CA1245216A - Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogenes les contenant - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à un procédé pour préparer une composition immunogène contenant un ou plusieurs polypeptides contenus dans des parasites du paludisme, infectieux pour l'homme, ces polypeptides étant plus particulièrement aptes à réagir avec des anticorps protecteurs provenant de singes résistant aux parasites humains du paludisme et notamment à des espèces de Plasmodium falciparum, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à traiter une préparation préalablement obtenue d'un parasite malarique infectieux, notamment du type plasmodium, tel que Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent susceptible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiniques du parasite, à séparer et à récupérer à partir de la solution formée ceux des polypeptides qui présentent des poids moléculaires moyens s'étageant d'environ 50.000 à environ 140.000 et contenant des polypeptides immunogènes et capables à la fois d'induire la production d'anticorps protecteurs contre des parasites infectieux contre l'homme et/ou le singe et d'être reconnus par des anticorps protecteurs obtenus à partir de singes immunisés.

Description

L'invention concerne des fractions polypeptidi-ques induGtrices d'anticorps pro-tec-teurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions immunogènes les contenant, suscep-tibles de conduire à
la production de vaccins pour ]'homme et l'animal.
Elle est egalement relative aux an-ticorps specifiques induits _ vivo par ces fractions.
L'expression "fractions polypeptidiques" est utilisee dans le texte qui suit pour la commodite du langage. Elle ne doit pas être interpretee de façon restrictive. Il peut s'agir en fait de fractions de proteines ou de fractions immunogeniques ayant une structure chimique distincte, par exemple contenant des antigènes saccharidiques ou glycoproteiniques ou glycopeptidiques.
En d'autres termes, l'expression "polypeptide"
designe en fait tout constituant peptidique ou protei-nique, notamment du type proteine ou glycoproteine, tel que ceux qui peuvent être obtenus à partir de 2Q Plasmodium falciparum ou de parasites du paludisme susceptibles d'infecter l'homme ou des primates.
On sait que chez l'homme ou l'animal qui a ete atteint par le paludisme et qui est devenu resistant, il existe des anticorps contre des formes erythro-cytaires du parasite. L'existence de ces anticorps peut être démontree par la protection qui peut tempo-rairement être conferee à un animal non immunise, sensible ou "naif", par transfert passif à celui-ci d'un immunserum d'un animal immunise ou d'immuno-globulines purifiees à partir de ce serum.

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Plusieurs tentatives d'isolement d'un principe immu-nogène protecteur à partir d'extraits de diverses espèces de parasites responsables d'une forme correspondante du paludisme ont été décrites dans la littérature technique.
Plus récemment, la technologie des hybridomes a permis d'isoler de nouveaux anticorps susceptibles d'être mis en oeuvre dans l'analyse des antigènes des constituants des parasites du paludisme.
C'est ainsi que YOSHIDA et Coll. (1980) Science, 207, 71, ont isolé un antigène capable d'induire une réponse immunitaire protectrice chez des rongeurs. D'autres labo-ratoires ont également rnis en oeuvre la technologie des hybridomes dans le but d'isoler des anticorps dirigés contre certaines espèces de Plasmodium falciparum, capables notamment d'infecter la souris. Des lignées d'hybridomes secréteurs d'anticorps, capables d'inhiber la croissance du parasite en culture ont été décrites par PERRIN et Coll. (1981), Nature, 289-301. Ces auteurs ont montré que les anticorps monoclonaux produits avaient des propriétés d'inhibition en culture d'une souche de P. falciparum capable d'infecter la souris.
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Un principe antigénique présenté comme pouvant être utilisé pour la constitution de vaccins contre le palu-disme a été décrit dans la demande de brevet européen n 0071705. Ce principe actif, obtenu notamment à partir de parasites de l'espèce Plasmodium, présente les carac-téristiques suivantes :
~ 1) sa masse moléculaire est de 1,8 x 105 à 2,5 x 105 ;
; 2) il est associé avec les membranes des formes schizontes érythrooy~aires~ ou mérozoites du parasite et 3) ce principe antigénique est susceptible d'être frag-menté,au sein même des érythrocytes,infectés en fragments plus petits possédant les mêmes propriétés antigéniques;
ledit antigène ou les fragments formés à partir de celui-~' ' ci étant associés aux surfaces membranaires des méro-zoites.
Parmi le8 Plasmodium cités, certains étaient des Plasmodium falciparum d'origine humaine.
La demande de brevet européen décrit également un procédé pour isoler ce principe antigénique, procédé qui comprend la solubilisation d'érythrocytes comprenant des formes schizontes du parasite Plasmodium, la mise en contact de la matière solubilisée avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine antigénique re-cherchée, de préférence préalablement fixés sur un sup- -port solide, pour former un complexe anticorps-antigène, l'élimination des protéines ou polypeptides non engagés dans le complexe ou non fixés et la récuparation de la protéine antigénique à partir du complexe anticorps-antigène. Les anticorps monoclonaux avaient été obtenus à partir d'hybridomes sélectionnés parmi des hybrides cellulaires, eux-mêmes obtenus par fusion entre des cellules de souris préalablement immunisées avec le parasite choisi et des cellules de myélome.
Des résultats démontrant le caractère protecteur du principe antigénique ainsi obtenu à l'égard de la souris ont effectivement été rapportés.
Bien que prometteurs, ces résultats doivent être considérés avec précaution. En effet, les parasites (pa-ludiques) infectieux pour l'homme et le primate ne le sont pas en général pour la souris et vice versa. On ne peut donc exclure que dans les systèmes antérieurement décrits, le système immunitaire de la souris ait reconnu des déterminants antigéniques contenus dans les extraits utilisés pour l'immunisation, n'étant cependant pas aptes à induire des anticorps réellement protecteurs pour le primate ou l'homme. Certes des antigènes obtenus étaient susceptibles d'être reconnus par des immunsérums humains in vitro, par exemple dans des expériences d'immuno-: - .

précipitation. Des résultats quant à leur activité pro-tectrice chez le singe ou l'homme n'ont pas été rappor-tés.
L'invention a pour but de fournir un principe actif perfectionné immunogène susceptible d'être obtenu à par-tir des diverses espèces de parasites connues ou sus-ceptibles d'être reconnues pour être capables d'infecter l'homme ou le primate,qui présente une aptitude plus certaine à la vaccination humaine contre la malaria ou le palu-disme. Elle a encore pour but l'obtention d'un procédépermettant ,d'obtenir de tels principes immunogènes.
La composition immunogène selon l'invention contient un ou plusieurs polypeptides contenus dans des parasites du pa-ludisme, infectieux pour l'homme, ces polypeptides étant plus particulièrement aptes à
réagir avec des anticorps protecteurs provenant de sin-ges résistant aux parasites humains du paludisme et no-tamment à des espèces de Plasmodium falciparum.
L'invention met à profit le fait qu'il est en effet possible d'adapter au singe Saimiri Sciureus (ou Aotus trivirgatus, ou encore Rhésus) des parasites infectieux pour l'homme, notamment Plasmodium falciparum et d'ob-tenir une infectioncomparable,en tous points identique à l'infection humaine. Les animaux peuvent être rendus ; 25 résistants par une infection expérimentale, suivie d'un traitement approprié, notamment par la quinine. Cette résistance est directement liée à l'apparition chez ces animaux d'anticorps protecteurs. On rappelle que le pa-rasite injecté chez un premier singe, puis ayant fait l'objet de passages successif`s dans plusieurs singes, s'y adapte au point de devenir virulent pour le singe, et plus particulièrement chez le singe splénectomisé.
En particulier, l'invention concerne des fractions polypeptidiques obtenues à partir de P. falciparum com-prenant les polypeptides ayant des poids moléculaires .

