EP1468278A1 - Vorrichtung, verwendung der vorrichtung und trennmittel zum trennen von teilchen in der free-flow-elektrophorese - Google Patents

Vorrichtung, verwendung der vorrichtung und trennmittel zum trennen von teilchen in der free-flow-elektrophorese

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Publication number
EP1468278A1
EP1468278A1 EP20030729399 EP03729399A EP1468278A1 EP 1468278 A1 EP1468278 A1 EP 1468278A1 EP 20030729399 EP20030729399 EP 20030729399 EP 03729399 A EP03729399 A EP 03729399A EP 1468278 A1 EP1468278 A1 EP 1468278A1
Authority
EP
European Patent Office
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particles
charge
ffe
medium
separation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP20030729399
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Eckerskorn
Hans-Jörg Grill
Gerhard Weber
Peter Weber
David Yost
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Tecan Trading AG
Original Assignee
Tecan Trading AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tecan Trading AG filed Critical Tecan Trading AG
Publication of EP1468278A1 publication Critical patent/EP1468278A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
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    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]

Definitions

  • the invention relates to a device, the use of the device and separating means for separating particles by means of the free-flow electrophoresis technique, according to the preamble of independent claims 1, 9, 26 and 27.
  • Free-flow electrophoresis is one of the most promising technologies for the separation of all possible particles [cf. Krivanova L. & Bocek P. (1998) "Continuous Free-Flow Electrophoresis” Electrophoresis 19: 1064-1074].
  • the FFE is the technology of choice for the pre-division of complex protein samples in relation to their different pl-value (degree of ionization).
  • the FFE separates cells based on the electrophoretic mobility of the cells.
  • the corresponding principles have already been thoroughly characterized [cf. e.g. Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G.
  • a generic FFE device is described in the international patent application PCT / EP01 / 14408. It is an electrophoresis device with a separation space through which a separation medium flows, which is separated by a base and a cover and by these two at a distance spacers held to each other is limited.
  • this FFE device comprises a pump for feeding the separation medium, which enters the separation space via media feeds and leaves it again via outlets.
  • the FFE device also includes electrodes for applying an electrical field in the separation medium and sample application points for adding a mixture of particles or analytes to be separated and fractionation points for removing particles separated by the FFE in the separation medium. These separated particles can be sent for analysis or for further processing.
  • two or more separate delivery channels of a metering pump are connected to the separation space in the region of the fractionation outlets near the electrodes in order to add medium.
  • U.S. Patent 5,948,231 discloses compounds, methods and devices for performing ultra-fast binding assays in capillary electrophoresis or in other electro-separation techniques such as e.g. in free flow electrophoresis.
  • the object of the present invention is to further improve the preparative or analytical isolation of particles such as cells, organelles and biomolecules (e.g. protein complexes) and the like, or of bioparticles or biopolymers in the FFE.
  • particles such as cells, organelles and biomolecules (e.g. protein complexes) and the like, or of bioparticles or biopolymers in the FFE.
  • this object is achieved - according to a first aspect - by proposing a free-flow electrophoresis device with the features of independent claim 1.
  • this object is achieved - according to a second aspect - by using a method for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof, using a free-flow electrophoresis device the features of independent claim 9 is proposed.
  • this object is achieved - according to a third aspect - by separating means for separating particles, in particular for separating cells, cell components, organelles or biomolecules or parts or complexes thereof in a free-fiow electrophoresis device, according to the features of independent claims 26 and 27, respectively.
  • particles are considered to be e.g. all particulate mass units, preferably of biological origin, such as cells, viruses, cell organelles, vesicles, cell nuclei and membranes, and parts or aggregates thereof; also biomolecules, such as lipids, proteins, DNA, RNA and sugar, and complexes or aggregates of biomolecules, such as lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, etc.
  • biomolecules such as lipids, proteins, DNA, RNA and sugar, and complexes or aggregates of biomolecules, such as lipoproteins, glycoproteins, lipopolysaccharides, etc.
  • These particles also include organic and inorganic molecules, such as pharmaceuticals, polymers and the like.
  • a device for separating such particles based on the selectively modified surface charge - in particular for separating cells or cell components, organelles or biomolecules, or parts or complexes thereof, using the free-flow electrophoresis technique comprises the following advantages:
  • Magnetic beads are not suitable for the preparative separation of particles; in addition, only a single type of particle can be isolated with magnetic beads. Magnetic bead applications can therefore be replaced by the FFE according to the invention, if positive and negative charged carriers are used at the same time.
  • the FFE according to the invention allows simultaneous isolation of at least two particle types with maximum efficiency, because the individual electrophoretic mobility of the ponds is increased significantly and selectively.
  • Many FACS applications can be replaced by FFE applications and can be carried out with much cheaper and faster devices, if required also automated.
  • living cells can be isolated qualitatively and quantitatively or on a preparative or analytical scale thanks to the specificity of the antibodies used and the separating power of the FFE.
  • tumor cells occur in the ratio of 1:10 6 to 1: 10 8 in whole blood
  • the white blood cells (2 ml MNC fraction from 10 ml Whole blood) including the tumor cells were separated from the red blood cells using a density gradient and, after appropriate labeling of the tumor cells (incubation with epitope-specific antibodies with "charge labels"), were applied to the FFE for separation. The addition took place at 4 to 10 ml / hour.
  • the purified tumor cells could be obtained in a final volume of 2-8 ml.
  • the proposed Free Flow Electrophoresis (FFE) device enables different separation techniques to be carried out with different and selective separation parameters.
  • the proposed FFE method enables not only the isolation but also the selective depletion of particles from a particle mixture, such as a depletion of abundant proteins (for example separation of serum albumin from body fluids, for example blood plasma). • The setting of particles separated on the electrodes due to their special biological relevance and the resulting substantial losses of these particles can be successfully prevented with a focusing pad made of an electrically highly conductive pad medium.
  • Fig. IC are equipped with three epitopes of a second type
  • FIG. 3A the two epitopes of the first type are negatively charged, which makes the net surface charge of the cells strongly negative, and in FIG. 3B the three epitopes of the second type are positively marked, which makes the net surface charge of the cells strongly positive;
  • FIG. 4 shows a basic diagram of a device according to the invention for the simultaneous separation of two charge-labeled cell types
  • Fig. 5 is a schematic representation of usable according to the invention
  • FIGS. 6A and 6D show a CHIEF device with a linear pH gradient and a homogeneous field
  • 6B and 6E show a PZE device with a homogeneous pH value and a homogeneous field
  • 6C and 6F show a CITP device with a pH gradient and a field gradient
  • Figure 1 shows cells to be separated as an example of particles 1, 1 ', 1 "to be separated. These cells can be equipped without specific epitopes (see FIG. 1A). Such cells have and are a relatively low negative net surface charge very difficult to separate in the FFE. However, if the cells have epitopes of a first type 2 '(FIG. IB) or a second type 2 "(FIG. IC), these cells can be epitope-specific with charge-carrying molecules or charge carriers be marked. In general, the net surface charge of particles can thus be selectively changed by binding charged binding molecules to these particles. This binding can be based on an antigen-antibody interaction.
  • Further interactions that can be used for the modification of the net surface charge of particles according to the invention for coupling binding molecules to the particles to be separated also include receptor-ligand, enzyme-substrate and protein-protein interactions. Chelation or a bond based on general molecular interactions, be it ionic or based on Van der Waals forces or on hydrogen bonds, but also a covalent bond can be used for this purpose.
  • relevant cells can be extracted from body fluids (eg disseminated tumor cells from blood, sputum, ascites, urine, lavage etc.) or from tissue homogenates (eg solid tumors in the kidney, thymus) etc.) or organelles from cell homogenates (eg caiciosomes, coated vesicles, endosomes, endoplasmic reticulum, Golgi cisterns, lysosomes, peroxisomes and mitochondria) and proteins from proteomes or expression systems.
  • body fluids eg disseminated tumor cells from blood, sputum, ascites, urine, lavage etc.
  • tissue homogenates eg solid tumors in the kidney, thymus
  • organelles from cell homogenates eg caiciosomes, coated vesicles, endosomes, endoplasmic reticulum, Golgi cisterns, lysosomes, peroxisomes and mitochondria
  • FIG. 2 shows an epitope-specific antibody and two monomeric or polymeric charge carriers or "charge labe! (cf. "CL” in FIG. 5) in the form of cations 4 or anions 5.
  • a charge carrier 4.5 is a molecule ionized at a given pH. It can be anionic or cationic, monomeric or polymeric. With the help of such charge carriers 4, 5, the net surface charge of particles can be changed in a targeted manner. Charged particles, e.g. Beads can also be used as charge carriers.
  • anionic charge carriers 5 are: polyglutamic acid (PGA); anionic or derivatized proteins such as albumin; anionic polysaccharides such as heparin or alginic acid, polyaspartic acid, polyacrylic acid and polyamic acids with a net negative charge at a usable pH (for example in the range from pH 4 to 10).
  • Anionic polymers with a molecular weight of 500 to about 500,000 Daltons are preferred.
  • Several monomeric or polymeric charge carriers can also be bound to a specific binding molecule in order to further develop the net surface charge of the particles to be separated.
  • Examples of preferred cationic charge carriers 4 include homopolymeric or copolymeric proteins with a preferred molecular weight of 500-5000000 daltons; quaternary ammonium compounds bonds with between 1% and 10% nitrogen (without counter ion).
  • Commercially available quaternary ammonium polymer compounds include, for example, the products MERQUAT.RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT.RTM. (National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA), GAFQUAT.RTM.
  • binding molecule 3 Such an antibody (cf. FIG. 2) is referred to below as binding molecule 3 or “binding molecule”.
  • the bond between a binding molecule 3 and a particle 1 ′, 1 ′′ and the bond between a charge carrier 4, 5 and the binding molecule 3 can be covalent or non-covalent (eg adsorptive, on Van der Waals forces or hydrogen bonds, on one Biotin-streptavidin interaction, etc.)
  • the binding molecule 3 can be, for example, an antibody (cf. FIG.
  • FIG. 3 shows cells to be separated with corresponding epitopes 2 ', 2 ".
  • the two epitopes of the first type 2' are negative in FIG. 3A and the three epitopes of the second type 2" are positively marked in FIG. 3B.
  • the net surface charge of the marked cells is therefore greatly changed, so that these cells behave differently with their specifically changed net surface charge in the FFE.
  • the net surface charge of the cells is preferably changed such that a cell type changes in a separation medium 8 of an inventive one Device moved against the cathode 9 and the other cell type against the anode 10, as shown in the schematic diagram of Figure 4.
  • the two groups of charge-modified particles 7 ′, 7 ′′ or the two charge-modified cell types move away essentially simultaneously from the unlabelled or non-charge-modified background cells 7, which are essentially in the middle (or at least a great distance from the electrodes) 9, 10 in the separation medium 8 of the device according to the invention, the arrow indicating the main flow direction of the separation medium 8.
