EP1519949A1

EP1519949A1 - Varianten des hausstaubmilbenallergens der f 2

Info

Publication number: EP1519949A1
Application number: EP03763652A
Authority: EP
Inventors: Andreas Nandy; Francicus Maria Kniest; Oliver Cromwell; Helmut Fiebig
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-07-10
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2005-04-06
Also published as: AU2003246586A1; WO2004007542A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung von neuen allelen Varianten des Der f 2 - Allergens, die bei Hausstaubmilben der Spezies Dermatophagoides farinae im europäischen Verbreitungsgebiet vorkommen. Die DNA-Moleküle und die davon abgeleiteten rekombinanten Proteinallergene bzw. deren Molekülfragmente können zur Therapie von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden, die durch Hausstaubmilbenallergene verursacht werden. Weiterhin können diese Varianten des Der f 2 - Allergens zur Verbesserung der Diagnostik von Hausstaubmilbenallergien verwendet werden.

Description

Varianten dss Haussϊaubriilfeenallergens Der 2

Die Erfindung betrifft die Bereitstellung von neuen allelen Varianten des Der f 2 -Allergens, die bei Hausstaubmilben der Spezies Dermatophagoides farinae im europäischen Verbreitungsgebiet vorkommen. Die DNA-

Moleküle und die davon abgeleiteten rekombinanten Proteinallergene bzw. deren Molekulfragmente können zur Therapie von allergischen Erkrankungen eingesetzt werden, die durch Hausstaubmilbenallergene verursacht werden. Weiterhin können diese Varianten des Der f 2 - Allergens zur Ver- besserung der Diagnostik von Hausstaubmilben-Allergien verwendet werden.

In den industrialisierten Ländern haben Allergien in den letzten Jahrzehnten enorm zugenommen. Bis zu 25 % der Bevölkerung in diesen Ländern lei- den unter Beschwerden wie allergischer Rhinitis, Konjunktivitis oder Bronchialasthma. Diese Allergien werden durch Allergenquellen verursacht, die durch die Luft verbreitet werden. Solche Aeroallergene sind z. B. die Pollen von Gräsern, Bäumen und Kräutern oder Staubpartikel, die Bestandteile von Hausstaubmilben enthalten. In Mitteleuropa sind die durch Milbenaller- gene hervorgerufenen allergischen Erkrankungen nach den Pollinosen am häufigsten. Besonders Bronchialasthma wird häufig durch Sensibilisierung mit Milbenallergenen ausgelöst und Asthmaanfälle resultieren aus der Exposition mit milbenallergenhaltigem Hausstaub. Da die Hausstaubmilben in den Schlaf- und Wohnräumen vorkommen, ist der Staub in diesen Wohn- bereichen besonders stark mit Milbenallergenen angereichert.

Bei den Typ 1 - Allergie auslösenden Substanzen handelt es sich um Proteine, Glykoproteine oder Polypeptide.

Diese Allergene reagieren nach Aufnahme über die Schleimhäute mit den bei sensibilisierten Personen an der Oberfläche von Mastzellen gebundenen IgE-Molekülen. Werden dabei zwei IgE-Moleküle durch ein Allergen miteinander vernetzt, führt dies zur Ausschüttung von Mediatoren (z. B. Histarnin, Leukotrienβ) und ∑ytokinen durch die Effektorzellen. Diese Mediatoren und Zytokine lösen die klinisch bekannten allergischen Symptome aus.

In Abhängigkeit von der relativen Häufigkeit mit der die einzelnen Aller- genmoleküle mit den IgE-Antikörpern von Allergikern reagieren, wird zwischen Major- und Minor-allergenen unterschieden.

