EP1458857A1 - Virus hxhv, mat riel nucl ique, mat riel peptidique et utilisations - Google Patents

Virus hxhv, mat riel nucl ique, mat riel peptidique et utilisations

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Publication number
EP1458857A1
EP1458857A1 EP02801182A EP02801182A EP1458857A1 EP 1458857 A1 EP1458857 A1 EP 1458857A1 EP 02801182 A EP02801182 A EP 02801182A EP 02801182 A EP02801182 A EP 02801182A EP 1458857 A1 EP1458857 A1 EP 1458857A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
fragment
dna
sequence
seq
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02801182A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Chemin
Christian Trepo
Frédéric Bedin
Colette Jolivet-Reynaud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Original Assignee
Biomerieux SA
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1458857A1 publication Critical patent/EP1458857A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • Hepatitis is the most important 'of communicable diseases.
  • the mode of transmission '. transfusion, organ transplantation and
  • hepatitis can also be transmitted by ingestion of food or contaminated water and by contact between individuals.
  • Viral hepatitis is induced by various viral agents which are distinguished from each other by their genomes and their modes of replication. Viral hepatitis causes liver damage with varying degrees of severity. " Almost one billion people worldwide suffer from viral hepatitis. • There are serious risks in les chronic forms of hepatitis that can evolve 'cirrhosis hépatocarcino e. Viral hepatitis can be diagnosed by demonstrating good symptoms
  • ⁇ Defined as -, jaundice * high levels of transaminases (aspartate transaminase- or AST, alanine aminotransferase, or ALT, LDH or lactate dehydrogenase) and liver damage.
  • transaminases aspartate transaminase- or AST, alanine aminotransferase, or ALT, LDH or lactate dehydrogenase
  • Hepatitis G viruses (GBV-A, GBV-B, GBV-C ) and TTV recently identified do seem to be pathogenic in humans and therefore can not explain the cases of hepatitis of unknown etiology or hepatitis X.
  • the reading frames codes for a protein of 21 kD, which protein has a region which exhibits all of the immunogenicity and hydrophylicity properties required to induce the production of antibodies
  • the present invention relates to the isolated HXHV virus and provides nucleic acids and polypeptides which are capable of being derived from HXHV.
  • the invention provides the means for diagnosing an infection with the HXHV virus in patients or animals suspected of having viral hepatitis as well as pharmaceutical or vaccine compositions for preventing or treating the disease associated with the infection.
  • the present invention relates to: - the isolated HXHV virus having the following characteristics:
  • an at least partially single-stranded DNA genome comprises one or more reading frames (ORF) encoding one or more protein (s) or polyprotein (s);
  • said genome comprises a nucleotide sequence capable of hybridizing to the sequence SEQ ID NO: 1 or to the sequence complementary to SEQ ID NO: 1; preferably, it has a nucleotide sequence which has, for any segment of at least 40 nucleotides belonging to said sequence, at least 90%, advantageously at least 95%, or better still at least 98%, of homology with SEQ ID NO: 1 or with its complement;
  • nucleic acid sequence capable of being obtained from the genome of the HXHV virus or fragments of said genome or a nucleic acid sequence homologous to said nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 or to the sequence complementary to SEQ ID NO: 1, and having at least 90%, preferably at least 95% and advantageously at least 98% homology over the length of the sequence represented in SEQ ID NO: 1; the virus having the characteristics defined above;
  • nucleotide fragment of DNA or RNA comprising or consisting of a DNA or RNA nucleotide sequence of at least 12 contiguous nucleotides, preferably at least 15 or 18 contiguous nucleotides, and advantageously at least 21 contiguous nucleotides , of the DNA nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 or of a sequence nucleotide which has at least 90%, for example at least 95% or 98% homology with respect to the sequence represented in SEQ ID NO: 1 or of their complementary DNA sequences or of the transcript of said DNA nucleotide sequences; in particular, a fragment of which said contiguous nucleotides belong to one of the following segments: a segment whose sequence begins at nucleotide 813 and ends at nucleotide 1361 of SEQ ID NO: 1 and a segment whose sequence begins at nucleotide 927 and ends at nucleotide 968 of SEQ ID NO: 1, the complementary fragment and the transcription product of said fragments and
  • DNA molecule which comprises or consists of a DNA nucleotide sequence represented in SEQ ID NO: 1 or in that it comprises at least one DNA nucleotide fragment as defined above or their complementary sequences;
  • RNA molecule which comprises or consists of an RNA nucleotide sequence which is the transcription product of a DNA nucleotide sequence represented in SEQ ID NO: 1 or of at least one of its fragments as defined above or their complementary sequences.
  • the above homology covers the functional equivalents of the sequence SEQ ID NO: 1, that is to say the DNA sequences in which at least one codon can be replaced by another codon while coding for an identical amino acid.
  • the codes of argininine, serine and leucine present a degeneration of order 6 (that is to say there are six different codons for each one of it), while the codes of other amino acids, such as glutamic acid, glutamine, tyrosine, histidine and a few others exhibit order 2 degeneration. Of all the amino acids only tryptophan and methionine have order 1 degeneration.
  • the homology defined above also targets the mutants of the HXHV virus, and in particular those resulting from natural variability. Indeed, it is well known to specialists that viruses have relatively high rates of spontaneous or induced mutations.
  • the invention also relates to: - a polypeptide comprising a polypeptide sequence or at least one of its fragments, characterized in that said polypeptide sequence is encoded by the genome of the HXHV virus or by fragments of said genome, by their functional equivalents or by a nucleotide sequence which has at least 90% homology, preferably at least 95% homology and advantageously at least 98% homology with respect to the sequence represented in SEQ ID NO: 1 and in that the virus has the characteristics determined above; - a polypeptide fragment, characterized in that it comprises or consists of a peptide sequence of at least 4 amino acids, preferably at least 5 or 6 amino acids and advantageously at least 7 amino acids, more preferably at most 15 amino acids, in particular 6 to 15 amino acids and advantageously 6 to 10 or 8 to 12 amino
  • SEQ ID NO: 5 there is a region of 14 amino acids which has all the required properties immunogenicity and hydrophilicity required to induce a humoral response.
  • This 14 amino acid polypeptide is identified in SEQ ID NO: 6. They have also shown that this 14 amino acid polypeptide corresponds to an antigenic region of the sequence represented in SEQ ID NO: 5 since it has made it possible to develop a protocol ELISA test for the detection of anti-HXHV antibodies in patients with chronic hepatitis Non-A Non-E. ; an advantageous polypeptide fragment comprises or consists of SEQ ID NO: 6 or a polypeptide sequence functionally equivalent to SEQ ID NO: 6;
  • polypeptide fragment which comprises or which consists of a peptide sequence represented in SEQ ID NO: 5 or a peptide sequence functionally equivalent to SEQ ID NO: 5.
  • polypeptide is meant a peptide, in the isolated state, having a sequence of a variable number of amino acids, such as an oligopeptide, a protein, a fusion protein, a fusion peptide, a peptide of synthesis.
  • a polypeptide can be obtained by various techniques well known to those skilled in the art, and in particular by chemical synthesis or by genetic recombination techniques.
  • the polypeptides according to the invention can be obtained by conventional synthesis methods, for example with an automatic peptide synthesizer, or by genetic engineering techniques comprising the insertion of a DNA sequence coding for said polypeptide into a vector of expression such as a plasmid or a virus, and the transformation of cells with this expression vector and culture of these cells.
  • peptide sequence equivalent to a reference peptide sequence is meant an amino acid sequence modified by insertion and / or deletion and / or substitution and / or lengthening and / or shortening and / or chemical modification of one or more acids amines, provided that these modifications substantially preserve or even develop the immunoreactive properties of said reference peptide sequence.
  • the term “functionally equivalent sequences” means which preserve the immunoreactive properties of SEQ ID NO: 5, in particular the sequences in which one or more amino acid (s) is or are substituted (s) by one or more other amino acids ; the sequences in which one or more amino acid of the L series is replaced by an amino acid of the D series, and vice versa; the sequences into which a modification of the side chains of the amino acids has been introduced, such as an acetylation of the amino functions, a carboxylation of the thiol functions, an esterification of the carboxylic functions; a modification of the peptide bonds such as for example carba, retro, inverso, retro-inverso, reduced and methylene-oxy bonds.
  • amino acid (s) in the sequences of the polypeptides of the invention can be substituted by one or more other amino acid (s) of similar polarity which act as functional equivalents.
  • substitutions for an amino acid in polypeptide sequences of interest can be determined from other members of the class to which the amino acid belongs.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine.
  • Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine.
  • the positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine.
  • the negatively charged amino acids (acids) include aspartic acid and glutamic acid.
  • Other substitutions for an amino acid in polypeptide sequences of interest can be determined from the information contained in the article by Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, No. 7, pp. 459-465 (1995)). These authors have created banks in which to reduce the problem of the combinatorial explosion in the number of molecules, they have used groups of amino acids made up of amino acids with similar physicochemical properties and these are the grouped amino acids. in each of these six groups, listed below, which are considered primarily equivalent in the present invention.
  • Group 1 alanine, proline, glycine.
  • Group 2 aspartic acid, glutamic acid.
  • Group 3 histidine, lysine, arginine.
  • the equivalence of a peptide sequence with respect to a reference peptide sequence can be defined by its identity or its homology, expressed as a percentage, with said reference sequence. This percentage is determined, for a series of a given number of contiguous amino acids, by alignment of the two sequences, displacement of one relative to the other, and comparison of the amino acids in the two sequences. The percentage of identity is determined from the number of amino acids which are identical to amino acids of the reference sequence, in the same position. The percentage of homology is determined from the number of amino acids which are equivalent to amino acids of the reference sequence, in the same position.
  • the invention also relates to a functional expression cassette in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism allowing the expression of a nucleic acid sequence or of a DNA fragment or of a DNA molecule as described above, places under the control of the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette is characterized in that it is functional in a cell derived from a prokaryotic organism, in particular E. coli or from a lower eukaryotic or eukaryotic organism, in particular COS and CHO cells and Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.
  • the invention further relates to a vector comprising said expression cassette; a cell derived from a prokaryotic organism, such as E. coli or eukaryotic, preferably a eukaryotic or lower eukaryotic organism and advantageously a COS or CHO cell or a cell derived from Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris comprising an expression cassette or a vector as defined above; and the polypeptide produced by the expression cassette, the vector or the cell.
  • a prokaryotic organism such as E. coli or eukaryotic, preferably a eukaryotic or lower eukaryotic organism and advantageously a COS or CHO cell or a cell derived from Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris
  • the subject of the invention is a process for preparing a polypeptide or a polypeptide fragment as defined above which consists in cultivating a host cell corresponding to the preceding definitions in an appropriate culture medium, said host cell being transformed with a vector of expression which contains a DNA nucleic acid sequence as defined above or a DNA nucleotide fragment as defined above or a DNA molecule as defined above and, to purify said polypeptide produced to a required degree of purity.
  • the subject of the invention is also an immunogenic polypeptide, characterized in that it has a peptide sequence or in that it consists of a polypeptide as defined above, in particular the polypeptide represents in SEQ ID NO: 6.
  • an immunogenic polypeptide is used for the production of monoclonal or polyclonal antibodies or fragments of said antibodies and the invention encompasses the antibodies.
  • monoclonal or polyclonal or their fragments being obtained by immunization of a mammalian animal (rabbit, rat, mouse) with such an immunogenic peptide.
  • the immunogen can be coupled to serum albumin (peptide SA) or to hemocyanin from Lymphet Keyhole
  • the immunogen identified in SEQ ID NO: 6 is coupled to BSA (bovine serum albumin).
  • BSA bovine serum albumin
  • the animals are subjected to several injections of immunogen, the antibodies are taken from the serum, purified (contact with a "normal" liver powder) and are then screened for their specificity using the usual techniques, such as tests. ELISA or Western Blot.
  • the animals are subjected to an injection of immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • the sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and their selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice. Whatever the mode of production, by supernatant or ascites, the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art. It is advantageous to use humanized antibodies.
  • humanized forms of non-human, for example murine, antibodies are chimeric antibodies which comprise a minimal sequence derived from a non-human munoglobulin.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
  • donor antibody such as mouse, rat, rabbit or non-human primate
  • the residues (FR) of the Fv region of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
  • the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulin and all or almost all FR regions will be those of a human immunoglobulin.
  • the optionally humanized antibodies may also comprise at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al. , Nature 332: 323-329 (1988); and Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
  • antibody fragment is meant the fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) of a native antibody and by derivative means, inter alia, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al ., 1989, Nature 339: 394-397). These antibody fragments and antibody derivatives retain the ability to selectively bind to the target antigen.
