CA2382977A1 - Antigenes de plasmodium falciparum et leurs applications vaccinales et diagnostiques - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux antigènes de Plasmodium falciparum et à leurs applications vaccinales et diagnostiques. Plus particulièrement, la présente invention vise des molécules polynucléotidique s et polypeptidiques immunogéniques, des compositions les comprenant, et des méthodes de diagnostic et de vaccination du paludisme (malaria).

Description

,.

ANTIG~NES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET
LEURS APPLICATIONS VACCINALES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention La présente invention se rapporte à de nouveaux antigènes de Plasmodium falciparum et à leurs applications vaccinales et diagnostiques.
Plus particulièrement, la présente invention vise des molécules polynucléotidiques et polypeptidiques immunogénïques, des compositions les comprenant, et des méthodes de diagnostic et de vaccination du paludisme.
b) Brève description de l'art antériëur Le paludisme est une maladie provoquée par l'infection de parasites protozoaires appartenant aux apicomplexes de l'espèce Plasmodium et transmis par les femelles des moustiques du genre Anopheles. Malgré le fait que l'OMS a classé, depuis 1998, le paludisme parmi les trois maladies infectieuses d'intérêt majeur pour la santé publique mondiale au même rang que la tuberculose et le SIDA, il n'existe pas encore de vaccin efficace contre cette maladie.
Des études précédentes ont conduit à la mise en évidence de polypeptides antigéniques du stade pré-érythracytaire de !a maladie, notamment les polypeptides SALSA (pour Sporozoïte Liver Stage Antigen) décrits dans EP A-0407230, le LSA 1 (pour Liver Stage Antigen) décrit dans WO 92/13884 et LSA-3 décrit dans FR 2,735,478.
La présente invention est relative à de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques des stades pré-érythrocytaires et à leurs utilisations à titre de principe actif de vaccin anti-palustre ou dans des méthodes de diagnostics de la maladie.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La Demanderesse a identifié une série de 120 fragments d'ADN
génomique codant pour des protéines exprimées aux stades pré-érythrocytaires, c'est-à-dire au stade sporozoïte et/ou au stade hépatique. La caractérisation ~ .

2 initiale de cette série de clones a conduit à identifier l'antigène LSA-1, puis SALSA, puis STARP, puis LSA-3. Des travaux plus récents portant sur 10 fragments de la même banque de clones codant pour des stades pré-érythrocytaires a permis de fournir des précisions concernant 8 d'entre eux, 3 se sont avérés être des gènes déjà connus comme étant exprimés au stade érythrocytaire et les 5 autres comme des gènes nouveaux non décrits à ce jour, et dont l'expression aux stades pré-érythrocytaires a pu être confirmée.
Par ailleurs, les travaux réalisés en utilisant les cellules de volontaires protégés par sporozoïtes irradiés, celles de chimpanzés protégés par la même méthode et celles de chimpanzés comme d'Aotus trivirgatus, protégés par immunisation par l'antigène LSA-3 ont conduit à caractériser les réponses cellulaires à fort taux de sécrétion d'interféron-y, généralement associés avec une faible production d'anticorps, comme étant associées avec l'état de protection, et vice-versa.
Parmi les nouveaux gènes pré-érythrocytaires étudiés, deux d'entre eux, dénommés DG747 et DG772 possèdent plusieurs propriétés remarquables: ils génèrent des réponses cellulaires à taux élevé d'Interféron-y, détectées par ELISPOT chez des volontaires protégés par sporozoïtes irradiés, qui sont retrouvés également pour plusieurs régions de l'antigène LSA-3 mais qui sont 2.0 absentes pour 4 régions de l'antigène LSA-1, deux de SALSA, deux de STARP
et deux de la "CircumSporozoïte protein". Ces deux mêmes clones sont positifs également dans les mêmes tests chez les chimpanzés protégés par des sporozdites irradiés. Le profil de réponse différentielle entre les chimpanzés protégés et celles de chimpanzés ayant reçu des sporozoïtes irradiés à trop forte dose, et non protégés, est identique à celui enregistré avec la molécule LSA-3 qui est capable d'induire une protection. Ce pro~1 de réponse correspond, d'après les travaux réalisés chez le rongeur, à la capacité d'induire un recrutement cellulaire spécifique au niveau intra-hépatique. La séquence complète des deux gènes a été identifiée. Les protéines correspondantes ont une antigénicité
élevée chez les individus exposés au parasite en zone d'endémie (réaction chez 80%
des adultes de zone d'endëmie). Leur localisation en surface du sporozoïte et leur production au cours de la maturation intra-hépatique du parasite a été

3 confirmée par diverses méthodes biologiques. Leur immunogénicité chez l'animal sous forme de protéines recombinantes, ou sous forme de plasmides (immunisation génétique) a été démontrée.
Plus particulièrement, un des aspects de la présente invention concerne un polynuciéotide isolé ou purifié comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 60%, préférablement au mains 80% et plus préférabiernent au moins 95% d'identité avec la SEQ ID NO: 1 (DG747) ou la SEQ ID NO: 2 (DG772).
Un autre aspect de la présente invention concerne un polynucléotide isolé
ou purifié comprenant au moins 10 nucléotides consécutifs identiques à la SEQ
ID NO: 1 ou la SEQ ID NO; 2. L'invention vise également les polynucléotides isolés ou purifiés qui s'hybrident dans des conditions de fortes stringences avec un polynucléotide tel que dëfini précédemment.
Un autre des aspects de la présente invention concerne un polypeptide isolé ou purifié qui est codé par un polynucléotide tel que défini précédemment.
Dans un mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention présente au moins 60%, préférablement au moins 80% et plus préférablement au moins 95%
d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772). Selon un autre mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention comprend au moins 5 acides aminés consécutifs identiques à l'une des SEQ ID NOs: 3 à 8.
Encore dans un autre mode de réalisation privilégié, le polypeptide de l'invention présente au moins 40%, préférablement au moins 60%, plus préférablement au moins 80% et encore plus préférablement au moins 95% d'identité avec l'une des SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et 12. L'invention couvre également les polypeptides recombinants ou chimériques comprenant au moins un polypeptide tel que défini précédemment.
Un autre des aspects de la présente invention concerne un antigène isolé
ou purifié consistant en un polynucléotide ou en un polypeptide tels que définis précédemment.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un conjugué
antigénique constitué d'un polynucléotide et/ou d'un polypeptide tels que définis précédemment; et d'un support sur lequel lesdits polynucléotides/polypeptides sont adsorbés. Un te( conjugué peut avantageusement être utilisé pour

4 l'immunisation d'individus infectés ou susceptibles d'être infectés par le paludisme.
Un autre des aspects de la présente invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, préférablement humanisés, reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides, polypeptides et/ou conjugués définis précédemment. Un aspect connexe de la présente invention concerne ies compositions pharmaceutiques qui comprennent à titre de substance active un ou plusieurs de ces anticorps polyclonaux ou monoclonaux, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne un vecteur de clonage ou d'expression (tel que les plasmides, les cosmides et les phages) comprenant une séquence polynucléôtidique selon la présente invention.
L'invention couvre également les celCules hôtes comprenant un tel vecteur, et tout particulièrement les cellules E.Coli recombinantes déposées à la C.N.C.M. le Mai 2001 sous les numéros d'accession I-2671 et I-2672.
Un autre des aspects de la présente invention concerne une composition immunogène comprenant des polynucléotides, des polypeptides etlou des conjugués tels définis précédemment; et un véhicule pharmaceutique acceptable.
Un autre aspect connexe de la présente invention concerne un vaccin anti ;?0 palustre comprenant des polynucléotides, des polypeptides et/ou des conjugués tels définis précédemment; et un véhicule pharmaceutique acceptable.
Préférablement, les compositions et vaccins de la présente invention sont utilisées pour la fabrication de médicaments destinés à la prévention et/ou au traitement du paludisme.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne des méthodes et des kits (trousses) de diagnostic in vitro du . paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum. Selon un mode de réalisation privilégié, la méthode comprend les étapes suivantes:
a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps tels que définis précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés.
Selon un autre mode de réalisation privilégié, la méthode de diagnostic

5 comprend les étapes suivantes a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu etiou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec des polynucléotides, des polypeptides, etlou des tels que définis précédemment, afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins un desdits éléments et des anticorps éventuellement présents dans lédit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés.
Selon un mode de réalisation privilégié, le kit de l'invention pour le ~ 5 diagnostic in vitro du paludisme comprend les éléments suivants:
a) au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les polynucléotides, les polypeptides, et les conjugués tels que définis précëdemment;
b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison 2.0 entre un échantillon à tester et au moins une des éléments définis en (a);
et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'ëtre reconnus à leur tour par un réactif marqué.
~5 Selon un autre mode de réalisation privilégié, ie kit de l'invention comprend les éléments suivants - des anticorps tels que définis précédemment;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et 30 - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également

6 porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué.
Un des avantages majeur de 1a présente invention est qu'elle fournit de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques des stades pré-érythrocytaires du paludisme. Les molécules polynucléotidiques et polypeptidiques de l'invention possèdent plusieurs propriétés remarquables.
lls génèrent notamment des réponses cellulaires à taux élevé d'interféron-Y. Les résultats obtenus suggèrent également que les molécules polynucléotidiques et polypeptidiques de l'invention ont la capacité d'induire un recrutement cellulaire 0 spécifique au niveau intra-hépatique. L'invention fournit également des vaccins anti-palustre efficaces et des méthodes de diagnostics sensibles du paludisme.
De nombreux autre objectifs et~ avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description non limitative de l'invention qui suit.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
Les Figures 1A, 1 B, 1C et 1 D montre la liste des séquences nucléotidiques (SEQ ID NOs: 1 et 2) et en acides aminé (SEQ ID NOs: 3 et 4) de DG747 et DG772.
La Figure 1 E montre des séquences répétées dégénérés caractéristiques du clone DG747 (SEQ ID NOs: 5-8).
La Figure 2A montre la séquence du gène codant pour DG747 (SEQ ID
NOs:9 et 10) extrait de la base des données génome de clone 3D7 de Plasmodium falciparum (Gène PfB00155). En gris (~ : ' ~), la séquence correspondant au clone DG747. La différence avec la séquence ïssue de la souche T9.96 (positions 344, 357) est montrée en gras dans la séquence.
La Figure 2B montre la séquence du gène codant pour DG772 (SEQ (D
NOs:9 et 10) extrait de la base des données génome de clone 3D7 de Plasmodium falciparum. En gris (~'), la séquence correspondant au clone DG772.
La différence avec la séquence issue de la souche T9.96 (position 3612) est montrée en gras dans la séquence.
Les Figures 3.1(a) et 3.1(b) sont des représentations schématiques des protéines correspondantes au DG747 (a) et DG772 (b). Les flèches pleines . ,

7 indiquent la localisation des amorces utilisées pour l'étude de la conservation des fragments. Les flèches vides indiquent les amorces utilisées dans la réaction RT-PCR. 3.1 (a): (a partie hachurée indique la région répétitive. 3.1 (b): les deux régions consensus 5' cys et 3' cys sont indiquées sur fe gène. La partie en pointillés représente les régions transmembranaires et non-transcrites supposées.
Les Figures 3.2A, 3.2B, 3.2C et 3.2D montrent des IFATs des stades sporozoïtes et sanguins de P. faiciparum et des sporozoïtes de P. yoelü.avec les anticorps anti-DG747 ou anti-DG772. Fig. 3.2A, Fig. 3.2B: sporozoïte de P.
falciparum (A) ou P. yoelü (B) marqué au anti-747 ou anti-772; Fig. 3.2C, Fig.
3.2D: stade sanguin asynchrone marqué au anti-747 (C) ou au anti-772 (D); a, t, s: formes anneaux, trophozoïtes ou schizontes, respectivement.
Les Fïgures 3.3(a) et 3.3(b) montrent des Western blots de P. falciparum, P. yoelü et de P. berghei utilisant des anticorps anti-Hiss-747 (a) et anti-Hiss-772 (b). Ligne 1: P. faiciparum sporozoïtes; Ligne 2: P. falciparum stade sanguin formes anneaux; Ligne 3: P. faiciparum stade sanguin formes schizontes; Ligne 4: surnageant de culture asynchrone; Ligne 5: Globules. rouges humains; Ligne 6:
P. yoelü sporozoïtes; Ligne 7: P, yoelü stade sanguin; Ligne 8: P. berghei stade sanguin; 9: Globules rouges de souris.
Les Figures 3.4(a), 3.4(b) et 3.4(c) montrent sous forme de photographies des résultats de PCR d'ADN de 12 souches différentes avec des amorces spécifiques de DG747 3.4(a) et DG772 3.4(b). Le contr6ie, 3.4(c), est un gène constitutif, le PCNA [Kilbey, 1993 #519j. Les ADN utilisés sont issus des souches : NF54, B1, F32, D7, D25, D28, D41, D50, D51, H1, L1, Mad20, T9.96, PA (puits 1 à 14, de gauche à droite). Le puits 15 ne contient pas d'ADN. La taille du produit PCR, correspondant à celle attendue est indiquée à côté des flèches.
Les Figures 3.5(a) et 3.5(b) illustrent à l'aide de graphiques la prévalence des réponses humorales contre Hiss-747 (a) et Hiss-772 (b) dans deux groupes d'âge et dans deux zones d'endémie différente.
Les Figures 3.6(a) et 3.6(b) illustrent à l'aide de graphiques les réponses cellulaires contre Hiss-747 et His6-772 chez des humains et des chimpanzés immunisés avec des sporozoïtes irradiés. Fig. 3.6a: Détection par Elispot de la . A
sécrétion d'IFN-'y de cellules provenant d'humains immunisés par des sporozoïtes irradiés; Fig. 3.6b: réponses cellulaires des chimpanzés immunisés par des sporozoïtes irradiés, détectés par stimulation de prolifération de lymphocytes T et sécrétion d'IFN-y (par dosage et Elispots). 1.S.: Index de stimulation; UI:
Unités Internationales; LC: Leucocytes (cellules mononuclées du sang périphérique).
His6 729, PC-pGEX: Recombinants appartenant à la protéine LSA3; pGEX:
protéine GST. Les valeurs seuils sont indiquées par une droite horizontale sur le graphe.
Les Figures 3.7(a) et 3.7(b) illustrent à l'aide de graphiques la distribution '10 des isotypes d'IgG dans les réponses humorales contre Hiss-747 et Hiss-772 d'individus exposés différentiellement au paludisme. ISS: Volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradiés; SHI: Sérum hyper-immun; Transfusion: Sérum de personnes ayant contracté un paludisme par transfusion de sang infecté. Les taux de réponses détectés en ELISA sont représentés par rapport aux taux d'IgG
total obtenus. L'écart type est indiqué sur le graphique.
Les Figures 3.8(a) et 3.8(b) illustre à l'aide de graphiques les réponses humorales de souris immunisées avec quatre formulations de protéines recombinantes. Fig. 3.8a: réponses anti-747; Fig. 3.8b: réponses anti-772; SB:
avec l'adjuvant SBS2A; micro: recombinant adsorbé sur des microparticules;
IFA:
2:0 Adjuvant incomplet de Freund; Vi: Sous forme d'ADN dans le vecteur VR1020 en PBS.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur la mise en évidence de nouvelles molécules polynucléotidiques et polypeptidiques spécifiques du stade pré-érythrocytaire du paludisme et à leurs utilisations à titre de principe actif de vaccin anti-palustre ou dans des méthodes de diagnostique de la maladie.
Plus particulièrement, l'invention vise des polynucléotides ayant une séquence nucléotidique d'au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou 200 nucléotides consécutifs et ayant au moins 60%, 65%, 70%, 75% préférablement 80%, 85%, 90% et plus préférablement au moins 95%, 97% ou même 100%
d'identité avec la SEQ. ID NO: 1 ou NO 2. D'autres molécules selon l'invention s'hybride dans des conditions de fortes stringences avec les séquences nucléotidiques ci-dessus, et plus particulièrement avec les SEQ. ID NOs: 1 et/ou NO 2. A titre d'exemple non-limitatif de conditions de fortes stringences Pon retrouve la méthode suivante:
a) pré-hybridation et hybridation à 68°C dans une solution contenant:

SSPE (1X SSPE = 0.18 M NaCI, 10 mM NaH2P04); 5X solution de Denhardt; 0.05% (w/v) dodecyl sulfate de sodium (SDS); et 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon;
b) deux lavages à température ambiante pendant 10 min en présence de 2X SSPE et de 0.1 % SDS;
c) un lavage à 60°C pendant 15 min en présence de 1X SSPE et 0.1%
SDS; et d) un lavage à 60°C pendant 15 min en présence de 0.1X SSPE et 0.1%
SDS.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui dérivent des séquences nucléotidiques ci-dessus mentionnés et préférablement les polypeptides ayant au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou 200 acides aminés consécutifs et au moins 60%, 70%, 80%, 85% et plus préférablement au moins 90%, 95%, 97% ou même 100% d'homologie avec l'une des séquences c.0 choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 â 8, 10 et 12.
D'autres molécules selon l'invention contiennent au moins 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, ou même 200 acides aminés consécutifs présentant au moins 60%, 70%, 80%, 85% et plus préférablement au moins 90%, 95%, 97% ou même 100% d'identité
avec les SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et 12.
2,5 II est bien connu dans le domaine comment déterminer les pourcentages d'homologie et d'identité entre différentes séquences. Ä titre d'exemple, une méthode d'analyse d'alignement de séquences nucléotidiques et peptidiques selon l'invention est avantageusement le programme GAP GCGT"" (Genetic Computer Group) du manuel de programmation UN1X'''~" (Wisconsin Sequence 30 Analysis PackageT""), algorithme de Needfeman et Wunsch. Les paramètres utilisés sont les paramètres par défaut ou les paramètres suivants: pour une comparaison de séquences de nucléotides: "gap penalty" = 50; "gap extension . .
penalty": 3; et pour une comparaison de séquences d'acides aminés: "gap penalty" = 5; "gap extension penalty": 0.30.
Les peptides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique 5 mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après.
Les molécules de l'invention peuvent être utilisées telles quelles ou être modifiées (conjugués chimiques, protéine de fusion) si nécessaire. Par exemple, '10 on peut envisager des modifications (chimiques ou nucléotidiques ou peptidiques) permettant aux nucléotides/peptides de franchir certaines barrières biologiques, de montrer une meilleure solubilisation, de faciliter leur incorporation dans des formes galéniques particulières comme par exemple des liposomes ou des microparticules. II convient d'ailleurs de remarquer à ce propos que les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynuclëotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN
codant pour les peptides de l'invention, suivi de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture.
L'invention concerne donc également tout vecteur (de clonage et/ou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Plus particulièrement, l'invention vise les cellules E. Coli recombinante contenant un insert correspondant aux polynucléotides définis par les SEQ ID

NOs: 1 et 2. Plus préférablement les cellules E. Coli sont celles qui ont été
déposée à la C.N.C.M. le 23 Mai 2001 sous les numéros d'accession I-2671 et (-2672. Brièvement, ces cellules ont été obtenues par transformation d'un plasmide contenant soit un insert correspondant aux polynucléotides définis par la SEQ ID NO: 1, soit un insert correspondant aux polynucléotides définis par la SEQ ID NO:2. dans la souche E. Coli DhSa. Chacun des plasmides a été
obtenus à partir d'un phage 7~gt11 recombinant contenant l'insert. Une PCR à
été
effectuée avec des amorces flanquantes à l'insert et cet insert amplifié a été
digéré avec EcoR1 et sous-cloné dans le vecteur pTreHiss (Invitrogen} dans les sites de EcoR1.
L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de peptides dans les cellules d'un h6te, notamment l'humain, est connue et ne sera pas décrite plus en détail. II peut être avantageux d'utiliser des vecteurs incorporant des séquences capables d'augmenter l'immunogénicité des polynucléotides/polypeptides de la présente invention, telles que les séquences CPG, le gène du GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) ou des gènes des cytokines. Les constructions spécifiques dépendent évidemment de l'hôte, de l'épitope et du vecteur retenu.
Les peptides de la présente invention et les polynucléotides les codant peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonal ou monoclonal capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un peptidelpolynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuons cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975}, 262:495-497).
Dans un mode de réalisation privilégié de l'invention, au moins une portion des peptides immunogéniques/pofynucléotides selon l'invention est conjuguée à
un support sur lequel elle est absorbée ou fixée de façon covalente ou non-covalente à son extrémité C et/ou N-terminale. Le support peut être constitué
de molécules porteuses (naturelles ou synthétiques), physiologiquement acceptables et non toxiques. Ces ~ molécules porteuses peuvent permettre notamment d'augmenter fimmunogénicité des peptides . de l'invention par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portés par la molécule porteuse et le peptide. A titre d'exemple de molécules porteuses, on mentionnera des protéines naturelles telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalbumine, des sérums albumines, des hémocyamines, le PPD (purified protein derivative) de la tuberculine, etc. Ä titre de supports macromoléculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine). Ä titre de supports hydrocarbonés ou lipidiques, on mentionnera les acides gras saturés ou insaturés. Le support peut également prendre la forme de liposomes, de particules et microparticules, de vésicules, de microsphères de billes de latex, de polyphosphoglycans (PGLA), ou de polystyrène.
L'invention porte aussi sur des compositions vaccinales/thérapeutiques (médicament) comprenant des peptides/polynucléotides, des conjugués et/ou des anticorps polyclonaux ou monoclonaux tel que décrits précédemment, et un véhicule pharmaceutique acceptable. L'invention se rapporte aussi à des compositions immunogènes capables d'induire une protection par une infection d'épreuve par Plasmodiums, aussi bien in vivo que in vitro et, de façon préférée, un protection par une infection d'épreuve par Plasmodium falciparum.
Préférablement, les compositions selon l'invention permettent la production d'interféron-y par des leucocytes de sujets immunisés par des sporozoïtes irradiés et/ou l'obtention d'une réponse humorale IgG de type lgG1, IgG2, IgG3 etiou IgG4.
Ces compositions peuvent être avantageuses dans le but d'être administrés in vivo pour le traitement ou la prévention du paludisme chez l'humain. Bien entendu, l'utilisation de compositions à base d'anticorps nécessite généralement que ceux-ci soient compatibles avec l'administration à l'être humain. II peut notamment s'agir d'anticorps humanisés par des techniques connues ou directement exprimés in situ à partir de la séquence d'ADN comme par exemple la technique décrite dans Ren EC, Ce¿lular and Molecular approaches to developping human monoclonal antibodies as drugs (1991), Ann.
Acad. Med. Singapore, 20:66-70.

Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée.
Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus particulièrement destinées aux injections dans la circulation sanguine chez l'humain.
Les compositions de l'invention peuvent comporter également des composants augmentant ou susceptible d'augmenter l'immunogénicité des peptides, notamment d'autres peptides immunogènes, des adjuvants d'immunité
spécifiques ou non tels que l'alun, le QS21, l'adjuvant de Freund, l'adjuvant SBA2, la montanide, des polysaccharides ou des composés équivalents.
La présente invention concerne de plus des compositions destinées à être administrées afin d'exprimer in situ les peptides décrits précédemment. Par exemple, en injectant l' "ADN nu" codant pour les peptides immunogéniques de l'invention, cette injection conduit, dans un certain nombre de cas, à
l'expression du peptide codée et à une rëponse immunitaire contre ledit peptide. On pourra également utïliser des systèmes d'ADN nu mais comportant leur propre système d'expression ou des vecteurs d'expression tel que décrit précédemment. Les vecteurs d'expression sont susceptibles, dans certains cas, d'améliorer l'activité
des peptides exprimés. Les systèmes de vaccination mettant en oeuvre des séquences d'ADN sont connus et sont déjà largement décrits dans la littérature.
Des exemples de vaccination mettant en oeuvre des séquences d'ADN sont décrits dans la demande internationale WO 95/111307 et dans la publication de Bot et al. (DNA immunization of newborn mice with a plasmid expressing .
nucleoprotein of Influenza virus (1996), Viral Immunol., 9:207-210).
L'invention porte aussi sur des méthodes de diagnostic in vifro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode comprend les étapes suivantes:
a) mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps tel que décrit précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode diagnostique comprend les étapes suivantes:
a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'ëtre infecté par Plasmodium falciparum avec des molécules polynucléotidiques/polypeptidiques telles que décrites précédemment afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins une desdites molécules et des anticorps éventuellement présents dans ledit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés.
'15 L'invention a aussi pour objet des kits (trousses) pour le diagnostique du paludisme chez un individu. Selon un mode de réalisation de l'invention, le kit comprend les éléments suivants:
a) au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les molécules polynucléotidiques; les molécules polypeptidiques et les ~!0 conjugués tels que décrits précédemment;
b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins une des molécules définies en (a); et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps ~5 produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit comprend les éléments suivants:
~~0 - des anticorps tels que décrits précédemment;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison, ces réactifs pouvant également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué
5 Bien qu'à travers le mémoire descriptif de la présente invention on utilise le terme "peptide" et "polypeptide", il est entendu que l'invention ne se limite pas aux composés formés par l'union d'un nombre limité d'acides aminés. En effet, la souplesse des technologies recombinantes permet de réaliser des protéines comportant une pluralité d'épitopes identiques ou différents et susceptibles 10 d'améliorer l'activité immunogénique du produit final. Ainsi la présente invention couvre également les polymères immunogéniques comprenant entre deux et dix peptides choisis parmi les polypeptides définis précédemment. De même, la présente invention inclus les oligonucléotides ayant une séquence nucléotidique codant pour des oligonucléotides incorporant un ou plusieurs polynucléotides tels 15 que définis précédemment.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer l'étendue d'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectués sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puissent utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la ~?5 présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
1y INTRODUCTION
1.1 Historique du paludisme Le paludisme est une maladie provoquée par l'infection de parasites ~i0 protozoaires appartenant aux apicomplexes de l'espèce Plasmodium et transmis par les femelles des moustiques du genre Anopheles. Les efforts soutenus et le programme d'éradication entamé dans les années 50, financé par l'OMS ont permis de limiter les zones où la maladie se propageait et de diminuer le nombre de personnes infectées. Depuis, la baisse d'efficacité des moyens de lutte contre le parasite a provoqué une augmentation des cas de paludisme par rapport à il y a 20 ans. Aujourd'hui le paludisme demeure concentré dans la ceinture sub-tropicale où entre 300 et 500 millions de cas cliniques sont recensés annuellement, dont au minimum 3 millions succombent en majorité à cause de l'infection par le P. falciparum. Suite à l'apparition et à l'extension d'une résistance globale aux seuls médicaments efficaces, et parce que les régions affectées sont en extension, l'OMS a classé, depuis 1998, le paludisme parmi les trois maladies infectieuses d'intérêt majeur pour la santé publique mondiale au même rang que la tuberculose et le SIDA.
La description de l'infection paludéenne, dont tes signes cliniques sont très caractéristiques, peut être retrouvée dans des écrits des civilisations les plus anciennes, tels que le Nei Ching, grand répertoire médical pour l'empereur chinois Huang Ti (2700 av. J. C.), des tablettes Mésopotamiennes (2000 av. J.
C.), des papyrus Égyptiens (1500 av. J. C.) et des écrits Védiques (1500-800 av.
J. C.). Une partie du « livre des épidémies » d'Hippocrate (460-370 av. J. C.) a été consacrée à la description détaïllée de fièvres tertiaires ou quaternaires où
est mentionnée aussi une relation entre des splénomégalies et la proximitë des ;?0 zones marécageuses. D'ailleurs, le terme paludisme désigne une fièvre issue des zones marécageuses (L. palude = marécage), ce qui est aussi reflété par le terme de malaria (I. mall'aria) probablement introduit par Sansovino en 1560 pour décrire le « mauvais air » issu des marécages. Le drainage de ces zones a été
un des seuls moyens de contrôle du paludisme connu avant la découverte de ;?5 l'agent infectieux. Malgré la connaissance des signes cliniques, le parasite causant la maladie n'a été découvert qu'à la fin du 19e siècle.
En 1880 Charles Louis Alphonse Laveran a observé l'exflagellation de microgamètes et des hématies altérées dans le sang de {Laveran, 1880), et if a associé ces formes avec la maladie. Ses conclusions ont été controversées et ne 30 furent acceptées par d'autres, en particulier par l'importante école italienne, que 5 ans plus tard. Le mode de transmission de la maladie est resté inconnu encore 12 ans. Patrick Manson avait en 1877 démontré que le nématode de la filariose (Elephantiasis) était transmis par un moustique. II était convaincu que le paludisme suivait un parcours semblable. II a conseillé à Ronald Ross d'entamer des recherches à ce sujet et ce dernier a décrit en 1897, pour la première fois, des oocystes chez des moustiques ayant été nourris sur des humains infectés.
Puis, à l'aide de Plasmodium d'oiseaux, il a pu décrire le cycle entier du parasite chez le moustique. Ce cycle a été confirmé, en 1898, pour les espèces plasmodiales de l'homme par les chercheurs italiens menés par Battista Grassi.
On a longtemps cru qu'après inoculation par le moustique, le sporozoïte envahissait directement le globule rouge du mammifère hôte, initiant ainsi le cycle sanguin asexué et sexué. Un cycle exo-érythrocytaire fut décrit dès 1908 chez des plasmodies d'oiseaux par H. de Beaupaire Aragao qui démontra le développement de formes atypiques, dans des cellules endothéliales et des macrophages, capables de libérer des formes envahissant les globules rouges et de se transformer en formes typiques pigmentées du parasite. Toutefois on a cru que le cycle tissulaire était une forme particulière de ces espèces plasmodiales.
Ce n'est qu'en raison des observations faites au cours d'infections paludéennes induites et suivies étroitement chez des individus (comme la malariothérapie des années 1920-50) que (a présence d'un stade supplémentaire tissulaire a été
postulée puis activement recherchée. Les formes pré-érythrocytaires des parasites de primates et d'humains n'ont été découvertes qu'en 1948 lorsque H.E. Shortt et P. C. C. Garnham ont décrit des formes hépatiques issues d'inoculations de sporozoïtes de P. cynomolgi (proche de P. vivax) chez le singe rhésus (Shortt and Garnham, 1948). En 1951, les mêmes stades ont été décrits pour P. falciparum (Shortt et al., 1951 ) dans une expérience remarquable où
une biopsie de foie a été prélevé chez un volontaire préalablement inoculé avec des millions de sporozoïtes. Toutefois les recrudescences dues à P. vivax ou à P.
ovale n'étaient pas expliquées, et on a émis l'hypothèse d'un cycle exo-érythrocytaire « secondaire ». Ce n'est que beaucoup plus tard que ce phénomène fut démontré expérimentalement. Ainsi, un stade « dormant » de la forme hépatique, l'hypnozoïte, a été décrit en 1980 (Krotoski et al., 1980) pour P.
cynomolgi, l'équivalent pour le primate de P. vivax. Cette forme est responsable des rechutes après une longue période d'absence de parasite dans le 1$
sang/d'exposition aux parasites, qui sont caractéristiques de P. vivax et P.ovale.
Récemment, un stade supplémentaire, le mérophore, une forme provenant des formes sanguines, a été observé dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris infectées par les Plasmodium mutins (P. yoelü, P. chabaudi et P.
vincke~~
(Landau et al., 1999). Cette étape du cycle reste encore à être décrite dans les espèces plasmodiales humaines.
Le cycle du parasite, comme il est conçu aujourd'hui est représenté dans la figure 1 (Les parties entre parenthèse sont des formes décrites pour d'autres espèces de Plasmodium, mais pas pour P. falciparum).
1.2 Les moyens de lutte contre l'extension du paludisme : nécessité du développement d'un vaccin Les deux découvertes de l'agent causal de la maladie et du vecteur de la maladie ont permis dès le début du 20e siècle d'élaborer des moyens de défense rationnels contre le paludisme en attaquant le parasite chez l'hôte vertébré
par des médicaments ou en ciblant le moustique vecteur soit avec des larvicides, soit avec des insecticides, soit par l'utilisation de moustiquaires. Le succès de l'élimination de la maladie dans les zones tempérées après la 2é"'e guerre mondiale, a mené vers une mise en place d'un programme d'éradication du paludisme qui a culminé dans les années 60 où le DDT a été le principal outil contre les moustiques et la chloroquine a été la principale drogue contre le parasite. La taille des territoires endémiques ciblés a ainsi été réduite (quasi éradication dans les zones tempérées) et le nombre de personnes affectées par la maladie a initialement diminué. Cependant les succès dans les zones tropicales furent de courte durée. Le nombre de malades n'a pas cessé de croître d'une part à cause de l'augmentation démographique, d'autre part en raison de l'apparition de résistances aux insecticides et aux drogues disponibles.
L'apparition de ces résistances a nécessité de s'orienter vers d'autres moyens de lutte. L'existence d'une immunité naturelle induite par l'exposition aux parasites et l'observation que le transfert passif d'immunoglobulines de personnes immunes diminue la parasitémie ainsi que l'immunisation efficace et stérilisante par des sporozoïtes atténués par irradiation ont rendu raisonnable l'argument d'un vaccin contre le paludisme, dont le développement constitue alors une priorité de santé publique au niveau mondial.
1.3 A la recherche de l'immunité salvatrice L'immunité naturelle contre le paludisme est caractérisée par un développement très lent et ie fait qu'elle n'aboutit pas à une protection stérilisante. Dans les zones hyperendémiques, l'acquisition de l'immunité
naturelle contre les stades érythrocytaires se manifeste chez les enfants d'abord par une tolérance au parasite (immunité anti-toxique) puis avec l'âge par une diminution de la charge parasitaire dans le sang (immunité anti-parasitaire).
Ces observations, faites au cours des études épidémiologiques ont été
confirmées par des infections expérimentales. La malarariothérapie appliquée aux personnes atteintes de neurosyphüis (Boyd and Coggeshall, 1938; Ciuca et al., 1943; James, 1936), a permis de définir des paramètres qui interviennent dans l'acquisition de l'immunité dans des expériences étroitement contrôlées.
II a ainsi été montré que l'immunité acquise était d'une part dépendante de l'espèce et de la souche et d'autre part différait en fonction du stade du cycle parasitaire infectant. Jusqu'à présent, les mécanismes précis de l'immunité anti-paludéenne restent à élucider.
Du fait que les signes cliniques et la transmission sont uniquement dus aux stades sanguins et que ceux-ci sont les plus accessibles aussi bien in vitro qu'in vivo, la plupart des études vaccinales ont concerné ces stades. Une trentaine d'antigènes exprimés dans les parasites érythrocytaires ont été
identifiés, particulièrement par des anticorps monoclonaux et considérés en tant que candidats vaccins. Toutefois les essais d'induction d'immunité protectrice par les rares antigènes testés chez l'homme sonf demeurés infructueux jusqu'à
présent.
La première immunisation avec les stades pré-érythrocytaires a été tentée sans succès par les frères Sergent en Algérie (Sergent and Sergent, 1910). La capacité de protéger de façon stérilisante (absence de toute parasitémie sanguine) n'a été obtenue que par l'immunisation avec des sporozoïtes atténués par irradiation. Cette approche fut initiée par des études chez l'oiseau avec des sporozoïtes irradiés par des rayons U.V. (Mulligan et al., 1941), et a été
reprise 20 ans plus tard avec des plasmodies de rongeur en utilisant des sporozoïtes irradiés par des rayons X et plus tard des rayons y, dont la dose peut être contrôlée plus facilement (Nussenzweig et al., 1967; Richards, 1966) ;
l'immunité
5 peut être maintenue par un rappel de sporozoïtes non-atténués (Orjih et al., 1982). Chez l'homme, une telle protection a aussi été obtenue (Clyde, 1975;
McCarthy and Clyde, 1977), toutefois elle n'est induite qu'après un très grand nombre d'inoculations par des sporozoïtes irradiés si bien qu'une telle procédure vaccinale ne peut être appliquée à grande échelle.
10 Pendant longtemps, on a cru que la protection était corrélée avec un phénomène observé lorsque l'on incube les sporozoïtes avec du sérum immun, la CS (Circum sporozoïte) précipitation (Vanderberg et al., 1969). La protéine majoritaire reconnue par ce sérum, la protéine CS, a donc été considérée responsable de cette immunité. Depuis elle a été à l'origine de multiples études 15 vaccinales dans beaucoup de modèles expérimentaux. Or jusqu'à présent aucune de ces études n'a pu reproduire une immunité aussi solide que celle induite par des sporozoïtes irradiés.
Une évaluation critique des résultats expérimentaux précédents a mené à
postuler que c'était le stade hépatique et non le sporozoïte qui était à
l'origine de 20 immunité stérilisante (Druilhe and Marchand, 1989). L'indice principal était le fait que la protection ne pouvait étre induite que par l'inoculation des sporozoïtes viables, par voie intraveineuse, capables d'envahir un hépatocyte et de s'y développer, et que les formes hépatiques issues de sporozoïtes irradiés persistaient (Ramsey et ai., 1982). De plus, une élimination des stades hépatiques provoquait une susceptibilité aux infections par des sporozoïtes chez des animaux préalablement protégés (Londono et al., 1991; Scheller and Azad, 1995).
Le stade hépatique possède des caractéristiques uniques. L'hépatocyte est une cellule nucléée métaboliquement très active et exprime des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité. La schizogonie hépatique entraîne la formation d'entre 10.000 et 30.000 rnérozoïtes alors que 4 à 32 mérozôites sont libérés par un schizonte sanguin. Les mérozoïtes issus de ces deux stades ont des différences morphologiques, mais on ne sait pas s'il existe des différences fonctionnelles ou moléculaires, car seuls les mérozoïtes sanguins ont pu être extensivement étudiés.
Du fait que dans le foie, seuls quelques hépatocytes sont infectés et qu'in vitro, les 'techniques de culture restent délicates et difficiles, ceci a constitué un obstacle majeur au développement des connaissances sur le stade hépatique et à la recherche d'antigènes exprimés à ce stade.
1.4 Criblage d'antigènes spécifiques de stade La première stratégie pour établir l'expression spécifique de stade est la génération de banques d'ADN complémentaires à partir d'ARN messagers des différents stades. Ceci a été accompli plusieurs fois aux stades sanguins (Chakrabarti et al., 1994; Watanabe et al., 2001) et plus récemment une fois au stade sporozoïte (Fidock et al., 2000). Cependant, cette approche n'est pas 1b possible pour le stade hépatique des plasmodies humains. Un autre moyen est la génération d'anticorps spécifiques dans des modèles animaux. Ceci est facile aux stades érythrocytaires mais. pour le stade hépatique, plusieurs tentatives ont échoués, car les injections de stades hépatiques de P. falciparum n'ont induit que très peu d'anticorps dans les souris. Une dernière approche est le criblage immunologique basé sur l'utilisation d'anticorps d'individus naturellement immunisés. Cette approche a permis de mettre en évidence pour la première fois que d'autres antigènes que la CS étaient présents à la surface du sporozoïte (Galey et al., 1990).
9.5 Stratégie élaborée dans le laboratoire d'identification d'antigènes exprimés aux stades pré-érythrocytaires Afin de contourner la difficulté de criblage aux stades pré-érythrocytaires, une stratégie de criblage d'antigènes de P. falciparum potentiellement exprimés dans les stades sporozoïte et hépatique a ëté développée (Marchand and 3G Druühe, 1990).
Le principe était de chercher des individus chez lesquels la réponse immune prédominante était contre les stades pré-érythrocytaires. Nous avons ainsi obtenu des sérums d'individus (sérums PM) vivant en zone d'endémie depuis plus de 20 ans et n'ayant jamais eu d'accès cliniques car ils étaient en permanence sous traitement prophylactique à la chloroquine (schizonticide efficace contre les stades sanguins, mais sans effet sur les stades hépatiques).
Les sérums correspondants ne reconnaissaient en effet que très faiblement des stades sanguins en Western Blot et en IFI (titres inférieurs à 1/2x0), tandis que les titres contre les stades sporozoïtes et hépatiques du parasite étaient compris entre 1/3200 et 1/6400 en IFl et ils marquaient plusieurs polypeptides sur des extraits protéiques de sporozoïtes de P. falciparum; il s'agissait donc de sérums contenant des anticorps spécifiques des antigènes exprimés aux stades pré-érythrocytaires.
Ces sérums ont été utilisés pouf- cribler une banque génomique de P.
falciparum (construite par Odile Merçereau Puijalon). L'ADN génomique issu du clone parasitaire T9-96 a été méthylé et digéré par la Dnase 1, et les fragments d'une taille allant de 200 à 2500 paires de bases ont été introduits dans le site EcoR1 du phage ~,gt11 (Guérin-Marchand et al., 1987).
Parmi les 7 millions de fragments d'ADN générés, 2000 clones produisant un antigène recombinant reconnu par des sérums hyper immuns (SH1) d'individus immuns vivant en zone d'endémie, ont ensuite été criblés avec les sérums PM. 120 clones ont ainsi été sélectionnés et l'expression de stade des antigènes correspondants a été déterminée par des tests d'IFIs; avec des anticorps humains immunopurifiés sur chaque protéine recombinante, sur les sporozoïtes, les stades hépatiques et les stades sanguins de P. falciparum, P.
yoelü et parfois avec P. berghei et P. vivax.
~'5 Le premier antigène à être étudié et contre lequel les réponses humorales étaient les plus élevées dans plusieurs sérums d'individus vivant dans une zone d'endémie était le Liver Stage Antigen 1, LSA-1 (Guérin-Marchand et al., 1987). II
demeure le seul antigène caractérisé à ëtre exprimé uniquement au stade hépatique.
0 ~ A la suite du LSA-1, 3 antigènes STARP, SALSA et LSA-3 ont été
sélectionnés à partir de divers critères et caractérisés au niveau moléculaire (Bottins et al., 1996; Daubersies et al., 2000; Fidock et al., 1994a), et immunologiquement par L. Benmohammed , K. Brahimi, J.P, Sauzet et B.
Perlaza. (BenMohamed et al., 1997; Perlaza et al., 1998; Sauzet et al., 2001 ).
Ces antigènes sont exprimés aussi bien à la surface du sporozoïte qu'au stade hépatique.
Le LSA3 est l'unique antigène reconnu différentiellement par des sérums de volontaires ou de chimpanzés protégés par l'immunisation avec des sporozoïtes irradiés. II est le seul à avoir induit une protection stérilisante et de longue durée chez des chimparizés (Daubersies et al., 2000), et sera bientôt testé dans des essais cliniques de phase I et II.
2) MATERIEL ET METHODES
2.1. Techniques de biologie moiéculairé
2.1.7. Souches bactériennes DHSa: supE44 alacU169(~80 IacZeM15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1.
1.5 2.1.2. Souches de parasites:
NF54 issue d'un isolat de malade européen infecté en Afrique (ATCC
MRA151 ) (Walliker et al., 1987).
3D7, la souche référence utilisée dans le projet génome, est un clone issu 29 de la souche (ATCC MRA151) (Vllalliker et al., 1987).
T9.96, une souche provenant d'un patient thaïlandais ATCC : MRA153 , (Thaithong et al., 1984) Pour les tests de polymorphisme, des souches distinctes ont été
employées: B1 (Brésil); F32, D7, D28, D50 issues de la Tanzania; D28 du 25 Sénégal, D41 de l'Inde, D51 de Myanmar, L1 de Libéria, H1 de Honduras, Mad20 de Papua New Guinea, et PA de Palo Alto, d'Amérique du Sud Ouest.
(Stricker et al., 2000).
Les sporozoïtes sont issues de la souche NF54 et obtenus par passage dans des Anopheles Gambiae REF

