EP1507799A2 - Nouveaux peptides cycliques, leur utilisation comme agents anti-microbiens. - Google Patents

Nouveaux peptides cycliques, leur utilisation comme agents anti-microbiens.

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Publication number
EP1507799A2
EP1507799A2 EP03749919A EP03749919A EP1507799A2 EP 1507799 A2 EP1507799 A2 EP 1507799A2 EP 03749919 A EP03749919 A EP 03749919A EP 03749919 A EP03749919 A EP 03749919A EP 1507799 A2 EP1507799 A2 EP 1507799A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
seq
peptides
amino acids
chosen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03749919A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bernard Romestand
Claude Granier
Philippe Roch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1507799A2 publication Critical patent/EP1507799A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to new antimicrobial agents, and more particularly low molecular weight peptides derived from the defensin of the Mediterranean mussel or Mytilus galloprovincialis. It also relates to a process for their preparation and their applications, in particular their use for the preparation of a medicament.
  • N-terminal natural defensin exhibited the most interesting profile of antimicrobial activity.
  • WO 98/40091 describes antimicrobial peptides whose sequence is derived from the amino acid sequences of natural defensins and bactenecins.
  • WO 01/09174 describes antimicrobial peptides derived from plant defensins by substitution of one or more amino acids.
  • WO 00/68625 describes cyclic peptides called theta defensins, which have antimicrobial activity. These peptides are derived from natural or modified linear peptides and cyclized by the formation of a peptide bond between the N-terminal amine and the C - terminal carbon. Peptides cyclized in this way do not offer a grip on the action of exopeptidases and are therefore likely to have a resistance to proteol is superior to that of natural peptides.
  • the present invention aims to provide new molecules with an interesting spectrum of antimicrobial activity and having unexpected properties compared to those of molecules of the prior art.
  • the molecules according to the invention can be easily prepared at a cost which makes it possible to envisage industrial and commercial production.
  • the subject of the invention is new cyclic peptides, or comprising a cyclic fragment, as well as certain of their chemical derivatives, which exhibit antimicrobial activity, in particular antibacterial and antifungal, these peptides comprising an unnatural bridge, preferably a disulfide bridge. , these peptides being derived from the defensin of Mytilus galloprovincialis noted MGD l '
  • MGD 1 Mytilus galloprovincialis
  • the first peptide according to the invention corresponds to the sequence SEQ ID NO: l
  • a subject of the invention is also homologs of the peptide SEQ ID NO: 1 and certain chemical derivatives of this peptide.
  • the term “homologs” means peptides whose amino acid sequence has at least 60% similarity to the sequence
  • SEQ ID NO: 1 even more preferably 70%, even more preferably still 80%, preferably at least 90%, and even more favorably at least 95%, or better, 98% similarity with the sequence SEQ ID NO: l, it being understood that the sequences concerned comprise a cysteine residue at each of their ends, these terminal cysteine residues being linked by a disulfide bridge.
  • X% between a peptide P and the sequence SEQ ID NO: l it is meant that: when the sequence of P is aligned opposite SEQ ID NO: l, in the same direction, X% of the amino acids of P are identical to the corresponding amino acid of SEQ ID NO: l or are replaced by an amino acid of the same class, it being understood that if the sequences are not the same length, we will place a space between the amino acids of the sequence concerned.
  • the degree of homology can be assessed by methods well known to those skilled in the art (e.g., WILBUR WJ et al Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983); MYERS et al, Comput. Appl Biosci.
  • the homology with SEQ ID NO: l extends to peptides comprising from 6 to 15 amino acids and the sequence of which, once aligned with SEQ ID NO: l, with the spaces placed between the acids suitable amines, has a similarity included in the values indicated above.
  • the homology extends to peptides comprising from 7 to 12 amino acids, even more preferably from 8 to 11 amino acids.
  • amino acids of the same class is meant an amino acid having substantially identical chemical properties.
  • this term is understood to mean amino acids having substantially the same charge, and / or the same size, and / or the same hydrophilicity or hydrophobia, and / or the same aromaticity.
  • Such amino acid groupings generally include:
  • proline phenylalanine.
  • Other amino acid substitutions can be envisaged within the meaning of the present invention in which an amino acid is replaced by another amino acid of the same class, that is to say having comparable properties, the amino acid of substitution being an unnatural amino acid.
  • a particular example of homolog is constituted by the functional fragments of the peptides according to the invention: these are peptides corresponding to one of the sequences according to the invention in which one or more amino acids are removed from the sequence but which retain a bactericidal activity comparable to that described for MGD1, in particular a minimum inhibitory concentration of less than 75 ⁇ M with respect to at least one bacterial microorganism.
  • the preferred functional fragments of the peptides according to the invention are those for which at most two amino acids are removed. Even more preferably, those for which an amino acid is removed.
  • substitutions of amino acids of the same class allow the peptide to retain its antimicrobial activity.
  • Appropriate substitutions can be determined by testing the antimicrobial properties of the peptides obtained using activity tests such as those described below.
  • the invention relates more specifically to molecules having a minimum inhibitory concentration of less than 75 ⁇ M with respect to at least one bacterial microorganism.
  • the substitution of histidine and leucine of SEQ ID NO: 1 by two lysines made it possible to obtain a peptide of sequence SEQ ID NO: 2 comprising a disulfide bridge between the two cysteines, this cyclic peptide having an antibacterial power greater than that of the cyclic peptide of sequence SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 2 C (S) GGWKRKRC (S)
  • the invention therefore also relates to a peptide of sequence
  • SEQ ID NO: 2 in which the two cysteine residues are engaged in a disulfide bridge, as well as its pharmaceutically acceptable salts, the functional fragments of this peptide, the homologous peptides and the chemical analogs of this peptide and certain chemical derivatives of this peptide.
  • the invention extends to peptides whose amino acid sequence has at least 60% similarity to a peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 2, even more preferably 70%, even more preferably still 80%, preferably at least 90%, and even more favorably at least 95%, or better, 98% similarity with the sequence SEQ ID NO: 2, said sequence comprising a cysteine residue at each of its ends, these terminal cysteine residues being linked by a disulfide bridge.
  • -Xi and X 2 identical or different, represent an amino acid chosen from glycine, valine, alanine, lysine,
  • - X 3 represents an amino acid chosen from tryptophan and tyrosine
  • - X, X 5 and X 7 identical or different, represent an amino acid chosen from histidine, arginine, lysine,
  • - X 6 represents an amino acid chosen from leucine, isoleucine, lysine.
  • a subject of the invention is also the derivatives of the peptides of formula (I) chosen from its pharmaceutically acceptable salts, the functional fragments of these peptides, the homologous peptides and the chemical analogs of these peptides and certain chemical derivatives of these peptides.
  • at least one of the independent conditions below is met:
  • - Xi represents glycine or lysine
  • - X 2 represents glycine or lysine
  • - X 6 represents leucine or lysine
  • - X 7 represents arginine
  • a subject of the invention is also peptides comprising a sequence according to formula (I), in particular the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2, in which the two cysteine residues are linked by a disulfide bridge, or peptides comprising a functional fragment of these peptides, a homolog, a chemical analog of these peptides or a chemical derivative of these peptides.
  • terminal amino acids preferably the terminal cysteines of the peptide according to formula (I) comprise, for one, a free terminal amine function, and for the other, a free terminal carboxyl function, these two functions each being capable of being involved in a bond peptide with C - terminal acid, respectively the N - terminal amine of another peptide fragment.
  • the subject of the invention is peptides derived from MGD 1, comprising the sequence according to formula (I) in which the two cysteine residues are linked by a disulfide bridge.
  • the invention relates more particularly to peptides corresponding to the sequence SEQ ID NO: 3, in which the two cysteine residues at 25 and 33 are linked by a disulfide bridge, the pharmaceutically acceptable salts of these peptides according to the invention, the functional fragments of these peptides, the homologous sequences, the chemical analogs of these peptides and certain chemical derivatives of these peptides.
  • SEQ ID NO: 3 GFGCPNNYQCHRHCKSIPGRC (S) GGYCGGWHR LRC (S) TCYRCG
  • the invention therefore also extends to peptides having a homology of at least 60%, preferably 70%, even more preferably 80%, preferably in at least 90% and even more favorably at least 95%, or better, at least 98% with the sequence SEQ ID NO: 3 and in which the two cysteines at 25 and 33 form a disulfide bridge.
  • the peptides concerned preferably comprise from 15 to 70 amino acids, even more preferably from 15 to 55 amino acids and advantageously from 15 to 50 amino acids.
  • the subject of the invention is the peptides corresponding to formula (II) below: wherein Yi and Y 2 represent a peptide fragment comprising from 1 to 60 amino acids, preferably from 1 to 40 amino acids and even more preferably from 1 to 15 amino acids; Xi, X 2 , X 3 , X4, X5, X 6 , X 7 have the same definition as above, the pharmaceutically acceptable salts of these peptides, the functional fragments of these peptides, the homologous sequences, the chemical analogs of these peptides and certain chemical derivatives of these peptides.
  • Yi and Y 2 respectively have a homology of at least 60%, preferably 70%, even more preferably 80%, preferably 90% and even more favorably 95% or better 98% with the N-terminal, respectively C-terminal fragment of MGD 1.