  • the monoclonal or polyclonal antibody thus obtained or its fragment is incorporated into a diagnostic composition which is used in a method for detecting at least one polypeptide or a polypeptide fragment as defined above in a biological sample, according to which the biological sample with the composition under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • the subject of the invention is also a diagnostic composition which comprises a polypeptide or a polypeptide fragment as defined above and a method for detecting antibodies directed against the HXHV virus or at least against a polypeptide or a polypeptide fragment of the invention, according to which a biological sample suspected of being or being able to have been infected by the HXHV virus is brought into contact with the composition diagnostic under predetermined conditions which allow the formation of antibody / antigen complexes and the formation of said complexes is detected.
  • the method described in the experimental part and the appended figure clearly shows that the polypeptide of the invention or the polypeptide fragment SEQ ID NO: 6 makes it possible to detect antibodies specific for the HXHV virus in patients with hepatitis Non-A Non-E .
  • the present invention therefore also relates to biological material for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of humans or animals infected with at least the HXHV virus and immunogenic preparations which can be used to produce therapeutic vaccines against a HXHV virus infection and prophylactic vaccines to prevent potential HXHV virus infection, said immunogenic preparations comprising:
  • a subject of the present invention is also the use of at least one monoclonal or polyclonal antibody or of at least one fragment of said antibodies of the invention, specific for at least one polypeptide or a polypeptide fragment as defined above. in (i) for the preparation of a pharmaceutical composition which administered to a patient infected with the HXHV virus has the ability to reduce or even inhibit the proliferation and / or replication of the virus. These antibodies or their fragments are called neutralizing antibodies.
  • the invention relates to an immunogenic or vaccine composition, characterized in that it comprises a polypeptide or a polypeptide fragment of the invention or the HXHV virus, optionally associated with a vehicle and / or adjuvant and / or diluent suitable and / or a pharmaceutically acceptable excipient; and to a pharmaceutical composition comprising a biological material as defined above, optionally associated with a vehicle and / or adjuvant and / or suitable diluent e / or a pharmaceutically acceptable excipient.
  • biological sample for example blood, serum, plasma, tissue samples, such as liver biopsy extracts.
  • the vaccines prepared are injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule can be mixed with excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Examples of favorable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations. In the case of peptides, their coupling to a larger molecule (KLH, tetanus toxin) sometimes increases immunogenicity.
  • the vaccines are administered conventionally by injection, for example intramuscularly.
  • Favorable additional formulations with other modes administration include suppositories and sometimes oral formulations.
  • pharmaceutically acceptable vehicle is meant the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mack Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • the subject of the invention is also:
  • a probe characterized in that it is capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or to a DNA molecule or of 'RNA of the invention; preferably, a probe of the invention comprises at least 12 nucleotides, and the hybridization is carried out under stringency conditions corresponding to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 12 to 20 ° C under Tm ( "melting temperature”) of the probe / nucleotide sequence complex to be detected;
  • a primer characterized in that it is capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or to a DNA molecule or of 'RNA of the invention; preferably, a primer of the invention comprises at least 12 nucleotides, and the hybridization is carried out under stringency conditions corresponding to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 12 and 20 ° C. under Tm ( "melting temperature ”) of the primer / nucleotide sequence complex to be amplified and / or detected;
  • a primer capable of hybridizing to a nucleic sequence or to a nucleotide fragment or to a DNA molecule of the invention, characterized in that it is chosen from any one of the sequences SEQ IDs NO: 19 to 22;
  • an anti-nucleic acid antibody characterized in that it is capable of binding to a nucleic acid sequence or to a nucleotide fragment of DNA or RNA or to a molecule of DNA or RNA;
  • a diagnostic composition characterized in that it comprises at least one probe or a primer or an anti-nucleic acid antibody as defined above; a method for diagnosing DNA and / or viral RNA, according to which a sample from a patient is taken, said sample is treated if necessary in order to extract the DNA and / or RNA, it is brought into contact said sample atyec at least one probe or primer of the invention, under determined stringency conditions and the presence of DNA and / or viral RNA is detected in the sample so ⁇ t by demonstration of a hybridization of said viral DNA and / or RNA with at least one probe, either by amplification of said DNA and / or RNA; and a viral DNA and / or RNA diagnostic method, according to which a serum or plasma sample is taken from a patient, said sample is treated if necessary to extract the DNA and / or RNA , said sample is brought into contact with at least one anti-nucleic acid antibody, said antibody being optionally labeled with any appropriate marker and the formation of a
  • Probes and primers capable of hybridizing under stringency conditions determined to a nucleotide sequence of DNA or RNA or to a nucleotide fragment as defined above are part of this definition. It is within the reach of the skilled person to define the appropriate stringency conditions. Characteristic stringency conditions are those which correspond to a combination of the temperature and the salt concentration chosen approximately between 12 to 20 ° C below the Tm (melting temperature ") of the hybrid under study. We can thus refer to the work of George H. Keller and Mark M.
  • the invention also relates to: a vaccine composition comprising a DNA sequence coding for at least one polypeptide or a polypeptide fragment of the invention, said DNA being mixed with a suitable vehicle and / or diluent; an antisense or anti-gene oligonucleotide, characterized in that it is capable of specifically interfering with the synthesis of at least one polypeptide or a polypeptide fragment of the invention;
  • a pharmaceutical composition characterized in that it comprises at least one antisense oligonucleotide or an anti-gene oligonucleotide;
  • a vector characterized in that it comprises at least one gene of therapeutic or vaccine interest, said gene encoding in particular - (i) either at least for a polypeptide or a polypeptide fragment of the invention;
  • a therapeutic or vaccine composition characterized in that it comprises, inter alia, a vector as defined in claim 37 and in that said gene of interest is placed under the dependence of elements ensuring its expression in vivo;
  • a biological material for the preparation of a pharmaceutical or vaccine composition comprising at least one cell, in particular a cell which does not naturally produce antibodies, in a form allowing its administration in a mammalian, human or animal organism, as well as possibly its prior culture, said cell being genetically modified in vitro by at least one nucleic acid sequence containing at least one gene coding in vivo for at least one polypeptide or a fragment polypeptide of the invention or coding for at least one molecule inhibiting the function and / or the fixation and / or the expression of at least one polypeptide or a polypeptide fragment of the invention or coding for at least an antibody or an antibody fragment capable of binding to at least one polypeptide or a polypeptide fragment of the invention;
  • a genetically modified cell in particular chosen from eukaryotic cells, such as COS and CHO cells and lower eukaryotic cells, such as yeast cells, in particular cells derived from Saccaromyces cerevisiae and Pichia pastoris , transformed by at least one nucleic acid sequence or a nucleotide fragment or a DNA molecule or by a vector of the invention; and a pharmaceutical or vaccine composition comprising such a cell.
  • eukaryotic cells such as COS and CHO cells
  • lower eukaryotic cells such as yeast cells, in particular cells derived from Saccaromyces cerevisiae and Pichia pastoris , transformed by at least one nucleic acid sequence or a nucleotide fragment or a DNA molecule or by a vector of the invention
  • a pharmaceutical or vaccine composition comprising such a cell.
  • compositions defined above are particularly advantageous DNA vaccine compositions, in particular compared to the "conventional" vaccine compositions based on recombinant protein.
  • the vaccine use of recombinant proteins is a cumbersome and expensive system, in particular because it requires very important steps in the purification of the recombinant antigens.
  • one of the difficulties encountered is to obtain a persistence of the vaccine long enough to maintain a good immune memory.
  • the DNA vaccination method whose advantages are inherent in the intrinsic properties of DNA, is simple and inexpensive and is carried out simply by injection. intramuscular or intradermal.
  • DNA vaccines are non-infectious / non-replicative, - that because DNA immunization is a form of transfection in vivo, the viral antigen is expressed in mammalian cells under its native conformation,
  • DNA vaccines can easily be combined due to their physico-chemical homogeneity.
  • the material used for the RDA consists of sera archived in the serotheque.
  • RDA was applied to a case of severe hepatitis, with no known etiology, successfully treated by IFN.
  • the normalization of transaminases in this patient after anti-viral treatment and especially the relapse after stopping treatment with a new response when resuming treatment are elements which argue in favor of a viral etiology of the disease.
  • a serum sample before treatment and a serum sample after treatment were used for RDA, the sample before treatment potentially containing the HXHV virus and the sample after treatment little or no virus.
  • the nucleic acid extractions are carried out with the QIAamp® Viral RNA Mini Kit from QIAGEN.
  • the differential technique is performed using the CLONTECH PCR - Select TM cDNA Subtraction Kit from CLONTECH according to the supplier's instructions.
  • the l st step of the GDR is to reduce the complexity of the genome. For this it is necessary to use a restriction enzyme which has a fairly frequent cleavage site which makes it possible to reduce the complexity of the genome.
  • the result of this step is to obtain a set of sequences of less complexity although representative of the initial sequences, hence the term "representational”. complexity of the genome to be studied improves the efficiency of the enrichment steps by facilitating complete hybridization of the samples. • Enrichment Adapters are plugged in (using a ligase) at each end of the DNA fragments from the "test" sample containing the viral genome. The driver sample has no adapters.
  • the "tester” is put in the presence of an excess of "driver".
  • the "driver” D contains many DNA fragments common with the “tester” T and therefore plays the role of competitive inhibitors by limiting the self-hybridization of the DNA fragments of the "tester” common to the two populations.
  • the whole is subjected to a denaturation / renaturation process during which three types of association will occur depending on the complementarity of the sequences.
  • T / T duplexes are therefore amplified exponentially by PCR and the T / D duplexes undergo linear amplification, the fragments of which are single strands.
  • T / D hybrids are not amplified. It is possible to destroy single stranded DNA by a nuclease which spares double stranded DNA.
  • This selective enrichment process for double-stranded "testers" can be repeated with different adapters to enrich the target DNA with respect to the other sequences of the "tester” after amplification. In general, three cycles of this reaction make it possible to obtain the enrichment factor of 10 6 of the viral sequence to be sought. Subsequently, the products obtained are subcloned into a plasmid for sequencing and analysis.
  • the RDA is carried out on the "test” and "driver" samples from the DNAs of the patient previously mentioned.
  • the buffer mixture Rsa I 10 X (5 ⁇ L), Rsa I (10 u / ⁇ L) (1.5 ⁇ L), nucleic acids 43.5 ⁇ L (2 ⁇ g) is prepared.
  • the mixture is incubated for 1 h 30 min at 37 ° C. and the reaction is stopped. with 2.5 ⁇ L of 20X EDTA / glycogen.
  • An extraction is carried out with 50 ⁇ L of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1). Centrifugation is carried out for 10 min. at 14000 rpm and the upper aqueous phase is removed.
  • a new extraction is carried out with 50 ⁇ L of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), followed by centrifugation for 10 min.
  • the aqueous phase is precipitated with 25 ⁇ L of NH40Ac 4M and 187.5 ⁇ L of 95% ethanol, followed by centrifugation for 20 min. at 14000 rpm and elimination of the supernatant.
  • the pellet is washed with 200 ⁇ L of 80% ethanol. A new centrifugation is carried out for 5 min. at 14000 rpm and the supernatant is removed.
  • the pellet is air dried for 5 to 10 min. then dissolved in 5.5 ⁇ L of H 2 0.
  • Mix 1.1 was prepared as follows: “test” 2 ⁇ L, adapter 1 (10 ⁇ M) 2 ⁇ L, Master mix 6 ⁇ L.
  • Mix 1.2 was prepared as follows: “test” 2 ⁇ L, 2R adapter (10 ⁇ M) 2 ⁇ L, Master mix 6 ⁇ L.
  • Preparation of the control not subtracted 2 ⁇ L of the mixture 1.1 were added to 2 ⁇ L of the mixture 1.2.
  • the mixture thus constituted is incubated for 1 night at 16 ° C. and the reaction is stopped by adding 1 ⁇ L of 20 X EDTA / glycogen.
  • the ligase is inactivated at 72 ° C for 5 min. and the mixture is cooled in ice.
  • the following mixture is prepared: ⁇ driver "1 ⁇ L, hybridization buffer 4 XI ⁇ L, H 2 02 ⁇ L.
  • the following mixture is prepared: H 2 0 19.5 ⁇ L, PCR buffer 10 X 2.5 ⁇ L, dNTPs (10 mM each) 0.5 ⁇ L, PCR primer 1 (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, 50 X advantage cDNA polyrrterase mix 0.5 ⁇ L, RDA samples 1 ⁇ L.
  • the program used is as follows: 75 ° c 5min, 94 ° c 30sec
  • Second round of PCR Use of l ⁇ l of the product of first PCR. The same mixture is used.