2.7.3. PCR â partir d'extraits de pliages ou d'ADN de pliages Le Expand High Fidelity KitT"" (Mannheim Boehringer, Allemagne) a été
utilisé comme indiqué par le fournisseur avec 2 mM de MgCl2, 3.5 unités de Taq polymérase, 0.2 mM de desoxyribonucléotides (dNTP), 50 nM des amorces 21 D
en 5' (CCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGG; SEQ ID NO : 13) et 26D en 3' (GGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGG; SEQ ID NO : 14) et 2 girl d'ADN purifié ou d'extrait de pliage. La réaction a comporté une dénaturation initiale de 2 minutes à 94 °C, suivie par 35 cycles consécutifs de 15 secondes de dénaturation à 94 °C, 30 secondes d'hybridation à 50 °C, et 2 minutes d'élongation à 68 °C. Le '10 circuit cyclique a été suivi par une incubation à 68 °C pendant 5 minutes.
2.1.3.1 Sous-clonage dans les vecteurs histidine. pNAK et Toao Selon la qualité du produit d'amplification des pliages, trois procédures ont été employées:
Les produits PCR présentant un smear ou un rendement très petit et étant de plus petite taille quasi impossible à détecter en digérant l'ADN du pliage correspondant, ont été clonés par l'intermédiaire d'un vecteur permettant un clonage direct du produit PCR sans digestion successive d'une enzyme de restriction à l'aide du kit de TopoTA CloningT"" (Invitrogen, Les Pays-Bas).
Le clonage Topo a aussi été effectué pour les fragments dont nous voulions uniquement déterminer la séquence.
Les produits PCR de tailles inférieures à 1 Kbp ont été digérés, précipités à l'éthanol, et resuspendus dans la moitié du volume initial d'H20, puis digérés par 10 U de l'enzyme de restriction EcoR1, pendant 1 heure à 37 °C, tirés sur un gel d'agarose à 2 %, purifiés sur gel par la procédure de gel extraction kit de Qiagen, donnant un volume de 50 p1.
Les produits PCR peu abondants de grande taille (supérieurs à 1000 bp) ont été isolés à partir de l'ADN de pliage purifié par une digestion avec EcoRl, puis par extraction de l'insert du gel d'agarose.

2.1.3.2 Étude du polymorphisme du gêne dans des souches parasitaires différentes.
Les amorces suivantes ont été utilisées pour identifier les polymorphismes en taille de régions spécifiques correspondant aux antigènes étudiés.
5 747-1: AAAAGTGATGATAGAAATGCTTGTG (5') ; SEQ ID NO : 15 747-2: TTTTGTTGATCTTACTTATTTCACC (3') ; SEQ ID NO : 16 772-1: CGGAATCAGGTTTAAATCCAAC (5') ; SEQ ID NO : 17 772-2: AGATCGTTTTTCATCAGGGGG (3') ; SEQ ID NO : 18.
La réaction cyclique a été effectuée avec un programme comportant une 10 étape initiale d'une dénaturation à 04°C pendant 15 secondes, suivie par 39 cycles comprenant une dénaturation à 94°C pendant 2 minutes, une hybridation à 52 °C pendant 1 minute et une élongation à 72°C pendant 2 minutes. Une étape de 5 minutes à 72°C a terminé la réaction.
Les PCR ont été effectuées sur un Crocodile IIIT"' de Appligène. Les 15 produits ont ensuite été analysés sur gel d'agarose.
2.7.4. Purification d'ADN
2.1.4.1 Pour les analyses de recombinants Les colonies positives en PCR ont été inoculées dans 3 ml de milieu 20 contenant l'antibiotique correspondant au vecteur utilisé (100 pg/ml ampicilline pour Topo et Histidine, 20 pg/ml kanamycine pour le vecteur Vical) et 2 ml d'inoculum ont été utilisés dans la préparation d'ADN plasmidique avec le QiagenT"" Miniprep Kit. L'ADN obtenu a successivement été digéré avec les enzymes de restriction utilisées dans le clonage et soumis à une électrophorèse 25 sur gel d'agarose, afin de détecter l'insertion du fragment.
2.1.4.2 Pour l'isolement de fragments:
100 ml de milieu Luria Broth supplémenté en antibiotique approprié ont été inoculés avec 1 colonie de bactérie comportant le recombinant, et incubé à
37 °G sur la nuit dans un bain thermostaté en agitation vigoureuse. Le lendemain, la culture bactérienne a été récoltée et l'ADN plasmique purifié
comme décrit (Qiagen maxiprepT"", Qiagen, Allemagne).

2.1.4.3 Pour l'immunisation de constructions ADN nu Afin d'éliminer les endotoxines, qui sont présents dans les bactéries et qui peuvent entraîner des réponses non spécifiques lors des immunisations de souris, l'ADN des constructions a été purifié à partir de 2 I de culture de bactéries recombinantes, par Qiagen EndoFree Plasmid GigaT"" kit (Qiagen, Allemagne).
2.1.4.4 Pour la aurification d'ADN de phases recombinants Les phages ont été réampl~és sur des boîtes d'agarose de LB, en '10 déposant 5 p1 sur du Topagar pris avec 200 NI d'inocuium de Y1090, et en laissant à 37 ° C sur la nuit.
Ensuite, une quantité plus grande a été produite en culture liquide.
D'abord, une plage piquée sur la boîte a été incubée avec 200 NI d'inoculum de Y1090, laissée à 37 °C avec agitation pendant 15 minutes . Ensuite, 5 ml de milieu sans antibiotique supplémenté avec 10 mM de MgS04 a été ajouté, et la culture laissée en agitation pendant 4 heures, jusqu'à l'apparition de lyse.

de Chloroforme a été ajouté, et le tout centrifugé à 7000 g pendant 10 minutes.
Après centrifugation, le surnageant libéré des débris cellulaires a été
récupéré.
Ce stock a été utilisé dans la production de 500 ml de phage en culture liquide 10 l'équivalent de 7.5 108 pfu (unités formant des plaques) à été ajouté à 500 p1 de cellules d'une culture inoculée sur la nuit de Y1090, et 500 NI de 10 mM
MgCI2/CaCl2. Tout a été incubé à 37 °C 15 minutes, et ajouté à 500 ml de milieu LB sans antibiotique. La lyse des bactéries observée par l'apparition de filaments dans la culture a été suivie jusqu'à la lyse totale (4-5h). Ensuite, la culture a été
centrifugée à 6000 g pendant 15 minutes à 4 °C, le surnageant récupéré, et stocké à 4 °C sur la nuit.
Le lendemain, la purification de l'ADN a été entreprise avec le Lambda Maxi KitT"" (Qiagen, Allemagne) avec des ajustements en début de protocole à
cause du volume plus grand de surnageant de départ. Le culot final a été
resuspendu dans 500 p1 de tampon TE.

2.1.4.5 Ä aartir de parasites 100 p1 de culot de culture de globules rouges à 10 % de parasitémie, a été
resuspendu dans 100 NI de PBS, pH 7,2 et purifié par le Qiaamp DNA Mini KitT""
(Qiagen, Allemagne). A partir de 100 p1 de culot d'une culture parasitée à 10 %, on a obtenu environ 5 pg d'ADN.
2.1.5. Purification d'ARN Total parasitaire Nous avons utilisé deux méthodes en fonction de (a quantité d'ARN voulu.
Pour des quantités importantes, la méthode décrite par (Kyes et al., 2000) a été
employée, tandis que pour obtenir des préparations de quantités plus restreintes, nous avons utilisé le RNeasy kitT"" (Qiagen, Allemagne.) 2.1.6. RT PCR.
La RT-PCR a été effectuée avec le kit RT-PCR de Qiagen (Allemagne).
Des amorces spécifiques pour chaque gène et situées, si possible, de telle façon que l'on puisse distinguer entre les produits issus d'amplification d'ADN
génomique et d'ARN (autour des introns) ont été utilisées. Une première réaction de Transcription réverse a été effectuée à 50 ° C pendant 30 minutes, puis une réaction de PCR a été effectuëe, dans tes même conditions que celle décrites pour une PCR d'ADN de parasite avec les amorces sélectionnées, parfois suivi d'une deuxième réaction (nested PCR) avec des amorces situés dans la séquence du premier produit PCR amplifié. Cependant, la température d'hybridation varie en fonction des amorces utilisées (entre 50 et 60 °
C).
2. 7.7. Purification des recombinants histidine 2 I de milieu de Luria Broth additionné avec l'ampicilline à 100 ng/ml a été
inoculé avec 50 ml de culture de bactérie contenant le plasmide recombinant.
La croissance des bactéries a été suivie par la mesure de la turbidité
bactérienne à
600 nm et à la densité optique voulue (entre 0,5 et 1) une concentration d'IPTG
variant entre 0,5 et 1 mM selon le recombinant a été ajoutée à la culture, et l'induction a duré entre 2 h et 4 h.