  • the term salts refers both to the amine salts of a carboxyl function of the peptide chain as well as to the acid addition salts with an amino group of this same polypeptide chain.
  • the salts of a carboxyl function can be formed with an inorganic or organic base.
  • Inorganic salts include, for example, alkali metal salts such as sodium, potassium and lithium salts; alkaline earth salts such as for example calcium, barium and magnesium salts; ammonium salts, ferrous, ferric salts, zinc, manganese, aluminum, magnesium salts.
  • Salts with organic amines include those formed for example with trimethylamine, triethylamine, tri (n-propyl) amine, dicyclohexylamine, triethanolamine, arginine, lysine, histidine, ethylenediamine, glucosamine , methylglucamine, purines, piperazines, piperidines, caffeine, procaine.
  • Acid addition salts include, for example, salts with mineral acids such as, for example, hydrochloric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid; salts with organic acids such as, for example, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid , malic acid, ascorbic acid, benzoic acid.
  • mineral acids such as, for example, hydrochloric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid
  • salts with organic acids such as, for example, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, citric acid , malic acid, ascorbic acid, benzoic acid.
  • Chemical derivatives of the peptides according to the invention include the alpha-amino peptide compounds, the N-alpha acyl substituted derivatives of the RCO- form, in which R represents a linear, branched alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or aralkyl group , or cyclic comprising from 1 to 50, preferably from 1 to 8 carbon atoms.
  • the preferred N-alpha acyl group is the acetyl group.
  • Such amine-terminal substituents can increase the activity of the peptide by slowing down or preventing the enzymatic degradation of the peptides in vivo.
  • peptides according to the invention include derivatives substituted on the C-terminal acid function by a group chosen from -NH 2 , alkyloxy, alkylthio or alkylamino of the form -OR, -SR or -NHR, in which R represents a group chosen to facilitate the in vivo penetration of the peptides.
  • R can represent an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl chain or an aralkyl group, linear, branched or cyclic comprising from 1 to 50, preferably from 8 to 50 carbon atoms.
  • the peptides according to the invention are amidated on their C-terminal function with -NH 2 .
  • Another kind of chemical derivative of the peptides according to the invention includes derivatives carrying a pliarmacophore substituent, such as a fluorescent group, a photoactivable group, a radiolabelled group or any other group allowing detection by spectroscopy and quantitative evaluation. of the peptide according to the invention in a biological sample without degradation of the biological sample.
  • a pliarmacophore substituent such as a fluorescent group, a photoactivable group, a radiolabelled group or any other group allowing detection by spectroscopy and quantitative evaluation.
  • the amino acids of which the peptides are made up are L enantiomers.
  • one or more amino acids of the peptide sequence can be replaced by its D enantiomer.
  • one or more peptide amide bonds can be replaced by an isostere bond such as: -CH 2 NH-, CH 2 S-, -CH 2 CH 2 -, -CH ⁇ CH- (cis and trans), -COCH 2 -, - CH (OH) CH 2 - and -CH SO-.
  • the peptides derived from the peptides according to the invention in which the two cysteine residues forming the disulfide bridge have been replaced by two tryptophan residues forming a di-tryptophan bridge or by a lanthionine residue forming a mono-sulfide bridge, or by two carrying amino acids, for one of a free acid function (for example a glutamic acid) and for the other a free ine function (for example a lysine) both engaged in a lactam bridge. It is also possible, according to a variant of the invention, to provide that the N-terminal and C-terminal ends of the peptide are engaged in an amide bond in order to cyclize this peptide.
  • the peptides which are the subject of the present invention can be easily obtained by any means known to those skilled in the art, in particular by synthesis.
  • the means used to obtain the peptides which are the subject of the invention will be illustrated in the examples.
  • a subject of the invention is also the linear peptides which are precursors of the peptides with cyclic fragments according to the invention.
  • the subject of the invention is linear peptides whose sequence corresponds to formula (I) or to formula (II), and more particularly the peptides of sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 these peptides linear being precursors of the cyclized peptides comprising the disulfide bridge between the extreme cysteines of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the subject of the invention is also the linear precursor sequences of the functional fragments of the peptides according to the invention, homologous sequences, chemical analogs of the peptides according to the invention and of certain chemical derivatives of these peptides as defined above.
  • a subject of the invention is also the linear peptides whose sequences numbered 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21 and 22 are given in the examples.
  • the invention extends to linear peptides comprising up to 30 amino acids, homologs of SEQ ID NO: 1 or of SEQ ID NO: 2, preferably to peptides comprising of 6 to 20 amino acids, even more preferably of 6 to 15, more preferably still from 7 to 12 amino acids.
  • the invention extends to linear peptides whose amino acid sequence has at least 60% similarity to a peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 or to the sequence SEQ ID NO: 2, even more preferably 70%, even more preferably still 80%, preferably at least 90%, and even more favorably at least 95%, or better, 98% similarity with the sequence SEQ ID NO: 1 or the sequence SEQ ID NO: 2 .
  • a linear peptide which is a precursor of the peptides with a cyclic fragment according to the invention can be obtained by synthesis or by expression in a cell expressing MGDl isolation then modification: cutting of certain peptide bonds and isolation of the fragments comprising SEQ ID NO: 1.
  • the linear peptides which are precursors of the peptides with a cyclic fragment according to the invention can be obtained by expression from a nucleic acid molecule encoding the corresponding peptide.
  • a subject of the invention is therefore also the nucleic acid molecules coding for a peptide of formula (I) or of formula (II), in particular the nucleic acid molecules coding for a peptide of sequence SEQ ID NO: 1 and its homologs , and those encoding the peptide of sequence SEQ ID NO: 2 and its homologs.
  • a nucleic acid molecule coding for a linear peptide according to the invention can be obtained either by chemical synthesis or by cloning from a cell containing a MGD 1 gene or from a cell coding a cDNA corresponding to l 'MGD mRNA l.
  • a nucleic acid molecule according to the invention encoding a precursor of the peptides with a cyclic fragment according to the invention, can be prepared by chemical synthesis on the basis of the amino acid sequence of these peptides and on the knowledge possessed by l skilled in the art of codons corresponding to each amino acid molecule.
  • a nucleic acid molecule encoding a precursor of the peptides with a cyclic fragment according to the invention can be cloned into an appropriate vector, in particular into an expression vector and the corresponding linear peptide can be expressed in a host cell in vitro.
  • an appropriate vector in particular into an expression vector and the corresponding linear peptide can be expressed in a host cell in vitro.
  • a subject of the invention is therefore also vectors containing a nucleic acid molecule encoding a precursor of the peptides with a cyclic fragment according to the invention and host cells comprising these vectors.
  • vectors and host cells capable of being used in the present invention are well known to those skilled in the art and are commercially available.
  • the peptides with a cyclic fragment according to the present invention represent a broad spectrum antimicrobial activity. They are likely to reduce or inhibit the survival or proliferation capacity of many microorganisms: bacteria, fungi, viruses, protozoa. In particular, among the bacteria there may be mentioned Escherichia, Salmonella, Staphylococcus and Listeria. Among the fungi: Cryptococcus, Candida and Fusarium oxysporum.
  • Antimicrobial activity can manifest itself in the form of two distinct actions: microbicide inhibition (bactericide, fungicide, virucide or parasiticide) which consists in destroying or irreversibly damaging the target microorganism; microbiostatic inhibition (bacteriostatic, virostatic, fungistatic or parasitostatic) which consists in reducing or inhibiting the proliferation capacities of the micro-organism without necessarily destroying it.
  • microbicide inhibition bactericide, fungicide, virucide or parasiticide
  • microbiostatic inhibition bacteriostatic, virostatic, fungistatic or parasitostatic
  • the peptides with a cyclic fragment according to the invention being endowed with antimicrobial activity make it possible to reduce or inhibit microbial proliferation or to destroy microorganisms in a given environment.
  • microorganism is meant in particular: viruses, bacteria, fungi, protozoa, helminths and other parasites.
  • the term “environment capable of being treated with the peptides according to the invention” denotes in particular: the tissues and bodily fluids of humans and animals; liquids such as water or aqueous solutions, such as for example disinfectant solutions, solutions for contact lenses, solutions for washing the skin and mucous membranes, solutions for washing the eyes; hygiene; food substances; objects such as for example food utensils, surgical instruments; gases such as for example anesthetic gases used in surgery; a space, such as the walls or floors of public or private spaces such as a hospital, a school, a retirement home.
  • liquids such as water or aqueous solutions, such as for example disinfectant solutions, solutions for contact lenses, solutions for washing the skin and mucous membranes, solutions for washing the eyes; hygiene; food substances; objects such as for example food utensils, surgical instruments; gases such as for example anesthetic gases used in surgery; a space, such as the walls or floors of public or private spaces such as a hospital, a school, a retirement home.
  • a treatment method according to the invention consists in treating an environment, excluding the human or animal body, with an effective amount of a peptide with a cyclic fragment according to the invention, so as to reduce or inhibit the capacity of the or microorganisms to proliferate or survive.
  • the peptides according to the invention can be used as preservatives in food, cosmetics, hygiene products or any other industry using preservatives, as disinfecting agent.
