EP1390401A2 - Antigenes de plasmodium falciparum et leurs applications vaccinales et diagnostiques - Google Patents

Antigenes de plasmodium falciparum et leurs applications vaccinales et diagnostiques

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Publication number
EP1390401A2
EP1390401A2 EP02732872A EP02732872A EP1390401A2 EP 1390401 A2 EP1390401 A2 EP 1390401A2 EP 02732872 A EP02732872 A EP 02732872A EP 02732872 A EP02732872 A EP 02732872A EP 1390401 A2 EP1390401 A2 EP 1390401A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
malaria
seq
salsa
antibodies
sporozoites
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02732872A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Druilhe
Anne-Charlotte GRÜNER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur
Original Assignee
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CA002345206A external-priority patent/CA2345206A1/fr
Priority claimed from CA002346968A external-priority patent/CA2346968A1/fr
Application filed by Institut Pasteur filed Critical Institut Pasteur
Publication of EP1390401A2 publication Critical patent/EP1390401A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to novel antigens of
  • Plasmodium falciparum and their vaccine and diagnostic applications More particularly, the present invention relates to immunogenic polynucleotide and polypeptide molecules, compositions comprising them, and methods of diagnosis and vaccination of malaria.
  • Malaria is a disease caused by the infection of protozoan parasites belonging to the apicomplexes of the Plasmodium species and transmitted by females of mosquitoes of the genus Anopheles.
  • WHO has ranked malaria among the three infectious diseases of major interest for global public health on the same level as tuberculosis and AIDS, there is not yet an effective vaccine against this disease. sickness.
  • the present invention relates to new polynucleotide and polypeptide molecules specific for the preerythrocytic stages and to their uses as active principle of anti-malaria vaccine or in methods of diagnosing the disease.
  • the Applicant has identified a series of 120 fragments of genomic DNA coding for proteins expressed at the pre-erythrocytic stages, that is to say at the sporozoite stage and / or at the hepatic stage.
  • the characterisation initial of this series of clones led to identify the antigen LSA-1, then SALSA, then STARP, then LSA-3.
  • More recent work on 10 fragments of the same bank of clones coding for pre-erythrocytic stages has made it possible to provide details concerning 8 of them, 3 have turned out to be genes already known to be expressed at the erythrocytic stage and the other 5 as new genes not described to date, and whose expression at the pre-erythrocytic stages has been confirmed.
  • DG747 and DG772 have several remarkable properties: they generate cellular responses to high levels of Interferon- ⁇ , detected by ELISPOT in volunteers protected by irradiated sporozoites, which are also found for several regions of the LSA-3 antigen but which are absent for 4 regions of the LSA-1 antigen, two of SALSA, two of STARP and two of the "CircumSporozoite protein". These same two clones are also positive in the same tests in chimpanzees protected by irradiated sporozoites.
  • the differential response profile between protected chimpanzees and those of chimpanzees having received sporozoites irradiated at too high a dose, and unprotected, is identical to that recorded with the molecule LSA-3 which is capable of inducing protection.
  • This response profile corresponds, according to work carried out in rodents, to the ability to induce specific cellular recruitment at the intrahepatic level.
  • the complete sequence of the two genes has been identified.
  • the corresponding proteins have a high antigenicity in individuals exposed to the parasite in the endemic area (reaction in 80% of adults in the endemic area). Their location on the surface of the sporozoite and their production during the intrahepatic maturation of the parasite was confirmed by various biological methods. Their immunogenicity in animals in the form of recombinant proteins, or in the form of plasmids (genetic immunization) has been demonstrated.
  • one aspect of the present invention relates to an isolated or purified polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 60%, preferably at least 80% and more preferably at least 95% of identity with SEQ ID NO: 1 (DG747 ) or SEQ ID NO: 2 (DG772).
  • Another aspect of the present invention relates to an isolated or purified polynucleotide comprising at least 10 consecutive nucleotides identical to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to isolated or purified polynucleotides which hybridize in high stringency conditions with a polynucleotide as defined above.
  • polypeptide of the invention has at least 60%, preferably at least 80% and more preferably at least 95% of homology with SEQ ID NO: 3 (DG747) or SEQ ID NO: 4 (DG772).
  • the polypeptide of the invention comprises at least 5 consecutive amino acids identical to one of SEQ ID NOs: 3 to 8.
  • the polypeptide of the invention has at least 40%, preferably at least 60%, more preferably at least 80% and even more preferably at least 95% identity with one of the SEQ ID NOs: 3 to 8, 10 and 12.
  • the invention covers also the recombinant or chimeric polypeptides comprising at least one polypeptide as defined above.
  • Another aspect of the present invention relates to an isolated or purified antigen consisting of a polynucleotide or a polypeptide as defined above.
  • the present invention relates to an antigenic conjugate consisting of a polynucleotide and / or a polypeptide as defined above; and a support on which said polynucleotides / polypeptides are adsorbed.
  • a conjugate can advantageously be used for immunization of individuals infected or likely to be infected with malaria.
  • Another aspect of the present invention relates to monoclonal or polyclonal antibodies, preferably humanized, specifically recognizing at least one of the polynucleotides, polypeptides and / or conjugates defined above.
  • a related aspect of the present invention relates to pharmaceutical compositions which comprise as active substance one or more of these polyclonal or monoclonal antibodies, in association with an acceptable pharmaceutical carrier.
  • the present invention relates to a cloning or expression vector (such as plasmids, cosmids and phages) comprising a polynucleotide sequence according to the present invention.
  • the invention also covers the host cells comprising such a vector, and more particularly the recombinant E.Coli cells deposited at the C.N.C.M. on May 23, 2001 under accession numbers 1-2671 and I-2672.
  • Another aspect of the present invention relates to an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising polynucleotides, polypeptides and / or conjugates as defined above; and an acceptable pharmaceutical vehicle.
  • compositions and vaccines of the present invention are used for the manufacture of medicaments for the prevention and / or treatment of malaria.
  • the present invention relates to methods and kits (kits) for in vitro diagnosis of malaria in an individual susceptible to infection by Plasmodium falciparum.
  • the method comprises the following steps: a) bringing into contact, under conditions allowing an immunological reaction, a tissue and / or a biological fluid taken from an individual susceptible to being infected by Plasmodium falciparum with a antibodies as defined above to allow the formation of immune complexes; and b) in vitro detection of the immune complexes formed.
  • the diagnostic method comprises the following steps: a) bringing into contact, under conditions allowing an immunological reaction, a tissue and / or a biological fluid taken from an individual susceptible to 'be infected with Plasmodium falciparum with polynucleotides, polypeptides, and / or as defined above, in order to allow the formation of immune complexes involving at least one of said elements and antibodies possibly present in said tissue or said biological fluid; and b) the in vitro detection of the immune complexes possibly formed.
  • the kit of the invention for the in vitro diagnosis of malaria comprises the following elements: a) - at least one of the elements chosen from the group consisting of: polynucleotides, polypeptides, and conjugates such as defined above; b) reagents for constituting a medium suitable for a bonding reaction between a sample to be tested and at least one of the elements defined in (a); and c) reagents for the detection of antigen-antibody complexes produced by said binding reaction, these reagents may also carry a label or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent.
  • the kit of the invention comprises the following elements:
  • reagents for the constitution of a medium suitable for a binding reaction between a test sample and at least one of said antibodies; and - reagents for the detection of antigen-antibody complexes produced by said binding reaction these reagents can also carry a marker or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent.
  • One of the major advantages of the present invention is that it provides new polynucleotide and polypeptide molecules specific for the preerythrocytic stages of malaria.
  • the polynucleotide and polypeptide molecules of the invention have several remarkable properties. In particular, they generate cellular responses to a high rate of interferon- ⁇ .
  • the results obtained also suggest that the polynucleotide and polypeptide molecules of the invention have the capacity to induce specific cell recruitment at the intrahepatic level.
  • the invention also provides effective malaria vaccines and methods for sensitive diagnosis of malaria.
  • Figures 1A, 1B, 1C and 1D show the list of nucleotide (SEQ ID NOs: 1 and 2) and amino acid sequences (SEQ ID NOs: 3 and 4) of DG747 and DG772.
  • Figure 1E shows degenerate repeated sequences characteristic of the clone DG747 (SEQ ID NOs: 5-8).
  • Figure 2A shows the sequence of the gene encoding DG747 (SEQ ID NO: 1
  • Plasmodium falciparum (Gene PfB00155). Gray (
  • Figure 2B shows the sequence of the gene encoding DG772 (SEQ ID NO: 1
  • Figures 3.1 (a) and 3.1 (b) are schematic representations of the proteins corresponding to DG747 (a) and DG772 (b).
  • the full arrows indicate the location of the primers used for the study of the conservation of the fragments.
  • the empty arrows indicate the primers used in the RT-PCR reaction.
  • the dotted part represents the supposed transmembrane and non-transcribed regions.
  • Figures 3.2A, 3.2B, 3.2C and 3.2D show IFATs of the sporozoite and blood stages of P. falciparum and the sporozoites of P. yoelii with anti-DG747 or anti-DG772 antibodies.
  • Fig. 3.2A, Fig. 3.2B sporozoite of P. falciparum (A) or P. yoelii (B) labeled with anti-747 or anti-772;
  • Fig. 3.2C, Fig. 3.2D asynchronous blood stage marked with anti-747 (C) or anti-772 (D); a, t, s: ring, trophozoite or schizont forms, respectively.
  • Figures 3.3 (a) and 3.3 (b) show Western blots of P. falciparum, P. yoelii and P. berghei using anti-His 6 -747 (a) and anti-His 6 -772 (b) antibodies .
  • Line 1 P. falciparum sporozoites
  • Line 2 P. falciparum blood stage ring shapes
  • Line 3 P. falciparum blood stage schizont forms
  • Line 4 asynchronous culture supernatant
  • Line 5 Human red blood cells
  • Line 6 P. yoelii sporozoites
  • Line 7 P. yoelii blood stage
  • Line 8 P. berghei blood stage
  • 9 Red blood cells of mice.
  • Figures 3.4 (a), 3.4 (b) and 3.4 (c) show in the form of photographs the DNA PCR results of 12 different strains with specific primers of DG747 3.4 (a) and DG772 3.4 (b).
  • the control, 3.4 (c) is a constituent gene, the PCNA [Kilbey, 1993 # 519].
  • the DNAs used come from the strains: NF54, B1, F32, D7, D25, D28, D41, D50, D51, H1, L1, Mad20, T9.96, PA (wells 1 to 14, from left to right). Well 15 does not contain DNA.
  • the size of the PCR product, corresponding to that expected is indicated next to the arrows.
  • Figures 3.5 (a) and 3.5 (b) graphically illustrate the prevalence of humoral responses against His 6 -747 (a) and His 6 -772 (b) in two age groups and in two areas d different endemic.
  • Figures 3.6 (a) and 3.6 (b) graphically illustrate the cellular responses against His 6 -747 and His 6 -772 in humans and chimpanzees immunized with irradiated sporozoites.
  • Fig. 3.6a Detection by Elispot of the secretion of IFN- ⁇ from cells from humans immunized with irradiated sporozoites; Fig.
  • 3.6b cellular responses of chimpanzees immunized by irradiated sporozoites, detected by stimulation of proliferation of T lymphocytes and secretion of IFN- ⁇ (by assay and Elispots).
  • IS Stimulation index
  • Ul International Units
  • LC Leukocytes (mononuclear cells of peripheral blood). His 6 " 729, PC-pGEX: Recombinants belonging to the LSA3 protein; pGEX: GST protein.
  • the threshold values are indicated by a horizontal line on the graph.
  • Figures 3.7 (a) and 3.7 (b) illustrate with graphs the distribution of IgG isotypes in the humoral responses against His 6 -747 and His 6 -772 of individuals differentially exposed to malaria.
  • ISS Volunteers immunized with irradiated sporozoites; SHI: Hyperimmune serum; Transfusion: Serum of people who contracted malaria by transfusion of infected blood. The response rates detected in ELISA are represented in relation to the total IgG levels obtained. The standard deviation is shown on the graph.
  • Figures 3.8 (a) and 3.8 (b) graphically illustrate the humoral responses of mice immunized with four formulations of recombinant proteins.
  • Fig. 3.8a anti-747 responses
  • Fig. 3.8b anti-772 responses
  • SB with the adjuvant SBS2A
  • micro recombinant adsorbed on microparticles
  • IFA Freund's incomplete adjuvant
  • Vi In the form of DNA in the vector VR1020 in PBS.
  • the originality of the present invention relates to the discovery of new polynucleotide and polypeptide molecules specific to the pre-erythrocytic stage of malaria and to their uses as active principle of malaria vaccine or in methods of diagnosing the disease. .
  • the invention relates to polynucleotides having a nucleotide sequence of at least 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, or 200 consecutive nucleotides and having at least 60%, 65%, 70%, 75% preferably
  • SEQ. ID NO: 1 or NO 2 80%, 85%, 90% and more preferably at least 95%, 97% or even 100% identity with the SEQ. ID NO: 1 or NO 2.
  • Other molecules according to the invention hybridizes under high stringency conditions with the above nucleotide sequences, and more particularly with SEQs. ID NOs: 1 and / or NO 2.
  • conditions of high stringency the following method is found: a) pre-hybridization and hybridization at 68 ° C in a solution containing: 5X
  • the invention also relates to the polypeptides (and fragments thereof) which derive from the above-mentioned nucleotide sequences and preferably the polypeptides having at least 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, or 200 consecutive amino acids and at least 60%, 70%, 80%, 85% and more preferably at least 90%, 95%, 97% or even 100% homology with one of the sequences chosen from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 8, 10 and 12.
  • Other molecules according to the invention contain at least 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, or even 200 consecutive amino acids having at least 60% , 70%, 80%, 85% and more preferably at least 90%, 95%, 97% or even 100% identity with SEQ ID NOs: 3 to 8, 10 and 12.
  • a method for aligning nucleotide and peptide sequences according to the invention is advantageously the GAP program GCG TM (Genetic Computer Group) of the UNIX TM programming manual (Wisconsin Sequence Analysis Package TM), algorithm by Needieman and Wunsch.
  • the peptides according to the present invention can be prepared by any suitable method. They can in particular be obtained by chemical synthesis, but it is also possible to obtain them by biological means, in particular by using different vectors in appropriate cell cultures as will be described below.
  • the molecules of the invention can be used as they are or can be modified (chemical conjugates, fusion protein) if necessary.
  • modifications chemical or nucleotide or peptide
  • the nucleotides / peptides can cross certain biological barriers, to show better solubilization, to facilitate their incorporation in particular galenical forms such as for example liposomes or microparticles.
  • the peptides according to the present invention can be in deglycosylated or glycosylated form, if necessary.
  • a person skilled in the field of the invention will be able to obtain different polynucleotides / polypeptides and he will also be able to determine which of the polynucleotides / polypeptides obtained have those which have adequate biological activity.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of a peptide of the invention, by transformation of a cellular host using an expression vector (plasmid, cosmid, virus, etc.) comprising the DNA sequences coding for the peptides of the invention, followed by the cultivation of the cell host thus transformed, and the recovery of the peptide from the culture medium.
  • an expression vector plasmid, cosmid, virus, etc.
  • the invention therefore therefore also relates to any vector (cloning and / or expression) and any cellular host (prokaryotic or eukaryotic) transformed by such a vector, and comprising the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence coding for a peptide according to the invention.
  • the invention relates to recombinant E. Coli cells containing an insert corresponding to the polynucleotides defined by SEQ IDs NOs: 1 and 2. More preferably the E. Coli cells are those which were deposited at the CNCM on May 23, 2001 under accession numbers 1-2671 and I-2672. Briefly, these cells were obtained by transformation of a plasmid containing either an insert corresponding to the polynucleotides defined by SEQ ID NO: 1, or an insert corresponding to the polynucleotides defined by SEQ ID NO: 2. in the E. Coli Dh5 strain. Each of the plasmids was obtained from a recombinant phage ⁇ gtl 1 containing the insert. A PCR was carried out with primers flanking the insert and this amplified insert was digested with EcoR1 and subcloned into the vector pTreHis ⁇ (Invitrogen) in the EcoR sites
  • vectors for the expression of proteins and peptides in the cells of a host in particular the human, is known and will not be described in more detail. It may be advantageous to use vectors incorporating sequences capable of increasing the immunogenicity of the polynucleotides / polypeptides of the present invention, such as the CPG sequences, the GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) gene or cytokine genes .
  • CPG sequences the CPG sequences
  • GMCSF Gramulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
  • the peptides of the present invention and the polynucleotides encoding them can also be used to prepare polyclonal or monoclonal antibodies capable of binding (preferably specifically) to at least one peptide / polynucleotide object of the invention.
  • the present invention therefore also relates to such purified antibodies which can be obtained by very well known techniques such as for example the technique described by Kolher and Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262: 495 -four hundred ninety seven).
  • the immunogenic peptides / polynucleotides according to the invention is conjugated to a support on which it is absorbed or fixed covalently or non-covalently at its C end and / or N-terminal.
  • the support can consist of carrier molecules (natural or synthetic), physiologically acceptable and non-toxic. These carrier molecules can allow in particular to increase the immunogenicity of the peptides of the invention by means of complementary reactive groups carried respectively by the carrier molecule and the peptide.
  • carrier molecules include natural proteins such as tetanus toxoid, ovalbumin, serum albumin, hemocyamines, PPD (purified protein derivative) of tuberculin, etc.
  • polylysines or poly (DL-alanine) -poly (L-lysine) will be mentioned, for example.
  • hydrocarbon or lipid carriers mention will be made of saturated or unsaturated fatty acids.
  • the support can also take the form of liposomes, particles and microparticles, vesicles, microspheres of latex beads, polyphosphoglycans (PGLA), or polystyrene.
  • the invention also relates to vaccine / therapeutic (drug) compositions comprising peptides / polynucleotides, conjugates and / or polyclonal or monoclonal antibodies as described above, and an acceptable pharmaceutical carrier.
  • the invention also relates to immunogenic compositions capable of inducing protection by a challenge infection by Plasmodiums, both in vivo and in vitro and, preferably, protection by a challenge infection by Plasmodium falciparum.
  • compositions according to the invention allow the production of interferon- ⁇ by leukocytes from subjects immunized by irradiated sporozoites and / or the obtaining of an IgG humoral response of the lgG1, lgG2, lgG3 and / or lgG4 type.
  • compositions may be advantageous for the purpose of being administered in vivo for the treatment or prevention of malaria in humans.
  • use of antibody-based compositions generally requires that these be compatible with administration to humans. They may in particular be antibodies humanized by known techniques or directly expressed in situ from the DNA sequence, for example the technique described in Ren EC, Cellular and Molecular approaches to developping human monoclonal antibodies as drugs (1991 ), Ann. Acad. Med. Singapore, 20: 66-70.
  • the compositions according to the present invention can be in any solid or liquid form customary for pharmaceutical administration, that is to say for example forms of liquid administration, in gel, or any other support allowing for example the controlled release.
  • injectable compositions more particularly intended for injections into the blood circulation in humans.