Hausstaubmilben, besonders die Spezies Dermatophagoides pteronyssi- nus und Dermatophagoides farinae, sind bedeutende Quellen von Allergenen im Inneren von Wohngebäuden. Die Hausstaubmilben leben in Betten, Teppichen, Polstermöbeln sowie in Kleidungsstücken und ernähren sich im Wesentlichen von menschlichen Hautschuppen. Die Allergene sind in den Zerfallsprodukten der abgestorbenen Milben enthalten und gelangen somit in den Hausstaub. Eine weitere wesentliche Quelle der Allergene stellt der Milbenkot dar. Es sind eine Reihe von Molekülen aus den Milbenkörpern und dem Kot als Allergene identifiziert und charakterisiert worden (Thomas u. Smith, Allergy 53, 821-832 (1998); Thomas u. Smith, Clin. Exp. Allergy 29, 1583-1587 (1999)). Sowohl im Hausstaub als auch in den Allerge- nextrakten, die aus Milbenkulturen oder gereinigten Milbenkörpern gewonnen werden, dominieren die Allergene der Gruppe 1 und 2. Die Gruppe 1 - Allergene (Der p 1 und Der f 1) sind Cysteinproteasen und kommen in hohen Konzentrationen im Milbenkot vor (Thomas u. Smith, Allergy 53, 821- 832 (1998); Thomas u. Smith, Clin. Exp. Allergy 29, 1583-1587 (1999)).

70 - 80 % der Milbenallergiker besitzen IgE-Antikörper, die mit diesen Gruppe 1 -Allergenen reagieren. Die Gruppe 2 -Allergene sind Proteine mit einer Molekularmasse von 14 kDa. 70 - 90 % der Milbenallergiker weisen IgE-Antikörper auf, die mit diesen Gruppe 2 -Allergenen reagieren.

Die cDNA-Sequenzen von Der p 2 (Thomas et al., Adv. Biosc. 74, 139-147 (1989); Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91, 118-123 (1990)) und Der f 2 (Yuuki et al., Jpn J. Allergy 39, 557-561 (1980); Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy 21, 33-37 (1991); Yuuki et al., Agric. Biol. Chem. 55, 1233-1238 (1991)) sind beschrieben worden und zeigen, dass diese Moleküle aus 129 Aminosäuren bestehen und keine N-Glykosylierungsstelle aufweisen.

Die Divergenz der Aminosäuresequenz der Gruppe 2 -Allergene dieser beiden Spezies beträgt 12 %. Diese Divergenz ist deutlich größer als bei den Gruppe 1 - Allergenen der beiden Milbenarten. Auch das Gruppe 2 - Allergen (Eur m 2) der nahe verwandten Spezies Euroglyphus maynei hat eine Aminosäuredivergenz von 18 % zu Der p 2 und Der f 2 (Smith et al., GenBank AF 047 613). Die Funktion der Gruppe 2 - Allergene ist noch nicht aufgeklärt. Es gibt jedoch Hinweise, dass die Gruppe 2 - Allergene Ähnlichkeiten bezüglich der Sequenz, der Molekülgröße und der Verteilung der Cysteine zu einer Familie von Epididymalen Proteinen aufweisen (Thomas u. Chua, Clin. Exp. Allergy 25, 667-669 (1995)). Die Tertiärstruktur von Der p 2 (Muelier et al., J. Biol. Chem. 272, 26893-26898 (1997)) und Derf 2 (I- chikawa et al., J. Biol. Chem. 273, 356-360 (1998)) ist durch nuklearmagnetische Resonanzmessungen aufgeklärt worden. Die Moleküle bestehen aus ß-Faltblattstrukturen, die eine immunglobulinähnliche Domäne bilden.

Das Der f 2 - Gen wird von einem einzigen Genlocus kodiert. Die ursprünglich aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Der f 2 - Moleküls zeigen einen Polymorphismus an den Positionen 76, 88, 111 und 125 (Yuuki et al., Jpn J. Allergy 39, 557-561 (1990); Yuuki et al., Agric. Biol. Chem. 55, 1233-1238 (1991)).