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moyennes s'étagean-t d'environ 72.000 à environ l'LO . 000, - qui sont induc-trices notammen-t chez le singe, et plus particulièrement le singe Saimiri Sciureus, d'anticorps actifs con-tre des parasi-tes du paludisme, plus particulièremen-t de Plasmodium falciparum ou des parasi-tes qui presentent les mêmes caracteristiques biologiques essentielles, - qui sont reconnues par des serums ou autres compo-1~ sitions d'immunoglobulines provenant d'animaux, notam-ment de singes Saimiri Sciureus, résistants au para-site, ces serums ou autres compositions d'immuno-globulines etant capables, par transfert passif ln vivo à des animaux sensibles au parasite, de les proteger contre ledit parasite.
On remarquera que ces fractions polypeptidiques sont egalement reconnues par les anticorps provenant d'individus adultes residant en zone endemique et pre-sentant un degre de resistance eleve à P. falciparum.
Le pouvoir portecteur du serum de -tels individus a dejà ete montre lors d'experiences de transfer-t passif chez des enfants atteints de paludisme (COHEN et Coll., 1961, Nature, 192:733).
Avantageusement, les compositions immunogènes de l'invention sont obtenues à partir de la souche de Plasmodium falciparum qui a fait l'objet d'un depot à
la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris (C.N.C.M.) sous le n FUPC I-212 le 23 decembre 1982.
Un premier groupe de fractions polypeptidiques preferees possedant les proprietes sus-indiquees sont en outre caracterisees par des poids moleculaires moyens de 72.000, 75.000 76.000, 80.000 ou 90.000 daltons. Des fractions polypeptiques particulièrement preferées de l'invention presentent des poids molé-culaires de l'ordre de 75.000 -~ 5.000.

~2~5~ ~.i ~n autre groupe de fractions polypep-tidiques pré-férées de l'invention concerne des composi-tions poly-peptidiques caracterisées par des polypeptides présen-tan-t les poids moléculaires suivan-ts : 90.000, 95.000, 100.000, 110.000, 115.000 et 130.000 dal-tons, au sein d~ln ensemble complexe s'étageant de 83.000 à 140.000 daltons. En particulier, l'invention concerne des fractions polypeptidiques ayant une masse moléculaire moyenne de l'ordre de 100.000 + 10.000.
L'invention concerne également plus particulière-ment les fractions davantage purifiées présentant des poids moléculaires respectivement contenus dans les intervalles 72.000 + 2.000 et 90.000 + 5.000 daltons.
L'ensemble des polypeptides de poids moléculaires qui précèdent peuvent être mis en évidence par incor-poration métabolique d'acides aminés marqués, par exemple la méthionine35S.
~ ne troisième catégorie de fractions poly-peptidiques ayant des caractéristiques immunogènes protectrices sont caractérisées par des poids molécu-laires moyens de l'ordre de 50.000 + 5.000. L'inven-tion concerne plus spécialement parmi ces dernières fractions celles qui ne peuvent pas être mises en évidence par l'incorporation métabolique d'acides aminés marqués, tels que la méthionine35S.
Les masses moléculaires indiquées dans ce qui précède résultent des mesures comparatives dans un système électrophorétique, d'une part, des distances de migration des fractions concernées et, d'autre 3~ part, des distances de migration mesurées, dans des conditions semblables de peptides de poids molécu-laires connus, plus particulièrement des IgG humaines, la sérumalbumine bovine (BSA), l'ovalbumine de poulet, la phosphorylase B et la myosine.

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Avantageusement les polypeptides et peptides utilisés sont marqués radioactivement ou non radioactivement, par exemple à l'lsothyocyanate de fluorescéine.
L'invention concerne encore des préparations davan-tage purifiées, caractérisées par leur capacité à réagiravec l'anticorps monoclonal du type IgC2a, secrété par l'hybridome déposé à la C.N.C.M. le 20 décembre 1983 sous le n I-271 et obtenu par fusion cellulaire de myé-lome (souche Sp2/0-Ag 14) et de cellules spléniques de souris Balblc immunisées avec des fractions de poids moléculaires moyens de 100.000 daltons obte-r;us à partir de la susdite souche FUPC I-212. Cet anti-corps monoclonal réagit spécifiquement avec un antigène de poids moléculaire 90.000, spécifiquement re-connu par des immunoglobulines protectrices obtenues à
partir d'un singe immunisé Saimiri Sciureus.
Plasmodium falciparum est bien connu des spécialis-tes. Les schizontes et les mérozoites de ce parasite ont déjà été utilisés pour réaliser des vaccins expérimentaux contre la malaria, notamment chez le singe [MITCHELL et al, (1977), Lancet, i, 1335, et SIDDIQUI, W.A. (1977), Science, 197, 388 (1977)]. Les résultats biologiques ob-servés chez le singe et rapportés dans ce dernier ar-: ~ \
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-ticle intitulé "An effective immunization of experi-mental monkeys against the human malaria parasite, Plasmodium falciparum" peuven-t être considéres comme significatifs et extrapolables aux résultats qui pourraient etre observés chez l'homme.
La capacité de ce même parasite d'infecter les singes Saimiri Sciureus est bien connue aussi (GYSIN
et al, 1980, J. Parasitol. 66: 1003). Il a également été montré que cet animal manifeste une réponse humorale élevée (GYSIN e-t al, 1982, Ann. Immunol.
(Institut Pasteur) 133D: 95) et que des anticorps pro-tecteurs sont produits dans la phase chronique de l'infection (GYSIN et al, 1982, Parasite Immunol. 4:
421).
L'invention concerne donc toutes préparations obtenues à partir de parasites infectieux pour l'homme ou le primate, susceptibles de réagir avec ces anti-corps protecteurs (sérum, ascites provoquées chez l'animal ou immunoglobulines davantage purifiées à

2~ partir de ce sérum), obtenues à partir de singes Saimiri Sciureus immunisés.
La présence des anticorps protecteurs dans le sérum de l'animal, particulièrement le singe, peut etre appréciée par la capacité induite par le sérum de l'animal immunisé (ou les immunoglobulines qui en sont extraites) de protéger ne fut-ce que temporairement seulement un animal non immunisé~ le cas échéant splénectomisé, et sensible contre le parasite, notam-ment la souche FUPC I-212, lorsque ce sérum est 3Q passivement transféré in vivo l'animal immunisé à
l'animal non immunisé.
En particulier, on pourra utiliser comme source d'anticorps protecteurs pour la reconnaissance des fractions polypeptidiques conformes à l'invention les sérums, ascites ou fractions immunoglobuliniques obte-nues à partir de singes et qui sont capables, par ~r - 8a --transfert passif ln vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection parasitaire, lorsque ceux ci ont reçu au préalable, par voie intraveineuse, ~

