EP0460177A1 - Procede de culture intensive, in vitro, de souches de babesia divergens, procede de preparation d'exoantigenes et vaccin contenant ces antigenes - Google Patents
Procede de culture intensive, in vitro, de souches de babesia divergens, procede de preparation d'exoantigenes et vaccin contenant ces antigenesInfo
- Publication number
- EP0460177A1 EP0460177A1 EP91901827A EP91901827A EP0460177A1 EP 0460177 A1 EP0460177 A1 EP 0460177A1 EP 91901827 A EP91901827 A EP 91901827A EP 91901827 A EP91901827 A EP 91901827A EP 0460177 A1 EP0460177 A1 EP 0460177A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- exoantigens
- divergens
- culture
- kda
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241001455947 Babesia divergens Species 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 18
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241000223836 Babesia Species 0.000 claims abstract description 16
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 241000223846 Babesia canis Species 0.000 claims description 13
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 41
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 40
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 27
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 23
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 21
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 21
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 11
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 9
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 6
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 6
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 208000009182 Parasitemia Diseases 0.000 description 5
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 241000223840 Babesia bigemina Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000593848 Babesia major Species 0.000 description 3
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 3
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 3
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 3
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 3
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 201000001505 hemoglobinuria Diseases 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101710172503 Chemokine-binding protein Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 101710138270 PspA protein Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- SCEVFJUWLLRELN-UHFFFAOYSA-N imidocarb Chemical compound C=1C=CC(C=2NCCN=2)=CC=1NC(=O)NC(C=1)=CC=CC=1C1=NCCN1 SCEVFJUWLLRELN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004683 imidocarb Drugs 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000223848 Babesia microti Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 240000001899 Murraya exotica Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 241000061220 Werneckiella equi Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 235000019624 protein content Nutrition 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/947—Microorganisms using protozoa
Definitions
- the present invention was made at the Cell Biology Laboratory of the University of POITIERS, Research Unit Associated with the National Center for Scientific Research, No. 290 and at the Parasitology Laboratory of RHONE-ERIEUX.
- the present invention relates to a method for intensive in vitro culture of Babesia divergens, preparation of exoantigens and parasitic proteins and their use as a vaccine.
- Babesiosis also called piroplasmosis
- piroplasmosis are intraerythrocytic parasitoses frequent in domestic and wild animals (cattle, dogs, horses, rodents in particular) and rarer in humans (16 clinical cases in Europe, around 200 in the United States have been described since 1957). They are transmitted by blood-sucking mites (ticks) and possibly by blood transfusion in humans.
- Babesia There are many species of Babesia.
- bovine babesiosis caused by B. bovis ( B. argentina), B. bigemina, B. major, B. divergens, is the most important from the economic point of view. In Europe, bovine babesiosis with B.
- bovine babesiosis represents a major obstacle to increasing the productivity of cattle farming and one of the main causes of economic losses recorded in certain regions of Africa. There are several methods of fighting Babesia:
- the parasitic exoantigens collected in the culture supernatants have already been used for vaccination against bovine babesiosis with B. bovis and B. bigemina (EP-0 018 579 B1) and canine babesiosis with B. canis (EP-0 220 988 Al).
- LIVE VACCINES a) "Prcinunisat ion" (infection then weak no yes yes c himiotherapy) b) Irradiated parasites (low no 9 c) Mitigated parasites (rapid passage variable no yes yes in animals)
- the present invention relates more particularly to a process for the preparation of exoantigens and proteins making it possible to obtain a vaccine against bovine babesiosis with B. divergens and which can be extended to other species of Babesia.
- the Babesia culture method is characterized in that the Babesia strain is maintained in culture on a culture medium free of serum protein, but containing lipoproteins as well as red blood cells.
- the lipoproteins which can be used according to the present invention are preferably of natural origin, in particular of human origin.
- HDL High Density Lipoprotein
- the Babesia divergent multiplication indices in in vitro culture in semi-defined medium are comparable to those obtained with complex media containing 5 to 10% human serum.
- This new technique can be adapted to the iii vitro culture of other Babesia species such as B. bovis, B. bigemina, B. canis, B. equi, B. major, B. microti.
- the use of semi-defined medium allows the purification of the exoantigens present in the medium and has advantages for the culture of Babesia:
- This semi-defined lipoprotein-based medium preferably comprises HDL fractions at a concentration of between 0.2 and 5 mg of lipid / ml, in particular 0.5 and 3 mg of lipid / ml, with or without LDL added, at a concentration between 0.5 and 1.5 mg of lipid / ml.
- This medium can also contain growth factors such as bovine insulin at a concentration of between 0.5 and 10 ⁇ g / ml, human transferrin at a concentration of 10 to 200 ⁇ g / ml, selenium and beta-cyclodextrin.
- These culture media free of serum protein are known. These are, for example, media such as RPMI 1640 used for cell cultures. These media are generally supplemented by protein se ⁇ ques in particular by fetal calf serum; in the case
- 5 present the complement consists of lipoproteins.
- the use of semi-defined medium allows the collection of parasite antigens candidates for the stimulation of humoral immunity and / or
- the method makes it possible to achieve a higher concentration of the antigen while retaining good solubility. It also improves the purification of protective serum factors.
- exoantigens of B. divergens obtained by these culture methods can be purified, concentrated and analyzed after labeling with radioactive amino acids. We thus highlight the disturbances caused by serum proteins during the separation of parasitic proteins.
- the soluble proteins of the B. divergens supernatant which confer protection against infection have the following relative molecular masses: 31-33 Da (doublet), 35-37 kDa (doublet), 43 ⁇ 2 kDa,
- the present invention also relates to the fractions of B. divergens exoantigens having an aV: - fraction 1) of between 0 and 0.27,
- fraction 4 between 0.78 and 0.95, in particular fractions 2 and 4.
- the invention also relates to the antigenic proteins making up these fractions and in particular the protein with a molecular weight of 17,000 + _ 2,000 Da appearing in fraction 4.
- the culture technique according to the invention in human red blood cells or in red blood cells can be used for industrial production, in semi-automated systems using large volumes of culture media.
- the exoantigens originating from the supernatant of these cultures in a semi-defined medium can be used to obtain vaccinating fractions.
- fractions can be used in admixture with immunity adjuvants, in particular lipid-type adjuvants and / or saponins for example.
- fractions described above in the vaccination strategy in particular fractions 3 and 4
- one or more proteins purified or obtained by other routes in particular by recombination genetic.
- Different antigens can be isolated and used to produce immune sera and / or monoclonal antibodies.
- Monoclonal antibodies can also be used to fractionate culture supernatants and purify exoantigens by known methods.
- the present invention also relates to these different antigen and antibody fractions for use in therapy, prevention and / or diagnosis. Other characteristics and advantages of the present invention will appear on reading the examples below.
- FIG. 1 represents the autoradiography of the proteins of the HDL fractions
- HSA human serum albumin
- FIG. 2A represents the electrophoresis on SDS-PAGE (10% of acrylamide) of the supernatant of in vitro culture of B. divergens labeled metabolically with 35-S-methionine,
- FIG. 2B represents the immunoprecipitation of in vitro culture of
- FIG. 3 represents the separation in gel filtration (Superose column
- FIG. 4 illustrates the immunoprecipitation of cultures of B. divergens metabolically labeled with 35-S-methionine
- FIG. 5 illustrates the growth of B. divergens in a semi-defined medium containing different concentrations of lipoproteins
- B. divergens strains The B. divergens strain used in this vaccination strategy is a human strain collected in Rouen, in June 1987, and maintained in in vitro culture on human red blood cells since that date. She will be designated by B. divergens strain Rouen 1987. Of course, it is possible to use other strains, this being mentioned only as a specific example.
- Any bovine strain of B. divergens can be cultured in human red cells by first performing a mixed culture of red blood cells / human red blood cells or red blood cells of human gerbils / red blood cells.
- the parasitized blood of gerbils comes indifferently from gerbils infected either by fresh (or cryopreserved) blood of parasitized cattle, or by fresh blood (or cryopreserved) of parasitized gerbils.
- composition is as follows: RPMI 1640: 10.4 g
- the pH is adjusted to 7.3 (7.2-7.4).
- DMEM fetal calf serum
- MEM fetal calf serum
- any equivalent synthetic medium may be used in place of RPMI 1640.
- the medium is then filtered on a 0.22 ⁇ m filter.
- the human serum used is a mixture of sera from healthy subjects of different or identical blood groups in the system A, B, O (negative viral serologies).
- the red cells used are human red cells, usually of group O, but the culture of B. divergens is feasible in red cells of any other blood group of the system A, B, O. In the latter case, if it is preferable to use a compatible serum, the use of incompatible sera is nevertheless possible because the agglutination of red blood cells does not inhibit the growth of the parasite.
- the hematocrit is between 2 and 5%. It must also be ensured that the volume of the red cell culture is adapted to the surface of the culture dish, for example, 5 ml of 2-5% hematocrit culture for a conventional culture dish of 25 cm2.
