0.01 equivalent of 4-dimethylaminopyridine and 5 equivalents of chloride are then added. acetyl.
  • the derivative 17 is converted into donor 27 according to JACQUINET J. C.; PETITOU M.; DUCHAUSSOY P.; LEDERMAN I.; CHOAY J.; TORRI G.; SINAY P., Carbohydrate Res. 1984, 130, 221, that is to say according to the following procedure 4: Procedure 4:
  • the mixture 17 is dissolved in anhydrous dichloromethane (0.1 M concentration), then 1/10 th by volume of anhydrous ethyl acetate is added and the mixture is left to react for 24 hours in the presence of 1.3 equivalents of TiBr 4 .
  • the mixture is diluted with CH 2 C1 2 and washed with ice water.
  • the organic phase is filtered on silicone paper and then concentrated.
  • the product 27 thus obtained is used directly in the next step.
  • the basic disaccharide 10 is transformed with a 95% yield into donor disaccharide 26 (synthesized by another route in TABEUR C.; MALLET JM; BONO F.; HERBERT JM; PETITOU M.; SINAY P., Bioorg., Med. Chem 1999, 7, 2 003 - 2 012, by isomerization of allyl, in the presence of C 8 H 14 MePh 2 PIr 1 PF s and cleavage of enol by mercury salts, as described by OLTVOORT JJ; VAN BOECKEL CAA; KONING JH; VAN BOOM JH, Synthesis 1981, 305 - 308, that is to say according to the following operating mode 5: Operating mode 5:
  • Disaccharide 10 is dissolved in anydre THF so as to have a concentration of 0.06 M.
  • the solution is degassed under vacuum, then 0.013 equivalents of C 8 H 14 MePh 2 PIr I PF 6 are added .
  • the mixture is redegased then left in contact with dihydrogen for 2 minutes and finally redegased then put under an argon atmosphere.
  • the mixture is evaporated and then taken up in the volume of acetone necessary to obtain a concentration of 0.05 M, 1.2 equivalents of HgO and 1.1 of HgCl 2 are then added. .
  • the mixture is filtered under Celite 545, evaporated and taken up in ethyl ether.
  • Disaccharide 10 treated with 1.5 equivalents of DDQ in dichloromethane saturated with water, leads after washing the organic phase with a saturated NaHCO 3 solution and chromatography on silica gel with petroleum ether / AcOEt mixture and acceptor disaccharide 25 with a yield of 95%.
  • the coupling of the acceptor disaccharide 25 and the donor disaccharide 26 (1.3 equivalents) is carried out in o dichloromethane at -40 ° C. in the presence of 4 A sieve and of terbutyldimethylsilyl triflate (0.2 equivalents). After addition of the catalyst, the reaction is left for 30 minutes at -40 ° C, then the temperature is allowed to rise to 0 ° C, temperature at which the reaction is stopped by adding 0.2 equivalents of triethylamine. Chromatography on direct silica gel of the reaction mixture with the CH 2 Cl 2 / AcOEt / petroleum ether mixture makes it possible to isolate the tetrasaccharide 27 with a yield of 95%.
  • tetrasaccharides acceptor 28 (90% yield) and donor 29 (95% yield) using the same reaction sequences as for disaccharide 10.
  • the couplings of the donor disaccharide 26 with the acceptor tetrasaccharide 28 and donor tetrasaccharide 29 with the acceptor tetrasaccharide 28 lead to hexasaccharide 30 and to octasaccharide 31 with yields of 95%.
  • the oligosaccharides 27, 30 and 31 are deacetylated in anhydrous methanol in the presence of 0.5 equivalent of anhydrous K 2 C0 3 .
  • the products are purified by chromatography on silica gel and obtained with yields of 86 to 95%.
  • the reduction of the azido groups is carried out with propane dithiol (2 equivalents per azido group) in methanol in the presence of triethylamine (2 equivalents per azido group).
  • the residues are chromatographed on silica gel (CH 2 Cl 2 / MeOH) to yield the amino compounds with yields of 90% to 80%. These compounds are then sulfated by the pyridine complex.
  • the couplings of oligosaccharides 32 to 34 (2.5 equivalents) on the dithiol spacers derived from polyethylene glycol of variable lengths: namely m 5, 10 and 32, at a concentration of 0.2 M in water, s' perform under ultraviolet irradiation at 365 nM or by heating in the presence of a radical initiator.
  • the mixture is directly treated with 8 equivalents of oxone, that is to say with a 0.2 M solution, brought to pH 6 by addition of K 2 HP0 4 .
  • the excess oxidant is reduced by adding a sodium thiosulfate solution and the mixture is directly purified by semi-preparative HPLC on reverse phase C18 (CH 3 CN / AcOH buffer -NEt 3 5 mM pH 7.0).
  • BIORAD ® AG 50 WX 8 200 Na +, oligosaccharides are resolubilized in 100 uL 40 mM sodium phosphate buffer pH 7 and spokes under hydrogen atmospheric pressure in the presence of a mass equivalent of palladium hydroxide 20% on coal.
  • OZMEN L. ROMAN D., FOUNTOULAKIS M., SCHMID G., RYFFEL B., GAROTTA GJ, Interferon Res, 1994, 14: 283 - 4.
  • OZMEN L. ROMAN D., FOUNTOULAKIS M., SCHMID G ., RYFFEL B., GAROTTA G., Eu. J. Immunol. , 1995, 25: 6-12.

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Abstract

Composé susceptible de se lier à l'interféron gamma (IFNgamma) choisi parmi les molécules répondant à la formule (I) suivante: dans laquelle X est un groupe espaceur divalent d'une longueur suffisante pour permettre aux deux fragments oligosaccharides A et B de se lier chacun à l'une des séquences peptidiques 125 à 143 des extrémités C-terminales d'un homodimère d'interféron gamma (IFN-gamma) et n représente un nombre entier de 0 à 10, par exemple égal à 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 et chaque R représente indépendamment un atome d'hydrogène un groupe SO3<->, ou phosphate, à la condition qu'aucun groupe SO3<-> ne se trouve en position 3 des unités glucosamines du composé (I). L'invention concerne également le procédé de préparation de ces composés, les complexes formés par ces composés et l'interféron gamma, et les médicaments comprenant ces composés ou complexes.

Description

COMPOSES SE LIANT A L' INTERFERON-GAMMA, LEUR PROCEDE DE PREPARATION, ET MEDICAMENTS LES CONTENANT
DESCRIPTION
L'invention concerne de nouveaux composés ou néoglycoconjugués se liant à l' interféron-gamma.
L'invention concerne également le procédé de préparation de ces composés, les complexes formés par ces composés et l' interféron-gamma, et les médicaments comprenant ces composés ou complexes .
L' interféron-gamma (IFNγ) est un polypeptide comprenant, par exemple, 143 acides-aminés chez l'homme qui fait partie de la famille des cyto ines . Les cytokines sont des médiateurs de la communication cellulaire, qui agissent selon un processus paracrine, autocrine ou parfois même endocrine .
Dans l'organisme, la production de ces protéines est finement régulée, et un défaut ou un excès de leur synthèse est généralement responsable de diverses pathologies.
D'un point de vue thérapeutique, il peut donc être intéressant d'augmenter, ou au contraire de réduire l'activité biologique d'une telle protéine.
L'IFNγ, d'abord caractérisé, sur la base de son activité antivirale, intervient notamment dans le contrôle de la réponse immune et au cours de l'inflammation.
Cette cytokine est également cytotoxique ou cytostatique pour les cellules transformées et induit la synthèse de radicaux oxygénés. Elle régule l'expression d'un grand nombre de molécules de l'espace péricellulaire, notamment les molécules de surface cellulaire, ainsi qu'un grand nombre de composés de la matrice extracellulaire. L'IFNγ joue donc un rôle important, entre autres, dans les mécanismes de défense, tels que la réponse immune et l'inflammation, dans la croissance cellulaire et la différenciation, dans les phénomènes d'adhésion et de migration cellulaire (1) .
Les thérapeutiques liées aux cytokines, telles que l'IFNγ, consistent soit à administrer ce type de molécule, soit, au contraire, à inhiber leurs activités.
Ainsi, les activités multiples mentionnées plus haut et observées in vitro ont, elles, donné lieu à de nombreux essais cliniques dans des pathologies variées, telles que le cancer (2), la granulomatose chronique (3), l'arthrite rhumatoïde (4), les infections bactériennes ou parasitaires (5) , les hépatites (6) ou les maladies fibroprolifératives, comme la sclérose systémique (7) . Néanmoins, l'efficacité clinique de l'IFNγ n'a pas été clairement démontrée jusqu'à présent, et son indication principale reste limitée à une maladie rare : la granulomatose chronique (8) .
A l'inverse dans certaines pathologies inflammatoires ou auto-immunes (9) , ou pour diminuer le rejet de la greffe après transplantation, il peut être intéressant d'inhiber l'activité biologique de la cytokine. Pour cela, des anticorps ou du récepteur sous forme soluble ont été développés et testés sur des modèles animaux (10) .
La mise au point d'une thérapie basée sur l'utilisation de l'IFNγ pose des problèmes techniques importants liés en particulier à sa faible demi-vie in vivo et à sa faible biodisponibilité.
L'obstacle de la faible biodisponibilité de l'IFNγ peut être surmonté en ayant recours à des méthodes d'application locale, mais ces méthodes ne permettent pas d'atteindre les organes profonds par voie systémique, de plus, le problème de la faible demi-vie in vivo demeure entier.