  • the primer pairs of the Clontech PCR-select TM cDNA substraction kit are used, they are located in the adapters "linked" to the DNA "to be tested” at the start of the RDA procedure.
  • the RDA products are then ligated into the plasmid pTOPO using topoisomerase I, then cloned into E. coli using the TOPO TA Cloning® Kit from Invitrogen.
  • the RDA technique makes it possible to obtain, from the "test” and “driver” samples, PCR products which reflect what is potentially different between the two samples. What constitutes the material subtracted.
  • the fifty clones selected at the end of the first stage are sequenced. Their respective sequences are compared with the sequences known in the Swissprot, Embl, Genbank, Draft databases of the human genome. A number appear unknown. The results of the sequence distribution are given below.
  • the next step is the validation of the relevance of these data both on samples from patients with hepatitis of undetermined etiology and controls consisting on the one hand of blood donors and on the other hand of patients suffering non-viral liver pathologies.
  • primers were synthesized within the DNA of the two clones and PCRs were carried out using these primers on the genomic DNA extracted from the serum of blood donors in order to eliminate the possibility that the DNA of the clones do not correspond to a DNA sequence frequent in the human genome.
  • a clone containing an insert of 1400bp (XH) originating from the RDA on DNA was selected for its absence of homologies with human genomic DNA and with any sequence present in the databases.
  • This sequence rich in GC (62%), presents several open reading phases. It is identified in SEQ ID NO: 1.
  • the open reading phases are identified in SEQ ID NO,: 2, 3, 4 and 5.
  • Antisense primer (3T7) 5'-ATGCCAACGCCCAGAGTCCG-3' (SEQ ID NO: 13)
  • the following mixture was prepared: H 2 0 17.5 ⁇ L, PCR buffer 10 X 2.5 ⁇ L, dNTPs (10 mM each) 0.5 ⁇ L, PCR nested primer sense (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, PCR nested primer antisense 2R (10 ⁇ M) 1 ⁇ L, 50 X advantage cDNA polymerase mix 0.5 ⁇ L, RDA samples 1/10 2 ⁇ L.
  • Antisense primer (1T7) 5'-GATGTTTCTGTGTCTGTGGG-3' (SEQ ID NO: 14)
  • liver and serum samples from patients from the alleged Trouble de Lyon, suffering from chronic Non-A Non-E hepatitis found that 10% of them ( 11/109) are carriers of the XH sequence.
  • a similar percentage of patients positive for HXHV DNA is obtained inixie patients with chronic hepatitis Non-A Non-E.
  • the XH sequence was captured with alternately two oligonucleotides specific for one or the other of the two DNA strands of the XH sequence fixed on magnetic particles ( Gene Trapper cDNA positive selection System, Gibco BRL (trade name)).
  • the oligonucleotides used are the following: sense oligonucleotide S6M13: 5'-GCCATGTAACTCGGCAGTGC-3 '(SEQ ID . NO: 9) antisense oligonucleotide Comp S6M13: 5'-GCACTGCCGAGTTACATGGC-3' (SEQ ID NO: 15)
  • the nature of the XH sequence which circulates in the patients was sought from several sera from "hepatitis X" patients, positive by PCR for the XH sequence.
  • the sera may or may not be ultracentrifuged before the capture process.
  • the XH sequence (SEQ ID NO: 1) has four open reading phases.
  • the ORFl is presented in SEQ ID NO: 2, it comprises 101 amino acids coded by the bases 1 to 103 of SEQ ID NO: 1.
  • LORF2 is presented in SEQ ID NO: 3, it comprises 135 amino acids coded by the bases 829 to 1233 of SEQ ID NO: 1.
  • L / 0RF3 is presented in SEQ ID NO: 4, it comprises 135 amino acids coded by the bases 270 to 674 of SEQ ID NO: 1.
  • LORF4 is presented in SEQ ID NO: 5 , it comprises 183 amino acids coded by the bases 813 to 1361 of SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide corresponding to the area of the 14 amino acids mentioned above has been synthesized for the production of polyclonal antibodies.
  • sequence of this polypeptide is given below and referenced in SEQ ID NO: 6.
  • RRAAELHRRDQYRL For the immunization of rabbits, a cysteine (C) was added to the COOH terminus of this polypeptide for coupling to BSA.
  • the immunogen RRAAELHRRDQYRLC-BSA was injected into rabbits at the rate of 100 ⁇ g of immunogen per rabbit and by injection.
  • the immunization protocol is as follows: D0: the taking 10 ml of blood era immunization 0.1 mg of immunogen (1 mg / ml) + 0.4 ml saline + 0.5 mL AFC 1 mL ID (0.1 mL x 10)
  • D28 0.1 mg of immunogen (1 mg / mL) + 0.4 mL of physiological water + 0.5 mL AFI in ID-1 L in ID (0.1 mL x 10)
  • D56 0.1 mg of immunogen (1 mg / mL) + 0.4 mL of physiological water + 0.5 mL AFI-1 mL in SC (0.25 mL x 4)
  • J112 0.1 mg of immunogen (1 mg / mL) + 0.4 L of saline + 0.5 L AFI-1 ID mL (0.1 mL x 10) J119: 3rd blood sampling 9 mL by ear without anticoagulant.
  • the production of specific antibodies is a very effective tool for screening the expression of the XH sequence on biopsies of Non-A Non-E patients in parallel with other categories of patients or controls.
  • the 14 amino acid polypeptide (SEQ ID NO: 6) is used for the development of an ELISA test for the capture of antibodies specific for the HXHV virus potentially present in patients with chronic hepatitis No-A No- E.
  • 100 ⁇ L of streptavidin diluted 1/100 in a carbonate buffer are placed in the wells of a microtiter plate. The deposit is followed by an incubation for 2 hours at 37 ° C. in an oven, after which three washes are carried out.
  • Sucrose gradients were made in order to isolate possible viral particles associated with the presence of the XH sequence.
  • the serum of a patient of the Non-A Non-E hepatitis cohort was used. Two consecutive fractions of this gradient appeared positive by PCR for the XH sequence. These fractions correspond to densities of the order of 1.2 to 1.5 g / cm 3 .
  • the study in electron microscopy made it possible to observe particles whose size and regularity (HOnm in diameter) are compatible with that of a viral agent. The frequency with which these particles are observed by electron microscopy suggests a concentration of the order of 5 ⁇ 10 5 particles / ml of serum.
  • the ELISA test developed allowed us to search for the presence of "anti-XH" antibodies in blood donors and in different categories of patients.
  • TN stands for "blood donors with normal transaminase levels"
  • TN stands for "blood donors with high transaminase levels"
  • HCV + stands for "HCV positive patients”.
  • HBV + stands for "HBV positive patients"
  • HIV + stands for "HIV positive patients”.
  • No A-E * means "patients with chronic non-A-E hepatitis"
  • H * means “hemophiliac patients who have been transfused before
  • a quantitative real-time PCR method using the Roche ® Light cycler has been developed to amplify the XH sequence. It was used, among other things, to amplify the XH sequence in ORF 4 in the 11 patients who were found to be positive for anti-XH antibodies.
  • the four specific primers described below were synthesized and purified on HPLC.
  • the composition of the reaction mixture is as follows:
  • Anti-sense primer (15 ⁇ M) l ⁇ l
  • the capillaries are sealed, briefly centrifuged and placed in the rotor of the Light Cycler.
  • Tx * temperature depending on the combination: type of primers used.
  • the theoretical detection threshold for the XH sequence inserted into the plasmid is between 1 and 2 copies per capillary.
  • the most frequently used Tm of the S1 / AS2 amplicon (312 bp) is 88 ° C.
  • the application of this technique shows, among other things, that four out of five of the patients who have progressed to chronic hepatitis are positive by PCR for the XH sequence. Conversely, five out of six of the cured patients became negative by PCR for the XH sequence.

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Abstract

Virus HXHV isolé présentant les caractéristiques suivantes : (i) un génome ô ADN, au moins partiellement simple brin, (ii) ledit génome comprend au moins une trame de lecture (ORF) codant pour une protéine ou une polyprotéine (iii) ledit génome comprend une séquence nucléotidique qui présente, pour tout segment d'au moins 40 nucléotides appartenant ô ladite séquence, au moins 90% d'homologie avec SEQ ID NO :1 ou avec son complémentaire, matériel nucléique et matériel peptidique et utilisations.

Description

VIRUS HXHV, MATERIEL NUCLEIQUE, MATERIEL PEPTIDIQUE ET
UTILISATIONS
L'hépatite est la plus importante 'des maladies transmissibles. Le mode de transmission '. est lé plus souvent la transfusion, la transplantation d'organes et
1' hémodialyse, mais l'hépatite peut également être transmise par ingestion de nourriture ou d' eau contaminée et par contact entre individus.
Les hépatites virales sont induites par divers agents viraux qui se distinguent les uns des autres par leurs génomes et leurs modes de réplication. Les hépatites virales causent des dommages au niveau du foie avec des de.grés variables de sévérité. "Près , d'un milliard de personnes dans le monde souffrent d"hépatites virales . • Il existe des risques graves dans les- formes chroniques des hépatites qui peuvent évoluer en' cirrhose ou hépatocarcino e. Les hépatites virales peuvent être diagnostiquées par mise en évidence de symptômes bien
\ définis, tels que -, la jaunisse* des taux élevés de transaminases (aspartate transaminase- ou AST, ' alanine transaminase ou ALT, lactate déshydrogénase ou LDH) , et des lésions hépatiques. Mais malgré la connaissance de différents virus des hépatites'" A, Ë, Ç, D, E, G et TTV, 5% de toutes les hépatites et 40% des hépatites fulminantes demeurent inexpliquées, d'où l'hypothèse de l'existence de virus inconnus des hépatites. Ces hépatites sans étiologie connue sont ' aussi bien post-transfusionnelles que sporadiques, chroniques ou fulminantes. Elles sont communément appelées hépatites X. Les virus des' hépatites G (GBV-A, GBV-B, GBV-C) et TTV récemment identifiés ne semblent, pas être pathogènes chez l'homme et ne peuvent donc pas expliquer les cas d'hépatites sans étiologie connue ou hépatites X.
A partir d'un cas d'hépatite grave sans étiologie connue, d'un patient chez lequel un traitement à l'interféron a permis de normaliser les transaminases, les présents inventeurs ont pu cloner grâce à la technique d'hybridation soustractive " RDA " (Representational Différence Analysis) les acides nucléiques différentielle ent exprimés entre le sérum au pic des transaminases et le sérum après normalisation des transaminases. 643 clones représentant des séquences ADN propres au sérum au pic des transaminases ont été criblés. De manière à exclure de possibles homologies avec le génome humain ou tout autre séquence connue, différentes voies ont été explorées :
• hybridation des 643 clones avec une sonde " ADN génomique humain ", ce qui a permis de montrer que 593 clones s'hybrident à la sonde λ ADN génomique humain " et que 50 clones ne s'hybrident pas à la sonde " ADN génomique humain " et comprennent un insert, recherche dans les banques de données de possibles homologies entre les séquences de ces 50 clones et les séquences publiées, en utilisant le programme BLAST sur le site NCBI selon les paramètres donnés par le site, B criblage complémentaire de 4 clones sélectionnés de l'étape précédente par " Dot blot " sur l'ADN des clones sélectionnés en utilisant une sonde λ ADN génomique humain " marquée radioactivement et par Southern blot d'ADN génomique humain en utilisant comme sonde les clones sélectionnés marqués radioactivement.
A l'issue de ces différentes étapes, 2 clones ADN ont été sélectionnés dont les séquences étaient inconnues dans les banques de données. Grâce à des PCRs réalisées au sein des séquences clonées, testées sur de l'ADN génomique humain provenant de donneurs de sang, en final un seul clone contenant un insert de 1400 paires de bases a été retenu pour son absence d' homologie avec l'ADN génomique humain et avec toutes séquences présentes dans les banques de données. La séquence de ce clone a été appelée XH. Cette séquence est riche en GC (62%) et présente quatre trames de lecture ouvertes. Cette séquence isolée a ensuite été caractérisée par quatre études parallèles :
B étude bio-cliniques et épidémiologiques,
B étude moléculaire, B production d'anticorps spécifiques,
B étude en microscopie électronique.