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ure lnjection de 50 x 10 cellules parasitées, elles-memes obtenues à partir de singe spl~ncctomisé et infecté
et prélevées au moment où l'infection était aiguë et en phase ascendante. De préférence, on aura recours à des sérums, ascites ou fractions immunoglobullniques qui per-mettent cette protection, lorsqu'ils sont administrés à
l'animal sensible à des doses telles que la teneur du sang en immunoglobulines reçues par l'animal receveur ne dépasse pas 1 mg par ml. Chez Saimiri Sciureus, or, peut utiliser à titre de source d'anticorps protecteurs les immunoglobulines qui permettent la susdite protec-tion, lorsqu'ils sont administrés - deux à trois jours après l'infection - à l'animal receveur par voie intra-péritonéale, à raison de doses quotidiennes de 3 à 10 mg d'immunoglobulines, ou par voie intraveineuse, à raison de doses quotidiennes de 0,5 à 2 mg d'immunoglobulines, pendant une durée de 3 à 6 jours. L'effet protecteur est lui-même évalué par l'inhibition et le contrôle alors observé de la parasitémie pendant et après le traitement, par comptage ~sous le microscope~ des pourcentages de globules rouges parasités dans des frottis de sang coloré
par le Giemsa.
Les parasites utilisés pour l'invention peuvent être constitués par la souche de P. falciparum FUPC I-212 sus-dite Les animaux immunisés, en particulier les singesSaimiri Sciureus, sont dcs animaux qui ont pu être eux-mêmes exposés aux parasites infectieux et traités soit par chimiothérapie, par exemple la quinine, soit par administration d'immunoglobulines protectrices provenant ~ d'un autre animal, lui-même immunisé. D'une façon géné-; rale, ces anticorps protecteurs sont présents dans des animaux en état d'infection ou de sub-infection chro-:
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nique. Il est a cet égard significa-tif que les anti-corps protecteurs peuvent n'être pas présents en quan-tités significative a la fin de la période d'infection aiguë chez l'animal receveur, bien qu'a ce moment-la des titres élevés d'anticorps anti-malariques peuvent être détectés ln vi-tro par des techniques classiques d'immunofluorescence. Ces anticorps protecteurs sont par contre susceptibles d'apparaltre dans un délai de 30 à 90 jours, à compter de la fin de l'infection aiguë.
De plus, la présence d'anticorps protecteurs n'est souvent pas corrélable avec la teneur du sérum en anticorps avant une activité inhibitrice ln vitro.
En particulier, on constate que des préparations d'immunoglobulines peuvent, par transfert passif in vivo, dans les conditions qui ont été indiquées, manifester une activité protectrice importante, tout en étant dépourvues d'effet inhibiteur in vitro contre le parasite en culture dans des globules rouges humains ou du singe Saimiri Sciureus.
La source d'immunoglobulines utilisable pour la détection des polypeptides selon l'invention soit est constituée par un sérum entier contenant lesdits anti-corps immunoprotecteurs, soit par des ascites préala-blement provoqués chez l'animal protégé, soit encorepar des fractions d'immunoglobulines obtenues à partir du serum ou de l'ascite. Les conditions dans lesquel-les les ascites peuvent être formés sont connues. On rappelle pour mémoire que ceux-ci peuvent par exemple être formés par injection intrapéritonéale d'adjuvant de Freund émulsionné dans une solution saline appro-priée. Des immunoglobulines davantage purifiées peuvent etre obtenues à partir du sérum ou de l'ascite, de façon en soi connue également, par exem-ple par passage du fluide sur un support, par exemplecelui commercialisé sous la désignation "SEPHAROSE
4B", sur lequel au préalable a été fixée de la sx~q~

protéine A. La fixation des immunoglobuline3 peut être ef`f`ectuée en présence d'un tampon phosphate pH 7,4. Les immunoglobuline~s fixées peuvent ensuite, après lavage poussé de la colonne avec un tampon adéquat, par exemple le tampon PBS, etre éluées avec de l'acide acétique 1M, puis neutralisées, dialysées contre du PBS et avantageu-sement concentrées jusqu'à atteindre un volume du rnême ordre de grandeur que le volume de sérurn ou d'ascite initialement mis en oeuvre.
lOUne caractéristique supplémentaire des anticorps protecteurs intervenant dans la caractérisation des frac-tions polyp,eptidiques selon l'invention réside dans leur.
capacité à reconna1tre non seulement des polypeptides de poids moléculaire élevé, par exemple de l'ordre de 15200.000, parmi les produits de dissolution du parasite, mais également des fractions polypeptidiques de plus faible poids moléculaire conformes à l'invention (ayant notamment des poids molélculaires s'étageant entre 75.000 et lO0.000). En cela ils se distinguent d'anti-corps non protecteurs qui reconnaissent les poids moléculaires élevés et ne reconnaissent pas les poids moléculaires 75.000 et lO0.000.
L'invention concerne encore plus particulièrement des polypeptides "intacts" en ce sens qu'ils ne consis-tent pas en des fragments de protéines membranaires ayantinitialement eu des poids moléculaires plus élevés, syn-thétisés au stade des schizontes et ayant ensuite subi une digestion intracellulaire. En particulier, des poly-~: peptides immunologiquement identiques à des polypeptides . 30 préférés de l'invention ( ayant un poids moléculaire del'ordre de 76Ø00) peuvent être synthétisés dans un sys-: tème non cellulaire ou "exempt de cellules" (cell free system), notamment dans un lysat de réticulocytes de lapin, par traduction in vitro d'ARNs messagers extraits du para-~ 35 site au stade schi~onte, dans des conditions où les pro-: téines synthétisées sont rendues résistantes à la diges-~ tion tryptigue. Avantageusement la traduction est réali-L;'15'~

sée en présence de microsomes de rein de chien, ajou-tés au préalable au lysat. Les memes observations peuvent etre faites avec les autres polypeptides capa-bles de réagir avec des anticorps protecteurs et pré-sentant des poids moléculaires analogues moyens à ceuxqui ont été mentionnés plus hau-t, et en particulier des polypeptides ayant des poids moléculaires de 72.000, 76.000, 90.000, 100.000 et 110.000. Ces observations suggèrent donc que les ARNs messagers mis 1~ en oeuvre en contenaien-t certains qui étaient spécifi-ques de ces polypeptides, de sorte que ceux-ci ne résultaient pas, meme à l'occasion de la traduction intracellulaire des ARNs messagers correspondants, de la degradation de protéines possédant en fait des poids moléculaires plus élevés.
L'invention concerne encore un procédé d'obten-tion de tels polypeptides protecteurs, comportant les étapes consistant à traiter une préparation préalable-ment obtenue d'un parasite malarique infectieux, notamment du type plasmodium, tel que Plasmodium falciparum avec une solution d'un détergent, tel que le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) ou celui connu sous la ; désignation commerciale TRITON x 100, ou analogue, susceptible d'induire la dissolution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiniques du parasite, à séparer et à récupérer à
partir de la solution formée ceux des polypeptides qui présentent les susdits poids moléculaires moyens ou contenus dans les intervalles de poids moléculaires

3~ moyens qui ont été indiqués plus haut et qui contien-nent des polypeptides immunogènes et capables à la fois d'induire la production d'anticorps protecteurs contre des parasi.tes infectieux contre l'homme et/ou le singe et d'etre reconnus par des anticorps protec-teurs obtenus à partir de singes immunisés. De préfé-rence, le traitement susdit de dissolution est effec-,~