  • the subject of the invention is also a disinfectant composition
  • a disinfectant composition comprising a peptide with a cyclic fragment according to the invention in a support suitable for its destination.
  • the peptides with a cyclic fragment according to the invention can also be used as a medicament. They can be used for the preparation of a therapeutic composition intended for the treatment of infections by microorganisms, in particular against bacteria and fungi.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising a peptide with a cyclic fragment according to the invention in a vehicle suitable for its administration to humans or animals.
  • Food products may, to improve their conservation or to eliminate or prevent the risk of infection by microorganisms, be treated with cyclic fragment peptides according to the invention.
  • Certain food products such as seafood and poultry often harbor endemic pathogenic microorganisms.
  • Fruits, vegetables and seeds can be treated to prevent rotting after harvest.
  • the quantity of peptide with a cyclic fragment to be administered to humans, or to animals or to any environment capable of being treated depends on the activity specific to this peptide, activity which can be measured by means which will be explained in the examples. It also depends on the degree of the infection to be treated.
  • the peptide with a cyclic fragment according to the invention can be administered alone or in combination with other antimicrobial agents.
  • AMS 422. Abimed AMS 422.
  • the peptides were deprotected and released from the resin by treatment with trifluoroacetic acid (TFA). They were then lyophilized and their purity estimated by HPLC on a C ⁇ 8 column (Waters) with elution in water-acetonitrile in the presence of 0.1% TFA and detection at 260 and 220 nm. Their molecular mass was determined by mass spectrometry in Maldi-Tof (Matrix assisted laser desorption ionization-time offlighi) on a Voyager Elite DE-RP device, DHB Matrix.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the activity of synthetic peptides was tested against Gram + bacteria Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Bacillus megaterium. The activities were determined according to the protocol described by HANCOCK et al. (http://www.interchg.ubc.ca/bobh/methods.htm) Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
  • the MIC was determined for each peptide by inhibition of growth in a liquid medium.
  • the peptide was diluted 2 by 2 in the wells of a Microtest plate in a volume of 10 ⁇ l.
  • the bacteria were grown in MUELLER HINTON BROTH liquid medium (MHB Difco). During the growth phase exponential, a solution of optical density 0.001 at 600 nm was made and 100 ⁇ l of this suspension were added to each well. The incubation lasted 24 h at 30 ° C., then the optical densities of each well were measured at 600 nm. The MIC value corresponds to the first well for which the optical density had not changed.
  • Minimum Bactericidal Concentration (CMB) Minimum Bactericidal Concentration
  • the CMB was determined on Petri dishes containing MUELLER HINTON AGAR (MHA Difco) solid medium by spreading the content of the wells corresponding to the first 3 dilutions for which no bacterial growth had been observed after 24 h of incubation. The dishes were incubated for 24 h at 30 ° C. The CMB value corresponds to the lowest concentration of the peptide for which no colony has developed.
  • the antifungal activity was determined by calculation of the MIC in a growth inhibition test of the parasitic fungus of shrimp, Fusarium oxysporum, in the liquid phase, according to the protocol described by FELHBAM et al. (J. Biol. Chem., 1994, 269: 33159-63). Each peptide was diluted 2 by 2 in the wells of a Microtest plate in a volume of 10 ⁇ l. 90 ⁇ l of spores resuspended in POTATO DEXTROSE BROTH medium (DIFCO) at a final concentration of 10 4 spores / ml were added to each well.
  • DIFCO POTATO DEXTROSE BROTH medium
  • Defensin MGDl It is a small cationic protein of 4 kDa comprising 39 amino acids, isolated from the plasma and hemocytes of the mold Mytilus galloprovincialis (Hubert et al. 1996, Eur. J. Biochem. 240_; 302- 6; Charlet et al, 1996, J. Biol. Chem. 271: 21808-13; Mitta et al, 1999, J. Cell. Sci, 112; 4233-42).
  • the MGDl sequence is illustrated in Figure 1.
  • the three-dimensional structure of the molecule established by proton magnetic resonance (Yang et al. 2000 Biochemistry, 39: 14436-47) illustrated in Figure 2 consists of an ⁇ helix and 2 antiparallel ⁇ sheets giving it a structure commonly called stabilized Cs ( ⁇ ) also observed in scorpion toxins.
  • the molecule has a distribution of positive charges localized over 3 domains and a hydrophobic side chain.
  • This peptide has antibacterial activity against Gram + bacteria and antifungal activity.
  • Seventeen peptides corresponding to fragments of the MGD 1 sequence were synthesized according to methods well known to those skilled in the art set out above. These peptides have been tested for their antimicrobial activity and their antifungal activity. The results of these tests are set out in Tables I and II.
  • Sequences 14 and 15 show no activity. - The elements corresponding to the ⁇ sheets (devoid of the loop) do not contain intrinsic activity: sequence 16.
  • SEQ ID NO: 4 SGGYC (S) GG HRLRC (S) SEQ ID NO: 5 C (S) GGYSGGWHRLRSTSYRC (S) G SEQ ID NO: 6 SGGYO s) GGWHRLRC (s) TSYRSG SEQ ID NO: 7.
  • K The substitution of histidine and leucine by 2 lysines (K) increases the activity (SEQ ID NO: 2).
  • the measured biological activity of the active molecule relates to the Gram + bacteria (Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium and Bacillus epidermidis) and to the filamentous fungus (Fusarium oxysporum) (Table 2).
  • This activity is localized on the loop formed by amino acids 25-33 of primary structure (CGGWHRLRC) provided that an unnatural disulfide bridge is made between amino acids 25 and 33.
  • the antibacterial power of this structure is increased by strengthening its cationic nature by substitution of histidine 29 and leucine 31 with two lysines.
  • Table II are collected the results of MIC and MBC activity (in ⁇ M) of the peptide fragments derived from MGDl defensin on a few bacterial strains (Gram +) and on a filamentous fungus.
  • Tests have been undertaken using the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in order to determine the impact on the biological activity of these peptides of an amino acid substitution by another amino acid of the same class or not and a decrease in the size of these peptides. These sequences have been numbered 19 to 24. Their sequence and their biological activity are described in Table III.
  • sequences 19 to 23 are endowed with an interesting activity, although weaker for sequence 23.
  • sequence No. 24 does not exhibit significant biological activity.
  • Sequences 19 to 23 constitute another object of the invention.

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Abstract

Composés choisis parmi: - les peptides répondant à la formule (I): C(S)-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C(S) dans laquelle: - les deux résidus cystéines sont reliés par un pont disulfure, représenté par le symbole C(S), -X1, X2, X3, X4, X5, X6 et X7, représentent des acides aminés choisis parmi une liste déterminée ainsi que: - les dérivés de ces peptides. L'invention a également pour objet les compositions les comprenant ainsi que leur utilisation comme agents anti-microbiens.

Description

NOUVEAUX PEPTIDES CYCLIQUES, LEUR UTILISATION COMME AGENTS
ANTI-MICROBIENS
La présente invention a pour objet de nouveaux agents antimicrobiens, et plus particulièrement des peptides de faible poids moléculaire dérivés de la défensine de la moule méditerranéenne ou Mytilus galloprovincialis. Elle concerne également un procédé pour leur préparation et leurs applications, notamment leur utilisation pour la préparation d'un médicament.
La découverte des antibiotiques a sans aucun doute été l'une des plus belles réussites médicales du XXième siècle. Aujourd'hui plus de 150 antibiotiques sont commercialisés et des dizaines de nouveaux composés sont en cours d'homologation. Cependant, la plupart des antibiotiques ne correspondent qu'à une demi-douzaine de familles différentes et les nouvelles molécules ne sont en fait que des variantes de composés déjà connus (Breihaupt, 1999, Nature 17 ; 1165-9). Ces familles de molécules ne permettent plus de neutraliser l'émergence de nouveaux pathogènes mutants résistants aux antibiotiques. En milieu hospitalier la situation est alarmante : les infections nosocomiales peuvent affecter 10% des patients et s'avérer extrêmement redoutables chez les malades atteints par le virus de rimmunodéficience humaine ou HIV, ou chez les individus en situation d'immuno- suppression, notamment à la suite de transplantations ou lors de traitements anticancéreux.
En aquaculture, les progrès zootechniques focalisés sur l'accroissement des productions (Mollusques bivalves et Crustacés) ont pour conséquence la création de conditions favorables à l' apparition et au développement des maladies bactériennes, virales et parasitaires. De plus, l'augmentation parfois excessive des densités d'élevages peut affecter l'état physiologique et immunitaire des animaux qui deviennent alors plus sensibles aux agents pathogènes ou opportunistes. On cherche actuellement à obtenir une meilleure prophylaxie des individus contre ces maladies.