A titre d'exemple, de telles méthodes d'administration locale de l'IFNγ : on peut citer l'inhalation de l'IFNγ pour le traitement du cancer du poumon, sa nébulisation dans le traitement de la réponse allergique, ou son encapsulation dans des liposomes.
L'étude de la réponse cellulaire à l'IFNγ peut permettre d'expliquer les difficultés de l'utilisation thérapeutique .
En effet, la réponse cellulaire à l'IFNγ dépend du type de cellules stimulées, de la concentration locale de l'IFNγ et des autres facteurs de régulation auxquels la cellule est exposée de façon concomitante.
En particulier, il a été démontré que, indépendamment de son récepteur cellulaire, l'IFNγ était également capable de se fixer à des oligossacharides de type héparine ou héparanes sulfates (HS) , avec une affinité importante (5 à 10 nM) (11) .
In vivo, chez l'animal, l'héparane sulfate fixe effectivement l'IFNγ, et cette interaction contrôle l'élimination plasmatique de la cytokine, son accumulation dans différents organes, et sa localisation dans les tissus. Notamment, après une injection intraveineuse, l'IFNγ est éliminé par un processus biexponentiel, au cours duquel 90 % de la cytokine disparaît de la circulation sanguine pendant les 5 à 10 premières minutes, avec un 5 temps de demi-vie particulièrement court, voisin de 1 minute .
Ces résultats démontrent qu'une large proportion, à savoir environ 90 % de l'IFNγ injecté est rapidement fixé par des molécules de type héparine/héparane sulfate,
10 notamment à la surface de l' endothelium vasculaire (12). En outre, l'observation autoradiographique de coupes tissulaires montre que l'IFNγ n'a pas accès de manière identique à tous les tissus.
Il s'accumule dans le foie, le rein et la rate,
15 mais, par exemple, pas dans le muscle. De plus, au sein d'un même tissu, il n'est pas réparti de façon homogène et se trouve concentré dans les zones riches en héparane sulfate. De telles concentrations locales sont détectées, par exemple, dans les sinusoïdes hépatiques - à la surface
20. des hépatocytes et des cellules endothéliales -, dans les glomérules rénaux ou dans la pulpe rouge de la rate (13) .
Il apparaît donc, de façon claire, que l'interaction de la cytokine avec les HS limite de façon considérable l'accessibilité à différents compartiments in
25 vivo, et les difficultés rencontrées au cours de l'utilisation thérapeutique de l'IFNγ (14) sont vraisemblablement liées en partie à ces interactions. Ces travaux montrent également que les héparines sulfates sont responsables d'accumulation locales importantes de cytokine
30 dans les tissus. Enfin, il a été montré également qu'in vivo, l'IFNγ, seul, est rapidement inactivé par dégradation protéolytique de son extrémité C-terminale (12) .
Afin d'apporter une solution aux problèmes mentionnés plus haut, il a été proposé d'associer l'IFNγ a une molécule d'héparine. Cette association permet une élimination plasmatique beaucoup plus lente et une distribution tissulaire plus large de la cytokine et induit, en outre, une augmentation de l'activité par un mécanisme de protection du domaine C-terminal, contre les dégradations protêolytiques .
Par ailleurs, l'injection d'héparine seule permet de déplacer la cytokine accumulée dans les tissus par les HS endogènes, et donc de réduire ou supprimer son activité. Cependant, l'utilisation d'une molécule d'héparine pour protéger l'IFNγ et augmenter sa biodisponibilité, ou au contraire pour en supprimer l'action locale, soulève des difficultés qui proviennent des activités de l'héparine, elle-même, et, en particulier, de ses propriétés anticoagulantes. Sur les héparane sulfates (HS) , a été caractérisé le site d'interaction pour l'IFNγ. Il est constitué de domaines octasaccharidiques hautement sulfatés séparés par un domaine plus étendu de 7 kD, moins sulfaté.
La figure 1 montre un complexe dimère d'IFNγ et d' héparane sulfate. Les deux domaines octasaccharidiques sont représentés par des traits gras sur la figure 1.
Seuls les domaines octasaccharidiques se lient à la forme dimérique de l'IFNγ, le domaine central faisant un pont entre les deux extrémités . Le document FR-A-2 736 832 (WO-A-97/03700) décrit un agent modulateur de l'activité de l' interféron-γ comprenant un groupement de formule A-X-B, dans laquelle A et B représentent indépendamment un groupe oligosaccharidique portant une charge anionique suffisante, par exemple, sous la forme de groupes sulfate pour conférer audit groupe oligosaccharidique une affinité pour une partie de l'extrémité C-terminale de l' interféron-γ humain contenant la séquence peptidique 125-131, et X est un bras espaceur de longueur suffisante pour permettre aux groupes A et B de se lier chacun à l'une desdites séquences peptidiques des extrémités C-terminales d'un homodimère d' interféron-γ. Le composé décrit dans ce document présente les inconvénients suivants :
Les molécules désignées par A et B sont des fragments de dépolymérisation d'héparine ou d' éparane sulfate. On peut rappeler ici que ces molécules sont caractérisées par une très grande hétérogénéité structurale, et qu'il n'existe pas de procédé pour obtenir des molécules de ce type de structure définie, à partir de sources naturelles. Le composé décrit dans ce document représente donc en fait un mélange de molécules de structures variées. De même pour le segment X qui, selon les cas, peut aussi être un fragment de dépolymérisation d' héparane sulfate.
Une telle molécule n'a pas nécessairement de symétrie C2, (les fragments A, X et B sont "en lignes", ou orientés dans le même sens, ou encore disposés de façon "parallèles") et ne respecte donc pas la symétrie de la protéine sur laquelle elle est censée se lier.
Par ailleurs, ces molécules sont d'origine animale et ont l'inconvénient de véhiculer des agents infectieux transmissibles éventuels. Il existe donc un besoin pour une molécule qui, liée à l'IFNγ, permette, entre autres, de protéger celui-ci contre toute dégradation, augmente sa biodisponibilité, ainsi que sa durée de demi-vie, ou, capable de déplacer l'IFNγ accumulé par les héparanes sulfates dans les tissus.
En d'autres termes, il existe un besoin pour une molécule qui, associée à l'IFNγ, ait une action sensiblement analogue à celle de l'héparine, sans présenter les inconvénients liés à celle-ci. Le but de l'invention est de fournir une molécule susceptible de se lier à l'IFNγ, qui réponde, entre autres, aux besoins indiqués ci-dessus.
Le but de l'invention est encore de fournir une molécule susceptible de se lier à l'IFNγ, qui ne présente pas les inconvénients, limitations, défauts et désavantages des molécules analogues de l'art antérieur, en particulier l'héparine et qui résolve les problèmes de l'art antérieur.
Ce but et d'autres encore sont atteints, conformément à l'invention, en fournissant un composé susceptible de se lier à 1 ' interféron-γ IFNγ répondant à la formule (I) suivante :
dans laquelle X est un groupe espaceur divalent d'une longueur suffisante pour permettre aux deux fragments oligosaccharidiques A et B de se lier chacun à l'une des séquences peptidiques 125 à 143 des extrémités C-terminales d'un homodimère d' interféron-γ (IFNγ) , n représente un nombre entier de 0 à 10, par exemple et égal à 0,1, 2, 3, 4 , ou 5 et chaque R représente indépendamment un atome d'hydrogène, un groupe S03 ", ou un groupe phosphate, à la condition qu'aucun groupe S03 " ne se trouve en position 3 des unités glucosamine du composé (I) .
De préférence, tous les R représentent un groupe
S03 " ou tous les groupes R représentent un groupe phosphate.
La molécule selon l'invention est nouvelle. Elle n'est identique à aucune molécule naturelle, ni à aucune des molécules synthétisées dans l'art antérieur et notamment dans la demande FR-A-2 736 832 ( O-A-97/03700) .
En effet, la molécule selon l'invention présente une structure spécifique due, tout d'abord, au fait que les deux groupements oligosaccharidiques, placés de part et d'autre du groupe espaceur X, sont dans une disposition que l'on peut qualifier de « symétrique » ou « antiparallèle » par rapport au bras espaceur, alors que aussi bien dans les molécules naturelles d'héparine et d' héparane sulfate, que dans les héparines synthétiques et dans les molécules similaires décrite dans l'art antérieur, les deux groupements oligosaccharidiques sont dans une disposition « parallèle » ou « asymétrique » . Ces molécules ne respectent donc pas la symétrie de la protéine sur laquelle elles sont susceptibles de se lier. En d'autres termes, les molécules naturelles et les molécules de l'art antérieur, qu'il s'agisse de l'héparine, de l' héparane sulfate, ou de molécules analogues à celles-ci' sont complètement, totalement asymétriques, c'est-à-dire qu'elles se présentent sous une forme de type « 1212 », alors que les molécules de l'invention sont sous une forme antiparallèle de type « 1221 », c'est-à-dire ayant une symétrie de type C2.
Par ailleurs, les molécules de l'invention se distinguent fondamentalement des molécules naturelles et des molécules de l'art antérieur par une autre caractéristique structurelle essentielle en ce sens que les molécules selon l'invention ne comportent pas de groupe sulfate en position 3 des unités glucosamine.
Du fait que ce groupe sulfate est responsable par une part prépondérante de l'activité anticoagulante de l'héparine, les molécules selon l'invention ne présentent donc pas l'un des inconvénients principaux des molécules de l'art antérieur lié à leur activité anticoagulante.