  • compositions of the invention may also contain components increasing or capable of increasing the immunogenicity of the peptides, in particular other immunogenic peptides, specific or non-specific immunity adjuvants such as alum, QS21, the adjuvant de Freund, the adjuvant SBA 2 , montanide, polysaccharides or equivalent compounds.
  • specific or non-specific immunity adjuvants such as alum, QS21, the adjuvant de Freund, the adjuvant SBA 2 , montanide, polysaccharides or equivalent compounds.
  • the present invention further relates to compositions for administration in order to express in situ the peptides described above.
  • compositions for administration in order to express in situ the peptides described above.
  • this injection leads, in a certain number of cases, to the expression of the coded peptide and to an immune response against said peptide.
  • naked DNA systems but comprising their own expression system or expression vectors as described above.
  • Expression vectors are capable, in certain cases, of improving the activity of the expressed peptides.
  • Vaccination systems using DNA sequences are known and are already widely described in the literature.
  • the invention also relates to methods of in vitro diagnosis of malaria in an individual susceptible to infection by Plasmodium falciparum.
  • the method comprises the following steps: a) bringing into contact, under conditions allowing an immunological reaction, a tissue or a biological fluid taken from a individual likely to be infected with Plasmodium falciparum with an antibody as described above in order to allow the formation of immune complexes; and b) in vitro detection of the immune complexes formed.
  • the diagnostic method comprises the following steps: a) bringing into contact, under conditions allowing an immunological reaction, a tissue or a biological fluid taken from an individual capable of be infected with Plasmodium falciparum with polynucleotide / polypeptide molecules as described above in order to allow the formation of immune complexes involving at least one of said molecules and antibodies possibly present in said tissue or said biological fluid; and b) the in vitro detection of the immune complexes possibly formed.
  • kits for the diagnosis of malaria in an individual.
  • the kit comprises the following elements: a) at least one of the elements chosen from the group consisting of: polynucleotide molecules; polypeptide molecules and conjugates as described above; b) reagents for constituting a medium suitable for a bonding reaction between a test sample and at least one of the molecules defined in (a); and c) reagents for the detection of antigen-antibody complexes produced by said binding reaction, these reagents may also carry a label or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent.
  • the kit comprises the following elements: - antibodies as described above;
  • these reagents can also carry a marker or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent
  • a marker or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent
  • the present invention also covers immunogenic polymers comprising between two and ten peptides chosen from the polypeptides defined above.
  • the present invention includes oligonucleotides having a nucleotide sequence coding for oligonucleotides incorporating one or more polynucleotides as defined above.
  • Malaria is a disease caused by the infection of protozoan parasites belonging to the apicomplexes of the Plasmodium species and transmitted by females of mosquitoes of the genus Anopheles.
  • the sustained efforts and the eradication program started in the 1950s, funded by WHO, allowed to limit the areas where the disease spread and to reduce the number of infected people. Since then, the decline in the effectiveness of the means of combating the parasite has caused an increase in malaria cases compared to 20 years ago.
  • Today malaria remains concentrated in the subtropical belt where between 300 and 500 million clinical cases are recorded annually, of which at least 3 million succumb mainly due to infection by P. falciparum.
  • POMS Following the appearance and extension of global resistance to effective drugs only, and because the regions affected are expanding, POMS has classified, since 1998, malaria among the three infectious diseases of major interest for the global public health on a par with tuberculosis and AIDS.
  • Natural immunity against malaria is characterized by very slow development and the fact that it does not lead to sterilizing protection.
  • the acquisition of natural immunity against erythrocytic stages is manifested in children first by tolerance to the parasite (anti-toxic immunity) then with age by a reduction in the parasitic load in the blood (anti-parasitic immunity).
  • the hepatic stage has unique characteristics.
  • the hepatocyte is a very active metabolically nucleated cell and expresses molecules of the major histocompatibility complex.
  • Hepatic schizogony leads to the formation of between 10,000 and 30,000 merozoites while 4 to 32 merozoites are released by a blood schizont.
  • Merozoites from these two stages have morphological differences, but it is not known whether there are functional or molecular differences, since only blood merozoites have been extensively studied.
  • stage-specific antigens The first strategy for establishing stage-specific expression is the generation of complementary DNA libraries from messenger RNAs of the different stages. This has been done several times in the blood stages (Chakrabarti et al., 1994; Watanabe et al., 2001) and more recently once in the sporozoite stage (Fidock et al., 2000). However, this approach is not possible for the hepatic stage of human parasites. Another way is the generation of specific antibodies in animal models. This is easy in the erythrocytic stages but for the hepatic stage, several attempts have failed, since injections of hepatic stages of P. falciparum have produced very little antibody in the mice.
  • a final approach is immunological screening based on the use of antibodies from naturally immunized individuals. This approach made it possible to demonstrate for the first time that other antigens than CS were present on the surface of the sporozoite (Galey et al., 1990).
  • LSA-1 Liver Stage Antigen 1
  • SALSA and LSA-3 antigens were selected based on various criteria and characterized at the molecular level (Bottius et al., 1996; Daubersies et al., 2000; Fidock et al., 1994a), and immunologically by L. Benmohammed, K. Brahimi, JP Sauzet and B. Perlaza. (BenMohamed et al., 1997; Perlaza et al., 1998; Sauzet et al., 2001). These antigens are expressed both on the surface of the sporozoite and in the hepatic stage.
  • LSA3 is the only antigen recognized differentially by sera from volunteers or chimpanzees protected by immunization with irradiated sporozoites. It is the only one to have induced long-term sterilizing protection in chimpanzees (Daubersies et al., 2000), and will soon be tested in phase I and II clinical trials.
  • DH5 ⁇ supE ⁇ A ⁇ / acU 169 ( ⁇ 580 / acZ ⁇ M15) hsdRIT recAl gyrAQ ⁇ thi- ⁇ 1 relAl.
  • NF54 from an isolate from a European patient infected in Africa (ATCC MRA151) (Walliker et al., 1987).
  • 3D7 the reference strain used in the genome project, is a clone derived from the strain (ATCC MRA151) (Walliker et al., 1987).
  • the sporozoites are from the NF54 strain and obtained by passage through Anopheles Gambiae REF 2.1.3. PCR from phage extracts or phage DNA
  • the Expand High Fidelity Kit TM (Mannheim Boehringer, Germany) was used as indicated by the supplier with 2 mM of MgCI 2 ⁇ 3.5 units of Taq polymerase, 0.2 mM of deoxyribonucleotides (dNTP), 50 nM of 21 D primers in 5 '( CCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGG; SEQ ID NO: 13) and 26D in 3 '(GGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGG; SEQ ID NO: 14) and 2 ⁇ l of purified DNA or phage extract.
  • dNTP deoxyribonucleotides
  • the reaction involved an initial denaturation of 2 minutes at 94 ° C, followed by 35 consecutive cycles of 15 seconds of denaturation at 94 ° C, 30 seconds of hybridization at 50 ° C, and 2 minutes of elongation at 68 ° C .
  • the cyclic circuit was followed by an incubation at 68 ° C for 5 minutes.
  • PCR products having a smear or a very small yield and being of smaller size almost impossible to detect by digesting the DNA of the corresponding phage were cloned through a vector allowing direct cloning of the PCR product without successive digestion of a restriction enzyme using the TopoTA Cloning TM kit (Invitrogen, The Netherlands). Topo cloning was also carried out for the fragments whose sequence we only wanted to determine.
  • PCR products smaller than 1 Kbp were digested, precipitated with ethanol, and resuspended in half of the initial volume of H 2 ⁇ , then digested with 10 U of the restriction enzyme EcoR1, for 1 hour at 37 ° C, drawn on a 2% agarose gel, purified on gel by the gel extraction kit procedure
  • PCRs were performed on an Appligene Crocodile III TM. The products were then analyzed on agarose gel.
  • the PCR positive colonies were inoculated in 3 ml of medium containing the antibiotic corresponding to the vector used (100 ⁇ g / ml ampicillin for Topo and Histidine, 20 ⁇ g / ml kanamycin for the Vical vector) and 2 ml of inoculum were used in the preparation of plasmid DNA with the Qiagen TM Miniprep Kit.
  • the DNA obtained was successively digested with the restriction enzymes used in the cloning and subjected to electrophoresis on an agarose gel, in order to detect the insertion of the fragment.
  • the DNA of the constructs was purified from 2 l of culture of recombinant bacteria, by Qiagen EndoFree Plasmid. Giga TM kit (Qiagen, Germany).
  • the phages were re-amplified on LB agarose dishes, by depositing 5 ⁇ l on Topagar taken with 200 ⁇ l of Y1090 inoculum, and leaving at 37 ° C. overnight.
  • a patch pricked on the dish was incubated with 200 ⁇ l of Y1090 inoculum, left at 37 ° C. with shaking for 15 minutes. Then, 5 ml of medium without antibiotic supplemented with 10 mM of MgSO 4 was added, and the culture left in agitation for 4 hours, until the appearance of lysis. 50 ⁇ l of Chloroform was added, and the whole centrifuged at 7000 g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant released from cell debris was recovered.
  • This stock was used in the production of 500 ml of phage in liquid culture: the equivalent of 7.5 ⁇ 10 8 pfu (units forming plaques) was added to 500 ⁇ l of cells from a culture inoculated on the night of Y1090, and 500 ⁇ l of 10 mM MgC / CaC. Everything was incubated at 37 ° C for 15 minutes, and added to 500 ml of LB medium without antibiotic. The lysis of bacteria observed by the appearance of filaments in the culture was followed until total lysis (4-5 h). Then, the culture was centrifuged at 6000 g for 15 minutes at 4 ° C, the supernatant collected, and stored at 4 ° C overnight.
  • RT-PCR was carried out with the RT-PCR kit from Qiagen (Germany). Primers specific for each gene and located, if possible, in such a way that a distinction can be made between the products derived from amplification of genomic DNA and RNA (around the introns) were used.
  • a first reverse transcription reaction was carried out at 50 ° C. for 30 minutes, then a PCR reaction was carried out, under the same conditions as that described for a parasite DNA PCR with the selected primers, sometimes followed by a second reaction (nested PCR) with primers located in the sequence of the first amplified PCR product.
  • the hybridization temperature varies depending on the primers used (between 50 and 60 ° C).
  • the cell suspension was subjected to sonications of 10 shocks of 1 minute each, and the supernatant containing the recombinant proteins was recovered by centrifugation at 10,000 g for 10 minutes, and filtered at 0.22 ⁇ m.
  • an affinity purification step on a Nickel column was carried out.
  • a 1 ml column (HiTrap TM, Pharmacia, Sweden) was washed as directed by the supplier and 1 ml of NiCI 2 was applied, followed by further washes. Then, the column was washed with 5 ml TU, and the supernatant applied to the column.
  • Optimal conditions were determined with 100 ⁇ l of antigen solution with a concentration of 10, 5 or 1 ⁇ g / ml coated on the plates in 50 mM Carbonate pH 9.6 or 1X PBS pH 7.4 by incubating the plates overnight at 4 ° C. Saturation was carried out, either in PBS supplemented with 3% skim milk, or 1% BSA (calf serum albumin) at room temperature or at 37 ° C for 2 hours. Dilution of sera 100 or 200 times was carried out either with 1.5% PBS / milk or with 1% PBS / BSA, and the incubation was carried out at room temperature or at 37 ° C for 1 h .
  • BSA calf serum albumin
  • variable acrylamide percentage gels (BioRad TM 29.1: 1 ratio) (5, 7.5, 10 or 12%) were used. After migration in Tris / glycine buffer (pH 8.5) with the minigel kit (Biorad, USA) the gels were either stained with Coomassie blue or subjected to transfer onto nitrocellulose filters (0.45 ⁇ m), in the Trans-Blot cell TM (BioRad.)
  • the proteins were visualized by staining with 0.2% Ponceau red in a solution of acetic acid (5%), then the filter was saturated with TBS / 5% skimmed milk for 30 minutes. Immunopurified human antibodies without dilution, and sera diluted 1/100 or 1/200 in TBS / 5% milk / 0.05% Tween TM were incubated for 1 to 2 hours at room temperature. Then, the filter was washed 3 times 10 minutes in 0.05% TBS / Tween TM, and incubated with the antisera coupled with alkaline phosphatase diluted 1/5000, for 30 minutes. After washing in the same buffer, the colored reactions were produced by the addition of NBT (330 ⁇ g / ml) and BCIP (165 ⁇ g / ml) (Promega, Germany) diluted in Tris pH 9 buffer.
  • NBT 330 ⁇ g / ml
  • BCIP 165 ⁇ g / ml
  • the blood smears were fixed for 10 minutes with acetone, and boxes for each sample to be tested were delimited by drawing edges with a Pentel-red marker on the smear.
  • the rest of the technique was identical for the three stages: After fixation, the antibodies to be tested (diluted in PBS) were deposited on each well, cup or cell, and the slide incubated at 37 ° C. in a humid chamber for 1 hour.
  • the slides were washed 3 times 10 minutes in 1 ⁇ PBS, then incubated with an anti-human or mouse anti-IgG IgG (depending on the specific antibodies used), coupled to fluorescein (Alexis) diluted 1/200 in PBS and Evans blue 1/50000, incubated for 30 minutes at 37 ° C in a humid chamber, washed three times in PBS 1X, and covered with a coverslip after a drop of buffer glycerin (PBS 30% glycerol) has been deposited.
  • the slide was read under a microscope at UN (Olympus TM BH2))
  • Protocols a, b and c were mainly applied to obtain specific sera, while protocols b, c and d were used to carry out challenge infections with P. yoelii.
  • 6-week-old female BALB / c mice received a first intraperitoneal injection of 500 ⁇ l, with 1 mixture of 20 ⁇ g of antigen (His 6 -249, His ⁇ - 680, His 6 -747. His 6 -772) , 2 mg / ml Alum (AI (OH) 3 , and incomplete Freund's Adjuvant (AIF), volume in volume, supplemented with 0.9% ⁇ aCI
  • the next 2 injections, each 15 days apart were performed with the same amount of antigen in the same volume, but without AIF, and with methiolate, a preservative, at 0.05%.
  • mice were removed (500 ⁇ l) before the immunization 2 weeks, 1 month and 6 weeks after the first immunization, on EDTA and the plasma recovered and stored at -20 ° C.
  • 6-week-old female BALB / c mice received 3 subcutaneous injections every 15 days at the base of the tail of a mixture consisting of 100 ⁇ l of complete Freund's adjuvant and 10 ⁇ g of antigen (His 6 -114 or His 6 - 662) in 100 ⁇ l of PBS. 1 week after the third injection, the sera of the mice were collected and the responses tested in ELISAs against the recombinant and in IFI on the sporozoites. 18 days after the last injection, the mice underwent challenge infection with P. yoelii sporozoites. c) SBAS 2 (Smith and Klein Beecham adjuvant)
  • mice received three subcutaneous injections at the base of the tail of 100 ⁇ l of a mixture consisting of 57 ⁇ l of adjuvant mixed with 43 ⁇ l of antigen (His 6 -249, His 6 - 747 or His 6 -772) corresponding to 10 ⁇ g, the injections being spaced 3 weeks apart. 10 days after the last immunization, the mice were collected and the corresponding sera collected.
  • mice received three subcutaneous injections at the base of the tail of 100 ⁇ l of a mixture consisting of microbial coatings with the antigen corresponding to 10 ⁇ g, the injections being spaced 3 weeks apart. 10 days after the last immunization, the mice were collected and the corresponding sera collected.
  • 6-week BALB / c and C3H mice were injected 3 times 8 weeks apart intramuscularly with 100 ⁇ l of antigen (pNAK114, pNAK249, pNAK438, pNAK571, pNAK747, pNAK772) in PBS pH 7.4, then a 4th time 12 weeks after the 3rd injection.
  • Blood samples were taken 1 week after the 3rd and 4th immunization on EDTA, and the sera collected after incubation of the sample overnight at 4 ° C.
  • mice Spleens from 3 mice / group were removed after the 4th immunization, and the stimulation of the cellular responses studied. After the fifth boost, 8 weeks after the 4 th injection, the mice underwent challenge infection with P. yoelii sporozoites. 2.2.6. Infection of tests with sporozoites and by blood stage
  • the sporozoites from Anopheles stephensii mosquitoes infected with clone 1.1 of P. yoelii yoelii were obtained by a method (Ozaki et al., 1984) which consists in isolating the rib cage of the mosquito and obtaining it by centrifugation at through glass wool sporozoites, which were washed by successive resuspensions in PBS after centrifugation.
  • mice were infected with P. yoelii sporozoites retro-orbitally with 150 to 200 sporozoites (200 ⁇ l / injection), and the parasitaemia followed by smears from day 3 following infection until the 12th day post- infection, both in immunized animals and in naive mice infected with the same batch of sporozoites.
  • mice The spleens were removed from the mice, the splenocyte suspensions were washed twice in RPMI 1640 TM (Gibco, France) and the cells resuspended at a final concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml in RPMI supplemented with 100 U / ml penicillin, 2 mM L-glutamine, 10 mM Hepes, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol, 1.5% fetal calf serum (FCS) and 0.5% normal mouse serum. 100 ⁇ l / well of each suspension was distributed in 96-well round bottom plates (Costar, USA) and the recombinant proteins to be tested were added at a concentration of 50 mg / ml.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were harvested in an automatic cell harvester (Skatron Inc., Sterling, VA, USA), and the incorporation of Thymidine 3 H quantified by scintillation. The results are expressed in Stimulation Index (SI) and proliferation was considered positive, when the Sl is above 2.
  • SI Stimulation Index
  • the IFN- ⁇ titers in the culture supernatants were determined by a double capture ELISA method. Maxisorp TM plates (Nunc, Denmark) with flat bottom were coated with a primary mouse anti-IFN- ⁇ rat monoclonal antibody (R4-6A2) (Pharmingen, San Diego, CA) diluted in 0.1 M buffer. carbonate, pH 9.6, and left overnight at 4 ° C. Between each step of the procedure, the plates were washed several times with PBS buffer supplemented with 0.05% Tween TM (PBS-T). Next, the plates were saturated with 3% calf serum albumin (BSA, Sigma Chemicals, St Louis, USA) in PBS-T.
  • R4-6A2 primary mouse anti-IFN- ⁇ rat monoclonal antibody
  • the number of IFN- ⁇ secreting cells was determined in unstimulated splenocytes 40 hours after they were freshly isolated and incubated with the antigens.
  • Microtiter plates (Multiscreen-HA TM, sterile plate, Millipore) were coated with 50 ⁇ l of a solution containing 5 ⁇ g / ml of anti-IFN- ⁇ antibody (18181D TM, Becton Dickinson Co). After one overnight incubation at 4 ° C, the wells were washed and saturated with a solution of 5% FCS. Cell suspensions of 5 ⁇ 10 5 cells / well were incubated with the antigen at 50 ⁇ g / ml in a total volume of 200 ⁇ l for 40 h, at 37 ° C.
  • spots were detected by development of a colored reaction with the BCIP / NBT reagents at 50 ⁇ g / ml at the place where individual cells secreted IFN- ⁇ .