L'identification de composés nouveaux dérivés de plantes et d'animaux susceptibles d'être des agents antimicrobiens permet d'envisager le développement de nouveaux médicaments. Les peptides anti-microbiens cationiques en particulier représentent une voie de développement très intéressante. Depuis la découverte du 1er peptide antimicrobien, la cécropine, chez le
Lépidoptère Hyalophora cecropia par l'équipe de Hans Boman (Steiner et al, 1981, Nature 292. 246-248), plus de 400 peptides antimicrobiens ont été identifiés à partir de différents organismes, dont la moule Mytilus edulis (Charlet et al, 1999, J. Biol. Chem. 271 ; 21808-13) et Mytilus galloprovincialis (Hubert et al, 1996, Eur. J. Biochem. 240 ; 302-6 ; Mitta et al, 1999, J. Cell. Sci., 112 ; 4233-42) ; ces peptides à activité antimicrobienne homologues de défensines d'arthropodes ont été décrits. Leur originalité réside dans leur mode d'action puisqu'il est différent de celui des antibiotiques conventionnels. Même si leur mode d'action n'est pas clairement élucidé, il est admis que les peptides antibactériens cationiques tuent les micro-organismes en désorganisant ou en perforant les membranes cytoplasmiques (Maloy et Kari, 1995, Biopolymers 37:105-22 ; Falla et al, 1996, J. Biol. Chem. 27J_:19298-303 ; Epand et Vogel, 1999, Biochim. Biophys Acta 1462:11-28). Leur spécificité d'action repose sur les différences de composition et de propriétés physico-chimiques qui différencient les membranes microbiennes des membranes des cellules eucaryotes (Friedrich et al, 2000, Antimicrob. Agents Chemoth, 44:2086-2092). Il s'agit d'un phénomène généralement rapide, irréversible et qui par sa nature même, diminue le risque de voir apparaître des individus résistants ; ceci constitue un atout important dans la perspective du développement de nouveaux antibiotiques.
Par le document US-5,821,224, on connaît des peptides antimicrobiens riches en cystéines, dérivés de neutrophiles bovins, appelés beta-défensines. Parmi les peptides étudiés dans ce document, il est apparu que ceux comportant l'extrémité
N-terminale de la défensine naturelle présentaient le profil d'activité antimicrobien le plus intéressant.
Le document WO 98/40091 décrit des peptides antimicrobiens dont la séquence est issue des séquences d'acides aminés des défensines et bacténécines naturelles.
Le document WO 01/09175 décrit des peptides antimicrobiens issus d'une défensine de plante dont la séquence est modifiée pour être soit enrichie en résidus cystéines, soit appauvrie en résidus susceptibles de former des ponts disulfures.
Le document WO 01/09174 décrit des peptides antimicrobiens dérivés de défensines végétales par substitution d'un ou plusieurs acides aminés.
Le document WO 00/68625 décrit des peptides cycliques nommés défensines thêta, dotés d'une activité antimicrobienne. Ces peptides sont dérivés de peptides linéaires naturels ou modifiés et cyclisés par formation d'une liaison peptidique entre l'aminé N-terminale et le carbone C - terminal. Des peptides cyclisés de cette façon n'offrent pas de prise à l'action des exopeptidases et sont donc susceptibles de présenter une résistance à la protéol se supérieure à celle des peptides naturels.
De nouvelles classes de molécules susceptibles de traiter les infections microbiennes sont donc apparues. Toutefois, on recherche toujours des molécules susceptibles de traiter ces infections, car des résistances apparaissent au fur et à mesure que des traitements sont développés. En outre, on recherche toujours plus d'efficacité et de sélectivité vis-à-vis des micro-organismes visés. La présente invention a pour but de fournir des molécules nouvelles présentant un spectre d'activité antimicrobien intéressant et présentant des propriétés inattendues par rapport à celles des molécules de l'art antérieur. En outre, les molécules selon l'invention peuvent être préparées facilement à un coût qui permet d'envisager une production industrielle et commerciale.
L'invention a pour objet de nouveaux peptides cycliques, ou comportant un fragment cyclique, ainsi que certains de leurs dérivés chimiques, qui présentent une activité antimicrobienne, en particulier antibactérienne et antifongique, ces peptides comportant un pont non naturel, de préférence un pont disulfure, ces peptides étant issus de la défensine de Mytilus galloprovincialis notée MGD l'
La défensine de Mytilus galloprovincialis, MGD 1, est connue pour son activité anti-microbienne (Hubert et al., 1996, Eur. J. Biochem., 240:302-6 ; Mitta et al., 1999, J. Cell. Sci., 112, 4233-42). Toutefois, l'utilisation de la MGD 1 native comme agent antimicrobien se heurte à une difficulté importante : son extraction et sa purification à partir de la moule sont difficiles à obtenir avec un rendement satisfaisant.
Par ailleurs, la synthèse chimique s'effectue avec un rendement global très mauvais à cause de la difficulté à former les 4 ponts disulfures. Le premier peptide selon l'invention répond à la séquence SEQ ID NO:l
C(S)GGWHRLRC(S) dans laquelle les deux résidus cysteine sont liés par un pont disulfure.
L'invention a également pour objet des homologues du peptide SEQ ID NO:l et certains dérivés chimiques de ce peptide. Par homologues, on entend au sens de la présente invention des peptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec la séquence
SEQ ID NO:l, encore plus préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO:l, étant entendu que les séquences concernées comportent un résidu cysteine à chacune de leurs extrémités, ces résidus cystéines terminaux étant liés par un pont disulfure.
Par similarité de X% entre un peptide P et la séquence SEQ ID NO:l, on entend que : lorsque la séquence de P est alignée face à SEQ ID NO:l, dans le même sens, X% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de SEQ ID NO:l ou sont remplacés par un acide aminé de même classe, étant entendu que si les séquences ne sont pas de même longueur, on placera un espace entre les acides aminés de la séquence concernée. Le degré d'homologie peut être évalué par des méthodes bien connues de l'homme du métier (par exemple, WILBUR W. J. et al Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80, 726-730 (1983) ; MYERS et al, Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17 (1988)). Au sens de la présente invention l'homologie avec la SEQ ID NO:l s'étend aux peptides comportant de 6 à 15 acides aminés et dont la séquence, une fois alignée avec SEQ ID NO:l, avec les espaces placés entre les acides aminés appropriés, possède une similarité comprise dans les valeurs indiquées ci-dessus. Préférentiellement, l'homologie s'étend aux peptides comportant de 7 à 12 acides aminés, encore plus préférentiellement de 8 à 11 acides aminés.
Par acides aminés de même classe on entend un acide aminé possédant des propriétés chimiques sensiblement identiques.
En particulier, on entend par ce terme des acides aminés ayant sensiblement la même charge, et/ou la même taille, et/ou la même hydrophilie ou hydrophobie, et/ou la même aromaticité.
De tels regroupements d'acides aminés incluent généralement :
(i) glycine, alanine, valine,
(ii) isoleucine, îeucine,
(iii) tryptophane, tyrosine, (iv) acide aspartique, acide glutamique,
(v) arginine, lysine, histidine,
(vi) asparagine, glutamine,
(vii) serine, thréonine,
(viii) proline, phénylalanine. D'autres substitutions d'acides aminés peuvent être envisagées au sens de la présente invention dans lesquelles on remplace un acide aminé par un autre acide aminé de même classe, c'est-à-dire possédant des propriétés comparables, l'acide aminé de substitution étant un acide aminé non naturel.
C'est le cas, par exemple, des énantiomères et des diastéréoisomères des acides aminés naturels, de l'hydroxyproline, de la norleucine, de l'omithine, de la citruline, de la cyclohexylalanine, des acides Ω-aminés tels que l'acide 3-propionique et l'acide 4-butyrique. De tels acides aminés sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être préparés par des méthodes connues. Sont également inclues dans la présente invention les substitution d'un ou plusieurs acides aminés par un acide aminé non naturel porteur d'un préparés par des méthodes connues. Sont également inclues dans la présente invention les substitutions d'un ou plusieurs acides aminés par un acide aminé non naturel porteur d'un groupement permettant la détection du peptide, tels qu'un acide aminé porteur d'un groupement fluorescent ou un acide aminé radiomarqué. Un exemple particulier d'homologue est constitué par les fragments fonctionnels des peptides selon l'invention : ce sont des peptides répondant à l'une des séquences selon l'invention dans lesquelles un ou plusieurs acides aminés sont ôtés de la séquence mais qui conservent une activité bactéricide comparable à celle décrite pour MGD1, en particulier une concentration minimale inhibitrice inférieure à 75 μM vis-à-vis d'au moins un micro-organisme bactérien. Les fragments fonctionnels préférés des peptides selon l'invention sont ceux pour lesquels au plus deux acides aminés sont ôtés. Encore plus préférentiellement, ceux pour lesquels un acide aminé est ôté.
Habituellement, des substitutions d'acides aminés de même classe permettent de conserver au peptide son activité antimicrobienne. Des substitutions appropriées pourront être déterminées en testant les propriétés antimicrobiennes des peptides obtenus en utilisant des tests d'activité tels que ceux décrits ci-après. L'invention concerne plus spécifiquement des molécules ayant une concentration minimale inhibitrice inférieure à 75μM vis-à-vis d'au moins un micro-organisme bactérien.
En particulier, dans la présente invention, la substitution de l'histidine et de la leucine de SEQ ID NO:l par deux lysines ont permis d'obtemr un peptide de séquence SEQ ID NO:2 comprenant un pont disulfure entre les deux cystéines, ce peptide cyclique ayant un pouvoir antibactérien supérieur à celui du peptide cyclique de séquence SEQ ID NO:l.