La molécule selon l'invention, qui peut être définie comme étant un « mîme structural » de l'héparane sulfate ou de l'héparine, dans lequel des oligosaccharides de type héparine sont liés par un espaceur hydrophile (X) de longueur modulable, se lie spécifiquement à l'IFNγ à la manière des HS .
Le composé selon l'invention possède donc, et même au-delà, toutes les propriétés avantageuses de l'héparine : à savoir, entre autre, le fait de protéger la molécule d'IFNγ contre les attaques des protéases, l'augmentation de la biodisponibilité de l'IFNγ, la capacité de dissocier, par compétition, un complexe iFNγ/héparane sulfate, sans en présenter l'inconvénient essentiel : à savoir, l'activité anticoagulante. Les molécules selon l'invention, enfin, sont des molécules entièrement synthétiques, au contraire des molécules de l'art antérieur, représenté, par exemple, par le document FR-A-2 736 832, dans lequel les fragments « terminaux » oligosaccharides sont d'origine naturelle, de même dans la plupart des cas, que le bras espaceur. On a déjà décrit plus haut les inconvénients présentés par les molécules du document FR-A-2 736 832 en particulier en ce qui concerne l'origine naturelle, animale des fragments qui les constituent.
Les molécules selon l'invention, du fait de leur structure spécifique, s'avèrent donc résoudre les problêmes des molécules utilisées aux mêmes fins dans l'art antérieur. Avantageusement, le groupe espaceur a une o o longueur de 15 à 150 A, de préférence de 33 à 50 A.
L'affinité pour la cytokine est optimale pour une o longueur de 33 à 50, par exemple de 50 A.
Généralement, le groupe espaceur est constitué par une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 120 C, dont un ou plusieurs des atomes de carbone sont éventuellement remplacés par un hétéroatome choisi parmi N, S, P et O, un groupe S0, ou un groupe aryle, ladite chaîne carbonée portant, en outre, éventuellement un ou plusieurs groupes anioniques choisis de préférence parmi les groupes sulfates, phosphates et les groupes carboxyliques, etc..
Avantageusement, et en particulier du fait du procédé mis en œuvre pour synthétiser les composés selon l'invention, le groupe espaceur X est issu d'un polyglycol choisi, de préférence, parmi les poly (alkylène glycol) dont le groupe alkylène comprend de 1 à 4 C, tel que le poly (éthylène glycol) .
Ainsi, le groupe espaceur pourra répondre à la
dans laquelle m est généralement un nombre entier de 5 à 32.
Et les composés selon l'invention répondront, ainsi de préférence, à la formule (II) suivante :
(II)
dans laquelle n et m ont la signification déjà donnée plus haut.
Les composés de formule (II) , particulièrement préférés, sont ceux dans lesquels n = 0 et m = 5 (lia) ; n = 0 et m = 10 (Ilb) ; n = 0 et m = 32 (Ile) ; n = 1 et m = 5 (Ild) ; n = 1 et m = 10 (Ile) ; n ≈ 1 et m = 32
(Ilf) ; n = 2 et m ≈ 5 (Ilg) ; n = 2 et m ≈ 10 (Ilh) ; n = 2 et m = 32 (Ili) .
L'invention concerne également un procédé de préparation des composés répondant à la formule (II) , dans lequel on réalise le couplage radicalaire de deux composés solubles dans l'eau précurseurs d'oligosaccharides de formule (III) :
(m)
dans laquelle n est un nombre entier de 0 à 10 par exemple égal à 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, et Ri et R2 représentent un groupe protecteur du groupe hydroxyle choisi, de préférence, parmi les groupes p-méthoxybenzyle et benzyle, avec un composé dithiol précurseur du groupe espaceur de formule :
dans laquelle m est un nombre entier de 5 à 32, pour obtenir un composé de formule (IV) :
puis, on oxyde les fonctions thioéthers en sulfones et on réalise la déprotection finale du composé (IV) pour donner le composé final de formule (II) :
(II)
Ri est, de préférence, un groupe p-méthoxybenzyle et R2 est un groupe benzyle.
Le composé soluble dans l'eau précurseur d' oligosaccharides dont la formule est donnée plus haut (III) est préparé par les étapes successives suivantes : a) un disaccharide de formule (V) :
est soumis à un clivage oxydâtif du groupement Ri, de préférence, paramethoxybenzyle, pour donner un disaccharide « accepteur » de formule :
b) parallèlement, un disaccharide de formule (V) , ci-dessus, est soumis à une isomerisation du groupe allyle en 1-propényle, suivi par une hydrolyse de l'éther d'énol formé et une activâtion du groupe hydroxyle sous forme de trichloroacétamidate pour donner un disaccharide « donneur », de formule (VIb) :
c) on couple le disaccharide accepteur (Via) et le disaccharide donneur (VIb) pour obtenir le tétrasaccharide (n = 0) de formule (VII) , avec une totale stéréospécificité alpha ; d) éventuellement, on répète les étapes a) à c) , en prenant comme produit de départ pour l'étape a), le tétrasaccharide préparé en c) , pour obtenir les hexa (n = 1) et octa (n ≈ 2) saccharide de formule (VII) :
e) éventuellement, on répète les étapes a) à c) en prenant comme produit de départ, pour l'étape a), l'octasaccharide préparée en d) , pour obtenir un hexadécasaccharide (n = 6) de formule (VII) ; f) on procède à la désacêtylation, réduction de la fonction azide, sulfatâtion et saponification pour obtenir le composé soluble dans l'eau, précurseur d' oligosaccharide (III) recherché.
Le disaccharide de formule (V) est, de préférence, préparé par une réaction de couplage entre un composé de formule (VIII) :
et un composé de formule (IX)
Enfin, le composé de formule (IX) est préparé à partir du composé de formule (X) et le composé de formule (VIII) est préparé à partir du composé de formule (XI) :
Un procédé préféré de préparation du composé (XI) est de réaliser 1 'acétylation du composé de formule :
à -40°C dans le dichlorométhane comme solvant, avec de la pyridine comme base, du chlorure d'acétyle comme agent acylant, et de la 4-diméthylaminopyridine comme catalyseur.
On obtient le composé de formule (XI) avec un rendement très élevé, généralement supérieur ou égal à 95%, et une grande pureté puisque les dérivés furano ne sont présents qu'à l'état de traces en une proportion généralement voisine de ou inférieure à 2%.
On évite ainsi, selon l'invention, une purification difficile. Dans tout ce qui suit, les utilisations thérapeutiques du composé selon 1 ' invention peuvent mettre en oeuvre un mais aussi plusieurs composés selon 1 ' invention. L'invention concerne, en outre, le composé (I) et les composés préférés (II) , et (lia) à (Ili) pour une utilisation comme médicament, de manière générale, le composé (I) et les composés (II) et (lia) à (Ili) étant nouveaux. En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation du composé (I) et des composés (II) et (lia) à (Ili) de manière générale pour préparer un médicament.
Lorsqu'ils sont utilisés seuls les composés selon l'invention peuvent être utilisés pour moduler, par exemple inhiber, l'activité de 1 ' interféron-γ exogène ou endogène.
L'invention est donc relative aussi au composé (I) et aux composés (II) et (lia) à (Ili) pour une utilisation comme modulateur, par exemple inhibiteur, c'est-à-dire réducteur ou suppresseur de l'activité de 1' interféron-γ endogène ou exogène.
L'invention a trait, en outre, au composé (I) et aux composés (II) et (lia) à (Ili) (seul (s) : c'est-à-dire sans autre principe actif de structure différente) pour une utilisation dans le traitement de maladies liées à, ou caractérisées par la présence de cytokines proinflammatoires comme 1 ' IFN-γ, il s'agit par exemple des maladies auto-immunes, inflammatoires, ou dégénérâtives telles que la sclérose multiple, la glomérulonéphrite, la maladie de Crohn et l'arthrite rhumatoïde, du rejet de greffes, etc... L'invention a ainsi trait, aussi, au composé (I) et aux composés (II) et (lia) à (Ili) seul (s) pour une utilisation dans un traitement de complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés, par exemple, pour éviter le rejet de greffes.
L'invention est également relative à l'utilisation de (I) (seul) et des composés (II) et (lia) à (Ili) pour préparer un médicament destiné au traitement des troubles, pathologies, reliés à l'activité, notamment excessive de l' interféron-γ endogène ou exogène et à l'utilisation de (I) pour préparer un médicament destiné au traitement de maladies liées à, ou caractérisées par la présence de cytokines pro-inflammatoires comme 1 ' IFN-γ, il s'agit par exemple des " maladies auto-immunes, inflammatoires, ou dégénérâtives telles que la sclérose multiple, la glomérulonéphrite, la maladie de Crohn, et l'arthrite rhumatoïde, du rejet de greffes, etc..
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé (I) et des composés (II) et (lia) à (Ili) pour préparer un médicament destiné à un traitement dé complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés, par exemple, pour éviter le rejet de greffes.