Dieser Polymorphismus konnte mittels PCR-Technik an genomischer DNA bestätigt werden (Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy 21, 33-37 (1991); Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. 16, 153-164 (1992)). Weitere vier geno- mische Sequenzen zeigten ebenfalls Substitutionen an den gleichen Positionen, allerdings in differenten Kombinationen (Yuuki et al., Int. Arch. Allergy Immun_.ol. 112, 44-48 (1997)). Eine weitere Substitution konnte an der Posi- tion 100 an Derf 2 aus einer koreanischen Milbenpopulation gefunden werden (Jeong et al., Allergy 57, 29-34 (2002)). Ein ähnlicher Polymorphismus wurde auch für Der p 2 gefunden (Chua et al., Clin. Exp. Allergy 26, 829-837 (1996); Thomas u. Smith, Allergy 53, 821-832 (1998)). Die Varianten dieses Allergens haben differente Kombinationen von Substitutionen an 7 Positionen (40, 47, 98, 111 , 114, 116, 127), so dass sich die einzelnen Allene in ein bis vier Aminosäuren unterscheiden. Die C-terminalen Positionen 111, 114, 116 und 127 befinden sich dabei in einer Region des Moleküls, die für die T-Zellerkennung sehr wichtig ist (O'Hehir et al., J. Al- lergy Clin. Immunol. 92, 105-113 (1993); O'Brien et al., Immunology 86, 176-182 (1995)). Die Erkennung von Allergenmolekülen durch T- Helferlymphozyten ist eine essenzielle Voraussetzung für das Wirken der Allergen-spezifischen Immuntherapie bei Patienten mit allergischen Erkrankungen (Fiebig, Allergo J. 4, 336-339 (1995)). Die T-Helferzellen reagieren mit Peptidfragmenten der Allergene, wobei 9 - 25 Aminosäuren einen Epi- top bilden.

Variationen der Aminosäuresequenz können zum Ausfall oder zu einer modifizierten T-Zellreaktion führen. Die bisher bekannten allelen Varianten des Der f 2 - Gens wurden an Milben bestimmt, die aus dem australischen und ostasiatischen Verbreitungsgebiet stammen.

Es war bisher nicht bekannt, welche allelen Varianten im europäischen Verbreitungsgebiet bei Dermatophagoides farinae vorkommen. Für den Er- folg einer spezifischen Immuntherapie mit rekombinanten Allergenen (bzw. einer immuntherapeutischen DNA-Vakzinierung mit den zugrunde liegenden DNA-Molekülen) wie z. B. Derf 2, ist es aber wichtig, dass solche allelen Der f 2 - Varianten zur Immuntherapie eingesetzt werden, die auch die Sensibilisierung der Allergiker der betreffenden geographischen Region ausgelöst haben. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe - und diese Aufgabe wurde von den Erfindern der vorliegenden Patentanmeldung gelöst - bestand daher in der Bereitstellung ebensolcher, im europäischen Verbreitungsgebiet auftretenden Allergenvarianten.

Beschreibung der Erfindung

Es wurden allele Varianten von Allergenen von Hausstaubmilben des Typs Der f 2 gefunden, die wertvolle Eigenschaften aufweisen. Diese können in Form ihrer Proteine für die Therapie von entsprechenden Allergien, sowie in Form ihrer DNA Moleküle als Vakzine im gentherapeutischen Sinn eingesetzt werden.

Die vor- und nachstehend verwendeten Bezeichnungen für Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen "SEQ ID NO" beziehen sich auf das der Beschreibung beigefügte Sequenzprotokoll.

Hausstaubmilben der Spezies Dermatophagoides farinae wurden in Mittel- europa (Hamburg und Umgebung) sowie aus einer bestehenden lokalen Milbenzuchtkolonie isoliert. Einzelmilben wurden präpariert und die Zellen durch Hitzebehandlung und Protease K aufgeschlossen. Die vorbereiteten Einzelmilben wurden einer PCR-Reaktion mit Primern, die spezifisch für die 5 - und 3^'-nicht-translatierten Bereiche des Der f 2 - Gens waren, unterwor- fen. Die Primer leiten sich aus der veröffentlichten Sequenz der Der f 2 - cDNA ab (Yuuki et al., Agric. Biol. Chem. 55, 1233-1238 (1991)). So gewonnene Amplifikate der Der f 2 - Allele einzelner Milben wurden kloniert und sequenziert. Dabei wurden die schon bekannten Sequenzen der Varianten Der f 2.0101 (SEQ ID NO 10), Der f 2.0102 (SEQ ID NO 11 ) und Der f 2.0103 (SEQ ID NO 12) bestätigt. Zusätzlich zu diesen bekannten allelen Varianten des Der f 2 - Gens wurden die im Folgenden beschriebenen neuen Varianten Der f 2 HH1 (SEQ ID NO 1), Der f 2 HH2 (SEQ ID NO 2) und Derf 2 HH3 (SEQ ID rJO 3) gefunden, jeweils umfassend eine 51 bp lange Signalsequenz am S'-Ende.TJie Nukleotidsequen∑en gemäß SEQ ID HO 1 (Der f 2 HH1) und 3 (Derf 2 HH3) enthalten weiterhin ein 87 bp langes Intron zwischen den Basenpositionen 76 und 162, die Nukleotidse- quenz gemäß SEQ ID NO 2 ein 90 bp langes Intron zwischen den Basenpositionen 76 und 165. Alle drei Sequenzen werden durch ein Stop-Codon "taa" beendet.