Les résultats montrent que :
B la séquence XH est retrouvée par PCR grâce à des amorces spécifiques chez 10% des patients porteurs d'une hépatite chronique sans étiologie connue présents dans l'étude (sur 110 patients testés),
B cette séquence est absente chez les donneurs de sang testés par la même PCR spécifique de la séquence XH clonée, B cette séquence est une séquence ADN au moins partiellement simple brin,
B elle présente plusieurs trames de lecture et une des trames de lecture code pour une protéine de 21kD, laquelle protéine possède une région qui présente toutes les propriétés d' immunogénicité et d' hydrophylicité requises pour induire la production d'anticorps,
B le fractionnement sur gradient de sucrose d'un sérum de patient Non A-E positif par PCR pour la séquence XH (XH+) a permis d' isoler deux fraction consécutives (1,3-1,5 g/cm3) positives pour la séquence XH dans lesquelles ont été mises en évidence des particules dont la taille et la régularité sont compatibles avec celles d'un agent viral. Ces particules ne sont pas observées sur des fractions du gradient négatives par PCR pour la séquence XH. Ce nouvel agent infectieux a été dénommé HXHV.
Aussi, la présente invention concerne le virus HXHV isolé et fournit des acides nucléiques et des polypeptides qui sont susceptibles d'être dérivés de HXHV. De plus, l'invention fournit les moyens pour diagnostiquer une infection par le virus HXHV chez des patients ou des animaux suspectés avoir une hépatite virale ainsi que les compositions pharmaceutiques ou vaccinales pour prévenir ou traiter la maladie associée à l'infection. Ainsi, la présente invention concerne : - le virus HXHV isolé présentant les caractéristiques suivantes :
(i) un génome à ADN au moins partiellement simple brin, (ii) ledit génome comprend une ou plusieurs trames de lecture (ORF) codant pour une ou des protéine (s) ou polyprotéine (s) ; (iii) ledit génome comprend une séquence nucléotidique susceptible de s'hybrider à la séquence SEQ ID NO : 1 ou à la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 1 ; de préférence, il présente une séquence nucléotidique qui présente, pour tout segment d'au moins 40 nucleotides appartenant à ladite séquence, au moins 90%, avantageusement au moins 95%, ou mieux encore au moins 98%, d' homologie avec SEQ ID NO : 1 ou avec son complémentaire ;
- une séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV ou des fragments dudit génome ou une séquence d' acide nucléique homologue à ladite séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 1 ou à la séquence complémentaire de SEQ ID NO : 1, et présentant au moins 90%, de préférence au moins 95% et avantageusement au moins 98% d' homologie sur la longueur de la séquence représentée en SEQ ID NO : 1 ; le virus présentant les caractéristiques définies ci-dessus ;
- un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN comprenant ou consistant en une séquence nucléotidique ADN ou ARN d'au moins 12 nucleotides contigus, de préférence d'au moins 15 ou 18 nucleotides contigus, et avantageusement d'au moins 21 nucleotides contigus, de la séquence nucléotidique ADN SEQ ID NO : 1 ou d'une séquence nucléotidique qui présente au moins 90%, par exemple au moins 95% ou 98% d' homologie par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 1 ou de leur séquences ADN complémentaires ou du produit de transcription desdites séquences nucléotidiques ADN ; en particulier, un fragment dont lesdits nucleotides contigus appartiennent à l'un des segments suivants : un segment dont la séquence commence au nucleotide 813 et se termine au nucleotide 1361 de SEQ ID NO : 1 et un segment dont la séquence commence au nucleotide 927 et se termine au nucleotide 968 de SEQ ID NO : 1, le fragment complémentaires et le produit de transcription desdits fragments et un fragment comprenant ou consistant en SEQ ID NO 1 ou sa séquence ADN complémentaire ou une séquence qui est le produit de transcription de SEQ ID NO :1 ;
- une molécule d'ADN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 1 ou en ce qu' elle comprend au moins un fragment nucléotidique ADN tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires ;
- une molécule d'ARN qui comprend ou consiste en une séquence nucléotidique ARN qui est le produit de transcription d'une séquence nucléotidique ADN représentée en SEQ ID NO : 1 ou d' au moins un de ses fragments tel que défini ci-dessus ou leurs séquences complémentaires.
L' homologie ci-dessus recouvre les équivalents fonctionnels de la séquence SEQ ID NO : 1, c'est à dire les séquences ADN dans lesquelles au moins un codon peut être remplacé par un autre codon tout en codant pour un acide aminé identique. On parle de dégénérescence du code génétique. Ainsi, les codes de l' argininine, de la serine et de la leucine présentent une dégénérescence d' ordre 6 (c'est à dire qu'il y a six codons différents pour chacune d'elle), tandis que les codes d'autres acides aminés, tels que l'acide glutamique, la glutamine, la tyrosine, l'histidine et quelques autres présentent une dégénérescence d'ordre 2. De tous les acides aminés seuls le tryptophane et la méthionine ont une dégénérescence d'ordre 1. Il est donc clair que pour l'expression d'un polypeptide dont la séquence est par exemple représentée en SEQ ID NO : 6, on peut utiliser des séquences d'acides nucléiques variantes et fonctionnelles dont les compositions en codons sont différentes de la séquence d'acide nucléique représentée en SEQ ID NO : 1.
L' homologie définie ci-dessus vise également les mutants du virus HXHV, et en particulier ceux issus de la variabilité naturelle. En effet, il est bien connu des spécialistes que les virus ont des taux relativement élevés de mutations spontanées ou induites. L' invention concerne également : - un polypeptide comprenant une séquence polypeptidique ou au moins un de ses fragments, caractérisé en ce que ladite séquence polypeptidique est codée par le génome du virus HXHV ou par des fragments dudit génome, par leurs équivalents fonctionnels ou par une séquence nucléotidique qui présente au moins 90% d' homologie, de préférence au moins 95% d' homologie et avantageusement au moins 98% d' homologie par rapport à la séquence représentée en SEQ ID NO : 1 et en ce que le virus présente les caractéristiques déterminées ci-dessus; - un fragment polypeptidique, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au moins 4 acides aminés, de préférence d'au moins 5 ou 6 acides aminés et avantageusement d'au moins 7 acides aminés, de préférence encore d'au plus 15 acides aminés, en particulier de 6 à 15 acides aminés et avantageusement de 6 à 10 ou de 8 à 12 acides aminés de la séquence peptidique représentée en SEQ ID NO : 5 ou d'une séquence peptidique fonctionnellement équivalente à SEQ ID NO : 5. Les inventeurs ont en particulier montré que dans la séquence SEQ ID NO : 5, il existe une région de 14 acides aminés qui présente toutes les propriétés requises d' immunogénicité et d'hydrophilicité requises pour induire une réponse humorale. Ce polypeptide de 14 acides aminés est identifiée en SEQ ID NO : 6. Ils ont encore montré que ce polypeptide de 14 acides aminés correspond à une région antigénique de la séquence représentée en SEQ ID NO : 5 puisqu' il a permis de développer un protocole de test en ELISA pour la détection d'anticorps anti-HXHV chez des patients ayant une hépatite chronique Non-A Non-E. ; un fragment polypeptidique avantageux comprend ou consiste en SEQ ID NO : 6 ou une séquence polypeptidique fonctionnellement équivalente à SEQ ID NO : 6 ;
- un fragment polypeptidique qui comprend ou qui consiste en une séquence peptidique représentée en SEQ ID NO : 5 ou une séquence peptidique fonctionnellement équivalente à SEQ ID NO : 5.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état isolé, présentant un enchaînement d'un nombre variable d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment par synthèse chimique ou par des techniques de recombinaison génétique. Les polypeptides selon l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur automatique de peptides, ou par les techniques de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces cellules .
Par séquence peptidique équivalente à une séquence peptidique de référence, on entend une séquence d'acides aminés modifiée par insertion et/ou délétion et/ou substitution et/ou allongement et/ou raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications préservent substantiellement voire développent les propriétés immunoréactives de ladite séquence peptidique de référence. Ainsi, on entend par séquences fonctionnellement équivalentes qui conservent les propriétés immunoréactives de SEQ ID NO : 5, notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide (s) aminé (s) est ou sont substitué (s) par un ou plusieurs autres acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un acide aminé de la série D, et vice- versa ; les séquences dans lesquelles on a introduit une modification des chaînes latérales des acides aminés, telle qu'une acétylation des fonctions aminés, une carboxylation des fonctions thiols, une estérification des fonctions carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso, retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
Par exemple un ou plusieurs acide (s) aminé (s) dans les séquences des polypeptides de l'invention peuvent être substitué (s) par un ou plusieurs autre (s) acide (s) aminé (s) de polarité similaire qui agissent comme des équivalents fonctionnels. Des substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptiques d' intérêt peuvent être déterminées à partir d'autres membres de la classe auquel l'acide aminé appartient. Par exemple, les acides aminés non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l' isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, la tryptophane, la méthionine. Les acides aminés neutres polaires comprennent la glycine, la serine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l' asparagine, la glutamine. Les acides aminés chargés positivement (basiques) comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les acides aminés chargés négativement (acides) comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique. D'autres substitutions pour un acide aminé dans des séquences polypeptidiques d' intérêt peuvent être déterminées à partir des informations contenues dans l'article de Kramer A. et al. (Molecular Immunology, Vol. 32, N°7, pp. 459-465 (1995)). Ces auteurs ont constitué des banques dans lesquelles pour réduire le problème de l'explosion combinatoire du nombre de molécules, ils ont utilisés des groupes d' acides aminés constitués d' acides aminés ayant des propriétés physico-chimiques similaires et ce sont les acides aminés regroupés dans chacun de ces six groupes, listés ci-dessous, qui sont considérés principalement comme équivalents dans la présente invention.
Groupe 1 : alanine, proline, glycine.
Groupe 2 : acide aspartique, acide glutamique. Groupe 3 : histidine, lysine, arginine.
Groupe 4 : asparagine, glutamine, serine, thréonine. Groupe 5 : phénylalanine, tyrosine, tryptophane. Groupe 6 : isoleucine, leucine, valine, méthionine. L'équivalence d'une séquence peptidique par rapport à une séquence peptidique de référence peut être définie par son identité ou son homologie, exprimée en pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position. Le pourcentage d' homologie est déterminé à partir du nombre d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés de la séquence de référence, dans la même position.
L'invention concerne aussi une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique ou d'un fragment d'ADN ou d'une molécule d'ADN tels que décrits ci-dessus, place sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. La cassette d'expression est caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote, en particulier E. coli ou d'un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur, en particulier les cellules COS et CHO et les cellules de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris .
L' invention concerne encore un vecteur comprenant ladite cassette d'expression ; une cellule issue d'un organisme procaryote, tel que E. coli ou eucaryote, de préférence un organisme eucaryote ou eucaryote inférieur et avantageusement une cellule COS ou CHO ou une cellule issue de Saccharomyces cerevisiae ou de Pichia pastoris comprenant une cassette d'expression ou un vecteur tel (le) que défini (e) précédemment ; et le polypeptide produit par la cassette d'expression, le vecteur ou la cellule.
L'invention a pour objet un procède pour préparer un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini ci-dessus qui consiste à cultiver une cellule hôte repondant aux définitions précédentes dans un milieu de culture approprie, ladite cellule hôte étant transformée avec un vecteur d'expression qui contient une séquence d' acide nucléique ADN telle que définie précédemment ou un fragment nucléotidique ADN tel que défini précédemment ou une molécule d'ADN telle que définie précédemment et, à purifier ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.
L'invention a aussi pour objet un polypeptide immunogene, caractérise en ce qu'il présente une séquence peptidique ou en ce qu' il consiste en un polypeptide tel (le) que défini (e) précédemment, en particulier le polypeptide représente en SEQ ID NO : 6. Un tel polypeptide immunogene est utilise pour la production d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou de fragments desdits anticorps et l' invention englobe les anticorps monoclonaux ou polyclonaux ou leurs fragments, étant obtenus par immunisation d'un animal mammifère (lapin, rat, souris) avec un tel peptide immunogene.
La production d' anticorps monoclonaux ou polyclonaux est bien connue de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 : 495-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G. F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Des anticorps peuvent également être produits par immunisation de souris, de rat ou de lapins avec les particules virales de
HXHV. Pour la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux, l' immunogene peut être couplé à de l'albumine sérique (peptide SA) ou à l' hémocyanine de Lymphet Keyhole
(peptide KLH) comme support pour l'immunisation. Dans le cadre de la présente invention, l' immunogene identifié en SEQ ID NO : 6 est couplé à la BSA (albumine sérique bovine) . Les animaux sont soumis à plusieurs injections d' immunogene, les anticorps sont prélevés dans le sérum, purifiés (Mise en contact avec une poudre de foie "normal") et sont ensuite criblés pour leur spécificité en utilisant les techniques habituelles, telles que des tests ELISA ou de Western Blot. Pour la production d'anticorps monoclonaux les animaux sont soumis à une injection d' immunogene en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vitro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d'ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d' ions et la chromatographie d' exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d' anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vitro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier. Il est avantageux d'utiliser des anticorps humanisés. Les formes " humanisées " d'anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d'une i munoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l' immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522- 525 (1986) ; Reichmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol . 2 : 593-596 (1992) .