  • the various cell types which are separated from one another are collected in a collection area 11 and sent for further use
  • the resolution of the FFE is essentially determined by the migration behavior of the particles 7, 7 'and the size and number of the discharge openings.
  • the separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and the two lateral regions 19 near the electrodes 19 with the cushion medium 20 formed focusing pillow 12, 13 (cf. also Fig. 7).
  • the mass of the charge-modified particles 7 ', 7 " is fed through the FFE in approximately a normal distribution to the discharge openings, apart from an (unwanted) adhesion of charge-modified particles 7', 7" on the surfaces of the electrodes 9, 10.
  • 7A shows a normal distribution in a schematic cross-sectional view.
  • a focusing pad 12, 13 made of a likewise flowable, electrically highly conductive separating material is preferably provided in the immediate vicinity of the electrodes 9, 10 Due to its high electrical conductivity, this focusing pad 12, 13 prevents the charge-modified particles 7 ', 7 "from being able to diffuse all the way to the respective electrode.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of separating agents which can be used according to the invention in a possible arrangement and interaction with a particle to be separated.
  • This charged binding molecule 6 consists of nickel-nitrilo-tetraacetic acid (Ni-NTA), which binds to the histidine molecules, here the anionic charge carrier 5 is covalently bound to the nickel-nitrilo-tetraacetic acid, the binding molecule 3.
  • Ni-NTA nickel-nitrilo-tetraacetic acid
  • FIG. 6 shows schematic top views of devices according to the invention.
  • This free-flow electrophoresis device comprises at least one separation space 14 through which a separation medium 8 can flow.
  • This separation space is delimited by a base and a cover and by these two spacers which are spaced apart from one another.
  • This FFE device also includes a metering pump (not shown) for conveying the separating medium 8, which enters the separating space 14 via media feeds 15, 15 'and leaves it again via outlets 16.
  • the FFE device comprises electrodes 9, 10 for applying an electric field in the separation medium 8 as well as sample application points 17 for adding a mixture of particles 7, 7 ', 7 "to be separated and fractionation points 18 for removing particles separated by the FFE in the separation medium 8
  • Two separate delivery channels 15 'of the metering pump are connected to the separating space 14 in the area of the fractionation outlets 16' near the electrodes in order to add medium Particles 7 ', 7 "in the regions 19 of the separating medium 8 near the electrodes and are connected to a separate medium container (not shown) for providing an electrically highly conductive cushion medium.
  • CHIEF CHIEF
  • This pI value corresponds to the pH of the surrounding, inhomogeneous medium, against which the particles appear neutral.
  • the FFE of particles due to their different isoelectric point enables the isolation of analytes or particles with the smallest differences in their pI values.
  • the total charge or net surface charge is at the isoelectric point p 1 (ie at the location of the separation medium 8 which has just the pH at which the number of negative and positive charges is the same for a given particle (for example a protein molecule)) of this particle is zero.
  • the focusing effect inherent in the separation medium 8 of a CHIEF device has the effect that a particle l ', l "which diffuses away from the pl automatically receives a (positive or negative) net surface charge again and is moved back to the pl by the electric field.
  • the method of continuous isolectrical focusing is particularly suitable for the micro-preparative to preparative isolation of biopolymers in general and of bioparticles whose biological function or their integrity is ensured in the range of the selected range of the pH gradient in the separation medium.
  • osmotic expanders can ensure the maintenance of an ideal osmotic pressure: by adding uncharged substances (e.g. sugar, as non-ionic, osmotic expander) and / or of salts (eg NaCI, as ionic, osmotic expander) an optimal osmotic pressure for a cell type, ie isomolar conditions (eg for mammalian cells 250-310 mosmol) can be generated.
  • uncharged substances e.g. sugar, as non-ionic, osmotic expander
  • salts eg NaCI, as ionic, osmotic expander
  • the separation space 14 comprises the space for the separation medium 8 and two lateral regions 19 near the electrodes for the guide or focusing cushions formed with the cushion medium 20.
  • the electrodes 9, 10 are preferably designed as electrode spaces, from an electrode buffer contacted by an electrical lead 23, 23 ' 24 flow through and have a preferably semipermeable membrane 25 in relation to the separation space 14.
  • the electrode buffer 24 is introduced into the electrode spaces via separate feed lines 26, 26 '(only partially shown in FIG. 6) and also leaves them via separate outlets 27, 27'.
  • An additional one is preferably used for circulating and possibly also for cooling the electrode buffer Pump device (not shown) used.
  • FIG. 6A shows such a CHIEF device with a linear pH gradient.
  • a separation medium 8 flows in a laminar movement (preferably from the bottom upwards in an inclined separation space) between the two electrodes (large arrow), is braked in the area of the outlet openings by a counterflow of separation medium (small arrow) and leaves the separation space 14 in fractions via the outlet openings.
  • a sample with three groups of particles to be separated is added to the separation medium via the sample inlet and moved with the laminar flow of the separation medium.
  • the three particle groups are continuously separated, focused and collected in separate fractions in the pH gradient, which is generated by the electric field generated between the electrodes in the separation medium.
  • FIG. 6A shows such a CHIEF device with a linear pH gradient.
  • the electrical conductivity of the separation medium 8 between the two preferably provided focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively low and high.
  • the pH gradient is built up in the separation medium 8 between the two focusing pads 12, 13.
  • the FFE separation technique of continuous FFE zone electrophoresis (PZE) is based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated compared to the separation medium used. FFE zone electrophoresis thus enables the isolation of analytes or particles on the basis of their different sizes and / or shapes and / or net surface charge.
  • FIG. 6B shows such a PZE device, in which the samples are separated on the basis of their charge and to a lesser extent on the basis of their shape and size.
  • the electrical conductivity of the separation medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is relatively low and homogeneous.
  • the pH value is the same in the entire separation medium.
  • the FFE separation technique of continuous isotachophoresis (CITP) is also based on the difference in the value of the electrophoretic mobility of the particles to be separated.
  • the separation takes place in inhomogeneous separation media and offers a better resolution due to an inherent "focusing effect”: If individual ponds diffuse away from a separated band of particles (eg proteins) during CITP, these particles enter into one Medium with different electric field strength, which accelerates or slows the particles. The inherent focusing effect means that the slower or faster migrating particles find their way back into the main fraction.
  • a separated band of particles eg proteins
  • This FFE separation technique is principally suitable for bioparticles and cells, their separation in media without special "essential cations” (eg Mg ++ or Ca ++ ) or "essential anions” (eg Cl " ), which are essential for stability and vitality of cells are important, is not possible.
  • essential cations eg Mg ++ or Ca ++
  • essential anions eg Cl "
  • FIG. 6C shows such a CITP device in which discrete spacers are used.
  • discrete spacers are ions with well-known, defined mobility, which push themselves between particles to be separated in the CITP and contribute to the separation taking place efficiently.
  • Ampholytes can also be used as such discrete spacers.
  • the electrical conductivity of the separating medium 8 between the two focusing pads 12, 13 - with high conductivity in the regions 19 near the electrodes - is at least partially gradient-like and inhomogeneous.
  • an at least partial pH gradient is built up in the separation medium 8 between the two focusing pads 12, 13, the areas of the two gradients essentially coinciding and both the pH values and the electrical conductivity in the area of the focusing pads 12, 13 each being different are high.
  • CHIEF and FFE-PZE or CHIEF and CITP are possible.
  • different separation media can be used simultaneously in the separation area of the FFE apparatus and thus different separation parameters can be used at the same time.
  • the device proposed according to the invention and the method proposed according to the invention allow continuous operating modes to be carried out, in which the separation of the particles 7, 7, 7, 7 "is carried out with a continuous flow of separation medium, permanent application of the electric field during the entire separation and continuous collection.
  • continuously preparative sample is added continuously with the same separation conditions
  • semi-preparative / analytical discontinuous sample addition with the same separation conditions).
  • the separation medium 8 flows continuously: the sample application takes place when the high voltage is switched off; After stopping the sample application, the medium transport is switched off or greatly reduced or reduced. The high voltage is then switched on until the sample has been separated. After a predetermined time, the voltage is switched off and the separated sample is eluted from the separation chamber with an increased medium flow and collected. It can also be provided that by means of a further metering pump or separate delivery channels of the medium pump - preferably at the end of the FFE device opposite the media feeds 15, 15 '- an auxiliary medium 21 is fed into the separation chamber 14 via auxiliary medium feeds 22 and together with the Separation medium 8 is removed via the fractionation points 18 (see FIGS. 6A to 6C).
  • FIG. 7 shows the effect of the focusing pads 12, 13, the border of the focusing pad with the electrically highly conductive pad medium 20, which runs essentially parallel to the electrode 9, 10, being indicated by dashed lines. If no focusing pad is produced (FIG. 7A), a normal distribution (hatched) of the particles separated from a rest of a sample by means of the selectively changed net surface charge is established. It can also happen that particles adhere to the electrode 9, 10 (not shown), so that in some cases substantial losses occur on these particles, for example because of their particular biological relevance. This can be done with a A focusing pillow 12, 13 made of an electrically highly conductive pillow medium 20 can be successfully prevented (cf. FIG.
  • the focusing pillow 12, 13 behaves like an electrode 9, 10, whereby - thanks to the high electrical conductivity of the cushion medium 20 is prevented that particles can reach the actual electrode 9, 10.
  • a concentration of the isolated particles forms at the cushion boundary, which far exceeds the measure of a normal distribution (shown in broken lines). A much larger amount of these particles in higher concentration can thus be removed from the FFE device and sent for further use via a fractionation point 18 which is positioned precisely in this area.
  • the use of such a focusing pad 12, 13 represents a significant improvement the use of a focusing pad in the fine separation of identical subunits biomolecules or their complexes appears to be less advantageous.
  • the guide or focusing pads 12, 13 are thus formed by a buffer 20, which has a greatly increased electrical conductivity compared to the separation medium 8.
  • the electrophoretic separation performance is dependent on the field strength and is inversely proportional to the conductivity, the electrophoretic separation performance in the focusing pads 12, 13 decreases so much that the charge-modified particles 7 ', 7 "at the interface between the separation medium 8 and the Focusing pillow 12, 13 can be focused.
  • EPG epidermal glycoprotein
  • Ber-EP4 new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from Mesothelia, J Clin Pathol 1990; 43: 213-9.
  • This monoclonal antibody is modified in two ways for the immune FFE: A) A charge carrier 4, 5 is directly and covalently coupled to the antibody (the binding molecule 3). B) Streptavidin is covalently coupled to the antiserum. Freely selectable, biotinylated charge carriers 4,5 are then bound to the streptavidin.
  • citrated or heparin whole blood is obtained from patients with e.g. Breast, ovarian or colon carcinoma either used directly or prepared as follows:
  • Peroxysomes are cell organelles that carry out oxidative reactions with molecular oxygen. They generate oxygen peroxide for oxidative purposes.
