EP1290018A2 - Bibliotheques peptidiques combinatoires convergentes et leur applicaton a la vaccination contre le virus de l'hepatite c - Google Patents

Bibliotheques peptidiques combinatoires convergentes et leur applicaton a la vaccination contre le virus de l'hepatite c

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Publication number
EP1290018A2
EP1290018A2 EP01938317A EP01938317A EP1290018A2 EP 1290018 A2 EP1290018 A2 EP 1290018A2 EP 01938317 A EP01938317 A EP 01938317A EP 01938317 A EP01938317 A EP 01938317A EP 1290018 A2 EP1290018 A2 EP 1290018A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequences
anchoring
virus
peptides
amino acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01938317A
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German (de)
English (en)
Inventor
Georges Bertrand
Hélène Gras-Masse
Ahmed Bouzidi
Claude Auriault
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
SEDAC-Therapeutics
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
SEDAC-Therapeutics
Institut Pasteur
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, SEDAC-Therapeutics, Institut Pasteur filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1290018A2 publication Critical patent/EP1290018A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to the design and synthesis of mixtures of immunogenic peptides corresponding to restricted regions of virus proteins and in particular of the Hepatitis C virus (HCV) and their use for the preparation of vaccine preparations against said viruses.
  • HCV Hepatitis C virus
  • the hepatitis C virus was identified in 1989 (CHOO Q.L. et al., Science, 1989, 244, 359 - 361). It is the main etiological agent of chronic hepatitis non-A, non-B, with parenteral transmission.
  • HCV infection progresses to a chronic pathology in 60 to 80 percent of cases.
  • the prevalence of these infections is high in the general population, around 1 to 2 percent in industrialized countries, especially in Western Europe (ALTER HJ et al., Blood, 1995, 85, 1681- 1695).
  • HCV is part of the viruses of the family of Flaviviridae having an AR genome encoding a single polyprotein which is cleaved into several subfragments: a capsid protein, two glycoproteins El and E2 and 6 so-called non-structural proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B.
  • These viral proteins represent antigenic targets for the immune response: the envelope proteins E1 and E2 constitute targets for neutralizing antibodies and the non-structural proteins are capable of inducing an effector response cytotoxic .
  • mutations occur in. within the HCV genome with a high frequency and generate numerous quasi-species facilitating the escape of the virus in the face of the host's antiviral defenses (WEINER A. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 92 , 2755).
  • TEL type response seems to support this immunity, probably by controlling the cytotoxic response mediated by CD8 cells or by directly secreting various antiviral factors. This response must nevertheless be maintained to allow longer-term control of the virus (GERLACH J.T. et al., Gastroenterology, 1999, 117: 933).
  • Synthetic peptides derived from the capsid proteins and from the NS3 and NS4 proteins have shown their capacity to induce a T helper type response (DIEPOLDER, J. Virol., 1997, 71: 6011).
  • DIEPOLDER J. Virol., 1997, 71: 6011
  • the induction and maintenance of the CD4 response by the use of peptide epitopes derived from these proteins of interest represent a promising strategy for the induction of protective immunity against HCV.
  • peptides are generally weakly immunogenic and above all are rarely capable of inducing an immune response independently of the restriction linked to the polymorphic molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • a combinatorial library of peptides is created in which coexist, at each of the chosen positions (which will be defined below), the native amino acid and the replacement amino acid chosen to create degeneration of the selected peptide.
  • the present invention therefore relates to the process for the preparation of said mixtures of immunogenic peptides.
  • the first step of the process concerns the strategy for selecting sequences potentially capable of inducing the activation of CD4 cells. Selection involves regions of the capsid protein and the NS3 and NS4 proteins of HCV; these regions are chosen for their high density in anchoring patterns for human MHC class II molecules.
  • MHC class II molecules The role of MHC class II molecules is to present degraded antigens in the form of peptides to CD4 T cells.
  • the presentation of these degraded antigens or T epitopes to T lymphocytes by MHC class II molecules is a necessary condition for the induction of an immune response.
  • the MHC molecules are polymorphic proteins, encoded by numerous alleles, each of which has specific interaction characteristics with T epitopes.
  • the crystallographic studies of several human MHC class II molecules have in particular made it possible to demonstrate the modalities of specific interaction with T epitopes Several criteria are important: on the one hand, the length of the peptides must be greater than 11 residues to allow effective interaction; on the other hand, certain residues of the antigenic peptide play a specific role in the interaction by interacting with microenvironments or pockets for anchoring the MHC molecule.
  • These anchor pockets are independent of each other and have specific physico-chemical characteristics which allow the specific anchoring of side chains of the peptide.
  • the polymorphic residues of the MHC molecules are mainly grouped at the level of the anchoring pockets and therefore influence the particular interaction characteristics of the peptide antigens.