- the culture of B. divergens is carried out at 37 ° C. box closed after gassing with a ternary gas mixture: N_: 9 1%,
- Lipoproteins are prepared, starting from human serum from healthy donors, by differential ultracentrifugation according to the technique described by Havel et al., (1955, 3. Clin. Exp. Invest., 34, 1345-1353). The density of the separated serum after simple coagulation of the blood without additive (blood collected on dry bottle) is successively adjusted to 1.019, 1.063 and 1.210 g / ml by addition of KBr and in the presence of EDTA (0.1% final). Three successive centrifugations of 22 hours at 120,000 g will allow to isolate 3 ° fractions:
- VLDL Very Low Density Lipoprotein
- LDL Low Density Lipoprotein
- High Density Lipoprotein (HDL) 1,063 - 1,210 g / ml
- the LDL and HDL fractions used for the culture are dialyzed at 4 ° C. for 24 hours, first against a saline solution buffered to pH 7.4 with 5 mM Tris-HCl, then against a solution of
- the culture medium for the in vitro development of B. divergens strain Rouen 1987 on human red blood cells must comprise a mixture of HDL, LDL, growth factors added in RPMI 1640 medium or equivalent media, HEPES 25 mM, NaHCO, 17 mM, the pH is adjusted to 7.4. This basic medium can be supplemented by the addition of anbitiotics.
- the total HDL fraction, of human origin, (d 1.063-1.210 g / ml), used generally contains the apoproteins AI 28 kDa, AU 17.4 kDa, AIV 45 kDa, C 6.6-8.8 kDa , and serum albumin, the amount of which varies according to the preparations of the total HDL fraction.
- the proteins of the HDL fraction can be specifically labeled with iodine-125 according to the technique of McFarlane (1958, Nature, 182, 53) and detected by SDS-PAGE and autoradiography (FIG. 1A). This HDL fraction is used at concentrations of between 0.5 mg and 2 mg / ml for an initial parasitaemia of the order of 1%.
- the apoprotein concentration of total LDL in the medium is between 0.5 and 1.5 mg / ml and the previous technique with iodine-125 according to McFarlane shows a majority labeling of apoprotein B-100 (FIG. 1B) .
- Human transferrin and bovine insulin are used respectively at doses of 100 ⁇ g / ml (10-200 ⁇ g / ml) and 1 ⁇ g / ml (0.5-10 ⁇ g / ml).
- the multiplication index defined as the ratio between the rate of parasitaemia after reinvasion and the rate of initial parasitaemia, was determined on the different strains of B. divergens cultivated in 25 cm 2 dishes. The incubations tested focused on six stages of reinvasion, which ensures that the parasites are always viable in the 6th biological cycle following their cultivation in a semi-defined medium. Table 2
- the multiplication indices in the semi-defined HL medium are similar to the reference serum medium during the first 20 hours, i.e. 2 cycles of erythrocytic development of B. divergens (the multiplication cycle of B. divergens cultivated in vitro on human red blood cells is indeed of the order of 8 to 10 hours). These culture conditions allow the purification of soluble parasitic proteins and in particular exoantigens.
- radioactive amines can be used such as L- [3H] -isoleucme (0,1 Ci / ⁇ mole) and L- (3H) -histidine (0,05 Ci / ⁇ mole).
- the culture media containing the parasitic proteins secreted into the medium or released during the reinvasion of red blood cells by merozoites are centrifuged (600 g for 5 min), then filtered through 0.22 ⁇ m Millex filters
- Parasitic proteins radiolabelled with one or more amino acids can be fractionated by conventional liquid chromatography techniques (ion exchange, gel filtration, isoelectronic focusing, hydrophobicity, etc.) associated with a determination of
- the purified parasite protein fractions may contain the proteins of the HDL fraction but are found to be depleted of the numerous native or modified serum proteins of the host, capable of interfering with the immune reaction (humoral
- the most immunogenic, revealed by immunoprecipitation in all the isolates tested have molecular weights varying from 34 to 37 kDa, from 43 to 46 kDa, from 69 to 72 kDa and from 90 to 100 kDa.
- the disturbances caused by serum proteins during the separation of parasitic proteins can be confirmed by liquid chromatography.
- the supernatants of an in vitro culture of B. divergens (8% parasitemia), radiolabelled for 12 hours with L- [35-S] -methionine can, after filtration (0.22 ⁇ ), be separated by gel filtration (Superose column 12, FPLC Pharmacia).
- the antigenic characteristics of the parasites cultivated in normal medium or in semi-defined mediums are similar, as well for the total proteins as for the soluble proteins of the parasite as show it the experiments of immunoprecipitation carried out with the same immunerum (figure 2B).
- Gerbill immune systems Gerbils were experimentally infected with the B. divergens strain, Rouen 1987 by 10 parasitized red cells / animal, then treated with imidocarb (Carbesia ND Lab. Coopers) when the parasitaemia reached 5%, and finally infected with the same strain several times, starting the following month. The animals thus treated were protected against B. divergens and designated under the name of super immune gerbils.
- V I A spienectomized calf (called V I) successively received 10 parasitized red cells from the Rouen patient (strain
- V2 A spienectomized calf (called V2) twice received 10 red blood cells from gerbils parasitized by the same strain.
- Antibodies to the 35 kDa protein group are the first to appear.
- the culture supernatants were immunoprecipitated using the three preceding immunsera (man, gerbil, calf). These immunoprecipitations made it possible to demonstrate major proteins having the same electrophoretic mobility in SDS-PAGE reducing medium in the three hosts (30 to 100 kDa), as well as minor proteins which may have a molecular weight greater than 100 kDa and less than 30 kDa.
- Table 3 summarizes the KaV of these different fractions as well as the molecular weights of the antigens contained in each of these fractions obtained by spreading on SDS PAGE gel.
- Vt volume of column Vo: dead volume
- Example 6 Anti-B vaccine. divergent
- Vaccination is carried out using the exoantigens and parasitic proteins collected in the culture supernatant in vitro on human red blood cells from B. divergens as antigens when the parasitaemia is of the order of 30 to 40%.
- the supernatant used as base g of vaccine corresponds to cultures containing approximately 10 red blood cells parasitized per ml of medium.
- the culture medium containing the parasitic antigens is centrifuged at 1500 g and then sterile filtered on a filter
- the dose of vaccinating antigen can be adapted, using the usual protein concentration procedures, to the animal to be vaccinated.
- RPMI 1640 as an adjuvant to obtain a final concentration of saponin at 0.5 mg / ml.
- the use of other adjuvants is possible.
- the semi-defined medium described above makes it possible to collect the exoantigens and parasitic proteins with very low contamination by the serum proteins and has a certain advantage compared to the previous patents (for example, the culture medium of Ristic (USA) contains 30 50% serum; that of Canning (GB) 40 ° _).
- This medium will bring a significant improvement in the concentration and fractionation of parasitic antigens necessary for the manufacture of a second generation vaccine.
- Gerbils receptive to infection by B. divergens (Lewis D. and Williams H., 1979, Nature, 278, 170-171) without repeated passages modifying the antigenicity or virulence of the parasite (Murphy TM, Gray 3. S. et al., 1986, Res. Vet. Science, 40, 285-287), constitute a reference model for testing the efficacy of a vaccine against B. divergens.
- the vaccine is administered by subcutaneous route, at two points on the back of gerbils (average weight: 52 g) according to the following protocol: Vaccinated animals: 5 number: 8 4 x 1 dose at 30, 310, 330, 350 number: 2 3 x 1 dose at 30, 310, 330
- Each dose contains 0.2 ml of parasitic antigens from the concentration of 1.5 ml of culture supernatant from a population of 30% parasitized human red blood cells and is added with 0 0.2 ml of saponin at 1 mg / ml.
- Control / adjuvant animals :
- 4 x 1 injection number 2 of 400 ⁇ l of saponin at 30, 310, 330, 350
- the vaccine is administered by subcutaneous route, at two points 0 on the back of the gerbils (average weight: 60 g) according to the following protocol: Vaccinated animals: number: 2 2 1 dose at 30, 320
- Each dose contains 0.2 ml of parasitic antigens from the concentration of 1.5 ml of culture supernatant from a population of 30% parasitized human red blood cells, and is added to 0.2 ml of saponin at 1 mg / ml.
- the gerbils receive 5.5.10 red blood cells intraperitoneally parasitized by the homologous human strain (Rouen 5 .987).
- the 10 gerbils v accineed survive, without ever having presented the slightest hemoglobinuria (clinical sign of advanced babesiosis).
- the gerbils receive intraperitoneally 1, 6.10 red blood cells parasitized by the homologous human strain (Rouen 1987).
- MA3G1B1 1 (6) - control sera: healthy gerbil serum (7) healthy dog serum (8).
- (1) and (2) were positive with a ratio of 1/12800. 3 and 4 were positive with a ratio of 1/800. (5), (6), (7) and (8) were negative with respect to the B. divergens antigen.
- Anti-B antibodies divergens and anti-B. The following canis were used on the B. canis antigen:
- the sera or antibodies (! '), (2 ! ), (3') and (4 ') were positive with a ratio of 1/4 800.