L'invention a, de plus, trait à un médicament contenant un composé (ou plusieurs composés) de formule (I) ou de formule (II) ou (lia) à (Ili), seul (s) (c'est-à-dire sans composé actif autre) ; à une composition contenant le composé (ou plusieurs composés) de formule (I) , (II) , (lia) à (Ili), seul (s) et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement de maladies liées à ou caractérisées par la présence de cytokines pro-inflammatoires comme 1 ' IFN-γ (il s'agit par exemple des maladies auto-immunes, inflammatoires, ou dégénératives telles que la sclérose multiple, la glomérulonéphrite, la maladie de Crohn et l'arthrite rhumatoïde, du rejet de greffes, etc.. ; à une composition contenant le composé (ou plusieurs composés) de formule (I), (II), (lia) à (Ili) seul (s) et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour utilisation dans un traitement de complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés, par exemple, pour éviter le rejet de greffes. Rappelons à ce propos que 1 ' interféron-gamma est une cytokine proinflammatoire, dont la présence caractérise un certain nombre de pathologies liées à l'inflammation. Dans de telles situations, il est utile de supprimer ou de réduire l'activité biologique de 1 ' interféron-gamma endogène. Chez l'animal, des modèles expérimentaux ont prouvé l'intérêt d'une telle stratégie (inhibition de 1 ' interféron-gamma) en utilisant des anticorps monoclonaux inhibiteurs, ou une forme soluble du récepteur de la cytokine. A titre d'exemple on peu citer les maladies autoimmunes ou dégénératives (Sclérose multiple,
Glomérulonéphrite, Maladie de Crohn, Arthrite rhumatoïde ...etc). De même, l'inhibition de 1 ' interféron-gamma peut être un complément efficace aux traitements immunosuppresseurs par exemple par la ciclosporine utilisés par exemple pour éviter le rejet de greffes.
Les médicaments contenant le composé (ou des composés) (I) seul (s) peuvent être administrés à des doses qui peuvent être déterminées préalablement par des expériences de routine, en fonction notamment de l'effet recherché. Ces doses peuvent aller par exemple de 0,1 à 200 mg par individu et par jour, de préférence, de 1 à 50 mg.
L'invention concerne, en outre, un médicament contenant, outre le composé (I) ou les composés préférés (II) de (lia) à (Ili), de l' interféron-γ.
Un tel médicament contient en combinaison le composé (I) et l' interféron-γ, de préférence à raison de
0,05 à 1 mg d' interféron-γ et de 1 à 50 équivalents du composé (I) . Dans ce médicament, le composé (I) (par exemple
(II) ou (lia) à (Ili)) et 1 ' interféron-γ se présente, de préférence, sous la forme d'un complexe du composé (I) et de l' interféron-γ. Ledit complexe permet d'augmenter la biodisponibilitê de la cytokine et la protège des dégradations protéolytiques .
En d'autres termes, le composé (I) empêche la capture de l' interféron-γ par des molécules d' éparane-sulfate endogènes, présents, par exemple, dans la matrice extracellulaire et à la surface de nombreuses cellules, et permet donc son maintien et son transport dans la circulation générale.
En outre, le composé (I) protège l' interféron-γ contre les dégradations susceptibles de réduire ou d'annuler son activité, et il permet de maintenir 1' interféron-γ sous sa forme la plus active, jusqu'au moment de son action sur les cellules compétentes.
L'invention concerne donc : le complexe du composé (I) (ou (lia) à (Ili)) et d' interféron-γ pour une utilisation comme médicament. En effet, ce complexe est nouveau et son utilisation thérapeutique n'a jamais été mentionnée ; le complexe, ci-dessus, pour une utilisation comme immunostimulant . Les effets immunostimulants comprennent, par exemple, l'effet antiprolifératif dans les cancers et l'activation des défenses immunitaires dans les maladies infectieuses, par exemple virales, bactériennes ou parasitaires, ou encore la capacité de bloquer la synthèse de collagène dans les fibroses d'organes, etc.
Et l'invention aura donc trait au complexe ci-dessus pour une utilisation dans le traitement d'une maladie choisie parmi le cancer, les maladies infectieuses, par exemple virales, bactériennes ou parasitaires, et les fibroses d'organes.
L'invention concerne, de manière générale, un médicament contenant ledit complexe, ainsi que l'utilisation du complexe pour le traitement d'une maladie, telle que mentionnée ci-dessus. L'invention a trait aussi à l'utilisation du complexe, de manière générale, pour préparer un médicament et, en particulier, à l'utilisation du complexe pour préparer un médicament destiné au traitement d'une maladie, telle que mentionnée ci-dessus. L'invention concerne, en outre, une composition contenant ledit complexe et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement d'une maladie choisie parmi le cancer, les maladies infectieuses, par exemple virales, bactériennes ou parasitaires, et les fibroses d'organes. L'invention va maintenant être décrite de manière détaillée dans la description qui va suivre, d'un mode de réalisation particulier de la présente invention, dans lequel le groupe espaceur est constitué essentiellement d'un polyglycol, en particulier d'un polyethylene glycol.
Cette description est réalisée en liaison avec les dessins joints dans lesquels : la figure 1 représente un complexe dimère IFNγ/HS ou molécule selon l'invention ; 0 la figure 2 est un graphique qui donne le % d'inhibition I pour différentes molécules selon l'invention définies par la longueur L du bras o espaceur (en A) et du nombre de saccharides des groupements oligosaccharides (tétra, hexa 5 ou octasaccharide) . Les composés selon l'invention peuvent être définis comme des mîmes structuraux de l'héparine ou de l' héparane sulfate ou encore comme des néoglycoconjugués répondant, en particulier, à la formule (II) . 0
(n)
5 Dans ces mîmes structuraux, des tétra à octasaccharides, de type héparine, sont liés par un espaceur hydrophile de longueur modulable, par exemple un espaceur de type polyglycol . Les molécules selon l'invention se lient spécifiquement à l'IFNγ, à la manière de l 'Héparane-Sulfate, comme cela est décrit sur la figure 1.
La mise au point d'un procédé de préparation des composés selon l'invention se heurtait essentiellement à quatre problèmes :
1. Disposer d'un couplage à haut rendement entre l' espaceur et les oligosaccharides qui demandent toujours un effort synthétique important.
2. Maîtriser la stéréochimie de la liaison entre l' espaceur et la première unité glucosamine de l' oligossacharide. Cette stéréochimie doit être alpha, puisque c'est la stéréochimie que l'on trouve naturellement dans le polymère d'Héparane-Sulfate (HS) .
3. Maîtriser la stéréochimie alpha de toutes les liaisons glycosidiques dans l' oligosaccharide.
4. Disposer d'un accès efficace à l'acide L-Iduronique, qui est un sucre rare que l'on ne peut isoler en quantité suffisante de sources naturelles pour des besoins synthétiques .
Nous décrivons dans ce qui suit la synthèse des composés selon l'invention en mettant l'accent chaque fois sur les solutions apportées par le procédé de l'invention à chacun des problèmes de synthèse énùmérés ci-dessus.
1. Mise au point d'un couplage efficace à un espaceur de poly (éthylène glycol) (PEG) . Pour le couplage entre les oligosaccharides et l' espaceur, on utilise, de préférence selon l'invention, une réaction classique en chimie organique : le couplage radicalaire d'un thiol sur un alcène (19) . On a testé avec succès cette méthode avec l'alpha-allyle glucosaminide 2 et les dérivés dithiol de PEG 3a-c. (schéma 1) .
Schéma 1
2. Contrôle de la stéréosêlectivité de la réaction d'alkylation anomérique,
Pour préparer le composé 2 , la méthode d'alkylation anomérique, développée par R. R. SCHMIDT (20) et déjà utilisée au laboratoire (21) a été choisie. La réaction de l'alcoxyde provenant de l'hémiacétal 5a avec le bromule allyle 6 conduit exclusivement, dans le dichlorométhane, au stéréoisomère béta.
De manière surprenante, il a été constaté que l'addition d'iodure de tétrabutylammonium inverse la stéréochimie et conduit majoritairement à l'isomère alpha dans des rapports alpha/béta pouvant aller jusqu'à 98/2
(22) (schéma 2). Ce mode opératoire spécifique à l'invention, conduisant de manière inattendue à l'isomère alpha, n'est ni décrit, ni suggéré dans l'art antérieur. Les conditions de réaction pour le dérivé de la glucosamine 5a ont été optimisées et appliquées telles quelles aux autres substrats. L'optimisation concerne la température, le rapport des réactifs, les concentrations, etc.. Ainsi, ces conditions de réaction ont-elles été appliquées à d'autres sucres et à un autre électrophile : le bromure de benzyle 7. Il a ainsi pu être montré que cette inversion de stéréosélectivité de la réaction d'alkylation anomérique par les sels de tétrabutylammonium était générale.
6,8 : R' - CH=CH2 5a, 8a, 9a : R1 -0Ac, R2 = H, R3 =NHAc,R = Ac 5c, 18c: ! =H, R2 =OAc, R3 = 0Ac,R = Ac
7, 9 : R' ≈ Ph 5b, 8b : Rt = OAc, R2 = H, R3 OAc, R = Ac 5d, 8d : Rt = OBn, R2 = H, Rg =0Bn, R = Bn
Schéma 2
3. Préparation des tétra à octasaccharides, précurseurs de fragments d'héparine.
Il existe de nombreuses méthodes permettant de préparer des fragments longs d'héparine ou des mîmes (23) .