  • the results are expressed as the number of spot-forming cells relative to the 5 x 10 6 splenocytes.
  • Ndiop is located in an endemic area with around 20 infectious bites / year
  • Dielmo in an area with around 150 infectious bites / year.
  • Each serum in one of the two regions corresponds in age and sex to a serum in the other region.
  • Two chimpanzees were immunized either with sporozoites irradiated at 18 kRad, or at 30 kRad by 4 injections of 5 x 10 6 sporozoites each by route intravéneuse. The first 3 immunizations were performed 1 month apart, while the 4 th was performed 4 months after the 3 rd . Their serum and peripheral blood cells were studied in cellular and humoral response tests after 3 immunizations. Both animals were infected by intravenous injection of 4 x 10 4 sporozoites (low dose) each of P. falciparum and only the chimpanzee immunized with sporozoites irradiated at 18 kRad was protected (did not develop blood parasitaemia ).
  • Clones DG 747 and DG772 were selected not only because of the initial criteria set (detection on sporozoites and the hepatic stage, as well as recognition by hyperimmune sera), but because several additional characteristics interested us: DG747 had no cross-reactivity with other PM library proteins, and DG772 had only one cross-reactivity, with LSA1, the only antigen identified as expressed only in the hepatic stage of P. falciparum. In addition, antibodies specific to the two proteins labeled P. yoelii sporozoites. Initial sequencing revealed that these two clones contained inserts belonging to previously unknown genes, but whose sequence was available on the P. falciparum genome databases.
  • DG747 codes for a polypeptide of 59 amino acids of which the 40 amino acids (aa) C-terminals are part of a repeating structure of 5 x 8 aa rich in arginine and in lysine.
  • This sequence is identical to aa 81-140 of the PfB0155c gene (1524 bp, 508 aa) located on chromosome 2 ( Figure 3.1a).
  • This gene which codes for a putative protein (Gardner et al., 1999), contains neither introns, nor predicted signal peptides, nor regions homologous to other proteins, whether Plasmodium or other organisms.
  • the corresponding protein has a theoretical molecular mass of 59 kDa, and a neutral isoelectric point (7.5), but certain regions have very variable pi, for example the region found in DG747 has a positive charge at neutral pH.
  • DG772 contains an insert of 333 bp, which are translated into 111 aa contained in an open reading frame.
  • This polypeptide corresponds to the region of aa 1146-1256 of a protein of 1493 amino acids encoded by a gene located on chromosome 1 ( Figure 3.1b).
  • the theoretical mass of the protein is 173 kDa and the isoelectric point is 5.05.
  • Protein consists mainly of acids polar amines and does not contain hydrophobic sites, except in the N-terminal part, where there could be a GPI anchor site.
  • the gene does not contain repeats and the translated nucleotide sequence has a strong homology with proteins of the “EBP” family (Adams et al., 1992), that is to say with 5 ′ cys and 3 ′ regions. cys which are characteristic of this family.
  • the surface of the sporozoites of P. falciparum was marked by antibodies (human or mouse) specific for DG747 and DG772, but the erythrocytic stages were marked differently for the two groups of antibodies.
  • the anti-His 6 -747 (anti-747) antibodies scarcely mark the young stages, but strongly the mature schizont stages, with localized labeling around the knob structures ( Figure 3.2 image A), while the anti-HiS 6 antibodies - 772 (anti-772) mark the parasite more evenly throughout the erythrocyte stage.
  • the surface of the sporozoites was strongly marked by the antibodies specific for the two antigens.
  • yoelii detected a 70 kDa polypeptide for anti-747 in sporozoites and blood stages and a 60 kDa polypeptide for anti-772, only detected in P. yoelii sporozoites .
  • Anti-772 serum labeled all sporozoites, while only 7 out of 10 of the isolates tested were labeled with anti-747.
  • PCR amplifications with specific primers for the two gene fragments indicated in FIGS.
  • the anti-772 response increases like the anti-747 according to age, but with a much less significant increase, compared to the rate of transmission observed between Ndiop and Dielmo and compared to age.
  • the rate of anti-772 responses measured in% of prevalence and intensity is higher for young people than that of anti-747 responses, but lower (75%) than anti-747 (85%) at Dielmo in immune individuals.
  • Lymphocyte proliferation is at the limit of the threshold value, while the secretion rates of IFN- ⁇ are high, both for the quantity of cytokine detected and for the number of secretory cells (detected by Elispot). This applies both to animals that are effectively immunized and those that are not protected. However, it appears that response rates are higher for animals immunized with irradiated sporozoites of 30 kRad. The responses induced by 747 are stronger than those induced by 772, and both stronger than those induced by LSA3.
  • cytophilic isotype lgG1 the level of which is much higher in the serum of immune individuals (SHl) than in the serum obtained from the patient infected by transfusion or from ISS volunteers.
  • SHl serum of immune individuals
  • the responses of these last two groups are quite similar and do not show any imbalance between cytophilic antibodies (lgG1 and lgG3) and non-cytophilic (lgG2 and lgG4).
  • PM permanent prophylaxis
  • mice of two different strains were immunized with the recombinants in the form of proteins, with different adjuvants or in the form of “naked” DNA constructs, without adjuvant.
  • mice immunized with pNAK747 there are both stimulation of proliferation and secretion of IFN- ⁇ , while that for pNAK772, the proliferation of T cells was very little stimulated compared to the stimulation of secretion of IFN- ⁇ which is considerable.
  • the highest level of IFN- ⁇ secretions is observed when the level of stimulation of proliferation is the lowest.
  • the anti-747 responses have a similar profile for all the immunized mice and all the formulations used, with an isotypic response predominantly lgG2b.
  • the anti-772 responses are also similar between mice and vaccine formulations, but with a clear predominance of lgG1.
  • the isotypic profile therefore depends on the immunogen more than on the mode of presentation used.
  • the endpoint titers are much higher when immunized with recombinant proteins (1 / 200,000) compared to DNA (1/2000), and the titers of sera from mice immunized with HiS 6 - 772 are higher than those of His 6 -747.
  • RT-PCR By RT-PCR on the total RNA from sporozoites and blood parasites, the inventors were able to determine the splicing sites of the messenger RNA corresponding to the coding gene.
  • the primer sequence was extracted from the Plasmodium falciparum genome data.
  • Amplification products are identical in size; sporozoite stages and blood stages, and differ in size from the product obtained by amplification of genomic DNA and by sequencing the splice sites were found to be identical (see the introns shown in the figure).
  • the gene encoding DG772 belongs to a family of proteins identified by a shared motif. All the proteins of the EBR (Erythrocyte Binding Proteins) family share conserved motifs of cysteine residues whose arrangement is similar for all the proteins. However, the degree of identity does not exceed 31% (max. 57% homology), even in the most conserved regions.
  • mice From our results obtained in mice, we can confirm that the antigens DG747 and DG772 used both in the form of DNA and in the form of recombinant protein are immunogenic. In addition, the fact that the recombinant proteins are recognized by individuals immunized and protected against infection by sporozoites of Plasmodium falciparum indicates a role for these antigens in pre-erythrocytic immunity. A test in primates, and in particular in chimpanzees, will make it easy to choose the optimal formulation for clinical trials in humans.
  • Hybridization by Southern blot under standard stringent conditions 0.1 ⁇ SSC, 60 ° C. would not give rise to any other hybridization except with the corresponding gene.
  • the parameters used are the default parameters found on the http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ sites.
  • the absence observed may be due to a real deletion of the gene or to experimental procedures.
  • one of the primers used for the detection of the coding part for DG747 overlaps the repeating part, which can cause a difficulty in amplifying a gene containing a greater repetition, or in detecting a gene containing less repetitions.
  • this is also the case for detection in indirect immunofluorescence where a possible number of repetition variations can change the affinity of the specific antibodies, if the target epitope overlaps this region.
  • the expression detected by IFI seems to be present throughout the asexual parasite cycle in the host vertebrate (we did not analyze the sexual stages).
  • Despite the presence of repeats in DG747 we did not detect cross-reactivity with other P. falciparum antigens.
  • the entire gene sequence has no homology with other plasmodial proteins so far identified, and we have no information yet on a possible biological function.
  • DG772 does not contain repeats and its presence seems to be constant, whether detected by PCR or by IFI.
  • the gene coding for DG772 turns out to be interesting.
  • this gene of 5300 bp of open reading frame belongs to the family of EBP (Erythrocyte Binding Protein) (Adams et al., 1992), but that the sequence of DG772 does not belong to conserved regions of this family, it only shares a small part of sequences with the N-terminal end of the 3'cys region. Moreover, it has no cross-reactivities nor sequence homology with DG249, another clone belonging to one of the consensus parts of the gene coding for EBA-175.
  • DG772 is part of a region which confers a particularity on each molecule of this family.
  • EBP family EBA-175 and 772
  • the antigens in gray are the antigens characterized in this application.
  • MSP-1 The presence at the pre-erythrocytic stages of other antigens (MSP-1) has also been suggested, but the preliminary results remain to be confirmed.
  • the underlined references indicate the year of discovery of the pre-erythrocytic expression.
  • S sporozoite
  • H Young and mature liver stage
  • SSA Young and mature asexual blood stage
  • SSS sexual blood stage.
  • ST sub-telomeric. The bold characters indicate the shape of the stage where the marking is most intense.
  • Table 3.1b Stimulation of cell proliferation and secretion of IFN- ⁇ by His 6 -772 after 3 immunizations with pNAK772.
  • Table 4.1 Cellular responses of mice after 5 immunizations with pNAK438 *.
  • the response rates are represented in relation to the responses obtained by a threshold value.
  • the threshold value is calculated by averaging the responses of non-immunized animals and that of animals immunized against a non-relevant antigen, such as OspC, a protein from Borrelia burgdorfe.
  • the spasmozoites of Plasmodium falciparum come from the strain NF54.
  • T23 strain of Thai origin; NF54 strain of African origin.
  • Table 5.1 Cross-reactivities detected in Western blots between members of the Pf11-1 family
  • E immunopurified antibodies (eluted) on the corresponding recombinant proteins.
  • P recombinant protein.

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux antigènes de <i>Plasmodium falciparum</i> et à leurs applications vaccinales et diagnostiques. Plus particulièrement, la présente invention vise des molécules polynucléotidiques et polypeptidiques immunogéniques, des compositions les comprenant, et des méthodes de diagnostic et de vaccination du paludisme (malaria).

Description

ANTIGÈNES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET
LEURS APPLICATIONS VACCINALES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION a) Domaine de l'invention
La présente invention se rapporte à de nouveaux antigènes de
Plasmodium falciparum et à leurs applications vaccinales et diagnostiques. Plus particulièrement, la présente invention vise des molécules polynucléotidiques et polypeptidiques immunogéniques, des compositions les comprenant, et des méthodes de diagnostic et de vaccination du paludisme.
b) Brève description de l'art antérieur
Le paludisme est une maladie provoquée par l'infection de parasites protozoaires appartenant aux apicomplexes de l'espèce Plasmodium et transmis par les femelles des moustiques du genre Anophèles. Malgré le fait que l'OMS a classé, depuis 1998, le paludisme parmi les trois maladies infectieuses d'intérêt majeur pour la santé publique mondiale au même rang que la tuberculose et le SIDA, il n'existe pas encore de vaccin efficace contre cette maladie. Des études précédentes ont conduit à la mise en évidence de polypeptides antigéniques du stade pré-érythrocytaire de la maladie, notamment les polypeptides SALSA (pour Sporozoïte Liver Stage Antigen) décrits dans EP A- 0407230, le LSA 1 (pour Liver Stage Antigen) décrit dans W0 92/13884 et LSA-3 décrit dans FR 2,735,478.
La présente invention est relative à de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques des stades pré-érythrocytaires et à leurs utilisations à titre de principe actif de vaccin anti-palustre ou dans des méthodes de diagnostics de la maladie.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION La Demanderesse a identifié une série de 120 fragments d'ADN génomique codant pour des protéines exprimées aux stades pré-érythrocytaires, c'est-à-dire au stade sporozoïte et/ou au stade hépatique. La caractérisation initiale de cette série de clones a conduit à identifier l'antigène LSA-1 , puis SALSA, puis STARP, puis LSA-3. Des travaux plus récents portant sur 10 fragments de la même banque de clones codant pour des stades pré- érythrocytaires a permis de fournir des précisions concernant 8 d'entre eux, 3 se sont avérés être des gènes déjà connus comme étant exprimés au stade érythrocytaire et les 5 autres comme des gènes nouveaux non décrits à ce jour, et dont l'expression aux stades pré-érythrocytaires a pu être confirmée.
Par ailleurs, les travaux réalisés en utilisant les cellules de volontaires protégés par sporozoïtes irradiés, celles de chimpanzés protégés par la même méthode et celles de chimpanzés comme d'Aotus trivirgatus, protégés par immunisation par l'antigène LSA-3 ont conduit à caractériser les réponses cellulaires à fort taux de sécrétion d'interfëron-γ, généralement associés avec une faible production d'anticorps, comme étant associées avec l'état de protection, et vice-versa. Parmi les nouveaux gènes pré-érythrocytaires étudiés, deux d'entre eux, dénommés DG747 et DG772 possèdent plusieurs propriétés remarquables: ils génèrent des réponses cellulaires à taux élevé d'Interféron-γ, détectées par ELISPOT chez des volontaires protégés par sporozoïtes irradiés, qui sont retrouvés également pour plusieurs régions de l'antigène LSA-3 mais qui sont absentes pour 4 régions de l'antigène LSA-1 , deux de SALSA, deux de STARP et deux de la "CircumSporozoïte protein". Ces deux mêmes clones sont positifs également dans les mêmes tests chez les chimpanzés protégés par des sporozoïtes irradiés. Le profil de réponse différentielle entre les chimpanzés protégés et celles de chimpanzés ayant reçu des sporozoïtes irradiés à trop forte dose, et non protégés, est identique à celui enregistré avec la molécule LSA-3 qui est capable d'induire une protection. Ce profil de réponse correspond, d'après les travaux réalisés chez le rongeur, à la capacité d'induire un recrutement cellulaire spécifique au niveau intra-hépatique. La séquence complète des deux gènes a été identifiée. Les protéines correspondantes ont une antigénicité élevée chez les individus exposés au parasite en zone d'endémie (réaction chez 80% des adultes de zone d'endémie). Leur localisation en surface du sporozoïte et leur production au cours de la maturation intra-hépatique du parasite a été confirmée par diverses méthodes biologiques. Leur immunogénicité chez l'animal sous forme de protéines recombinantes, ou sous forme de plasmides (immunisation génétique) a été démontrée.
Plus particulièrement, un des aspects de la présente invention concerne un polynucléotide isolé ou purifié comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 60%, préférablement au moins 80% et plus préférablement au moins 95% d'identité avec la SEQ ID NO: 1 (DG747) ou la SEQ ID NO: 2 (DG772).
Un autre aspect de la présente invention concerne un polynucléotide isolé ou purifié comprenant au moins 10 nucléotides consécutifs identiques à la SEQ ID NO: 1 ou la SEQ ID NO: 2. L'invention vise également les polynucléotides isolés ou purifiés qui s'hybrident dans des conditions de fortes stringences avec un polynucléotide tel que défini précédemment.
Un autre des aspects de la présente invention concerne un polypeptide isolé ou purifié qui est codé par un polynucléotide tel que défini précédemment. Dans un mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention présente au moins 60%, préférablement au moins 80% et plus préférablement au moins 95% d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772). Selon un autre mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention comprend au moins 5 acides aminés consécutifs identiques à l'une des SEQ ID NOs: 3 à 8. Encore dans un autre mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention présente au moins 40%, préférablement au moins 60%, plus préférablement au moins 80% et encore plus préférablement au moins 95% d'identité avec l'une des SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et 12. L'invention couvre également les polypeptides recombinants ou chimériques comprenant au moins un polypeptide tel que défini précédemment.
Un autre des aspects de la présente invention concerne un antigène isolé ou purifié consistant en un polynucléotide ou en un polypeptide tels que définis précédemment.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un conjugué antigenique constitué d'un polynucléotide et/ou d'un polypeptide tels que définis précédemment; et d'un support sur lequel lesdits polynucléotides/polypeptides sont adsorbés. Un tel conjugué peut avantageusement être utilisé pour l'immunisation d'individus infectés ou susceptibles d'être infectés par le paludisme.
Un autre des aspects de la présente invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, préférablement humanisés, reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides, polypeptides et/ou conjugués définis précédemment. Un aspect connexe de la présente invention concerne les compositions pharmaceutiques qui comprennent à titre de substance active un ou plusieurs de ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un vecteur de clonage ou d'expression (tel que les plasmides, les cosmides et les phages) comprenant une séquence polynucléόtidique selon la présente invention. L'invention couvre également les cellules hôtes comprenant un tel vecteur, et tout particulièrement les cellules E.Coli recombinantes déposées à la C.N.C.M. le 23 Mai 2001 sous les numéros d'accession 1-2671 et I-2672.
Un autre des aspects de la présente invention concerne une composition immunogène comprenant des polynucléotides, des polypeptides et/ou des conjugués tels définis précédemment; et un véhicule pharmaceutique acceptable.
Un autre aspect connexe de la présente invention concerne un vaccin anti- palustre comprenant des polynucléotides, des polypeptides et/ou des conjugués tels définis précédemment; et un véhicule pharmaceutique acceptable. Préférablement, les compositions et vaccins de la présente invention sont utilisées pour la fabrication de médicaments destinés à la prévention et/ou au traitement du paludisme. Selon un autre aspect, la présente invention concerne des méthodes et des kits (trousses) de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum. Selon un mode de réalisation privilégié, la méthode comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps tels que définis précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés. Selon un autre mode de réalisation privilégié, la méthode de diagnostic comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec des polynucléotides, des polypeptides, et/ou des tels que définis précédemment, afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins un desdits éléments et des anticorps éventuellement présents dans ledit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés. Selon un mode de réalisation privilégié, le kit de l'invention pour le diagnostic in vitro du paludisme comprend les éléments suivants: a)- au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les polynucléotides, les polypeptides, et les conjugués tels que définis précédemment; b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins une des éléments définis en (a); et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. Selon un autre mode de réalisation privilégié, le kit de l'invention comprend les éléments suivants :
- des anticorps tels que définis précédemment;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. Un des avantages majeur de la présente invention est qu'elle fournit de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques des stades pré-érythrocytaires du paludisme. Les molécules polynucléotidiques et polypeptidiques de l'invention possèdent plusieurs propriétés remarquables. Ils génèrent notamment des réponses cellulaires à taux élevé d'interféron-γ. Les résultats obtenus suggèrent également que les molécules polynucléotidiques et polypeptidiques de l'invention ont la capacité d'induire un recrutement cellulaire spécifique au niveau intra-hépatique. L'invention fournit également des vaccins anti-palustre efficaces et des méthodes de diagnostics sensibles du paludisme.
De nombreux autre objectifs et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative de l'invention qui suit.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les Figures 1A, 1B, 1C et 1D montre la liste des séquences nucléotidiques (SEQ ID NOs: 1 et 2) et en acides aminé (SEQ ID NOs: 3 et 4) de DG747 et DG772.