- each dose contains 200 ⁇ l of parasitic antigens
- each dose contains 200 ⁇ l of parasitic antigens (1.5 ml of concentrated culture supernatant)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé de culture de Babesia divergens, caractérisé en ce que la souche de Babesia est maintenue en culture sur un milieu de culture exempt de protéine sérique mais contenant des lipoprotéines ainsi que des hématies, ainsi qu'un procédé de préparation d'exoantigènes et un vaccin contenant ces antigènes.
Description
PROCEDE DE CULTURE IOTENSIVE, IN VITRO, DE SOUCHES DE BABESIA DIVERGENS, PROCEDE DE PREPARATION D'EXOANTIGE ES ET VACCIN CONTENANT CES ANTIGENES
La présente invention a été faite au Laboratoire de Biologie Cellulaire de l'Université de POITIERS, Unité de Recherche Associée au Centre National de la Recherche Scientifique, n° 290 et au Laboratoire de Parasitologie de RHONE- ERIEUX.
La présente invention concerne un procédé de culture intensive in vitro de Babesia divergens, de préparation d'exoantigènes et de protéines parasitaires et leur utilisation comme vaccin.
Les babésioses, encore appelées piroplasmoses, sont des parasitoses intraérythrocytaires fréquentes chez les animaux domestiques et sauvages (bovins, chiens, chevaux, rongeurs notamment) et plus rares chez l'homme ( 16 cas cliniques en Europe, 200 environ aux Etats Unis ont été décrits depuis 1957). Elles sont transmises par des Acariens hématophages (tiques) et éventuellement par transfusion sanguine chez l'homme . Il existe de nombreuses espèces de Babesia. Parmi les différentes babésioses animales, la babésiose bovine causée par B. bovis (= B. argentina), B. bigemina, B. major, B. divergens, est la plus importante du point de vue économique. En Europe, la babésiose bovine à B. divergens provoque une mortalité limitée grâce à une chimiothérapie efficace (par exemple l'imidocarbe). Toutefois, des cas de chimiorésistance commencent à être observés, en particulier en France (Ecole Nationale Vétérinaire, Nantes). Par contre, la morbidité de l'infection est à l'origine de pertes économiques importantes.
Dans les pays en voie de développement, la babésiose bovine représente un obstacle majeur à l'augmentation de la productivité de l'élevage bovin et une des principales causes de pertes économiques enregistrées dans certaines régions d'Afrique. u existe plusieurs méthodes de lutte contre les Babesia :
- lutte contre les arthropodes vecteurs (tiques),
- chimiothérapie antiparasitaire curative ou préventive,
- vaccination des animaux contre les Babesia : à l'heure actuelle, seuls sont utilisés à grande échelle les vaccins contre la babésiose bovine à B. bovis e à B. bigemina (Australie, Amérique latine, Israël, Afrique du Sud) et
contre la babésiose canine à B. canis (France) ; aucun vaccin commercialisé n'existe encore contre B. divergens et B. major, espèces responsables de la babésiose bovine en Europe, seul Taylor a proposé un vaccin obtenu à partir de sang de bovin parasité (GB-A-2 200 638). Parmi les vaccins anti-Babesia décrits, il existe deux types majeurs : les vaccins vivants et les vaccins inactivés (leurs avantages et inconvénients sont résumés dans le tableau 1 ). Les exoantigènes parasitaires recueillis dans les surnageants de culture ont déjà été utilisés pour la vaccination contre la babésiose bovine à B. bovis et B. bigemina (EP-0 018 579 Bl) et la babésiose canine à B. canis (EP-0 220 988 Al).
Tableau I
Type de vaccin Reproductibilité
VACCINS VIVANTS: a) "Prcinunisat ion" (infection puis faible non oui ouï c himiothérapie) b) Parasites irradiés (aible non 9 c) Parasites atténués (passages rapides variable non oui oui
chez l'animal)
VACCINS INACTIVES:
Préparés à partir de bovins infectes: a) Antigènes figurés faible non b) Antigènes solubles extraits d'hématies faible non parasitées surnageants de lyse bonne oui c) Antigènes solubles plasmatiques faible non
Préparés à partir de cultures in vitro :
Exoantigènes solubles isolés de surnageants bonne oui non non de culture
La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'exoantigènes et de protéines permettant d'obtenir un vaccin contre la babésiose bovine à B. divergens et qui peut être étendu à d'autres espèces de Babesia.
Le procédé de culture de Babesia est caractérisé en ce que la souche de Babesia est maintenue en culture sur un milieu de culture exempt de protéine sérique, mais contenant des lipoprotéines ainsi que des hématies.
Les lipoprotéines utilisables selon la présente invention sont de préférence d'origine naturelle, notamment d'origine humaine.
Parmi ces lipoprotéines, il faut citer plus particulièrement la lipoprotéine de haute densité, dénommée ci-après "HDL" "High Density Lipoprotein".
Les index de multiplication de Babesia divergens en culture in vitro en milieu semi-défini sont comparables à ceux obtenus avec les milieux complexes contenant de 5 à 10 % de sérum humain.
Cette nouvelle technique peut être adaptée à la culture iii vitro d'autres espèces de Babesia telles que B. bovis, B. bigemina, B. canis, B. equi, B. major, B. microti. L'emploi de milieu semi défini permet la purification des exoantigènes présents dans le milieu et présente des avantages pour la culture de Babesia :
- diminution des risques de contamination des expérimenta¬ teurs par la présente éventuelle de virus dans les sérums (virus de l'hépatite, HIV) ;
- bonne reproductibilité du développement des parasites qui n'est plus dépendante de la variabilité des lots sériques ;
- suppression des problèmes d'incompatibilité sérum/hématie et possibilité d'utiliser toutes les hématies du système ABO. Ce milieu semi-défini à base de lipoprotéines comporte de préférence des fractions HDL à une concentration comprise entre 0,2 et 5 mg de lipide/ml, en particulier 0,5 et 3 mg de lipide/ml, additionnées ou non de LDL, à une concentration comprise entre 0,5 et 1,5 mg de lipide/ml. Ce milieu peut contenir également des facteurs de croissance comme l'insuline bovine à une concentration comprise entre 0,5 et 10 μg/ml, la transferrine humaine à une concentration de 10 à 200 μg/ml, le sélénium et la Béta-cyclodextrine.
Ces milieux de culture exempts de protéine sérique sont connus. Il s'agit par exemple de milieux tels que le RPMI 1640 utilisé pour les cultures cellulaires. Ces milieux sont en général complémentés par des protéines séπques notamment par du sérum de veau foetal ; dans le cas
5 présent le complément est constitué par des lipoprotéines.
Ces milieux sont connus de l'homme de métier et ne seront pas décrits plus avant. On utilisera parfois pour ces milieux la terminologie d'équivalents au milieu RPMI 1640.
Ce procédé de culture permet notamment la préparation
' d'exoantigènes de Babesia, lesquels sont isolés du milieu de culture.
B. divergens produit des exoantigènes dans le surnageant de culture, dont certains induisent une immunoprotection chez les animaux vaccinés. L'emploi de milieu semi-défini permet le recueil des antigènes parasitaires candidats à la stimulation de l'immunité humorale et/ou de
' l'immunité à médiation cellulaire, en s'affranchissant des problèmes liés à la présence dans le milieu de culture de protéines plasmatiques majeures (albumine, immunoglobuline). Le procédé permet de réaliser-une concentra¬ tion plus élevée de l'antigène en lui conservant une bonne solubilité. Il améliore de même la purification des facteurs sériques protecteurs.
2 Dans le cas de B. divergens et B. canis, le recueil d'antigènes se heurtait jusqu'ici aux difficultés de maintien des cultures en continu par les méthodes précédemment décrites. Ainsi, lors de la culture de B. canis utilisée pour le vaccin Pirodog (Rhône Mérieux), la parasitémie tombe en dessous de 1 ?_, en trois semaines (Moreau Y. et Laurent N., jji : "Malaria
25 and Babesiosis", Ristic M., Ambroise-Thomas P., Kreier 3. P. (eds), Martinus Nijhoff, Dordrecht, Hollande, 1984, 132). Cette situation entraînait donc la nécessité d'initier régulièrement de nouvelles cultures avec des hématies de chiens parasités.
Les faibles parasitémies décrites dans la littérature obtenues
^0 lors de la culture de B. divergens en hématies de bovins, l'utilisation de concentrations élevées de sérum bovin, ne permettent ni l'accumulation de grandes quantités d'antigènes parasitaires dans les surnageants de culture, ni une séparation aisée de la fraction proteique vaccinante ; ces antigènes sont présents en très faible quantité dans le surnageant par rapport aux
35 protéines sériques bovines.
La souche de B. divergens cultivée selon le procédé de l'invention et notamment sur hématies humaines depuis juin 1987 ne nécessite pas de changement de milieu quotidien pour des parasitémies inférieures à 5 %. Comme il s'agit d'une culture continue, il n'est pas nécessaire d'initier régulièrement les cultures avec du sang de bovins ou de gerbilles parasités.
Les exoantigènes de B. divergens obtenus par ces procédé de culture peuvent être purifiés, concentrés et analysés après marquage par des acides aminés radioactifs. On met ainsi en évidence les perturbations provoquées par les protéines sériques lors de la séparation des protéines parasitaires.