  • Highly enriched peroxysomes can e.g. from rat liver using an expensive density gradient centrifugation according to the method of Lüers et al. Isolation (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998; 19: 1205-210):
  • the resulting pellet then contains the so-called "light microsomal fraction" (including peroxysomes, microsomes and some mitochondria with lysosomes) and thus represents a mixture which also includes the peroxysomes.
  • Example C Isolation of recombinant proteins
  • vectors which can attach a cassette of 5-10 histidines to the protein to be expressed at the 5 'or 3' end of a construct (His tags, see FIG. 5). These additional histidines are used for later purification of the expressed proteins.
  • Other vectors include e.g. Glutathione-S-transferase as an additional element. These vectors are suitable for the expression of recombinant proteins e.g. in E. coli, baculovirus-infected bacteria and mammalian cells. Appropriate methods for producing recombinant proteins are known to the person skilled in the art.
  • the immune FFE according to the invention shown in FIG. 5, which comprises the following steps, is particularly suitable for the purification of recombinant proteins:
  • Lysis of the cells e.g. yeast, bacteria, mammalian cells
  • Binding of charge carriers 4,5 to the His-tagged proteins Variant 1: Binding of the charge carriers 4,5 to a binding molecule 3 in
  • His-tagged proteins can either now be used directly or the His-Tags are cleaved off enzymatically before further use.
  • His tags There are several ways to separate the His tags from the proteins: For variant 1: a) detachment of the chelate by known incubation with imidazole and, if necessary, renewed purification of the protein for FFE; b) Known enzymatic cleavage of the His tag with thrombin or exoprotease and, if necessary, renewed purification of the isolated protein for FFE.
  • variant 2 For variant 2: c) detachment of the antibodies using methods known per se, e.g. by changing the salt concentration or pH. d) Enzymatic cleavage of the His tags using methods known per se. e) Clean again with FFE.
  • the charge label or the charge carriers or the agent carrying the charge carrier can also be additionally marked (for example with a dye). This enables detection during or after the FFE.
  • Charge carriers could also be all types of particles (eg beads of all types, such as latex, agarose particles, colloids, etc.).
  • Charge carriers can also be virtually any combination of beads and / or antibodies and / or charge-carrying molecules and / or fluorescent markers and / or dyes. Beads can, for example, be colored with fluorescent or other dyes. Beads can simultaneously carry a fluorescent label (inside or outside), the charge label and the binding molecule (eg antibody or Ni-NTA).
  • beads which have an enzymatically cleavable bridge, then after cleaning (eg cleaning of recombinant proteins with Ni-NTA) the beads can be cleaved from the purified molecule.
  • Beads that are fluorescent and that are provided on the surface with charge carriers and binding molecules are particularly preferred. Possible measures for maintaining the biological activity or vitality of bioparticles in the various FFE separation techniques are shown in Table 1 below:
  • the separation of particles according to the invention enables concentrated collection or enrichment of biologically relevant particles, the analysis or use of which in diagnostic or therapeutic processes has not previously been possible because of the background of too many related but irrelevant particles present at the same time.
  • the FFE methods and devices presented thus enable isolation and consequently the use of particles naturally present in extremely low concentrations or the provision of their biologically relevant information for use in diagnostic or therapeutic processes.
  • the isolated particles can be used to find and characterize targets for the development of medicines, targets for use serve in diagnostics, therapy selection and therapy monitoring for humans as well as for animals and plants.
  • the disclosed methods according to the invention are - if appropriate after appropriate adaptation - also suitable for use in a wide variety of areas of chromatography, for example in the affinity chromatography of organic or inorganic molecules and polymers.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung sowie ein Verfahren und Trennmittel zum Trennen von Teilchen mit einer solchen Vorrichtung. Dabei umfasst diese FFE-Vorrichtung zumindest einen mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist. Diese FFE-Vorrichtung umfasst zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15, 15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder verlässt, Elektroden (9, 10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1, 1', 1'') und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8). Diese FFE-Vorrichtung umfasst selektiv wählbare Ladungsträger (4, 5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (1', 1'') und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7''), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7). Die erfindungsgemässe Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie zwischen dem Trennmedium (8) und mindestens einer Elektrode (9, 10) angeordnete Führungs- oder Fokussierkissen (12, 13) umfasst. Diese Fokussierkissen (12, 13) bestehen aus einem Kissenmedium (20), welches eine gegenüber dem Trennmedium (8) stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist. Zudem umfasst diese Vorrichtung separate Kanäle (15') zum Zuführen dieses Kissenmediums (20) zu den Fokussierkissen (12, 13).

Description

Vorrichtung, Verwendung der Vorrichtung und Trennmittel zum Trennen von Teilchen in der Free-Flow-Elektrophorese
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die Verwendung der Vorrichtung und Trennmittel zum Trennen von Teilchen mittels der Free-Flow-Elektrophorese- Technik, entsprechend dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche 1, 9, 26 und 27.
Eine wichtige Problematik in der Diagnostik und in der Forschung betrifft die exakt definierte Probenpräparation. Allerdings beinhalten die heute gebräuchlichen Technologien, wie z.B. Zentrifugation, Filtrierung, Magnetseparation und FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) verschiedenste Nachteile, wie eingeschränkte Spezifität, niedrige Durchsatzrate, geringes Reinigungsvermögen oder auch eine teure Vorrichtung zur Isolierung und Reinigung von Zellen, Organellen oder Biomolekülen (z.B. Proteinkomplexen). Die wichtigsten Anwendungen für die Reinigung von Zellen, Organellen und Biomolekülen (z.B. Proteinkomplexen) finden sich in Bereichen der Biopharmazie, Biotechnologie, Umweltanalytik, Lebensmitteltechnologie und in der Medizin. Die angewandten Techniken sind entweder präparativ (Biopharmazie und Biotechnologie) oder analytisch (Umweltanalytik, Lebensmitteltechnologie und in der Medizin) ausgerichtet.
Die Free-Flow-Elektrophorese (FFE) ist eine der vielversprechendsten Technologien für die Auftrennung aller möglicher Teilchen [vgl. Krivanova L. & Bocek P. (1998) "Continuous free-flow electrophoresis" Electrophoresis 19 : 1064-1074]. Im Proteomics-Bereich ist die FFE die Technologie der Wahl für die definierte Voraufteilung von komplexen Proteinproben in Bezug auf deren unterschiedlichen pl-Wert (Ionisierungsgrad). Die Auftrennung von Zellen durch die FFE erfolgt auf Grund der elektrophoretischen Mobilität der Zellen. Die entsprechen- den Prinzipien wurden bereits gründlich charakterisiert [vgl. z.B. Bondy B., Bauer J., Seuffert I. und Weber G. (1995) "Sodium chloride in Separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16 : 92-97], hingegen wurde die FFE bislang nur wenig akzeptiert, weil die meisten Zeil-Typen sich in ihrer Oberflächenladung nur geringfügig unterscheiden, eine Auftrennung dieser Zelltypen deshalb schwierig ist. Eine erste Verbesserung brachte die Einführung der Immuno-FFE, bei der spezifische Antikörper an definierte Oberflächenepitope der aufzutrennenden Zellen gebunden werden und so über eine veränderte Nettoladung der Zelloberfläche eine modifizierte elekro- phoretische Mobilität dieser Zellen in der FFE erzielt werden konnte [vgl. z.B. Hansen E. und Hannig K. (1982) "Antigen-specific electriophoretic cell Separation (ASECS): isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free- flow electrophoresis after reaction with antibodies", J. Immunol. Methods 11, 51 : 197-208].
Eine gattungsgemässe FFE-Vorrichtung wird in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/14408 beschrieben. Es handelt sich um eine Elektrophorese- Vorrichtung mit einem von einem Trennmedium durchflossenen Trennraum, der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist. Zudem umfasst diese FFE- Vorrichtung eine Pumpe zum Zuführen des Trennmediums, welches über Medienzuführungen in den Trennraum gelangt und diesen über Auslässe wieder verlässt. Die FFE-Vorrichtung umfasst ausserdem Elektroden zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium sowie Probeaufgabestellen zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen bzw. Analyten und Fraktionierstellen zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium. Diese abgetrennten Teilchen können einer Analyse oder einer präparati- ven Weiterverarbeitung zugeführt werden. Zum Beeinflussen des Strömungs- profils des Trennmediums kann vorgesehen sein, dass zwei oder mehrere separate Förderkanäle einer Dosierpumpe mit dem Trennraum im Bereich der elektrodennahen Fraktionierauslässe verbunden sind, um Medium zuzugeben.
Das Patent US 5,948,231 offenbart Verbindungen, Verfahren und Vorrichtungen zum Ausführen von ultraschnellen Bindungs-Assays in der Kapillar-Elektropho- rese oder in anderen Elektroseparations-Techniken wie z.B. in der Free Flow Elektrophorese.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die präparative bzw. analytische Isolation von Teilchen, wie Zellen, Organellen und Biomolekülen (z.B. Proteinkomplexen) und dergleichen, bzw. von Biopartikeln oder Biopolymeren in der FFE weiter zu verbessern.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem ersten Aspekt - gelöst, indem eine Free-Flow-Elektrophorese-Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1 vorgeschlagen wird.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem zweiten Aspekt - gelöst, indem ein Verfahren zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben, unter Verwendung einer Free-Flow-Elektrophorese- Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 9 vorgeschlagen wird. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe - gemäss einem dritten Aspekt - gelöst, indem Trennmittel zum Trennen von Teilchen, insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben in einer Free-Fiow-Elektrophorese-Vorrichtung, entsprechend den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 26 bzw. 27 vorgeschlagen werden.
Weitere bevorzugte Merkmale ergeben sich jeweils aus den abhängigen Ansprüchen.
Als Teilchen oder "particle" gelten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung z.B. alle partikulären Masseneinheiten vorzugsweise biologischen Ursprungs, wie Zellen, Viren, Zellorganellen, Vesikel, Zellkerne und Membranen sowie Teile oder Aggregate derselben; zudem Biomoleküle, wie Lipide, Proteine, DNA, RNA und Zucker, sowie Komplexe oder Aggregate von Biomolekülen, wie Lipoproteine, Glykoproteine, Lipopolysaccharide usw.. Zu diesen Teilchen zählen auch organische und anorganische Moleküle, wie Pharmaka, Polymere und dergleichen.
Eine erfindungsgemässe Vorrichtung zum Trennen von solchen Teilchen auf Grund der selektiv modifizierten Oberflächenladung - insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Teilen oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow-Elektrophorese- Technik umfasst folgende Vorteile:
• Magnet-Beads eignen sich nicht zur präparativen Trennung von Teilchen; zudem kann mit Magnet-Beads nur jeweils ein einziger Teilchentypus isoliert werden. Magnet-Bead-Anwendungen können deshalb - falls gleichzeitig positiv und negative geladene Ladungsträger verwendet werden - durch die er- findungsgemässe FFE ersetzt werden. Die erfindungsgemässe FFE erlaubt eine simultane Isolation von mindestens zwei Teilchentypen mit einer maximalen Effizienz, weil die individuelle elektrophoretische Mobilität der Teichen wesentlich und selektiv erhöht wird. • Viele FACS-Anwendungen können durch FFE-Anwendungen ersetzt und mit wesentlich kostengünstigeren und schnelleren Vorrichtungen, nach Wunsch auch automatisiert, durchgeführt werden.