La Figure 1E montre des séquences répétées dégénérés caractéristiques du clone DG747 (SEQ ID NOs: 5-8).
La Figure 2A montre la séquence du gène codant pour DG747 (SEQ ID
NOs:9 et 10) extrait de la base des données génome de clone 3D7 de
Plasmodium falciparum (Gène PfB00155). En gris (|ïl), 'a séquence correspondant au clone DG747. La différence avec la séquence issue de la souche T9.96 (positions 344, 357) est montrée en gras dans la séquence.
La Figure 2B montre la séquence du gène codant pour DG772 (SEQ ID
NOs:9 et 10) extrait de la base des données génome de clone 3D7 de
Plasmodium falciparum. En gris (f|), la séquence correspondant au clone DG772.
La différence avec la séquence issue de la souche T9.96 (position 3612) est montrée en gras dans la séquence.
Les Figures 3.1 (a) et 3.1 (b) sont des représentations schématiques des protéines correspondantes au DG747 (a) et DG772 (b). Les flèches pleines indiquent la localisation des amorces utilisées pour l'étude de la conservation des fragments. Les flèches vides indiquent les amorces utilisées dans la réaction RT- PCR. 3.1 (a): la partie hachurée indique la région répétitive. 3.1(b): les deux régions consensus 5' cys et 3' cys sont indiquées sur le gène. La partie en pointillés représente les régions transmembranaires et non-transcrites supposées.
Les Figures 3.2A, 3.2B, 3.2C et 3.2D montrent des IFATs des stades sporozoïtes et sanguins de P. falciparum et des sporozoïtes de P. yoelii avec les anticorps anti-DG747 ou anti-DG772. Fig. 3.2A, Fig. 3.2B: sporozoïte de P. falciparum (A) ou P. yoelii (B) marqué au anti-747 ou anti-772; Fig. 3.2C, Fig. 3.2D: stade sanguin asynchrone marqué au anti-747 (C) ou au anti-772 (D); a, t, s: formes anneaux, trophozoïtes ou schizontes, respectivement.
Les Figures 3.3(a) et 3.3(b) montrent des Western blots de P. falciparum, P. yoelii et de P. berghei utilisant des anticorps anti-His6-747 (a) et anti-His6-772 (b). Ligne 1 : P. falciparum sporozoïtes; Ligne 2: P. falciparum stade sanguin formes anneaux; Ligne 3: P. falciparum stade sanguin formes schizontes; Ligne 4: surnageant de culture asynchrone; Ligne 5: Globules rouges humains; Ligne 6: P. yoelii sporozoïtes; Ligne 7: P. yoelii stade sanguin; Ligne 8: P. berghei stade sanguin; 9: Globules rouges de souris. Les Figures 3.4(a), 3.4(b) et 3.4(c) montrent sous forme de photographies des résultats de PCR d'ADN de 12 souches différentes avec des amorces spécifiques de DG747 3.4(a) et DG772 3.4(b). Le contrôle, 3.4(c), est un gène constitutif, le PCNA [Kilbey, 1993 #519]. Les ADN utilisés sont issus des souches : NF54, B1 , F32, D7, D25, D28, D41 , D50, D51 , H1 , L1 , Mad20, T9.96, PA (puits 1 à 14, de gauche à droite). Le puits 15 ne contient pas d'ADN. La taille du produit PCR, correspondant à celle attendue est indiquée à côté des flèches.
Les Figures 3.5(a) et 3.5(b) illustrent à l'aide de graphiques la prévalence des réponses humorales contre His6-747 (a) et His6-772 (b) dans deux groupes d'âge et dans deux zones d'endémie différente. Les Figures 3.6(a) et 3.6(b) illustrent à l'aide de graphiques les réponses cellulaires contre His6-747 et His6-772 chez des humains et des chimpanzés immunisés avec des sporozoïtes irradiés. Fig. 3.6a: Détection par Elispot de la sécrétion d'IFN-γ de cellules provenant d'humains immunisés par des sporozoïtes irradiés; Fig. 3.6b: réponses cellulaires des chimpanzés immunisés par des sporozoïtes irradiés, détectés par stimulation de prolifération de lymphocytes T et sécrétion d'IFN-γ (par dosage et Elispots). I.S.: Index de stimulation; Ul: Unités Internationales; LC: Leucocytes (cellules mononuclées du sang périphérique). His6 "729, PC-pGEX: Recombinants appartenant à la protéine LSA3; pGEX: protéine GST. Les valeurs seuils sont indiquées par une droite horizontale sur le graphe.
Les Figures 3.7(a) et 3.7(b) illustrent à l'aide de graphiques la distribution des isotypes d'IgG dans les réponses humorales contre His6-747 et His6-772 d'individus exposés différentiellement au paludisme. ISS: Volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradiés; SHI: Sérum hyper-immun; Transfusion: Sérum de personnes ayant contracté un paludisme par transfusion de sang infecté. Les taux de réponses détectés en ELISA sont représentés par rapport aux taux d'IgG total obtenus. L'écart type est indiqué sur le graphique.
Les Figures 3.8(a) et 3.8(b) illustre à l'aide de graphiques les réponses humorales de souris immunisées avec quatre formulations de protéines recombinantes. Fig. 3.8a: réponses anti-747; Fig. 3.8b: réponses anti-772; SB: avec l'adjuvant SBS2A; micro: recombinant adsorbé sur des microparticules; IFA: Adjuvant incomplet de Freund; Vi: Sous forme d'ADN dans le vecteur VR1020 en PBS.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur la mise en évidence de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques du stade pré-érythrocytaire du paludisme et à leurs utilisations à titre de principe actif de vaccin anti-palustre ou dans des méthodes de diagnostique de la maladie.
Plus particulièrement, l'invention vise des polynucléotides ayant une séquence nucléotidique d'au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou 200 nucléotides consécutifs et ayant au moins 60%, 65%, 70%, 75% préférablement
80%, 85%, 90% et plus préférablement au moins 95%, 97% ou même 100% d'identité avec la SEQ. ID NO: 1 ou NO 2. D'autres molécules selon l'invention s'hybride dans des conditions de fortes stringences avec les séquences nucléotidiques ci-dessus, et plus particulièrement avec les SEQ. ID NOs: 1 et/ou NO 2. À titre d'exemple non-limitatif de conditions de fortes stringences l'on retrouve la méthode suivante: a) pré-hybridation et hybridation à 68°C dans une solution contenant: 5X
SSPE (1X SSPE = 0.18 M NaCI, 10 mM NaH2P04); 5X solution de Denhardt; 0.05% (w/v) dodecyl sulfate de sodium (SDS); et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon; b) deux lavages à température ambiante pendant 10 min en présence de 2X SSPE et de 0.1% SDS; c) un lavage à 60°C pendant 15 min en présence de 1X SSPE et 0.1% SDS; et d) un lavage à 60°C pendant 15 min en présence de 0.1X SSPE et 0.1% SDS. L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui dérivent des séquences nucléotidiques ci-dessus mentionnés et préférablement les polypeptides ayant au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou 200 acides aminés consécutifs et au moins 60%, 70%, 80%, 85% et plus préférablement au moins 90%, 95%, 97% ou même 100% d'homologie avec l'une des séquences choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et 12. D'autres molécules selon l'invention contiennent au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou même 200 acides aminés consécutifs présentant au moins 60%, 70%, 80%, 85% et plus préférablement au moins 90%, 95%, 97% ou même 100% d'identité avec les SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et 12. II est bien connu dans le domaine comment déterminer les pourcentages d'homologie et d'identité entre différentes séquences. À titre d'exemple, une méthode d'analyse d'alignement de séquences nucléotidiques et peptidiques selon l'invention est avantageusement le programme GAP GCG™ (Genetic Computer Group) du manuel de programmation UNIX™ (Wisconsin Séquence Analysis Package™), algorithme de Needieman et Wunsch. Les paramètres utilisés sont les paramètres par défaut ou les paramètres suivants: pour une comparaison de séquences de nucléotides: "gap penalty" = 50; "gap extension penalty": 3; et pour une comparaison de séquences d'acides aminés: "gap penalty" = 5; "gap extension penalty": 0.30.
Les peptides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après.
Les molécules de l'invention peuvent être utilisées telles quelles ou être modifiées (conjugués chimiques, protéine de fusion) si nécessaire. Par exemple, on peut envisager des modifications (chimiques ou nucléotidiques ou peptidiques) permettant aux nucléotides/peptides de franchir certaines barrières biologiques, de montrer une meilleure solubilisation, de faciliter leur incorporation dans des formes galéniques particulières comme par exemple des liposomes ou des microparticules. H convient d'ailleurs de remarquer à ce propos que les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivi de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture.
L'invention concerne donc également tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Plus particulièrement, l'invention vise les cellules E. Coli recombinante contenant un insert correspondant aux polynucléotides définis par les SEQ ID NOs: 1 et 2. Plus préférablement les cellules E. Coli sont celles qui ont été déposée à la C.N.C.M. le 23 Mai 2001 sous les numéros d'accession 1-2671 et I-2672. Brièvement, ces cellules ont été obtenues par transformation d'un plasmide contenant soit un insert correspondant aux polynucléotides définis par la SEQ ID NO: 1 , soit un insert correspondant aux polynucléotides définis par la SEQ ID NO:2. dans la souche E. Coli Dh5 . Chacun des plasmides a été obtenus à partir d'un phage λgtl 1 recombinant contenant l'insert. Une PCR à été effectuée avec des amorces flanquantes à l'insert et cet insert amplifié a été digéré avec EcoR1 et sous-cloné dans le vecteur pTreHisβ (Invitrogen) dans les sites de EcoR
L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est connue et ne sera pas décrite plus en détail. Il peut être avantageux d'utiliser des vecteurs incorporant des séquences capables d'augmenter l'immunogénicité des polynucléotides/polypeptides de la présente invention, telles que les séquences CPG, le gène du GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) ou des gènes des cytokines. Les constructions spécifiques dépendent évidemment de l'hôte, de l'épitope et du vecteur retenu.
Les peptides de la présente invention et les polynucléotides les codant peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonal ou monoclonal capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un peptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-497).
Dans un mode de réalisation privilégié de l'invention, au moins une portion des peptides immunogéniques/polynucléotides selon l'invention est conjuguée à un support sur lequel elle est absorbée ou fixée de façon covalente ou non- covalente à son extrémité C et/ou N-terminale. Le support peut être constitué de molécules porteuses (naturelles ou synthétiques), physiologiquement acceptables et non toxiques. Ces molécules porteuses peuvent permettre notamment d'augmenter Pimmunogénicité des peptides de l'invention par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portés par la molécule porteuse et le peptide. À titre d'exemple de molécules porteuses, on mentionnera des protéines naturelles telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalbumine, des sérums albumines, des hémocyamines, le PPD (purified protein derivative) de la tuberculine, etc. À titre de supports macromoléculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L- alanine)-poly(L-lysine). À titre de supports hydrocarbonés' ou lipidiques, on mentionnera les acides gras saturés ou insaturés. Le support peut également prendre la forme de liposomes, de particules et microparticules, de vésicules, de microsphères de billes de latex, de polyphosphoglycans (PGLA), ou de polystyrène.
L'invention porte aussi sur des compositions vaccinales/thérapeutiques (médicament) comprenant des peptides/polynucléotides, des conjugués et/ou des anticorps polyclonaux ou monoclonaux tel que décrits précédemment, et un véhicule pharmaceutique acceptable. L'invention se rapporte aussi à des compositions immunogènes capables d'induire une protection par une infection d'épreuve par Plasmodiums, aussi bien in vivo que in vitro et, de façon préférée, un protection par une infection d'épreuve par Plasmodium falciparum. Préférablement, les compositions selon l'invention permettent la production d'interféron-γ par des leucocytes de sujets immunisés par des sporozoïtes irradiés et/ou l'obtention d'une réponse humorale IgG de type lgG1 , lgG2, lgG3 et/ou lgG4.
Ces compositions peuvent être avantageuses dans le but d'être administrés in vivo pour le traitement ou la prévention du paludisme chez l'humain. Bien entendu, l'utilisation de compositions à base d'anticorps nécessite généralement que ceux-ci soient compatibles avec l'administration à l'être humain. Il peut notamment s'agir d'anticorps humanisés par des techniques connues ou directement exprimés in situ à partir de la séquence d'ADN comme par exemple la technique décrite dans Ren EC, Cellular and Molecular approaches to developping human monoclonal antibodies as drugs (1991), Ann. Acad. Med. Singapore, 20:66-70. Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée. Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez l'humain.
Les compositions de l'invention peuvent comporter également des composants augmentant ou susceptible d'augmenter l'immunogénicité des peptides, notamment d'autres peptides immunogènes, des adjuvants d'immunité spécifiques ou non tels que l'alun, le QS21 , l'adjuvant de Freund, l'adjuvant SBA2, la montanide, des polysaccharides ou des composés équivalents.
La présente invention concerne de plus des compositions destinées à être administrées afin d'exprimer in situ les peptides décrits précédemment. Par exemple, en injectant I' "ADN nu" codant pour les peptides immunogéniques de l'invention, cette injection conduit, dans un certain nombre de cas, à l'expression du peptide codée et à une réponse immunitaire contre ledit peptide. On pourra également utiliser des systèmes d'ADN nu mais comportant leur propre système d'expression ou des vecteurs d'expression tel que décrit précédemment. Les vecteurs d'expression sont susceptibles, dans certains cas, d'améliorer l'activité des peptides exprimés. Les systèmes de vaccination mettant en œuvre des séquences d'ADN sont connus et sont déjà largement décrits dans la littérature.
Des exemples de vaccination mettant en œuvre des séquences d'ADN sont décrits dans la demande internationale WO 95/111307 et dans la publication de Bot et al. (DNA immunization of newborn mice with a plasmid expressing . nucleoprotein of Influenza virus (1996), Viral Immunol., 9:207-210).
L'invention porte aussi sur des méthodes de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum. Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode comprend les étapes suivantes: a) mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps tel que décrit précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés. Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode diagnostique comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec des molécules polynucléotidiques/polypeptidiques telles que décrites précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins une desdites molécules et des anticorps éventuellement présents dans ledit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés. L'invention a aussi pour objet des kits (trousses) pour le diagnostique du paludisme chez un individu. Selon un mode de réalisation de l'invention, le kit comprend les éléments suivants: a) au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les molécules polynucléotidiques; les molécules polypeptidiques et les conjugués tels que décrits précédemment; b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins une des molécules définies en (a); et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit comprend les éléments suivants: - des anticorps tels que décrits précédemment;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué Bien qu'à travers le mémoire descriptif de la présente invention on utilise le terme "peptide" et "polypeptide", il est entendu que l'invention ne se limite pas aux composés formés par l'union d'un nombre limité d'acides aminés. En effet, la souplesse des technologies recombinantes permet de réaliser des protéines comportant une pluralité d'épitopes identiques ou différents et susceptibles d'améliorer l'activité immunogenique du produit final. Ainsi la présente invention couvre également les polymères immunogéniques comprenant entre deux et dix peptides choisis parmi les polypeptides définis précédemment. De même, la présente invention inclus les oligonucléotides ayant une séquence nucléotidique codant pour des oligonucléotides incorporant un ou plusieurs polynucléotides tels que définis précédemment.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue d'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectués sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puissent utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
1) INTRODUCTION
1.1 Historique du paludisme
Le paludisme est une maladie provoquée par l'infection de parasites protozoaires appartenant aux apicomplexes de l'espèce Plasmodium et transmis par les femelles des moustiques du genre Anophèles. Les efforts soutenus et le programme d'éradication entamé dans les années 50, financé par l'OMS ont permis de limiter les zones où la maladie se propageait et de diminuer le nombre de personnes infectées. Depuis, la baisse d'efficacité des moyens de lutte contre le parasite a provoqué une augmentation des cas de paludisme par rapport à il y a 20 ans. Aujourd'hui le paludisme demeure concentré dans la ceinture sub- tropicale où entre 300 et 500 millions de cas cliniques sont recensés annuellement, dont au minimum 3 millions succombent en majorité à cause de l'infection par le P. falciparum. Suite à l'apparition et à l'extension d'une résistance globale aux seuls médicaments efficaces, et parce que les régions affectées sont en extension, POMS a classé, depuis 1998, le paludisme parmi les trois maladies infectieuses d'intérêt majeur pour la santé publique mondiale au même rang que la tuberculose et le SIDA.
La description de l'infection paludéenne, dont les signes cliniques sont très caractéristiques, peut être retrouvée dans des écrits des civilisations les plus anciennes, tels que le Nei Ching, grand répertoire médical pour l'empereur chinois Huang Ti (2700 av. J. C), des tablettes Mésopotamiennes (2000 av. J. C), des papyrus Égyptiens (1500 av. J. C.) et des écrits Védiques (1500-800 av. J. C). Une partie du « livre des épidémies » d'Hippocrate (460-370 av. J. C.) a été consacrée à la description détaillée de fièvres tertiaires ou quaternaires où est mentionnée aussi une relation entre des splénomégalies et la proximité des zones marécageuses. D'ailleurs, le terme paludisme désigne une fièvre issue des zones marécageuses (L. palude = marécage), ce qui est aussi reflété par le terme de malaria (I. maU'aria) probablement introduit par Sansovino en 1560 pour décrire le « mauvais air » issu des marécages. Le drainage de ces zones a été un des seuls moyens de contrôle du paludisme connu avant la découverte de l'agent infectieux. Malgré la connaissance des signes cliniques, le parasite causant la maladie n'a été découvert qu'à la fin du 19e siècle.
En 1880 Charles Louis Alphonse Laveran a observé l'exflagellation de microgamètes et des hématies altérées dans le sang de (Laveran, 1880), et il a associé ces formes avec la maladie. Ses conclusions ont été controversées et ne furent acceptées par d'autres, en particulier par l'importante école italienne, que 5 ans plus tard. Le mode de transmission de la maladie est resté inconnu encore 12 ans. Patrick Manson avait en 1877 démontré que le nématode de la filariose (Elephantiasis) était transmis par un moustique. Il était convaincu que le paludisme suivait un parcours semblable. II a conseillé à Ronald Ross d'entamer des recherches à ce sujet et ce dernier a décrit en 1897, pour la première fois, des oocystes chez des moustiques ayant été nourris sur des humains infectés. Puis, à l'aide de Plasmodium d'oiseaux, il a pu décrire le cycle entier du parasite chez le moustique. Ce cycle a été confirmé, en 1898, pour les espèces plasmodiales de l'homme par les chercheurs italiens menés par Battista Grassi.