Die reife Form (ohne Signalsequenz) der Variante Der f 2 HH1 (mDer f 2 HH1) (SEQ ID NO 5, korrespondierende DNA-Sequenz entspricht SEQ ID NO 4) unterscheidet sich überraschenderweise an 11 Aminosäurepositionen von dem erstbeschriebenen Molekül Der f 2.0101 (Yuuki et al., Agric. Biol. Chem. 55, 1233-1238 (1991); Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy 21 , 33-37 (1991). Im Einzelnen sind dies die Positionen 11, 36, 40, 57, 58, 63, 75, 76, 88, 111 und 125. Dies entspricht einer Aminosäureidentität von nur 91 %, was für allele Varianten eine große Abweichung darstellt, die nahe an der Abweichung von homologen Molekülen eng verwandter Spezies (z. B. Dermatophagoides pteronyssinus bis zu 90 %) heranreicht. Im Vergleich mit den bisher bekannten Der f 2 - Varianten 2.0101, 2.0102, 2.0103 und 2.0104 (SEQ ID NO 13) (Yuuki et al., Agric. Biol. Chem. 55,

1233-1238 (1991); Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy 21 , 33-37 (1991) sind von den 11 genannten Austauschpositionen 7 an bisher noch nicht als variabel erkannten Aminosäurepositionen lokalisiert (Positionen 11, 36, 40, 57, 58, 63 und 75). Die variable Position 76 ist durch Isoleucin besetzt, einer Aminosäure, die an dieser Position bisher noch nicht beschrieben ist.

Weiter wurde die Variante mDer f 2 HH2 (SEQ ID NO 7, korrespondierende DNA-Sequenz entspricht SEQ ID NO 6) gefunden, die sich an 8 Amino- Säurepositionen von dem erstbeschriebenen Molekül (Der f 2.0101 ) unterscheidet. Im Einzelnen sind dies die Positionen 57, 58, 59, 63, 75, 76, 88 und 125. Davon sind 5 Positionen neu als variabel erkannt (Positionen 57, 58, 59, 63 und 5). Von diesen variablen Po^ilionen sind 4 Positionen (57, 58, 63, 75) auch in Der f 2 HH1 enthalten. Die variable Position 76 ist durch Isoleucin besetzt, einer Aminosäure, die an dieser Position bisher noch nicht beschrieben ist und auch in HH1 und HH3 vorkommt.

Weiter wurde die Variante mDer f 2 HH3 (SEQ ID NO 9, korrespondierende DNA-Sequenz entspricht SEQ ID NO 8) gefunden, die sich ebenfalls an 8 Aminosäurepositionen von dem erstbeschriebenen Molekül (Derf 2.0101) unterscheidet. Im Einzelnen sind dies die Positionen 57, 58, 63, 75, 76, 88, 111 und 125. Davon sind 4 Positionen neu als variabel erkannt (Positionen 57, 58, 63 und 75). Diese neuen variablen Positionen sind auch in Der f 2 HH1 und HH2 enthalten.

Die variable Position 76 ist durch Isoleucin besetzt, einer Aminosäure, die an dieser Position bisher noch nicht beschrieben ist und auch in HH1 und HH2 vorkommt.

Ein Aminosäuresequenzvergleich der reifen Sequenzen der bekannten Varianten mDer f 2.0101 , 2.0102, 2.0103 und 2.0104 von Derf 2 mit den neu gefundenen Varianten mDer f 2 HH1, HH2 und HH3 ist in Tab. 1 darge- stellt. Bisher nicht beschriebene neue Aminosäuren sind kursiv dargestellt. Die bisher bekannten Aminosäuresequenzen der Varianten Derf 2.0101, 2.0102, 2.0103 und 2.0104 unterscheiden sich in 1 bis 5 Positionen. Die allele Variante HH1 unterscheidet sich in 8, 9 oder 11 Positionen, die allele Variante HH2 in 7 oder 8 Positionen sowie die allele Variante HH3 in 5, 6 oder 8 Positionen von den bisher bekannten Varianten.