• Spezifisch ausgewählte, lebende Zellen können dank der Spezifität der verwendeten Antikörper und der Trennkraft der FFE qualitativ und quantitativ bzw. im präparativen oder analytischen Massstab isoliert werden.
• Erstmals wird es möglich, eine sanfte Präparation zur Gewinnung einer hochreinen Population von Organellen auszuführen.
• Im präparativen bzw. analytischen Massstab können Teilchengemische in relativ grosser Menge innerhalb kurzer Zeit exakt getrennt werden. Als ein Beispiel dient die Aufreinigung zirkulierender Tumorzellen aus Vollblut (Tumor- zellen kommen im Verhältnis von 1: 106 bis 1 : 108 in Vollblut vor): Aus hepari- nisiertem Vollblut wurden die weissen Blutkörperchen (2 ml MNC-Fraktion aus 10 ml Vollblut) inkl. der Tumorzellen mittels eines Dichtegradienten von den roten Blutkörperchen abgetrennt und nach entsprechender Markierung der Tumorzellen (Inkubation mit epitopspezifischen Antikörpern mit "charge la- bels") auf die FFE zur Trennung aufgegeben. Die Zugabe erfolgte mit 4 bis 10 ml/Stunde. Die gereinigten Tumorzellen konnten in 2-8 ml Endvolumen gewonnen werden.
• Die vorgeschlagene Free Flow Elektrophorese (FFE) - Vorrichtung ermöglicht die Durchführung verschiedener Trenntechniken mit unterschiedlichen und selektiven Trennparametern.
• Das vorgeschlagene FFE-Verfahren ermöglicht nicht nur die Isolation sondern auch die selektive Depletion von Teilchen aus einem Teilchengemisch, wie z.B. eine Abreicherung von abundanten Proteinen (z.B. Trennen von Serumalbumin aus Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blutplasma). • Das Festsetzen von auf Grund ihrer besonderen biologischen Relevanz abgetrennten Teilchen an den Elektroden und daraus resultierende, wesentliche Verluste dieser Teilchen, können mit einem Fokussierkissen aus einem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium erfolgreich verhindert werden.
Bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Vorrichtung zum Trennen von Teilchen auf Grund ihrer selektiv veränderten Netto- Oberflächenladung - insbesondere zum Auftrennen von Zellen oder Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen, bzw. von Teilen oder Komplexen derselben mittels der Free-Flow-Elektrophorese-Technik - werden im Folgenden an Hand von schematischen Zeichnungen - welche die Erfindung lediglich veranschaulichen, deren Umfang aber nicht einschränken - näher erläutert. Dabei zeigen:
Fig. 1 zu trennende Zellen, welche:
Fig. 1A ohne bestimmte Epitope,
Fig. 1B mit zwei Epitopen eines ersten Typs,
Fig. IC mit drei Epitopen eines zweiten Typs ausgestattet sind;
Fig. 2 einen epitop-spezifischen Antikörper und ladungstragende Moleküle;
Fig. 3 zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen, wobei in :
Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs negativ ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark negativ wird, und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs positiv ladungsmarkiert sind, wodurch die Netto-Oberflächenladung der Zellen stark positiv wird;
Fig. 4 ein Prinzipschema einer erfindungsgemässe Vorrichtung zum gleichzeitigen Trennen von zwei ladungsmarkierten Zelltypen; Fig. 5 eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendbaren
Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwirkung mit einem zu trennenden Teilchen;
Fig. 6 schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen, wobei: Fig. 6A und 6D eine CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten und einem homogenem Feld; Fig. 6B und 6E eine PZE-Vorrichtung mit einem homogenen pH-Wert und einem homogenen Feld; und
Fig. 6C und 6F eine CITP-Vorrichtung mit einem pH-Gradienten und einem Feld-Gradienten zeigen;
Fig. 7 eine schematische Mengen-Verteilung von ladungstragenden Zellen gleichen Typs:
Fig. 7A ohne Verwendung, und
Fig. 7B mit Verwendung eines erfindungsgemässen Fokussier- kissens.
Figur 1 zeigt zu trennende Zellen als Beispiel für zu trennende Teilchen 1,1', 1". Diese Zellen, können ohne bestimmte Epitope (vgl. Fig. 1A) ausgestattet sein. Solche Zellen weisen eine relativ geringe negative Netto-Oberflächenladung auf und sind in der FFE nur sehr schwer zu trennen. Weisen die Zellen aber Epitope eines ersten Typs 2' (Fig. IB) oder eines zweiten Typs 2" (Fig. IC) auf, so können diese Zellen mit ladungstragenden Molekülen bzw. Ladungsträgern epitop- spezifisch markiert werden. Allgemein kann somit die Netto-Oberflächenladung von Teilchen selektiv verändert werden, indem geladene Bindungsmoleküle an diese Teilchen gebunden werden. Diese Bindung kann auf einer Antigen-Anti- körper-Wechselwirkung beruhen. Weitere, zur erfindungsgemässen Modifikation der Netto-Oberflächenladung von Teilchen verwendbare Wechselwirkungen zum Ankoppeln von Bindungsmolekülen an die zu trennenden Teilchen umfassen auch Rezeptor-Ligand-, Enzym-Substrat- und Protein-Protein-Wechselwirkun- gen. Auch eine Chelatbildung oder eine auf allgemeinen Molekül-Wechselwirkungen beruhende Bindung, sei diese ionisch oder auf Van-der-Waals-Kräften bzw. auf Wasserstoffbrücken beruhend, aber auch eine kovalente Bindung kann für diesen Zweck verwendet werden.
Mit der erfindungsgemässen FFE-Vorrichtung bzw. mit dem erfindungsgemässen FFE-Verfahren können relevante Zellen aus Körperflüssigkeiten (z.B. dissemi- nierte Tumorzellenn aus Blut, Sputum, Ascites, Urin, Lavagen etc.) bzw. aus Gewebehomogenaten (z.B. solide Tumoren in Niere, Thymus etc.) oder Orga- nellen aus Zellhomogenaten (z.B. Caiciosomen, "coated vesicles", Endosomen, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Zisternen, Lysosomen, Peroxisomen und Mitochondrien) sowie Proteine aus Proteomen oder Expressionssystemen isoliert werden.
Figur 2 zeigt einen epitop-spezifischen Antikörper sowie zwei monomerische oder polymerische Ladungsträger oder "charge labe!" (vgl. "CL" in Fig. 5) in Form von Kationen 4 oder Anionen 5. Ein Ladungsträger 4,5 ist ein bei einem gegebenen pH-Wert ionisiertes Molekül. Es kann anionisch oder kationisch, monomer oder polymer sein. Mit Hilfe von solchen Ladungsträgern 4,5 kann die Netto-Oberflächenladung von Teilchen gezielt verändert werden. Geladene Partikel, wie z.B. Beads können auch als Ladungsträger verwendet werden.
Beispiele von anionischen Ladungsträgern 5 sind: Polyglutaminsäure (PGA); anionische oder derivatisierte Proteine, wie Albumin; anionische Polysaccharide, wie Heparin oder Algininsäure, Polyasparaginsäure, Polyacrylsäure und Polya- minsäuren mit einer negativen Netto-Ladung bei einem brauchbaren pH (z.B. im Bereich von pH 4 bis 10). Anionische Polymere mit einem Molekulargewicht von 500 bis etwa 500O00 Dalton werden bevorzugt. An ein spezifisches Bindungsmolekül können auch mehrere monomerische oder polymerische Ladungsträger gebunden werden, um die Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen noch stärker auszubilden. Beispiele von bevorzugten kationischen Ladungsträgern 4 umfassen homopolymere oder copolymere Proteine mit einem bevorzugten Molekulargewicht von 500-500O00 Dalton; quaternäre Ammoniumver- bindungen mit zwischen 1 % bis 10 % Stickstoffanteil (ohne Gegenion). Kommerziell erhältliche quaternäre Ammonium-Polymerverbindungen umfassen z.B. die Produkte MERQUAT.RTM. (Calgon, Pittsburgh, PA, USA), CELQUAT.RTM. (National Starch and Chemical Corp., Bridgewater, NJ, USA) , GAFQUAT.RTM. (GAF Corp., Wayne, NJ, USA)und MAGNIFLOC.RTM (CYTEC Ind., Indianapolis, IN, USA) sowie Hexadimetrinbromid (POLYBRENE.RTM) und Diethylaminoethyl- Dextran (beide von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Diese und weitere anionischen und kationischen Ladungsträger sind im Patent US 5,670,381 beschrieben, auf welches hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Ein solcher Antikörper (vgl. Fig. 2) wird in der Folge als Bindungsmolekül 3 oder "binding molecule" bezeichnet. Die Bindung zwischen einem Bindungsmolekül 3 und einem Teilchen l',l" sowie die Bindung zwischen einem Ladungsträger 4,5 und dem Bindungsmolekül 3 kann kovalent oder nicht-kovalent (z.B. adsorptiv, auf Van-der-Waals-Kräften oder Wasserstoffbrücken, auf einer Biotin-Streptavi- din-Wechselwirkung etc. beruhend) sein. Das Bindungsmolekül 3 kann z.B. ein Antikörper (vgl. Fig. 2), Streptavidin, Biotin, Rezeptor, Ligand, Chelatbildner (z.B. Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), ein niedrig-affiner Binder (Pro- tein-Protein-Wechselwirkung) oder ein chemisch aktiviertes Molekül (z.B. aktivierter Ester, Affinitätslabel) sein. Den Komplex bestehend aus Bindungsmolekül 3 und Ladungsträger 4 bzw. 5 nennen wir geladenes Bindungsmolekül 6 oder "charge label binding molecule"..