L'analyse par gel filtration (colonne Superose 12, FPLC Pharmacia), permet de détecter trois ensembles de protéines parasitaires radiomarquées dans les surnageants provenant de milieux semi-définis, alors que la même expérience réalisée en présence de milieu complet ( 10 % de sérum) montre un seul pic majeur de radioactivité dû à une accumulation provoquée par la présence de protéines sériques.
Les protéines solubles du surnageant de B. divergens qui confèrent une protection contre une infection ont les masses moléculaires relatives suivantes : 31-33 Da (doublet), 35-37 kDa (doublet), 43^2 kDa,
46^3 kDa, 50_+2 kDa, 66-68 kDa (doublet), 70^3 kDa, 80^3 kDa, 90_+3 kDa,
1 10^3 kDa, 130^3 kDa, 140.+5 kDa et 150 kDa.
La présente invention concerne, en outre, les fractions des exoantigènes de B. divergens ayant un aV: - fraction 1) compris entre 0 et 0,27,
- fraction 2) compris entre 0,27 et 0,57,
- fraction 3) compris entre 0,57 et 0,78,
- fraction 4) compris entre 0,78 et 0,95, en particulier les fractions 2 et 4. L'invention concerne également les protéines antigéniques composant ces fractions et notamment la protéine d'un poids moléculaire de 17 000 +_ 2 000 Da figurant dans la fraction 4.
Il s'agit d'une protéine qui se trouve aussi bien dans B. divergens et B. canis. C'est un exoantigène pour lequel l'anticorps correspondant a un pouvoir inhibiteur de 100 % à 50 μg/ml. Cette protéine est présente sur la surface de structures de type mitochondrial ainsi que sur les membranes.
La protéine p35 de poids moléculaire 35 000 _+ 2 000 Da qui est une glycoprotéine exoantigène palmitoylée qui ne croise pas avec B. canis et qui se trouve dans les fractions 3 et 4.
La protéine p50 d'un poids moléculaire de 50 000 +_ 3 000 Da dans les fractions F3 et F4 qui est reconnue par le sérum des animaux protégés bovins, gerbilles.
La technique de culture selon l'invention en hématies humaines ou en hématies bovines est utilisable pour une production industrielle, dans des systèmes semi-automatisés mettant en oeuvre de grands volumes de milieux de culture. Les exoantigènes provenant du surnageant de ces cultures en milieu semi-défini sont utilisables pour obtenir des fractions vaccinantes.
Ces fractions peuvent être utilisées en mélange avec des adjuvants d'immunité, notamment des adjuvants de type lipidique et/ou des saponines par exemple.
Bien qu'il soit plus particulièrement intéressant d'utiliser les fractions décrites précédemment dans la stratégie vaccinante, notamment les fractions 3 et 4, il est possible d'utiliser une ou plusieurs protéines purifiées ou bien obtenues par d'autres voies, notamment par recombinaison génétique.
Différents antigènes peuvent être isolés et utilisés pour produire des immunsérums et/ou des anticorps monoclonaux.
Ces fractions anticorps peuvent être utilisées en thérapie ou bien dans des buts de diagnostics. Les anticorps monoclonaux peuvent également être utilisés pour fractionner les surnageants de culture et purifier les exoantigènes par des procédés connus.
La présente invention concerne également ces différentes fractions antigènes et anticorps tant pour l'usage en thérapie, en prévention et/ou le diagnostic. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après.
Sur les dessins annexés à la présente description,
la figure 1 représente l'autoradiographie des protéines des fractions HDL
(fig. 1A) et LDL (fig. 1B) marqués à l'iode-125 selon McFarlane (1958);
A : dans la fraction HDL les apoprotéines A4,E, Al, A2 sont détectées, la sérum albumine humaine (HSA) est présente en quantité variable selon les préparations de la fraction HDL;
B : dans la fraction LDL, l'apoprotéine B-100 est majoritaire ; la figure 2A représente l'électrophorèse en SDS-PAGE (10 % d'acryl- amide) du surnageant de culture in vitro de B. divergens marqué métaboliquement avec de la 35-S-méthionine,
1 : kit de poids moléculaire
2 : surnageant de culture en milieu semi-défini (H + L)
3 : surnageant de culture en milieu sérique (10 % de sérum humain); . la figure 2B représente l'immunoprécipitation de culture in vitro de
B. divergens marqué à la 35-S-méthionine par un immunsérum humain, 1 : kit de poids moléculaire
2 : surnageant de culture en milieu sérique (10 % de sérum humain)
3 : surnageant de culture en milieu semi-défini (H + L)
4 : antigènes totaux B. divergens en milieu sérique (10 % de sérum humain) 5 : antigènes totaux B. divergens en milieu semi-défini (H + L) ;
. la figure 3 représente la séparation en gel filtration (colonne Superose
12, Pharmacia) des antigènes parasitaires présents dans le surnageant de culture de B. divergens marqué à la 35-S-méthionine ;
. la figure 4 illustre l'immunoprécipitation de cultures de B. divergens marquées métaboliquement à la 35-S-méthionine;
. la figure 5 illustre la croissance de B. divergens dans un milieu semi-défini contenant des concentrations différentes en lipoprotéines
(HDL ou LDL) comparée à la croissance observée en présence de milieu contenant 10 % de sérum humain (croissance = 100 %).
Exemple 1 Conditions de culture continue de B. divergens en hématies humaines
a) Souches de B. divergens La souche de B. divergens utilisée dans la présente stratégie de vaccination est une souche humaine recueillie à Rouen, en juin 1987, et maintenue en culture in vitro sur hématies humaines depuis cette date. Elle
sera désignée par B. divergens souche Rouen 1987. Bien entendu, il est possible d'utiliser d'autres souches, celle-ci n'étant mentionnée qu'à titre d'exemple spécifique.
Toute souche bovine de B. divergens peut être mise en culture en hématies humaines en réalisant, dans un premier temps, une culture mixte hématies de bovins/hématies humaines ou hématies de gerbilles/ hématies humaines. Dans le dernier cas, le sang parasité de gerbilles provient indifféremment de gerbilles infectées soit par du sang frais (ou cryoconservé) de bovins parasités, soit par du sang frais (ou cryoconservé) de gerbilles parasitées.
Plusieurs centaines de souches bovines recueillies en France dans les zones à B. divergens, cryoconservées dans l'azote liquide après passages préalables chez la gerbille, ont été rassemblées à l'Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes (A. Marchand).
b) Milieu de culture continu
Sa composition est la suivante : RPMI 1640 : 10,4 g
NaHCO-, : 2,1 g/1
3 HEPES : 8,3 g/1
H-O qsp 900 ml
Le pH est ajusté à 7,3 (7,2-7,4).
On ajoute ensuite 100 mi de sérum humain décomplémenté par chauffage à 56°C pendant 30 minutes et éventuellement de la gentamycine (0,1 à 1 mg/1).
Le DMEM, le MEM ou tout milieu synthétique équivalent pourront être utilisés à la place du RPMI 1640.
Le milieu est ensuite filtré sur filtre 0,22 μm. Le sérum humain utilisé est un mélange de sérums de sujets sains de groupes sanguins différents ou identiques dans le système A, B, O (sérologies virales négatives).
Des sérums bovins décomplémentés, préalablement sélectionnés pour leur non-agglutination d'hématies 0+ peuvent aussi être utilisés. C'est dans ce milieu de culture continu (RPMI + 10 % sérum humain) que les souches humaines isolées à Rouen et au Mans sont
maintenues depuis respectivement juin 1987 et mai 1988. c) Hématies
Les hématies utilisées sont des hématies humaines, habituelle- ment de groupe O , mais la culture de B. divergens est réalisable dans des hématies de tout autre groupe sanguin du système A, B, O. Dans ce dernier cas, s'il est préférable d'utiliser un sérum compatible, l'utilisation de sérums incompatibles est néanmoins possible car l'agglutination des hématies n'inhibe pas la croissance du parasite.
Les sangs humains, recueillis stérilement sur anticoagulant de type A. CD. (acide citrique, citrate de sodium, dextrose) ou équivalent, peuvent être utilisés pour la culture pendant une durée maximaie de 7 jours. Avant mise en culture, les hématies sont lavées 2 fois en RPMI 1640, puis une fois en RPMI 1640 + 10 % sérum + gentamycine. Le dernier culot de centrifugation d'hématies lavées est utilisé pour la culture.
d) Condition de culture
Quelle que soit la taille des boîtes de culture, i'hématocrite est compris entre 2 et 5 %. Il faut en outre veiller à ce que le volume de la culture d'hématies soit adapté à la surface de la boîte de culture, à titre d'exemple, 5 ml de culture à hematocrite 2-5 % pour une boîte de culture conventionnelle de 25 cm2.
La- culture de B. divergens est effectuée à 37°C : . boîte fermée après gazage par un mélange gazeux ternaire: N_ : 9 1 %,
02 : 6 %, C02 : 3 . boîte ouverte dans une cloche à bougie : CO- : de l'ordre de 5 °6 boîte ouverte dans une étuve à CO- ' 5 %.