- lZa -tué en présence d'un inhibi-teu.r de protéases~
Une purification supplémentaire peut etre obtenue par réactlon avec ces anticorps protecteurs ou équiva-lents, préalablement fixés sur un support insoluble.
Par "anticorps équivalents", on entend ici des an-ticorps --5~

préalablement formés et capables de réagir avec les mêmes peptides immunogènes. Il s'agit par exemple d'anti-corps monoclonaux obtenus à partir d'hybridomes résultant de fusions cellulaires ayant mis en jeu des souri& immu-nisées contre des fractions extraites de P. falciparumet correspondant à l'un des poids moléculaires sus-indiqués. On peut ensuite recueillir les polypeptides immunogènes ayant formé un complexe avec l'anticorps utilisé, par exemple en ayant recours à une technique semblable à celle qui a été indiquée plus haut,lorsqu'a été décrit un exemple d'enrichissement des immunoglobu-lines contenues dans un sérum ou ascite d'un animal immunisé contre les parasites.
Avantageusement, il s'agit d'anticorps obtenus à
partir d'hybridomes formés à partir de cellules de souris et immunisées contre l'un des polypeptides capables à
la fois d'induire la production d'anticorps producteurs contre des parasites infectieux et d'être retenus par les anticorps producteurs obtenus à partir de singes immu-nisés. Un anticorps monoclonal préféré pour réaliser lapurification de l'un des peptidès conformes à l'invention est constitué par l'anticorps déposé à la C.N.C.M. sous le n I-271.
En variante, on peut également obtenir des fractions immunogènes conformes à l'invention à partir de la sus-dite solution des structures cellulaires et des consti-tuants protéiniques du parasite, par mise en contact direct de cette solution avec un anticorps fixé, tel que sus-défini, puis dissocier le complexe formé en vue de récupérer les antigènes fixés et, le cas échéant, sé-~; parer et récupérer les différents polypeptides immuno-gènes présents,selon leurs poids moléculaires respectifs.
L'invention n'est pas limitée aux susdites fractions.
Elle s'étend encore aux fractions polypeptidiques qui peuvent être obtenues à partir de parasites qui peuvent être considérés comme des dérivés ou même encore des mutants de .

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Plasmodium falciparum. Notamment sont inclus dans le ca-dre des revendications de cette demande tous les polypep-tides immunogènes, qui sont reconnus par des anticorps protecteurs, obtenus à partir d'animaux résistants à la souche de Plasmodium falciparum déposée à la C.N.C.M.
90U~S le n FUPC I-212 le 23 décembre 1982, et plus parti-cuIièrement encore les anticorps protecteurs plus spéci-i ; . . . : .,:
fiques susceptibles d'être obtenus à partir des animauximmunisés avec les polypeptides protecteurs selon l'in-vention issus de cette même souche. Sont également inclusdans le cadr,e de la présente demande les polypeptides ob-tenus à partir de parasites malariques infectieux, quelle que soit leur origine, qui sont à la fois protecteurs et reconnus par des anticorps monoclonaux secrétés par les hybridomes formés dans les conditions qui ont également été indiquées, en mettant en oeuvre, pour l'immunisation des animaux donneurs des cellules spléniques requises, les polypeptides conformes à l'invention et obtenus à
partir de la souche FUPC I-212.
Il en est particulièrement ainsi des polypeptides issus de souches autres que P.falciparum, et qui sont re-connus par les anticorps de singe protecteurs et éven-tuellement par l'anticorps monoclonal secrété par l'hybri-dome I-271 identifié plus haut. A titre d'exemple de "sources" de polypeptides conformes à l'invention, on mentionne P. vivax, P. ovale, P. chabaudi, P. yoelli, P. ~owlesi, etc D'une fa$on générale, on pourra, à partir d'une pré-~; paration donnée de parasites, déterminer ceux des cons-tituants protéiniques susceptibles d'induire in vivo la ; 30 production d'anticorps protecteurs en procédant comme sult.
On part d'une culture du parasite étudié, préalable-ment réalisée au sein d'un milieu de culture contenant un marqueur radioactif spécifique des constituants pro-téiniques des parasites en question, tel que la méthio-; nine35S. Les constituants parasitaires sont alors re-:
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cueillis et traités comme iL a été décrit plus haut en ce qui concerne Plasmoclium falciparum ou de façon plu5 détaillée dans les exemples qui suivent, mais en vue de dissoudre la majeure partie des constituants cellulaires et protéiniques du parasite choisi, sauf que l'on utilise le détergent TRITON X100 en lieu et place du SDS. Le TRITON X100 solubilise en effet les protéines antigéni-ques sans altérer profondément leur structure, de sorte qu'elles peuvent toujours encore être reconnues par des anticorps. On procède alors aux séries d'opérations sui-vantes.
Première serie_d'operations :
a) On fait une électrophorèse d'un échantillon de l'ensemble des constituants protéiniques des parasites.
On obtient toute une série de bandes visualisables par autoradiographie. Par comparaison avec des protéines dont les poids moléculaires sont connus, on détermine les suc-cessions de poids moléculaires, par rapport aux migra-tions réalisées de fason concomitante par des peptides de poids moléculaires connus.
b) Partant d'un échantillon distinct desdits consti-tuants protéiniques (il s'agit toujours de la préparation marquée), on le fait réagir avec un sérum contenant des anticorps protecteurs et provenant d'un singe résistant au parasite ; on fait ensuite réagir l'ensemble avec la protéine A du staphylocoque doré (préparation commer-ciale). On sépare par centrifugation le précipité formé, qui contient un complexe protéine A - anticorps - anti-~' , gène radioactif.
Après lavage du précipité, on le redissout' en pré-sence de SDS. Celui-ci dissocie l'antigène de l'anticorps et de la protéine A. On resoumet l'ensemble à électropho-rèse et on repère les bandes marquées, en nombre plus ré-duit que dans le cas précédent, ainsi que leurs poids mo-35 léculaires respectifs.