SEQ ID NO:2 : C(S)GGWKRKRC(S) L'invention a donc également pour objet un peptide de séquence
SEQ ID NO:2 dans lequel les deux résidus cystéines sont engagés dans un pont disulfure, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables, les fragments fonctionnels de ce peptide, les peptides homologues et les analogues chimiques de ce peptide et certains dérivés chimiques de ce peptide. En particulier l'invention s'étend aux peptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec un peptide répondant à la séquence SEQ ID NO:2, encore plus préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO:2, ladite séquence comportant un résidu cysteine à chacune de ses extrémités, ces résidus cystéines terminaux étant liés par un pont disulfure.
De manière plus générale, l'invention a pour objet des peptides répondant à la formule (I) ci-dessous : C(S)-Xι-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C(S) (I) dans laquelle :
- les deux résidus cystéines sont reliés par un pont disulfure, représenté par le symbole C(S),
-Xi et X2, identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi la glycine, la valine, l' alanine, la lysine,
- X3 représente un acide aminé choisi parmi le tryptophane et la tyrosine,
- X , X5 et X7, identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi l'histidine, l'arginine, la lysine,
- X6 représente un acide aminé choisi parmi la leucine, l'isoleucine, la lysine.
L'invention a également pour objet les dérivés des peptides de formule (I) choisis parmi ses sels pharmaceutiquement acceptables, les fragments fonctionnels de ces peptides, les peptides homologues et les analogues chimiques de ces peptides et certains dérivés chimiques de ces peptides. Préférentiellement, selon l'invention, une au moins des conditions indépendantes ci-dessous est remplie :
- Xi représente la glycine ou la lysine
- X2 représente la glycine ou la lysine
- X3 représente le tryptophane - représente l'histidine ou la lysine,
- X5 représente l'arginine,
- X6 représente la leucine ou la lysine,
- X7 représente l'arginine.
Préférentiellement, plusieurs des conditions ci-dessus sont remplies. L'invention a également pour objet des peptides comprenant une séquence selon la formule (I), notamment la séquence SEQ ID NO:l ou la séquence SEQ ID NO : 2, dans laquelle les deux résidus cysteine sont reliés par un pont disulfure, ou des peptides comprenant un fragment fonctionnel de ces peptides, un homologue, un analogue chimique de ces peptides ou un dérivé chimique de ces peptides. En effet, les acides aminés terminaux, de préférence les cystéines terminales du peptide selon la formule (I) comportent, pour l'un, une fonction aminé terminale libre, et pour l'autre, une fonction carboxyle terminale libre, ces deux fonctions étant chacune susceptibles d'être engagées dans une liaison peptidique avec l'acide C - terminal, respectivement l'aminé N - terminale d'un autre fragment de peptide. En particulier, l'invention a pour objet des peptides dérivés de MGD 1, comportant la séquence selon la formule (I) dans laquelle les deux résidus cysteine sont reliés par un pont disulfure.
L'invention concerne plus particulièrement des peptides répondant à la séquence SEQ ID NO:3, dans lesquels les deux résidus cysteine en 25 et 33 sont reliés par un pont disulfure, les sels pharmaceutiquement acceptables de ces peptides selon l'invention, les fragments fonctionnels de ces peptides, les séquences homologues, les analogues chimiques de ces peptides et certains dérivés chimiques de ces peptides.
SEQ ID NO :3 : GFGCPNNYQCHRHCKSIPGRC(S)GGYCGGWHR LRC(S)TCYRCG L'invention s'étend donc également aux peptides présentant une homologie d'au moins 60%, préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement 80%, de manière préférée au moins 90% et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, au moins 98% avec la séquence SEQ ID NO:3 et dans lesquels les deux cystéines en 25 et 33 forment un pont disulfure. Les peptides concernés comprennent de préférence de 15 à 70 acides aminés, encore plus préférentiellement de 15 à 55 acides aminés et avantageusement de 15 à 50 acides aminés.
En particulier, l'invention a pour objet les peptides répondant à la formule (II) ci-dessous : dans laquelle Yi et Y2 représentent un fragment peptidique comprenant de 1 à 60 acides aminés, préférentiellement de 1 à 40 acides aminés et encore plus préférentiellement de 1 à 15 acides aminés ; Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7 ont la même définition que ci-dessus, les sels pharmaceutiquement acceptables de ces peptides, les fragments fonctionnels de ces peptides, les séquences homologues, les analogues chimiques de ces peptides et certains dérivés chimiques de ces peptides.
De préférence Yi et respectivement Y2 ont une homologie d'au moins 60%, préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement 80%, de manière préférée 90% et encore plus favorablement 95% ou mieux 98% avec le fragment N-terminal, respectivement C-terminal de MGD 1.
Selon l'invention, le terme sels se rapporte à la fois aux sels d'aminé d'une fonction carboxyle de la chaîne peptidique aussi bien qu'aux sels acides d'addition à un groupe aminé de cette même chaîne polypeptidique. Les sels d'une fonction carboxyle peuvent être formés avec une base inorganique ou organique. Les sels inorganiques incluent par exemple les sels de métaux alcalins tels que les sels de sodium, de potassium et de lithium ; les sels alcalino-terreux tels que par exemple les sels de calcium, de barium et de magnésium ; les sels d'ammonium, les sels ferreux, ferriques, les sels de zinc, de manganèse, d'aluminium, de magnésium. Les sels avec des aminés organiques incluent ceux formés par exemple avec la triméthylamine, la triéthylamine, la tri(n-propyl)amine, la dicyclohexylamine, la triéthanolamine, l'arginine, la lysine, l'histidine, l'éthylènediamine, la glucosamine, la méthylglucamine, les purines, les pipérazines, les pipéridines, la cafféine, la procaine. Les sels d'addition acides incluent, par exemple, les sels avec des acides minéraux tels que par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bro hydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide nitrique ; les sels avec des acides organiques tels que par exemple, l'acide acétique, l'acide oxalique, l'acide tartarique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide malique, l'acide ascorbique, l'acide benzoïque.
Des dérivés chimiques des peptides selon l'invention incluent les composés des-alpha amino peptides, les dérivés N-alpha acyl substitués de la forme RCO-, dans laquelle R représente un groupement alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou aralkyle, linéaire, ramifié, ou cyclique comprenant de 1 à 50, préférentiellement de 1 à 8 atomes de carbone. Le groupement N-alpha acyle préféré est le groupement acétyle. De tels substituants amine-terminaux peuvent augmenter l'activité du peptide en ralentissant ou en empêchant la dégradation enzymatique des peptides in vivo.
D'autres dérivés chimiques des peptides selon l'invention incluent les dérivés substitués sur la fonction acide C-terminale par un groupement choisi parmi -NH2, les alkyloxy, alkylthio ou alkylamino de la forme -OR, -SR ou -NHR, dans lesquels R représente un groupe choisi pour faciliter la pénétration in vivo des peptides. Par exemple, R peut représenter une chaîne alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou un groupement aralkyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 1 à 50, préférentiellement de 8 à 50 atomes de carbone. Préférentiellement, les peptides selon l'invention sont amidés sur leur fonction C-terminale par -NH2.
Une autre sorte de dérivé chimique des peptides selon l'invention inclut les dérivés porteurs d'un substituant pliarmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection par spectroscopie et l'évaluation quantitative du peptide selon l'invention dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
Préférentiellement, selon l'invention, les acides aminés dont sont constitués les peptides sont des énantiomères L. Toutefois, un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique peut être remplacé par son énantiomère D.
Au titre des analogues chimiques, dans les peptides selon l'invention, une ou plusieurs liaisons amides peptidiques (-CO-NH-) peuvent être remplacées par une liaison isostère telle que : -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2-, -CH≈CH- (cis et trans), -COCH2-, - CH(OH)CH2- et -CH SO-. Cette substitution peut être faite par des méthodes bien connues de l'homme du métier (on peut se reporter par exemple à : SPATOLA, Vega Data, Vol.l, issue 3 (1983) ; SPATOLA, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins, Weinstein, éd., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983) . MORLEY.J.-S., Trends Pharm. Sci., 463-468 (1980) ; HUDSON et al, Int. J. Pept. Prot. Res. 14, 177-185 (1979) SPATOLA et al, Life Sci., 38, 1243-1249 (1986) ; Hann, J.Chem. Soc. Perkin Trans.I 307-314 (1982) ; ALMQUIST et al, J. Med. Chem., 23, 1392-1398 (1980) ; JENNINGS-WHITE et al, EP- 45665 ; HOLLADAY et al, Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (1983) . HRUBY et al, Life Sci. 31, 189-199 (1982)).
En outre, sont inclus dans la présente invention, au titre d'analogues chimiques, les peptides dérivés des peptides selon l'invention, dans lesquels les deux résidus cystéines formant le pont disulfure ont été remplacés par deux résidus tryptophanes formant un pont di-tryptophane ou par un résidu lanthionine formant un pont mono-sulfure, ou par deux acides aminés porteurs, pour l'un d'une fonction acide libre (par exemple un acide glutamique) et pour l'autre une fonction a iné libre (par exemple une lysine) engagés tous deux dans un pont lactame. On peut également, selon une variante de l'invention, prévoir que les extrémités N-terminale et C-terminale du peptide soient engagées dans une liaison amide pour cycliser ce peptide.