Du fait de l'étape essentielle du procédé de l'invention, il est impératif de préparer des fragments possédant un groupement allyle en position anomérique, pour les couplages à l' espaceur, ce qui conduit à mettre au point un procédé spécifique. En effet, il fallait utiliser une méthode hautement convergente, basée sur la préparation d'un disaccharide convenablement protégé qui permette de générer un disaccharide donneur et un disaccharide accepteur, de façon à préparer un tétrasaccharide, ce dernier pouvant lui-même servir de base pour la préparation d'hexa et octasaccharides . Les contraintes de stéréochimie des couplages oligosaccharidiques, les motifs de sulfatation désirés, ainsi que la nécessité du groupement allyle en position anomérique ont conduit à envisager le disaccharide 10 comme brique de base de la synthèse (schéma 3) .
Schéma 3
3. 1. Synthèse du disaccharide de base 10.
3. 1. 2. Nouveaux accès à l'acide L-iduronique (24) .
L'acide L-Iduronique est un sucre rare qu'il est impossible d'isoler en quantité suffisante à partir de sources naturelles pour des besoins synthétiques. Il est donc capital de disposer de méthodes efficaces de préparation de dérivés de ce composé (25) . Bien que l'addition d' organometalliques sur l'aldéhyde 12 (26) soit reportée pour se produire avec une très faible diastérêosélectivité (27) , il a été entrepris, dans le cadre de l'invention, une étude de l'addition de nucléophiles précurseurs de groupements carboxylates sur ce composé (schéma 4) .
Schéma 4
Dans un premier temps, l'addition d'organometalliques vinyliques a été étudiée et il a été constaté, de manière étonnante, que dans certaines conditions, il était possible d'obtenir les diastéréoisomères ido et gluco 13a et 14b dans des proportions 50/50. Ce résultat est particulièrement intéressant dans l'optique du développement de la synthèse combinatoire de fragments de glycosaminoglycanes contenant des acides glucuroniques et iduroniques .
Il a été ensuite constaté que la proportion de stéréoisomère L-ido augmentait avec l'encombrement du nucléophile, pour atteindre 100 % de stéréosélectivité avec (PhS)3CLi. Cette addition, totalement stéréosélective du tris- (phénylthio)méthyllithium sur l'aldéhyde 12 est l'étape clef dans la préparation du dérivé pyranosique de l'acide L-iduronique 17.
Une autre amélioration remarquable du procédé du schéma 5 donnée sur le schéma 5bis est 1 ' acétylation des cristaux du composé 15 en procédant à -40°C dans le dichloromethane comme solvant, avec de la pyridine comme base, du chlorure d'acétyle comme agent acylant et de la 4-diméthylaminopyridine comme catalyseur. Dans ces conditions, le mélange 17 ( :β 2/98) est obtenu avec 98% de rendement et les dérivés furano 16 ne sont présents qu'à l'état de traces (2%). Cette amélioration est spectaculaire car dans les conditions décrites précédemment (25) les dérivés 16 étaient obtenus avec 40% de rendement ce qui nécessitait une purification difficile et leur recyclage par désacétylation.
Le rendement global de la préparation de ce synthon, couramment employé pour la préparation de fragments d'héparine, à partir du diacéone glucose 11 est de 65 %, ce qui est bien plus élevé que les méthodes précédemment décrites qui conduisent à des rendements globaux de 25 à 30 % (schéma 5) .
Kg∞;, MeOH 80% après un recyclage des dérivés furanoses
Schéma 5
K,OQ3, MeOH 80% après un recyclage des dérivés juranoses
Schéma 5bis
3. 1. 3. Accès au disaccharide 10.
Ayant mis au point divers accès à des synthon d'acide L-iduroniques, il est ensuite nécessaire de préparer un dérivé de 2-azido glucose permettant la préparation de la brique de base 10. Dans les synthèses classiques impliquant un groupement azido en position 2, on introduit ce groupement en premier, puis le groupement protecteur de la position anomérique via une réaction de glycosylation. Comme nous avions déjà un accès très performant à l'alpha allyle-N-acétyle glucosaminide 8a alpha (voir schéma 4), nous avons décidé d'utiliser le tri lylazide développé par VASELLA (28) pour introduire le groupement azido sur le composé 18 dont la position anomère est déjà protégée par un groupement allyle (schéma 6) .
Schéma 6
Afin de démontrer qu'il est possible d'utiliser le synthon 13a pour préparer des oligosaccharides de type héparine, une méthodologie spécifique a été développée pour le transformer en donneur 26, dans lequel tous les groupements protecteurs du disaccharide de base 10 sont introduits avant la réaction de couplage (schéma 7) .
Cette méthodologie a aussi été appliquée en partie au synthon glucuronique 14a, et a permis de préparer un donneur d'acide glucuronique possédant des groupements protecteurs voisins de 26.
Schéma 7
Lorsque l'on désire préparer des GAGs : glycosaminoglycanes ne possédant que de l'acide L-iduronique, l'accès stéréosélectif au thiorthoester 13c est beaucoup plus rentable que l'addition non stéréosêlective conduisant à 13a et 14a. Il a été montré que le synthon 17 pouvait être transformé en une étape en donneur 27. Ce composé se couple avec de bons rendements à l'accepteur 21 pour conduire au disaccharide 22, dans lequel il reste à installer les groupements protecteurs 'sur la partie acide iduronique, ce qui s'opère en quelques étapes (schéma 8) .
Schéma 8
3. 2. Stratégie efficace pour l'obtention des oligosaccharides .
A partir du disaccharide 10, on prépare aisément le disaccharide accepteur 25 par clivage oxydatif du groupement paramethoxybenzyle par DDQ : dichlorodycyanoquinone .
Le disaccharide donneur 26 (29) est, quant à lui, préparé par isomerisation de l' allyle en 1-propényle par un catalyseur à base d'iridium, (30), puis hydrolyse de l'éther d'ênol, ainsi formé, catalysé par des sels de mercure, ce qui permet la libération de la position anomérique, qui est ensuite activée sous forme de trichloroacétimidate (schéma 9) .
Schéma 9
Le couplage du disaccharide accepteur 25 et du disaccharide donneur 26 à -40°C, en présence de TBDMSOTf, conduit avec un excellent rendement au tétrasaccharide 27, avec une totale stéréosélectivité alpha. En appliquant au tétrasaccharide 27 les mêmes opérations qu'au disaccharide, on peut préparer, avec de très bons rendements, le tétrasaccharide accepteur 28 et le tétrasaccharide donneur 29 (schéma 10) qui permettent d'obtenir les hexa et octasaccharides 30 et 31. Cette méthodologie s'étend sans problème à la préparation d'un hexadecasaccharide ou d'un dodécasaccharide .
Schéma 10 4. Préparation des néocon ugués.
Les oligosaccharides protégés sont transformés en composés partiellement déprotégés et solubles dans l'eau par : désacétylation, réduction de la fonction azido, sulfatation, puis saponification (schéma 11) .
Schéma 11
On obtient ainsi les composés 32-34, solubles dans l'eau et prêts pour le couplage aux bisthioPEGs. Sous irradiation UV d'une lampe moyenne pression, le produit attendu se forme, mais accompagné de produits secondaires, issus vraisemblablement d'une oxydation des groupements benzyles que l'on élimine par chromatographie en phase inverse C18. La déprotection finale des néoglycoconjugués est réalisée par hydrogénolyse, sur hydroxyde de palladium sur charbon en présence de tampon phosphate pH 7, après oxydation des thioéthers en sulfone pour éviter l'empoisonnement du catalyseur (schéma 12) .
0
Schéma 12
Les produits ainsi synthétisés ont été testés pour leur capacité à se lier à l'IFNγ. 5 L'utilisation d'un système d'analyse d'interaction moléculaire, en temps réel (BIAcore) offre la possibilité d'identifier et de quantifier très rapidement les affinités existant entre différentes molécules.
Cet appareil utilise un système de détection optique, le phénomène de résonance plasmonique de surface, pour mesurer la concentration de molécules ayant réagi à la surface d'un biocapteur ("sensor chip"). On immobilise de l'héparine biotinilée sur une "sensor chip" préalablement activée à la streptavidine . Il est alors possible de mesurer l'interaction d'IFNγ, injecté en flux continu à la surface de ce capteur, avec l'héparine immobilisée. L'interaction entre l'héparine et 1 ' IFNγ entraîne une modification de masse à la surface du capteur, qui est enregistrée en fonction du temps. Dans une deuxième étape, 1 ' IFNγ est préalablement incubé avec les différents produits synthétisés, puis les complexes sont injectés à la surface du biocapteur. On mesure alors la capacité des produits testés à inhiber l'interaction 1 ' IFNγ/héparine .
Les résultats sont exposés sur la figure 2, et indiquent qu'une molécule contenant un bras espaceur de o 5 nm (50 A), reliant deux octasaccharides, possède une très forte affinité pour la cytokine.
Il en est de même pour les molécules contenant un bras espaceur de 33 A et de 114 A qui ont aussi la capacité d' interagir avec 1 ' IFNγ, mais avec des affinités, cependant moindres.