Plus particulièrement, par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab' , sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394-397). Ces fragments d'anticorps et dérivés d'anticorps conservent la capacité de se lier sélectivement à l'antigène cible.
L'anticorps monoclonal ou polyclonal ainsi obtenu ou son fragment est incorporé dans une composition diagnostique qui est utilisée dans un procédé pour détecter au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini précédemment dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec la composition dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes.
L'invention a également pour objet une composition diagnostique qui comprend un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini précédemment et un procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV ou au moins contre un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention, selon lequel on met en contact un échantillon biologique suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le virus HXHV avec la composition diagnostique dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes. Le procédé décrit dans la partie expérimentale et la figure annexée montrent clairement que le polypeptide de l'invention ou le fragment polypeptidique SEQ ID NO : 6 permet de détecter des anticorps spécifiques du virus HXHV chez des patients ayant une hépatite Non-A Non-E.
Il est connu que lors d'une infection par un agent viral, l'hôte développe des anticorps dirigés contre cet agent viral (réponse humorale) . Il est montré dans la partie expérimentale que l'immunisation de lapins avec un immunogene de l'invention permettait la production d'anticorps par les lapins. Il a aussi été montré que des patients ayant une hépatite Non-A Non-E ont développé des anticorps dirigés contre le virus HXHV. La présente invention a donc aussi pour objet le matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des êtres humains ou des animaux infectés par au moins le virus HXHV et des préparations imπiunogènes qui peuvent être utilisées pour produire des vaccins thérapeutiques contre une infection par le virus HXHV et des vaccins prophylactiques pour prévenir une potentielle infection par le virus HXHV, lesdites préparations immunogènes comprenant :
(i) soit au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique naturel, recombinant, ou de synthèse de l'invention; soit
(ii) le virus HXHV, par exemple sous une forme atténuée ou mutée.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal ou d' au moins un fragment desdits anticorps de l'invention, spécifique d'au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini ci-dessus en (i) pour la préparation d'une composition pharmaceutique qui administrée à un patient infecté par le virus HXHV a la capacité de réduire voire d'inhiber la prolifération et/ou la réplication du virus. Ces anticorps ou leurs fragments sont appelés anticorps neutralisants. En conséquence, l'invention se rapporte à une composition immunogene ou vaccinale, caractérisée en ce qu' elle comprend un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention ou le virus HXHV, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et/ou à un excipient pharmaceutiquement acceptable ; et à une composition pharmaceutique comprenant un matériel biologique tel que défini ci- dessus, éventuellement associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié e /ou à un excipient pharmaceutiquement acceptable .
Par échantillon biologique, on entend par exemple le sang, le sérum, le plasma, les prélèvements tissulaires, tels que les extraits de biopsie du foie.
Les vaccins préparés sont injectables, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxide d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations. Dans le cas des peptides, leur couplage à une plus grosse molécule (KLH, toxine tétanique) augmente quelquefois l' immunogénicité . Les vaccins sont administrés conventionnellement par injection par exemple intramusculaire. Des formulations additionnelles favorables avec d' autres modes d'administration incluent des suppositoires et quelquefois des formulations orales.
Par " véhicule pharmaceutiquement acceptable " on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mack Publishing Co. Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington' s Pharmaceutical Sciences précité.
L'invention a encore pour objet :
- une sonde, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence d' acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence, une sonde de l'invention comprend au moins 12 nucleotides, et l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 °C sous le Tm (" melting température ") du complexe sonde / séquence nucléotidique à détecter ;
- une amorce, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence d' acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN de l'invention ; de préférence, une amorce de l'invention comprend au moins 12 nucleotides, et l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 °C sous le Tm (" melting température ") du complexe amorce / séquence nucléotidique à amplifier et/ou détecter ;
- une amorce susceptible de s'hybrider à une séquence nucléique ou à un fragment nucléotidique ou à une molécule d'ADN de l'invention, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ IDs NO : 19 à 22 ;
- un anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique ou à un fragment nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à une molécule d'ADN ou d'ARN ;
- une composition diagnostique, caractérisée en ce qu' elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel que défini ci-dessus ; - un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon atyec au moins une sonde ou une amorce de l'invention, dans des conditions de stringence déterminées et on détecte la présence d'ADN et/ou d'ARN viral dans l'échantillon so±t par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN et/ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN et/ou ARN ; et un procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps anti- acide nucléique, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.
La production de polynucléotides, sondes ou amorces fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut notamment citer l'utilisation d'enzymes de restriction, et la synthèse chimique sur synthétiseur automatique. Les sondes et amorces susceptibles de s'hybrider dans des conditions de stringence déterminées à une séquence nucléotidique d'ADN ou d'ARN ou à un fragment nucléotidique tel que défini précédemment font partie de cette définition. Il est à la portée de l'homme du métier de définir les conditions de stringence appropriées. Des conditions de stringence caractéristiques sont celles qui correspondent à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20°C sous le Tm ( melting température ") de l'hybride à l'étude. On peut ainsi se référer à l'ouvrage de George H. Keller et Mark M. Manak, DNA PROBES, second édition, Stockton Press, 1993, 49 West 24th St., New York, N.Y. 10010 USA. Les conditions de stringence pour discriminer même une seule mutation ponctuelle sont connues depuis au moins les années 1979 ; On peut citer à titre d'exemples
Wallace R. B et al., DNA. Nucleic. Acids . Res. 6, 3543-
3557 (1979), Wallace R. B et al., Science, 209, 1396-1400
(1980), Itakura K. and Riggs A.D., Science, 209, 1401-1405 (1980), Suggs S.V. et al., PNAS, 78, 6613-6617 (1981),
Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9, 3647-3656
(1981), Wallace R.B et al. DNA. Nucleic. Acids. Res., 9,
879-894 (1981) et Conner B.J. étal, PNAS, 80, 278-282
(1983) . Par ailleurs, on connaît des techniques pour la production d'anticorps anti-acides nucléiques. On peut citer à titre d'exemples Philippe Gros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, N°. 15, 2951-2957 ; Anderson, W.F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74 ; Lee, J.S. et al. (1984) FEBS Lett . , 168, 303-306 ; Malfoy, B. et al. (1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467 ; Stollar, B.D. et al., J.J. (eds) Methods in Enzymology, Académie Press, pp 70-85 ; Traincard, F. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 et Traincard, F. et al. (1989) Mol. Cell. Probes, 3, 27-38). L'invention se rapporte aussi à : - une composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant approprié ; un oligonucleotide anti-sens ou anti-gène, caractérisé en ce qu' il est capable d' interférer spécifiquement avec la synthèse d'au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention ;
- une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu' elle comprend au moins un oligonucleotide anti-sens ou un oligonucleotide anti-gène ;
- un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment - (i) soit au moins pour un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention;
(ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) ;
(iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d' au moins un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) ;
- (iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) et/ou d'inhiber sa fonction ; une composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini dans la revendication 37 et en ce que ledit gène d' intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo ;
- un matériel biologique pour la préparation d'une composition pharmaceutique ou vaccinale, comprenant au moins une cellule, notamment une cellule ne produisant pas naturellement des anticorps, sous une forme permettant son administration dans un organisme mammifère, humain ou animal, ainsi qu'éventuellement sa culture préalable, ladite cellule étant génétiquement modifiée in vitro par au moins une séquence d' acide nucléique contenant au moins un gène codant in vivo pour au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique de l'invention ou codant pour au moins une molécule inhibitrice de la fonction et/ou de la fixation et/ou de l'expression d'au moins un polypeptide ou d'un fragment polypeptidique de l'invention ou codant pour au moins un anticorps ou un fragment d' anticorps capable de se lier à au moins un polypeptide ou d'un fragment polypeptidique de l'invention ;
- une cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d' eucaryotes, telles que les cellules COS et CHO et les cellules d' eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccaromyces cerevisiae et de Pichia pastoris, transformées par au moins une séquence d' acide nucléique ou un fragment nucléotidique ou une molécule d'ADN ou par un vecteur de l'invention ; et une composition pharmaceutique ou vaccinale comprenant une telle cellule.
Les compositions pharmaceutiques définies ci-dessus sont des compositions vaccinales à ADN particulièrement avantageuses, en particulier par rapport aux compositions vaccinales " classiques " à base de protéine recombinante. En effet, l'utilisation à visée vaccinale de protéines recombinantes est un système lourd et onéreux, notamment parce qu' il exige de très importantes étapes de purification des antigènes recombinants. De plus, une des difficultés rencontrées est d'obtenir une persistance du vaccin suffisamment longue pour maintenir une bonne mémoire immunitaire. Au contraire, la méthode de vaccination par l'ADN, dont les avantages sont inhérents aux propriétés intrinsèques de l'ADN, est simple et peu coûteuse et est effectuée simplement par injection intramusculaire ou intradermique. De plus, il convient de noter que : les vaccins à ADN sont non infectieux/non réplicatifs, - que du fait que l'immunisation par l'ADN est une forme de transfection in vivo, l'antigène viral est exprimé dans les cellules mammifères sous sa conformation native,
- comme dans le cas d'une infection virale, une large réponse immune, à la fois humorale et cellulaire est induite, et que
- de plus, les vaccins à ADN peuvent facilement être combinés en raison de leur homogénéité physico-chimique.
I. MATERIELS ET METHODES
1-1. Source de matériel biologique.
Le matériel utilisé pour la RDA est constitué de sérums archivés en sérothèque. La RDA a été appliquée à un cas d'hépatite grave, sans étiologie connue, traité avec succès par l'IFN. La normalisation des transaminases chez ce patient après traitement anti-viral et surtout la rechute après arrêt du traitement avec une nouvelle réponse lors de la reprise du traitement sont des éléments qui plaident en faveur d'une étiologie virale de la maladie. Un prélèvement de sérum avant traitement et un prélèvement de sérum après traitement ont été utilisés pour la RDA, le prélèvement avant traitement contenant potentiellement le virus HXHV et le prélèvement après traitement peu ou pas de virus. 1-1.1 Recherche préalable des virus connus des hépatites .
• Criblage par des PCR ultra sensibles: Afin d'éliminer la présence de virus connus des hépatites, qui pourraient être présents en quantité très faibles ou sous la forme de mutants, des tests très sensibles de PCR pour les virus des hépatites responsables d'hépatite chronique (B, C, G et TTV) ont été développés (Chemin et al, J of Hepatol., 2001) d'une grande sensibilité (détection de 10 génomes viraux) .
Les sérums successifs du patient traité à l'interferon et destinés à la méthode d'hybridation soustractive sont demeurés négatifs par ces tests pour tous les virus connus des hépatites ainsi que pour le virus SEN (Minoru Shibata et al. The Journal of Infectious Diseases 2001 ; 184 :400-404). 1-1.2 Choix des échantillons pour la procédure RDA.
* • Echantillons "tester" ou contrôles positifs au pic des transaminases: acides nucléiques totaux extraits du sérum prélevé au pic des transaminases.
• Echantillons "driver" ou contrôles négatifs après traitement: acides nucléiques totaux extraits du sérum prélevé au taux le plus faible des transaminases.
Les extractions des acides nucléiques sont réalisées avec le kit QIAamp® Viral RNA Mini Kit de QIAGEN. La technique différentielle est réalisée grâce au kit CLONTECH PCR - Select™ cDNA Subtraction Kit de CLONTECH selon les instructions du fournisseur.
1-2. La procédure RDA.
1-2.1 Principe.
La méthode développée par Lysitsyn et al. en 1993 repose sur le principe suivant et le kit Clontech (Clontech PCR-select™ cDNA substraction kit) a été utilisé:
• Diminution de la complexité de l'ADN génomique.
La lere étape de la RDA consiste à diminuer la complexité du génome. Pour cela il faut utiliser une enzyme de restriction qui a un site de coupure assez fréquent ce qui permet de réduire la complexité du génome. Le résultat de cette étape est l'obtention d'un ensemble de séquences de moindre complexité quoique représentatifs des séquences initiales, d'où le terme de representational ". La réduction préalable de la complexité du génome à étudier améliore l'efficacité des étapes d'enrichissement en facilitant l'hybridation complète des échantillons. • Enrichissement Des adaptateurs sont raboutés (grâce à une ligase) à chaque extrémité des fragments d'ADN de l'échantillon "tester" contenant le génome viral. L'échantillon "driver" n'a pas d'adaptateurs.