Ensuite les cellules ont été récoltées et le culot de bactéries resuspendu dans un tampon de 20 mM de NaPO4, pH 7.4, et 8 M d'urée (TU) (25 ml/litre de culture bactérienne). Ensuite, la suspension de cellules a été soumise à des sonications de 10 chocs de 1 minute chacun, et le surnageant contenant les protéines recombinantes a été récupéré par centrifugation à 10.000 g pendant minutes, et filtré à 0.22 pm. Ensuite, une étape de purification par affinité
sur une colonne de Nickel a été effectuée. Une colonne de 1 ml (HiTrapT"", Pharmacia, Suède) a été lavée comme indiqué par le fournisseur et 1 ml de NiCl2 a été appliqué, suivi par d'autres lavages. Ensuite, la colonne a été
lavée '10 avec 5 ml de TU, et le surnageant appliqué sur la colonne. Ensuite, un lavage de 10 ml de TU a été effectué, et le recombinant élué par un gradient croissant en imidazole, compétiteur de l'histidine. Selon le recombinant purifié, des concentrations différentes ont été employées, et les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous. Ensuite, le pool de protéines a été
dialysé
contre un tampon L-histidine pH 6, et chromatographié sur une colonne échangeuse d'anions (HiTrap QT"', Pharmacia, Suède) afin d'éliminer une partie des Lipo Poly Saccharides (LPS) ou endoxines qui induisent des réponses non spécifiques (Morrison and Ryan, 1987).
Tableau de purification des recombinants histidine DO Emplacement Recombinant Inducton~ aprs de fa protine,ImidazoleNaCI

inductionPoids (mM)3 (mM)4 molculaire2 DO

Tem s 747 0.5 0.5 4h 2.7 Mem, 18 50 360 772 0.5 0.5 4h 2.2 SN, 35 36 120 1 : La DO mesurée à 600 nm, La concentration en IPTG (mM) ; et le temps d'induction avant récolte.
2 : Après sonication, et centrifugation d'une suspension de bactéries ne contenant pas d'urée (8M) dans le tampon, le surnageant et le culot contenant les débris de membranes bactériennes ont été testés en Western blot afin de détecter où la protéine recombinante se trouvait. En présence d'urée toutes les protéines étaient solubles, et les procédures de purification ont donc été appliquées en présence de 8 M d'urée.
3 : La concentration d'imidazole à laquelle la protéine a été éluée sur la colonne de HiTrap-NiT""
4 : La concentration de NaCI à laquelle la protéine a été éluée sur la colonne de HiTrap-QT""

2.2. Techniaues ümmunoloaiaues 2.2. 9. ELISAs (Enzyme Linked lmmunoSorbant Assay) Les conditions optimales ont été déterminées avec 100 frl de solution d'antigène d'une concentration de 10, 5 ou 1 pglml coatés sur les plaques dans 50 mM de Carbonate pH 9.6 ou 1X PBS pH 7.4 en incubant les plaques sur la nuit à 4 °C. La saturation a été effectuée, soit en PBS supplémenté par 3 % de fait écrémé, ou 1 % de BSA (albumine de sérum de veau) à température ambiante ou à 37°C pendant 2 heures. La dilution de sérums de 100 ou de fois a été effectuée soit avec du PBS/lait à 1.5 % , soit avec du PBS/BSA 1 %, et l'incubation a été faite à température ambiante ou à 37°C pendant 1 h.
L'incubation avec les anticorps secondaires couplés à la HRPO
(peroxidase de navet) dilués au 1/2000 dans le tampon de dilution des sérums a été effectuée à température ambiante, et les révélations ont été faites à
l'aide des tampons de TMB (peroxidase substrate et peroxidase solution B) (Laboratories Kirkegaard et Perry, USA) mélangés volume à volume immédiatement avant utilisation dont 100 p1 ont été distribués dans chaque puit. Les réactions colorées en bleu ont été arrëtées en ajoutant le même volume d'une solution d'1 M
d'acide phosphorique. Les réactions sont lues à 450 nm dans un lecteur Multiscan AscentT"" (Labsystems).
Les résultats des souris sont exprimés en Ratio (unité arbitraire par rapport aux taux des réponses dans des témoins naïfs) et dans les expériences où les taux des isotypes ont été étudiés, par rapport au Ratio des IgG totaux déterminé
dans la mëme expérience.
2.2.2. Immunopurification d'anticorps spécifiques Pour l'immunopurification d'anticorps spécifiques contre les recombinants Hiss, une méthode décrite par (Brahimi et al., 1993) a été employée. 100 pl/puits de solution d'antigène dans du PBS, pH 7.2, à une concentration de 5 Ng/ml ont été adsorbés sur plaques Nunc MaxisorpT~" (Nunc, Danemark), et les plaques incubées à +4 °C la nuit. Ensuite, des sérums hyperimmuns ont été
incubés à
une dilution de 1/50 pendant 1 heure à température ambiante, les plaques lavées et l'élution des anticorps effectuée par ajout de glycine pH 2.5 à 0.2 M, incubation pendant 3 minutes et récupération suivie par une neutralisation du pH avec du Tris, 1 M, pH 11. L'immunopurification à partir de recombinants de fusion (i-galactosidase a été effectuée sur des filtres de nitrocellulose, comme décrit (Beall and Mitchell, 1986).

2.2.3. SDS-PAGE et Western Blot En fonction des échantillons à tester, des gels de pourcentage d'acrylamide (BioRadT"" 29.'1:1 ratio) variables {5, 7.5, 10 ou 12 %) ont été
utilisés. Après migration en tampon Tris/glycine (pH 8.5) avec le kit minigel 10 (Biorad, USA) les gels ont soit été colorés par bleu de Coomassie soit soumis à
un transfert sur filtres de nitrocellulose (0.45 pm), dans fa cellule Trans-BIotT""
(BioRad.) Après transfert, les protéines ont été visualisées par une coloration avec 0,2 % de rouge Ponceau dans une solution d'acide acétique (5%), puis le filtre a 15 été saturé en TBS/lait écrémë à 5 % pendant 30 minutes. Les anticorps humains immunopurifiés sans dilution, et les sérums dilués 1/100 ou 11200 dans du TBS/lait 5%/ TweenT"" 0,05% ont été incubés pendant 1 à 2 heures à
température ambiante. Ensuite, le filtre a été lavé 3 fois 10 minutes en TBS/TweenT"~ 0,05 %, et incubé avec les antisérums couplés à la phosphatase 20 alcaline dilués 1/5000, pendant 30 minutes. Après lavage dans le mëme tampon, les réactions colorées ont été produites par I"ajout de NBT (330 pg/ml)et de BCIP
(165 pg/ml) (Promega, Allemagne) dilués dans du tampon Tris pH 9.
2.2.4. IFI (lmmunofluorescence indirecte) 25 Toutes les incubations à 37°C ont été effectuées dans une chambre humide afin d'éviter l'assèchement des tissus ou cellules à étudier. Les tampons ont été filtrés par un filtre à 0.22 pm afin d'éviter des contaminations par d'autres microorganismes et des bruits de fond.

2.2.4.1 Stade saorozoïtes Après dissection des glandes salivaires de moustiques infectés avec le parasite, les sporozoïtes ont été fixés avec 0.01 % de glutaraldehyde en PBS
et lavés soigneusement en PBS.
Afin d'étudier le marquage uniquement en surface des sporozoïtes, (Galey et al., 1990) a développé une technique permettant une fixation « humide »
avec une suspension de sporozoïtes attachés à la polylysine. Les lames de titration (PolyLabo, France) ont été coatées avec 1 p1 d'une solution de 50 mg/ml de poiylysine, puis laissées sécher une nuit à 37°C. 1 NI d'une suspension de '10 sporozoïtes (20/pl) a été déposée sur chaque puits, et incubé dans une chambre humide à 4°C sur la nuit. La détection d'une présence intra-parasitaire a été faite par fixation des sporozoïtes dans l'acétone.
2.2.4.2 Stade héaatiaue Les coupes fixées au Carnoy et paraffinées ont été préparées par 3 bains de Xylène de 10 mn chacun, 3 bains d'alcool absolu de 5 mn chacun, 2 bains d'eau distillée de 5 mn chacun, et séchées à l'air libre. Ensuite, les coupes ont été réhydratées pendant 10 mn dans du PBS pH 7.4 filtré. Les coupes à
congélation ont été fixées 10 minutes en acétone.
2.2.4.3 Stade sanguin.
Les frottis sanguins ont été fixés 10 minutes à l'acétone, et des cases pour chaque échantillon à tester ont été délimitées en dessinant des bords avec un marqueur Pentel-rouge sur le frottis.
~'5 La suite de la technique a ëté identique pour les trois stades: Après fixation, les anticorps à tester (dilués dans du PBS) ont été déposés sur chaque puit, coupe ou case, et la lame incubée à 37°C en chambre humide pendant 1 heure. Les lames ont été lavées 3 fois 10 minutes dans du PBS 1X, puis incubées avec un anti-lgG anti-humain ou souris (selon les anticorps spécifiques utilisés), couplé à la fluorescéine (Alexis) dilué 1/200 dans du PBS et du bleu d'Evans 1/50000, incubées 30 minutes à 37°C en chambre humide, lavées trois fois en PBS 1X, et couvertes par une lamelle après qu'une goutte de tampon glycériné (PBS 30 % glycérol) ait été déposée. La lecture de la lame a été
effectuée au microscope à U.V (OlympusT"" BH2)) 2.2.5. Immunisations de sourïs 2.2.5.1 Par les recombinants histidines Les protocoles a, b et c ont essentiellement été appliqués pour obtenir des sérums spécifiques, tandis que les protocoles b, c et d ont été employés afin d'effectuer des infections d'épreuve par P. yoelü.
a) Adjuvant IFA/Alum Des souris BALB/c femelles de 6 semaines ont reçu 1 première injection intra-péritonéale de 500 NI, avec 1 mélarige de 20 Ng d'antigène (Hiss-249, Hiss-680, Hiss-747. Hiss-772), 2 mglml d'Alum (Al(OH)3, et de l'Adjuvant incomplet de Freund (AIF), volume dans volume, supplémenté avec 0.9% de NaCI.
Les 2 injections suivantes, chacune à 15 jours d'intervalle, ont été
effectuées avec la même quantité d'antigène dans le même volume, mais sans AIF, et avec de la méthiolate, un conservateur, à 0.05%.
Les souris ont été prélevées (500 p1) avant l'immunisation 2 semaines, 1 mois et 6 semaines après la première immunisation, sur EDTA et les plasma récupérés et stockés à -20°C.
b) CFA
Des souris BALB/c femelles de 6 semaines ont reçu 3 injections sous-cutanées tous les 15 jours à la base de la queue d'un mélange constitué par 100 lal d'adjuvant complet de Freund et de 10 pg d'antigène (Hiss-114 ou Hiss-662) dans 100 p1 de PBS. 1 semaine après la troisième injection, les sérums des souris' ont été prélevés et les réponses testés en ELISAs contre le recombinant et en IFI sur les sporozoïtes. 18 jours après la dernière injection, les souris ont subi une infection d'épreuve par des sporo2oïtes de P. yoelü.

c) SBAS2 (Adjuvant Smith and Klein Beecham) Des souris C3H femelles de 7 semaines ont reçu trois injections sous-cutanées à la base de la queue de 100 p1 d'un mélange constitué par 57 NI
d'adjuvant mélangé avec 43 p1 d'antigène (His6-249, Hiss-747 ou Hiss-772) correspondant à 10 pg, les injections étant espacées de 3 semaines chacune. 10 jours après la dernière immunisation, les souris ont été prélevées et les sérums correspondants récoltés.
d) Microparticules Les solutions d'antigènes (Hiss-249, Hisfi-747 ou Hiss-772) ont été
adsorbées sur des microparticules en polystyrëne de 0.5 pm de diamètre (Polysciences Inc, USA) par incubation à 37 °C en agitation pendant 4 heures dans une solution de glycine, pH 8Ø L'adsorption de l'antigène a été
vérifiée par la capacité des micro- billes d'agglutiner avec un sérum spécifique à
l'antigène adsorbé. Des souris C3H femelles de 7 semaines ont reçu trois injections sous-cutanées à la base de fa queue de 100 u1 d'un mélange constitué de microbilles coatés avec l'antigène correspondant à 10 pg, les injections étant espacées de semaines chacune. 10 jours après la dernière immunisation, les souris ont été
prélevées et les sérums correspondants récoltés.
2.2.5.2 Par les recombinants ADN
Des souris BALB/c et C3H de 6 semaines ont été injectées 3 fois à 8 semaines d'intervalle par voie intramusculaire avec 100 NI d'antigène (pNAK114, pNAK249, pNAK438, pNAK571, pNAK747, pNAK772) dans du PBS pH 7.4, puis une 4ème fois 12 semaines après la Sème injection. Les prélèvements de sang ont été effectués 1 semaine après la 3ëme et la 4ème immunisation sur EDTA, et les sérums récoltés après une incubation du prélèvement la nuit à 4°C.
Les rates de 3 souris /groupe ont été prélevées après la 4ème immunisation, et les stimulations des réponses cellulaires étudiées. Après un Sème boost, 8 semaines après la 4é"'8 injection, les souris ont subi une infection d'épreuve par des sporozoïtes de P. yoelü.