Les peptides objets de la présente invention peuvent être aisément obtenus par tous moyens connus de l'homme du métier, notamment par voie de synthèse. Les moyens employés pour obtenir les peptides objets de l'invention seront illustrés dans les exemples. L'invention a également pour objet les peptides linéaires précurseurs des peptides à fragments cycliques selon l'invention.
En particulier, l'invention a pour objet les peptides linéaires dont la séquence répond à la formule (I) ou à la formule (II), et plus particulièrement les peptides de séquence SEQ ID NO:l et SEQ ID NO:2 ces peptides linéaires étant des précurseurs des peptides cyclisés comportant le pont disulfure entre les cystéines extrêmes de SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:2. L'invention a également pour objet les séquences linéaires précurseurs des fragments fonctionnels des peptides selon l'invention, des séquences homologues, des analogues chimiques des peptides selon l'invention et de certains dérivés chimiques de ces peptides tels que définis plus haut.
L'invention a également pour objet les peptides linéaires dont les séquences numérotées 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21 et 22 sont données dans les exemples.
L'invention s'étend aux peptides linéaires comportant jusqu'à 30 acides aminés, homologues de SEQ ID NO:l ou de SEQ ID NO:2, de préférence aux peptides comportant de 6 à 20 acides aminés, encore plus préférentiellement de 6 à 15, plus préférentiellement encore de 7 à 12 acides aminés.
En particulier l'invention s'étend aux peptides linéaires dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec un peptide répondant à la séquence SEQ ID NO:l ou à la séquence SEQ ID NO:2, encore plus préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec la séquence SEQ ID NO:l ou la séquence SEQ ID NO:2.
Un peptide linéaire précurseur des peptides à fragment cyclique selon l'invention, peut être obtenu par voie de synthèse ou par expression dans une cellule exprimant MGDl isolement puis modification : coupure de certaines liaisons peptidiques et isolement des fragments comportant SEQ ID NO:l.
Il peut aussi être exprimé par une molécule d'acide nucléique recombinant.
Le peptide linéaire ainsi obtenu par des méthodes bien connues de l'homme du métier est ensuite traité dans des conditions d'oxydation appropriées pour former le pont disulfure entre les deux résidus cysteine de SEQ ID NO:l ou de son homologue. Dans le cas où le pont est d'un autre type qu'un pont di-sulfure, l'homme du métier saura adapter la méthode de cyclisation au composé concerné.
Les peptides linéaires précurseurs des peptides à fragment cyclique selon l'invention peuvent être obtenus par expression à partir d'une molécule d'acide nucléique codant le peptide correspondant. L'invention a donc également pour objet les molécules d'acides nucléiques codant un peptide de formule (I) ou de formule (II), en particulier les molécules d'acides nucléiques codant un peptide de séquence SEQ ID NO:l et ses homologues, et celles codant le peptide de séquence SEQ ID NO:2 et ses homologues. Une molécule d'acide nucléique codant un peptide linéaire selon l'invention peut être obtenue soit par voie de synthèse chimique, soit par clonage à partir d'une cellule contenant un gène de MGD 1 ou d'une cellule codant un ADNc correspondant à l'ARNm de MGD l.
Une molécule d'acide nucléique selon l'invention, codant un précurseur des peptides à fragment cyclique selon l'invention, peut être préparée par synthèse chimique en se fondant sur la séquence d'acides aminés de ces peptides et sur la connaissance que possède l'homme du métier des codons correspondant à chaque molécule d'acide aminé.
Une molécule d'acide nucléique codant un précurseur des peptides à fragment cyclique selon l'invention peut être clonée dans un vecteur approprié, en particulier dans un vecteur d'expression et le peptide linéaire correspondant peut être exprimé dans une cellule hôte in vitro. On peut par ce moyen obtenir de grandes quantités des précurseurs de peptide à fragment cyclique selon l'invention.
L'invention a donc également pour objet des vecteurs contenant une molécule d'acide nucléique codant un précurseur des peptides à fragment cyclique selon l'invention et des cellules hôtes comprenant ces vecteurs.
Les vecteurs et les cellules hôtes susceptibles d'être utilisés dans la présente invention sont bien connus de l'homme du métier et disponibles commercialement.
Les peptides à fragment cyclique selon la présente invention représentent une activité antimicrobienne à large spectre. Ils sont susceptibles de réduire ou d'inhiber la survie ou la capacité de prolifération de nombreux micro-organismes : bactéries, champignons, virus, protozoaires. En particulier, parmi les bactéries on peut citer Escherichia, Salmonella, Staphylococcus et Listeria. Parmi les champignons : Cryptococcus, Candida et Fusarium oxysporum.
L'activité antimicrobienne peut se manifester sous la forme de deux actions distinctes : l'inhibition microbicide (bactéricide, fongicide, virucide ou parasiticide) qui consiste à détruire ou endommager irréversiblement le micro-organisme cible ; l'inhibition microbiostatique (bactériostatique, virostatique, fongistatique ou parasitostatique) qui consiste à réduire ou inhiber les capacités de prolifération du micro-organisme sans nécessairement le détruire. Les peptides à fragment cyclique selon l'invention étant dotés d'une activité antimicrobienne permettent de réduire ou d'inhiber la prolifération microbienne ou de détruire les microorganismes dans un environnement donné. Par microorganisme, on entend en particulier : les virus, les bactéries, les champignons, les protozoaires, les helminthes et autres parasites. Par environnement susceptible d'être traité par les peptides selon l'invention on désigne en particulier : les tissus et les fluides corporels de l'homme et de l'animal ; les liquides tels que l'eau ou les solutions aqueuses, comme par exemple des solutions désinfectantes, des solutions pour lentilles de contact, des solutions pour le lavage de la peau et des muqueuses, des solutions pour le lavage des yeux ;des articles d'hygiène ; des substances alimentaires ; des objets tels que par exemple des ustensiles alimentaires, des instruments de chirurgie ; des gaz tels que par exemple des gaz anesthésiques utilisés en chirurgie ; un espace, tel que les murs ou les sols d'espaces publics ou privés comme par exemple un hôpital, une école, une maison de retraite.
Un procédé de traitement selon l'invention consiste à traiter un environnement, à l'exclusion du corps humain ou animal, avec une quantité efficace d'un peptide à fragment cyclique selon l'invention, de façon à réduire ou inhiber la capacité du ou des micro-organismes à proliférer ou à survivre.
Les peptides selon l'invention peuvent être utilisés comme agents conservateurs dans l'alimentation, la cosmétique, les produits d'hygiène ou tout autre industrie utilisant des agents conservateurs, comme agent désinfectant.
L'invention a en outre pour objet une composition désinfectante comprenant un peptide à fragment cyclique selon l'invention dans un support approprié à sa destination.
Les peptides à fragment cyclique selon l'invention peuvent également être utilisés comme médicament. Il peuvent être utilisés pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au traitement des infections par les micro-organismes, en particulier contre les bactéries et les champignons.
Dans ce cas, ils sont associés à un support pharmaceutiquement acceptable. Le choix du support et des adjuvants sera guidé par le mode d'administration qui sera adapté en fonction du type d'infection à traiter et de sa localisation. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un peptide à fragment cyclique selon l'invention dans un véhicule approprié pour son administration à l'homme ou à l'animal.
Les produits alimentaires peuvent, pour améliorer leur conservation ou pour éliminer ou prévenir le risque d'infection par des micro-organismes, être traités par des peptides à fragment cyclique selon l'invention. Certains produits alimentaires tels que les fruits de mer et la volaille abritent souvent des micro-organismes pathogènes de façon endémique. Les fruits, les légumes et les graines peuvent être traités pour éviter leur pourrissement après récolte. La quantité de peptide à fragment cyclique à administrer à l'homme, ou à l'animal ou à tout environnement susceptible d'être traité dépend de l'activité propre à ce peptide, activité qui peut être mesurée par des moyens qui seront exposés dans les exemples. Elle dépend également du degré de l'infection à traiter.
Le peptide à fragment cyclique selon l'invention peut être administré seul ou en association avec d'autres agents antimicrobiens.