Die regional gefundenen Varianten HH1, 2 und 3 repräsentieren mitteleuropäische Varianten des Hauptallergens Der f 2. Es ist davon auszugehen, daß die Aminosäureaustausche an den genannten Positionen Auswirkun- gen auf ihre Verwendung in der Diagnostik oder in der Spezifischen

Immuntherapie haben. Die Tertiärstruktur des rekombinanten Allergens Der f 2.0101 (Ichikawa et al., J. Biol. Chem. 273, 356-360 (1998)) zeigt, dass die Positionen 11 und 59 stark oberflächenexponiert sind. Der Austausch Positionen 1 1 und 59 stark oberflächene_^poniert sind. Der Austausch von Asparagin zu Histidin (Pos. 11) bzw. von der potentiell negativ geladenen Asparaginsäure zu Asparagin (Pos. 59) kann in den hier beschriebenen Varianten zu einer Veränderung der B-Zellepitope führen und damit die Bin- düng von monoklonalen Antikörpern oder von IgE-Antikörpern von Allergikern in Diagnostiksystemen beeinflussen.

Die Aminosäuren an den Positionen 36, 40, 57, 63 und 75 sind schwach oberflächenexponiert, können jedoch ebenfalls zu einer veränderten B-Zell- Epitopen führen. Mueller et al., J. Biol. Chem. 276, 9359-9365 (2001) zeig- ten, dass die künstliche Mutation von Serin 57 zu Alanin in einem rekombinanten Der p 2 Molekül die Bindung des monoklonalen Antikörpers 7A1 beeinflusst.

Van t'Hoff et al., Mol. Immunol. 28, 1225-1232 (1991) beschrieben die Regionen 41 bis 64 und 65 bis 78 als IgE-reaktive Fragmente. In diesen Be- reichen liegen 6 der neuen variablen Positionen in den in Mitteleuropa vorkommenden allelen Varianten von Der f 2. Es ist zu erwarten, dass diese Unterschiede der Primärstruktur und eventuell dadurch bedingte konforma- tionelle Molekülunterschiede zu einer IgE-Antikörperantwort hinsichtlich ihrer Epitopspezifität führen, die sich von der unterscheidet, die durch die schon bekannten allelen Varianten induziert wird.

Untersuchungen der T-Zellepitope von Der p 2 (OΕrien et al., Immunology 86, 176-182 (1995); O^'Hehir et al., J. Allergy Clin. Immunol. 92, 105-113 (1993); Verhoef et al., International Immunology 5, 1589-1597 (1993)) zeigten eine Verteilung von T-Zellepitopen über die gesamten 129 Aminosäu- ren des Moleküls. Diese Ergebnisse lassen sich aller Voraussicht nach auf die Der f 2 Situation übertragen.

Den regionalen Varianten HH1 , 2 und 3 kommt somit eine wichtige Rolle in der Spezifischen Immuntherapie von Milbenallergikern zu, die mit Mitteleu- ropäischen D. farinae Milben sensibilisiert wurden.

Die Frequenz der neuen allelen Varianten beträgt 25 % in der untersuchten Milbenzuchtkolonie und 34 % in den Wildfängen. Tabelle 1: AminosäurcεsquGn∑verglΘich von Der r 2 Varianten