Figur 3 zeigt zu trennende Zellen mit entsprechenden Epitopen 2', 2". Dabei sind in Fig. 3A die beiden Epitope des ersten Typs 2' negativ und in Fig. 3B die drei Epitope des zweiten Typs 2" positiv ladungsmarkiert. Die Netto-Oberflächenladung der markierten Zellen ist deshalb stark verändert, so dass sich diese Zellen mit ihrer spezifisch veränderten Netto-Oberflächenladung in der FFE un- terschiedlich verhalten. Den Komplex aus Teilchen 3 und geladenem Bindungsmolekül 6 nennen wir ladungsmodifiziertes Teilchen 7', 7" oder "charge modified particle". Vorzugsweise wird die Netto-Oberflächenladung der Zellen so verändert, dass sich ein Zelltyp in einem Trennmedium 8 einer erfindungsgemässen Vorrichtung gegen die Kathode 9 und der andere Zelltyp gegen die Anode 10 bewegt, wie dies im Prinzipschema von Figur 4 dargestellt ist. Dabei entfernen sich die zwei Gruppen ladungsmodifizierter Teilchen 7', 7" bzw. die zwei ladungsmodifizierten Zelltypen im Wesentlichen gleichzeitig von den unmarkierten bzw. nicht-ladungsmodifizierten Hintergrundzellen 7, welche sich im Wesentlichen in der Mitte (oder zumindest in einer grossen Entfernung von den Elektroden 9,10 im Trennmedium 8 der erfindungsgemässen Vorrichtung bewegen. Der Pfeil gibt dabei die Hauptfliessrichtung des Trennmediums 8 an. In einem Sammelbereich 11 werden die verschiedenen, von einander getrennten Zelltypen aufgesammelt und einer Weiterverwendung zugeleitet. Das Sammein geschieht in an sich bekannter Weise über in einer Reihe angeordnete Ablassöffnungen. Die Auflösung der FFE wird im Wesentlichen durch das Migrationsverhalten der Teilchen 7,7' und die Grosse und Anzahl der Ablassöffnungen bestimmt. Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und die beiden seitlichen, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissenmedium 20 gebildeten Fokussierkissen 12,13 (vgl. auch Fig. 7).
Die Masse der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" wird durch die FFE in etwa in einer Normalverteilung den Ablassöffnungen zugeleitet, wenn man von einem (ungewollten) Anhaften von ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" an den Oberflächen der Elektroden 9, 10 absieht. In Fig. 7A ist so eine Normalverteilung in einer schematischen Querschnittsansicht dargestellt. Weil aber dieses Migrationsverhalten der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" zu einer schlechten Auflösung der FFE führen kann, wird vorzugsweise je ein Fokussierkissen 12,13 aus einem ebenfalls fliessfähigen, elektrisch hoch-leitenden Trennmaterial, in der unmittelbaren Nähe der Elektroden 9,10 vorgesehen. Dieses Fokussierkissen 12,13 verhindert durch seine hohe elektrische Leitfähigkeit, dass die ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" bis ganz zur jeweiligen Elektrode diffundieren können. An der Grenze zwischen dem Trennmedium 8 und dem Kissenmedium 20 kommt es zu einer Konzentration der ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7", wie dies in Fig. 7B dargestellt ist. Vorzugsweise fliessen dabei Trennmedium 8 und Kissenmedium 20 in die gleiche Richtung. Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung von erfindungsgemäss verwendbaren Trennungsmitteln in einer möglichen Anordnung und Wechselwirkung mit einem zu trennenden Teilchen. Das ladungsmodifizierte Teilchen 7', 7" besteht hier aus einem Protein P an welches in an sich bekannter Weise eine Kette von Histidinmolekülen H (ein sogenanntes "His Tag") angehängt worden ist. An dieses His Tag gebunden ist ein geladenes Bindungsmolekül 6. Diese geladene Bindungsmolekül 6 besteht aus Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure = Ni-NTA), welches an die Histidinmoleküle bindet. Der anionische Ladungsträger 5 ist hier kovalent an die Nickel-Nitrilo-Tetraessigsäure, das Bindungsmolekül 3 gebunden.
Figur 6 zeigt schematisierte Draufsichten auf erfindungsgemässe Vorrichtungen. Diese Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung umfassen zumindest einen mit einem Trennmedium 8 durchfliessbaren Trennraum 14. Dieser Trennraum ist durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt. Diese FFE-Vorrichtung umfasst zudem eine Dosierpumpe (nicht dargestellt) zum Fördern des Trennmediums 8, welches über Medienzuführungen 15,15' in den Trennraum 14 gelangt und diesen über Auslässe 16 wieder verlässt. Des Weiteren umfasst die FFE-Vorrichtung Elektroden 9,10 zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium 8 sowie Probeaufgabestellen 17 zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen 7, 7', 7" und Fraktionierstellen 18 zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium 8. Zwei separate Förderkanäle 15' der Dosierpumpe sind mit dem Trennraum 14 im Bereich der elektrodennahen Fraktionierauslässe 16' verbunden, um Medium zuzugeben. Diese zwei se- paraten Förderkanäle der Dosierpumpe dienen vorzugsweise zum Ausbilden je eines elektrisch hoch-leitenden Fokussier oder Führungskissens für die ladungsmodifizierten Teilchen 7', 7" in den elektrodennahen Bereichen 19 des Trennmediums 8 und sind mit einem separaten Mediumbehälter (nicht dargestellt) zum Bereitstellen eines elektrisch hoch-leitenden Kissenmediums verbunden. Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen isoelektrischen Fokussierung
(CHIEF) beruht auf dem unterschiedlichen pl-Wert der zu trennenden Teilchen. Dabei entspricht dieser pl-Wert den pH-Wert des umgebenden, inhomogenen Mediums, gegenüber dem die Teilchen neutral erscheinen. Die FFE von Teilchen auf Grund ihres unterschiedlichen isoelektrischen Punktes ermöglicht die Isolierung von Analyten bzw. Teilchen mit geringsten Differenzen in ihren pl- Werten. Am isoelektrischen Punkt pl (d.h. an der Stelle des Trennmediums 8, welche gerade den pH-Wert aufweist, bei dem für ein gegebenes Teilchen (z.B. ein Proteinmolekül) die Anzahl negativer und positiver Ladungen gleich gross ist) ist die Gesamtladung bzw. Netto-Oberflächenladung dieses Teilchens gleich null. Der im Trennmedium 8 einer CHIEF-Vorrichtung inhärente Fokussiereffekt bewirkt, dass ein Teilchen l',l", welches vom pl wegdiffundiert, automatisch wieder eine (positive oder negative) Netto-Oberflächenladung erhält und durch das elektrische Feld wieder zum pl hin bewegt wird.
Auf Grund der Wechselwirkung von Analyten bzw. Teilchen mit einem einzigen Bindungsmolekül oder "binding molecule" mit hoher Ladungsdichte ist eine wesentliche Veränderung des pl-Wertes und somit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen isolektri- schen Fokussierung ist besonders geeignet zur mikropräparativen bis präparativen Isolierung von Biopolymeren allgemein und von Biopartikeln, deren biologische Funktion bzw. deren Integrität im Bereich der gewählten Spannbreite des pH-Gradienten im Trennmedium gesichert ist. Dies gilt im Fall von vielen Ver- tretern der Viren, Bakterien, Zellorganellen und Membrandomänen, da durch Zugabe von "osmotischen Expandern" die Erhaltung eines idealen osmotischen Druckes gesichert werden kann : Durch Zugabe von ungeladenen Substanzen (z.B. Zucker, als nicht-ionischer, osmotischer Expander) und/oder von Salzen (z.B. NaCI, als ionischer, osmotischer Expander) kann ein für einen Zelltyp op- timaler osmotischer Druck, d.h. isomolale Konditionen erzeugt werden (z.B. für Säugerzellen 250-310 mosmol). Figur 6 zeigt eine erfindungsgemässe Vorrichtung zur Trennung von ladungsmodifizierten Teilchen 7',7" von nicht-ladungsmodifizierten Teilchen 7 in einem Trennmedium 8, welches in einem Trennraum 14 zwischen zwei Elektroden 9,10 fliesst (grosser Pfeil, 8). Der Trennraum 14 umfasst dabei den Raum für das Trennmedium 8 und zwei seitliche, elektrodennahen Bereiche 19 für die mit dem Kissenmedium 20 gebildeten Fuhrungs- bzw. Fokussierkissen. Die Elektroden 9,10 sind vorzugsweise als Elektrodenräume ausgebildet, von einem durch eine elektrische Zuleitung 23,23' kontaktierten Elektrodenpuffer 24 durchflössen und weisen gegenüber dem Trennraum 14 eine vorzugsweise semipermeable Membran 25 auf. Der Elektrodenpuffer 24 wird über separate Zuleitungen 26,26' in die Elektrodenräume eingeleitet (in Fig. 6 nur teilweise gezeigt) und veriässt diese auch über separate Auslässe 27,27'. Zum Umwälzen und gegebenenfalls auch zum Kühlen des Elektrodenpuffers wird vorzugsweise eine zusätzliche Pumpvorrichtung (nicht gezeigt) verwendet.
Figur 6A zeigt eine solche CHIEF-Vorrichtung mit einem linearen pH-Gradienten. Ein Trennmedium 8 fliesst in laminarer Bewegung (vorzugsweise von unten nach oben in einem schräg gehaltenen Trennraum) zwischen den beiden Elektroden (grosser Pfeil), wird im Bereich der Auslassöffnungen durch einen Ge- genfluss von Trennmedium (kleiner Pfeil) abgebremst und veriässt den Trennraum 14 in Fraktionen über die Auslassöffnungen. Eine Probe mit drei zu trennenden Teilchengruppen wird über den Probeneinlass dem Trennmedium zugegeben und durch den laminaren Fluss des Trennmediums mitbewegt. Die drei Teilchengruppen werden im pH-Gradienten, welcher durch das zwischen den Elektroden im Trennmedium erzeugte elektrische Feld erzeugt wird, kontinuierlich aufgetrennt, fokussiert und in getrennten Fraktionen gesammelt. Wie aus Fig. 6D ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden vorzugsweise vorgesehenen Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - relativ gering und ho- mögen. Der pH-Gradient wird im Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 aufgebaut. Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen FFE-Zonenelektrophorese (PZE) beruht auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen gegenüber dem verwendeten Trennmedium. Die FFE- Zonenelektrophorese ermöglicht somit die Isolierung von Analyten bzw. Teil- chen auf Grund ihrer unterschiedlichen Grosse und/oder Form und/oder Netto- Oberflächenladung.
Auf Grund der Wechselwirkung von Teilchen mit einem einzigen Bindungsmolekül mit hoher Ladungsdichte ist eine wesentliche Veränderung des Wertes der elektrophoretischen Mobilität und damit eine schnelle und vollständige Trennung des Komplexes aus Teilchen und Bindungsmolekül 3 von den übrigen Spezies der Probe zu erwarten. Das Verfahren der kontinuierlichen FFE-PZE ist besonders geeignet im Fall der Trennung von "empfindlichen" Biopartikeln und Komplexen, bei deren Trennung besondere Anforderungen an das Trennmedium ge- stellt werden müssen. Dies insbesondere dann, wenn die biologische Funktion und Integrität dieser Teilchen auch nach der Trennung gewährleistet sein sollen. Als besondere Anforderungen gelten in diesen Fällen : Eng begrenzter pH- Bereich der Trennmedien, gute Pufferkapazität der Trennmedien, physiologische Verträglichkeit der verwendeten Puffersubstanzen, Mindestgehalte von diversen "essentiellen" Kationen und Anionen etc.. Obwohl die üblichen Zellkulturmedien als wenig kompatibel mit allen Techniken der Elektrophorese gelten, ist die erfolgreiche Trennung von Zellen mit FFE-PZE möglich.