2.2. 6. Infection d'épreuves par sporozoi~es et par stade sanguin Les sporozoïtes issus de moustiques Anopheles stephensü infectés par le clone 1.1 de P. yoelü yoelü ont été obtenus par une méthode (Ozaki et al., 1984) qui consiste en l'isolement de la cage thoracique du moustique et l'obtention par centrifugation à travers de la laine de verre des sporozoïtes, qui ont été
lavés par des resuspensions successives en PBS après centrifugation.
Les souris ont été infectées par des sporozoïtes de P. yoelü par voie rétro orbitale avec 150 à 200 sporozoïtes (200 girl/ injection), et la parasitémie suivie par des frottis du jour 3 suivant l'infection jusqu'au l2ème jour post-infection, aussi bien sur les animaux immunisés que sur des souris naïves infectées par le même lot de sporozoïtes.
Des stades sanguins prélevés sûr d'autres souris infectées par P. yoelü
ont été lavés dans du PBS, et l'équivalent de 5 x 104 parasites ont été
injectés par voie intrapéritonéale.
'15 2.2.7. Étude des réponses cellulaires.
Afin d'étudier aussi bien l'induction de prolifération de cellules-T
spécifiques ainsi que la sécrétion de cytokines capables de stimuler la réponse immune, nous avons étudié la stimulation de splénocytes de souris par les antigènes et la sécrétion d'IFN-y par ces cellules:
2.2.7.1 Proliférations de I~mphocytes T
Les rates ont été prélevées sur les souris, les suspensions de splénocytes ont été lavées deux fois dans du RPMI 1640T"" (Gibco, France) et les cellules resuspendues à une concentration finale de 5 x 106 cellules /ml dans du RPMI
supplémenté avec 100 Ulml pénicilline, 2 mM L-glutamine, 10 mM Hepes, 50 NM
~i-mercaptoéthanol, 1,5% sérum de veau foetal (SVF) et 0,5 % de sérum de souris normal. 100 Nl/puits de chaque suspension a été distribuée dans des plaques de 96 puits à fond rand (Costar, USA) et les protéines recombinantes à
tester ont été ajoutés à une concentration de 50 mg/ml. Ces tests ont été
effectués en triplicat. Aprës 48 h d'incubation, (37 °C avec 5 % de C02), 50 pl/puits de surnageant de culture a été prélevé et stocké à -70 °C
avant la détermination de titres d'IFN-y. 50 Nl/puit de surnageant a été prélevé pour dosage de cytokines. Afin de détecter la réplication d'ADN due à une stimulation de division, 50 p1 d'une solution de thymidine tritiée (3H) (Amersham Life Science, England) à 1 NCi/puits a été ajoutée durant les 12 dernières heures d'incubation.
5 Les cellules ont été récoltées dans un récolteur de cellules automatique (Skatron Inc, Sterling, VA, USA), et l'incorporation de Thymidine 3H quantifiée par scintillation. Les résultats sont exprimés en Index de Stimulation (1.S.) et la prolifération a été considérée comme positive, lorsque le S.I. est au dessus de 2.
10 2.2.7.2 Détection de sécrétion d'interféron v (IFN-y) Les titres d'IFN-y dans les surnageants de culture ont été déterminés par un méthode d'ELISA à double capture. Des plaques MaxisorpT~" (Nunc, Danemark) à fond plat ont été coatées par un anticorps monoclonal de rat anti-IFN-y de souris primaire (R4-6A2) (Pharmingen., San Diego, CA) dilué dans un 15 tampon de 0.1 M de carbonate, pH 9.6, et laissé sur la nuit à 4 °C.
Entre chaque étape de la procédure, les plaques ont été lavées plusieurs fois avec du tampon PBS supplémenté avec 0,05 % TweenT"" (PBS-T). Ensuite, les plaques ont été
saturées avec 3% d'albumine de sérum de veau (BSA, Sigma Chemicals, St Louis, USA) dans du PBS-T. Des surnageants non-dilués ont été ajoutés aux 2n puits et les plaques incubées sur la nuit à 4°C, suivi par une incubation 1 h à
température ambiante avec un anticorps monoclonal rat anti-souris IFN-y secondaire biotinylé (XMG1.2T"", Pharmingen, San Diego, CA) dilué dans du PBS-T. Les ëtapes de marquage avec dés anticorps couplés à la peroxidase sont identiques à celles utilisées dans la technique de l'ELISA. (A.2.1) 2.2.7.3 Détection de cellules sécrétrices d'IFN-v aar Elispot Le nombre de cellules sécrétrices d'IFN-y a été déterminé dans des splénocytes non stimulées 40 heures après qu'elles soient fraîchement isolées et incubés avec les antigènes. Des plaques de microtitrage (Multiscreen-HAT"", plaque stérile, Millipore) ont été coatées par 50 girl d'une solution contenant 5 pg/m! d'anticorps anti-IFN-y (18181 DT"", Becton Dickinson Co). Après une incubation sur la nuit à 4 °C, les puits ont été lavés et saturés par une solution de % de SVF. Des suspensions de cellules de 5 x 105 cellules/puit ont été
incubées avec l'antigène à 50 pg/ml dans un volume total de 200 p1 pendant 40 h, à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Les plaques ont 5 ensuite été lavées 3 fois avec du PBS-T et 3 fois avéc du PBS seul et les puits ont alors été coatés par 50p1 de solution d'anticorps anti-souris IFN-y biotinylé
(Becton Dickinson Co, USA) diluë au 1/200 et incubé sur la nuit à 4 °C.
Les plaques ont ensuite été lavées de la même façon que précédemment, avant un ajout de 50 Irl par puit de phosphatase alcaline couplée à la streptavidine (Boehringer-Mannheim, Allemagne) à une dilution de 1/2000 dans du PBS. Après 1 h d'incubation, et lavage des plaques, des spots ont été détectés par développement d'une réaction colorée avec les réactifs BC1PJNBT à 50 Ng/ml à
l'endroit où des cellules individuelles ont sécrété de l'IFN-y. Les résultats sont exprimés comme le nombre de cellules formant des spots par rapport aux 5 x 106 splënocytes.
2.2.8. Sérums et cellules 2.2.8.1 D'individus naturellement exposés au parasite.
10 sérums provenant d'adultes vivant dans une forte zone d'endémie (Côte d'Ivoire) et naturellement protégés ont été employés dans des études d'ELISA et des immunopurifications d'anticorps spécifiques aux antigènes étudiés.
Des sérums provenant d'individus de deux tranches d'ages allant de 0 -9 ans ou au dessus de 12 ans, ont été sélectionnés des Villages Ndiop et Dielmo (Rogier and Trape, 1995; Trape et al., 1994). Ndiop est situé dans une zone d'endémie qui compte environ 20 piqûres infectieuses/an, et Dielmo, dans une zone qui compte 150 piqûres infectieuses/an. Chaque sérum dans une des deux régions correspond en age et en sexe à un sérum de l'autre région.
2.2.8.2 D'animaux ou d'humains immunisés avec des saorozoïtes irradiés.
Deux chimpanzés ont été immunisés soit avec des sporozoïtes irradiés à
18 kRad, soit à 30 kRad par 4 injections de 5 x 106 sporozoïtes chacune par voie intravéneuse. Les 3 premières immunisations ont été effectuées avec 1 mois d'intervalle, tandis que la 4B""e a été effectuée 4 mois après la 3~"'e. Leur sérum et les cellules du sang périphérique ont été étudiés dans des tests de réponses cellulaires et de réponses humorales après 3 immunisations. Les deux animaux ont été infectés par l'injection intravéneuse de 4 x 104 sporozoïtes (faible dose) chacune de P. falciparum et seulement le chimpanzé immunisé avec les sporozoïtes irradiés à 18 kRad a été protégé (n'a pas développé de parasitémie sanguine).
Deux volontaires humains immunisés par le méme moyen, ont reçu un rappel avec un nouveau lot de sporozoïtes irradiés, et les cellules du sang périphérique ont été étudiées dans des tests d'Elispot. De plus, le sérum de 4 volontaires humains immunisés avec des sporozoïtes irradiés a également été à
la disposition de la Demanderesse.
2.2.8.3 D'individus exposés différemment au parasite Nous avions à notre disposition des sérums de 8 individus exposés naturellement au parasite mais sous traitement de chloroquine permanent, ce qui élimine les stades sanguins à une forme très précoce et des sérums de 5 individus accidentellement infectés par la transfusion de sang infecté par P. falciparum.

3.0: Exemple 1 Identification de deux antigèn~s nouveaux DG47 et DG772 de P. falciparum reconnus par des volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradié
Les clones DG 747 et DG772 ont été sélectionnés non seulement à cause des critères initiaux posés (détection sur les sporozoïtes et le stade hépatique, ainsi qu'une reconnaissance par des sérums hyperimmuns), mais parce que plusieurs caractéristiques supplémentaires nous ont intéressés : le DG747 n'avait ~f0 aucune réactivité croisée avec d'autres protéines de la banque PM, et le n'avait qu'une seule réactivité croisée, avec LSA1, le seul antigène identifié

comme exprimé uniquement au stade hépatique de P. falciparum. De plus, des anticorps spécifiques des deux protéines marquaient des sporozoïtes de P.
yoelü.
Un séquençage initial a révélé que ces deux clones contenaient des inserts appartenant â des gènes jusqu'ici inconnus, mais dont la séquence était disponible sur les bases de données du génome de P. falciparum. Nous nous sommes donc consacrés au travail de la caractérisation moléculaire d'expression du stade, de la conservation du gène, ainsi qu'à un travail de caractérisation immunologique (antigénicité, immunogénicité) de ces nouveaux antigènes. Les résultats ont montré que a) ces deux antigènes induisent une rëponse immune chez des individus ou des animaux uniquement exposés aux stades pré-érythrocytaires aussi bien artificiellement (par immunisation) que naturellement (sur le terrain), b) qu'ils sont reconnus par des sérums d'individus naturellement exposés au cycle entier du parasite, aussi bien dans des zones de faible que de forte endémie. De plus, nous avons évalué chez fa souris leur potentiel immunogène et protecteur par l'immunisation et l'infection d'épreuve par P.
yoelü.
3.1. Analyse des séquences DG747 code pour un polypeptide de 59 acides aminés dont les 40 acides aminés (aa) C-terminaux font partie d'une structure répétitive de 5 x 8 aa riches en arginine et en lysine. Cette séquence est identique aux aa 81-140 du gène PfB0155c (1524 pb, 508 aa) situé sur le chromosome 2 (Figure 3.1 a). Ce gène qui code pour une protéine putative (Gardner et ai., 1999), ne comporte ni introns, ni peptide signal prédits, ni de régions homologues à d'autres protéines qu'elles soient de Plasmodium ou d'autres organismes. La protéine correspondante a une masse moléculaire théorique de 59 kDa, et un point isoélectrique neutre (7.5), mais certaines régions ont des p1 très variables, par exemple la région retrouvée dans DG747 a une charge positive à pH neutre.
DG772 contient un insert de 333 pb, qui sont traduits en 111 aa contenus dans un cadre de lecture ouvert. Ce polypeptide correspond à la région des aa 3() 1146-1256 d'une protéine de 1493 acides aminés codée par un gène situé sur le chromosome 1 (figure 3.1 b). La masse théorique de la protéine est de 173 kDa et le point isoélectrique est de 5.05. La protéine est constituée en majorité
d'acides aminés polaires et ne contient pas de sites hydrophobes, à part dans la partie N-terminale, où il pourrait y avoir un site d'ancrage de GPI. Le gène ne contient pas de répétitions et la séquence nucléotidique traduite a une forte homologie avec les protéines de la famille « EBP » (Adams et al., 1992), c'est-à-dire avec des régions 5'cys et 3'cys qui sont caractéristiques de cette famille.
3.2. Expression de stade et conservation du gène Afin d'évaluer plus précisément l'expression de stade des deux protéines, nous avons utilisé les techniques d'IFI et de Western blot sur des stades différents de P. falciparum et sur fes parasites murins P. yoelü et P.
berghei.
La surtace des sporozoïtes de P. falciparum a été marquée par les anticorps {humains ou de souris) spécifiques de DG747 et de DG772, mais les stades érythrocytaires ont été marqués d'une façon différente pour les deux groupes d'anticorps. Les anticorps anti-Hiss-747 (anti-747) marquent peu les stades jeunes, mais fortement les stades schizontes mûrs, avec un marquage localisé autour des structures knob (Figure 3.2 image A), tandis que les anticorps anti-Hiss-772 (anti-772) marquent le parasite d'une façon plus homogène tout au long du stade érythrocytaire. Dans les espèces murines P. yoelü et P. berghei, la surface des sporozoïtes a été fortement marquée par les anticorps spécifiques 2.0 des deux antigènes.
Afin de définir les tailles des protéines détectées, nous avons aussi effectué un Western Blot des extraits protéiques de parasites sanguins de P.
falciparum avec les mêmes anticorps (Figures 3.3 a et b).
Les anticorps anti-747 marquent un polypeptide d'environ 70 kDa aussi bien dans les extraits d'anneaux que ceux de schizontes, tandis qu'aucune bande n'a été
détectée dans les érythrocytes non parasités. Le polypeptide détecté par des anticorps anti-772 est plus grand, d'une masse moléculaire de 150 kDa, et est détecté aussi bien dans les anneaux que dans les schizontes. Le marquage d'extraits protéiques de P. yoeüi a détecté un polypeptide de 70 kDa pour les anti-747 dans les sporozoïtes et ies stades sanguins et un polypeptide de 60 kDa pour les anti-772, seulement détecté dans les sporozoïtes de P. yoelü.

' x De plus, afin de confirmer la présence des protéines et leur constance d'expression à la surface des sporozoïtes provenant de plusieurs parasites différents, nous avons examiné par IFI des lots de sporozoïtes provenant de différents isolats Thai de P, falciparum. Le sërum anti-772 a marqué tous les 5 sporozoïtes, tandis que seulement 7 sur 10 des isolats testés étaient marqués par les anti-747. De même, des amplifications par PCR avec des amorces spécifiques pour les deux fragments de gène (indiquées dans les Figure 3.1a et 3.1 b) ont été effectuées avec de l'ADN issu de stades sanguins de 12 souches différentes de P. falciparum (Figure 3.4). Les produits PCR correspondant au 10 DG772 ont été amplifiés à partir des 12 échantillons et leur taille était similaire, tandis que les amorces spécifiques pour DG747 n'ont pu amplifier un fragment qu'à partir de 9 des 12 ADN. II faut préciser que toutes les lignées de parasites utilisées dans ce travail (T9-96, NF54 et 3D7) contiennent les gènes correspondants. Ces résultats indiquent une variation au niveau de l'expression 15 ou de la présence de DG747 dans des souches parasitaires, car au total, seulement 15 sur 22 parasites ont semblé contenir le gène du DG747 ou ont montré une réactivité positive en IFI.
3.3. Reconnaissance par le système immunitaire humain dans des zones 20 endémipues En plus de l'étude de la constance d'expression de l'antigène, nous avons étudié la prévalence des réponses humorales d'individus vivant dans des zones de forte (Dielmo) ou de faible (Ndiop) endémie, et dans deux groupes d'âge différents dans ces deux zones (Figures 3.5a et 3.5b) 25 On observe une même prévalence (40 %) confire 747 dans la zone de faible endémie, sauf que le nombre d'individus qui répondent fortement (l'intensité
de réponse par rapport aux témoins) augmente avec l'âge. Dans la zone de forte endémie, le nombre de répondeurs contre 747 augmentent avec l'âge, ainsi que l'intensité de la réponse, et la prévalence chez les adultes, que l'on peut 30 considérer comme ayant acquis une immunité, est de 85 %. De plus, ces réponses semblent corrélées avec l'exposition au sporozoïte, car le taux d'anticorps est plus élevé chez les individus d'un groupe d'âge donné dans une zone de transmission plus forte. Toutefois, dans une même zone, la réponse n'a pas changé d'une façon significative durant des saisons de plus faible transmission (saison sèche) (résultats non montrés), ce qui pourrait correspondre à la réponse contre les stades sanguins etlou indiquer que la réponse immune anti-747 est de longue durée. La réponse ïnduite par DG747 augmente en prévalence et en intensité en fonction de l'exposition et de la durée d'exposition au parasite (âge).
La réponse anti-772 augmente comme l'anti-747 en fonction de l'âge, mais avec une augmentation beaucoup moins importante, par rapport au taux de transmission observé entre Ndiop et Dielmo et par rapport à l'âge. Le taux de réponses anti-772 mesuré en % de prévalence et en intensité est plus élevé
pour les individus de bas âge que celui des réponses anti-747, mais moins forte (75%) que l'anti-747 (85%) à Dielmo dans les individus immuns.
3.4. Comparaison des réponses induites par des stades dïfférents du parasite Nous avions le privilège d'être en possession de cellules issues d'individus immunisés avec des sporozoïtes irradiés, et de sérums provenant de personnes exposées de façon différente à l'infection parasitaire.
3.4.1. Réaonses cellulaires Toutes ces études ont été effectuées en étroite collaboration avec Jean-Pierre Sauzet dans le laboratoire. Compte tenu du peu de matériel dont nous disposions, nous avons restreint les analyses afin de détecter ce que nous avions précédemment défini comme un des critères importants (rôle dans la protection) pour l'évaluation d'un potentiel vaccinal au stade pré-érythrocytaire. Nous avons étudié la sécrétion de IFN-y de cellules issues de 2 individus immunisés avec des sporozoïtes irradiés de P. falciparum, car nous avions observé, lors de l'analyse d'autres antigènes, et en particulier de LSA3, un candidat vaccin étudié dans notre laboratoire (Daubersies et al., 2000), que le taux de sécrétion de cette cytokine semble être corrélë à la protection. Chez ces deux volontaires, le nombre de cellules sécrétant l'1FN-y contre DG747 et DG772 est aussi élevé que pour les recombinants issus de LSA3 (729 et PC), (Figure 3.6a). De plus, nous avons examinë si les réponses immunes cellulaires mesurées par la prolifération de lymphocytes T et la sécrétion d'IFN-y différaient entre deux chimpanzés immunisés avec les sporozoïtes irradiés de P. falciparum, mais dont un n'était pas protégé, (Figure 3.6b).
Les cellules du système immunitaire de l'animal immunisé avec les sporozoi"tes irradiés viables (18 kRad) et ultérieurement protégé, ont reconnu les antigènes DG747 et DG772, ainsi que l'ont fait les cellules de l'animal immunisé
avec des sporozoïtes irradiés non-viables (30 kRad), et pas protégé lors d'une 'C 0 infection d'épreuve.
Les proliférations lymphocytaires sont à la limite de la valeur seuil, tandis que les taux de sécrétion d'IFN-~y sont -élevés, aussi bien pour la quantité
de cytokine détectée que pour le nombre de cellules sécrétrices (détecté par Elispot). Ceci est valable aussi bien pour les animaux efficacement immunisés et ceux n'étant pas protégés. Cependant, il semble que les taux de réponses sont plus élevés pour les animaux immunisés avec les sporozoïtes irradiés de 30 kRad. Les réponses induites par 747 sont plus fortes que celles qu'induit 772, et les deux plus fortes que celles induïtes par LSA3.
Les cellules prélevées sur des animaux ayant subi une immunisation supplémentaire par les sporozoi'tes irradiés ont été endommagées lors du transport à partir du centre de primatologie en Afrique, et nous n'avons donc pas pu étudier la présence d'un « boost » induit contre ces antigènes.
3.4.2. Étude des réponses humorales Nous n'étions pas en possession des cellules de tous les groupes humains exposés de façon différente à l'infection parasitaire, mais nous avons pu étude en détail la réponse humorale (isotypes d'IgG) de volontaires immunisés avec des sporozoïtes irradiés (ISS, seulemenfi exposés aux stades pré-érythrocytaires), d'individus naturellement immuns vivant en zone de forte endémie (exposés à
tous les stades du parasite), et d'un individu ayant été accidentellement infecté
par le paludisme par transfusion sanguine, (uniquement exposé aux stades sanguins) (Figures 3.7a et 3.7b).