SEQ Ällsrgen

IDWO

10 mDer f2 2.0101 D Q V D V K D C A N N E I K K V M V D G 20

11 mDer £2 2.0102 D Q V D V K D C A N N E I K K V M V D G 20

12 mDer f2 2.0103 D Q V D V K D c A N N E I K K V M V D G 20

13 mDer f2 2.0104 D Q V D V K D c A N N E I K K V M V D G 20

5 mDer f2 HH1 D Q V D V K D c A N H E I K K V M V D G 20

7 mDer f2 HH2 D Q V D V K D c A N N E I K K V M V D G 20

9 mDer f2 HH3 D Q V D V K D c A N N E I K K V M V D G 20

11

10 mDer £2 2.0101 C H G S D P C I I H R G K P F T L E A L 40

11 mDer £2 2.0102 C H G s D P C I I H R G K P F T L E A L 40

12 mDer f2 2.0103 C H G s D P C I I H R G K P F T L E A L 40

13 mDer f2 2.0104 c H G s D P C I I H R G K P F T L E A 40

5 mDer f2 HH1 c H G s D P C I I H R G K P F N L E A I 40

7 mDer f2 HH2 c H G s D P C I I H R G K P F T L E A L 40

9 mDer f2 HH3 c H G s D P C I I H R G K P F T L E A L 40

36 40

10 mDer f2 2.0101 F D A N Q N T K T A K I E I K A S L D G 60

11 mDer f2 2.0102 F D A N Q N T K T A K I E I K A S L D G 60

12 mDer f2 2.0103 F D A N Q N T K T A K I E I K A s L D G 60

13 mDer f2 2.0104 F D A N Q N T K T A K T E I K A s D G 60

5 mDer f2 HH1 F D A N Q N T K T A K I E I K A N I D G 60

7 mDer f2 HH2 F D A N Q N T K T A K I E I K A N I N G 60

9 mDer f2 HH3 F D A N Q N T K T A K I E I K A N I D G 60

52 57 58 59

10 mDer f2 2.0101 L E I D V P G I D T N A C H F V K C P L 80

11 mDer f2 2.0102 L E I D V P G I D T N A c H F M K c P L 80

12 mDer f2 2.0103 L E I D V P G I D T N A c H F K c P L 80

13 mDer f2 2.0104 L E I D V P G I D T N A c H F M K c P L 80

5 mDer £2 HH1 L E V D V P G I D T N A c H Y I K c P L 80

7 mDer f2 HH2 L E V D V P G I D T N A c H Y I K c P L 80

9 mDer f2 HH3 L E V D V P G I D T N A c H Y I K c P L 80

63 75 76

10 mDer f2 2.0101 V K G Q Q Y D I K Y T N V P K I A P K 100

11 mDer f2 2.0102 V K G Q Q Y D I K Y T W N V P K I A P K 100

12 mDer f2 2.0103 V K G Q Q Y D A K Y T W N V P K I A P K 100 13 mDer £2 2.010^ KG Q Q DA KY T W N P K I A P K 100

5 mDer £2 HH1 K G Q Q Y DAK Y T W N V P K I A P K 100

7 mDer £2 HH2 KG Q Q Y DA K Y T W N V P KI A P K 100

9 mDer £2 HH3 V K G Q Q Y DAK Y T W N V P K I A P K 100

10 mDer f2 2.0101 S E N VVV T V KL I G D N G V LA C A 120

11 mDer £2 2.0102 S E N VVV T VKL I G D N GV A CA 120

12 mDer £2 2.0103 S E N VV V T V K LVG D N G V LA CA 120

13 mDer £2 2.0104 S E N VV V T V KLVG D N G V L A CA 120

5 mDer £2 HH1 S E N VVV T V KLVG D N G V LACA 120

7 mDer f2 HH2 S E N V V V T V K L I G D N G V LA CA 120

9 mDer £2 HH3 S E N VVV T V K LVG D N G V LA C A 120

111

10 mDer f2 2.0101 I A T H G K I R D 129

11 mDer £2 2.0102 I A T H GK I R D 129

12 mDer f2 2.0103 I A T HAK I R D 129

14 mDer £2 2.0104 I A T HAK I R D 129

5 mDer f2 HH1 I A T HA K I R D 129

7 mDer f2 HH2 I A T HAK I R D 129

9 mDer f2 HH3 I A T HA K I R D 129

Aminosäurepositionen, an denen Austausche beobachtet werden, sind fett dargestellt und mit einer Positionsnummer versehen. Aminosäuren, die innerhalb der bekannten Sequenzen Derf 2.0101, Derf 2.0102, Derf 2.0103 und Der f 2.0104 identisch sind, bei denen es innerhalb der Gruppe der erfindungsgemäßen Sequenzen HH1, HH2 und HH3 gegenüber den bekannten Sequenzen jedoch Austausche ergibt, sind in den letztgenannten Sequenzen zusätzlich kursiv und unterstrichen dargestellt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein DNA-Molekül entsprechend einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 und SEQ ID NO 8 - insbesondere kodierend für eine allele Variante des Hausstaubmilbenallergens Der f 2 aus Dermatophagoides farinae - sowie ein rekombinanter DNA-

Expressionsvektor oder ein lonierungssystem, enthaltend besagtes DNA- Molekül.