Figur 6B zeigt eine solche PZE-Vorrichtung, in welcher die Proben an Hand ihrer Ladung und zu einem geringeren Mass an Hand ihrer Form und Grosse aufgetrennt werden. Wie aus Fig. 6E ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - relativ gering und homogen. Der pH-Wert ist im ganzen Trennmedium gleich. Die FFE-Trenntechnik der kontinuierlichen Isotachophorese (CITP) beruht ebenfalls auf dem Unterschied im Wert der elektrophoretischen Mobilität der zu trennenden Teilchen. Im Unterschied zur FFE-PZE erfolgt die Trennung in inhomogenen Trennmedien und bietet wegen eines inhärenten "Fokussierungsef- fektes" eine bessere Auflösung: Wenn während der CITP aus einer aufgetrennten Bande von Teilchen (z.B. Proteinen) einzelne Teichen wegdiffundieren, so gelangen diese Teilchen in ein Medium mit unterschiedlicher elektrischer Feldstärke, wodurch die Teilchen beschleunigt oder verlangsamt werden. Der inhärente Fokussiereffekt bedingt, dass die langsamer oder schneller wandernden Teilchen wieder in der Hauptfraktion einfinden.
Diese FFE-Trenntechnik ist prinzipiell für Biopartikel und Zellen geeignet, deren Trennung in Medien ohne spezielle "essentielle Kationen" (z.B. Mg++ oder Ca++) bzw. "essentielle Anionen" (z.B. Cl"), die für die Stabilität und Vitalität von Zel- len wichtig sind, nicht möglich ist.
Figur 6C zeigt eine solche CITP-Vorrichtung, in welcher diskrete Spacer verwendet werden. Solche diskrete Spacer sind Ionen mit wohlbekannter, definierter Mobilität, welche sich in der CITP zwischen zu trennende Teilchen drängen und dazu beitragen, dass die Trennung effizient abläuft. Als solche diskrete Spacer lassen sich auch Ampholyte einsetzen. Wie aus Fig. 6F ersichtlich, ist die elektrische Leitfähigkeit des Trennmediums 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 - mit hoher Leitfähigkeit in den elektrodennahen Bereichen 19 - zumindest teilweise gradientenartig ausgebildet und inhomogen. Zusätzlich wird ein zumindest teilweiser pH-Gradient im Trennmedium 8 zwischen den beiden Fokussierkissen 12,13 aufgebaut, wobei sich die Bereiche der beiden Gradienten im Wesentlichen decken und sowohl die pH-Werte als auch die elektrische Leitfähigkeit im Bereich der Fokussierkissen 12,13 jeweils unterschiedlich hoch sind.
Diverse Kombinationen dieser Trenntechniken (CHIEF und FFE-PZE bzw. CHIEF und CITP) sind möglich. So können z.B. verschiedene Trennmedien gleichzeitig im Trennraum der FFE-Apparatur verwendet und damit auch gleichzeitig unterschiedliche Trennparameter genutzt werden. Die erfindungsgemäss vorgeschlagene Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäss vorgeschlagene Verfahren erlauben die Durchführung von kontinuierlichen Betriebsarten, bei denen die Trennung der Teilchen 7,7, ',7" bei kontinuierlichem Trennmediumfluss, permanenter Anwendung des elektrischen Feldes während der gesamten Trennung und kontinuierlichem Sammeln durchgeführt wird. Dabei wird zwischen kontinuierlich präparativen (Probe wird kontinuierlich bei gleichbleibenden Trennbedingungen zugegeben) und semipräparativ/analyti- schen (diskontinuierliche Probenzugabe bei gleichbleibenden Trennbedingungen) unterschieden.
Bei einer ebenfalls möglichen, diskontinuierlichen Betriebsart strömt das Trennmedium 8 kontinuierlich : Die Probenaufgabe erfolgt bei abgeschalteter Hochspannung; nach dem Stoppen der Probenaufgabe wird der Mediumtransport abgeschaltet bzw. stark gedrosselt bzw. reduziert. Darauf wird die Hoch- Spannung eingeschaltet, bis die Probenauftrennung erfolgt ist. Nach einer vorgegebenen Zeit wird die Spannung ausgeschaltet und die aufgetrennte Probe mit erhöhtem Mediumdurchfluss aus der Trennkammer eluiert und gesammelt. Es kann zudem vorgesehen sein, dass mittels einer weiteren Dosierpumpe bzw. separaten Förderkanälen der Mediumpumpe - vorzugsweise am den Medienzu- führungen 15,15' entgegengesetzten Ende der FFE-Vorrichtung - ein Hilfsmedium 21 über Hilfsmediumzuführungen 22 in die Trennkammer 14 geleitet und gemeinsam mit dem Trennmedium 8 über die Fraktionierstellen 18 abgeführt (vgl. Figuren 6A bis 6C) wird.
Figur 7 zeigt den Effekt der Fokussierkissen 12,13, wobei die Grenze des Fokus- sierkissens mit dem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20, welches im Wesentlichen parallel zu der Elektrode 9,10 verläuft, gestrichelt angedeutet ist. Wird kein Fokussierkissen erzeugt (Fig. 7A), so stellt sich in etwa eine Normalverteilung (schraffiert) der an Hand der selektiv veränderten Netto-Oberflächen- ladung von einem Rest einer Probe abgetrennten Teilchen ein. Es kann auch vorkommen, dass sich Teilchen an der Elektrode 9,10 festsetzen (nicht gezeigt), so dass zum Teil wesentliche Verluste an diesen, z.B. auf Grund ihrer besonderen biologischen Relevanz abgetrennten Teilchen, eintreten. Dies kann mit ei- nem Fokussierkissen 12,13 aus einem elektrisch hoch-leitenden Kissenmedium 20 erfolgreich verhindert werden (vgl. Fig. 7B): Dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit verhält sich das Fokussierkissen 12,13 wie eine Elektrode 9,10, wobei - dank der hohen elektrischen Leitfähigkeit des Kissenmediums 20 - ver- hindert wird, dass Teilchen bis zur tatsächlichen Elektrode 9,10 gelangen können. Wie in Fig. 7B gezeigt, bildet sich an der Kissengrenze eine Konzentration der isolierten Teilchen (schraffiert) aus, welche das Mass einer Normalverteilung (gestrichelt dargestellt) bei Weitem übertrifft. Über eine Fraktionierstelle 18, die gerade in diesem Bereich positioniert ist, kann somit eine wesentlich grössere Menge dieser Teilchen in höherer Konzentration der FFE-Vorrichtung entnommen und der Weiterverwendung zugeführt werden. Insbesondere für die Isolierung von Zellen, Organellen, Membranteilen oder Komplexen von Biomolekülen, welche an Hand ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung mittels der FFE vom Rest einer Probe abgetrennt werden sollen, stellt die Verwendung eines solchen Fokussierkissens 12,13 eine wesentliche Verbesserung dar. Hingegen erscheint die Verwendung eines Fokussierkissens bei der Feintrennung von identische Untereinheiten aufweisenden Biomolekülen bzw. derer Komplexe als weniger vorteilhaft. Die Fuhrungs- oder Fokussierkissen 12,13 werden somit durch einen Puffer 20 gebildet, der im Vergleich zum Trennmedium 8 eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist. Da die elektrophoretische Trennleistung abhängig von der Feldstärke ist, und sich umgekehrt proportional zur Leitfähigkeit verhält, nimmt die elektrophoretische Trennleistung in den Fokussierkissen 12,13 so stark ab, dass die ladungsmodifizierten Teilchen 7',7" an der Grenzfläche zwischen dem Trennmedium 8 und den Fokussierkissen 12,13 fo- kussiert werden.
Im Folgenden werden drei Ausführungsbeispiele für Immun-FFE vorgestellt:
Beispiel A: Reinigung von zirkulierenden Tumorzellen aus Vollblut
Eine Zusammenfassung der Wertigkeit von disseminierten Tumorzellen findet sich in : Bockmann B, Grill HJ, Giesing M. Molecular characterization of minimal residual cancer cells in patients with solid tumors. Biomol Eng 2001; 17:95-111. Als Zelloberflächenmarker wird das für Epithelzellen spezifische Membranprotein "Epitheliales Glycoprotein" (EGP) verwendet. Dieses EPG wird auch von Tumorzellen epithelialer Tumoren exprimiert (Moldenhauer G, Momburg F, Möller P, Schwartz R, Hämmerling GJ. Epithelium-specific surface glycoprotein of Mr 34,000 is widely distributed carcinoma marker. BrJ Cancer 1987;56:714-21). Gegen ein Zelloberflächenepitop des EGP gibt es einen in der Literatur gut beschriebenen monoklonalen Antikörper mit der Bezeichnung Ber-EP4 (Latza U, Niedobitek G, Schwarting R, Nekarda H, Stein H. Ber-EP4: new monoclonal an- tibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J Clin Pathol 1990; 43: 213-9).
Dieser monoklonale Antikörper wird auf 2 Arten für die Immun-FFE modifiziert: A) Ein Ladungsträger 4,5 wird direkt und kovalent an den Antikörper (das Bindungsmolekül 3) gekoppelt. B) An das Antiserum wird kovalent Streptavidin gekoppelt. An das Streptavidin werden dann, frei wählbar, biotinylierte Ladungsträger 4,5 gebunden.
Zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen wird Citrat- oder Heparin-Vollblut von Patient(inn)en mit z.B. Mamma-, Ovarial- oder Colonkarzinom entweder direkt eingesetzt oder wie folgt vorbereitet:
1. Isolierung der weissen Blutkörperchen (Mononuclear Cells, MNC) über einen Dichtegradienten, mittels an sich bekannter Methoden.
2. Zugabe der entsprechend, mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Antikörper.
3. Inkubation mittels an sich bekannter Methoden. 4. Auftrennung der Zellen in der Immun-FFE:
In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium gewählt, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "So- dium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97 bekannt sind. Auf diese Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf diese Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen. Beispiel B: Isolierung von Peroxysomen
Peroxysomen sind Zellorganellen, die oxidative Reaktionen mit molekularem Sauerstoff durchführen. Sie generieren Sauerstoffperoxid für oxidative Zwecke.
Hoch-angereicherte Peroxysomen könne z.B. aus Rattenleber über eine aufwendige Dichtegradienten-Zentrifugation nach der Methode von Lüers et al. Isoliert werden (Lüers GH, Hartig R, Mohr H, Hausmann M, Fahimi HD, Cremer C, Völkl A. Immuno-isolation of highly purified peroxisomes using magnetic beads and continuous immunomagnetic sorting. Electrophoresis 1998; 19: 1205- 210) :
1. Homogenisierung der Rattenleber mit an sich bekannten Methoden.
2. Zentrifugation des Homogenisats bei 1,900 x g zur Entfernung von Zellkernen, Zelldebris, Mitochondrien und noch intakten Zellen. 3. Zentrifugation des Überstandes bei 25,000 x g.
4. Das resultierende Pellet enthält dann die sogenannte "light microsomal frac- tion" (inkl. Peroxysomen, Mikrosomen und einige Mitochondrien mit Lyso- somen) und stellt somit eine Mischung dar, welche auch die Peroxysomen umfasst.