Pour les deux antigènes, la différence la plus grande est observée pour fisotype cytophile IgG1 dont le taux est beaucoup plus élevé dans le sérum d'individus immuns (SHI) que dans le sérum issu du malade infecté par transfusion ou de volontaires ISS. Les réponses de ces deux derniers groupes sont assez semblables et ne font pas apparaître de déséquilibre entre anticorps cytophiles (IgG1 et IgG3) et non cytophiles (IgG2 et IgG4). Nous avons en outre remarqué pue le sérum issu d'un individu exposé longuement au parasite, mais sous prophylaxie permanente (le PM), a le même profil en isotypes que les ISS.
3.5. Immunogénicité chez la souris Des souris de deux souches différentes ont été immunisées avec les recombinants sous formes de protéines; avec des adjuvants différents ou sous forme de constructions d'ADN « nu », sans adjuvant.
Une étude préliminaire avec une construction ADN nu ne comportant pas de séquence signal permettant l'exportation de la protéine synthétisée a été
effectuée. Les souris immunisées n'ont généré aucune réponse humorale, que cela soit pour ces deux antigènes ou pour d'autres étudiés simultanément.
Cependant, nous avons détecté des réponses cellulaires spécifiques anti-747 et anti-772. Aussi bien les proliférations de lymphocytes T que le taux de sécrétion d'IFN-y ont été testés pour deux souches de souris, la C3H et la BALB/c. Les profils de réponses sont présentés dans les Tableaux 3.1 a et 3.1 b où l'on peut remarquer que pour le cas des réponses cellulaires de souris immunisées avec pNAK747, il y a aussi bien des stimulations de prolifération que de sécrétion d'IFN-y, tandis que pour pNAK772, les proliférations des cellules. T ont été
très peu stimulées par rapport à la stimulation de sécrétion d'IFN-y qui est considérable. Parmi toutes les souris immunisées, le niveau le plus élevé de sécrétions d'IFN-y est observé lorsque le niveau de stimulation de prolifération est le plus bas.
Les vaccinations par les autres formulations (protéine recombinante et ADN nu avec une séquence signal) ont toutes induit une réponse humorale chez les souris (Figure 3.8). Tous les sérums issus de ces souris immunisées reconnaissent la protéine native en tests d'IFI et le marquage correspond avec celui observé pour les anticorps humains immunopurifiés.
Les réponses anti-747 présentent un profil similaire pour toutes les souris immunisées et toutes les formulations utilisées, avec une réponse isotypique à
prépondérance IgG2b. Les réponses anti-772 sont aussi similaires entre souris et formulations de vaccins, mais avec une nette prédominance des IgG1. Le profil isotypique dépend donc de l'immunogène plus que du mode de présentation utilisé. Cependant, fes titres à point final sont beaucoup plus élevés lorsque l'on immunise avec des protéines recombinantes (1/200.000) par rapport à l'ADN
(1!2000), et les titres des sérums de souris immunisées avec Hiss-772 sont plus élevés que ceux des Hiss-747.
Puisque nous avions observé ' une réactivité croisée avec le stade sporozoïte de P. yoelü, nous avons testé le potentiel protecteur de ces antigènes par l'infection avec des sparozoïtes de cette espèce de souris immunisées avec ~ 5 les protéines recombinantes. La parasitémie a été suivie par l'observation des formes sanguines sur des frottis à partir du jour 3 de l'infection et pendant jours consécutifs. Nous n'avons observé aucune protection quelle pue soit la souche de souris utilisée, car la parasitémie a été détectée au même jour que celle des souris non immunisées, et la courbe était semblable à celle des souris _ témoins (résultats non-montrës).
3.6 Donnëes supplémentaires 3.6.1 DG772 Par RT-PCR sur l'ARN total issu de sporozoïtes et de parasites sanguins, 2.5 les inventeurs ont pu déterminer les sites d'épissage de l'ARN messager correspondant au gène codant. La séquence des amorces a été extraite des données du génome de Plasmodium faiciparum.
Les produits d'amplification sont de tailles identiques dans les stades sporozoïtes et les stades sanguins, et diffèrent de la taille du produit obtenu par amplification de l'ADN génomique et par séquençage les sites d'épissages se sont avérés d'être identiques {voir les introns indiqués dans la figure).

Le gène codant pour DG772 appartient à une famille de protéines identifiés par un motif partagé. Toutes les protéines de la famille des EBP
(Erythrocyte Binding Proteins) partagent des motifs conservés de résidus cystéine dont l'agencement est similaire pour toutes les protéines. Cependant, le 5 degré d'identité ne dépasse pas 31 % (max. 57 % d'homologie), même dans les régions les plus conservées.
3.6.2 Tests d'immunoçténicité envisagés dans les humains.
D'après nos résultats obtenus dans les souris, nous pouvons confirmer 10 que les antigènes DG747 et DG772 employés aussi bien sous forme d'ADN que sous forme de protéine recombinante sont immunogènes. De plus, du fait que les protéines recombinantes sont reconnues par des individus immunisés et protégés contre l'infection par des sporozottes de Plasmodium falciparum indique un rôle de ces antigènes dans l'immunité pré-érythrocytaire. Un test dans des 15 primates, et en particulier des chimpanzés permettra de choisir facilement la formulation optimale pour des tests cliniques chez l'humain.
Dans les essais de phase I, afin d'étudier l'immunogénicité et la sûreté du produit, nous envisageons trois formulations toutes préparées dans des conditions GMP: 1 ) l'antigène sous forme de protéine recombinante purifiée à
' 20 partir de la bactérie Lactococcuc lacfis (utilisation permise dans les humains) adjuvée avec l'adjuvant SBAS2 (GSK) ; 2) la construction d'ADN dans le vecteur VicaIT"" (Avantis Pasteur) ; et 3) des (ipopeptides synthétiques injectés sans aucun adjuvant (v. LSA3) . Ces formulations vont être distribuées par injection sous-cutanée (au niveau du deltoïde). Par des tests préliminaires, nous savons 25 que ies antigènes Hiss-747 et His6-772 induisent des réponses cellulaires et des réponses humorales chez des indivïdus n'ayant été exposés uniquement aux stades pré-érythrocytaires. Nous allons ensuite étudier les réponses cellulaires et les réponses humorales des individus immunisés par les formulations choisies en les comparant avec celles observées dans des individus immunisés avec des 30 sporozoïtes atténués par irradiation et protégés contre une infection d'épreuve avec des sporozoïtes non-atténués. En fonction de ces réponses, une infection d'épreuve avec des sporozo'ites de Plasmodium falciparum sera envisagée.

3.6.3 Homoloaie avec d'autres séquences nucléotidiaues.
Une hybridation par Southern blot dans les conditions stringentes standard (0.1 X SSC, 60 °C) ne donnerait lieu à aucune autre hybridation qu'avec fe gène correspondant.
3.6.4 Recherche d'homologie par des moyens bioinformatiaue Les recherches ont été effectuées avec le logiciel SLASTT"" (tblastx et blastn) sur toutes les bases de données disponibles du génome de,Plasmodium falciparum ainsi que les bases de données d'autres organismes. Les paramètres utilisées sont les paramètres de défaut trouvées sur les site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
3.7 Discussion Ce travail qui fait partie de l'étude des antigènes exprimés aux stades pré-érythrocytaires nous a permis une première caractérisation et l'évaluation du potentiel vaccinal de deux nouveaux antigènes de P. falciparum. Ces deux antigènes ont des caractéristiques différentes au niveau moléculaire. D'une part, la protéine dont fait partie le DG747 contient des répétitions, tandis que la molécule contenant le DG772 n'a aucune répétition directe. Le gène Pfb0155c codant pour DG747 est petit (1524 bp) et contient une région répétitive à
laquelle appartient DG747. Nous n'avons pas pu détecter la présence du gène par PCR
dans toutes les souches, ni pu observer une réactivité avec toutes les souches de sporozoïtes étudiées. L'absence observée peut être due à une réelle délétion du gène ou aux procédures expérimentales. En effet, une des amorces utilisées pour la détection de la partie codante pour DG747 chevauche la partie répétitive, ce qui peut entraîner une difficulté à amplifier un gëne contenant une répétition plus grande, ou à détecter un gène contenant moins de répétitions. De plus, ceci est aussi le cas pour la détection en immunofluorescence indirecte où un nombre éventuel de variations de répétitions peut changer l'affinité des anticorps spécifiques, si l'epitope cible chevauche cette région. L'expression détectée par IFI semble être présente tout au long du cycle parasitaire asexué dans l'hôte vertébré (nous n'avons pas analysé les stades sexués). Malgré la présence de répétitions dans le DG747, nous n'avons pas détecté de réactivité croisée avec d'autres antigènes de P. falciparum. La séquence du gène entier n'a pas d'homologie avec d'autres protéines plasmodiales jusqu'ici identifiées, et nous n'avons pas encore d'indications sur une fonction biologique éventuelle.
Le DG772 ne contient pas de répétitions et sa présence semble être constante, qu'elle soit détectée par PCR ou par IFI. Au niveau biologique, le gène codant pour DG772 s'avère être intéressant. Nous avons trouvé par homologie de séquence que ce gène de 5300 bp de cadre de lecture ouverte fait partie de la famille des EBP (Erythrocyte Binding Protein) {Adams et al., 1992), mais que la séquence de DG772 n'appartient pas aux régions conservées de cette famille, il ne partage qu'une petite partie de séquènces avec l'extrémité N-terminale de la région 3'cys. D'ailleurs, il n'a pas de réactivités croisées ni d'homologie de séquence avec DG249, un autre clone faisant partie d'une des parties consensus du gène codant pour EBA-175. II se peut que DG772 fasse partie d'une région qui confère une particularité à chaque molécule de cette famille. La présence de deux molécules de la famille d'EBP (EBA-175 et 772) sur les sporozoïtes pourrait impliquer qu'il existe plusieurs molécules de cette famille qui interviendraient de façon alternative dans le processus d'invasion comme décrit dans les stades 2.0 sanguins.
Une connaissance de la prévalence est utile lors de l'évaluation d'un candidat vaccin, et les prévalences obtenues pour DG747 et DG772, de 85% et 75%, sont importantes. Cette étude a montré l'antigénicité importante d'un petite partie des deux molécules, et a suggéré qu'il y aurait un intérêt à étudier plus en détail d'autres epitopes de la même molécule. La réponse humorale détectée contre DG747 et DG772 dans des individus exposés en permanence indique qu'il y a une prépondérance en réponse IgG1 (type cytophile) développée lors d'une exposition soutenue qui n'est pas retrouvée dans le cas de paludisme transfusionnel. Par contre, les profils de réponses humorales obtenus pour deux groupes exposés aux stades pré-érythrocytaires à plus ou moins longue durée (PM et ISS) se ressemblent, et le niveau d'IgG1 est bas, ce qui indique que cet isotype traduit l'exposition répétée de l'antigène aux stades sanguins.
L'étude des réponses cellulaires dans ces mêmes zones devra être effectuée afin d'avoir une notion plus précise des réponses immunitaires induites par ces antigènes.
Aux stades pré-érythrocytaires, nous avons observé une induction de réponse cellulaire par ces antigènes aussi bien dans des chimpanzés que chez des humains. Nous avons observé la sécrétion IFN-y, décrit comme un facteur intervenant dans la protection contre les stades pré-érythrocytaires. La différence de réponse observée chez les chimpanzés en fonction de la dose d'irradiation pourrait signifier que les antigènes sont reconnus aussi bien sur les sporozoïtes que dans les stades hépatiques. En effet, les sporozoïtes irradiés à 30 kRad sont incapables de pénétrer dans l'hépatocyte, et les réponses détectées sont donc seulement dues à cette exposition, tandis que les sporozôites irradiés à 18 kRad se dévelôppent dans l'hépatocyte, et les réponses détectées sont donc dues à
ce stade. I! serait intéressant d'étudier de plus près les réponses induites dans ces deux animaux (restriction MHC1), et l'induction de « boost » de réponse lors de plusieurs immunisations successives. Ce travail a aussi montré que dans ces deux fragments d'antigènes, il existe aussi bien des épitopes T que des épitopes B.
L'immunogénicité induite par les deux antigènes dans la souris est différente avec une prédominance d'IgG1 pour le DG772, qui n'est pas observée pour DG747. Par contre, nous n'avons observé aucune différence dans les réponses en fonction des formulations, ce qui est intéressant car la présentation des molécules n'est pas identique pour chaque formulation. Les réponses cellulaires uniquement obtenues pour la formulation n'ayant pas induit de réponses humorales détectables montre qu'il y a eu aussi bien des proliférations de lymphocytes, que des sécrétions d'IFN~y en fonction des souris.

Tableau D1:Récapitulatif des antigènes pré-érythrocytaires du paludisme connus à présent*.
Antigne Rfrences ' Stades LocalisationStructures d'expression ' Intron ' Reps S
H
SSA
SSS

CS (Nardin et al.. 1982) + j - - CHR3 + +

LSA1 (Gurin-Marchand et + j,m - - CHR4 - +
al., 1987) TRAP jRobson et al., 1988) + j,m m - CHR13 - +

PfHsp70 Renia et al.. 1990) + j,m j,m - CHR13 +

STARP ~Fidock et al 1994) + j,m - - CHR12 + +

EXP-1 (Koenen et al., 1984),- m j,m Nt CHR12 - +
(Sanchez et al.. 1994) Pfs16 LBruce et al.. 1990) + nt - + ? - -SALSA LBottius et al.. 1996)+ j,m - - CHR2 + -LSA3 jDaubersies et al.. + j,m - - CHR2 + +
2000) PfEMP3 (Pasloske et al., 1993),+ j,m j,m - CHR2 + +
(Grner et al.. 20011 GLURP (Borre et al., 1991) + m j,m Nt CHR10 - +

EBA-175 (Camus and Hadley, + j,m j,m - CHR4,13 + -1985) ~~ >:
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* Les antigènes en gris sont les antigènes caractérisés dans cette demande.
NT : Non testé
1 : La présence aux stades pré-érythrocytaires d'autres antigènes (MSP-1) a aussi été suggérée, mais les résultats préliminaires restent à confirmer, Les références soulignées indiquent l'année de découverte de l'expression pré-érythrocytaire.
2, S : sporozotte ; H : Stade hépatique jeune et mür ; SSA : Stade Sanguin asexué jeune .et mfir ;
1 a SSS : Stade sanguin sexué. 3. ST : sub-télomérique. Les caractéres en gras indiquent la forme du stade où le marquage est le plus intense.
3. La plupart des localisations chromosomales a été faites par recherche d'homologie sur des bases de données Tableau 3.1a: Stimulation de proliférations cellulaires et de sécrétion d'IFN-y par Hisg-747 après 3 immunisations avec pNAK747.
Prolifration Interfron Souche de sourislymphocytaire gamma Index de stimulation IU/ml Hiss-747 GEX- Hiss-747 NN GEX- NN

C3H 8.6 t 3.0 3.2 f 1.1 7.0 t 0.4 4.0 t 0,9 C3H 23.55.9 8.82.9 7.00.7 4.00.2 C3H 3.010.9 1.10.1 16.011.9 1.02.1 Positifs 2/3 - 113 -BALBIc 2.710.2 1.310.2 40.0 t 5.0 24.0 3.0 BALBIc 23.5-4.3 3.010.3 15.04.4 8.01.8 BALB/c 33.7 7.2 5.910.3 15.011.5 10.0_ 14.2 Positifs 213 - 3/3 _ -pGEX-NN : antigène de P. falciparum non cross-réactif avec HisB-747.
Les résultats positifs sont en gras.

Tableau 3.1b: Stimulation de proliférations cellulaires et de sécrétïon d'IFN.~ par Hiss-772 après 3 immunisations avec pNAK772.
Prolifration Interfron souche de sourislymphocytaire gamma Index de stimulation IU/ml Hise-772 GEX- His -772 NN GEX- NN

C3H 0.90,1 0.70.1 23.912.0 10.72.9 C3H 0.9 t 0.2 0.6 0.1 1.7 t 2.0 3.3 2.1 C3H 0.8-f-0.2 0.90.2 6.6f0.1 5.812.6 Positifs 013 - 113 -BALB/c 3.50.3 2.70.4 24.02.2 10.83.0 BALB/c 1.9 0.3 1,2 0.4 31.3 t 7.1 5.6 0.9 BALB/c 3.2 0.9 _ 1.5 0.2 _ 25.0 t 12.1 6.9 t 1.5 Positifs 113 - 3/3 -pGEX-NN : antigène de P. falciparum non cross-réactif avec Hiss-772.
Les résultats positifs sont en gras Tableau 4.1: Réponses cellulaires de souris aprës 5 immunisations avec pNAK438*.
souris Prolifration Scrtion d'IFN-y Anticorps (1S.) C3H 2.3 0.3 2.212.0 -C3H 1.81.1 ' 15.64.0 - ' C3H 3.21.3 0.50.2 -Positifs 213 1I3 BALB/c 4.3 ~ 1.6 26.2 t 6.3 -BALB/c 5.3 f 0.6 29.3 8.5 -BALB/c 15.3 t 2.2 12.7 t 8.7 -Positifs 313 I 313 - _. ~

* Les taux de réponses sont représentés par rapport aux réponses obtenues par une valeur seuil.
La valeur seuil est calculée en faisant la moyenne des réponses d'animaux non-immunisés et celle des animaux immunisés contre un antigène non-relevant, comme fOspC, une protéine de la Borrelia burgdorteri.
Tableau 4.2: Détection d'expression par IFI avec des anticorps humains immunopurifiés ou des sérums de souris spécifiques anti-Hiss-680 a-Hiss-680 Parasites* souris ou humains Sporozotes P. falciparum ++

Sporozotes P. yoel clone ++
1.1 Stade hpatique P. falciparum ++

Stade sanguin T23 ++/+++ (75%) anneaux/schizontes ++/+++ (75%) Stade sanguin NF54 anneaux/schizontes * Les sporozoïtes de Plasmodium falciparum viennent de la souche NF54.
T23: souche de provenance thaï; NF54 souche d'origine africaine.