Lors de l'hybridation soustractive le "tester" est mis en présence d'un excès de "driver". Le "driver" D contient de nombreux fragments d'ADN communs avec le "tester" T et joue donc le rôle d'inhibiteurs compétitifs en limitant l'auto-hybridation des fragments d'ADN du "tester" commun aux deux populations. L'ensemble est soumis à un processus de dénaturation/renaturation au cours duquel trois types d'association vont se produire en fonction de la complémentarité des séquences.
Le "driver" étant en large excès, les fragments communs aux deux pools forment essentiellement des hybrides D/D (sans adaptateurs) et aussi des hybrides T/D
(avec un adaptateur à l'extrémité de l'un des deux brins).
Seuls les hybrides T/T possèdent à chaque extrémité les adaptateurs qui seront complétés lors de l'étape d'élongation précédant la PCR . En répétant plusieurs fois la procédure après avoir sélectionné les duplex T/T, il est théoriquement possible de purifier les séquences présentes uniquement dans le "tester" . Cependant l'efficacité de la technique d'hybridation soustractive est limitée en partie à cause de la grande complexité du génome humain et de l'abondance de séquences d'ADN génomique dans tout échantillon de sérum. La répétition d'étape soustractive aboutit à un facteur d'enrichissement final de 102 à 103, alors que l'on recherche un facteur de 106. Il est donc nécessaire d'associer à cette méthode un second moyen d'enrichissement dit cinétique. Ceci est réalisé grâce à une étape de PCR qui utilise des amorces complémentaires des adaptateurs ajoutés lors de l'étape précédente. Les duplex T/T sont donc amplifiés exponentiellement par PCR et les duplex T/D subissent une amplification linéaire dont les fragments issus sont simples brins. Les hybrides T/D ne sont quant à eux pas amplifiés. Il est possible de détruire les ADN simple brin par une nuclease qui épargne les ADN double brin. Ce procédé d'enrichissement sélectif des " testers " double brin peut être répété avec différents adaptateurs pour enrichir l'ADN cible par rapport aux autres séquences du "tester" après amplification. En général, trois cycles de cette réaction permettent d'obtenir le facteur d'enrichissement de 106 de la séquence virale à rechercher. Par la suite les produits obtenus sont sous clones dans un plasmide pour séquençage et analyse.
1-2.2 Protocole.
La RDA est réalisée sur les échantillons " tester " et " driver " à partir des ADNs du patient préalablement cité .
• Digestion des échantillons par l'enzyme de restriction Rsa I
La procédure est réalisée séparément pour l'ADN du "tester" et l'ADN du "driver".
Afin de ne négliger aucune piste, une expérience de
RDA a été effectuée en parallèle avec les ARN sur les mêmes échantillons. Cependant, aucun clone, dont la séquence n'ait pas d' homologie avec des séquences connues, n'a pu être obtenu à partir de l'ARN viral.
Préparation du mélange suivant :
Le mélange tampon Rsa I 10 X (5 μL) , Rsa I (10 u/μL) (1,5 μL) , acides nucléiques 43,5 μL (2 μg) est préparé. Le mélange est incubé lh30 à 37 °C et la réaction est stoppée avec 2,5 μL de 20X EDTA/glycogène. Une extraction est réalisée avec 50 μL de phénol : chloroforme : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) . Une centrifugation est effectuée pendant 10 min. à 14000 tpm et la phase aqueuse supérieure est prélevée. Une nouvelle extraction est réalisée avec 50 μL de chloroforme : isoamyl alcohol (24 : 1), suivie d'une centrifugation pendant 10 min. à 14000 tpm et prélèvement de la phase aqueuse supérieure. La phase aqueuse est précipitée avec 25 μL de NH40Ac 4M et 187,5 μL d'éthanol 95%, suivie d'une centrifugation pendant 20 min. à 14000 tpm et élimination du surnageant. Le culot est lavé avec 200 μL d'éthanol 80%. Une nouvelle centrifugation est effectuée pendant 5 min. à 14000 tpm et le surnageant est éliminé. Le culot est séché à l'air 5 à 10 min. puis dissous dans 5,5 μL d'H20.
• Ligation du "tester" aux adaptateurs (qui contiennent les séquences des amorces PCR, nécessaires à la phase finale de la procédure) : lμL du λλ tester " est dilué dans 5 μL d'eau. Le mélange de ligation est préparé comme suit : H20 (15 μL) , tampon de ligation 5 X (BIOLABS) (10 μl) , T4 ADN ligase (400u/μL) BIOLABS (5 μL) .
Le mélange 1.1 a été préparé comme suit : " tester " 2 μL, adaptateur 1 (lOμM) 2 μL, Master mix 6 μL. Le mélange 1.2 a été préparé comme suit : " tester " 2 μL, adaptateur 2R (lOμM) 2 μL, Master mix 6 μL.
Préparation du contrôle non soustrait : 2 μL du mélange 1.1 ont été additionnés à 2 μL du mélange 1.2. Le mélange ainsi constitué est incubé 1 nuit à 16°C et la réaction est stoppée par addition de 1 μL de 20 X EDTA/glycogène. La ligase est inactivée à 72 °C pendant 5 min. et le mélange est refroidi dans la glace.
• Hybridation soustractive : λλ tester - driver ".
La procédure est réalisée séparément pour l'ADN du λΛ tester " et l'ADN du " driver ". Première hybridation : Deux mélanges Hl et H2 ont été réalisé séparément constitués de l'ADN du " tester " ligaturé avec l'adaptateur 1 (mélange Hl) ou l'adaptateur 2R (mélange H2) . Mélange Hl : " driver " 1,5 μL, " tester 1 - 1" l,5μL, tampon d'hybridation 4 X lμL. Mélange H2 : " driver " 1,5 μL, λλ tester 1 - 2" l,5μL, tampon d'hybridation 4 X lμL. De l'huile a été ajoutée à chacun de ces mélanges et chaque mélange est incubé pendant 1 min.30 à 98 °C puis 6 h à 68 °C avant de procéder immédiatement à la deuxième hybridation.
Deuxième hybridation :
Le mélange suivant est préparé: λ driver " 1 μL, tampon d'hybridation 4 XI μL, H202 μL.
1 μL du mélange est dénaturé à 98 °C pendant 1 min. 30.
15 μL du mélange H2 sont prélevés à l'interface huile/échantillon. L'air est aspiré, le " driver est prélevé et le tout est ajouté au mélange Hl . L'ensemble est incubé à 68 °C pendant la nuit. Dilution des ADN soustraits :
Aux tubes hybrides sont ajoutés 200 μL de tampon de dilution. Le mélange après aspirations et refoulements est incubé à 68 °C pendant 7 min. et la réaction est stoppée dans la glace. • PCR sur les produits de RDA.
La procédure est réalisée séparément sur :
- les produits de RDA dérivant des ADNs,
- le contrôle non soustrait, le contrôle soustrait du kit et le témoin positif PCR du kit.
Premier tour de PCR :
Le mélange suivant est préparé: H20 19,5 μL, tampon PCR 10 X 2,5 μL, dNTPs (10 mM de chaque) 0,5 μL, PCR amorce 1(10 μM) 1 μL, 50 X advantage cDNA polyrrterase mix 0,5 μL, échantillons RDA 1 μL. Le programme utilisé est le suivant: 75°c 5min, 94°c 30sec
Puis 25 cycles: 94°c 10sec, 66°C 30sec, 72°c lmin30
Deuxième tour de PCR: Utilisation de lμl du produit de première PCR. Le même mélange est utilisé.
20 cycles sont effectués: 94°c 10sec, 68°c 30sec, 72 °c lmin30.
Les couples d'amorces du kit Clontech PCR-select™ cDNA substraction sont utilisées, elles sont situées dans les adaptateurs "liés" à l'ADN "tester" au début de la procédure RDA.
Analyse de 8 μL d'échantillon sur gel d'agarose 1 % en TBE IX avec coloration au Bromure d'éthidium.
Les produits de RDA sont ensuite ligués dans le plasmide pTOPO grâce à la topoisomerase I, puis clones dans E. coli à l'aide du kit TOPO TA Cloning® Kit de Invitrogen.
II - ANALYSE DES PRODUITS DE RDA
II-l. Criblage des clones générés par RDA.
La technique RDA permet d' obtenir à partir des échantillons " tester " et " driver " des produits de PCR qui reflètent ce qui est potentiellement différent entre les deux échantillons. Ce qui constitue le matériel soustrait.
Après clonage des produits de RDA 643 clones ont été criblés selon les étapes décrites ci-après.
II-2 Répliques des produits de clonage.
Afin d'éliminer un maximum de clones d'origine humaine, les répliques des clones RDA "ADN" sont hybridées avec des sondes correspondant à de l'ADN génomique humain digéré par Eco RI / Pst I et radiomarquées au 3P. Les résultats à l'issue de ce criblage sont présentés ci-dessous .
643 clones RDA Répliques
Hybridation
Sonde génome humain
593 hybrident 50 clones au génome humain n' hybrident pas à la sonde génome
II-3. Interrogation de banques de données
Les cinquante clones sélectionnés à l' issue de la première étape sont séquences. Leurs séquences respectives sont comparées aux séquences connues dans les banques de données Swissprot, Embl, Genbank, Draft du génome humain. Un certain nombre apparaît inconnu. Les résultats de la répartition des séquences sont donnés ci-dessous.
Phosphatase 23% ADN humain chromosomes 16 + 17 31%
Protéinase 8%
Immunoglobuline humaine 16%
Inconnues 8%
II-4 Criblage complémentaire.
Des étapes supplémentaires de criblage ont été réalisées sur les 4 clones sélectionnés à l'étape précédente selon le processus décrit ci-dessous. • " Dot blot " sur l'ADN des clones sélectionnés en utilisant une sonde ADN génomique Eco RI / Pst I radiomarquée au 32P.
• Southern blot d'ADN génomique en utilisant comme sonde les clones sélectionnés préalablement marqués au 32P.
A l'issue de ces différentes étapes, deux clones ΛΛ ADN ", dont les séquences sont inconnues dans les banques de données, ont été sélectionnés.
L' étape suivante est la validation de la pertinence de ces données à la fois sur des échantillons provenant de patients atteints d'hépatite d' étiologie indéterminée et des témoins constitués d'une part des donneurs de sang et d'autre part des patients souffrant de pathologies du foie d'origine non virale. Pour cela, des amorces ont été synthétisées au sein de l'ADN des deux clones et des PCRs ont été réalisées en utilisant ces amorces sur l'ADN génomique extrait du sérum de donneurs de sang afin d'éliminer la possibilité que l'ADN des clones ne corresponde à une séquence ADN fréquente dans le génome humain.
Un clone contenant un insert de 1400bp (XH) provenant de la RDA sur ADN a été sélectionné pour son absence d' homologies avec l'ADN génomique humain et avec toute séquence présente dans les bases de données. Cette séquence, riche en GC (62%) présente plusieurs phases de lecture ouvertes. Elle est identifiée en SEQ ID NO :1. Les phases de lecture ouvertes sont identifiées en SEQ ID NO, : 2, 3, 4 et 5.
III . Caractérisation de la séquence associée aux hépatites X : XH
Quatre approches parallèles ont été mises en œuvre afin de caractériser et préciser la nature de la séquence XH isolée : Etudes bio-cliniques et épidémiologiques Approche " Moléculaire " Production d'anticorps spécifiques Etude en microscopie électronique
III-l Etudes bio-cliniques et épidémiologiques - Différents jeux d'amorces et de sondes ont été synthétisés afin de pouvoir amplifier par PCR la séquence XH.
Il est possible d'utiliser la combinaison d'amorces suivante : Amorce sens (1M13) :
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO :10) Amorce antisens (3T7) : 5'-ATGCCAACGCCCAGAGTCCG-3' (SEQ ID NO :13)
Cycles de PCR : 75°C 5 min., 94°C 2 min., 94°C 10 s x 28, 66°c 30 s x 28, 72°C 1 min. 30 x 28 et 72°C 7 min. Deuxième tour de PCR :
3 μL d'échantillons du 1er tour ont été dilués avec 27 μL d'eau.
Le mélange suivant a été préparé: H20 17,5 μL, tampon PCR 10 X 2,5 μL, dNTPs (10 mM de chaque) 0,5 μL, PCR nichée amorce sens (10 μM) 1 μL, PCR nichée amorce antisens 2R (10 μM) 1 μL, 50 X advantage cDNA polymerase mix 0,5 μL, échantillons RDA 1/10 2 μL.