Les exemples ci-dessous feront mieux comprendre l'invention. EXEMPLES
I- PROTOCOLES EXPERIMENTAUX A- Synthèse des peptides La synthèse a été réalisée par chimie Fmoc sur un synthétiseur
Abimed AMS 422. Les peptides ont été déprotégés et libérés de la résine par traitement à l'acide trifluoroacétique (TFA). Ils ont ensuite été lyophilisés et leur pureté estimée par HPLC sur colonne Cι8 (Waters) avec élution en eau-acétonitrile en présence de 0,1 % de TFA et détection à 260 et 220 nm. Leur masse moléculaire a été déterminée par spectrométrie de masse en Maldi-Tof (Matrix assisted laser desorption ionisation-time offlighi) sur un appareil Voyager Elite DE-RP, Matrice DHB. La formation du ou des ponts disulfures a eu lieu dans une solution de DMSO à 20% dans du tampon acétate d'ammonium (50 mM, pH 7,5) par agitation douce durant 48 h à température ambiante. L'état d'oxydation a été vérifié en spectrométrie de masse comme précédemment. B- Tests d'activités anti bactériennes
L'activité des peptides synthétiques a été testée vis-à-vis des bactéries à Gram+ Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et Bacillus megaterium. Les activités ont été déterminées selon le protocole décrit par HANCOCK et al. (http://www.interchg.ubc.ca/bobh/methods.htm) Concentration Minimale Inhibitrice (CMI)
La CMI a été déterminée pour chaque peptide par inhibition de croissance en milieu liquide. Le peptide a été dilué de 2 en 2 dans les puits d'une plaque Microtest sous un volume de 10 μl. Les bactéries ont été mises à croître dans du milieu liquide MUELLER HINTON BROTH (MHB Difco). Lors de la phase de croissance exponentielle, une solution de densité optique 0,001 à 600 nm a été réalisée et 100 μl de cette suspension ont été ajoutés à chaque puits. L'incubation a duré 24 h à 30°C, puis les densités optiques de chaque puits ont été mesurées à 600 nm. La valeur de la CMI correspond au premier puits pour lequel la densité optique n'avait pas changé. Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
La CMB a été déterminée sur boites de Pétri contenant du milieu solide MUELLER HINTON AGAR (MHA Difco) en étalant le contenu des puits correspondant aux 3 premières dilutions pour lesquelles on n'avait observé aucune croissance bactérienne au bout des 24 h d'incubation. Les boîtes ont été incubées 24 h à 30°C. La valeur de la CMB correspond à la plus faible concentration du peptide pour laquelle aucune colonie ne s'est développée.
C - Test d'activité antifongique
L'activité antifongique a été déterminée par calcul de la CMI dans un test d'inhibition de croissance du champignon parasite des crevettes, Fusarium oxysporum, en phase liquide, selon le protocole décrit par FELHBAM et al. (J. Biol. Chem., 1994, 269:33159-63). Chaque peptide a été dilué de 2 en 2 dans les puits d'une plaque Microtest sous un volume de 10 μl. 90 μl de spores resuspendues dans du milieu POTATO DEXTROSE BROTH (DIFCO) à une concentration finale de 104 spores/ml ont été ajoutés à chaque puits. L'inhibition de croissance a été mesurée après une incubation de 24 h à 25°C à l'obscurité, par observation au microscope optique et mesure de l'augmentation de la DO à 600 nm. La valeur de la CMI correspond au premier puis pour lequel la densité optique n'avait pas augmenté. La défensine MGDl : Il s'agit d'une petite protéine cationique de 4 kDa comprenant 39 acides aminés, isolée du plasma et des hémocytes de la moule Mytilus galloprovincialis (Hubert et al. 1996, Eur. J. Biochem. 240_; 302-6 ; Charlet et al, 1996, J. Biol. Chem. 271 : 21808-13 ; Mitta et al, 1999, J. Cell. Sci, 112 ; 4233-42). La séquence de MGDl est illustrée à la Figure 1. La structure tri-dimensionnelle de la molécule établie par résonance magnétique du proton (Yang et al. 2000 Biochemistry, 39:14436-47) illustrée sur la Figure 2 consiste en une hélice α et 2 feuillets β antiparallèles lui donnant une structure communément dénommée Cs ( β) stabilisée observée également chez les toxines de scorpions. La molécule présente une distribution de charges positives localisées sur 3 domaines et une chaîne latérale hydrophobe. Ce peptide a une activité antibactérienne contre les bactéries à Gram + et une activité antifongique. Dix sept peptides correspondant à des fragments de la séquence de MGD 1 ont été synthétisés suivant les méthodes bien connues de l'homme du métier exposées ci-dessus. Ces peptides ont été testés pour leur activité antimicrobienne et leur activité antifongique. Les résultats de ces tests sont exposés dans les Tableaux I et II.
En se fondant sur la structure 3D de la molécule native, celle-ci a été fractionnée en 17 éléments (Tableau I). Tous ces fragments ont été synthétisés et leurs activités évaluées par utilisation de tests antibiotiques sur des bactéries Gram+, Gram- et sur un champignon filamenteux. Ont ainsi été déterminées les Concentrations Minimales Inhibitrices (MIC) et Bactériostatiques (MBC) de chaque peptide qui ont été comparées à celles de la molécule native. De ces comparaisons il ressort que :
- La partie N-terminale et celle correspondant à l'hélice α ne possèdent pas d'activité : séquences 8 à 13.
- Les séquences 14 et 15 ne présentent aucune activité. - Les éléments correspondants aux feuillets β (dépourvus de la boucle) ne comportent pas d'activité intrinsèque : séquence 16.
- Le peptide de séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence en acides aminés de la boucle naturelle de la défensine MGDl, contrainte par un pont disulfure non naturel réalisé en 25-33, possède une activité antibactérienne (dans la molécule MGDl, la cysteine 25 est reliée à la cysteine 4 et la cysteine 33 est reliée à la cysteine 10). Ce résultat est confirmé par le fait que l'absence de ce pont disulfure sur une molécule analogue (séquence 17) dans laquelle les 2 cystéines ont été substituées par la serine (S) donne une molécule dépourvue d'activité. L'activité de la boucle non naturelle est augmentée par l'adjonction des séquences des feuillets β ou des parties des feuillets βl ou β2 : peptides représentés par les séquences 4 à 7 :
SEQ ID NO:4 SGGYC(S)GG HRLRC(S) SEQ ID NO:5 C(S)GGYSGGWHRLRSTSYRC(S)G SEQ ID NO:6 SGGYOs)GGWHRLRC(s)TSYRSG SEQ ID NO:7. C(S2)GGYC(S1)GG WHRLRC(si)TSYRC(S2)G - La substitution de l'histidine et de la leucine par 2 lysines (K) augmente l'activité (SEQ ID NO:2).
Les résultats de ces tests sont surprenants car :
Le fait que l'hélice α seule et la partie N-terminale associée à l'hélice α ne présentent aucune activité est inattendu car il diffère de ceux obtenus avec certaines catégories de peptides possédant une activité antimicrobienne et pour lesquels l'hélice α et/ou la partie N-terminale est impliquée dans l'activité. On peut se reporter par exemple à : Maloy et Kari, 1995, Biopolymers 37:105-22 ; Juvvadi et al, 1996, J. Amer. Chem. Soc, 118 : 8989-97, US-5,821,224. L'activité biologique mesurée de la molécule active porte sur les bactéries Gram + (Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium et Bacillus epidermidis) et sur le champignon filamenteux (Fusarium oxysporum) (Tableau 2). Cette activité est localisée sur la boucle formée par les acides aminés 25-33 de structure primaire (CGGWHRLRC) à condition qu'un pont disulfure non naturel soit réalisé entre les acides aminés 25 et 33. Le pouvoir antibactérien de cette structure est augmenté en renforçant son caractère cationique par substitution de l'histidine 29 et de la leucine 31 par deux lysines. L'association des brins βl ou β2 avec un pont disulfure en 25-33 ou du feuillet β avec un pont disulfure supplémentaire naturel en 21-38 confèrent à la molécule de séquence C(S )GGYC(S1)GGWKRKRC(S1)TSYRC(S2)G (séquence 7) une structure bicyclique plus active que la structure minimale et fait apparaître la capacité à lyser les cellules.
Sur le Tableau II sont rassemblés les résultats d'Activité MIC et MBC (en μM) des fragments peptidiques dérivés de la défensine MGDl sur quelques souches bactériennes (Gram +) et sur un champignon filamenteux.
Tableau I
(*) position des acides aminés dans la séquence MGDl Tableau II
Des essais ont été entrepris à partir des séquences SEQ ID NO:l et SEQ ID NO:2 afin de déterminer l'impact sur l'activité biologique de ces peptides d'une substitution d'acide aminé par un autre acide aminé de même classe ou non et d'une diminution de la taille de ces peptides. Ces séquences ont été numérotées 19 à 24. Leur séquence et leur activité biologique sont décrites dans le tableau III.
On constate que les séquences 19 à 23 sont dotées d'une activité intéressante, quoique plus faible pour la séquence 23. En revanche, la séquence n° 24 ne présente pas d'activité biologique significative. Les séquences 19 à 23 constituent un autre objet de l'invention.