Zur Anreicherung von Peroxysomen mit einer modifizierten Immun-FFE gibt es bereits eine Methode (Voelkl A, Mohr H, Weber G, Fahimi HD. Isolation of pero- xisome subpopulations from rat liver by means of immune free-flow electrophoresis. Electrophoresis 1998; 19 : 1140-1144). Diese bekannte Methode zur Anreicherung von Peroxysomen mit Immun-FFE wird jedoch durch das Einführen von Ladungsträgern 4,5 wie folgt modifiziert:
1. Homogenisierung der Rattenleber wie bekannt.
2. Zentrifugation bei 400 x g zur Entfernung von Zellkernen, Zelldebris, und noch intakten Zellen. 3. Der Überstand wird mit einem mit Ladungsträgern 4,5 modifizierten Antikörper gegen ein Membranprotein der Peroxysomen (z.B. PMP70; 70 kDa grosses cytoplasmatisches Membranprotein von Peroxysomen, Antikörper gegen das C-terminale, elf Aminosäuren lange, cytoplasmatische Ende) inkubiert. 4. Die Auftrennung mit Immun-FFE erfolgte, wie durch A. Völkl, H. Mohr, G. Weber und H.D. Fahimi beschrieben (Electrophoresis 1998, 19, 1140-1144), bei einer Trennmedium-Temperatur von 4°C und bei einem pH von 8.0 in einem elektrischen Feld von l'OOO V und 100 mA sowie einer Trennmedium- Flussgeschwindigkeit von ca. 5 ml/Fraktion pro Stunde. Die Proben wurden mit etwa 2 ml/Stunde in die Trennkammer eingeführt und die aufgetrennten Fraktionen wurden mit Hilfe einer 96-Kanal-Peristaltikpumpe gesammelt. Jeder einzelne Trennversuch dauerte etwa 60 bis 90 Minuten.
Beispiel C: Isolierung von rekombinanten Proteinen
Zur Expression rekombinanter Proteine gibt es Vektoren, die am 5' oder 3' Ende eines Konstruktes eine Kassette von 5-10 Histidinen an das zu exprimierende Protein anhängen können (His-Tags, vgl. Fig. 5). Diese zusätzlichen Histidine werden zur späteren Reinigung der exprimierten Proteine verwendet. Andere Vektoren enthalten z.B. Glutathion-S-Transferase als zusätzliches Element. Die- se Vektoren eignen sich zur Expression rekombinanter Proteine z.B. in E. coli, Baculovirus-infizierten Bakterien und Säugerzellen. Entsprechende Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine sind dem Fachmann bekannt.
Die derzeitigen Möglichkeiten zur Aufreinigung von rekombinant exprimierten Proteinen beruhen hauptsächlich auf affinitätschromatographischen Methoden. Diese Methoden sind relativ leicht anwendbar und - je nach Menge der zu reinigenden Proteine - skalierbar. Die affinitätschromatographische Reinigung rekombinanter Proteine hat jedoch mehrere signifikante Nachteile: 1. Ausbluten der Affinitätsmatrix 2. Verstopfen der Säulen bedingt durch die Probenmatrix (Zell-Lysate)
3. Unspezifische Bindung von Proteinen
4. Enzymatische Lyse von Proteinen (Proteolyse) Die Reinigung von rekombinanten Proteinen mit poly-His-Tags mittels immobilisierten Ni-NTA (Nickel Nitrilotriacetic Acid) Chelaten ist dem Fachmann bekannt. Die feste Phase kann für präparative Reinigungen in Chromatographiesäulen gepackt sein (z.B. Ni-NTA-Agarose), für analytische Anwendungen stehen (z.B. Ni-NTA) Magnetpartikel zur Verfügung.
Besonders geeignet für die Reinigung rekombinanter Proteine ist die in Fig. 5 dargestellte, erfindungsgemässe Immun-FFE, die folgende Schritte umfasst:
1. Lyse der Zellen (z.B. Hefen, Bakterien, Säugerzellen) nach an sich bekann- ter Methode.
2. Bindung von Ladungsträgern 4,5 an die His-tagged Proteine: Variante 1: Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 in
Form von Ni-NTA und Bindung dieses geladenen Bindungsmoleküls 6 an die His-Tags; oder Variante 2: Bindung der Ladungsträger 4,5 an ein Bindungsmolekül 3 in
Form eines anti-poly-His Antikörpers und Bindung dieses geladenen Bindungsmoleküls 6 an die His-Tags.
3. Inkubation nach an sich bekannter Methode.
4. Separation mittels FFE (qualitativ aber auch quantiativ möglich) : In einem ersten Versuch wurden Trennbedingungen und Trennmedium gewählt, wie sie aus Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995) "So- dium Chloride in the Separation medium enhances cell compatibility of Free Flow Electrophoresis", Electrophoresis 16: 92-97 bekannt sind. Auf diese Publikation wird hier ausdrücklich Bezug genommen. In einem weiteren Versuch wurde ein Trennmedium verwendet, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/EP01/10036 beschrieben ist. Auf diese Anmeldung wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
5. Sammeln der isolierten His-tagged Proteine
Die His-tagged Proteine können entweder nun direkt verwendet werden oder die His-Tags werden vor der weiteren Verwendung enzymatisch abgespalten.
Zum Abtrennen der His-Tags von den Proteinen gibt es mehrere Möglichkeiten : Für Variante 1 : a) Ablösen des Chelats durch an sich bekannte Inkubation mit Imidazol und ggf. erneute Reinigung des Proteins auf FFE; b) An sich bekannte enzymatische Abspaltung des His-Tags mit Thrombin oder Exoprotease und ggf. erneute Reinigung des isolierten Proteins auf FFE.
Für Variante 2: c) Ablösen der Antikörper mit an sich bekannten Methoden, z.B. durch Verändern der Salzkonzentration oder des pH. d) Enzymatische Abspaltung der His-Tags mit an sich bekannten Methoden. e) Erneute Reinigung mit FFE.
Der Charge Label bzw. die Ladungsträger oder das den Ladungsträger tragende Agens (z.B. Biomolekül) kann auch zusätzlich (z.B. mit einem Farbstoff) markiert sein. Dadurch wird eine Detektion während oder nach der FFE möglich. Ladungsträger könnten auch alle Arten von Partikeln sein (z.B. Beads aller Art, wie Latex, Agarosepartikel, Kolloide, etc.). Ladungsträger können auch prak- tisch beliebige Kombinationen von Beads und/oder Antikörpern und/oder ladungstragenden Molekülen und/oder Fluoreszenzmarkern und/oder Farbstoffen sein. Beads können z.B. mit Fluoreszenz- oder anderen Farbstoffen gefärbt sein. Beads können gleichzeitig eine Fluoreszenzmarkierung (innen oder aussen), den Charge Label und das Bindungsmolekül (z.B. Antikörper oder Ni-NTA) tragen. Falls Beads verwendet werden, welche eine enzymatisch spaltbare Brücke besitzen, dann können nach erfolgter Reinigung (z.B. Reinigung von rekombinanten Proteinen mit Ni-NTA) die Beads vom gereinigten Molekül abgespalten werden. Besonders bevorzugt werden Beads, welche fluoreszierend sind und an der Oberfläche mit Ladungsträgern und Bindungsmolekülen versehen sind. Mögliche Maßnahmen zur Erhaltung der biologischen Aktivität bzw. Vitalität von Biopartikeln bei den verschiedenen FFE-Trenntechniken ergeben sich aus der folgenden Tabelle 1 :
Erklärungen : PZE: kontinuierliche Free Flow Zonenelektrophorese CITP: kontinuierliche Free Flow Isotachophorese CHIEF: kontinuierliche Isoelektrische Fokussierung +++ = uneingeschränkte Anwendung
+ + = nur geringfügig eingeschränkte Anwendung. + = nur in Sonderfällen anwendbar
= Anwendung nicht möglich
Die erfindungsgemässe Auftrennung von Teilchen ermöglicht ein konzentriertes Sammeln bzw. eine Anreicherung von biologisch relevanten Teilchen, deren Analyse bzw. deren Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren wegen des zu hohen Hintergrundes an gleichzeitig anwesenden, verwandten, aber irrelevanten Teilchen bisher nicht zugänglich war. Die vorge- stellte FFE-Methoden und Vorrichtungen ermöglichen somit Isolation und demzufolge die Nutzung von naturgemäss in äusserst geringen Konzentrationen vorliegenden Teilchen bzw. die Bereitstellung derer biologisch relevanten Informationen zur Verwendung in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren. Zudem können die isolierten Teilchen zum Auffinden und Charakterisieren von Targets für die Entwicklung von Medikamenten, von Targets für die Anwendung in der Diagnostik, der Therapie-Auswahl und dem Therapiemonitoring sowohl für Menschen, als auch für Tiere und Pflanzen dienen.
Anwendungen der erzielten Ergebnisse umfassen z.B. aus Vollblut isolierte Tumorzellen zur Target-Identifikation in der Entwicklung von Medikamenten gegen migrierende. Tumorzellen.
Für die gleichen Merkmale gelten in allen Figuren die identischen Bezugszeichen, auch wenn diese nicht ausdrücklich zitiert sind.
Die offenbarten, erfindungsgemässen Verfahren eignen sich - gegebenenfalls nach entsprechender Anpassung - auch für die Anwendung in verschiedensten Gebieten der Chromatographie, wie beispielsweise in der Affinitätschromatographie von organischen oder anorganischen Molekülen und Polymeren.

Claims

Patentansprüche
1. Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den
Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder veriässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") und Fraktionierstellen (18) zum Ab- führen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten auf- weisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7), umfasst, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Vorrichtung zwischen dem Trennmedium (8) und mindestens einer Elektrode (9,10) angeordnete Fuhrungs- oder Fokussierkissen (12,13) umfasst, wobei diese Fokussierkissen (12,13) aus einem Kissenmedium (20) bestehen, welches eine gegenüber dem Trennmedium (8) stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist und wobei diese Vorrichtung separate Kanäle (15') zum Zuführen dieses Kissenmediums (20) zu den Fokussierkissen (12,13) umfasst.
2. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Kissenmedium (20) mit den Bereichen (19) in der Nähe von Anode (10) und Kathode (9) eine schnellere erste Fliessbewegung als im zwischen den Bereichen (19) liegenden Trennmedium (8) erzeugbar ist, wobei die beiden Fliessbewegungen gleichgerichtet sind.
3. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 1, oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke des mit dieser Vorrichtung erzeugten elektrischen Feldes während dem Betrieb der FFE-Vorrichtung an eine selektiv veränderte Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen (1,1',1") anpassbar ist.
4. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie Trennmittel umfasst, mit denen die Netto-Oberflächenladung der zu trennenden Teilchen (1,1', 1") vorgängig zum Betrieb der FFE- Vorrichtung an die Stärke des mit dieser Vorrichtung erzeugbaren elektrischen Feldes anpassbar ist.