Les couples d'amorces suivants ont été utilisés : Amorce sens (1M13) :
5'-CCCGCCCCGCTGATGAAAAG-3' (SEQ ID NO :10) Amorce antisens (1T7): 5'-GATGTTTCTGTGTCTGTGGG-3' (SEQ ID NO :14)
Cycles de PCR : 94°C 2 min., 94°C 10 s x 10-15, 68°c 30 s x 10-15, 72°C 1 min. 30 x 10-15 et 72°C 7 min.
Tout d'abord, 90 donneurs de sang ayant des transaminases normales ont été criblés par PCR. Tous sont négatifs pour la séquence XH. - En parallèle la présence de la séquence XH à différentes dates dans le sérum du patient ayant permis de réaliser la RDA a été recherchée. La présence de la séquence XH a été constatée uniquement au moment où les transaminases étaient particulièrement élevées. L'analyse d'une biopsie de foie de ce patient après la chute des transaminases révèle la présence de cette séquence. Il faut noter, dans ce cas, que le patient est traité par l'interferon désormais depuis 10 ans et que toute tentative d' arrêt du traitement a pour conséquence une augmentation rapide des transaminases suggérant la présence persistante de l'agent en cause dans la maladie du foie.
Vingt cas de cirrhose biliaire primitive sont demeurés également négatifs pour la séquence XH au niveau du sérum et du foie. Quatre cas d'hépatites médicamenteuses ont également été étudiés et se sont également révélés négatifs. Seuls 1/21 cas d'hépatite auto-i mune et 1/7 cas d'hépatite alcoolique étaient positifs pour la séquence XH. Ces résultats sur des populations contrôles ont permis de vérifier que la séquence XH n' est pas habituellement présente dans le sérum humain " normal " ou dans le contexte de lésions du foie d' étiologie non virale.
De manière très intéressante, l'analyse d'échantillons de foie et de sérum de patients de l'Hôtel Dieu de Lyon, souffrant d'une hépatite chronique Non-A Non-E a permis de constater que 10% d'entre eux (11/109) sont porteurs de la séquence XH. Un pourcentage similaire de patients positifs pour l'ADN de HXHV est obtenu chez des patients marocains ayant une hépatite chronique Non-A Non-E.
- Les patients positifs par PCR dans le sérum pour la séquence XH sont apparus également positifs au niveau de l'ADN extrait de biopsies de foie lorsque la biopsie était disponible. La présence de la séquence XH a pu être observée à différentes dates, espacées de plusieurs années, pour un même patient. produits amplifiés par PCR qui ont été séquences et montrent une séquence très similaire d'un patient à 1' autre.
Ces patients ont tous une hépatite chronique avec des degrés variables au niveau des lésions du foie, depuis l'hépatite minime jusqu'à la cirrhose. Certains seulement ont été transfusés ce qui constitue un facteur de risque clairement établit quant à la transmission d'un virus des hépatites. Ces patients n'étant porteur d'aucun virus connu des hépatites n'ont intégrés aucun protocole de traitement antiviral.
De plus, l'analyse de treize cas d'hépatite aiguë Non-A Non-E du Brésil a permis de détecter la présence de la séquence XH chez onze de ces patients à la phase aiguë.
II1-2 Approche " moléculaire II
Afin de déterminer la nature de l'ADN isolé (simple brin ou double brin) la séquence XH a été capturée avec alternativement deux oligonucléotides spécifiques de l'un ou l'autre des deux brins ADN de la séquence XH fixés sur des particules magnétiques (Gène Trapper cDNA positive sélection System, Gibco BRL (nom commercial) ) . Les oligonucléotides utilisés sont les suivants : oligonucleotide sens S6M13: 5'-GCCATGTAACTCGGCAGTGC-3' (SEQ ID. NO :9) oligonucleotide antisens Comp S6M13: 5'-GCACTGCCGAGTTACATGGC-3' (SEQ ID NO :15)
Dans un deuxième temps les produits relargués après capture avec les oligonucléotides spécifiques sont analysés par :
PCR et hybridation des produits de PCR avec une sonde spécifique de XH.
Clonage, analyse des clones par PCR, hybridations des répliques des produits clones, sequençage des clones. Cette démarche a été validée sur la séquence XH clonée dans le vecteur TOPO. Sous cette forme, la séquence issue de la RDA est double brin puisque issue d'une PCR. La procédure de capture réalisée sur la séquence clonée permet en final de capturer les deux brins d'ADN présents.
La nature de la séquence XH qui circule chez les patients a été recherchée à partir de plusieurs sérums de patients " hépatite X ", positifs par PCR pour la séquence XH. Les sérums sont ou non ultracentrifugés avant le procédé de capture.
L'ensemble de ces résultats démontre que seul l'un des oligonucléotides (1' oligonucleotide sens, S6M13) est capable de retenir la séquence XH qui circule dans le sérum des patients. En conséquence, cette séquence est au moins partiellement simple brin. Cette hypothèse sur la nature simple brin de l'ADN de XH est étayée par des essais de traitements préalables de l'ADN de XH par la nuclease SI, enzyme spécifique des formes simple brin d'ADN. Le traitement préalable d'extraits de sérums positifs pour l'ADN de XH abolit le signal PCR et confirme donc la nature simple brin de la séquence.
III-3 Production d' anticorps spécifiques . - La séquence XH (SEQ ID NO : 1) présente quatre phases de lecture ouvertes. L'ORFl est présentée en SEQ ID NO : 2, elle comprend 101 acides aminés codés par les bases 1 à 103 de SEQ ID NO : 1. LORF2 est présentée en SEQ ID NO : 3, elle comprend 135 acides aminés codés par les bases 829 à 1233 de SEQ ID NO : 1. L/0RF3 est présentée en SEQ ID NO : 4, elle comprend 135 acides aminés codés par les bases 270 à 674 de SEQ ID NO : 1. LORF4 est présentée en SEQ ID NO : 5, elle comprend 183 acides aminés codés par les bases 813 à 1361 de SEQ ID NO : 1. Par analyse informatique il a été montré que la protéine choisie possède une région de 14 acides aminés qui a toutes les propriétés d' immunogénicité et hydrophilicité requises pour induire la production d' anticorps.
- Un polypeptide correspondant à la zone des 14 acides aminés précitée a été synthétisé pour la production d'anticorps polyclonaux. La séquence de ce polypeptide est donnée ci-dessous et référencée en SEQ ID NO : 6.
RRAAELHRRDQYRL Pour l'immunisation des lapins, une cystéine (C) a été ajoutée à l'extrémité COOH terminale de ce polypeptide pour le couplage à la BSA. L' immunogene RRAAELHRRDQYRLC- BSA a été injecté aux lapins à raison de 100 μg d' immunogene par lapin et par injection. Le protocole d'immunisation utilisé est le suivant : J0 : lère prise de sang de 10 ml, immunisation : 0,1 mg d' immunogene (1 mg/mL) + 0,4 mL d'eau physiologique + 0,5 mL AFC 1 mL en ID (0,1 mL x 10)
J28 : 0,1 mg d' immunogene (1 mg/mL) + 0,4 mL d'eau physiologique + 0,5 mL AFI en ID-1 L en ID (0,1 mL x 10) J56 : 0,1 mg d' immunogene (1 mg/mL) + 0,4 mL d'eau physiologique + 0,5 mL AFI-1 mL en SC (0,25 mL x 4)
J63 : lere prise de sang de 3 mL à l'oreille sans anticoagulant
J84 : 0,1 mg d' immunogene (1 mg/mL) + 0,4 mL d'eau physiologique + 0,5 mL AFI 1 mL en IM (0,25 mL x 4)
J91 : 2ème prise de sang de 9 mL à l'oreille sans anticoagulant
J112 : 0,1 mg d' immunogene (1 mg/mL) + 0,4 L d'eau physiologique + 0,5 L AFI-1 mL en ID (0,1 mL x 10) J119 : 3eme prise de sang de 9 mL à l'oreille sans anticoagulant .
La production d'anticorps spécifiques est un outil très efficace pour le criblage de l'expression de la séquence XH sur des biopsies de patients Non-A Non-E en parallèle avec d'autres catégories de patients ou de contrôles. - Le polypeptide de 14 acides aminés (SEQ ID NO :6) est utilisé pour la mise au point d'un test ELISA pour la capture d' anticorps spécifiques du virus HXHV potentiellement présents chez des patients ayant une hépatite chronique Non-A Non-E. Dans les puits d'une plaque de microtitration sont déposés 100 μL de streptavidine diluée au 1/100 dans un tampon carbonate. Le dépôt est suivi d'une incubation pendant 2 heures à 37 °C dans une étuve, après laquelle trois lavages sont effectués. 100 μL du peptide biotinylé, dilué au 1/100 dans du PBS, sont ensuite ajoutés dans chacun des puits. Le mélange est incubé pendant une nuit à 4°C. Trois lavages sont ensuite réalisés. 250 μL de PBS + sérum de chèvre sont ensuite ajoutés afin de saturer les sites. L'ensemble est incubé pendant 2 heures à 37 °C. Après trois lavages, 100 μL de chaque sérum à tester (dilué à la dilution appropriée dans du PBS Tween + SC) sont ajoutés et une incubation est réalisée pendant 2 heures à 37 °C en étuve. Trois lavages sont ensuite réalisés et 100 μL d'une solution diluée d' anticorps anti-IgG humain couplé à la peroxydase sont déposés. L'ensemble est incubé en étuve pendant une heure à 37°C. L'incubation est suivie d'une étape de trois lavages. La révélation est réalisée par addition d' ortho-phenylènediamine (100 μL) . La réaction est bloquée par addition de 50 μL d' H2S0 et la lecture est effectuée aux DO 492nm et 635nm. Les résultats sont présentés dans la figure annexée. Comme cela ressort de cette figure 6 patients sont très bien détectés par cette technique parmi les 16 chez lesquels le séquence XH avait été détectée par PCR. Un septième patient est détecté faiblement, à la limite du seuil.
III-4 Etude en microscopie électronique
Des gradients de sucrose ont été réalisés afin d' isoler d' éventuelles particules virales associées à la présence de la séquence XH. Pour cela, le sérum d'un patient de la cohorte d'hépatites Non-A Non-E a été utilisé. Deux fractions consécutives de ce gradient sont apparues positives par PCR pour la séquence XH. Ces fractions correspondent à des densités de l'ordre de 1,2 à 1,5 g/cm3. L'étude en microscopie électronique a permis d'observer des particules dont la taille et la régularité (HOnm de diamètre) sont compatibles avec celle d'un agent viral. La fréquence avec laquelle ces particules sont observées en microscopie électronique suggère une concentration de l'ordre de 5xl05 particules/ml de sérum.
Le test ELISA mis au point nous a permis de rechercher la présence d'anticorps "anti-XH" chez des donneurs de sang et dans différentes catégories de patients.
IV ETUDE SUR DES DONNEURS DE SANG ET DES PATIENTS IV-1. Recherche d' anticorps anti-XH La recherche d'anticorps anti-XH chez des donneurs de sang et dans différentes catégories de patients a été réalisée par test ELISA. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Tableau
TN signifie « donneurs de sang ayant un taux de transaminases normale »
TN signifie « donneurs de sang ayant un taux de transaminases élevé »
VHC+ signifie « patients VHC positifs »
VHB+ signifie « patients VHB positifs »
VIH+ signifie « patients VIH positifs »
Non A-E* signifie « patients atteints d'une hépatite non A-E chronique »
Non A-E** signifie « patients atteints d'une hépatite non A-E fulminante »
H* signifie « patients hémophiles ayant été transfusés avant
1987, c'est à dire avant traitement du sang par des solvants détergents »
H** signifie « patients hémophiles ayant été transfusés après
1987 »
La différence de prévalence des anticorps anti-XH entre les 408 donneurs de sang ayant des transaminases normales et les 389 donneurs de sang ayant de transaminases élevées est significative. Cette différence, observée entre ces deux groupes testés en double aveugle, suggère une relation causale entre la présence des anticorps anti-XH et la maladie hépatique. Une fraction des donneurs de sang ayant des transaminase élevées (20%) est retrouvée positive en PCR pour la séquence XH. Cette séquence n'a jamais été retrouvée chez les donneurs de sang ayant des transaminases normales. Un pourcentage plus élevé de positivité en anticorps anti-XH est retrouvé pour les patients VIH positifs (35%), comparé aux 16% chez les patients porteurs chroniques du VHB et aux 3% chez les porteurs chroniques du VHC. L'étude détaillée des facteurs de risque auxquels les patients ont été exposés démontre que la séquence XH est transmissible par voie parentérale et sexuelle.