SEQ ID NO: 19 C(S)GGWKRLRC(S)
SEQ ID NO.-20 C(S)GGWKRKRC(S)
SEQ ID NO:21 C(S)10 WKRKRC(S)
SEQ ID NO:22 C(S)KWKRKRC(S) SEQ ID NO:23 C(S)WKRKRC(S)
SEQ ID NO:24 C(S)WKRKC(S)

Claims

REVENDICATIONS
1 °) Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi :
- les peptides répondant à la formule (I) : C(S)-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C(S) (I) dans laquelle :
- les deux résidus cystéines sont reliés par un pont disulfure, représenté par le symbole C(S),
-Xi et X , identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi la glycine, la valine, l'alanine, la lysine,
- X3 représente un acide aminé choisi parmi le tryptophane et la tyrosine,
- Xi, X5 et X7, identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi l'histidine, l'arginine, la lysine,
- X6 représente un acide aminé choisi parmi la leucine, l'isoleucine, la lysine, ainsi que :
- les dérivés de ces peptides sélectionnés parmi :
- les sels pharmaceutiquement acceptables de ces peptides,
- les fragments fonctionnels de ces peptides, - les analogues chimiques de ces peptides choisis parmi ceux dans lesquels : un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique ont été remplacés par leur énantiomère D ; une ou plusieurs liaisons amides peptidiques (-CO-NH-) ont été remplacées par une liaison isostère telle que : -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2-, -CH*=CH- (cis et trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- et -CH2SO- ; un ou plusieurs acides aminés ont été remplacés par un acide aminé non naturel ; les deux résidus cysteine formant le pont disulfure ont été remplacés par deux résidus tryptophanes formant un pont di-tryptophane ou par un résidu lanthionine formant un pont mono-sulfure, ou par deux acides aminés porteurs, pour l'un d'une fonction acide libre et pour l'autre une fonction aminé libre engagés tous deux dans un pont lactame ou un peptide dans lequel le pont disulfure a été remplacé par une liaison amide entre les extrémités N-terminale et C-terminale du peptide.
- les dérivés chimiques de ce peptide choisis parmi : les composés desalpha amino peptides ; les dérivés N-alpha acyl substitués de la forme RCO-, dans laquelle R représente un groupement alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou aralkyle, linéaire, ramifié, ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone ; les dérivés substitués sur la fonction acide C-terminale par un groupement choisi parmi -NH2, les alkyloxy, alkylthio ou alkylamino de la forme -OR, -SR or -NHR, dans lesquels R représente une chaine alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou un groupement aralkyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone, les dérivés porteurs d'un substituant pharmacophore.
2°) Peptide cyclique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence SEQ ID NO:l C(S)GGWHRLRC(S) dans laquelle les deux résidus cysteine sont liés par un pont disulfure.
3°) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence SEQ ID NO:2 : C(S)GGWKRKRC(S) dans laquelle les deux résidus cysteine sont liés par un pont disulfure.
4°) Peptide dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec un peptide répondant à la formule (I) selon la revendication 1, encore plus préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec une séquence selon la formule (I), ladite séquence comportant un résidu cysteine à chacune de ses extrémités, ces résidus cystéines terminaux étant liés par un pont disulfure.
5°) Peptide dont la séquence d'acides aminés présente au moins 60% de similarité avec un peptide répondant à la séquence SEQ ID NO:l selon la revendication 2 ou à la séquence SEQ ID NO:2 selon la revendication 3, encore plus préférentiellement
70%o, encore plus préférentiellement encore 80%, de manière préférée au moins 90%, et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, 98% de similarité avec la séquence
SEQ ID NO:l ou la séquence SEQ ID NO:2, ladite séquence comportant un résidu cysteine à chacune de ses extrémités, ces résidus cystéines terminaux étant liés par un pont disulfure.
6°) Peptide selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte de 6 à 15 acides aminés.
7°) Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comporte de 7 à 12 acides aminés, encore plus préférentiellement de 8 à 11 acides aminés.
8°) Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : - les peptides répondant à la formule (II) :
Y1-C(S)-Xι-X2-X3-X4-X5-X6-X7-C(S)-Y2 (II) dans laquelle Yi et Y représentent un fragment peptidique comprenant de 1 à 60 acides aminés, préférentiellement de 1 à 40 acides aminés et encore plus préférentiellement de 1 à 15 acides aminés .
-Xi et X2, identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi la glycine, la valine, l'alanine, la lysine,
- X3 représente un acide aminé choisi parmi le tryptophane et la tyrosine,
- , X5 et X , identiques ou différents, représentent un acide aminé choisi parmi l'histidine, l'arginine, la lysine,
- X6 représente un acide aminé choisi parmi la leucine, l'isoleucine, la lysine, ainsi que : - les dérivés de ces peptides sélectionnés parmi :
- les sels pharmaceutiquement acceptables de ces peptides,
- les fragments fonctionnels de ces peptides, - les analogues chimiques de ces peptides choisis parmi ceux dans lesquels : un ou plusieurs acides aminés de la séquence peptidique ont été remplacés par leur énantiomère D ; une ou plusieurs liaisons amides peptidiques (-CO-NH-) ont été remplacées par une liaison isostère telle que : -CH2NH-, CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis et trans), -COCH2-, -CH(OH)CH - et -CH2SO- ; un ou plusieurs acides aminés ont été remplacés par un acide aminé non naturel ; les deux résidus cysteine formant le pont disulfure ont été remplacés par deux résidus tryptophanes formant un pont di-tryptophane ou par un résidu lanthionine formant un pont mono-sulfure, ou par deux acides aminés porteurs, pour l'un d'une fonction acide libre et pour l'autre une fonction aminé libre engagés tous deux dans un pont lactame ou un peptide dans lequel le pont disulfure a été remplacé par une liaison amide entre les extrémités N-terminale et C-terminale du peptide.
- les dérivés chimiques de ce peptide choisis parmi : les composés desalpha amino peptides ; les dérivés N-alpha acyl substitués de la forme RCO-, dans laquelle R représente un groupement alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou aralkyle, linéaire, ramifié, ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone ; les dérivés substitués sur la fonction acide C-terminale par un groupement choisi parmi -NH2, les alkyloxy, alkylthio ou alkylamino de la forme -OR, -SR or -NHR, dans lesquels R représente une chaine alkyle, alcényle, alcynyle, aryle ou un groupement aralkyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant de 1 à 50 atomes de carbone, les dérivés porteurs d'un substituant pharmacophore.
9°) Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide de séquence SEQ ID NO:l dans laquelle les deux résidus cysteine sont reliés par un pont disulfure.
10°) Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide de séquence SEQ ID NO:2 dans laquelle les deux résidus cysteine sont reliés par un pont disulfure.
11°) Peptide selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est dérivé de la MGD 1.
12°) Peptide selon la revendication 9 ou la revendication 11, caractérisé en ce qu'il répond à la séquence SEQ ID NO:3 ; dans laquelle les deux résidus cysteine en 25 et 33 sont reliés par un pont disulfure.
13°) Peptide caractérisé en ce qu'il présente une homologie d'au moins 60%), préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement 80%, de manière préférée au moins 90% et encore plus favorablement au moins 95%, ou mieux, au moins 98%» avec le peptide répondant à la séquence SEQ ID NO: 3 selon la revendication 12 et dans lequel les deux cystéines en 25 et 33 forment un pont disulfure.
14°) Peptide selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend de 15 à 70 acides aminés, encore plus préférentiellement de 15 à 55 acides aminés et avantageusement de 15 à 50 acides aminés.
15°) Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des séquences :
SEQ ID NO:4 SGGYC(S)GGWHRLRC(S), SEQ ID NO:5 C(S)GGYSGGWHRLRSTSYRC(S)G
SEQ ID NO:6 SGGYC(S)GGWHRLRC(S)TSYRSG
SEQ ID NO:7 C(S2)GGYC(S1)GG WHRLRC(si)TSYRC(S2)G
SEQ ID NO: 19 C(S)GGWKRLRC(S)
SEQ ID NO:20 C(S)GGW RKRC(S) SEQ ID NO:21 C(S)KKWKRKRC(S)
SEQ ID NO:22 C(S)KWKRKRC(S)
SEQ ID NO:23 C(s)VvT RKRC(s) 16°) Peptide linéaire, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi ceux répondant à l'une des séquences :
SEQ ID NO:l CGGWHRLRC
SEQ ID NO:2 : CGGWKRKRC SEQ ID NO:4 SGGYCGGWHRLRC
SEQ ID NO:5 CGGYSGGWHRLRSTSYRCG
SEQ ID NO:6 SGGYCGGWHRLRCTSYRSG
SEQ ID NO:7 CGGYCGGWHRLRCTSYRCG
SEQ ID NO: 19 CGGWKRLRC SEQ ID NO:20 CGGWKRKRC
SEQ ID NO:21 CKKWKRKRC
SEQ ID NO:22 CKWKRKRC
SEQ ID NO:23 CWKRKRC
17°) Procédé de préparation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, comportant un pont disulfure, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une première étape choisie parmi la synthèse chimique, l'expression dans une cellule exprimant MGDl, l'expression par une molécule d'acide nucléique recombinant et au moins un seconde étape consistant en un traitement dans des conditions d'oxydation appropriées pour former le pont disulfure entre les deux résidus cystéines. 18°) Molécule d'acide nucléique codant un peptide selon la revendication
16.
19°) Vecteur contenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 18.
20°) Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 19. 21°) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour réduire ou d'inhiber la prolifération microbienne ou détruire les microorganismes dans un environnement à l'exclusion du corps humain ou animal.
22°) Utilisation selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'environnement à traiter est choisi parmi : les liquides, des articles d'hygiène, des substances alimentaires, des objets à usage alimentaire ou chirurgical, des gaz, un espace. 23°) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 dans un support pharmaceutiquement acceptable.
24°) Composition désinfectante caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.
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