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, ~ , Deuxième série d'opérations :
___________________________ On répète l'ensemble des étapes a) et b) ci-dessus, mais en utilisant cette fois-ci des anticorps provenant d'un singe sensible au parasite.
Par comparaison des bandes obtenues sur les gels après les réactions avec les sérums provenant d'animaux résistants, d'une part, et de celles obtenues apres réac-tion avec des sérums provenant d'animaux sensibles, d'autre part, on détermine celles des bandes qui n'ont été obtenues qu'au terme de l'étape b) de la première série d'opé~ations et leurs régions de poids moléculaires.
Ces bandes contiennent des constituants protéiniques reconnus préférentiellement par des sérums d'animaux ré-sistants et, de ce fait, les antigènes reconnus spécifi-quement par les anticorps protecteurs.
Troisième série d'opérations :
_______ ___.________________ On réalise enfin une nouvelle cultur~ du même para-site, mais en l'absence du marqueur radioactif, et on procède à une nouvelle séparation électrophorétique de ses constituants protéiniques dans les mêmes conditions que dans la première et deuxième série d'opérations. On teste ensuite la capacité des constituants ayant migré
aux mêmes distances que ceux qui ont été reconnus par les anticorps a l'issue de la deuxième série d'opérations, à induire in vivo la production d'anticorps protecteurs, et l'on recueille ceux de ces constituants qui ont in-~; duit une réaction immunologique positive, par exemple dans les mêmes conditions que celles évoquées précédem-ment à propos des constituants protéiniques actifs de Plasmodium falciparum.
Les constituants actifs ainsi isolés constituent des équivalents des polypeptides protecteurs qui ont plus particulièrement été~décrits plus haut.
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' Des caractéristiques supplémentaires de l'inventlon apparaltront encore au cours de la description qui suit d~exemples de production de fractions polypeptidiques selon l'invention, à partir d'une cu].ture de parasites, et des propriétés biologiques de ces fractions.
EXEMPLE I
Culture des parasites et préparation.
_ _ Les parasites sont cultivés sur globules rouges hu-mains de groupe A~, dans du milieu RPMI 1640 (FLOBIO) aa-ditionné de 10 % de sérum humain du meme groupe, sous une atmosphère contenant 1 % 2 ~ 3 % C2 ~ 96 % N2 (% en volumes)-Les cultures sont synchronisées au stade "anneaux", tel que défini dans l'article de Science 1976, 193, 673, par traitement au sorbitol (LAMBROS 1979, vol. 65, p. 418 J. of Parasitology). Elles sont récoltées 40 heures plus tard, lorsque les parasites atteignent le stade de schi-zontes murs, à 8 noyaux en moyenne.
Les globules rouges sont lavés par centrifugation en RPMI 1640 et lysés par action de la Saponine à 0,025 % en RPMI (% en poids), en présence d'inhibiteurs de protéases "PMSF", "TLCK" (SIGMA) 10 3 M, pendant 10 minutes à 37C.
Les parasites libres sont purifiés par centrifuga-tion dans un gradient discontinu en PBS comportant 40 à
70 % de PERCOLI.~ PHARMACIA), pendant 30 minutes à 4C.
25 L'interface 40-70 % est récoltée par pipettage et lavée deux à trois fois en PBS.
Préparation des protéines semi-purif ées.
~;Les parasites sont traités par 5 à 10 volumes de tampon pour électrophorèse, contenant 6 % en poids de SDS
30 et 10 % de bêta-mercapto-éthanol (ou d'un agent anal-ogue ; ssuceptible de couper les ponts disulfure des protéines et de linéariser les chaînes polypeptidiques) deux fois pendant 5 minutes à 100C.
Les extraits sont centrifugés 5 minutes à 15.000 g, 35 les surnageants (contenant plus de 90 % de~ pro~éines to-.
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3~ d ~" ~

1~
tales initialement contenues dans les parasites) sont sou-mis à une électrophorèse (pendant 4 heures SOU9 200 V) en gel contenant 10 % en poids/volume d'acrylamide au sein d'un tampon Tris aqueux (à pH 8-9 ) conkenant 0,2 % de SDS
5 (en poids/volume).
Après électrophorèse, des bandes de gels sont cou-pées aux niveaux correspondants aux poids moléculaires 75 . 000 - 7 . 500 daltons repérés sur le gel par électropho-rèse simultanée de peptides marqués à l'isothyocyanate de fluorescéine (IgG humaines, BSA, ovalbumine, phosphorylase B et la myosir~e ).On découpe de la même fa~con les bandes de gels contenant les polypeptides présentant des poids moléculaires moyens de 100.000 * 10.000, récoltés dans un sac à dialyse. La concentration en protéines est détermi-15 née par dosage colorimétrique des protéines ("Biorad Assay",kit commercialisé par BIORAD et décrit par SPECTOR, Analytical Biochemistry, 1978, 86, 142).
Les préparations finalement obtenues sont analysées par électrophorèse en gel polyacrylamide-SDS et révélées 20 par coloration au nitrate d'argent. On peut ainsi encore séparer à partir de la préparation de polypeptides ayant des poids moléculaires de 75.000 - 5.000:
- 3 bandes majeures dans la zone de poids moléculaires 72.000, 76.000, 80.000 daltons, - 1 bande mineure dans la zone de poids moléculaires :
90 . ooo daltons.
Des produits de dégradation mineurs de cette bande de 75.000 sont vus dans les zones 33.000 et 45.000 daltons.
De même, on peut encore séparer dans les mêmes con-30 ditions, à partir de la fraction de poids moléculaires100.000 - 10.000, des bandes majeures isolées dans les zones suivantes de poids moléculaires :

4 o . 0 0 0 , 4 5 . 0 o o , 1 0 0 . 0 0 0 , 1 1 0 . 0 0 0 , 1 1 5 . o o 0 et 1 3 o . 0 0 0 , parmi un ensemble complexe étendu, s'étageant entre 83.000 35 et 140.0DO. Des produits de dégradation mlneurs de cette -1~2f~

bande sont vues dans les zones 33.000 et ll5.oO0 daltons.
L.es propriétés biologiques de cette fraction, qu'il s'agisse des fractions de poids moléculaires moyens 75.000 ou 100.000, ou des fractions protéiniques davantage puri-fiées, qui peuvent être isolées à partir des précédentes,peuvent être mises en évidence comme décrit ci-après. Les résultats qui suivent ont été obtenus avec les fractions 75.000 et lO0.000, avant purification supplémentaire.
Essai d'immunisation de singes Saimiri Sciureus.
Les résultats d'immunisation susceptibles d'être ob-servés dans c~s primates sont particulièrement représenta-tifs de ce qui pourrait être obtenu de façon semblable chez l'homme. Ces animaux peuvent être davantage encore rendus sensibles à l'infection parasitaires par spénectomie : l'in-fection se développe rapidement chez des singes splénecto-misés. Elle se manifeste par des parasitémies importantes (50 % environ de leurs globules rouges pouvant être para-sités). Les animaux splénectomisés et impaludés meurent au bout d'une durée de l'ordre de lO jours.
Les essais qui suivent ont été réalisés chez des animaux splénectomisés répartis respectivement en deux groupes de 5 et 10 singes.
Les animaux du premier groupe sont inoculés trois fois avec chaque fois une dose de 100 microgrammes des pré-parations à tester diluées dans 0,5 ml de PBS émulsionné
avec un volume égal d'adjuvant de Freund, complet pour la première inoculation, incomplet pour les deux suivantes.
Ces inoculations se font à trois semaines d'intervalle, sous la forme d'injections sous-cutanées.
3o Les singes du deuxieme groupe (témoins) ne reçoivent que les adjuvants.
Trois semaines après la troisième immunisation, les animaux sont infectés avec 50 x 106 globules rouges para-sités, par voie intraveineuse. La parasitémie est ensuite .

contrôlée chaque jour pendant trois semaines. On observe tout de suite un important retard de la multiplication pa-rasitaire chez ceux des animaux qui ont été immunisés.
15 jours plus tard, la proportion de globules rouges para-sités chez les animaux immunisés est inférieure à 10 %,alors que chez le groupe témoin -5jours après la dernière injection -laparasitémie est de plus de 25 %. On a obtenu des résultats semblables avec les deux préparations.
Ces résultats sont hautement significatifs, compte tenu du caractère splénectomisé des animaux. ~es résultats semblables peuvent être obtenus avec des fractions davan-tage purifiées encore.
EXEMPLE II.
Culture des parasites et préparation.
Les parasites (provenant de la souche de P. falciparum, C.N.C.M. n FUPC I-212) ont été cultivés sur globules rouges humains A+, selon la technique décrite par GYSIN J. et Coll. (Les Ann. Immunol. (Institut Pasteur) 133 D, 95-102 (1982)) et synchronisée pa-r la technique 20 au sorbitol telle que décrite par LAMBROS C. et Coll.
(J. Parasitol. 65, 418-420 (1979)).
Les cultures infectées ont été collectées quand la parasitémie a atteint 5 à 10 % des cellules et quand les parasites ont atteint le stade des schizontes. Après 25 deux lavages avec du milieu RPMI-1640 (CIBCO), les globules rouges ont été lysés par la saponine (à 0,025 % en poids) pendant 10 minutes à 37C. La suspension a ensuite été
__ \
\

' re~roidie à ~C et centrlfugee a 3.500 g pendant 10 minutes.
Le culot a é-té resuspendu dans du RPMI-16~0, introduit dans un gradient au PERCOI,L (produit fabriqué par PHARMACIA) (20-40 %), puis centrifugé à 3.500 g à 4C pendan-t 30 minutes. Les parasites libres ont é-té collec-tés à l'inter-face 20/40, lavés deux fois dans le tampon PBS et congelésà -20~C, en présence d'inhibiteurs de protéase, tels que ceux commercialisés sous les désignations TLCK e-t PMSF
lSIGMA).