L'invention va maintenant être décrite en référence à l'exemple suivant, donné à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1
Dans cet exemple, on décrit la synthèse de composés selon l'invention : à savoir, de néoglycoconjugués fixant l'interféron, dans lesquels le groupe ou bras espaceur est issu de poly(éthylène glycol) s de longueurs variables et les deux oligosaccharides d'extrémités sont constitués par des disaccharides trisulfatés. Le produit de départ de la synthèse est le composé 8α, préparé selon LUBINEAU A. ; ESCHER S. ; ALAIS J. ; BONNAFFE D. , Tetrahedron Lett . 1997, 38, 4 087 - 4 090, c'est-à-dire selon le mode opératoire 1 suivant : Mode opératoire 1 :
Le chlorydrate de glucosamine commercial est peracétylé dans un mélange d'anhydride acétique (20 équivalents) et de pyridine (30 équivalents). Après évaporâtion des réactifs et coévaporation par du toluène, le mélange est cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle-éther de pétrole pour conduire à la glucosamine peracétylée avec un rendement de 90%. Les cristaux récupérés sont traités par 1,1 équivalent d'acétate d'hydrazine dans le THF anydre (concentration 0,3 M) pendant 2Oh à 20°C. Le THF est alors évaporé à température ambiante sous pression réduite, le résidu coévaporé par du toluène et l'huile résiduelle directement chromatographiée sur gel de silice par un mélange AcOEt/Ether de pétrole/CH2Cl2 (8/1/1 à 8/0/2) . Le composé libre en position anomérique est obtenu avec 75% de rendement. Il est ensuite solubilisé dans le volume nécesaire de CH2C12 pour avoir une concentration de 0,5 M et ajouté goutte-à-goutte à un mélange de bromure de tétrabutylammonium (2 eq.), de NaH (1,5 eq) et de bromure d' allyle (20 eq. ) refroidit à -20°C. On laisser alors remonter la température à 20°C sur 12h et l'on arrête la réaction par addition de 0,5 équivalent d'acide acétique. Le milieu réactionnel est évaporé sous pression réduite et le résidu directement chromatographie sur silice (éluant : toluène/acétone 1/0 à 7/3) pour conduire au composé 8a avec un rendement de 88%.
Le composé 8a α est traité par huit équivalents de Ba(OH)2 dans l'eau à 100°C pendant une nuit, le pH est alors abaissé à 3 par addition d'acide sulfurique, le mélange centrifugé pour précipiter le sulfate de baryum, le surnageant collecté, puis évaporé sous pression réduite et coévaporé à l'eau pour éliminer l'acide acétique formé. Le sel 18 est neutralisé par du carbonate de potassium et directement traité par TfN3, en suivant le protocole décrit dans ALPER P. B. ; HUNG S. C. ; ONG C. H., Tetrahedron Lett. 1996, 37, 6 029-6032, c'est-à-dire selon le mode opératoire 2 suivant : Mode opératoire 2 : On dissout 15 équivalents de NaN3 dans le minimum d'eau nécessaire et l'on refroidit à 0°C puis on ajoute un volume équivalent de dichloromethane et 2 équivalents d'anhydride triflique goutte à goutte. Après 2h sous agitation vive à 0°C, on laisse décanter puis on récupère la phase organique que l'on lave par un volume équivalent de solution de bicarbonate de sodium saturé. La phase organique est alors directement ajoutée sur une solution aqueuse du sel 18 et de 0,01 équivalent de sulfate de cuivre. On ajoute alors le minimum de méthanol nécessaire pour obtenir un mélange homogène. Après 4h de réaction à 20°C, on ajoute un équivalent de butylamine pour détruire le triflylazide en excès.
La solution résultante est déposée sur gel de silice 70-200 μ par évaporation et le composé 19 élue par un mélange MeOH/CH2Cl2 8/2.
Après évaporation sous pression réduite, le résidu est solubilisé dans de 1 'acétonitrile anhydre et traité par le diméthylacétal du benzaldéhyde en présence d'acide camphorsulfonique. Après deux heures à température ambiante, la solution est neutralisée par addition d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium et le composé 20 extrait par de l'éther diéthylique. Après purification par chromatographie sur gel de silice (éther de pétrole/AcOEt) , le composé 20 est traité par le bromure de benzyle en présence de NaH dans le DMF. Après dilution à l'éther diéthylique, lavage de la phase organique par de l'eau et évaporation, le résidu est traité à 50°C, par une solution d'acide acétique à 60 %, pendant deux heures. Après évaporation et coévaporation avec du toluène, le résidu est chromatographie sur gel de silice (éther de pétrole/AcOEt) . Le diol ainsi obtenu est solubilisé dans de la pyridine' anhydre et un équivalent de chlorure d'acétyle est ajouté à -20 °C, on laisse alors la température remonter à 0°C. La réaction est terminée en une nuit. On évapore alors la pyridine sous pression réduite, le résidu est solubilisé dans l'éther diéthylique, puis on lave la phase organique obtenue par une solution diluée d'HCl, de l'eau et une solution de bicarbonate de sodium. La phase organique est alors séchée, évaporée et chromatographie sur gel de silice avec un mélange d' éther de pétrole et d'AcOEt. On obtient ainsi le composé 21 avec un rendement global de 75 % depuis 8a a.
Par ailleurs, le dérivé 17 est préparé selon LUBINEAU A. ; GAVARD O. ; ALAIS J. ; BONNAFFE D., Tetrahedron Lett . 2000, 307 - 311, c'est-à-dire selon le mode opératoire 3 suivant : Mode opératoire 3 :
Du diacétoneglucose commercial, solubilisé dans du diméthyle formamide anhydre (concentration de 0,5 M), est traité par 1,2 équivalents de bromule de benzyle et 1,3 équivalents de NaH. Après lh à 20°C, l'excès de NaH est détruit par de 1 ' isopropanol . Le mélange réactionnel est alors dilué par de l'éther éthylique et la phase organique lavée trois fois par de l'eau. Après évaporation, le résidu est repris par de l'acide acétique à 60% jusqu'à atteindre une concentration de 0,1 M. Après deux heures à 50°C, le mélange est évaporé puis coévaporé par du toluène sous pression réduite. Une chromatographie sur gel de silice
(éluant : éther de pétrole/acétate d'éthyle 9/1 à 2/8) permet d'obtenir le diol désiré avec 98% de rendement. Ce diol est solubilisé dans le dichloromethane (concentration de 0,25 M), puis on ajoute le même volume d'eau, 0,5 équivalent d'hydrogénosulfate de tétrabutylammonium, 0,5 équivalents de NaHC03 puis, après avoir abaissé la température à 0°C, 2 équivalents de NaI04 par petites portions. On laisse ensuite la température remonter à l'ambiante puis on laisse sous agitation lh. Après décantation, on récupère la phase organique que l'on évapore puis reprends par de l'éther éthylique. La phase organique est lavée trois fois par de l'eau, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée. Le résidu est filtré sur gel de silice (êluant : acétate d'éthyle) et le composé 12, obtenu quantitativement, est directement utilisé, après évaporation et coévaporation au toluène, dans l'étape ultérieure. On prépare une solution de tris-phénylthiométhyle-lithium de la manière suivante : on solubilise 1,2 équivalents (par rapport à l'aldéhyde) de tris-phénylthiométhane dans la quantité de THF nécessaire pour obtenir une concentration de 0,8 M, la température est abaissée à-78°C et le mélange mis sous agitation mécanique, puis on ajoute 1,1 équivalents (par rapport à l'aldéhyde) de n-butyllithium en solution dans l'hexane. Un précipité jaune apparaît et l'on maintient l'agitation à -78°C pendant lh.30. On ajoute alors goutte-à-goutte l'aldéhyde, solubilisé dans du THF (concentration 0,6 M). On agite à -78 °C pendant une heure puis on laisse remonter la température à l'ambiante sur 16h et l'on arrête la réaction par addition d'une solution saturée de chlorure d'ammonium. La solution résultante est extraite trois fois par de l'éther éthylique, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, évaporée puis chromatographiee sur gel de silice (éluant éther de pétrole/acétate d'éthyle 9/1 à 6/4) . On obtient ainsi le composé 13c avec 92% de rendement .
Le tris-phénylethioorthoester 13c obtenu précédemment est solubilisé dans le volume de méthanol nécessaire pour obtenir une concentration de 0,05 M, on ajoute alors l/10ême de volume d'eau et l/10ême de volume de dichloromethane puis 1,7 équivalents de CuO et 4 équivalents de CuCl2. Après une heure à température ambiante, le mélange est filtré sur Célite 545 et évaporé à température ambiante sous pression réduite. Le résidu est repris dans du CH2C12 et la phase organique est lavée par une solution saturée de NaCl, filtrée sur papier séparateur de phase et évaporée. Le mélange est purifié par chromatographie sur silice (éluant : éther de pétrole/AcOEt 8/2 à 5/5) , on obtient ainsi le produit 14 avec un rendement de 94%. On traite ensuite le produit 14 par une solution d'acide trifluoroacétique à 90% pendant 30 minutes à température ambiante (concentration initiale du réactif : 0,35 M). Le milieu réactionnel est évaporé sous pression réduite puis coévaporé deux fois par de l'eau. On obtient ainsi une huile qui cristallise. Ces cristaux du composé 15 sont suspendus dans du dichloromethane (concentration 0,2 M) et la température est abaissée à -40°C, on ajoute alors 9 équivalents de pyridine, 0,01 équivalent de 4-diméthylaminopyridine et 5 équivalents de chlorure d'acétyle. Après lh d'agitation à -40°C, on laisse la température remonter à l'ambinate, on dilue par du dichloromethane et on lave la phase organique par une solution saturée de NaHC03, d'eau, d'acide sulfurique 1 M et d'eau. On obtient ainsi le mélange 17 (α/β 2/98) avec un rendement de 98%.