On a longtemps cru qu'après inoculation par le moustique, le sporozoïte envahissait directement le globule rouge du mammifère hôte, initiant ainsi le cycle sanguin asexué et sexué. Un cycle exo-érythrocytaire fut décrit dès 1908 chez des plasmodies d'oiseaux par H. de Beaupaire Aragao qui démontra le développement de formes atypiques, dans des cellules endothéliales et des macrophages, capables de libérer des formes envahissant les globules rouges et de se transformer en formes typiques pigmentées du parasite. Toutefois on a cru que le cycle tissulaire était une forme particulière de ces espèces plasmodiales. Ce n'est qu'en raison des observations faites au cours d'infections paludéennes induites et suivies étroitement chez des individus (comme la malariothérapie des années 1920-50) que la présence d'un stade supplémentaire tissulaire a été postulée puis activement recherchée. Les formes pré-érythrocytaires des parasites de primates et d'humains n'ont été découvertes qu'en 1948 lorsque H.E. Shortt et P. C. C. Garnham ont décrit des formes hépatiques issues d'inoculations de sporozoïtes de P. cynomolgi (proche de P. vivax) chez le singe rhésus (Shortt and Garnham, 1948). En 1951 , les mêmes stades ont été décrits pour P. falciparum (Shortt et al., 1951) dans une expérience remarquable où une biopsie de foie a été prélevé chez un volontaire préalablement inoculé avec des millions de sporozoïtes. Toutefois les recrudescences dues à P. vivax ou à P. ovale n'étaient pas expliquées, et on a émis l'hypothèse d'un cycle exo- érythrocytaire « secondaire ». Ce n'est que beaucoup plus tard que ce phénomène fut démontré expérimentalement. Ainsi, un stade « dormant » de la forme hépatique, l'hypnozoïte, a été décrit en 1980 (Krotoski et al., 1980) pour P. cynomolgi, l'équivalent pour le primate de P. vivax. Cette forme est responsable des rechutes après une longue période d'absence de parasite dans le sang/d'exposition aux parasites, qui sont caractéristiques de P. vivax et P.ovale. Récemment, un stade supplémentaire, le mérophore, une forme provenant des formes sanguines, a été observé dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris infectées par les Plasmodium murins (P. yoelii, P. chabaudi et P. vinckeî) (Landau et al., 1999). Cette étape du cycle reste encore à être décrite dans les espèces plasmodiales humaines.
Le cycle du parasite, comme il est conçu aujourd'hui est représenté dans la figure 1 (Les parties entre parenthèse sont des formes décrites pour d'autres espèces de Plasmodium, mais pas pour P. falciparum).
1.2 Les moyens de lutte contre l'extension du paludisme : nécessité du développement d'un vaccin
Les deux découvertes de l'agent causal de la maladie et du vecteur de la maladie ont permis dès le début du 20e siècle d'élaborer des moyens de défense rationnels contre le paludisme en attaquant le parasite chez l'hôte vertébré par des médicaments ou en ciblant le moustique vecteur soit avec des larvicides, soit avec des insecticides, soit par l'utilisation de moustiquaires. Le succès de l'élimination de la maladie dans les zones tempérées après la 2e e guerre mondiale, a mené vers une mise en place d'un programme d'éradication du paludisme qui a culminé dans les années 60 où le DDT a été le principal outil contre les moustiques et la chloroquine a été la principale drogue contre le parasite. La taille des territoires endémiques ciblés a ainsi été réduite (quasi éradication dans les zones tempérées) et le nombre de personnes affectées par la maladie a initialement diminué. Cependant les succès dans les zones tropicales furent de courte durée. Le nombre de malades n'a pas cessé de croître d'une part à cause de l'augmentation démographique, d'autre part en raison de l'apparition de résistances aux insecticides et aux drogues disponibles.
L'apparition de ces résistances a nécessité de s'orienter vers d'autres moyens de lutte. L'existence d'une immunité naturelle induite par l'exposition aux parasites et l'observation que le transfert passif d'immunoglobulines de personnes immunes diminue la parasitémie ainsi que l'immunisation efficace et stérilisante par des sporozoïtes atténués par irradiation ont rendu raisonnable l'argument d'un vaccin contre le paludisme, dont le développement constitue alors une priorité de santé publique au niveau mondial.
1.3 A la recherche de l'immunité salvatrice L'immunité naturelle contre le paludisme est caractérisée par un développement très lent et le fait qu'elle n'aboutit pas à une protection stérilisante. Dans les zones hyperendémiques, l'acquisition de l'immunité naturelle contre les stades érythrocytaires se manifeste chez les enfants d'abord par une tolérance au parasite (immunité anti-toxique) puis avec l'âge par une diminution de la charge parasitaire dans le sang (immunité anti-parasitaire).
Ces observations, faites au cours des études épidémiologiques ont été confirmées par des infections expérimentales. La malarariothérapie appliquée aux personnes atteintes de neurosyphilis (Boyd and Coggeshall, 1938; Ciuca et al., 1943; James, 1936), a permis de définir des paramètres qui interviennent dans l'acquisition de l'immunité dans des expériences étroitement contrôlées. Il a ainsi été montré que l'immunité acquise était d'une part dépendante de l'espèce et de la souche et d'autre part différait en fonction du stade du cycle parasitaire infectant. Jusqu'à présent, les mécanismes précis de l'immunité anti-paludéenne restent à élucider. Du fait que les signes cliniques et la transmission sont uniquement dus aux stades sanguins et que ceux-ci sont les plus accessibles aussi bien in vitro qu'/t? vivo, la plupart des études vaccinales ont concerné ces stades. Une trentaine d'antigènes exprimés dans les parasites érythrocytaires ont été identifiés, particulièrement par des anticorps monoclonaux et considérés en tant que candidats vaccins. Toutefois les essais d'induction d'immunité protectrice par les rares antigènes testés chez l'homme sont demeurés infructueux jusqu'à présent.
La première immunisation avec les stades pré-érythrocytaires a été tentée sans succès par les frères Sergent en Algérie (Sergent and Sergent, 1910). La capacité de protéger de façon stérilisante (absence de toute parasitémie sanguine) n'a été obtenue que par l'immunisation avec des sporozoïtes atténués par irradiation. Cette approche fut initiée par des études chez l'oiseau avec des sporozoïtes irradiés par des rayons UN. (Mulligan et al., 1941), et a été reprise 20 ans plus tard avec des plasmodies de rongeur en utilisant des sporozoïtes irradiés par des rayons X et plus tard des rayons γ, dont la dose peut être contrôlée plus facilement (Νussenzweig et al., 1967; Richards, 1966) ; l'immunité peut être maintenue par un rappel de sporozoïtes non-atténués (Orjih et al., 1982). Chez l'homme, une telle protection a aussi été obtenue (Clyde, 1975; McCarthy and Clyde, 1977), toutefois elle n'est induite qu'après un très grand nombre d'inoculations par des sporozoïtes irradiés si bien qu'une telle procédure vaccinale ne peut être appliquée à grande échelle. Pendant longtemps, on a cru que la protection était corrélée avec un phénomène observé lorsque l'on incube les sporozoïtes avec du sérum immun, la CS (Circum sporozoïte) précipitation (Vanderberg et al., 1969). La protéine majoritaire reconnue par ce sérum, la protéine CS, a donc été considérée responsable de cette immunité. Depuis elle a été à l'origine de multiples études vaccinales dans beaucoup de modèles expérimentaux. Or jusqu'à présent aucune de ces études n'a pu reproduire une immunité aussi solide qμe celle induite par des sporozoïtes irradiés.
Une évaluation critique des résultats expérimentaux précédents a mené à postuler que c'était le stade hépatique et non le sporozoïte qui était à l'origine de immunité stérilisante (Druilhe and Marchand, 1989). L'indice principal était le fait que la protection ne pouvait être induite que par l'inoculation des sporozoïtes viables, par voie intraveineuse, capables d'envahir un hépatocyte et de s'y développer, et que les formes hépatiques issues de sporozoïtes irradiés persistaient (Ramsey et al., 1982). De plus, une élimination des stades hépatiques provoquait une susceptibilité aux infections par des sporozoïtes chez des animaux préalablement protégés (Londono et al., 1991 ; Scheller and Azad, 1995).
Le stade hépatique possède des caractéristiques uniques. L'hépatocyte est une cellule nucléée métaboliquement très active et exprime des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité. La schizogonie hépatique entraîne la formation d'entre 10.000 et 30.000 mérozoïtes alors que 4 à 32 mérozoïtes sont libérés par un schizonte sanguin. Les mérozoïtes issus de ces deux stades ont des différences morphologiques, mais on ne sait pas s'il existe des différences fonctionnelles ou moléculaires, car seuls les mérozoïtes sanguins ont pu être extensivement étudiés.
Du fait que dans le foie, seuls quelques hépatocytes sont infectés et qu'/'n vitro, les techniques de culture restent délicates et difficiles, ceci a constitué un obstacle majeur au développement des connaissances sur le stade hépatique et à la recherche d'antigènes exprimés à ce stade.
1.4 Criblage d'antigènes spécifiques de stade La première stratégie pour établir l'expression spécifique de stade est la génération de banques d'ADN complémentaires à partir d'ARN messagers des différents stades. Ceci a été accompli plusieurs fois aux stades sanguins (Chakrabarti et al., 1994; Watanabe et al., 2001) et plus récemment une fois au stade sporozoïte (Fidock et al., 2000). Cependant, cette approche n'est pas possible pour le stade hépatique des plasmodies humains. Un autre moyen est la génération d'anticorps spécifiques dans des modèles animaux. Ceci est facile aux stades érythrocytaires mais pour le stade hépatique, plusieurs tentatives ont échoués, car les injections de stades hépatiques de P. falciparum n'ont induit que très peu d'anticorps dans les souris. Une dernière approche est le criblage immunologique basé sur l'utilisation d'anticorps d'individus naturellement immunisés. Cette approche a permis de mettre en évidence pour la premjère fois que d'autres antigènes que la CS étaient présents à la surface du sporozoïte (Galey et al., 1990).
1.5 Stratégie élaborée dans le laboratoire d'identification d'antigènes exprimés aux stades pré-érythrocytaires
Afin de contourner la difficulté de criblage aux stades pré-érythrocytaires, une stratégie de criblage d'antigènes de P. falciparum potentiellement exprimés dans les stades sporozoïte et hépatique a été développée (Marchand and Druilhe, 1990).
Le principe était de chercher des individus chez lesquels la réponse immune prédominante était contre les stades pré-érythrocytaires. Nous avons ainsi obtenu des sérums d'individus (sérums PM) vivant en zone d'endémie depuis plus de 20 ans et n'ayant jamais eu d'accès cliniques car ils étaient en permanence sous traitement prophylactique à la chloroquine (schizonticide efficace contre les stades sanguins, mais sans effet sur les stades hépatiques). Les sérums correspondants ne reconnaissaient en effet que très faiblement des stades sanguins en Western Blot et en IFI (titres inférieurs à 1/200), tandis que les titres contre les stades sporozoïtes et hépatiques du parasite étaient compris entre 1/3200 et 1/6400 en IFI et ils marquaient plusieurs polypeptides sur des extraits protéiques de sporozoïtes de P. falciparum; il s'agissait donc de sérums contenant des anticorps spécifiques des antigènes exprimés aux stades pré- érythrocytaires.
Ces sérums ont été utilisés pour cribler une banque génomique de P. falciparum (construite par Odile Merçereau Puijalon). L'ADN génomique issu du clone parasitaire T9-96 a été méthylé et digéré par la Dnase 1 , et les fragments d'une taille allant de 200 à 2500 paires de bases ont été introduits dans le site EcoR1 du phage λgt11 (Guérin-Marchand et al., 1987).
Parmi les 7 millions de fragments d'ADN générés, 2000 clones produisant un antigène recombinant reconnu par des sérums hyper immuns (SHI) d'individus immuns vivant en zone d'endémie, ont ensuite été criblés avec les sérums PM. 120 clones ont ainsi été sélectionnés et l'expression de stade des antigènes correspondants a été déterminée par des tests d'IFIs, avec des anticorps humains immunopurifiés sur chaque protéine recombinante, sur les sporozoïtes, les stades hépatiques et les stades sanguins de P. falciparum, P. yoelii et parfois avec P. berghei et P. vivax. Le premier antigène à être étudié et contre lequel les réponses humorales étaient les plus élevées dans plusieurs sérums d'individus vivant dans une zone d'endémie était le Liver Stage Antigen 1 , LSA-1 (Guérin-Marchand et al., 1987). Il demeure le seul antigène caractérisé à être exprimé uniquement au stade hépatique. A la suite du LSA-1 , 3 antigènes STARP, SALSA et LSA-3 ont été sélectionnés à partir de divers critères et caractérisés au niveau moléculaire (Bottius et al., 1996; Daubersies et al., 2000; Fidock et al., 1994a), et immunologiquement par L. Benmohammed , K. Brahimi, J.P. Sauzet et B. Perlaza. (BenMohamed et al., 1997; Perlaza et al., 1998; Sauzet et al., 2001). Ces antigènes sont exprimés aussi bien à la surface du sporozoïte qu'au stade hépatique.
Le LSA3 est l'unique antigène reconnu différentiellement par des sérums de volontaires ou de chimpanzés protégés par l'immunisation avec des sporozoïtes irradiés. Il est le seul à avoir induit une protection stérilisante et de longue durée chez des chimpanzés (Daubersies et al., 2000), et sera bientôt testé dans des essais cliniques de phase I et II.
2) MATERIEL ET METHODES
2.1. Techniques de biologie moléculaire
2.11 Souches bactériennes
DH5α: supEΛA Δ/acU 169(^580 /acZΔM15) hsdRIT recAl gyrAQδ thi-\ 1 relAl .
2.1.2. Souches de parasites:
NF54 issue d'un isolât de malade européen infecté en Afrique (ATCC MRA151) (Walliker et al., 1987).
3D7, la souche référence utilisée dans le projet génome, est un clone issu de la souche (ATCC MRA151) (Walliker et al., 1987).
T9.96, une souche provenant d'un patient thaïlandais ATCC : MRA153 , (Thaithong et al., 1984)
Pour les tests de polymorphisme, des souches distinctes ont été employées: B1 (Brésil); F32, D7, D28, D50 issues de la Tanzania; D28 du Sénégal, D41 de l'Inde, D51 de Myanmar, L1 de Libéria, H1 de Honduras,
Mad20 de Papua New Guinea, et PA de Palo Alto, d'Amérique du Sud Ouest.
(Stricker et al., 2000).
Les sporozoïtes sont issues de la souche NF54 et obtenus par passage dans des Anophèles Gambiae REF 2.1.3. PCR à partir d'extraits de phages ou d'ADN de phages
Le Expand High Fidelity Kit™ (Mannheim Boehringer, Allemagne) a été utilisé comme indiqué par le fournisseur avec 2 mM de MgCI2ι 3.5 unités de Taq polymérase, 0.2 mM de desoxyribonucléotides (dNTP), 50 nM des amorces 21 D en 5' (CCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGG; SEQ ID NO : 13) et 26D en 3' (GGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGG; SEQ ID NO : 14) et 2 μl d'ADN purifié ou d'extrait de phage. La réaction a comporté une dénaturation initiale de 2 minutes à 94 °C, suivie par 35 cycles consécutifs de 15 secondes de dénaturation à 94 °C, 30 secondes d'hybridation à 50 °C, et 2 minutes d'élongation à 68 °C. Le circuit cyclique a été suivi par une incubation à 68 °C pendant 5 minutes.
2.1.3.1 Sous-clonage dans les vecteurs histidine, pNAK et Topo
Selon la qualité du produit d'amplification des phages, trois procédures ont été employées: Les produits PCR présentant un smear ou un rendement très petit et étant de plus petite taille quasi impossible à détecter en digérant l'ADN du phage correspondant, ont été clones par l'intermédiaire d'un vecteur permettant un clonage direct du produit PCR sans digestion successive d'une enzyme de restriction à l'aide du kit de TopoTA Cloning™ (Invitrogen, Les Pays-Bas). Le clonage Topo a aussi été effectué pour les fragments dont nous voulions uniquement déterminer la séquence.
Les produits PCR de tailles inférieures à 1 Kbp ont été digérés, précipités à l'éthanol, et resuspendus dans la moitié du volume initial d'H2θ, puis digérés par 10 U de l'enzyme de restriction EcoR1 , pendant 1 heure à 37 °C, tirés sur un gel d'agarose à 2 %, purifiés sur gel par la procédure de gel extraction kit de
Qiagen, donnant un volume de 50 μl.
Les produits PCR peu abondants de grande taille (supérieurs à 1000 bp) ont été isolés à partir de l'ADN de phage purifié par une digestion avec EcoR1, puis par extraction de l'insert du gel d'agarose. 2.1.3.2 Étude du polymorphisme du gène dans des souches parasitaires différentes.
Les amorces suivantes ont été utilisées pour identifier les polymorphismes en taille de régions spécifiques correspondant aux antigènes étudiés. 747-1 : AAAAGTGATGATAGAAATGCTTGTG (5') ; SEQ ID NO : 15
747-2: TTTTGTTGATCTTACTTATTTCACC (3') ; SEQ ID NO : 16 772-1 : CGGAATCAGGTTTAAATCCAAC (5') ; SEQ ID NO : 17 772-2: AGATCGTTTTTCATCAGGGGG (3') ; SEQ ID NO : 18. La réaction cyclique a été effectuée avec un programme comportant une étape initiale d'une dénaturation à 94°C pendant 15 secondes, suivie par 39 cycles comprenant une dénaturation à 94°C pendant 2 minutes, une hybridation à 52 °C pendant 1 minute et une élongation à 72°C pendant 2 minutes. Une étape de 5 minutes à 72°C a terminé la réaction.
Les PCR ont été effectuées sur un Crocodile III™ de Appligène. Les produits ont ensuite été analysés sur gel d'agarose.
2.14. Purification d'ADN
2.1.4.1 Pour les analyses de recombinants
Les colonies positives en PCR ont été inoculées dans 3 ml de milieu contenant l'antibiotique correspondant au vecteur utilisé (100 μg/ml ampicilline pour Topo et Histidine, 20 μg/ml kanamycine pour le vecteur Vical) et 2 ml d'inoculum ont été utilisés dans la préparation d'ADN plasmidique avec le Qiagen™ Miniprep Kit. L'ADN obtenu a successivement été digéré avec les enzymes de restriction utilisées dans le clonage et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose, afin de détecter l'insertion du fragment.
2.1.4.2 Pour l'isolement de fragments:
100 ml de milieu Luria Broth supplémenté en antibiotique approprié ont été inoculés avec 1 colonie de bactérie comportant le recombinant, et incubé à 37 °C sur la nuit dans un bain thermostaté en agitation vigoureuse. Le lendemain, la culture bactérienne a été récoltée et l'ADN plasmique purifié comme décrit (Qiagen maxiprep™, Qiagen, Allemagne). 2.1.4.3 Pour l'immunisation de constructions ADN nu
Afin d'éliminer les endotoxines, qui sont présents dans les bactéries et qui peuvent entraîner des réponses non spécifiques lors des immunisations de souris, l'ADN des constructions a été purifié à partir de 2 I de culture de bactéries recombinantes, par Qiagen EndoFree Plasmid Giga™ kit (Qiagen, Allemagne).
2.1.4.4 Pour la purification d'ADN de phages recombinants
Les phages ont été réamplifiés sur des boîtes d'agarose de LB, en déposant 5 μl sur du Topagar pris avec 200 μl d'inoculum de Y1090, et en laissant à 37 ° C sur la nuit.