Préparation des protéines immunogènes semi-purifiées.
~ _ _ _ _ ~10 Les préparations de parasites (20/40) sont in-tro-duites dans 5 volumes d'une solution tampon (tris 0,0625 M, pH 6,8, dodécylsulfate de sodium à 6 %, 2-mercaptoétha-nol à 5 %, glycérol à 5 %), portés à l'ébullition pendant

5 minutes et centrifugés à 15.000 g pendant 10 minutes.
Le surnageant a été appliqué sur un gel de SDS-polyacrylamide, en parallèle avec des marqueurs de poids moléculaires déterminés et marqués à l'isothiocyanate de fluorescéine (sérum albumine bovine, IgG de lapin et ovalbumine). Après migration à travers le gel, les bandes 20 de poids moléculaires correspondant aux ~ones 70.000 -85.000 et~90.000 - 120.000 respectivement (vis-à-vis des distances de migration des marqueurs) ont été découpées.
Les protéines ont ensuite été éluées à partir de ces bandes de gel par électrophorèse dans un tampon tris-25 glycine, pH 8,6, et contenant 0,1 % en poids de dodécyl-sulfate de sodium (SDS), et récoltées dans un sac à dia-lyse. La concentration en protéines a été déterminée par dosage colorimétrique des protéines, méthode au bleu de Coomasie, "Biorad Assay", test commercialisé par BIORAD
30 et décri-t par Spector, "Analytical Biochemistry", 1978, 86, 1~2 .
On a ainsi obtenu les fractions I et II ultérieure-ment utilisées dans les essais d'immunisation décrits ci-après. Ces fractions contenaient environ 100 micro-yrammes de protéine/20 mg de protéine contenue dans l'ex-trait brut initial.
Ces fractions se sont révélées contenir des bandes de poids moléculaires distincts, à l'occasion d'un re-fractionnement dans un gel de polyacrylamide - SDS à 7,5 %. Ces fractions ont été révélées par coloration par le nitrate d'argen-t. La fraction I s'est révélée contenir quatre bandes polypeptidiques majeures de poids molécu-10 laires 72.000, 76.000, 85.000 e-t 90.000 et la fraction II s'est révélée contenir principalement cinq bandes de poids moléculaires moyens 90.000, 96.000, 100.000, 105.000, et 120.000, respectivement.
La présence de bandes mineures correspondant à
15 la région 50.000 daltons a été détectée dans les deux préparations.

Essai d'immunisation de singes écureuils.
Des groupes de cinq animaux splénectomisés reçoi-vent trois injections sous-cutanées successives aux 20 jours 0, 21 et 41. Chaque injection consiste en 100 micro-grammes soit de la fraction I, soit de la fraction II, contenue dans une émulsion formée à partir d'une solution saline tamponnée au phosphate et contenant 0,1 % de SDS
et d'un même volume de l'adjuvant complet de Freund (pour 25 les premières injections) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (pour les injections suivantes). Dix animaux témoins ne reçoivent que la solution saline tamponnée au phospha-te (PBS) contenant 0,1 % de SDS avec l'adjuvant complet ou l'adjuvant incomplet de Freund pour l'applicaion du même 30 protocole d'administration. Des prélèvements de sang sont faits périodiquement, avant et pendant la vaccination, et examinés pour ce qui est de leurs caractéristiques hématologiques, parasitologiques, microbiologiques et sérologiques. Les animaux ont très bien toléré la vaccina-tion. Aucune lésion n'a été observée aux sites d'injection.Les singes ont toujours paru en bonne santé et maniEes-taient une activité normale. Aucune anémie n'a été détec-tée tant chez les animaux vaccinés que chez les anlmaux témoins.
Des anticorps antimalariques, mesurés par immuno-fluorescence indirecte, on-t été dé-tectés dès après la seconde injec-tion.
Les animaux ont reçu, par injection intraveineuse, 50 x 10 parasites (souche ~UP) au jour 55. Après cette épreuve, les parasitémies ont été mesurées quotidiennement sur des prélèv'ements colorés par le réactif de Giemsa.
La parasitémie aiguë qui s'est développée chez neuf animaux sur les dix animaux témoins a nécessité une chimiothérapie à la quinine dans les huit jours qui ont suivi, pour éviter la mort. Parmi les cinq animaux ayant reçu la fraction I, un seul a présenté une réponse semblable à celle des témoins. Les quatre autres animaux ont manifesté une résis-tance élevée à l'épreuve. Une parasitémie marginale a été observée dans deux d'entre eux. Dans les deux autres, la parasitémie s'est élevée à environ 5 % pour disparaître complètement dans les trois semaines suivantes. Les cinq animaux immunisés avec la fraction II ont tous manifesté
une bonne résistance à l'épreuve. On a observé un accrois-sement de 10 % de la parasitémie au dixième jour aprèsl'épreuve chez l'un d'entre eux seulement. Ce-tte parasité-mie a cependant décru dans les trois semaines suivantes.
Des frottis de contrôle ont été ensuite effectués deux fois par semaine pendant les deux mois qui ont suivi l'épreuve. Les mesures ont donné des résultats négatifs dans tous les animaux vaccinés, alors qu'une recrudescence de la parasitémie a été observée dans cinq des animaux témoins qui avaient été trai-tés par la quinine, après l'interruption du -traitement, de sorte qu'ils ont dû être soumis à un second cycle de chimiothérapie. I'ous les ani-maux infec-tés par le parasite (animaux vacclnés et animaux témoins) ont présen-té dans les premières semaines une cer-taine anémie avec une chute moyenne de 30 % des taux en globules rouges. L'anémie a cependant été différée dans les animaux vaccinés. En outre les hématocrites ont repris une valeur normale quatre semaines après l'épreuve.
Les variations de poids des animaux avan-t et après la vaccination n'ont pas dépassé 2 %.
La réponse humorale des singes aux différentes immunisations a été appréciée par immunoprécipitation 10 réalisée entre des extraits de parasites marqués à la 5S-méthionine et des échantillons de sérum prélevés chez les animaux avant et après les susdites immunisations.
On n'a observé aucune immunoprécipitation spécifique avec les échantillons de sérum prélevés chez tous les 15 animaux avant l'immunisation et chez les animaux témoins, avant l'épreuve par le parasite vivant. Chez les animaux immunisés aussi bien par la fraction I que par la frac-tion II, on a constaté des réponses sensiblement homoyènes contre principalemen-t deux polypeptides de masse molécu-20 laire 72 et 90.000 et des rép~nses de moindre importanceà l'égard de peptides de masse moléculaire 96.000 et 100.000.
Une bande de précipitine dans la région de poids moléculaire 110.000 a été constatée chez les animaux 25 vaccinés avec la fraction II. Aucune réponse n'a été cons-tatée~ du moins dans les conditions de l'expérience,contre la bande 76.000 contenue dans la fraction I originale.
Cette dernière observation trouve peut-être son explica-tion dans la modification des déterrninants antigéniques 30 que présente la protéine répondant à ce poids moléculaire chez les parasites vivants au cours des étapes de puri-fication décrites plus haut. Les réponses comparables qui ont été observées dans les deux groupes d'animaux immunisés donnent à penser qu'il existe une parenté anti-"' , .