Tableau 5.1: Réactivités croisées détectées en Western blots entre les membres de la famille Pf11-1 E : anticorps immunopurifiés (éluésj sur !es protéir3es recombinantes correspondantes.
P : protéine recorr~binante.
Tableau 5.2: F~éactivités croisées au niveau nucléotidique entre les clones de la famille Pfl1-1*
clones PM PCR571 -11 sonde contrle 43 +++ ++

88 ++ ~3 322 _++++-i- +++++
~ ~

52 5 _ ++++ +++++

563 ++++ ++++
~

571 __ ++--+-~-+
++-+-+-~
~

676f ++++-~- ++++
._ ~

729E +++ +++-+-+
._____ , - _ 2 6 3 ++++ N T
~
~

381 ++ N T
_ ~

453 +++ ~ ~
ill~T

* L'intensité du signai est symbolisé par des croix.
NT : non testé.
Réaction forte p~>~: ,~ -i; 1u ~
f ~, Réaction moyenne Tableau 5.3 : Homologies de séquences des clones étudiés par BLAST
Taille Rptitions Homologie Degr d'homologie nuclotidique'acides amins avec 571 lone (bp) Nuclotides Nuclotides Protines Protines DG43 900 PIVeELLEE Pf11-1 Part 1 :94 %, 80%, 80%
100% (=88) DG88 900 PIVeELLEE Pf11-1 Part 1 :94 %, Idem DG43 100%(=43) DG263-7253 Non P, falciparum Chr 12 95%, 60%

DG263-8176 Non P. f. CHR12 95%, 45% -humain chr22 58%

DG322-1500. - _ - -DG322-22000 PeeVLEEvI Pf11-1 86 %, 65% 79% -DG381 400 PEkIvEEVI plastid tRNA 100%, CHR2 -71%

DG453 300 PIVEEvVEE Pf11-1 Part 2 88%, 83% 93%, 7 2%

DG525 450 PeIeEVEvI GLURP R2 98%, 100% -DG563 438 PIVEEvvEE Pf11-1 Part 4 : 86%, 75%, 56%, Part 1 68%

DG571 550 PEEiIEEiv Pf11-1 Part 5 87 %, 55% 100 %, 100%

DG676f 2000 PvVEEvLEE Pf11.1 Part 488 %, Part 74%, 44%
5 75%

DG729E 1_7 - ma13P5100%

~ : raille estimée par rapport aux produits PCR obtenus, ou la taille précise lorsque le clone entier a été séquencé.
CNR : Chromosome; part : partie Tableau 5.4: Réactivité en IFI testés avec des anticorps spécifiques aux Hisg-571 et Vi571 Parasites a-Hiss-571, aVi571 souris ou humains Sporozo'ttes P. falcipanrm NF54 ++

Sporozotes P. yoel clone 1.'1 ++

Stade hpatique P. falciparum ++

Stade sanguin T23 anneaux/schizontes++/+++ (75%) Stade sanguin NF54 anneauxlschizontes++/+++ (75%) Tableau 5.5: Réponses cellulaires des souris immunisées avec pNAK571 Prolifration Interfron souche de sourislymphocytaire gamma Index de stimulation IUlml 571 pGEX NNpGEX 571 pGEX
NNpGEX

C3H morte 0.9 0.1 0.7 0.05 31.0 t 2.5 21.2110.6 C3H 0.90.2 0.70.1 30.212.6 10.502.03 C3H 0.80.2 0.90.2 16.810.1 6.652.8 Positifs OI3 - 2I3 -BALB/c 3.5 f 0.3 2.7 t 0.13 23.1 t 0.9 10.36 2.2 BALB/c 1.90.3 1.20.1 15.92.1 8.633.9 BALB/c (morte) 3.2 ~ 0.9 1.5 t 0.1 5.3 t 1.3 1.06 0.5 Positifs 2/3 - 313 -NNpGEX : recombinant de fusion GST de LSA3 non relevant.

Bien que la présente invention ait été décrite par rapport aux réalisation concrètes et privilégiée, il apparaftra toutefois évident aux personnes versées dans l'art ou la science en cause qu'il est possible d'introduire un certains nombres de variations et modifications sans déroger à la portée de l'invention 10 décrite et revendiquée dans ce document.

SÉQUENCE LISTING
<110> Institut Pasteur <120> ANTIG~NES DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET LEURS APPLICATIONS VACCINALES
ET DIAGNOSTIQUES
<130> 000466-0035 <150> CA 2,345,206 <151> 2001-05-16 <150> CA 2,346,968 <151> 2001-05-23 <160> 18 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 192 <212> DNA
<213> Plasmodium falciparum <400> 1 gaattccata tgcacgatta catatatgat gatcgtatct acaataatga taaagagaaa 60 aatgttataa aaagtgataa taaaaatgtt ataaaaagtg ataataaaaa tgattataaa 120 aagtgtaata aaaatgttat aaaaagtgat aataaaaatg ttataaaaag tgataataaa 180 aatgtggaat tc 192 <210>

<211>

<212>
DNA

<213>
Plasmodium falciparum <400>

gaattcccagatcctcgaagtaatgaccaagaagatgctactgacgatgttgtagaaaat60 agtagagatgataataatagtctctctaatagcgtagataatcaaagtaatgttttaaat120 agagaagatcctattgcttctgaaactgaagttgtaagtgaacctgaggattcaagtagg180 ataatgactacagaagttccaagtactacagtaaaaccccctgatgaaaaacgatctgaa240 gaagtaggagaaaaagaagctaaagaaattaaagtagaacctgttgtaccaagagccatt300 ggagaaccaatggaaaattctgtgagcgtacagtcccctcctaaggaattc 351 <210> 3 <211> 64 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <400> 3 Glu Phe His Met His Asp Tyr Ile Tyr Asp Asp Arg Ile Tyr Asn Asn ,~sp Lys Glu Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Asp Tyr Lys Lys Cys Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Glu Phe <210> 4 <211> 117 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <400> 4 ~lu Phe Pro Asp Pro Arg Ser Asn Asp Gln Glu Asp Ala Thr Asp Asp Val Val Glu Asn Ser Arg Asp Asp Asn Asn Ser Leu Ser Asn Ser Val .~sp Asn Gln Ser Asn Val Leu Asn Arg Glu Asp Pro Ile Ala Ser Glu Thr Glu Val Val Ser Glu Pro Glu Asp Ser Ser Arg Ile Met Thr Thr Glu Val Pro Ser Thr Thr Val Lys Pro Pro Asp Glu Lys Arg Ser Glu ~lu Val Gly Glu Lys Glu Ala Lys Glu Ile Lys Val Glu Pro Val Val Pro Arg Ala Ile Gly Glu Pro Met Glu Asn Ser Val Ser Val Gln Ser Pro Pro Lys Glu Phe <210> 5 <211> 5 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <400> 5 Asp Asn Lys Asn Val <210> 6 <211> 5 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <400> 6 Asp Asn Lys Asn Asp <210> 7 <21I> 6 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <900> 7 Asp Lys Glu Lys Asn Val <210> 8 <211> 7 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum <400> 8 Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val <210> 9 <211> 1524 <212> DNA
<213> Plasmodium falciparum <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1524) <223>

<400> 9 atg aag acg aca aaa gaa aat gac: aat aat aac ata gta cat tat gta 48 Met Lys Thr Thr Lys Glu Asn Asp Asn Asn Asn Ile Val His Tyr Val gat tgg ata aac cag att ttt aaa aag aat tct tta caa tgt gat tta 96 Asp Trp Ile Asn Gln Ile Phe Lys Lys Asn Ser Leu Gln Cys Asp Leu tat ttt ttg gat gac aac aaa gaa aaa gat gtt agt aag aaa aga aaa 144 Tyr Phe Leu Asp Asp Asn Lys G1~ Lys Asp Val Ser Lys Lys Arg Lys gctcaattg aaggatgaa tatgataat atatcaagg agcaaagaa aat 192 AlaGlnLeu LysAspGlu TyrAspAsn IleSerArg SerLysGlu Asn attaataat tccaaaaaa ataaaaaat gaattaagt ataaaagat aat 240 IleAsnAsn SerLysLys IleLysAsn GluLeuSer I1eLysAsp Asn atgcacgat tacatatat gatgatcgt at:ctacaat aatgataaa gag 288 MetHisAsp TyrIleTyr AspAspArg IleTyrAsn AsnAspLys Glu aaaaatgtt ataaaaagt gataataaa aatgttata aaaagtgat aat 336 LysAsnVal IleLysSer AspAsnLys AsnValIle LysSerAsp Asn aaaaatgat tataaaaag tgtaataaa aatgttata aaaagtgat aat 384 LysAsnAsp TyrLysLys CysASI1Lys AsnValIle LysSerAsp Asn aaaaatgtt ataaaaagt gataai:aaa aatgttata aaaagtgat aat 432 LysAsnVal IleLysSer AspAsnLys AsnValIle LysSerAsp Asn aaaaatgtt ataaaaagt gattat:aaa agtgatgat agaaatgct tgt 480 LysAsnVal IleLysSer AspTyr_Lys SerAspAsp ArgAsnAla Cys gatatttat aaaagtaat aaaaa<3aat gttcctgat aattgccat ata 528 AspIleTyr LysSerAsn LysLysAsn ValProAsp AsnCysHis Ile tatgatgat aatagttca gttgaaaat ttagatgga aaaaataaa tta 576 TyrAspAsp AsnSerSer ValGluAsn Le>.uAspGly LysAsnLys Leu aataatata aggaacata cataai:gat aactcatct tcatgcgat ata 624 AsnAsnIle ArgAsnIle HisAsnAsp AsnSerSer SerCysAsp Ile tccgatata aaaagtgaa gatgaatat atagaacca tatgaaaaa aag 672 SerAspIle LysSerGlu AspGluTyr IleGluPro TyrGluLys Lys aatgaagaa aatataaat gaatai.aag aataagaaa aatatagcc aat 720 AsnGluGlu AsnIleAsn GluTyrLys AsnLysLys AsnIleAla Asn gaaaatata aaagaagga aagagttca at:ttataat gatgaacat aat 768 GluAsnIle LysGluGly LysSerSer IleTyrAsn AspGluHis Asn tataattca ttattatat aattcttgt aatggtgaa ataagtaag atc 816 TyrAsnSer LeuLeuTyr AsnSerCys AsnGlyGlu IleSerLys Ile aacaaaata agtagtcat aataatatt gataataat atggataat tat 864 AsnLysIle SerSerHis AsnAsnIle A,spAsnAsn MetAspAsn Tyr 275 28() 285 ~ CA 02382977 2002-05-15 aatacgttt gcaaat gtgaataatttt ataatatat tcctcagat gat 912 AsnThrPhe AlaAsn ValAsnAsnPhe IleIleTyr SerSerAsp Asp gaagataat atatca aattattataat ggtaaagac gtattaaat gat 960 GluAspAsn IleSer AsnTyrTyrAsn GlyLysAsp ValLeuAsn Asp gagattatg ttccct ataaaatti=aat tttgaaaaa ttaaaaaaa aat 1008 GluIleMet PhePro IleLysPheAsn PheGluLys LeuLysLys Asn atttatgta atagag catatagacaaa atatattat gatacattt tta 1056 IleTyrVal IleGlu HisIleAspLys IleTyrTyr AspThrPhe Leu aataaaaat ccaagt gaaaaaagtgtt tttatgaat gatgaatct act 1104 AsnLysAsn ProSer GluLysSerVal PheMetAsn AspGluSer Thr ggttatttg aaaaat gatgtgaatgac aaatgtgtt gttgataat ata 1152 GlyTyrLeu LysAsn AspValAsnAsp LysCysVa1 ValAspAsn Ile aatgttatt aatcct tctagtgtgaat acgttgagt aatatttca aat 1200 AsnValIle AsnPro SerSerValAsn ThrLeuSer AsnIleSer Asn attaggaat gaaaaa atagaaaataat aataagaat gaaaaatta ata 1248 IleArgAsn GluLys IleGlufisnAsn AsnLysAsn GluLysLeu Ile 405 4'w0 415 aaatcatat cctaca caatcaaaaaat gttatgagt acattttcc ttt 1296 LysSerTyr ProThr GlnSerLysAsn ValMetSer ThrPheSer Phe tggaatatt gaaaag gagacatttata ac:aaaacct ttgtatgca caa 1344 TrpAsnIle GluLys GluThrPheIle ThrLysPro LeuTyrAla Gln aatttgaga aaaaaa caatttagttta ttagatgaa tctgaagag atg 1392 AsnLeuArg LysLys GlnPheSerLeu LeuAspGlu SerGluGlu Met ataagaaat tattca tctaatcaatat tctataaaa tttgtacca aga 1490 IleArgAsn TyrSer SerAsnGlnTyr SerIleLys PheValPro Arg catttatta tatgta atgagtcaagtt gcttctcga tcctttttt gat 1488 HisLeuLeu TyrVal MetSerGlnVal AlaSerArg SerPhePhe Asp cctttatat agaaag cagttattt=ttt cgttactaa 1524 ProLeuTyr ArgLys GlnLeuPhePhe ArgTyr <210> 10 <211>

<212>
PRT

~ CA 02382977 2002-05-15 <213> Plasmodium falciparum <900> 10 Met Lys Thr Thr Lys Glu Asn Asp Asn Asn Asn Ile Val His Tyr Val Asp Trp Ile Asn Gln Ile Phe Lys Lys Asn Ser Leu Gln Cys Asp Leu Tyr Phe Leu Asp Asp Asn Lys Glu Lys Asp Val Ser Lys Lys Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Glu Tyr Asp Asn Ile Ser Arg Ser Lys Glu Asn Ile Asn Asn Ser Lys Lys Ile Lys Asn Glu Leu Ser Ile Lys Asp Asn Met His Asp Tyr Ile Tyr Asp Asp Arg Ile Tyr Asn Asn Asp Lys Glu Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asr~ Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Asp Tyr Lys Lys Cys Asr: Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Asn Lys Asn Val Ile Lys Ser Asp Tyr Lys Ser Asp Asp Arg Asn Ala Cys Asp Ile Tyr Lys Ser Asn Lys Lys Asn Val Pro Asp Asn Cys His Ile Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Val Glu Asn Leu Asp Gly Lys Asn Lys Leu Asn Asn Ile Arg Asn Ile His Asn Asp Asn Ser Ser Ser Cys Asp Ile Ser Asp Ile Lys Ser Glu Asp G1u Tyr Ile Glu Pro Tyr Glu Lys Lys Asn Glu Glu Asn Ile Asn Glu Tyr Lys Asn Lys Lys Asn Ile Ala Asn Glu Asn Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Ile Tyr Asn Asp Glu His Asn Tyr Asn Ser Leu Leu Tyr Asn Ser Cys Asn Gly Glu Ile Ser Lys Ile Asn Lys Ile Ser Ser His Asn Asn Ile Asp Asn Asn Met Asp Asn Tyr Asn Thr Phe Ala Asn Val Asn Asn Phe I1e Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Glu Asp Asn Ile Ser Asn Tyr Tyr Asn G1y Lys Asp Val Leu Asn Asp Glu Ile Met Phe Pro Ile Lys Phe Asn Phe Glu Lys Leu Lys Lys Asn Ile Tyr Val Ile Glu His Ile Asp Lys I''~e Tyr Tyr Asp Thr Phe Leu Asn Lys Asn Pro Ser Glu Lys Ser Val Phe Met Asn Asp Glu Ser Thr Gly Tyr Leu Lys Asn Asp Val Asn Asp Lys Cys Val Val Asp Asn Ile Asn Val Ile Asn Pro Ser Ser Val Asn Thr Leu Ser Asn Ile Ser Asn Ile Arg Asn Glu Lys Ile Glu ASn Asn A:>n Lys Asn Glu Lys Leu Ile Lys Ser Tyr Pro Thr Gln Ser Lys Asn Val Met Ser Thr Phe Ser Phe Trp Asn Ile Glu Lys Glu Thr Phe Ile Thr Lys Pro Leu Tyr Ala Gln Asn Leu Arg Lys Lys Gln Phe Ser Leu Leu Asp Glu Ser Glu Glu Met Ile Arg Asn Tyr Ser Ser Asn G1n Tyr Ser I1e Lys Phe Val Pro Arg His Leu Leu Tyr Val Met Ser G1I1 Val Ala Ser Arg Ser Phe Phe Asp Pro Leu Tyr Arg Lys Gln Leu Phe Phe Arg Tyr <210> 11 <211> 5050 <212> DNA
<213> Plasmodium falciparum <220>
<221> CDS
<222> (1)..(4464) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (4557)..(9634) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (4751)..(4837) <223>
<220>
<221> CDS
<222> (4973)..(5047) <223>
<900> 11 atgaaa gggaaaatg aatatgtgt:ttgtt:tttt ttctattct atatta 48 MetLys GlyLysMet AsnMetCys LeuPhePhe PheTyrSer IleLeu tatgtt gtattatgt acctatgta ttaggtata agtgaagag tatttg 96 TyrVal ValLeuCys ThrTyrVal LeuGlyIle SerGluGlu TyrLeu aaggaa aggccccaa ggtttaaat:gttgagact aataataat aataat 144 LysGlu ArgProGln GlyLeuAsn ValG7.uThr AsnAsnAsn AsnAsn aataat aataataat aatagtaat agtaacgat gcgatgtct tttgta 192 AsnAsn AsnAsnAsn AsnSerAsn SerAsnAsp AlaMetSer PheVal aatgaa gtaataagg tttatagaa aacgagaag gatgataaa gaagat 240 AsnG1u ValIleArg PheIleGlu AsnGluLys AspAspLys GluAsp aaa aaa gtg aag ata ata tct aga cct gt:t gag aat aca tta cat aga 288 ~ CA 02382977 2002-05-15 LysLysValLys IleIleSer ArgProVal GluAsnThr LeuHisArg .