Le dérivé 17 est converti en donneur 27 selon JACQUINET J. C. ; PETITOU M. ; DUCHAUSSOY P. ; LEDERMAN I. ; CHOAY J. ; TORRI G. ; SINAY P., Carbohydrate Res. 1984, 130, 221, c'est-à-dire selon le mode opératoire 4 suivant : Mode opératoire 4 :
Le mélange 17 est mis en solution dans du dichloromethane anhydre (concentration 0,1 M) puis on ajoute l/10ème en volume d'acétate d'éthyle anhydre et on laisse réagir pendant 24h en présence de 1,3 équivalents de TiBr4. Le mélange est dilué par du CH2C12 et lavé par de l'eau glacée. La phase organique est filtrée sur papier siliconé puis concentrée. Le produit 27 ainsi obtenu est directement utilisé dans l'étape suivante. Le couplage de 21 (1,2 équivalents) avec 27 s'effectue dans le dichloromethane à 20°C, en présence de σ tamis 4 A et de triflate d'argent (1,2 équivalents) et conduit, après chromatographie sur gel de silice avec le mélange éther de pétrole/AcOEt, au disaccharide 22 avec un rendement de 85 % .
Le composé 22 est désacétylé dans le méthanol anhydre en présence de K2C03, après neutralisation par de la résine DO EX® 50 x 8 200 H+, filtration et évaporation, le résidu est suspendu dans du benzène, puis on ajoute 2,2 équivalents de Bu2SnO. Après 2 heures d'entraînement azéotropique de l'eau, on ajoute 3 équivalents de triéthylamine et 2.2 équivalents de chlorure d'acétyle fraîchement distillé. On obtient alors un mélange de 3 produits, dont le majoritaire est le composé 24 accompagné des composés acétylés en position 6/4' et 6/2'/4'.
Après chromatographie sur gel de silice avec' le mélange éther de pétrole/AcOEt, les produits secondaires sont désacétylês et soumis de nouveau à la réaction d'acylation : on obtient ainsi après un recyclage le composé.24 avec 85 % de rendement.
Le traitement de ce dernier par 2 équivalents de trichloroacétimidate de l'alcool paramêthoxybenzylique dans le dichloromethane en présence de 0,1 équivalent de triflate de triméthylsilyle permet d'obtenir le composé 10 avec un rendement de 80 % accompagné de 20 % de 24 n'ayant pas réagi. Ces deux produits 10_ et 24 sont aisément séparables par chromatographie sur gel de silice avec le mélange éther de pétrole/AcOEt .
Le disaccharide de base 10 est transformé avec 95 % de rendement en disaccharide donneur 26 (synthétisé par une autre voie dans TABEUR C. ; MALLET J.M. ; BONO F. ; HERBERT J. M. ; PETITOU M. ; SINAY P., Bioorg. , Med. Chem. 1999, 7, 2 003 - 2 012, par isomerisation de l' allyle, en présence de C8H14MePh2PIr1PFs et coupure de l'énol par des sels de mercure, comme cela est décrit par OLTVOORT J. J. ; VAN BOECKEL C. A. A. ; KONING J. H. ; VAN BOOM J. H., Synthesis 1981, 305 - 308, c'est-à-dire selon le mode opératoire 5 suivant : Mode opératoire 5 :
Le disaccharide 10 est solubilisé dans du THF anydre de façon à avoir une concentration de 0,06 M. La solution est dégazée sous vide, puis on ajoute 0,013 équivalents de C8H14MePh2PIrIPF6. Le mélange est redégazé puis laissé au contact de dihydrogène pendant 2 minutes et enfin redégazé puis mis sous atmosphère d'argon. Après deux heures sous agitation à température ambiante, le mélange est évaporé puis repris dans le volume d'acétone nécessaire pour obtenir une concentration de 0,05 M, on ajoute alors 1,2 équivalents d'HgO et 1,1 d'HgCl2. Après deux heures sous agitation à température ambiante, le mélange est filtré sous Célite 545, évaporé et repris par de l'éther éthylique. La phase éthérée est lavée par une solution à 10% de Kl, puis à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, évaporée et enfin chromatographiee sur gel de silice (éluant toluène/AcOEt 8/2 à 6/4) pour conduire au disaccharide libre en position anomérique avec un rendement de 97%. Puis, on réalise un traitement dans le dichloromethane par 6 équivalents de trichloroacétonitrile et 2 équivalents de K2C03, suivi d'une chromatographie sur gel de silice avec le mélange éther de pétrole/AcOEt 1 %o NEt3. Le disaccharide 10, traité par 1,5 équivalents de DDQ dans du dichloromethane saturé en eau conduit après lavage de la phase organique par une solution saturée de NaHC03 et chromatographie sur gel de silice avec le mélange éther de pétrole/AcOEt au disaccharide accepteur 25 avec un rendement de 95 %.
Le couplage du disaccharide accepteur 25 et du disaccharide donneur 26 (1,3 équivalents) est effectué dans o le dichloromethane à -40°C en présence de tamis 4 A et de triflate de terbutyldiméthylsilyle (0,2 équivalents). Après addition du catalyseur, la réaction est laissée 30 minutes à -40°C, puis on laisse la température remonter à 0°C, température à laquelle on arrête la réaction par ajout de 0,2 équivalents de triéthylamine . Une chromatographie sur gel de silice directe du mélange réactionnel avec le mélange CH2Cl2/AcOEt/éther de pétrole permet d'isoler le tétrasaccharide 27 avec un rendement de 95 %.
Ce dernier est alors transformé en tétrasaccharides accepteur 28 (rendement 90 %) et donneur 29 (rendement 95 %) en utilisant les mêmes séquences réactionnelles que pour le disaccharide 10. En utilisant les mêmes conditions que pour la préparation du tétrasaccharide 27, les couplages du disaccharide donneur 26 avec le tétrasaccharide- accepteur 28 et du tétrasaccharide donneur 29 avec le tétrasaccharide accepteur 28 conduisent à l'hexasaccharide 30 et à 1' octasaccharide 31 avec des rendements de 95 %. Les oligosaccharides 27, 30 et 31 sont désacétylés dans le méthanol anhydre en présence de 0,5 équivalent de K2C03 anhydre. Après neutralisation des milieux réactionnels par de la DOWEX 50 X 8 200 H+ et évaporation, les produits sont purifiés par chromatographie sur gel de silice et obtenus avec des rendements de 86 à 95 %. La réduction des groupements azido est effectuée par le propane dithiol (2 équivalents par groupement azido) dans le méthanol en présence de triéthylamine (2 équivalents par groupement azido) . Après évaporation du méthanol par balayage d'argon, les résidus sont chromatographiés sur gel de silice (CH2Cl2/MeOH) pour conduire aux composés aminés avec des rendements de 90 % à 80 %. Ces composés sont ensuite sulfatés par le complexe pyridine. S03 (5 équivalents par fonction à sulfater) dans la pyridine pendant 16 heures à 20°C, suivies de 24 heures à 55°C. L'excès d'agent sulfatant est détruit par 16 équivalents de méthanol et le mélange directement chromatographie sur SEPHADEX® LH-20
(CH2Cl2/Me0H 1/1) , puis sur colonne phase inverse C18 (MeOH/tampon AcOH-Net3 5 mM pH 7,0). Après échange sur résine BIORAD® AG 50 W X 8 200 Na+, les oligosaccharides sulfatés sont obtenus avec des rendements allant de 80 à 95 %. La saponification est effectuée pendant 48 heures à 37°C, en présence de lithine aqueuse (26 équivalents par ester à saponifier) et d'eau oxygénée (3 équivalents par rapport à la lithine) . Le pH est alors amené à 5 par addition d'acide acétique (0,75 équivalents par rapport à la lithine) et le mélange purifié par chromatographie sur colonne phase inverse Cl8 (MeOH/tampon AcOH-NEt3 10 mM pH O 2004/000887
48
7,0). Après échange sur résine BIORAD® AG 50 X 8 200 Na+, les oligosaccharides 32 à 34, dans lesquels respectivement n = 0, 1 et 2, sont obtenus avec des rendements de 90 % à quantitatifs . Les couplages des oligosaccharides 32 à 34 (2,5 équivalents) sur les espaceurs dithiols dérivés de polyethylene glycol de longueurs variables : à savoir m = 5, 10 et 32, à une concentration de 0,2 M dans l'eau, s'effectuent sous irradiation ultraviolette à 365 nM ou par chauffage en présence d'un initiateur de radicaux.
Le mélange est directement traité par 8 équivalents d'oxone, c'est-à-dire par une solution à 0,2 M, amenée à pH 6 par addition de K2HP04. Après 4 heures de réaction à 20°C, l'excès d'oxydant est réduit par addition d'une solution de thiosulfate de sodium et le mélange est directement purifié par HPLC semi-préparâtive sur phase inverse C18 (CH3CN/tampon AcOH-NEt3 5 mM pH 7,0). Après échange sur résine BIORAD® AG 50 WX 8 200 Na+, les oligosaccharides sont resolubilisés dans 100 μL de tampon phosphate de sodium 40 mM pH 7 et rais sous pression atmosphérique d'hydrogène en présence d'un équivalent massique d'hydroxyde de palladium 20 % sur charbon. Après 48 heures de réaction à 20°C, les échantillons sont filtrés sur célite 545, puis dessalés sur BIOGEL® 10 DG (H20) . On obtient ainsi les composés Illa-i avec un rendement de 80 à 90 % sur ces trois étapes. Parallèlement, les oligosaccharides 32 à 34 ont été débenzylés quantitativement dans les mêmes conditions. Pour les composés la à le, n = 0, pour les composés ld à lf, n = 1, et pour les composés lg à li, n = 2. Pour les composés la, ld et lg : m = 5 et la longueur du bras espaceur est de 33 A, pour les composés lb, le, lh : m = 10 et la longueur o du bras espaceur est de 50 A, et pour les composés le, lf et li : m ≈ 32 et la longueur du bras espaceur est de 114 A.