5~

génique importante entre les protéines des deux fractions, parenté qui explique sans doute le degré de résistance comparable contre le parasite, qui a été observé dans les deux groupes.
Les résultats qui précèdent témoignent donc de l'importante capacité vaccinante des fractions de l'inven-tion. Ce résultat est d'autant plus remarquable, que cette vaccination a été obtenue avec des protéines de parasites "dénaturées" par le SDS. La dénaturation chimique des 10 protéines par le détergent n'entraîne pas la perte des propriétés vac~inantes de ces dernières.
Les fractions peptidiques selon l'invention constituent tout d'abord des réactifs biologiques particulièrement inté-ressants en ce qu'ils sont actifs in vivo. Ils peuvent être 15 utilisés comme référence de mesure de l'activité in vivo d'autres préparations immunogènes obtenues à partir de pa-rasites responsables des diverses formes de paludisme.
Une purification plus poussée de l'antigène vacci-nant contenu dans les susdites fractions peut être réali-sée selon les techniques décrites plush a u t . L'invention concerne plus particulièrement les fractions de poids moléculaires 72.000 et 90.000.
Les fractions de l'invention davantage purifiées ou non, y inclus la fraction de poids moléculaire 50.000, peuvent également être utilisées comme réactifs pour le diagnostic et/ou le titrage des anticorps antipaludéens.
Dans~leur utilisation comme réactifs pour un diagnostic, on peut avoir recours à des techniques classiques, par exemple à la technique ELISA. On rappelle ci-après le principe d'une telle méthode. Elle comprend, par exemple, les étapes suivantes :
- dépôt de quantités déterminées d'un polypeptide selon l'inven-tion dans les puits d'une microplaque du type de celle utilisée pour la mise en oeuvre de la méthode ELISA ;

-: ' : : :

- introduction de dilutions croissantes du sérum contenant, le cas échéant, les anticorps à détecter, voire à doser, dans les puits de cette microplaque ;
- incubation ;
- lavage poussé de la microplaque avec un tampon approprié;
- introduction d'anticorps marqués dirigés contre les pre-miers, le marquage étant fait au moyen d'une molécule fluo-rescente ou d'une enzyme capable d'hydrolyser un substrat choisi parmi ceux pour lesquels cette hydrolyse se manifeste par une variation d'absorbance pour une radiation de lon-gueur d'onde donnée ;
- mesure de l'intensité de fluorescence ou de la variation d'absorbance et - détermination, de préférence vis-à-vis de mesures sembla-bles faites vis-à-vis d'un témoin, de la teneur en anti-corps du sérum étudié.
L'invention concerne encore plus particulièrement un nécessaire ou coffret de diagnostic du paludisme contenant plus particulièrement :
- l'un des polypeptides définis dans ce qui précède, ce polypeptide étant marqué par une enzyme ou par un composé
fluorescent ;
- d'anticorps spécifiques du polypeptide utilisé, - des tampons et substrats éventuellement nécessaires à
la révélation du marqueur.
Il va naturellement de soi que tout autre marqueur peut être utilisé, par exemple un marqueur radioactif.
Le coffret peut également permettre de suivre chez le malade l'évolution de la maladie par dosage des anticorps et des parasites présents dans le sang du sujet atteint.
Il convient de souligner que l'antigène de poids molé-culaire 72.000 est immunoprécipité avec des immunsérums anti-P. vivax, anti-P.ovale, anti-P.chabaudi. Cet antigène apparalt comme un constituant commun à différentes espèces de Plasmodium.
A titre d'exem~le, on a incubé un extrait polypeptidi-~ue de P. chabaudi marqué par 35S-méthionine (300.000 ,. ' ' . ' cpm) avec 10 microlitres d'immunsérum anti-P. falciparum obtenu après immunisation de Saimiri Sciureus ou d'un patient résistant à P. falciparum vivant en zone endémique ou encore de souris immunisées avec la fraction selon l'invention. Sur gel, l.'analyse des bandes immunoprécipi-tées, révèle cet antigène de 72.000 dal-tons produit par P. chabaudi.
_ _ _ Une observation identique a été .faite avec la fraction de poids moléculaire 90.000 préparée à partir de _. chabaudi.
Ces résultats sont particulièrement intéressants, dans la mesur,e où ils montrent que l'antigénicité des peptides obtenus à partir de ces différents Plasmodiums n'a pas une spécificité d'espèce. On remarque en particu-lier que P. chabaudi est un Plasmodium se développan-t , . _ .
chez la souris. Il en résulte que l'utilisation des poly-peptides antigéniques issus de PO chabaudi ou de tout autre Plasmodium se développant dans des petits-animaux, sera particulièrement avantageuse, en ce sens que la cul-ture de ces PlasmodLwns est moins onéreuse que celle de P. falcipa-rum dont l'un des hôtes na-turels est le grand singe.
L'invention concerne encore plus particulièrement les compositions vaccinantes contenant lesdites fractions polypeptidiques en association, comme on l'a déjà indiqué, avec les divers véhicules pharmaceutiques et/ou agents : 25 adjuvants couramment utilisés dans les compositions de vaccins. De préférence, l'invention concerne des solutions injectables desdites fractions polypeptidiques.
\

Les fractions polypeptidiques selon l'invention peuvent encore être utilisées pour la rabrication d'anti-corps plus spéciriques à l'égard de Plasmodium falciparum que les sérums ou fractions purifiés d'immunoglobulines susceptibles d'être obtenus à partir d'animaux devenus résistants, Avantageusemer1t, on aura recours pour la fabri-cation de ces anticorps plus spécifiques à la technique de fabrication des hybrides cellulaires ou hybridomes,compor-tant alors les étapes essentielles suivantes (susceptibles dlêtre mises en oeuvre selon des techniques aujourd'hui connues ) :
- fusion de cellules myélomateuses et de cellules splé-niques de souris ou de rat~ voire de singe, ayant au préalable été immunisées avec les fractions peptidiques sus-définies, - sélection parmi les hybridomes formés de ceux qui sécrè-tent des anticorps monoclonaux actifs contre les susdites fractions polypeptidiques.
Ces anticorps plus spécifiques, particulièrement ces anticorps monoclonaux, peuvent alors être à leur tour utilisés, par exemple pour constituer des colonnes de chro-matographie d'affinité. Une telle colonne est par exemple obtenue par fixation de ces anticorps monoclonaux sur la résine commercialisée par PHARMACIA sous la marque SEPHAR0-SE par la méthode bien connue au bromure de cyanogène.Ces colonnes de chromatographie d'affinité peuvent alors à leur tour être utilisées pour réaliser la séparation de fractions polypeptidiques immunogènes, que ce soit à par-tir de solutions obtenues à partir de préparations de pa-3o rasites traités avec des agents diss,olvants, du genre deceux qui ont été mentionnes plus haut, ou à partir de fractions déjà concentrées et dont un état de plus grande pureté est recherché.