tatccagttagt tcttttctg aat;atcaaa aagtatggt aggaaaggg 336 TyrProValSer SerPheLeu AsnIleLys LysTyrGly ArgLysGly gaatatttgaat agaaatagt tttgttcaa agatcatat ataaggggt 384 GluTyrLeuAsn ArgAsnSer PheValGln ArgSerTyr IleArgGly tgtaaaggaaaa agaagcaca catacatgg atatgtgaa aataaaggg 432 CysLysGlyLys ArgSerThr HiaThrTrp IleCysGlu AsnLysGly aataataatata tgtattcct gatagacgt gtacaatta tgtataaca 480 AsnAsnAsnIle CysIlePro AspArgArg ValGlnLeu CysIleThr gctcttcaagat ttaaaaaat tcaggatca gaaacgact gatagaaaa 528 AlaLeuGlnAsp LeuLysAsn SerGlySer GluThrThr AspArgLys ttattaagagat aaagtattt gattcagct atgtatgaa actgatttg 576 LeuLeuArgAsp LysValPhe AspSerAl.aMetTyrGlu ThrAspLeu ttatggaataaa tatggtttt cgt;ggattt gatgatttt tgtgacgat 624 LeuTrpAsnLys TyrGlyPhe ArcsGlyPhe AspAspPhe CysAspAsp gtaaaaaatagt tatttagat tataaagat gttatattt ggaaccgat 672 ValLysAsnSer TyrLeuAsp TyrLysAsp ValIlePhe GlyThrAsp ttagataaaaat aatatatca aaqttagta gaggaatca ttaaaacgt 720 LeuAspLysAsn AsnIleSer Ly~>LeuVal GluGluSer LeuLysArg ttttttaaaaaa gatagtagt gtacttaat cctactgct tggtggaga 768 PhePheLysLys AspSerSer ValLeuAsn ProThrAla TrpTrpArg aggtatggaaca agactatgg aaaactatg atacagcca tatgctcat 816 ArgTyrGlyThr ArgLeuTrp Ly:~ThrMet IleGlnPro TyrAlaHis ttaggatgtaga aaacctgat gagaatgaa cctcagata aatagatgg 864 LeuGlyCysArg LysProAsp GluAsnGl.uProGlnIle AsnArgTrp attctggaatgg gggaaatat aat:tgtaga ttaatgaag gagaaagaa 912 IleLeuGluTrp GlyLysTyr AsnCysArg LeuMetLys GluLysGlu aaattgttaaca ggagaatgt tct:gttaat agaaaaaaa tctgactgc 960 LysLeuLeuThr GlyGluCys Ses-ValAsn ArgLysLys SerAspCys tcaaccggatgt aataatgag tgt;tatac:ctataggagt cttattaat 1008 SerThrGlyCys AsnAsnGlu Cy:~TyrThr TyrArgSer LeuIleAsn agacaa agatatgag gtctctata ttaggaaaa aaatatatt aaagta 1056 ArgGln ArgTyrGlu ValSerI1e LeuGlyLys LysTyrIle LysVal gtacga tatactata tttaggaga aaaatagtt caacctgat aatgct 1104 ValArg TyrThrIle PheArgArg LysIleVal GlnProAsp AsnAla ttggat tttttaaaa ttaaattgt tctgagtgt aaggatatt gatttt 1152 LeuAsp PheLeuLys LeuAsnCys SerGluCys LysAspIle AspPhe aaaccc ttttttgaa tttgaatat ggtaaatat gaagaaaaa tgtatg 1200 LysPro PhePheGlu PheGluTyr GlyLysTyr GluGluLys CysMet tgtcaa tcatatatt gatttaaaa atccaattt aaaaataat gatatt 1248 CysGln SerTyrIle AspLeuLys IleGlnPhe LysAsnAsn AspIle tgttca tttaatgct caaacagat actgtttct agcgataaa agattt 1296 CysSer PheAsnAla GlnThrAsp ThrValSer SerAspLys ArgPhe tgtctt gaaaagaaa gaatttaaa ccatggaaa tgtgataaa aattct 1344 CysLeu GluLysLys GluPheLys ProTrpLys CysAspLys AsnSer tttgaa acagttcat cataaaggt:gtatgtgtg tcaccgaga agacaa 1392 PheGlu ThrValHis HisLysGly ValCysVal SerProArg ArgGln ggtttt tgtttagga aatttgaac tatctactg aatgatgat atttat 1440 GlyPhe CysLeuGly AsnLeuAsn TyrLeuLeu AsnAspAsp IleTyr aatgta cataattca caactactt atcgaaatt ataatggct tctaaa 1488 AsnVal HisAsnSer GlnLeuLeu IleGluIle IleMetAla SerLys caagaa ggaaagtta ttatggaaa aaacatgga acaatactt gataac 1536 GlnGlu GlyLysLeu LeuTrpLys LysHisGly ThrIleLeu AspAsn cagaat gcatgcaaa tatataaat gatagttat gttgattat aaagat 1584 GlnAsn AlaCysLys TyrIleAsn AspSerTyr ValAspTyr LysAsp atagtt attggaaat gatttatgg aatgataac aactctata aaagtt 1632 IleVal IleGlyAsn AspLeuTrp AsnAspAsn AsnSerIle LysVal caaaat aatttaaat ttaattttt:gaaagaaat tttggttat aaagtt 1680 GlnAsn AsnLeuAsn LeuIleFhe GluArgAsn PheGlyTyr LysVal ggaaga aataaactc tttaaaaca attaaagaa ttaaaaaat gtatgg 1728 GlyArg AsnLysLeu PheLysThr IleLysGlu LeuLysAsn ValTrp ~ CA 02382977 2002-05-15 tggatattaaataga aataaagta tgggaa tcaatgagatgt ggaatt 1776 TrpIleLeuAsnArg AsnLysVal TrpGlu SerMetArgCys GlyIle gacgaagtagatcaa cgtagaaaa acttgt gaaagaatagat gaacta 1824 AspGluValAspGln ArgArgLys ThrCys GluArgIleAsp GluLeu gaaaacatgccacaa ttctttaga tggttt tcacaatgggca catttc 1872 GluAsnMetProGln PhePheArg TrpPhe SerGlnTrpAla HisPhe ttttgtaaggaaaaa gaatattgg gaatta aaattaaatgat aaatgt 1920 PheCysLysGluLys GluTyrTrp GluLeu LysLeuAsnAsp LysCys acaggtaataatgga aaatcctta tgtcag gataaaacatgt caaaat 1968 ThrGlyAsnAsnGly LysSerLeu CysGln AspLysThrCys GlnAsn gtgtgtactaatatg aattattgg acatat actagaaaatta gcttat 2016 ValCysThrAsnMet AsnTyrTrp ThrTyr ThrArgLysLeu AlaTyr gaaatacaatccgta aaatatgat aaagat agaaaattattt agtctt 2064 GluIleGlnSerVal LysTyrAsp LysAsp ArgLysLeuPhe SerLeu gctaaagacaaaaat gtaactaca ttttta aaggaaaatgca aaaaat 2112 AlaLysAspLysAsn ValThrThr PheLeu LysGluAsnAla LysAsn tgttctaatatagat tttacaaaa atattc gatcagcttgac aaactc 2160 CysSerAsnIleAsp PheThrLys IlePhe AspGlnLeuAsp LysLeu tttaaggaaagatgt tcatgtatg gataca caagttttagaa gtaaaa 2208 PheLysGluArgCys SerCysMet AspThr GlnValLeuGlu ValLys aacaaagaaatgtta tctatagac tcaaat agtgaagatgcg acagat 2256 AsnLysGluMetLeu SerIleAsp SerA.snSerGluAspA1a ThrAsp ataagtgagaaaaat ggagaggaa gaatta tatgtaaatcac aattct 2304 IleSerGluLysAsn GlyGluGlu GluLeu TyrVa:1AsnHis AsnSer gtgagtgtcgcaagt ggtaataaa gaaatc gaaaagagtaag gatgaa 2352 ValSerValAlaSer GlyAsnLys GluIle GluLysSerLys AspGlu aagcaacctgaaaaa gaagcaaa~acaaact aatggaacttta accgta 2900 LysGlnProGluLys GluAlaLys GlnTh AsnGlyThrLeu ThrVal ~ r cgaactgacaaagat tcagataga aacaaa ggaaaagataca 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<213> Plasmodium falciparum <400> 12 Met Lys Gly Lys Met Asn Met Cys Leu Phe Phe Phe Tyr Ser Ile Leu Tyr Val Val Leu Cys Thr Tyr Val Leu Gly Ile Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Arg Pro Gln Gly Leu Asn Val G~~.u Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Ser Asn Asp Ala Met Ser Phe Val Asn Glu Val Ile Arg Phe Ile Glu Asn Glu Lys Asp Asp Lys Glu Asp Lys Lys Val Lys Ile Ile Ser Arg Pro Val Glu Asn Thr Leu His Arg Tyr Pro Val Ser Ser Phe Leu Asn Ile Lys Lys Tyr Gly Arg Lys Gly Glu Tyr Leu Asn Arg Asn Ser Phe Val Gl.n Arg Ser Tyr Ile Arg Gly Cys Lys Gly Lys Arg Ser Thr His Thr Trp Ile Cys Glu Asn Lys Gly Asn Asn Asn Ile Cys Ile Pro Asp Arg Arg Val Gln Leu Cys Ile Thr Ala Leu Gln Asp Leu Lys Asn Ser Gly Ser G1u Thr Thr Asp Arg Lys Leu Leu Arg Asp Lys Val Phe Asp Ser Al.a Met Tyr Glu Thr Asp Leu Leu Trp Asn Lys Tyr Gly Phe Arg Gly Phe Asp Asp Phe Cys Asp Asp Val Lys Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Lys Asp Val Ile Phe Gly Thr Asp Leu Asp Lys Asn Asn Ile Ser Lys Leu Val Glu Glu Ser Leu Lys Arg 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Claims (49)

1. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la SEQ ID NO: 1 (DG747) ou la SEQ ID NO:2(DG772).

2. Polynucléotide selon la revendication 1, comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec la SEQ ID NO:1(DG747) ou la SEQ ID NO:2(DG772).

3. Polynucléotide selon la revendication 2, comprenant une séquence nucléotidique ayant au moins 95% d'identité avec la SEQ ID NO:1(DG747) ou la SEQ ID NO:2(DG772).

4. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend au moins nucléotides consécutifs identiques à la SEQ ID NO: 1 ou la SEQ ID NO: 2.

5. Polynucléotide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il s'hybride dans des conditions de fortes stringences avec un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4.

6. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

7. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il présente au moins 60%, d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772).

8. Polypeptide selon la revendication 7, présentant au moins 80%, d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772).

9. Polypeptide selon la revendication 8, présentant au moins 95%, d'homologie avec la SEQ ID NO: 3 (DG747) ou la SEQ ID NO: 4 (DG772).

10. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5 acides aminés consécutifs identiques à l'une des séquences choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 à 7, et la SEQ ID NO: 8.

11. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il présente au moins 40%, d'identité avec l'une des séquences choisies dans le groupe constitué par les SEQ ID NOs: 3 à 8, 10 et la SEQ ID NO: 12.

12. Polypeptide selon fa revendication 11, dans lequel le pourcentage d'identité est d'au moins 60%.

13. Polypeptide selon la revendication 12, dans lequel le pourcentage d'identité est d'au moins 80%.

14. Polypeptide selon la revendication 13, dans lequel le pourcentage d'identité est d'au moins 95%.

15. Polypeptide recombinant ou chimérique caractérisé en ce qu'il comprend au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 6 à 14.

16. Antigène isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou en un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 6 à 15.

17. Conjugué antigénique constitué de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et/ou de polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15; et d'un support sur lequel lesdits polynucléotides/
polypeptides sont adsorbés.

18. Conjugué selon la revendication 17 caractérisé en ce que le support est constitué de microsphères, de microparticules de billes de latex, de microparticules de polyphosphoglycans (PGLA) ou de microparticules de polystyrène.

19. Utilisation d'un conjugué selon la revendications 17 ou 18, pour l'immunisation d'individus infectés ou susceptibles d'être infectés par le paludisme.

20. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides, polypeptides et/ou conjugués définis aux revendications 1 à 18.

21. Anticorps selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'ils sont humanisés.

22. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

23. Un vecteur selon la revendication 22, dans lequel la dite séquence polynucléotidique est incorporé dans un site non essentiel à la réplication dudit vecteur.

24. Un vecteur selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi dans le groupe constitué par les plasmides, les cosmides et les phages.

25. Cellule hôte comprenant un vecteur selon l'une quelconque des revendications 22 à 24.

26. Cellule E.Coli recombinante choisie parmi les cellules déposées à la C.N.C.M. le 23 Mai 2001 sous les numéros d'accession I-2671 et I-2672.

27. Composition immunogène comprenant:
- au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, des conjugués selon la revendication 17 ou 18; et - un véhicule pharmaceutique acceptable.

28. Composition immunogène selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'elle contient de plus au moins un composé choisi dans le groupe constitué
par l'alun, le QS21, le montanide, l'adjuvant SBAS2 et l'adjuvant incomplet de Freund.

29. Composition immunogène selon la revendication 26 ou 27, caractérisée en la molécule polypeptidique est adsorbé sur des microparticules.

30. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
29, dans laquelle ladite molécule polynucléotidique est sous forme d'ADN.

31. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
30, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus au moins un épitope choisi dans le groupe constitué par: les protéines CS, MSP-1, MSP-3, LSA-1,TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II et LSA-3.

32. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
31, caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention d'une réponse cellulaire et/ou humorale in vivo et/ou in vitro.

33. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
32, caractérisée en ce qu'elle permet la production d'interféron-y par des leucocytes de sujets immunisés par des sporozoïtes irradiés.

34. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
33, caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention d'une réponse humorale IgG.

35. Composition immunogène selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle permet l'obtention de réponse humorale de type IgG1, IgG2, IgG3 et/ou IgG4.

36. Composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 26 à
35, caractérisée en ce qu'elle est capable d'induire, in vivo et in vitro, une protection par une infection d'épreuve par Plasmodium falciparum.

37. Vaccin anti-palustre comprenant:
- au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, des conjugués selon la revendication 17 ou 18; et - un véhicule pharmaceutique acceptable.

38. Vaccin selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins un épitope choisi dans le groupe constitué par: les protéines CS, MSP-1, MSP-3, LSA-1,TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II et LSA-3.

39. Composition pharmaceutique comportant à titre de substance active un ou plusieurs anticorps polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 20 ou 21, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.

40. Composition pharmaceutique selon la revendication 39, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus au moins un composé choisi dans le groupe constitué
par l'alun, le QS21, le montanide, l'adjuvant SBAS2 et l'adjuvant incomplet de Freund.

41. Utilisation d'au moins un des éléments suivants: polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, conjugués selon la revendication 17 ou 18;
anticorps selon la revendication 20 ou 21; pour la fabrication d'un médicament destiné
au traitement du paludisme.

42. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum comprenant les étapes suivantes :
a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec un anticorps selon la revendication 20 ou 21 afin de permettre la formation de complexes immuns; et b) la détection in vitro des complexes immuns formés.

43. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum comprenant les étapes suivantes :
a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu susceptible d'être infecté par Plasmodium falciparum avec au moins un des éléments suivants: des polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5; des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, des conjugués selon la revendication 17 ou 18; afin de permettre la formation de complexes immuns impliquant au moins un desdits éléments et des anticorps éventuellement présents dans ledit tissu ou ledit fluide biologique; et b) la détection in vitro des complexes immuns éventuellement formés.

44. Méthode selon la revendication 42 ou 43, caractérisée en ce qu'à l'étape a), le tissu et/ou le fluide biologique est de plus mis en contact avec au moins un épitoge choisi dans le groupe constitué par: les protéine CS, MSP-1, MSP-3, LSA-1,TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II ou LSA-3.

45. Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme comprenant les éléments suivants:

a) au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: les polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5; les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, les conjugués selon la revendication 17 ou 18;
b) des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins une des éléments définis en (a); et c) des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison.

46. Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme comprenant les éléments suivants:
- des anticorps selon la revendication 20 ou 21;
- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps; et - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite réaction de liaison.

47. Le kit selon la revendication 45 ou 46, caractérisé en ce qu'il comprend de plus au moins une molécule peptidique choisie dans le groupe constitué par;
les protéine CS, MSP-1, MSP-3, LSA-1,TRAP, STARP, SALSA, SALSA I, SALSA II
et LSA-3.

48. Le kit selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, caractérisé en ce qu'il comprend également l'adjuvant SBAS2.

49. Le kit selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, caractérisé en ce que les réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps portent un marqueur pouvant être reconnu par un second réactif marqué.