Ensuite, une quantité plus grande a été produite en culture liquide. D'abord, une plage piquée sur la boîte a été incubée avec 200 μl d'inoculum de Y1090, laissée à 37 °C avec agitation pendant 15 minutes . Ensuite, 5 ml de milieu sans antibiotique supplémenté avec 10 mM de MgS04 a été ajouté, et la culture laissée en agitation pendant 4 heures, jusqu'à l'apparition de lyse. 50 μl de Chloroforme a été ajouté, et le tout centrifugé à 7000 g pendant 10 minutes. Après centrifugation, le surnageant libéré des débris cellulaires a été récupéré. Ce stock a été utilisé dans la production de 500 ml de phage en culture liquide : l'équivalent de 7.5 108 pfu (unités formant des plaques) à été ajouté à 500 μl de cellules d'une culture inoculée sur la nuit de Y1090, et 500 μl de 10 mM MgC /CaC . Tout a été incubé à 37 °C 15 minutes, et ajouté à 500 ml de milieu LB sans antibiotique. La lyse des bactéries observée par l'apparition de filaments dans la culture a été suivie jusqu'à la lyse totale (4-5h). Ensuite, la culture a été centrifugée à 6000 g pendant 15 minutes à 4 °C, le surnageant récupéré, et stocké à 4 °C sur la nuit.
Le lendemain, la purification de l'ADN a été entreprise avec le Lambda Maxi Kit™ (Qiagen, Allemagne) avec des ajustements en début de protocole à cause du volume plus grand de surnageant de départ. Le culot final a été resuspendu dans 500 μl de tampon TE. 2.1.4.5 À partir de parasites
100 μl de culot de culture de globules rouges à 10 % de parasitémie, a été resuspendu dans 100 μl de PBS, pH 7,2 et purifié par le Qiaamp DNA Mini Kit™ (Qiagen, Allemagne). A partir de 100 μl de culot d'une culture parasitée à 10 %, on a obtenu environ 5 μg d'ADN.
2.15. Purification d'ARN total parasitaire
Nous avons utilisé deux méthodes en fonction de la quantité d'ARN voulu. Pour des quantités importantes, la méthode décrite par (Kyes et al., 2000) a été employée, tandis que pour obtenir des préparations de quantités plus restreintes, nous avons utilisé le RNeasy kit™ (Qiagen, Allemagne.)
2.1.6. RT-PCR.
La RT-PCR a été effectuée avec le kit RT-PCR de Qiagen (Allemagne). Des amorces spécifiques pour chaque gène et situées, si possible, de telle façon que l'on puisse distinguer entre les produits issus d'amplification d'ADN génomique et d'ARN (autour des introns) ont été utilisées. Une première réaction de Transcription réverse a été effectuée à 50 ° C pendant 30 minutes, puis une réaction de PCR a été effectuée, dans les même conditions que celle décrites pour une PCR d'ADN de parasite avec les amorces sélectionnées, parfois suivi d'une deuxième réaction (nested PCR) avec des amorces situés dans la séquence du premier produit PCR amplifié. Cependant, la température d'hybridation varie en fonction des amorces utilisées (entre 50 et 60 ° C).
2.17. Purification des recombinants histidine
2 I de milieu de Luria Broth additionné avec l'ampicilline à 100 ng/ml a été inoculé avec 50 ml de culture de bactérie contenant le plasmide recombinant. La croissance des bactéries a été suivie par la mesure de la turbidité bactérienne à 600 nm et à la densité optique voulue (entre 0,5 et 1) une concentration d'IPTG variant entre 0,5 et 1 mM selon le recombinant a été ajoutée à la culture, et l'induction a duré entre 2 h et 4 h. Ensuite les cellules ont été récoltées et le culot de bactéries resuspendu dans un tampon de 20 mM de NaP04, pH 7.4, et 8 M d'urée (TU) (25 ml/litre de culture bactérienne). Ensuite, la suspension de cellules a été soumise à des sonications de 10 chocs de 1 minute chacun, et le surnageant contenant les protéines recombinantes a été récupéré par centrifugation à 10.000 g pendant 10 minutes, et filtré à 0.22 μm. Ensuite, une étape de purification par affinité sur une colonne de Nickel a été effectuée. Une colonne de 1 ml (HiTrap™, Pharmacia, Suède) a été lavée comme indiqué par le fournisseur et 1 ml de NiCI2 a été appliqué, suivi par d'autres lavages. Ensuite, la colonne a été lavée avec 5 ml de TU, et le surnageant appliqué sur la colonne. Ensuite, un lavage de 10 ml de TU a été effectué, et le recombinant élue par un gradient croissant en imidazole, compétiteur de l'histidine. Selon le recombinant purifié, des concentrations différentes ont été employées, et les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous. Ensuite, le pool de protéines a été dialyse contre un tampon L-histidine pH 6, et chromatographié sur une colonne échangeuse d'anions (HiTrap Q™, Pharmacia, Suède) afin d'éliminer une partie des Lipo Poly Saccharides (LPS) ou endoxines qui induisent des réponses non spécifiques (Morrison and Ryan, 1987).
Tableau de purification des recombinants histidine
1 : La DO mesurée à 600 nm, La concentration en IPTG (mM) ; et le temps d'induction avant récolte.
2 : Après sonication, et centrifugation d'une suspension de bactéries ne contenant pas d'urée (8M) dans le tampon, le surnageant et le culot contenant les débris de membranes bactériennes ont été testés en Western blot afin de détecter où la protéine recombinante se trouvait. En présence d'urée toutes les protéines étaient solubles, et les procédures de purification ont donc été appliquées en présence de 8 M d'urée.
3 : La concentration d'imidazole à laquelle la protéine a été éiuée sur la colonne de HïTrap-Ni™
4 : La concentration de NaCI à laquelle la protéine a été éluée sur la colonne de HiTrap-Q™ 2.2. Techniques immunoloqiques
2.2.1 ELIS As (Enzyme Linked [mmunoSprbant Assay)
Les conditions optimales ont été déterminées avec 100 μl de solution d'antigène d'une concentration de 10, 5 ou 1 μg/ml coatés sur les plaques dans 50 mM de Carbonate pH 9.6 ou 1X PBS pH 7.4 en incubant les plaques sur la nuit à 4 °C. La saturation a été effectuée, soit en PBS supplémenté par 3 % de lait écrémé, ou 1% de BSA (albumine de sérum de veau) à température ambiante ou à 37°C pendant 2 heures. La dilution de sérums de 100 ou de 200 fois a été effectuée soit avec du PBS/lait à 1.5 % , soit avec du PBS/BSÀ 1%, et l'incubation a été faite à température ambiante ou à 37°C pendant 1 h.
L'incubation avec les anticorps secondaires couplés à la HRPO (peroxidase de navet) dilués au 1/2000 dans le tampon de dilution des sérums a été effectuée à température ambiante, et les révélations ont été faites à l'aide des tampons de TMB (peroxidase substrate et peroxidase solution B) (Laboratories Kirkegaard et Perry, USA) mélangés volume à volume immédiatement avant utilisation dont 100 μl ont été distribués dans chaque puit. Les réactions colorées en bleu ont été arrêtées en ajoutant le même volume d'une solution d'1 M, d'acide phosphorique. Les réactions sont lues à 450 nm dans un lecteur Multiscan Ascent™ (Labsystems). Les résultats des souris sont exprimés en Ratio (unité arbitraire par rapport aux taux des réponses dans des témoins naïfs) et dans les expériences où les taux des isotypes ont été étudiés, par rapport au Ratio des IgG totaux déterminé dans la même expérience.
2.2.2. Immunopurification d'anticorps spécifiques
Pour l'immunopurification d'anticorps spécifiques contre les recombinants His6, une méthode décrite par (Brahimi et al., 1993) a été employée. 100 μl/puits de solution d'antigène dans du PBS, pH 7.2, à une concentration de 5 μg/ml ont été adsorbés sur plaques Nunc Maxisorp™ (Nunc, Danemark), et les plaques incubées à +4 °C la nuit. Ensuite, des sérums hyperimmuns ont été incubés à une dilution de 1/50 pendant 1 heure à température ambiante, les plaques lavées et l'élution des anticorps effectuée par ajout de glycine pH 2.5 à 0.2 M, incubation pendant 3 minutes et récupération suivie par une neutralisation du pH avec du Tris, 1M, pH 11. L'immunopurification à partir de recombinants de fusion β-galactosidase a été effectuée sur des filtres de nitrocellulose, comme décrit (Beall and Mitchell, 1986).
2.2.3. SDS-PAGE et Western Blot
En fonction des échantillons à tester, des gels de pourcentage d'acrylamide (BioRad™ 29.1 :1 ratio) variables (5, 7.5, 10 ou 12 %) ont été utilisés. Après migration en tampon Tris/glycine (pH 8.5) avec le kit minigel (Biorad, USA) les gels ont soit été colorés par bleu de Coomassie soit soumis à un transfert sur filtres de nitrocellulose (0.45 μm), dans la cellule Trans-Blot™ (BioRad.)
Après transfert, les protéines ont été visualisées par une coloration avec 0,2 % de rouge Ponceau dans une solution d'acide acétique (5%), puis le filtre a été saturé en TBS/lait écrémé à 5 % pendant 30 minutes. Les anticorps humains immunopurifiés sans dilution, et les sérums dilués 1/100 ou 1/200 dans du TBS/lait 5%/ Tween™ 0,05% ont été incubés pendant 1 à 2 heures à température ambiante. Ensuite, le filtre a été lavé 3 fois 10 minutes en TBS/Tween™ 0,05 %, et incubé avec les antisérums couplés à la phosphatase alcaline dilués 1/5000, pendant 30 minutes. Après lavage dans le même tampon, les réactions colorées ont été produites par l'ajout de NBT (330 μg/ml)et de BCIP (165 μg/ml) (Promega, Allemagne) dilués dans du tampon Tris pH 9.
2.2.4. IFI ([mmunofluorescence indirecte) Toutes les incubations à 37°C ont été effectuées dans une chambre humide afin d'éviter l'assèchement des tissus ou cellules à étudier. Les tampons ont été filtrés par un filtre à 0.22 μm afin d'éviter des contaminations par d'autres microorganismes et des bruits de fond. 2.2.4.1 Stade sporozoïtes
Après dissection des glandes salivaires de moustiques infectés avec le parasite, les sporozoïtes ont été fixés avec 0.01 % de glutaraldehyde en PBS et lavés soigneusement en PBS. Afin d'étudier le marquage uniquement en surface des sporozoïtes, (Galey et al., 1990) a développé une technique permettant une fixation « humide » avec une suspension de sporozoïtes attachés à la polylysine. Les lames de titration (PolyLabo, France) ont été coatées avec 1 μl d'une solution de 50 mg/ml de polylysine, puis laissées sécher une nuit à 37°C. 1 μl d'une suspension de sporozoïtes (20/μl) a été déposée sur chaque puits, et incubé dans une chambre humide à 4°C sur la nuit. La détection d'une présence intra-parasitaire a été faite par fixation des sporozoïtes dans l'acétone.
2.2.4.2 Stade hépatique Les coupes fixées au Carnoy et paraffinées ont été préparées par 3 bains de Xylène de 10 mn chacun, 3 bains d'alcool absolu de 5 mn chacun, 2 bains d'eau distillée de 5 mn chacun, et séchées à l'air libre. Ensuite, les coupes ont été réhydratées pendant 10 mn dans du PBS pH 7.4 filtré. Les coupes à congélation ont été fixées 10 minutes en acétone.
2.2.4.3 Stade sanguin.
Les frottis sanguins ont été fixés 10 minutes à l'acétone, et des cases pour chaque échantillon à tester ont été délimitées en dessinant des bords avec un marqueur Pentel-rouge sur le frottis. La suite de la technique a été identique pour les trois stades: Après fixation, les anticorps à tester (dilués dans du PBS) ont été déposés sur chaque puit, coupe ou case, et la lame incubée à 37°C en chambre humide pendant 1 heure. Les lames ont été lavées 3 fois 10 minutes dans du PBS 1X, puis incubées avec un anti-lgG anti-humain ou souris (selon les anticorps spécifiques utilisés), couplé à la fluorescéine (Alexis) dilué 1/200 dans du PBS et du bleu d'Evans 1/50000, incubées 30 minutes à 37°C en chambre humide, lavées trois fois en PBS 1X, et couvertes par une lamelle après qu'une goutte de tampon glycérine (PBS 30 % glycérol) ait été déposée. La lecture de la lame a été effectuée au microscope à UN (Olympus™ BH2))
2.2.5. Immunisations de souris 2.2.5.1 Par les recombinants histidines
Les protocoles a, b et c ont essentiellement été appliqués pour obtenir des sérums spécifiques, tandis que les protocoles b, c et d ont été employés afin d'effectuer des infections d'épreuve par P. yoelii.
a) Adjuvant IFA/Alum
Des souris BALB/c femelles de 6 semaines ont reçu 1 première injection intra-péritonéale de 500 μl, avec 1 mélange de 20 μg d'antigène (His6-249, Hisβ- 680, His6-747. His6-772), 2 mg/ml d'Alum (AI(OH)3, et de l'Adjuvant incomplet de Freund (AIF), volume dans volume, supplémenté avec 0.9% de ΝaCI. Les 2 injections suivantes, chacune à 15 jours d'intervalle, ont été effectuées avec la même quantité d'antigène dans le même volume, mais sans AIF, et avec de la méthiolate, un conservateur, à 0.05%.
Les souris ont été prélevées (500 μl) avant l'immunisation 2 semaines, 1 mois et 6 semaines après la première immunisation, sur EDTA et les plasma récupérés et stockés à -20°C.
b) CFA
Des souris BALB/c femelles de 6 semaines ont reçu 3 injections sous- cutanées tous les 15 jours à la base de la queue d'un mélange constitué par 100 μl d'adjuvant complet de Freund et de 10 μg d'antigène (His6-114 ou His6- 662) dans 100 μl de PBS. 1 semaine après la troisième injection, les sérums des souris ont été prélevés et les réponses testés en ELISAs contre le recombinant et en IFI sur les sporozoïtes. 18 jours après la dernière injection, les souris ont subi une infection d'épreuve par des sporozoïtes de P. yoelii. c) SBAS2 (Adjuvant Smith and Klein Beecham)
Des souris C3H femelles de 7 semaines ont reçu trois injections sous- cutanées à la base de la queue de 100 μl d'un mélange constitué par 57 μl d'adjuvant mélangé avec 43 μl d'antigène (His6-249, His6-747 ou His6-772) correspondant à 10 μg, les injections étant espacées de 3 semaines chacune. 10 jours après la dernière immunisation, les souris ont été prélevées et les sérums correspondants récoltés.
d) Microparticules Les solutions d'antigènes (His6-249, His6-747 ou His6-772) ont été adsorbées sur des microparticules en polystyrène de 0.5 μm de diamètre (Polysciences lnc, USA) par incubation à 37 °C en agitation pendant 4 heures dans une solution de glycine, pH 8.0. L'adsorption de l'antigène a été vérifiée par la capacité des micro- billes d'agglutiner avec un sérum spécifique à l'antigène adsorbé. Des souris C3H femelles de 7 semaines ont reçu trois injections sous- cutanées à la base de la queue de 100 μl d'un mélange constitué de microbilies coatés avec l'antigène correspondant à 10 μg, les injections étant espacées de 3 semaines chacune. 10 jours après la dernière immunisation, les souris ont été prélevées et les sérums correspondants récoltés.
2.2.5.2 Par les recombinants ADN
Des souris BALB/c et C3H de 6 semaines ont été injectées 3 fois à 8 semaines d'intervalle par voie intramusculaire avec 100 μl d'antigène (pNAK114, pNAK249, pNAK438, pNAK571 , pNAK747, pNAK772) dans du PBS pH 7.4, puis une 4ème fois 12 semaines après la 3ème injection. Les prélèvements de sang ont été effectués 1 semaine après la 3ème et la 4ème immunisation sur EDTA, et les sérums récoltés après une incubation du prélèvement la nuit à 4°C.
Les rates de 3 souris /groupe ont été prélevées après la 4ème immunisation, et les stimulations des réponses cellulaires étudiées. Après un 5ème boost, 8 semaines après la 4eme injection, les souris ont subi une infection d'épreuve par des sporozoïtes de P. yoelii. 2.2.6. Infection d'épreuves par sporozoïtes et par stade sanguin
Les sporozoïtes issus de moustiques Anophèles stephensii infectés par le clone 1.1 de P. yoelii yoelii ont été obtenus par une méthode (Ozaki et al., 1984) qui consiste en l'isolement de la cage thoracique du moustique et l'obtention par centrifugation à travers de la laine de verre des sporozoïtes, qui ont été lavés par des resuspensions successives en PBS après centrifugation.
Les souris ont été infectées par des sporozoïtes de P. yoelii par voie rétro orbitale avec 150 à 200 sporozoïtes (200 μl/ injection), et la' parasitémie suivie par des frottis du jour 3 suivant l'infection jusqu'au 12ème jour post-infection, aussi bien sur les animaux immunisés que sur des souris naïves infectées par le même lot de sporozoïtes.
Des stades sanguins prélevés sur d'autres souris infectées par P. yoelii ont été lavés dans du PBS, et l'équivalent de 5 x 104 parasites ont été injectés par voie intrapéritonéale.
2.2.7. Étude des réponses cellulaires.
Afin d'étudier aussi bien l'induction de prolifération de cellules-T spécifiques ainsi que la sécrétion de cytokines capables de stimuler la réponse immune, nous avons étudié la stimulation de splénocytes de souris par les antigènes et la sécrétion d'IFN-γ par ces cellules.
2.2.7.1 Proliférations de lymphocytes T
Les rates ont été prélevées sur les souris, les suspensions de splénocytes ont été lavées deux fois dans du RPMI 1640™ (Gibco, France) et les cellules resuspendues à une concentration finale de 5 x 106 cellules /ml dans du RPMI supplémenté avec 100 U/ml pénicilline, 2 mM L-glutamine, 10 mM Hepes, 50 μM β-mercaptoéthanol, 1 ,5% sérum de veau fœtal (SVF) et 0,5 % de sérum de souris normal. 100 μl/puits de chaque suspension a été distribuée dans des plaques de 96 puits à fond rond (Costar, USA) et les protéines recombinantes à tester ont été ajoutés à une concentration de 50 mg/ml. Ces tests ont été effectués en tripiicat. Après 48 h d'incubation, (37 °C avec 5 % de C02), 50 μl/puits de surnageant de culture a été prélevé et stocké à -70 °C avant la détermination de titres d'IFN-γ. 50 μl/puit de surnageant a été prélevé pour dosage de cytokines. Afin de détecter la réplication d'ADN due à une stimulation de division, 50 μl d'une solution de thymidine tritiée (3H) (Amersham Life Science, England) à 1 μCi/puits a été ajoutée durant les 12 dernières heures d'incubation. Les cellules ont été récoltées dans un récolteur de cellules automatique (Skatron Inc, Sterling, VA, USA), et l'incorporation de Thymidine 3H quantifiée par scintillation. Les résultats sont exprimés en Index de Stimulation (I.S.) et la prolifération a été considérée comme positive, lorsque le S.l. est au dessus de 2.