Weiterhin betrifft die Erfindung einen Wirtsorganismus, transformiert mit besagtem DNA-Molekül oder einem entsprechenden Expressionsvektor sowie ein Verfahren zur Herstellung einer entsprechenden allelen Allergen- variante, kodiert durch eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, durch Kultivieren eines besagten Wirtsorganismus und Gewinnung der entsprechen- den Allergenvariante aus der Kultur.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besagte Allergenvariante - ausgewählt aus einer Gruppe von Aminosäuresequen∑en bestehend aus SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 und SEQ ID NO 9 - vorzugsweise in ihrer Eigenschaft als Arzneimittel - sowie eine pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens eine solche allele Allergenvariante und gegebenenfalls weitere Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur Diagnose und/oder Behandlung von Allergien, an deren Auslösung das Hausstaubmilbenallergen Der f 2 aus Dermatophagoides farinae beteiligt ist. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung mindestens einer besagten allelen Allergenvariante zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose und/oder Behandlung der zuvor beschriebenen Allergien

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist besagtes DNA- Molekül oder ein entsprechende Expressionsvektor als Arzneimittel im Sinne der gentherapeutischen DNA-Vakzinierung.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung eine entsprechende pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens ein besagtes DNA-Molekül oder mindestens einen besagten Expressionsvektor und gegebenenfalls weitere Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur immuntherapeutischen DNA-Vakzinierung von Patienten mit Allergien, an deren Auslösung das Hausstaubmilbenallergen Der f 2 aus Dermatophagoides farinae beteiligt ist und/oder zur Pra¬

ll veniion solcher Allergien, sowie die Verwendung mindestens eines besagten DNA-Moleküls oder mindestens eines besagten Expressionsveittor zur Herstellung eines Arzneimittels zur immuntherapeutischen Di A- Vakzinierung von Patienten mit den zuvor beschriebenen Allergien.

Claims

1. Ein DNA-Molekül entsprechend einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6 und SEQ ID N0 8.

2. Ein DNA-Molekül entsprechend einer Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 , kodierend für eine allele Variante des Hausstaubmilbenaller- gens Der f 2 aus Dermatophagoides farinae.

3. Ein rekombinanter DNA-Expressionsvektor oder ein Klonierungssystem, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2, funktionell verbunden mit einer Expressionskontrolisequenz.

4. Ein Wirtsorganismus, transformiert mit einem DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 3.

5. Ein Verfahren zur Herstellung einer allelen Allergenvariante, kodiert durch eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, durch Kultivieren eines Wirtsorganismus gemäß Anspruch 4 und Gewinnung der entsprechenden Allergenvariante aus der Kultur.

6. Eine allele Allergenvariante, kodiert von einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus einer Gruppe von Aminosäurese- quenzen bestehend aus SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7 und SEQ ID NO 9.

7. Eine allele Allergenvariante gemäß Anspruch 6 als Arzneimittel.

8. Eine pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens eine allele Allergenvariante gemäß Anspruch 6 oder 7 und gegebenenfalls weitere

Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur Diagnose und/oder Behandlung von Allergien, an deren Auslösung das Hausstaubmilbenallergen Derf 2 aus Dermatophagoides farinae beteiligt ist.

9. Verwendung mindestens einer allelen Allergenvariante gemäß Anspruch 7 oder 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnose und/oder Behandlung von Allergien, an deren Auslösung das

Hausstaubmilbenallergen Der f 2 aus Dermatophagoides farinae beteiligt ist und/oder zur Prävention solcher Allergien.

10. Ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2 als Arzneimittel.

11. Ein rekombinanter Expressionsvektor gemäß Anspruch 3 als Arzneimittel.

12. Eine pharmazeutische Zubereitung, enthaltend mindestens ein DNA- Molekül gemäß Anspruch 1 , 2 oder 10 oder mindestens einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 11 und gegebenenfalls weitere Wirk- und/oder Hilfsstoffe zur immuntherapeutischen DNA-Vakzinierung von Patienten mit Allergien, an deren Auslösung das Hausstaubmilbenallergen Der f 2 aus Dermatophagoides farinae beteiligt ist und/oder zur Prävention solcher Allergien.

13. Verwendung mindestens eines DNA-Moleküls gemäß Anspruch 1, 2 oder 10 oder mindestens eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 11 zur Hersteilung eines Arzneimittels zur immuntherapeutischen DNA- Vakzinierung von Patienten mit Allergien, an deren Auslösung das