12~5;~6 - 2~ -Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention s'é-tend aussi à
toutes les variantes et à toutes les composi-tions pos-sédant des propriétés immunologiques semblables. En particulier, l'invention concerne encore toutes les fractions peptidiques immunogènes susceptibles d'être obtenues à partir d'autres Plasmodiums, notamment P. vivax, P. ovale et P. chabaudl, P. yaelli et P.
knowlesi déjà nommés, etc., en me-ttant en oeuvre des procédés semblables à ceux qui viennent d'être décrits D'une façon générale, l'invention concerne des polypeptides immunogènes susceptibles d'ê-tre obtenus a partir de tout Plasmodium, de tous variants et mutants de ces Plasmodiae, des lors que ces polypeptides sont reconnus par des anticorps formés plus particuliere-ment contre les fractions qui ont été définies plus haut. L'invention concerne également encore des pep-tides immunogenes de poids moléculaire plus faible, par exemple des peptides immunogenes résultant d'une hydrolyse partielle des peptides précédents, dans la mesure ou cette hydrolyse ne porte pas atteinte a l'immunogénicité recherchée. Entrent encore dans le cadre de l'invention tous conjugues entre l'un des peptides immunogenes envisages ci-dessus et une molécule porteuse ("carrier"), chaque fois qu'un tel couplage peut être jugé désirable pour renforcer l'immunogénicité des peptides en cause.
D'une facon générale, l'invention concerne donc tous polypeptides répondant aux conditions qui ont été
3a sus-définies et qui pourraient être reconnus par des anticorps monoclonaux préalablement ormés contre chacun des polypeptides correspondant aux poids molé-culaires moyens qui ont été indiqués, notamment 75.000 et 100.000, ou correspondant encore a des fractions purifiées dont les constituants mejeurs sont respecti-vement formés de polypeptides ayant des poids molécu-laires de l'ordre de 72.000, 75.000 (ou 76.ooo), 85.000, 90.000, 96.000, 100.000, 105.000 et 120.000. Il résulte naturellement de ce qui précède que ces hybridomes peuvent être formés par la méthode devenue classique de Kohler et Milstein. La sélection finale des hybridomes secréteurs des anticorps monoclonaux recherchés est alors notamment basée sur la détection des anticorps qui reconnaissent des polypeptides ayant les poids molécu-laires correspondant à ceux ayant initialement servi à la production des hybridomes correspondants et qui sont égale-ment reconnus par les anticorps protecteurs obtenus à par-tir de singe.~ devenus résistants au parasite de la malaria ou encore par le sérum humain provenant de personnes im-munisées résidant dans des zones endémiques et présentant un pouvoir de résistance élevé aux Plasmodiae

Claims (16)

Les réalisations de l'invention au sujet des-quelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé pour préparer une composition immunogène contenant un ou plusieurs polypeptides conte-nus dans des parasites du paludisme, infectieux pour l'homme, ces polypeptides étant plus particulièrement aptes à réagir avec des anticorps protecteurs provenant de singes résistant aux parasites humains du paludisme, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à
traiter une préparation préalablement obtenue d'un para-site malarique infectieux, du type plasmodium, avec une solution d'un détergent susceptible d'induire la disso-lution de la majeure partie des structures cellulaires et des constituants protéiniques du parasite, à séparer et à récupérer à partir de la solution formée ceux des polypeptides qui présentent des poids moléculaires moyens s'étageant d'environ 50,000 à environ 140,000 et contenant des polypeptides immunogènes et capables à la fois d'induire la production d'anticorps protecteurs contre des parasites infectieux contre l'homme et/ou le singe et d'être reconnus par des anticorps protecteurs obtenus à partir de singes immunisés.

2. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que les parasites humains du paludisme sont des espèces de Plasmodium falciparum.

3. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'on sépare les polypeptides ayant des poids moléculaires moyens de 75,000 ? 5,000.

4. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'on sépare les polypeptides ayant des poids moléculaires moyens de 100,000 ? 10,000.

5. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que l'on sépare les polypeptides ayant des poids moléculaires de l'ordre de 50,000.

6. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que le détergent consiste en une solution de dodécylsulfate de sodium.

7. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce qu'il comprend au moins une gel filtration, électrophorèse ou analogue, et la récupération des poly-peptides présentant les poids moléculaires correspon-dants.

8. Procédé selon la revendication 7, caracté-risé en ce que l'on recueille les polypeptides dont les poids moléculaires s'étagent de 72,000 à 85,000.

9. Procédé selon la revendication 7, caracté-risé en ce qu'il comprend au moins une gel filtration, électrophorèse ou analogue, et la récupération des poly-peptides présentant les poids moléculaires de 90,000 à
120,000.

10. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé par la mise en contact de la solution résultant du traitement du parasite avec le détergent avec des anti-corps protecteurs fixes sur un support insoluble et l'élution du complexe forme entre les anticorps fixés et les antigènes correspondants.

11. Procédé selon la revendication 7, caracté-risé en ce qu'il comprend à la fois une gel filtration, électrophorèse ou analogue, et une mise en contact avec des anticorps, la gel filtration ou l'électrophorèse précédant la mise en contact des fractions retenues avec les anticorps, ou vice versa.

12. Procédé selon la revendication 11, carac-térisé en ce que les anticorps protecteurs fixés sont remplacés par des anticorps monoclonaux préalablement formés contre les polypeptides réagissant avec susdits anticorps protecteurs.

13. Procédé selon la revendication 12, carac-térisé en ce que l'anticorps monoclonal mis en oeuvre est dirigé contre l'un des polypeptides protecteurs, choisi parmi ceux qui présentent les poids moléculaires suivants: 50,000, 72,000, 76,000, 85,000, 90,000, 96,000, 100,000, 105,000 et 120,000.

14. Procédé selon la revendication 13, carac-térisé en ce que l'anticorps monoclonal est dirigé
contre le polypeptide de poids moléculaire moyen 90,000, cet anticorps monoclonal correspondant à celui qui est secrété par l'hybridome qui a été déposé à la C.N.C.M.
sous le n° I-271.

15. Procédé de diagnostic in vitro de la pré-sence d'anticorps anti-paludéens dans un sérum compre-nant les étapes suivantes:
- dépôt de quantités déterminées d'un polypeptide obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 3 dans les puits d'une microplaque du type de celle utilisée pour la mise en oeuvre de la méthode ELISA;
- introduction de dilutions croissantes du sérum conte-nant, le cas échéant, les anticorps à détecter, voire à
doser dans les puits de cette microplaque;
- incubation;
- lavage poussé de la microplaque avec un tampon appro-prié;
- introduction d'anticorps marques dirigés contre les premiers, le marquage étant fait au moyen d'une molécule fluorescente ou d'une enzyme capable d'hydrolyser un substrat choisi parmi ceux pour lesquels cette hydrolyse se manifeste par une variation d'absorbance pour une radiation de longueur d'onde donnée;
- mesure de l'intensité de fluorescence ou de la varia-tion d'absorbance, et - détermination, de préférence vis-à-vis de mesures semblables faites vis-à-vis d'un témoin de la teneur en anticorps du sérum étudié.

16. Nécessaire ou "kit" de diagnostic in vitro de la présence d'antigènes paludéens dans un sérum com-prenant:
- l'un des polypeptides obtenus par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ce polypeptide étant marqué, par une enzyme ou par un composé fluorescent;
- des anticorps spécifiques du polypeptide utilisé;
- des tampons et substrats éventuellement nécessaires à
la révélation du marqueur.