5. FFE-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie Trennmittel umfasst, mit welchen die Netto- Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") zum im Wesentlichen gleichzeitigen, selektiven Bewegen einer ersten Fraktion dieser Teilchen in Richtung zu der Kathode (9) hin und einer zweiten Fraktion in Richtung zu der Anode (10) hin veränderbar ist.
6. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass diese Trennmittel an Bindungsmoleküle (3) gebundene Ladungsträger (4,5) umfassen, welche eine stark positive oder negative Ladung aufweisen.
7. FFE-Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
Ladungsträger (4,5) kovalent an die Bindungsmoleküle (3) gebunden sind.
8. FFE-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosierpumpe zusätzliche Förderkanäle, bzw. dass die FFE-Vorrichtung eine weitere Dosierpumpe zum Fördern eines
Hilfsmediums (21) umfasst, welches über Hilfsmedienzuführungen (22) in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Fraktionierstellen (18) und Auslässe (16) wieder veriässt. Verfahren zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") - insbesondere zum Auftrennen von Zellen, Zellbestandteilen, Organellen oder Biomolekülen bzw. von Teilen oder Komplexen derselben - insbesondere unter Verwendung einer Free-Flow-Elektrophoresevorrichtung gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, welche einen Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, eine Dosierpumpe zum Fördern eines Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder veriässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabestellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen (1,1', 1") im Trennmedium (8) umfasst, welches folgende Schritte umfasst:
• Bereitstellen eines Trennmediums (8)
• Fördern des Trennmediums (8) mittels der Dosierpumpe über die Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14);
• Durchfliessen des Trennraums (.14) mit dem Trennmedium (8); • Fraktionieren des Trennmediums (8) über diskrete Auslässe (16);
• Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8);
• Kombinieren eines zu trennenden Teilchens (l',l") mit selektiv wählbaren Ladungsträgern (4,5) zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto- Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht-ladungsmodifizierte Teilchen (7);
• Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") zum Trennmedium (8) im Trennraum (14) über die Probeaufgabestellen (17); • Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen (1,1', 1") im Trennmedium (8) über Fraktionierstellen (18) ;
• Sammeln der Fraktionen mit den abgetrennten Teilchen; dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Trennmedium (8) und mindestens einer Elektrode (9,10) Fuhrungs- oder Fokussierkissen (12,13) mit einem Kissenmedium (20) erzeugt werden, wobei dieses Kissenmedium (20) eine gegenüber dem Trennmedium (8) stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweist und über separate Kanäle (15') zu diesen Fokussierkissen (12,13) zugeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass während dem Betrieb der FFE-Vorrichtung die Netto-Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") an die Stärke des elektrischen Feldes angepasst wird oder dass die Stärke des elektrischen Feldes an die veränderte Oberflächenladung der Teilchen (1,1',1") angepasst wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass vorgängig zum Betrieb der FFE-Vorrichtung die Netto-Oberflächenladung der Teilchen
(1,1', 1") an die Stärke des elektrischen Feldes angepasst wird oder dass die Stärke des elektrischen Feldes vorgängig zum Betrieb der FFE- Vorrichtung an die veränderte Oberflächenladung der Teilchen (1,1',1") angepasst wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese selektive Veränderung der Netto-Oberflächenladung mit an Bindungsmoleküle (3) gebundenen Ladungsträgern (4,5) erzeugt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als ein geladenes Bindungsmolekül (6) ein epitop-spezifischer Antikörper oder ein Ni-NTA verwendet wird, die an entsprechenden Epitopen (2', 2") auf den Teilchenoberflächen immobilisiert werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) eine stark positive oder negative Ladung aufweist, als Bead, Latex- oder Agarosepartikel, Molekül und dergleichen ausgebildet ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere Ladungsträger (4,5) oder Polymere derselben ausgewählt werden aus einer Gruppe umfassend : Lysin, Arginin, Histidin,
Aspartat und Glutamat.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) kovalent an den epitop-spezifischen Antikör- per oder an ein Ni-NTA-Molekül gebunden wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es die Verwendung eines oder mehrere Bindungsmoleküle (3) umfasst, die ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Neutravidin-, Streptavidin/Biotin- und sekundäre Antikörper-Systeme sowie Chelatbild- ner.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste, eine negative Netto-Oberflächenladung aufweisende Teil- chengruppe im elektrischen Feld des Trennmediums (8) in Richtung gegen die Anode (10) und - im Wesentlichen synchron dazu - eine zweite, eine positive Netto-Oberflächenladung aufweisende Teilchengruppe im elektrischen Feld des Trennmediums (8) in Richtung gegen die Kathode (9) bewegt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass während dem Betrieb der FFE-Vorrichtung im Kissenmedium (20) mit den Bereichen (19) in der Nähe von Anode (10) und Kathode (9) eine schnellere erste Fliessbewegung als im zwischen den Bereichen (19) lie- genden Trennmedium (8) erzeugt wird, wobei die beiden Fliessbewegungen gleichgerichtet sind.
20. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass durch Einstellen eines bestimmten pH-Wertes im Trennmedium (8) bzw. in Teilen desselben mit einem Puffer-System auf den Ladungsträgern (4) oder Polymeren derselben, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Lysin, Arginin und Histidin, eine positive
Ladung ausgeprägt wird.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass durch Einstellen eines bestimmten pH-Wertes im Trennmedium (8) bzw. in Teilen desselben mit einem Puffer-System auf den Ladungsträgern (5) oder Polymeren derselben, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend : Aspartat und Glutamat, eine negative Ladung ausgeprägt wird.
22. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zum kovalenten Binden an die Bindungsmoleküle (3) Biomoleküle verwendet werden, welch aus der Gruppe ausgewählt sind, welche primäre, sekundäre Antikörper, Avidine, Rezeptoren sowie Enzyme umfasst.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass zum kovalenten Binden an die Bindungsmoleküle (3) Liganden verwendet werden, welch aus der Gruppe ausgewählt sind, welche Biotin, Steroide und Enzymsubstrate umfasst.
24. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass mit diesem Verfahren Teilchen (1,1', 1") isoliert werden, welche zur Charakterisierung bzw. Darstellung von Targets für die Entwicklung von Medikamenten bzw. für die Anwendung in der Diagnostik und/oder der Therapie-Auswahl und/oder dem Therapiemonitoring für
Menschen, Tiere oder Pflanzen dienen.
25. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass mit diesem Verfahren eine selektive Abreicherung bzw. Depletion von Teilchen aus einem Teilchengemisch erzeugt wird.
26. Trennmittel zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") mittels der Free-Flow- Elektrophorese-Technik in einer FFE-Vorrichtung, insbesondere in einer FFE-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder veriässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabe- stellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1',1") und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teil- chen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht- ladungsmodifizierte Teilchen (7), umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es ein gegenüber dem Trennmedium (8) eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweisendes, elektrisch hoch-leitendes Kissenmedium (20) ist, welches über separaten Förderkanäle (15') zum Ausbilden zumindest eines elektrisch hoch-leitenden Fuhrungs- oder Fokussierkissens (12,13) für die ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7") zwischen den Elektroden (9,10) und dem Trennmedium (8) in den elektrodennahen Bereichen (19) des Trennmediums (8) einleitbar ist.
7. Trennmittel zum Trennen von Teilchen (1,1', 1") mittels der Free-Flow- Elektrophorese-Technik in einer FFE-Vorrichtung, insbesondere in einer FFE-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, mit zumindest einem mit einem Trennmedium (8) durchfliessbaren Trennraum (14), der durch einen Boden und einen Deckel sowie durch diese beiden in einem Abstand zu einander haltenden Abstandhalter begrenzt ist, wobei diese FFE-Vorrichtung zudem eine Dosierpumpe zum Fördern des Trennmediums (8), welches über Medienzuführungen (15,15') in den Trennraum (14) gelangt und diesen über Auslässe (16) wieder veriässt, Elektroden (9,10) zum Anlegen eines elektrischen Feldes im Trennmedium (8) sowie Probeaufgabe- stellen (17) zum Hinzufügen eines aufzutrennenden Gemisches von Teilchen (1,1', 1") und Fraktionierstellen (18) zum Abführen von mittels der FFE getrennten Teilchen im Trennmedium (8) umfasst, wobei die Vorrichtung selektiv wählbare Ladungsträger (4,5) zum Kombinieren mit zu trennenden Teilchen (l',l") und zum Erzeugen von ladungsmodifizierten Teil- chen (7', 7"), die - wegen ihrer selektiv veränderten Netto-Oberflächenladung - in der FFE ein anderes Migrationsverhalten aufweisen, als nicht- ladungsmodifizierte Teilchen (7), sowie ein gegenüber dem Trennmedium (8) eine stark erhöhte elektrische Leitfähigkeit aufweisendes, elektrisch hoch-leitendes Kissenmedium (20) umfasst, wobei dieses Kissenmedium (20) über separaten Förderkanäle (15') zum Ausbilden zumindest eines elektrisch hoch-leitenden Fuhrungs- oder Fokussierkissens (12,13) für die ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7") zwischen den Elektroden (9,10) und dem Trennmedium (8) in den elektrodennahen Bereichen (19) des Trennmediums (8) einleitbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es ein gela- denes Bindungsmolekül (6) ist, mit welchem die Netto-Oberflächenladung der Teilchen (1,1', 1") zum im Wesentlichen gleichzeitigen, selektiven Bewegen einer ersten Fraktion dieser Teilchen in Richtung zu der Kathode (9) hin bzw. einer zweiten Fraktion in Richtung zu der Anode (10) hin, veränderbar ist.
28. Trennmittel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das geladene Bindungsmolekül (6) ein Bindungsmolekül (3) und einen Ladungsträger (4,5) mit einer stark positiven oder negativen Ladung umfasst.
29. Trennmittel nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) als Bead, Latex- oder Agarosepartikel, Molekül und dergleichen ausgebildet und an das Bindungsmolekül (3) gebunden ist.
30. Trennmittel nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmolekül (3) ein epitop-spezifischer Antikörper oder ein Ni-
NTA-Molekül ist, welches auf den Teilchenoberflächen immobilisierbar ist.
31. Trennmittel nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass das geladene Bindungsmolekül (6) bzw. das Bindungsmolekül (3) eine detektierbare Markierung, insbesondere einen Färb- oder Leuchtstoff, zur Detektion der aktuellen Position der ladungsmodifizierten Teilchen (7', 7") im Trennmedium (8) umfasst.
32. Trennmittel nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeich- net, dass das geladene Bindungsmolekül (6) einen oder mehrere Ladungsträger (4,5) oder Polymere derselben umfasst, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe umfassend: Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat und Glutamat.
33. Trennmittel nach einem der Ansprüche 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Ladungsträger (4,5) kovalent an das Bindungsmolekül (3) gebunden ist.
4. Trennmittel nach einem oder mehreren der Ansprüche 28 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmolekül (3) ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend: Neutravidin-, Streptavidin/Biotin- und sekundäre Antikörper-Systeme sowie Chelatbildner.
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