Partant d'une parasitémie à 1 %, ces conditions de culture permettent d'atteindre régulièrement des parasitemies de 30 à 80 % après respectivement 3 à 5 jours de culture. Le taux effectif de multiplication par 24 heures est voisin de 5 avec la souche B. divergens souche Rouen
1987.
Aucun changement de milieu n'est nécessaire avant que la parasitémie atteigne 5 %. Un changement est effectué par 24 heures pour des parasitemies comprises entre 5 et 30 %. Deux changements de milieu
par 24 heures sont réalisés lorsque la parasitémie atteint 30 %. Les surnageants des cultures dont la parasitémie est comprise entre 20 et 40 % sont recueillis : ils constituent la base du vaccin proposé.
Un repiquage de la souche humaine (Rouen 1987) de B. divergens tous les 5 jours permet son maintien en culture continue depuis juin 1987.
Exemple 2
Culture in vitro de B. divergens dans des milieux semi-définis 0 à base de lipoprotéines et de facteurs de croissance
a) Préparation des lipoprotéines et des facteurs de croissance
Les lipoprotéines sont préparées, en partant du sérum humain de donneurs sains, par ultracentrifugation différentielle selon la technique 5 décrite par Havel et al., (1955, 3. Clin. Exp. Invest., 34, 1345-1353). La densité du sérum séparé après simple coagulation du sang sans additif (sang récolté sur flacon sec) est successivement ajustée à 1,019, 1,063 et 1,210 g/ml par addition de KBr et en présence d'EDTA (0,1 % final). Trois centrifugations successives de 22 heures à 120 000 g permettront d'isoler 3 ° fractions :
"Very Low Density Lipoprotein" (VLDL) 1,006 - 1,019 g/ml "Lo Density Lipoprotein (LDL) 1,019 - 1,063 g/ml
"High Density Lipoprotein (HDL) 1,063 - 1,210 g/ml
Les fractions LDL et HDL utilisées pour la culture sont dialysées à 4°C pendant 24 heures, d'abord contre une solution saline tamponnée à pH 7,4 avec du Tris-HCl 5 mM, puis contre une solution de
. RPMI 1640 bicarbonate de sodium 17 mM, HEPES 25 mM (pH 7,4). Les solutions obtenues sont stérilisées par filtration sur filtre 0,22 μ et conservées à 4°C. La quantité de lipoprotéines est estimée après dosage ° colorimétrique des protéines (Lowry et al., 1951 , 3. Biol. Chem., 193, 265-275) en multipliant cette valeur par 2 pour les HDL et par 4 pour les LDL, il est en effet admis que les contenus en protéines des HDL et LDL sont respectivement de 50 et 25 % de la masse finale (Patsch et al., 1974, 3. Lip. Res., 15, 356-366). La composition des apoprotéines des fractions isolées est contrôlée par électrophorèse en gel d'acrylamide à 15 % (SDS-PAGE).
b) Milieu semi-défini permettant au moins 2 cycles de développement
Le milieu de culture pour le développement in vitro de B. divergens souche Rouen 1987 sur hématies humaines doit comprendre un mélange HDL, LDL, des facteurs de croissance additionnés dans le milieu RPMI 1640 ou milieux équivalents, HEPES 25 mM, NaHCO, 17 mM, le pH est ajusté à 7,4. Ce milieu de base peut être complété par l'addition d'anbitiotiques.
La fraction HDL totale, d'origine humaine, (d = 1,063- 1,210 g/ml), utilisée contient en général les apoprotéines AI 28 kDa, AU 17,4 kDa, AIV 45 kDa, C 6,6-8,8 kDa, et de la sérum albumine dont la quantité varie selon les préparations de la fraction HDL totale. Les protéines de la fraction HDL peuvent être marquées spécifiquement à l'iode-125 selon la technique de McFarlane (1958, Nature, 182, 53) et détectées par SDS-PAGE et autoradiographie (Figure 1A). Cette fraction HDL est utilisée à des concentrations comprises entre 0,5 mg et 2 mg/ml pour une parasitémie initiale de l'ordre de 1 %. La concentration en apoprotéines des LDL totales dans le milieu est comprise entre 0,5 et 1,5 mg/ml et la technique précédente à l'iode-125 selon McFarlane montre un marquage majoritaire de l'apoprotéine B-100 (figure 1B). La transferrine humaine et l'insuline bovine sont utilisées respectivement aux doses de 100 μg/ml (10-200 μg/mi) et 1 μg/ml (0,5- 10 μg/ml). L'index de multiplication, défini comme le rapport entre le taux de parasitémie après réinvasion et le taux de parasitémie initiale, a été déterminé sur les différentes souches de B. divergens cultivées en boîtes de 25 cm2. Les incubations testées ont porté sur six étapes de réinvasion, ce qui permet d'assurer que les parasites sont toujours viables au 6ème cycle biologique consécutif à leur mise en culture en milieu semi-défini.
Tableau 2
Index de multiplication entre le temps de mise en culture (T0) et la 24ème heure de culture (T24)et la période T24 et 48 heures (T48)
(H, HDL, L, LDL)
INDEX DE MULTIPLICATION T0-24 T24-48
Sérum 4 4
HL 4,1 2,8
Des cultures in vitro utilisant des HDL et des LDL additionnées de transferrine 50 μg/ml, sélénium 10 μg/ml et de béta-cyclodextrine 250 μg/ml ont également été effectuées. Ces facteurs possèdent des propritétés stimulatrices des cultures (sélénium : inhibiteur des peroxy- dations ; béta-cyclodextrine : inhibiteur de la toxicité de molécules présentes dans le milieu de culture). Des index de multiplications similaires aux précédentes ont été obtenus.
Pour des parasitemies initiales élevées (15 à 20 %), les index de multiplication dans le milieu semi-défini HL sont similaires au milieu sérique de référence durant les 20 premières heures soit 2 cycles de développement érythrocytaire de B. divergens (le cycle de multiplication de B. divergens cultivé in vitro sur hématies humaines est en effet de l'ordre de 8 à 10 heures). Ces conditions de culture permettent la purification de protéines parasitaires solubles et notamment des exoantigènes.
c) Milieu semi-défini simplifié pour l'obtention des protéines sécrétées au cours d'un cycle biologique Le milieu semi-défini ne contenant que la fraction HDL totale à 1 mg de lipide/ml permet de recueillir les protéines parasitaires libérées au cours des différentes étapes du cycle érythrocytaire et au moment de la réinvasion, notamment après marquage métabolique du parasite à l'aide d'acide(s) aminé(s) radioactif(s).
Ce milieu permet donc une bonne maturation de B. divergens, il serait possible de recueillir les antigènes produits pendant cette maturation et de les concentrer dans des conditions favorables caractérisées par l'absence de protéines plasmatiques dans le milieu de culture. 5
Exemple 3
Obtention et purification des protéines de B. divergens stimulatrices de l'immunité humorale et/ou de l'immunité à médiation cellulaire
' a) Marquage métabolique et obtention des protéines parasitaires
Les cultures in vitro de B. divergens sur hématies humaines sont incubées avec 40 μCi/ml de L-[35-S]-méthionine (Amersham : supérieur à 1 Ci/μmole), dans du milieu RPMI 1640 ou équivalent sans méthionine additionné des constituants des milieux semi-définis. D'autres acides
1 aminés radioactifs peuvent être utilisés tels que la L-[3H]-isoleucme (0, 1 Ci/μmole) et la L-(3H)-histidine (0,05 Ci/μmole). Les milieux de culture contenant les protéines parasitaires sécrétées dans le milieu ou libérées lors de la réinvasion des globules rouges par les mérozoîtes sont centrifugés (600 g pendant 5 mn), puis filtrés sur filtres Millex 0,22 μm
2 J pour éliminer les constituants particulaires. Les protéines sont ensuite concentrées de 5 à 10 fois par ultrafiltration sur membranes (B 15 ou P.M 10 Centπcon, Amicon). Les protéines parasitaires sont analysées par électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie.