2.2.7.2 Détection de sécrétion d'interféron γ (IFN-γ)
Les titres d'IFN-γ dans les surnageants de culture ont été déterminés par un méthode d'ELISA à double capture. Des plaques Maxisorp™ (Nunc, Danemark) à fond plat ont été coatées par un anticorps monoclonal de rat anti- IFN-γ de souris primaire (R4-6A2) (Pharmingen, San Diego, CA) dilué dans un tampon de 0.1 M de carbonate, pH 9.6, et laissé sur la nuit à 4 °C. Entre chaque étape de la procédure, les plaques ont été lavées plusieurs fois avec du tampon PBS supplémenté avec 0,05 % Tween™ (PBS-T). Ensuite, les plaques ont été saturées avec 3% d'albumine de sérum de veau (BSA, Sigma Chemicals, St Louis, USA) dans du PBS-T. Des surnageants non-dilués ont été ajoutés aux puits et les plaques incubées sur la nuit à 4°C, suivi par une incubation 1 h à température ambiante avec un anticorps monoclonal rat anti-souris IFN-γ secondaire biotinylé (XMG1.2™, Pharmingen, San Diego, CA) dilué dans du PBS-T. Les étapes de marquage avec des anticorps couplés à la peroxidase sont identiques à celles utilisées dans la technique de l'ELISA. (A.2.1)
2.2.7.3 Détection de cellules sécrétrices d'IFN-γ par Elispot
Le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-γ a été déterminé dans des splénocytes non stimulées 40 heures après qu'elles soient fraîchement isolées et incubés avec les antigènes. Des plaques de microtitrage (Multiscreen-HA™, plaque stérile, Millipore) ont été coatées par 50 μl d'une solution contenant 5 μg/ml d'anticorps anti-IFN-γ (18181D™, Becton Dickinson Co). Après une incubation sur la nuit à 4 °C, les puits ont été lavés et saturés par une solution de 5 % de SVF. Des suspensions de cellules de 5 x 105 cellules/puit ont été incubées avec l'antigène à 50 μg/ml dans un volume total de 200 μl pendant 40 h, à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de C02. Les plaques ont ensuite été lavées 3 fois avec du PBS-T et 3 fois avec du PBS seul et les puits ont alors été coatés par 50μl de solution d'anticorps anti-souris IFN-γ biotinylé (Becton Dickinson Co, USA) dilué au 1/200 et incubé sur la nuit à 4 °C. Les plaques ont ensuite été lavées de la même façon que précédemment, avant un ajout de 50 μl par puit de phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (Boehringer-Mannheim, Allemagne) à une dilution de 1/2000 dans du PBS. Après 1 h d'incubation, et lavage des plaques, des spots ont été détectés par développement d'une réaction colorée avec les réactifs BCIP/NBT à 50 μg/ml à l'endroit où des cellules individuelles ont sécrété de l'IFN-γ. Les résultats sont exprimés comme le nombre de cellules formant des spots par rapport aux 5 x 106 splénocytes.
2.2.8. Sérums et cellules
2.2.8.1 D'individus naturellement exposés au parasite.
10 sérums provenant d'adultes vivant dans une forte zone d'endémie (Côte d'Ivoire) et naturellement protégés ont été employés dans des études d'ELISA et des immunopurifications d'anticorps spécifiques aux antigènes étudiés.
Des sérums provenant d'individus de deux tranches d'âges allant de 0 -9 ans ou au dessus de 12 ans, ont été sélectionnés des Villages Ndiop et Dielmo (Rogier and Trape, 1995; Trape et al., 1994). Ndiop est situé dans une zone d'endémie qui compte environ 20 piqûres infectieuses/an, et Dielmo, dans une zone qui compte 150 piqûres infectieuses/an. Chaque sérum dans une des deux régions correspond en âge et en sexe à un sérum de l'autre région.
2.2.8.2 D'animaux ou d'humains immunisés avec des sporozoïtes irradiés.
Deux chimpanzés ont été immunisés soit avec des sporozoïtes irradiés à 18 kRad, soit à 30 kRad par 4 injections de 5 x 106 sporozoïtes chacune par voie intravéneuse. Les 3 premières immunisations ont été effectuées avec 1 mois d'intervalle, tandis que la 4ème a été effectuée 4 mois après la 3ème. Leur sérum et les cellules du sang périphérique ont été étudiés dans des tests de réponses cellulaires et de réponses humorales après 3 immunisations. Les deux animaux ont été infectés par l'injection intravéneuse de 4 x 104 sporozoïtes (faible dose) chacune de P. falciparum et seulement le chimpanzé immunisé avec les sporozoïtes irradiés à 18 kRad a été protégé (n'a pas développé de parasitémie sanguine).
Deux volontaires humains immunisés par le même moyen, ont reçu un rappel avec un nouveau lot de sporozoïtes irradiés, et les cellules du sang périphérique ont été étudiées dans des tests d'Elispot. De plus, le sérum de 4 volontaires humains immunisés avec des sporozoïtes irradiés a également été à la disposition de la Demanderesse.
2.2.8.3 D'individus exposés différemment au parasite
Nous avions à notre disposition des sérums de 8 individus exposés naturellement au parasite mais sous traitement de chloroquine permanent, ce qui élimine les stades sanguins à une forme très précoce et des sérums de 5 individus accidentellement infectés par la transfusion de sang infecté par P. falciparum.
3) RESULTATS 3.0: Exemple 1
Identification de deux antigènes nouveaux DG47 et DG772 de P. falciparum reconnus par des volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradié
Les clones DG 747 et DG772 ont été sélectionnés non seulement à cause des critères initiaux posés (détection sur les sporozoïtes et le stade hépatique, ainsi qu'une reconnaissance par des sérums hyperimmuns), mais parce que plusieurs caractéristiques supplémentaires nous ont intéressés : le DG747 n'avait aucune réactivité croisée avec d'autres protéines de la banque PM, et le DG772 n'avait qu'une seule réactivité croisée, avec LSA1 , le seul antigène identifié comme exprimé uniquement au stade hépatique de P. falciparum. De plus, des anticorps spécifiques des deux protéines marquaient des sporozoïtes de P. yoelii. Un séquençage initial a révélé que ces deux clones contenaient des inserts appartenant à des gènes jusqu'ici inconnus, mais dont la séquence était disponible sur les bases de données du génome de P. falciparum. Nous nous sommes donc consacrés au travail de la caractérisation moléculaire d'expression du stade, de la conservation du gène, ainsi qu'à un travail de caractérisation immunologique (antigénicité, immunogénicité) de ces nouveaux antigènes. Les résultats ont montré que a) ces deux antigènes induisent une réponse immune chez des individus ou des animaux uniquement exposés aux stades pré- érythrocytaires aussi bien artificiellement (par immunisation) que naturellement (sur le terrain), b) qu'ils sont reconnus par des sérums d'individus naturellement exposés au cycle entier du parasite, aussi bien dans des zones de faible que de forte endémie. De plus, nous avons évalué chez la souris leur potentiel immunogène et protecteur par l'immunisation et l'infection d'épreuve par P. yoelii.
3.1. Analyse des séquences
DG747 code pour un polypeptide de 59 acides aminés dont les 40 acides aminés (aa) C-terminaux font partie d'une structure répétitive de 5 x 8 aa riches en arginine et en lysine. Cette séquence est identique aux aa 81-140 du gène PfB0155c (1524 pb, 508 aa) situé sur le chromosome 2 (Figure 3.1a). Ce gène qui code pour une protéine putative (Gardner et al., 1999), ne comporte ni introns, ni peptide signal prédits, ni de régions homologues à d'autres protéines qu'elles soient de Plasmodium ou d'autres organismes. La protéine correspondante a une masse moléculaire théorique de 59 kDa, et un point isoélectrique neutre (7.5), mais certaines régions ont des pi très variables, par exemple la région retrouvée dans DG747 a une charge positive à pH neutre.
DG772 contient un insert de 333 pb, qui sont traduits en 111 aa contenus dans un cadre de lecture ouvert. Ce polypeptide correspond à la région des aa 1146-1256 d'une protéine de 1493 acides aminés codée par un gène situé sur le chromosome 1 (figure 3.1b). La masse théorique de la protéine est de 173 kDa et le point isoélectrique est de 5.05. La protéine est constituée en majorité d'acides aminés polaires et ne contient pas de sites hydrophobes, à part dans la partie N- terminale, où il pourrait y avoir un site d'ancrage de GPI. Le gène ne contient pas de répétitions et la séquence nucléotidique traduite a une forte homoiogie avec les protéines de la famille « EBP » (Adams et al., 1992), c'est-à-dire avec des régions 5'cys et 3'cys qui sont caractéristiques de cette famille.
3.2. Expression de stade et conservation du gène
Afin d'évaluer plus précisément l'expression de stade des deux protéines, nous avons utilisé les techniques d'IFI et de Western blot sur des stades différents de P. falciparum et sur les parasites murins P. yoe//7 et P. berghei.
La surface des sporozoïtes de P. falciparum a été marquée par les anticorps (humains ou de souris) spécifiques de DG747 et de DG772, mais les stades érythrocytaires ont été marqués d'une façon différente pour les deux groupes d'anticorps. Les anticorps anti-His6-747 (anti-747) marquent peu les stades jeunes, mais fortement les stades schizontes mûrs, avec un marquage localisé autour des structures knob (Figure 3.2 image A), tandis que les anticorps anti-HiS6-772 (anti-772) marquent le parasite d'une façon plus homogène tout au long du stade érythrocytaire. Dans les espèces murines P. yoelii et P. berghei, la surface des sporozoïtes a été fortement marquée par les anticorps spécifiques des deux antigènes.
Afin de définir les tailles des protéines détectées, nous avons aussi effectué un Western Blot des extraits protéiques de parasites sanguins de P. falciparum avec les mêmes anticorps (Figures 3.3 a et b). Les anticorps anti-747 marquent un polypeptide d'environ 70 kDa aussi bien dans les extraits d'anneaux que ceux de schizontes, tandis qu'aucune bande n'a été détectée dans les érythrocytes non parasités. Le polypeptide détecté par des anticorps anti-772 est plus grand, d'une masse moléculaire de 150 kDa, et est détecté aussi bien dans les anneaux que dans les schizontes. Le marquage d'extraits protéiques de P. yoelii a détecté un polypeptide de 70 kDa pour les anti-747 dans les sporozoïtes et les stades sanguins et un polypeptide de 60 kDa pour les anti-772, seulement détecté dans les sporozoïtes de P. yoelii. De plus, afin de confirmer la présence des protéines et leur constance d'expression à la surface des sporozoïtes provenant de plusieurs parasites différents, nous avons examiné par IFI des lots de sporozoïtes provenant de différents isolats Thai de P. falciparum. Le sérum anti-772 a marqué tous les sporozoïtes, tandis que seulement 7 sur 10 des isolats testés étaient marqués par les anti-747. De même, des amplifications par PCR avec des amorces spécifiques pour les deux fragments de gène (indiquées dans les Figure 3.1a et 3.1 b) ont été effectuées avec de l'ADN issu de stades sanguins de 12 souches différentes de P. falciparum (Figure 3.4). Les produits PCR correspondant au DG772 ont été amplifiés à partir des 12 échantillons et leur taille était similaire, tandis que les amorces spécifiques pour DG747 n'ont pu amplifier un fragment qu'à partir de 9 des 12 ADN. Il faut préciser que toutes les lignées de parasites utilisées dans ce travail (T9-96, NF54 et 3D7) contiennent les gènes correspondants. Ces résultats indiquent une variation au niveau de l'expression ou de la présence de DG747 dans des souches parasitaires, car au total, seulement 15 sur 22 parasites ont semblé contenir le gène du DG747 ou ont montré une réactivité positive en IFI.
3.3. Reconnaissance par le système immunitaire humain dans des zones endémiques
En plus de l'étude de la constance d'expression de l'antigène, nous avons étudié la prévalence des réponses humorales d'individus vivant dans des zones de forte (Dielmo) ou de faible (Ndiop) endémie, et dans deux groupes d'âge différents dans ces deux zones (Figures 3.5a et 3.5b) On observe une même prévalence (40 %) contre 747 dans la zone de faible endémie, sauf que le nombre d'individus qui répondent fortement (l'intensité de réponse par rapport aux témoins) augmente avec l'âge. Dans la zone de forte endémie, le nombre de répondeurs contre 747 augmentent avec l'âge, ainsi que l'intensité de la réponse, et la prévalence chez les adultes, que l'on peut considérer comme ayant acquis une immunité, est de 85 %. De plus, ces réponses semblent corrélées avec l'exposition au sporozoïte, car le taux d'anticorps est plus élevé chez les individus d'un groupe d'âge donné dans une zone de transmission plus forte. Toutefois, dans une même zone, la réponse n'a pas changé d'une façon significative durant des saisons de plus faible transmission (saison sèche) (résultats non montrés), ce qui pourrait correspondre à la réponse contre les stades sanguins et/ou indiquer que la réponse immune anti-747 est de longue durée. La réponse induite par DG747 augmente en prévaience et en intensité en fonction de l'exposition et de la durée d'exposition au parasite (âge).
La réponse anti-772 augmente comme l'anti-747 en fonction de l'âge, mais avec une augmentation beaucoup moins importante, par rapport au taux de transmission observé entre Ndiop et Dielmo et par rapport à l'âge. Le taux de réponses anti-772 mesuré en % de prévalence et en intensité est plus élevé pour les individus de bas âge que celui des réponses anti-747, mais moins forte (75%) que l'anti-747 (85%) à Dielmo dans les individus immuns.
3.4. Comparaison des réponses induites par des stades différents du parasite
Nous avions le privilège d'être en possession de cellules issues d'individus immunisés avec des sporozoïtes irradiés, et de sérums provenant de personnes exposées de façon différente à l'infection parasitaire.
3.4.1. Réponses cellulaires
Toutes ces études ont été effectuées en étroite collaboration avec Jean- Pierre Sauzet dans le laboratoire. Compte tenu du peu de matériel dont nous disposions, nous avons restreint les analyses afin de détecter ce que nous avions précédemment défini comme un des critères importants (rôle dans la protection) pour l'évaluation d'un potentiel vaccinal au stade pré-érythrocytaire. Nous avons étudié la sécrétion de IFN-γ de cellules issues de 2 individus immunisés avec des sporozoïtes irradiés de P. falciparum, car nous avions observé, lors de l'analyse d'autres antigènes, et en particulier de LSA3, un candidat vaccin étudié dans notre laboratoire (Daubersies et al., 2000), que le taux de sécrétion de cette cytokine semble être corrélé à la protection. Chez ces deux volontaires, le nombre de cellules sécrétant l'IFN-γ contre DG747 et DG772 est aussi élevé que pour les recombinants issus de LSA3 (729 et PC), (Figure 3.6a). De plus, nous avons examiné si les réponses immunes cellulaires mesurées par la prolifération de lymphocytes T et la sécrétion d'IFN-γ différaient entre deux chimpanzés immunisés avec les sporozoïtes irradiés de P. falciparum, mais dont un n'était pas protégé, (Figure 3.6b).
Les cellules du système immunitaire de l'animal immunisé avec les sporozoïtes irradiés viables (18 kRad) et ultérieurement protégé, ont reconnu les antigènes DG747 et DG772, ainsi que l'ont fait les cellules de l'animal immunisé avec des sporozoïtes irradiés non-viables (30 kRad), et pas protégé lors d'une infection d'épreuve.
Les proliférations lymphocytaires sont à la limite de la valeur seuil, tandis que les taux de sécrétion d'IFN-γ sont élevés, aussi bien pour la quantité de cytokine détectée que pour le nombre de cellules sécrétrices (détecté par Elispot). Ceci est valable aussi bien pour les animaux efficacement immunisés et ceux n'étant pas protégés. Cependant, il semble que les taux de réponses sont plus élevés pour les animaux immunisés avec les sporozoïtes irradiés de 30 kRad. Les réponses induites par 747 sont plus fortes que celles qu'induit 772, et les deux plus fortes que celles induites par LSA3.
Les cellules prélevées sur des animaux ayant subi une immunisation supplémentaire par les sporozoïtes irradiés ont été endommagées lors du transport à partir du centre de primatologie en Afrique, et nous n'avons donc pas pu étudier la présence d'un « boost » induit contre ces antigènes.
3.4.2. Étude des réponses humorales Nous n'étions pas en possession des cellules de tous les groupes humains exposés de façon différente à l'infection parasitaire, mais nous avons pu étude en détail la réponse humorale (isotypes d'IgG) de volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradiés (ISS, seulement exposés aux stades pré-érythrocytaires), d'individus naturellement immuns vivant en zone de forte endémie (exposés à tous les stades du parasite), et d'un individu ayant été accidentellement infecté par le paludisme par transfusion sanguine, (uniquement exposé aux stades sanguins) (Figures 3.7a et 3.7b). Pour les deux antigènes, la différence la plus grande est observée pour l'isotype cytophile lgG1 dont le taux est beaucoup plus élevé dans le sérum d'individus immuns (SHl) que dans le sérum issu du malade infecté par transfusion ou de volontaires ISS. Les réponses de ces deux derniers groupes sont assez semblables et ne font pas apparaître de déséquilibre entre anticorps cytophiles (lgG1 et lgG3) et non cytophiles (lgG2 et lgG4). Nous avons en outre remarqué que le sérum issu d'un individu exposé longuement au parasite, mais sous prophylaxie permanente (le PM), a le même profil en isotypes que les ISS.
3.5. Immunogénicité chez la souris
Des souris de deux souches différentes ont été immunisées avec les recombinants sous formes de protéines, avec des adjuvants différents ou sous forme de constructions d'ADN « nu », sans adjuvant.
Une étude préliminaire avec une construction ADN nu ne comportant pas de séquence signal permettant l'exportation de la protéine synthétisée a été effectuée. Les souris immunisées n'ont généré aucune réponse humorale, que cela soit pour ces deux antigènes ou pour d'autres étudiés simultanément. Cependant, nous avons détecté des réponses cellulaires spécifiques anti-747 et anti-772. Aussi bien les proliférations de lymphocytes T que le taux de sécrétion d'IFN-γ ont été testés pour deux souches de souris, la C3H et la BALB/c. Les profils de réponses sont présentés dans les Tableaux 3.1a et 3.1b où Ton peut remarquer que pour le cas des réponses cellulaires de souris immunisées avec pNAK747, il y a aussi bien des stimulations de prolifération que de sécrétion d'IFN-γ, tandis que pour pNAK772, les proliférations des cellules T ont été très peu stimulées par rapport à la stimulation de sécrétion d'IFN-γ qui est considérable. Parmi toutes les souris immunisées, le niveau le plus élevé de sécrétions d'IFN-γ est observé lorsque le niveau de stimulation de prolifération est le plus bas.