Seuls les patients ayant une hépatite chronique ou fulminante Non-A Noh-E positifs en ELISA sont positifs paîr
PCR dans 50% des cas , alors qu'aucun positif en ADN n'a été détecté dans le groupe des patients VHC, VHB ou parmi les hémophiles. . • . ':
Une étude a également été menée sur des patients atteints d'hépatite aiguë d'étiolpgie inconnue évoluant vers la chronicité ou la guérison. Sur 13 cas étudiés, 11 se sont révélés positifs en anticorps anti-XH durant la phase aiguë de la maladie. Parmi les cas ayant pu être suivis, tous sont demeurés positifs en anticorps dans le temps .
IV-2. Recherche de la séquence XH par PCR
Une méthode de PCR quantitative en temps réel utilisant le Light cycler Roche® a été développée pour amplifier la séquence XH. Elle a été utilisée, entre autres, pour amplifier la séquence XH dans l'ORF 4 chez les 11 patients qui s'étaient révélés être positifs en anticorps anti-XH. Les quatre amorces spécifiques décrites ci-dessous ont été synthétisées et purifiées sur HPLC.
51 (sens) : 5' -GCGTTGTGGTTCTGTTGC-3' (SEQ ID NO: 19)
52 (sens) : 5' -GATCAATATCGCCTACGC-3' (SEQ ID NO: 20)
AS1 (anti-sens) : 5' -CTGAAGGATAGGGCTGATG-3' (SEQ ID NO 21) AS2 (anti-sens) : 5' -CTGTTCGCCAGCCACCAG-3' (SEQ ID NO 22) La PCR est réalisée à partir du kit Qiagen « QuantiTect SYBR Green PCR Kit» (nom commercial) .
La composition du mélange de réaction est la suivante
Master mix quantitect Qiagen lOμl
Amorce sens (15μM) lμl
Amorce anti-sens (15μM) lμl
ADN cible 5μl
Eau (sans RNAse) 3μl
Volume total par capillaire 20μl
Une fois les 20μl déposés, les capillaires sont scellés, centrifugés brièvement et placés dans le rotor du Light Cycler.
Protocole de la PCR.
• Activation :
95 ° C pendant 15 minutes .
• Amplification/Quantification : Nombre de cycles 45
Dénaturation Hybridation Elongation Température [ °C] 95 52 72
Incubation [ s ] 0 5 Tx*
Taux de transition de température [ °C/s ] 20 20 20
Tx* : température dépendant de la combi:naison d' amorces utilisée .
Amorces Taille de l' ampl:icon (pb) Tx (s
S1/AS1 441 18
S1/AS2 312 13
S1/AS2 331 13
S2/AS2 232 10 • Analyse de la courbe de fusion :
Dénaturation Hybridation Elongation
Température [°C] 95 40 95 Incubation [s] 0 5 0
Taux de transition de température [°C/s] 20 20 0,3
• Refroidissement : 40 °C pendant 30 secondes.
• Caractérisation et seuil de détection de la séquence d' intérêt.
Le seuil de détection théorique de la séquence XH insérée dans le plasmide se situe entre 1 et 2 copies par capillaire. Le Tm de l'amplicon S1/AS2 (312 pb) le plus fréquemment utilisé est de 88 °C.
L'application de cette technique montre, entre autres, que quatre sur cinq des patients ayant évolués vers une hépatite chronique sont positifs par PCR pour la séquence XH. A l'inverse cinq sur six des patients ayant guéris sont devenus négatifs par PCR pour la séquence XH.

Claims

REVENDICATIONS
1. Virus HXHV isolé présentant les caractéristiques suivantes : (i) un génome à ADN, au moins partiellement simple brin, (ii) ledit génome comprend au moins une trame de lecture (ORF) codant pour une protéine ou une polyprotéine (iii) ledit génome comprend une séquence nucléotidique qui présente, pour tout segment d'au moins 40 nucleotides appartenant à ladite séquence, au moins 90% d' homologie avec SEQ ID NO :1 ou avec son complémentaire.
2. Virus selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence selon (iii) présente, pour tout segment de 40 nucleotides appartenant à ladite séquence, au moins 95% d' homologie avec SEQ ID NO : 1 ou avec son complémentaire .
3. Virus selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite séquence selon (iii) présente, pour tout segment de 40 nucleotides appartenant à ladite séquence, au moins 98% d' homologie avec SEQ ID NO : 1 ou avec son complémentaire .
4. Virus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que. son génome comprend au moins une trame de lecture codant pour une séquence peptidique choisie parmi SEQ ID NO : 2-6.
5. Séquence d'acide nucléique susceptible d'être obtenue à partir du génome du virus HXHV tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Fragment nucléotidique d'ADN, caractérisé en ce qu' il comprend ou consiste en une séquence nucléotidique d'au moins 12 nucleotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire.
7. Fragment selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en au moins 15 nucleotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire .
8. Fragment selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu' il comprend ou consiste en au moins 18 nucleotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire.
9. Fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en au moins 21 nucleotides contigus appartenant à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire.
10. Fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que lesdits nucleotides contigus appartiennent au segment commençant au nucleotide 813 et se terminant au nucleotide 1361 de SEQ ID NO :1, ou fragment complémentaire.
11. Fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que lesdits nucleotides contigus appartiennent au segment commençant au nucleotide 927 et se terminant au nucleotide 968 de SEQ ID NO :1, ou fragment complémentaire.
12. Fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en SEQ ID NO :1 ou son complémentaire.
13. Produit de transcription d'un fragment tel que défini à l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou de son complémentaire.
14. Molécule d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en un fragment tel que défini à l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou en son complémentaire .
15. Molécule d'ARN, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en un produit de transcription tel que défini à la revendication 13.
16. Polypeptide dont la séquence polypeptidique est codée par le génome d'un virus HXHV tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4.
17. Fragment peptidique comprenant ou consistant en une séquence peptidique d' au moins 7 acides aminés appartenant à SEQ ID NO : 5.
18. Fragment selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en SEQ ID NO :5.
19. Fragment selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence peptidique d'au plus 15 acides aminés appartenant à SEQ ID NO :5.
20. Fragment selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu' il comprend ou consiste en SEQ ID NO :6.
20. Fragment selon la revendication 17 ou 19, caractérisé en ce qu' il comprend ou consiste en une séquence peptidique ayant de 6 à 10 acides aminés ou de 8 à 12 acides aminés, lesdits acides aminés appartenant à SEQ ID NO :5.
21. Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique selon la revendication 5, ou d'un fragment selon l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou d'une molécule d'ADN selon la revendications 14, placée sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression.
22. Vecteur comprenant une cassette d'expression selon la revendication 21.
23. Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression selon la revendication 21 ou un vecteur d'expression selon la revendication 22.
24. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote choisi parmi les cellules COS et CHO.
25. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un organisme eucaryote inférieur choisi parmi les cellules de Saccharomyces cerevisiae et de Pichia pastoris .
26. Polypeptide susceptible d'être produit par une cassette d'expression selon la revendication 21, un vecteur selon la revendication 22, ou une cellule selon l'une quelconque des revendications 24 à 26.
27. Procédé pour préparer un polypeptide selon la revendication 16 ou un fragment polypeptidique selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, selon lequel on cultive une cellule hôte telle que définie à l'une quelconque des revendications 23 à 25 dans un milieu de culture approprié, et on purifie ledit polypeptide produit jusqu'à un degré de pureté requis.
28. Polypeptide immunogene consistant en un polypeptide tel que défini à la revendication 16 ou 26, ou en un fragment peptidique tel que défini à l'une quelconque des revendications 17 à 20.
29. Polypeptide selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il consiste en SEQ ID NO :6.
30. Anticorps monoclonal ou polyclonal susceptible d'être obtenu par immunisation d'un animal mammifère avec un peptide immunogene tel que défini dans la revendication 28 ou 29.
31. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu' elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 16 ou 26, ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 17 à 20, 28 et 29.
32. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu' elle comprend un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal tel que défini dans la revendication 30.
33. Procédé pour détecter des anticorps dirigés contre le virus HXHV selon la revendication 1 ou au moins contre un polypeptide tel que défini à la revendication 16 ou 26, ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 17 à 20, selon lequel on met en contact un échantillon biologique suspecté être ou pouvoir avoir été infecté par le virus HXHV avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 31, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes .
34. Procédé pour détecter un polypeptide tel que défini à la revendication 16 ou 26, ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans un échantillon biologique, selon lequel on met en contact l'échantillon biologique avec une composition diagnostique telle que définie dans la revendication 32, dans des conditions prédéterminées qui permettent la formation de complexes anticorps/antigène et on détecte la formation desdits complexes .
35. Composition immunogene ou vaccinale, caractérisée en ce qu' elle comprend un polypeptide tel que défini à la revendication 16 ou 26, ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 17 à 20, 28 et 29, ou le virus HXHV tel que défini dans la revendication 1, associé à un véhicule et/ou adjuvant et/ou diluant approprié et/ou à un excipient pharmaceutiquement acceptable.
36. Sonde d'au moins 12 nucleotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 5, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 14 ou 15, l'hybridation étant réalisée dans les conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 °C sous le Tm (Λ melting température ") du complexe sonde - séquence d'acide nucléique à détecter.
37. Amorce d'au moins 12 nucleotides, caractérisée en ce qu'elle est susceptible de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 5, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 14 ou 15 l'hybridation étant réalisée dans les conditions de stringence correspondant à une combinaison de la température et de la concentration saline choisie approximativement entre 12 à 20 °C sous le Tm ( melting température ") du complexe amorce - séquence d'acide nucléique à amplifier et/ou détecter.
38. Amorce susceptible de s'hybrider à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 5, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou à une molécule d'ADN telle que définie dans la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ IDs NO : 19 à 22.
39. Anticorps anti-acide nucléique, caractérisé en ce qu'il est susceptible de se lier à une séquence d'acide nucléique telle que définie dans la revendication 5, ou à un fragment nucléotidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 12, ou à une molécule d'ADN ou d'ARN telle que définie dans la revendication 14 ou 15.
40. Composition diagnostique, caractérisée en ce qu' elle comprend au moins une sonde ou une amorce ou un anticorps anti-acide nucléique tel (le) que défini (e) dans les revendications 36, 37, 38 et 39.
41. Procédé de détection d'un ADN ou d'un ARN viral, dans un échantillon biologique, selon lequel on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraire l'ADN ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde ou une amorce telle que définie dans la revendication 36, 37 ou 38, dans des conditions de stringence déterminées, et on détecte la présence d'ADN ou d'ARN viral dans l'échantillon soit par mise en évidence d'une hybridation dudit ADN ou ARN viral avec au moins une sonde, soit par amplification dudit ADN ou ARN.
42. Procédé de diagnostic d'ADN et/ou d'ARN viral, selon lequel on prélève un échantillon de sérum ou de plasma d'un patient, on traite si nécessaire ledit échantillon pour en extraite l'ADN et/ou l'ARN, on met en contact ledit échantillon avec au moins un anticorps antiacide nucléique tel que défini dans la revendication 30, ledit anticorps étant éventuellement marqué par tout marqueur approprié et on met en évidence la formation d'un complexe acide nucléique/anticorps.
43. Composition vaccinale comprenant une séquence d'ADN codant pour au moins un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 16 à 20, 28 et 29, ledit ADN étant mélangé avec un véhicule et/ou un diluant approprié.
44. Vecteur comprenant au moins un gène d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, ledit gène codant notamment
(i) soit au moins pour un polypeptide ou un fragment polypeptidique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 16 à 20, 28 et 29;
(ii) soit au moins pour tout ou partie d'un anticorps polyclonal ou monoclonal capable de se fixer à au moins un un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) ; (iii) soit au moins pour une molécule inhibitrice d' au moins un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) ;
(iv) soit au moins pour un ligand ou toute partie d'un ligand capable de se fixer à au moins un polypeptide ou fragment polypeptidique défini en (i) et/ou d'inhiber sa fonction.
45. Composition thérapeutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre autre, un vecteur tel que défini dans la revendication 44 et en ce que ledit gène d' intérêt est placé sous la dépendance d'éléments assurant son expression in vivo .
46. Cellule génétiquement modifiée, en particulier choisie parmi les cellules d' eucaryotes, telles que les cellules COS et CHO et les cellules d' eucaryotes inférieurs, telles que les cellules de levure, en particulier les cellules issues de Saccaromyces cerevisiae et de Pichia pastoris, transformées par au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 5 ou un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 6 à 12 ou une molécule d'ADN selon la revendication 14 ou par un vecteur selon la revendication 44.
47. Composition pharmaceutique ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule telle que définie dans la revendication 46.
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