" 5 b) Séparation des protéines parasitaires
Les protéines parasitaires radiomarquées avec un ou plusieurs acides aminés peuvent être fractionnées par les techniques classiques de chromatographie liquide (échange d'ions, gel filtration, focalisation iso- électrtque, caractère hydrophobe, etc.) associées à une détermination de
^ leur radioactivité par un compteur du type "Flow-one", modèle C R (Radiomatic, Tampa U.5.A.). Les fractions de protéines parasitaires purif iées peuvent contenir les protéines de la fraction HDL mais se trouvent dépletées des nombreuses protéines sériques natives ou modifiées de l'hôte, susceptibles d'interférer avec la réaction immunitaire (humorale
3 et/ou à médiation cellulaire).
c) Identification des protéines parasitaires solubles de B. divergens
Les surnageants de culture in vitro de B. divergens sur hématies humaines en présence de L-[35-S]-méthionine, concentrés par ultrafiltration montrent des modifications de migration électrophorétique dans le milieu complet ( 10 % sérum) pour les protéines de 40 à 70 000 (Figure 2A). Les protéines solubles du surnageant de culture de B. divergens qui confèrent une protection contre une infection peuvent être révélées par marquage métabolique à la 35-S-méthionine. Elles ont les masses moléculaires relatives suivantes : 31 -33 kDa (doublet), 35-37 kDa (doublet), 43 i 2 kDa, 46 _+ 3 kDa, 50 +_ 2 kDa, 66-68 kDa (doublet), 70 +_ 3 kDa, 80 _+ 3 kDa, 90 _+ 3 kDa, 1 10 +. 3 kDa, 130 _+ 3 kDa, 140 +. 5 kDa et 150 kDa. Parmi celles-ci, les plus immunogènes, révélées par immunoprécipitation chez tous les isolats testés ont des masses moléculaires variant de 34 à 37 kDa, de 43 à 46 kDa, de 69 à 72 kDa et de 90 à 100 kDa. Les perturbations provoquées par les protéines sériques lors de la séparation des protéines parasitaires peuvent être confirmées par chromatographie liquide. Les surnageants d'une culture in vitro de B. divergens (parasitémie 8 %), radiomarqués 12 heures à la L-[35-S]-méthionine peuvent, après filtration (0,22 μ ) être séparés par gel filtration (colonne Superose 12, FPLC Pharmacia). Trois ensembles de protéines parasitaires radiomarquées sont détectés dans les surnageants provenant de milieux semi-définis avec le compteur de radioactivité Flow-one, modèle CR (Figure 3). La même expérience réalisée en présence de milieu complet ( 10 % de sérum) montre un seul pic majeur de radioactivité dû à une accumulation provoquée par la présence des protéines sériques (figure 3).
Les caractères antigéniques des parasites cultivés en milieu normal ou en milieux semi-définis sont similaires, aussi bien pour les protéines totales que pour les protéines solubles du parasite comme le montrent les expériences d'immunoprécipitation réalisées avec le même immunsérum (figure 2B).
Exemple
L'identification des protéines immunogènes de B. divergens, à partir de culture in vitro sur hématies humaines, indispensable à la mise au point d'un vaccin, a nécessité l'étude de la réponse immunitaire à
B. divergens dans trois hôtes réceptifs : boeuf, homme, gerbille. Pour cette étude, les immunsérums suivants ont été utilisés. :
. Im unsérums humains : Il s'agit de 5 sérums provenant de malades français et en particulier du malade traité avec succès à Rouen en juin 1987.
. Immunsérums de gerbilles : Les gerbilles ont été infectées expérimentalement par la souche B. divergens, Rouen 1987 par 10 hématies parasitées/animal, puis traitées par de l'imidocarbe (Carbesia N.D. Lab. Coopers) quand la parasitémie a atteint 5 %, et enfin infectées par la même souche à plusieurs reprises, à partir du mois suivant. Les animaux ainsi traités ont été protégés contre B. divergens et désignés sous le nom de gerbilles super immunes.
. Immunsérums de veaux : Un veau spiénectomisé (appelé V I) a reçu successivement 10 hématies parasitées du malade de Rouen (souche
B. divergens, Rouen 1987), puis 10 hématies de gerbilles parasitées par la même souche (les hématies du malade guéri ne pouvaient plus être utilisées).
Un veau spiénectomisé (appelé V2) a reçu à deux reprises 10 hématies de gerbilles parasitées par la même souche.
1 ) Identification dans des lysats d'hématies parasitées des protéines immunogènes de B. divergens à l'aide d'immunsérums de boeuf, de gerbille et d'homme
Un marquage métabolique de B. divergens (souche Rouen 1987) cultivé in vitro sur hématies humaines a été effectué selon les méthodes classiques à l'aide de la 35S-méthionine, avec des temps d'incubation de 12 heures. Les protéines immunoprécipitées grâce aux sérums du malade recueillis à partir du jour 34 de l'épisode clinique jusqu'au 9ème mois suivant ont été analysées par électrophorèse SDS.PAGE en milieu réducteur et autoradiographiées.
Les anticorps dirigés contre le groupe de protéines de 35 kDa sont les premiers à apparaître.
Une communauté antigénique, avec notamment les groupes de protéines majeures et des protéines mineures est observée quel que soit l'immunsérum utilisé.
La figure 4 illustre l'immunoprécipitation de cultures de Babesia divergens marquées métaboliquement ( S-méthionine) par différents immunsérums issus de : a : gerbille b : homme c : boeuf (k = kit de poids moléculaires).
2) Immunoprécipitations des protéines parasitaires, présentes dans les surnageants de culture de B. divergens (souche Rouen 1987) à l'aide des trois immunsérums (homme, gerbille, veau)
Après élimination des immunoglobulines sériques par fixation sur de la protéine A-Staphylococcus ou protéine A-Sépharose CL 4B (Pharmacfa), les surnageants de culture ont été immunoprécipités à l'aide des trois immunsérums (homme, gerbille, veau) précédents. Ces immuno¬ précipitations ont permis de mettre en évidence des protéines majeures présentant la même mobilité électrophorétique en SDS-PAGE milieu réducteur chez les trois hôtes (30 à 100 kDa), ainsi que des protéines mineures pouvant présenter un poids moléculaire supérieur à 100 kDa et inférieur à 30 kDa.
Exemple 5 Purification d'exoantigènes de B. divergens
Les surnageants de culture de B. divergens Rouen 1987 (parasitémie 30-40 %) obtenus en milieu semi-défini (MDL : 0,5 mg/ml, LDL : 0,125 mg/ml, exprimé en mg de protéines des lipoprotéines) obtenus par le procédé décrit précédemment ont été concentrés 15 fois sur Amico CF25 et chargés sur une colonne Superose 12 (système FPLC Pharmacia). A l'aide d'un tampon acétate d'ammonium 25 mM, pH 7,3, les différentes fractions sont éluées à un débit de 0,3 ml/min. Les différentes fractions obtenues sont :
- Fraction I : FI : 6,5 à 11 ml d'élution
- Fraction II : F2 : 1 1 à 16,5 ml d'élution
- Fraction III : F3 : 16,5 à 20 ml d'élution
- Fraction IV : F4 : 20 à 23 ml d'élution.
Le tableau 3 résume les KaV de ces différentes fractions ainsi que les masses moléculaires des antigènes contenus dans chacune de ces fractions obtenus par étalement sur gel SDS PAGE.
Tableau 3 Caractéristiques des fractions
FI
Volume d'élution 6,5-1 1 (ml)
Kav 0-0,27
MM 136
SDS PAGE 124
(kDa) 97 92 86 69 66 57 53 49 37 29
21 16
Colonne : Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) Surnageant de culture concentré 50 fois sur Centriflo CF25 (Amicon)
Kav - (Ve - Vt)/(Vt - Vo) Ve : volume d'élution
Vt : volume de la colonne Vo : volume mort
Exemple 6 Vaccin anti-B. divergens
1 ) Antigènes vaccinants
La vaccination est réalisée en utilisant comme antigènes les exoantigènes et protéines parasitaires recueillis dans le surnageant de culture in vitro sur hématies humaines de B. divergens lorsque la parasitémie est de l'ordre de 30 à 40 %. Le surnageant utilisé comme base g de vaccin correspond a des cultures renfermant environ 10 hématies parasitées par ml de milieu. Le milieu de culture contenant les antigènes parasitaires est centrifugé à 1500 g puis filtré stérilement sur filtre
0,22 μm. La dose d'antigène vaccinant peut être adaptée, grâce aux procédés usuels de concentration des protéines, à l'animal à vacciner. A la dose de protéines parasitaires contenues dans 0,2 ml dans le cas de la gerbille, est ajouté un volume correspondant de saponine à l mg/ml de
RPMI 1640 à titre d'adjuvant pour obtenir une concentration finale de saponine à 0,5 mg/ml. L'utilisation d'autres adjuvants est, possible.
2) Utilisation de milieux de culture semi-définis pour le recueil des exoantigènes et protéines parasitaires
Le milieu semi-défini décrit précédemment permet de recueillir les exoantigènes et protéines parasitaires avec une très faible contamination par les protéines sériques et présente par rapport aux brevets antérieurs un avantage certain (par exemple, le milieu de culture de Ristic (USA) contient 30 à 50 % de sérum ; celui de Canning (GB) 40 °_).
Ce milieu apportera une amélioration sensible dans la concentration et le fractionnement des antigènes parasitaires nécessaire à la fabrication d'un vaccin de deuxième génération.