1) BnBr, NaH
88 % sur les trois étapes
accepte
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Claims

58
REVENDICATIONS
1. Composé susceptible de se lier à l' interféron-gamma (IFNγ) choisi parmi les molécules répondant à la formule (I) suivante :
dans laquelle X est un groupe espaceur divalent d'une longueur suffisante pour permettre aux deux fragments oligosaccharides A et B de se lier chacun à l'une des séquences peptidiques 125 à 143 des extrémités C-terminales d'un homodimere d' interféron-γ (IFN-γ) et n représente un nombre entier de 0 à 10, par exemple égal à 0,1, 2, 3, 4 ou 5 et chaque R représente indépendamment un atome d'hydrogène un groupe S03 ", ou phosphate, à la condition qu'aucun groupe S03 " ne se trouve en position 3 des unités glucosamines du composé (I) .
2. Composé selon la revendication 1, dans lequel tous les R représentent un groupe S03 " ou tous les groupes R représentent un groupe phosphate .
3. Composé selon la revendication 1, dans lequel σ le groupe espaceur est de longueur de 15 à 150 A, de o préférence de 33 à 50 A.
4. Composé selon la revendication 1, dans lequel le groupe espaceur est constitué par une chaîne carbonée, de préférence de 1 à 120C, dont un ou plusieurs des atomes de carbone sont éventuellement remplacés par un hétéroatome choisi parmi N, S, P et 0, un groupe S02, un groupe aryle, ladite chaîne carbonée portant, en outre, éventuellement un ou plusieurs groupes anioniques.
5. Composé selon la revendication 4, dans lequel lesdits groupes anioniques sont choisis parmi les groupes sulfate, phosphate et les groupes carboxyliques.
6. Composé selon la revendication 4, dans lequel le groupe espaceur est issu d'un polyglycol choisi, de préférence, parmi les poly (alkylène glycol) dont le groupe alkylène comprend de 1 à 4 C, tel que le poly (éthylene glycol) .
7. Composé selon la revendication 6, dans lequel le groupe espaceur répond à la formule :
dans laquelle m est un nombre entier de 5 à 32. 8. Composé selon la revendication 7, répondant à la formule (II) suivante :
(II) dans laquelle n représente un nombre entier de 0 à 10, par exemple égal à O, 1, 2, 3, 4 ou 5, et m est un nombre entier de 5 à 32.
9. Composé (Ha) répondant à la formule (II) selon la revendication 8, dans laquelle n = 0 et m ≈ 5.
10. Composé (Ilb) répondant à la formule (II) selon la revendication 8, dans laquelle n = 0 et m = 10.
11. Composé (Ile) répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n ≈ 0 et m ≈ 32.
12. Composé (Ild) répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n ≈ 1 et m ≈ 5. 13. Composé répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n = 1 et m = 10.
14. Composé (Ilf) répondant- à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle m ≈ 1 et m = 32.
15. Composé (Ilg) répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n = 2 et m = 5.
16. Composé (Ilh) répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n = 2 et m = 10.
17. Composé (Ili) répondant à la formule (II), selon la revendication 8, dans laquelle n = 2 et m = 32. 18. Procédé de préparation d'un composé susceptible de se lier à l' interféron-gamma (IFNγ) de formule (II) selon la revendication 8, dans lequel on réalise le couplage radicalaire de deux composés solubles dans l'eau, précurseurs d'oligosaccharides de formule (III) :
(m)
dans laquelle n est un nombre entier de 0 à 10, par exemple égal à 0, 1, 2, 3, 4 ou 5, et Ri et R2 représentent un groupe protecteur du groupe hydroxyle choisi, de préférence, parmi les groupes p-méthoxybenzyle et benzyle, avec un composé dithiol précurseur du groupe espaceur de formule :
dans laquelle m est un nombre entier de 5 à 32, pour obtenir un composé de formule (IV) :
puis, on oxyde les fonctions thioéthers en sulfones et on réalise la déprotection finale du composé (IV) pour donner le composé final de formule (II) .
(II)
19. Procédé selon la revendication 18, dans 0 laquelle Ri est un groupe p-méthoxybenzyle et R2 est un groupe benzyle .
20. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le composé soluble dans 1 ' eau précurseur d' oligosaccharides de formule (III) est préparé par les 5 étapes successives suivante : a) un disaccharide de formule (V) :
O 2004 0
63
est soumis à un clivage oxydatif du groupement Ri, de préférence, paramethoxybenzyle, pour donner un disaccharide « accepteur » de formule :
b) parallèlement, un disaccharide de formule (V) , ci-dessus, est soumis à une isomerisation du groupe allyle en 1-propényle, suivi par une hydrolyse de l'éther d'énol formé et une activation du groupe hydroxyle sous forme de trichloroacétamidate pour donner un disaccharide « donneur », de formule (VIb) : 64
c) on couple le disaccharide accepteur (Via) et le disaccharide donneur (VIb) pour obtenir le tétrasaccharide (n = 0) de formule (VII) , qui a une totale stéréospécificité alpha ; d) éventuellement, on répète les étapes a) à c) , en prenant comme produit de départ pour l'étape a), le tétrasaccharide préparé en c) , pour obtenir les hexa (n = 1) et octa (n = 2) saccharide de formule (VII) :
e) éventuellement, on répète les étapes a) à c) en prenant comme produit de départ, pour l'étape a), l'octasaccharide préparée en d) , pour obtenir un hexadecasaccharide (n = 7) de formule (VII) ; 65
f) on procède à la désacétylation, réduction de la fonction azide, sulfatation et saponification pour obtenir le composé soluble dans l'eau, précurseur d' oligosaccharide (III) recherché.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le disaccharide de formule (V) est préparé par une réaction de couplage entre un composé de formule (VIII) :
et un composé de formule (IX)
22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel le composé de formule (IX) est préparé à partir du composé de formule (X) et le composé de formule (VIII) est préparé à partir du composé de formule (XI) : es
23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel le composé de formule :
est préparé par acétylation du composé de formule (XII)
à -40°C dans le dichloromethane comme solvant, avec de la pridine comme basse, du chlorue d'acétyle comme agent acylant, et de la 4-diméthylaminopyridine comme catalyseur.
24. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une utilisation comme médicament.
25. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications l à 17, pour préparer un médicament .
26. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une utilisation comme modulateur par exemple inhibiteur, de l'activité de 1' interféron-γ endogène ou exogène.
27. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une utilisation dans le traitement des maladies liées à, ou caractérisées par, la présence de cytokines proinflammatoires comme 1 ' Interféron- γ par exemple les maladies auto-immunes inflammatoires ou dégénératives telles que la sclérose multiple, la Glomérulonéphrite, la maladie de Crohn et l'arthrite rhumatoïde .
28. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour une utilisation dans un traitement de complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés par exemple pour éviter le rejet de greffes.
29. Médicament contenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17. 30. Composition contenant le composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement des maladies liées à, ou caractérisées par, la présence de cytokines proinflammatoires comme 1 ' interféron-γ, par exemple les maladies auto-immunes ou dégénératives telles que la sclérose multiple, la Glomérulonéphrite, la maladie de Crohn, et l'arthrite rhumatoïde .
31. Composition contenant le composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une utilisation dans un traitement de complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés par exemple pour éviter le rejet de greffes.
32. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour préparer un médicament destiné au traitement des pathologies ou troubles reliés à l'activité, notamment excessive, de l' interféron-γ endogène ou exogène .
33. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour préparer un médicament destiné au traitement des maladies liées à, ou caractérisées par, la présence de cytokines proinflammatoires comme l' Interféron-γ par exemple les maladies auto-immunes inflammatoires ou dégénératives telles que la sclérose multiple, la Glomérulonéphrite, la maladie de Crohn et l'arthrite rhumatoïde..
34. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour préparer un médicament destiné à un traitement de complément aux traitements immunosuppresseurs utilisés par exemple pour éviter les rejets de greffes.
35. Médicament contenant, outre un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, de 1' interféron-γ.
36. Médicament selon la revendication 35, dans lequel le composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et l' interféron-γ se présentent sous la forme d'un complexe du composé et de l' interféron-γ.
37. Complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et d' interféron-γ pour une utilisation comme médicament.
38. Complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et d' interféron-γ pour une utilisation comme immunostimulan .
39. Complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 et d' interféron-γ pour une utilisation dans le traitement d'une maladie choisie parmi le cancer, les maladies infectieuses par exemple virales, bactériennes ou parasitaires et les fibroses d'organes.
40. Composition contenant un complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et d' interféron-γ, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour une utilisation dans le traitement d'une maladie choisie parmi le cancer, les maladies infectieuses, par exemple virales, bactériennes ou parasitaires, et les fibroses d'organes.
41. Médicament contenant un complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et d' interferon -γ.
42. Utilisation d'un complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, et d' interferon γ, pour préparer un médicament .
43. Utilisation d'un complexe d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, et d' interferon γ, pour préparer un médicament destiné au traitement d'une maladie donnée parmi le cancer, les maladies infectieuses, par exemple virales, bactériennes ou parasitaires, et la fibrose d' organes .
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