Les vaccinations par les autres formulations (protéine recombinante et ADN nu avec une séquence signal) ont toutes induit une réponse humorale chez les souris (Figure 3.8). Tous les sérums issus de ces souris immunisées reconnaissent la protéine native en tests d'IFI et le marquage correspond avec celui observé pour les anticorps humains immunopurifiés. •
Les réponses anti-747 présentent un profil similaire pour toutes lés souris immunisées et toutes les formulations utilisées, avec une réponse isotypique à prépondérance lgG2b. Les réponses anti-772 sont aussi similaires entre souris et formulations de vaccins, mais avec une nette prédominance des lgG1. Le profil isotypique dépend donc de l'immunogène plus que du mode de présentation utilisé. Cependant, les titres à point final sont beaucoup plus-élevés lorsque l'on immunise avec des protéines recombinantes (1/200.000) par rapport à l'ADN (1/2000), et les titres des sérums de souris immunisées avec HiS6-772 sont plus élevés que ceux des His6-747.
Puisque nous avions observé une réactivité croisée avec le stade sporozoïte de P. yoelii, nous avons testé le potentiel protecteur de ces antigènes par l'infection avec des sporozoïtes de cette espèce de souris immunisées avec les protéines recombinantes. La parasitémie a été suivie par l'observation des formes sanguines sur des frottis à partir du jour 3 de l'infection et pendant 12 jours consécutifs. Nous n'avons observé aucune protection quelle que soit la souche de souris utilisée, car la parasitémie a été détectée au même jour que celle des souris non immunisées, et la courbe était semblable à celle des souris témoins (résultats non-montrés).
3.6 Données supplémentaires
3.6.1 DG772
Par RT-PCR sur l'ARN total issu de sporozoïtes et de parasites sanguins, les inventeurs ont pu déterminer les sites d'épissage de l'ARN messager correspondant au gène codant. La séquence des amorces a été extraite des données du génome de Plasmodium falciparum.
Les produits d'amplification sont de tailles identiques dans les; stades sporozoïtes et les stades sanguins, et diffèrent de la taille du produit obtenu par amplification de l'ADN génomique et par séquençage les sites d'épissages se sont avérés d'être identiques (voir les introns indiqués dans la figure). Le gène codant pour DG772 appartient à une famille de protéines identifiés par un motif partagé. Toutes les protéines de la famille des EBP (Erythrocyte Binding Proteins) partagent des motifs conservés de résidus cystéine dont l'agencement est similaire pour toutes les protéines. Cependant, le degré d'identité ne dépasse pas 31 % (max. 57 % d'homologie), même dans les régions les plus conservées.
3.6.2 Tests d'immunogénicité envisagés dans les humains.
D'après nos résultats obtenus dans les souris, nous pouvons confirmer que les antigènes DG747 et DG772 employés aussi bien sous forme d'ADN que sous forme de protéine recombinante sont immunogènes. De plus, du fait que les protéines recombinantes sont reconnues par des individus immunisés et protégés contre l'infection par des sporozoïtes de Plasmodium falciparum indique un rôle de ces antigènes dans l'immunité pré-érythrocytaire. Un test dans des primates, et en particulier des chimpanzés permettra de choisir facilement la formulation optimale pour des tests cliniques chez l'humain.
Dans les essais de phase I, afin d'étudier l'immunogénicité et la sûreté du produit, nous envisageons trois formulations toutes préparées dans des conditions GMP: 1) l'antigène sous forme de protéine recombinante purifiée à partir de la bactérie Lactococcuc lactis (utilisation permise dans les humains) adjuvée avec l'adjuvant SBAS2 (GSK) ; 2) la construction d'ADN dans le vecteur Vical™ (Avantis Pasteur) ; et 3) des lipopeptides synthétiques injectés sans aucun adjuvant (v. LSA3) . Ces formulations vont être distribuées par injection sous-cutanée (au niveau du deltoïde). Par des tests préliminaires, nous savons que les antigènes HÎS6-747 et His6-772 induisent des réponses cellulaires et des réponses humorales chez des individus n'ayant été exposés uniquement aux stades pré-érythrocytaires. Nous allons ensuite étudier les réponses cellulaires et les réponses humorales des individus immunisés par les formulations choisies en les comparant avec celles observées dans des individus immunisés avec des sporozoïtes atténués par irradiation et protégés contre une infection d'épreuve avec des sporozoïtes non-atténués. En fonction de ces réponses, une infection d'épreuve avec des sporozoïtes de Plasmodium falciparum sera envisagée. 3.6.3 Homologie avec d'autres séquences nucléotidiques.
Une hybridation par Southern blot dans les conditions stringentes standard (0.1 X SSC, 60 °C) ne donnerait lieu à aucune autre hybridation qu'avec le gène correspondant.
3.6.4 Recherche d'homologie par des moyens bioinformatigue
Les recherches ont été effectuées avec le logiciel BLAST™ (tblastx et blastn) sur toutes les bases de données disponibles du génome de Plasmodium falciparum ainsi que les bases de données d'autres organismes. Les paramètres utilisées sont les paramètres de défaut trouvées sur les site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
3.7 Discussion Ce travail qui fait partie de l'étude des antigènes exprimés aux stades pré- érythrocytaires nous a permis une première caractérisation et l'évaluation du potentiel vaccinal de deux nouveaux antigènes de P. falciparum. Ces deux antigènes ont des caractéristiques différentes au niveau moléculaire. D'une part, la protéine dont fait partie le DG747 contient des répétitions, tandis que la molécule contenant le DG772 n'a aucune répétition directe. Le gène Pfb0155c codant pour DG747 est petit (1524 bp) et contient une région répétitive à laquelle appartient DG747. Nous n'avons pas pu détecter la présence du gène par PCR dans toutes les souches, ni pu observer une réactivité avec toutes les souches de sporozoïtes étudiées. L'absence observée peut être due à une réelle délétion du gène ou aux procédures expérimentales. En effet, une des amorces utilisées pour la détection de la partie codante pour DG747 chevauche la partie répétitive, ce qui peut entraîner une difficulté à amplifier un gène contenant une répétition plus grande, ou à détecter un gène contenant moins de répétitions. De plus, ceci est aussi le cas pour la détection en immunofluorescence indirecte où un nombre éventuel de variations de répétitions peut changer l'affinité des anticorps spécifiques, si l'epitope cible chevauche cette région. L'expression détectée par IFI semble être présente tout au long du cycle parasitaire asexué dans l'hôte vertébré (nous n'avons pas analysé les stades sexués). Malgré la présence de répétitions dans le DG747, nous n'avons pas détecté de réactivité croisée avec d'autres antigènes de P. falciparum. La séquence du gène entier n'a pas d'homologie avec d'autres protéines plasmodiales jusqu'ici identifiées, et nous n'avons pas encore d'indications sur une fonction biologique éventuelle.
Le DG772 ne contient pas de répétitions et sa présence semble être constante, qu'elle soit détectée par PCR ou par IFI. Au niveau biologique, le gène codant pour DG772 s'avère être intéressant. Nous avons trouvé par homologie de séquence que ce gène de 5300 bp de cadre de lecture ouverte fait partie de la famille des EBP (Erythrocyte Binding Protein) (Adams et al., 1992), mais que la séquence de DG772 n'appartient pas aux régions conservées de cette famille, il ne partage qu'une petite partie de séquences avec l'extrémité N-terminale de la région 3'cys. D'ailleurs, il n'a pas de réactivités croisées ni d'homologie de séquence avec DG249, un autre clone faisant partie d'une des parties consensus du gène codant pour EBA-175. Il se peut que DG772 fasse partie d'une région qui confère une particularité à chaque molécule de cette famille. La présence de deux molécules de la famille d'EBP (EBA-175 et 772) sur les sporozoïtes pourrait impliquer qu'il existe plusieurs molécules de cette famille qui interviendraient de façon alternative dans le processus d'invasion comme décrit dans les stades sanguins.
Une connaissance de la prévalence est utile lors de l'évaluation d'un candidat vaccin, et les prévalences obtenues pour DG747 et DG772, de 85% et 75%, sont importantes. Cette étude a montré l'antigénicité importante d'un petite partie des deux molécules, et a suggéré qu'il y aurait un intérêt à étudier plus en détail d'autres epitopes de la même molécule. La réponse humorale détectée contre DG747 et DG772 dans des individus exposés en permanence indique qu'il y a une prépondérance en réponse lgG1 (type cytophile) développée lors d'une exposition soutenue qui n'est pas retrouvée dans le cas de paludisme transfusionnel. Par contre, les profils de réponses humorales obtenus pour deux groupes exposés aux stades pré-érythrocytaires à plus ou moins longue durée (PM et ISS) se ressemblent, et le niveau d'IgGI est bas, ce qui indique que cet isotype traduit l'exposition répétée de l'antigène aux stades sanguins. L'étude des réponses cellulaires dans ces mêmes zones devra être effectuée afin d'avoir une notion plus précise des réponses immunitaires induites par ces antigènes.
Aux stades pré-érythrocytaires, nous avons observé une induction de réponse cellulaire par ces antigènes aussi bien dans des chimpanzés que chez des humains. Nous avons observé la sécrétion IFN-γ, décrit comme un facteur intervenant dans la protection contre les stades pré-érythrocytaires. La différence de réponse observée chez les chimpanzés en fonction de la dose d'irradiation pourrait signifier que les antigènes sont reconnus aussi bien sur les sporozoïtes que dans les stades hépatiques. En effet, les sporozoïtes irradiés à 30 kRad sont incapables de pénétrer dans l'hépatocyte, et les réponses détectées sont donc seulement dues à cette exposition, tandis que les sporozoïtes irradiés à 18 kRad se développent dans l'hépatocyte, et les réponses détectées sont donc dues à ce stade. Il serait intéressant d'étudier de plus près les réponses induites dans ces deux animaux (restriction MHC1), et l'induction de « boost » de réponse lors de plusieurs immunisations successives. Ce travail a aussi montré que dans ces deux fragments d'antigènes, il existe aussi bien des epitopes T que des epitopes B.
L'immunogénicité induite par les deux antigènes dans la souris est différente avec une prédominance d'IgGI pour le DG772, qui n'est pas observée pour DG747. Par contre, nous n'avons observé aucune différence dans les réponses en fonction des formulations, ce qui est intéressant car la présentation des molécules n'est pas identique pour chaque formulation. Les réponses cellulaires uniquement obtenues pour la formulation n'ayant pas induit de réponses humorales détectables montre qu'il y a eu aussi bien des proliférations de lymphocytes, que des sécrétions d'IFN-γ en fonction des souris. Tableau D1: Récapitulatif des antigènes pré-érythrocytaires du paludisme connus à présent*.
* Les antigènes en gris sont les antigènes caractérisés dans cette demande.
NT : Non testé
1 : La présence aux stades pré-érythrocytaires d'autres antigènes (MSP-1) a aussi été suggérée, mais les résultats préliminaires restent à confirmer. Les références soulignées indiquent l'année de découverte de l'expression pré-érythrocytaire.
2. S : sporozoïte ; H : Stade hépatique jeune et mûr ; SSA : Stade Sanguin asexué jeune .et mûr ; SSS : Stade sanguin sexué. 3. ST : sub-télomérique. Les caractères en gras indiquent la forme du stade où le marquage est le plus intense.
3. La plupart des localisations chromosomales a été faites par recherche d'homologie sur des bases de données Tableau 3.1a: Stimulation de proliférations cellulaires et de sécrétion d'IFN-γ par His6-747 après 3 immunisations avec pNAK747.
pGEX-NN : antigène de P. falciparum non cross-réactif avec His6-747. Les résultats positifs sont en gras.
Tableau 3.1b: Stimulation de proliférations cellulaires et de sécrétion d'IFN-γ par His6-772 après 3 immunisations avec pNAK772.
pGEX-NN : antigène de P. falciparum non cross-réactif avec His6-772. Les résultats positifs sont en gras
Tableau 4.1 : Réponses cellulaires de souris après 5 immunisations avec pNAK438*.
* Les taux de réponses sont représentés par rapport aux réponses obtenues par une valeur seuil. La valeur seuil est calculée en faisant la moyenne des réponses d'animaux non-immunisés et celle des animaux immunisés contre un antigène non-relevant, comme l'OspC, une protéine de la Borrelia burgdorfe .
Tableau 4.2: Détection d'expression par IFI avec des anticorps humains immunopurifiés ou des sérums de souris spécifiques
Les sporozoïtes de Plasmodium falciparum viennent de la souche NF54. T23: souche de provenance thaï; NF54 souche d'origine africaine. Tableau 5.1 : Réactivités croisées détectées en Western blots entre les membres de la famille Pf11-1
Réaction forte Réaction moyenne
E : anticorps immunopurifiés (élues) sur les protéines recombinantes correspondantes. P : protéine recombinante.
Tableau 5.2: Réactivités croisées au niveau nucléotidique entre les clones de la famille Pf11-1*
* L'intensité du signal est symbolisé par des croix. NT : non testé.
1 : Taille estimée par rapport aux produits PCR obtenus, ou la taille précise lorsque le clone entier a été séquence.
CHR : Chromosome; part : partie
Tableau 5.4: Réactivité en IFI testés avec des anticorps spécifiques aux His6-571etVi571
Tableau 5.5: Réponses cellulaires des souris immunisées avec pNAK571
Bien que la présente invention ait été décrite par rapport aux réalisation concrètes et privilégiée, il apparaîtra toutefois évident aux personnes versées dans l'art ou la science en cause qu'il est possible d'introduire un certains nombres de variations et modifications sans déroger à la portée de l'invention décrite et revendiquée dans ce document.

Claims

REVENDICATIONS:
1. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 60 %, préférablement au moins 80% et plus préférablement au moins 95% d'identité avec la SEQ ID NO: 1 (DG747) ou la SEQ ID NO: 2 (DG772).
2. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs identiques à la SEQ ID NO: 1 ou la SEQ ID NO: 2.
3. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il s'hybride dans des conditions de fortes stringences avec un polynucléotide selon la revendication 1 ou la revendication 2.
4. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il présente au moins 60%, préférablement au moins 80% et plus préférablement au moins 95% d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772).
6. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5 acides aminés consécutifs identiques à l'une des séquences choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 à 7, et la SEQ ID NO: 8.
7. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il présente au moins 40%, préférablement au moins 60%, plus préférablement au moins 80% et encore plus préférablement au moins 95% d'identité avec l'une des séquences choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et la SEQ ID NO: 12.
8. Polypeptide recombinant ou chimérique caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 4 à 7.
9. Antigène isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou en un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 4 à 8.
10. Conjugué antigenique constitué de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, et/ou de polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8; et d'un support sur lequel lesdits polynucléotides/ polypeptides sont adsorbés.
11. Conjugué selon la revendication 10 caractérisé en ce que le support est constitué de microsphères, de microparticules de billes de latex, de microparticules de polyphosphoglycans (PGLA) ou de microparticules de polystyrène.
12. Utilisation d'un conjugué selon la revendications 10 ou 11 , pour l'immunisation d'individus infectés ou susceptibles d'être infectés par le paludisme.
13. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides, polypeptides et/ou conjugués définis aux revendications 1 à 11.
14. Anticorps selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'ils sont humanisés.
15. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
16. Un vecteur selon la revendication 15, dans lequel la dite séquence polynucléotidique est incorporé dans un site non essentiel à la réplication dudit vecteur.
17. Un vecteur selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi dans le groupe constitué par les plasmides, les cosmides et les phages.
18. Cellule hôte comprenant un vecteur selon l'une quelconque des revendications 15 à 18.
19. Cellule E.Coli recombinante choisie parmi les cellules déposées à la C.N.C.M. le 23 Mai 2001 sous les numéros d'accession 1-2671 et I-2672.
20. Composition immunogène comprenant:
- au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, des conjugués selon la revendication 10
- ou 11 ; et
- un véhicule pharmaceutique acceptable.
21. Composition immunogène selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle contient de plus au moins un composé choisi dans le groupe constitué par l'alun, le QS21 , le montanide, l'adjuvant SBAS2 et l'adjuvant incomplet de Freund.
22. Composition immunogène selon la revendication 20 ou 21 , caractérisée en la molécule polypeptidique est adsorbé sur des microparticules.
23. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, dans laquelle ladite molécule polynucléotidique est sous forme d'ADN.
24. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 caractérisée en ce qu'elle comprend de plus au moins un épitope choisi dans le groupe constitué par: les protéines CS, MSP-1 , MSP-3, LSA-1.TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II et LSA-3.
25. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à 24 caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention d'une réponse cellulaire et/ou humorale in vivo et/ou in vitro.
26. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à
25, caractérisée en ce qu'elle permet la production d'interféron-γ par des leucocytes de sujets immunisés par des sporozoïtes irradiés.
27. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à
26, caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention d'une réponse humorale IgG.
28. Composition immunogène selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention de réponse humorale de type lgG1 , lgG2, lgG3 et/ou lgG4.
29. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 20 à 28, caractérisée en ce qu'elle est capable d'induire, in vivo et in vitro, une protection par une infection d'épreuve par Plasmodium falciparum.
30. Vaccin anti-palustre comprenant:
- au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, des conjugués selon la revendication 10 ou 11 ; et
- un véhicule pharmaceutique acceptable.
31. Vaccin selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins un épitope choisi dans le groupe constitué par: les protéines CS, MSP- 1 , MSP-3, LSA-1 ,TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II et LSA-3.
32. Composition pharmaceutique comportant à titre de substance active un ou plusieurs anticorps polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 13 ou 14, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
33. Composition pharmaceutique selon la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus au moins un composé choisi dans le groupe constitué par l'alun, le QS21 , le montanide, l'adjuvant SBAS2 et l'adjuvant incomplet de Freund.
34. Utilisation d'au moins un des éléments suivants: polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, conjugués selon la revendication 10 ou 11 ; anticorps selon la revendication 13 ou 14; pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du paludisme.
35, Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps selon la revendication 13 ou 14 afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés.
36. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3; des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, des conjugués selon la revendication 10 ou 11 ; afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins un desdits éléments et des anticorps éventuellement présents dans ledit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés.
37. Méthode selon la revendication 35 ou 36, caractérisée en ce qu'à l'étape a), le tissu et/ou le fluide biologique est de plus mis en contact avec au moins un épitope choisi dans le groupe constitué par: les protéine CS, MSP-1 , MSP-3, LSA-1.TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II ou LSA-3.
38. Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme comprenant les éléments suivants : a) au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3; les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, les conjugués selon la revendication 10 ou 11; b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins une des éléments définis en a); et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur susceptible d'être reconnu par un second réactif marqué.
39. Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme comprenant les éléments suivants : - des anticorps selon la revendication 13 ou 14;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et
- des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur susceptible d'être reconnu par un second réactif marqué.
40. Le kit pour le diagnostic in vitro du paludisme selon la revendication 38 ou 39, caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins une molécule peptidique choisie dans le groupe constitué par: les protéine CS, MSP-1 , MSP-3, LSA- 1.TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II et LSA-3.
41. Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme selon l'une quelconque des revendications 38 à 40, caractérisé en ce qu'il comprend également l'adjuvant SBAS2.
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