3) Vaccination de gerbilles
Les gerbilles, réceptives à l'infection par B. divergens (Lewis D. et Williams H., 1979, Nature, 278, 170-171 ) sans que les passages répétés ne modifient l'antigénicité ou la virulence du parasite (Murphy T.M., Gray 3. S. et al., 1986, Res. Vet. Science, 40, 285-287), constituent un modèle de référence pour tester l'efficacité d'un vaccin contre B. divergens.
a) Protocole de vaccination 1
Le vaccin est administré par voie sous-cutanée, en deux points du dos des gerbilles (poids moyen : 52 g) selon le protocole suivant : Animaux vaccinés : 5 nombre : 8 4 x 1 dose à 30, 310, 330, 350 nombre : 2 3 x 1 dose à 30, 310, 330
Chaque dose contient 0,2 ml d'antigènes parasitaires provenant de la concentration de 1,5 ml de surnageant de culture d'une population de globules rouges humains parasités à 30 % et est adjuvée par 0 0,2 ml de saponine à 1 mg/ml. Animaux témoins/adjuvant :
4 x 1 injection nombre : 2 de 400 μl de saponine à 30, 310, 330, 350
(0,5 mg/ml) 5 Animaux témoins : nombre : 10 gerbilles maintenues dans les mêmes conditions d'élevage que les animaux précédents. . b) Protocole de vaccination 2
Le vaccin est administré par voie sous-cutanée, en deux points 0 du dos des gerbilles (poids moyen : 60 g) selon le protocole suivant : Animaux vaccinés : nombre : 2 2 1 dose à 30, 320
Chaque dose contient 0,2 ml d'antigènes parasitaires provenant de la concentration de 1,5 ml de surnageant de culture d'une population de globules rouges humains parasités à 30 %, et est adjuvée à 0,2 ml de saponine à 1 mg/ ml. Animaux témoins : nombre : 2 gerbilles maintenues dans les mêmes conditions d'élevage que les animaux précédents. ° c) Résultats
Immunoprotection contre la souche homologue de B. divergens (souche Rouen 1987) (protocole de vaccination 1)
A 363 les gerbilles reçoivent par voie intrapéritonéale 5,5.10 globules rouges parasités par la souche humaine homologue (Rouen 5 .987).
Les 10 gerbilles non vaccinées, ainsi que celles n'ayant reçu que l'adjuvant, meurent 6 à 9 jours après la contamination. Les 10 gerbilles v accinées survivent, sans avoir jamais présenté la moindre hémoglobinurie (signe clinique d'une babésiose avancée).
Immunoprotection contre la souche homologue de B. divergens (souche Rouen 1987) (protocole de vaccination 2)
A 354 les gerbilles reçoivent par voie intrapéritonéale 1 ,6.10 globules rouges parasités par la souche humaine homologue (Rouen 1987).
Les 2 gerbilles non vaccinées meurent 5 jours après la contamination. Les 2 gerbilles vaccinées survivent, sans avoir jamais présenté la moindre hémoglobinurie. Immunoprotection contre des souches bovines hétéroiogues (protocole 1)
Les 8 gerbilles précédentes ayant reçu 4 doses et protégées contre la souche homologue (Rouen 1987) ont été contaminées une nouvelle fois à 379 par injection intrapéritonéale de 2,5.10 globules rouges de gerbilles parasitées par des souches hétéroiogues selon le protocole suivant :
Souches de B. divergens Animaux Animaux utilisées pour l'infection vaccines témoins . Souche homologue :
Rouen (Haute Normandie) 1987 . Souches hétéroiogues : côte d'Or (Bourgogne)
Indre (Centre) Loire-Atlantique (Pays de Loire)
Les quatre gerbilles témoins meurent entre 78 et 1 16 heures après la contamination. Les 8 gerbilles vaccinées survivent sans aucune hémoglobinurie.
Exemple 7 Etude de l'antigénicité croisée entre Babesia canis et Babesia divergens
a) Immunofluorescence indirecte Les anticorps anti-B. divergens et anti-B. canis suivants ont été utilisés sur l'antigène B. divergens
- sérum de gerbille anti-B. divergens (1)
- anticorps monoclonal DG7 (ascite) dirigé contre B. divergens (2)
- anticorps polyclonal anti-P35 dirigé contre une protéine de 35 kDa de B. divergens (3)
- sérum de chien anti-B. canis (4)
- anticorps monoclonaux dirigés contre B. canis 42E3 (5)
MA3G1B1 1 (6) - sérums contrôles : sérum de gerbille saine (7) sérum de chien sain (8).
(1) et (2) se sont révélés positifs avec un rapport de 1/12 800. 3 et 4 se sont révélés positifs avec un rapport de 1/800. (5), (6), (7) et (8) se sont révélés négatifs vis-à-vis de l'antigène B. divergens.
Les anticorps anti-B. divergens et anti-B. canis suivants ont été utilisés sur l'antigène B. canis :
- sérum de chien anti-B. canis (!')
- anticorps monoclonal MA3G1B11 (2') - anticorps monoclonal 42E3 (3')
- anticorps monoclonal DG7 (41)
- sérum de gerbille anti-B. divergens (5')
- anticorps polyclonal anti-P35 (60
- sérums contrôles : sérum de gerbille saine (7') sérum de chien sain (8').
Les sérums ou anticorps (! '), (2!), (3') et (4') se sont révélés positifs avec un rapport de 1/4 800.
(51) s'est révélé positif avec un rapport de 1/400. (6'), (71) et (8') se sont révélés négatifs sur l'antigène B. canis.
b) Immunoprécipitations
Les immunoprécipitations effectuées sur des antigènes B. divergens marqués à la méthionine 5 à l'aide de sérum de chien anti-B. canis et de sérum de gerbille anti-B. divergens ont démontré une grande antigénicité croisée entre les deux espèces.
Les protéines majeures reconnues par les deux types d'immunosérums (chien et gerbille) ont les masses moléculaires suivantes :
- antigène supérieure à 220 kDa
- doublet de 200 à 210 kDa 105 à 1 10 kDa
85 kDa 70 kDa 46 kDa 37 kDa
35 kDa
Exemple 8 Protocole de vaccination
8.1 ) Influence de la fraction, de la dose et du nombre d'injections
Le protocole défini précédemment est modifié de la façon suivante :
- vaccination par voie sous-cutanée
- injection à 30-321-342 - chaque dose contient 200 μl d'antigènes parasitaires
- adjuvant : 200 μg de Quil A/injection
- épreuve à 363 par injection IP de 10 globules rouges parasités
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 4 :
Tableau 4
DEUX IN3ECTIONS TROIS IN3ECTIONS
TRAITEMENT
A (1,5 ml équivalent)
B (0,3 ml L équivalent)
C (0,06 ml . équivalent)
(placebo)^
E témoins (eau physio¬
logique)
1 : ml de surnageant brut contenu dans une dose vaccinale
2 : surnageant de culture d'hématies saines
3 : intervalle de confiance de la moyenne
On constate que le surnageant selon l'invention est protecteur à 1,5 et 0,3 ml équivalent. 8.2) Influence de la fraction antigénique vaccinate
On opère comme précédemment mais en utilisant différentes fractions correspondant aux fractions 1 à 4 décrites précédemment, un surnageant sérique, c'est-à-dire d'une culture avec 10 % de sérum et un surnageant lipo, c'est-à-dire d'une culture contenant des lipoprotéines. L'ensemble de ces fractions procure une protection. Les résultats sont rassemblés sur le tableau 5.
Tableau 5 Résultats à l'épreuve virulente (Gerbille)
Mortalité
TRAITEMENTS Vaccinés Placebo
Surnageant sérique 0/10 10/10 ( 1 ,5 ml éq.)
Surnageant lipo 0/10 10/10
( 1,5 ml éq.)
Fraction n° 1 0/10 10/10 ( 1 ,5 ml éq.)
Fraction n° 2 0/9 9/10
( 1,5 ml éq.)
Fraction n° 3 0/9 8/10
( 1 ,5 ml éq.)
Fraction n° 4 0/10 10/10
( 1 ,5 ml éq.)
8.3) Essais hétéroiogues
Essai de protection hétéroiogue :
- vaccination par voie sous-cutanée
- injections à 30 - 321
- chaque dose contient 200 μl d'antigènes parasitaires ( 1,5 ml de surnageant de culture concentré)
- adjuvant : 200 μg de Quil A/injection
- épreuve à 342 par injection IP de 10 globules rouges parasités.
Souche
Rouen
Allemande
Anglaise
7107A
Irlandaise
On constate une protection pour des souches hétéroiogues même si pour la souche dite "allemande" les résultats restent moyens.
Claims
27
REVENDICATIONS
1) Procédé de culture de Babesia, caractérisé en ce que la souche de Babesia est maintenue en culture sur un milieu de culture exempt de protéine sérique mais contenant des lipoprotéines ainsi que des hématies.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont d'origine naturelle.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont des lipoprotéines de haute densité naturelle ou HDL.
4) Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que les lipoprotéines sont d'origine humaine.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le milieu de culture est le milieu RPMI 1640 ou un milieu équivalent.
6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu contient, en outre, des facteurs de croissance.
7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la teneur en HDL est comprise entre 0,2 et 5 mg de lipide/ml.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration en HDL est de 0,5 à 1,5 mg de lipide/ml.
9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les hématies utilisées sont des hématies humaines.
10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la souche de Babesia est du genre Babesia divergens.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on récupère après culture les exoantigènes solubles dans le milieu et en ce que l'on les isole.
12) Exoantigènes de Babesia caractérisés en ce qu'ils peuvent être obtenus par le procédé selon la revendication 1 1.
13) Exoantigènes selon la revendication 12, caractérisés en ce qu'ils comportent au moins l'un des trois ensembles de protéines majeures.
14) Exoantigènes de B. divergens selon la revendication 12, caractérisés en ce que leurs masses moléculaires relatives varient respectivement de 34 à 37 kDa, de 43 à 46 kDa, de 69 à 72 kDa et de 90 à 100 kDa.
15) Exoantigènes de B. divergens choisis parmi les exoantigènes ayant un KaV compris entre 0 et 0,27.
16) Exoantigènes de B. divergens choisis parmi les exoantigènes ayant un KaV compris entre 0,27 et 0,57.
17) Exoantigènes de B. divergens choisis parmi les exoantigènes ayant un KaV compris entre 0,57 et 0,78.
18) Exoantigènes de B. divergens choisis parmi les exoantigènes ayant un KaV compris entre 0,78 et 0,95.
19) Exoantigènes de B. divergens ayant un poids moléculaire de 17 000 +_ 2 000 qui est une protéine qui se trouve chez B. canis et B^ divergens, ayant un KaV compris entre 0,57 et 0,95.
20) Exoantigènes de B. divergens, caractérisés en ce qu'il s'agit d'une glycoprotéine palmitoylée de poids moléculaires 35 000 +_ 2 000 Da qui ne croise pas avec B. canis et qui a un KaV de 0,57 à 0,95.
21) Exoantigènes de B. divergens, caractérisés en ce qu'il s'agit d'une protéine ayant un poids moléculaire de 50 000 _+ 3 000 Da et un KaV compris entre 0,57 et 0,95.
22) Anticorps monoclonaux dirigés contre les exoantigènes selon l'une des revendications 12 à 21.
23) Vaccin caractérisé en ce qu'il comporte au moins un exoantigène selon l'une des revendications 12 à 21.
24) Immunsérum dirigé contre les exoantigènes selon l'une des revendications 12 à 21.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8916890 | 1989-12-20 | ||
| FR898916890A FR2655853B1 (fr) | 1989-12-20 | 1989-12-20 | Procede de culture intensive, in vitro, de souches de babesia divergens, procede de preparation d'exoantigenes et vaccin contenant ces antigenes. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP0460177A1 true EP0460177A1 (fr) | 1991-12-11 |
Family
ID=9388758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP91901827A Withdrawn EP0460177A1 (fr) | 1989-12-20 | 1990-12-20 | Procede de culture intensive, in vitro, de souches de babesia divergens, procede de preparation d'exoantigenes et vaccin contenant ces antigenes |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5290688A (fr) |
| EP (1) | EP0460177A1 (fr) |
| AU (1) | AU641723B2 (fr) |
| FR (1) | FR2655853B1 (fr) |
| IE (1) | IE904638A1 (fr) |
| PT (1) | PT96273A (fr) |
| WO (1) | WO1991008771A2 (fr) |
| ZA (1) | ZA9010116B (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2724392B1 (fr) * | 1994-09-08 | 1996-12-13 | Virbac Lab | Procedes de culture, d'attenuation de la virulence et de clonage in vitro de parasites du genre babesia et leurs applications |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4055466A (en) * | 1973-07-09 | 1977-10-25 | Johnson & Johnson | Culture medium for tissue culture techniques |
| US4596707A (en) * | 1979-04-30 | 1986-06-24 | University Of Illinois Foundation | Babesia parasite antigen useful in vaccine and diagnostic reagent |
| GB2062463B (en) * | 1979-11-06 | 1983-11-23 | Commw Scient Ind Res Org | Babesiosis vaccine |
| US4767622A (en) * | 1983-08-19 | 1988-08-30 | University Of Illinois | Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection |
| FR2589063B1 (fr) * | 1985-10-24 | 1988-08-26 | Rhone Merieux | Procede de culture de babesia canis, application a la preparation d'antigenes et de vaccins, et antigenes et vaccins contre la piroplasmose |
| GB8630851D0 (en) * | 1986-12-24 | 1987-02-04 | Department Of Agriculture For | Babesia divergens antigen & vaccine |
| ZA902546B (en) * | 1989-04-04 | 1991-04-24 | Univ Florida | Novel proteins and cloned genes for diagnosis and prophylaxis of babesiosis |
-
1989
- 1989-12-20 FR FR898916890A patent/FR2655853B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-12-17 ZA ZA9010116A patent/ZA9010116B/xx unknown
- 1990-12-19 PT PT96273A patent/PT96273A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-12-20 US US07/752,625 patent/US5290688A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-20 EP EP91901827A patent/EP0460177A1/fr not_active Withdrawn
- 1990-12-20 IE IE463890A patent/IE904638A1/en unknown
- 1990-12-20 WO PCT/FR1990/000934 patent/WO1991008771A2/fr not_active Application Discontinuation
- 1990-12-20 AU AU70547/91A patent/AU641723B2/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See references of WO9108771A2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU7054791A (en) | 1991-07-18 |
| US5290688A (en) | 1994-03-01 |
| IE904638A1 (en) | 1991-07-17 |
| PT96273A (pt) | 1991-09-30 |
| WO1991008771A3 (fr) | 1991-08-08 |
| FR2655853B1 (fr) | 1994-06-10 |
| ZA9010116B (en) | 1991-09-25 |
| FR2655853A1 (fr) | 1991-06-21 |
| WO1991008771A2 (fr) | 1991-06-27 |
| AU641723B2 (en) | 1993-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Restrepo-Moreno et al. | Nature of the skin-reactive principle in culture filtrates prepared from Paracoccidioides brasiliensis | |
| Gamble | Trichinella spiralis: immunization of mice using monoclonal antibody affinity-isolated antigens | |
| EP0197062B1 (fr) | Anticorps monoclonaux anti-leishmania, hybridomes secreteurs de ces anticorps, antigenes de leishmania reconnus par ces anticorps, procede d'obtention et applications de ces anticorps monoclonaux et de ces antigenes | |
| FR2682041A1 (fr) | Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis. | |
| EP0112784A1 (fr) | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogènes les contenant | |
| EP0301961B1 (fr) | Antigènes d'excrétion-sécrétion spécifiques de toxoplasma gondii, leurs produits d'expression, leurs procédés d'obtention et leurs applications diagnostiques et prophylactiques | |
| JP2759652B2 (ja) | 蛋白質、蛋白質の抽出方法、ワクチンおよび反芻動物を免疫する方法 | |
| EP1621547B1 (fr) | Conjugués d' un polypeptide de stade pre-erythrocytaire du paludisme et d'un résidu lipidique | |
| EP0268501B1 (fr) | Protéines à activité glutathion-S-transférase, séquences d'ADN, anticorps, poxvirus et médicaments pour la prévention de la schistosomose | |
| WO1991008771A2 (fr) | Procede de culture intensive, in vitro, de souches de babesia divergens, procede de preparation d'exoantigenes et vaccin contenant ces antigenes | |
| WO1994026899A1 (fr) | Procede de culture in vitro de differents stades de parasites tissulaires | |
| EP0082072A1 (fr) | Procédé de production d'un vaccin biochimique contre les fièvres à salmonelles | |
| FR2571968A1 (fr) | Virus purifie des lymphadenopathies et du syndrome d'immuno-depression acquise et antigenes d'enveloppe de ce virus, procede d'obtention de ce virus et de ces antigenes d'enveloppe de ce virus, applications de ce virus ou de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic des susdites affections. | |
| EP1320552B1 (fr) | Procede de production d'immunoglobulines anti-thymocytes humains | |
| CA1245216A (fr) | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogenes les contenant | |
| FR2598147A1 (fr) | Immunogene isole de mollusques, son procede de preparation, reactifs de diagnostic des bilharzioses humaines, vaccins contre les schistosomiases et compositions immunisantes comprenant ledit immunogene. | |
| FR2724392A1 (fr) | Procedes de culture, d'attenuation de la virulence et de clonage in vitro de parasites du genre babesia et leurs applications | |
| Van Than et al. | Immunological studies on Ascaris suum infections in mice | |
| FR2570947A1 (fr) | Anticorps monoclonaux anti-leishmania, hybridomes secreteurs de ces anticorps, antigenes de leishmania reconnus par ces anticorps, procede d'obtention et applications de ces anticorps monoclonaux et de ces antigenes | |
| FR2556971A2 (fr) | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogenes les contenant | |
| EP0149395B1 (fr) | Procédé de préparation de l'antigène tuberculinique-L | |
| CH623231A5 (en) | Process for preparing an antischistosomal immunologial agent and product obtained | |
| El Kammah et al. | Studies on the Immune Defence of Chickens against Argas persicus (Oken) 1818 and Cattle against Boophilus annulatus Say, 1821 (Acari: Ixodoidea) | |
| Muhammed | The effect of leucocytes from cattle immunized against East Coast fever on the migration of bovine lymphoblasts infected with Theileria parva | |
| El-Adhami | Studies on surface membrane proteins of Schistosoma mansoni |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 19911007 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): BE CH DE DK ES FR GB IT LI NL SE |
|
| 17Q | First examination report despatched |
Effective date: 19940201 |
|
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 19940812 |