  • the amino acid occupying the position Pi is necessarily hydr ⁇ phobic and is an aliphatic or aromatic amino acid, ie V, I, L, F, M, W or Y; the amino acids occupying positions P4, P6 and P9 are preferably I, V, L, M, F or A, respectively; A, P, G, S or T; and A, I, V, Y, L, F or M.
  • the portions of protein sequences which exhibit a high density of these anchoring motifs have been identified and selected.
  • the peptide sequences selected have a length of between 19 and 36 residues. They include at least 1 to 2 residues upstream of the first anchoring pattern and downstream of the last anchoring pattern. These ends can be extended from 1 to 6 additional natural amino acids in order to include charged amino acids in the sequence, which can facilitate the solubility of sequences too rich in hydrophobic residues.
  • TD sequences # 1 to 8 are regions of the capsid protein
  • TD sequences # 9 to 21 are regions of the NS3 protein
  • TD sequences # 22 to 26 are regions of the NS4 protein.
  • the second step of the method according to the invention consists in designing, from these sequences, convergent combinatorial peptide libraries (called convertopes).
  • the choice of amino acid substitutions intended to create the cobatory library is based on the molecular characteristics of recognition of antigens by iiraminitary receptors, in particular by molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) and by T lymphocyte receptors. , and, more particularly, on the notion of degeneration of these recognition mechanisms by the immune system (see in particular Hemmer et al. Immunol. Today 1998, 19, 163-168 "Probing degeneracy in T-cell recognition using peptide coiribinatorial libraries” ).
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • the degeneration sought is an unnatural degeneration which is distinguished from the so-called natural degeneration which is developed on the basis of existing mutations, present in the antigen sequences of different natural variants of viruses (GRAS-MASS H ., Pept. Res., 1992, 5: 211-216).
  • This concept of unnatural degeneration for the development of convergent peptide mixtures was initially proposed by GRAS-MASSE H. (GRAS-MASSE H., Curr. Cpin. In Immunol., 1999, 11: 223-228).
  • the purpose of using said mixtures is in particular to stimulate a broader immune response, which will allow subsequent recognition of related peptides but different from the native peptide and which could be found in natural variants of the virus.
  • a first type of degeneration is created with the aim of increasing the anchoring capacity of the epitopes to the MHC molecules.
  • a second type of degeneration can be created in order to increase the recognition of epitopes by T cell receptors; it concerns only the positions which do not intervene in the anchoring to the molecules of the MHC, that is to say the residues other than 1, 4, 6 and 9.
  • the substitutions envisaged here are based on a replaceability matrix developed by Geysen (J. Mol. Recog. 1988, 1,32) which takes account of the irrational degeneration of the recognition of antigens by T receptors. All positions can give rise to a substitution, with the exclusion of common residues to 2 or more neighboring anchoring patterns and the substitution of which would be incompatible with the neighboring pattern or with a substitution already carried out in it.
  • each convertope comprises the peptide of native sequence and all the peptides whose sequence is totally or partially substituted, at the positions indicated.
  • All the peptides constituting a convertope are obtained in a single synthesis during which, for each cycle corresponding to a position which can be substituted, a mixture of the native amino acid and of the substitute amino acid is used, of which the concentrations are adjusted to produce an equimolar ratio in the synthesized peptide.
  • the process according to the invention has been developed for the Hepatitis C virus and more particularly for the capsid protein and the NS3 and NS4 proteins of this virus.
  • this method comprises:
  • convertopes libraries of convergent combinatorial peptides (called convertopes), derived from the sequences of epitopes identified in a), by directed substitution of amino acids at selected positions, to induce degeneration unnatural of each of the epitopes
  • the search for anchoring patterns is carried out by application of the following criteria which are common to the majority of MHC class II alleles: - in a pattern of 9 adjacent amino acids, the amino acid occupying the PI position is necessarily hydrophobic and is an aliphatic or aromatic amino acid, either V, I, L, F, M, W or Y; the amino acids occupying positions P4, P6 and P9 are preferably, respectively, I, V, L, M, F or A; A, P, G, S or T; and A, I, V, Y, L, F or M.
  • the design of the convertopes includes the substitution, in each anchoring motif identified, of one or more of the residues P4, P6 or P9 if they do not meet the common criteria as defined above, by a more conforming amino acid, and preferably by an alanine.
  • the design of the convertopes may, in addition, include the substitution of one or more residues other than 1, 4, 6 or 9, according to a replaceability matrix promoting the recognition of the epitope by the T cell receptor, to the exclusion of residues common to 2 or more neighboring anchoring patterns and the substitution of which would be incompatible with the neighboring motif or with a substitution already carried out in it.
  • the mixtures of immunogenic peptides obtained by the process according to the invention are mainly intended for vaccination against the viruses from which these peptides are derived. More particularly, the present invention relates to a composition intended for vaccination against the hepatitis C virus. This composition comprises pairs of native sequences and degenerate sequences obtained by the process of the invention and chosen from the convertopes presented in the table I.
  • the vaccine composition can find not only prophylactic but also therapeutic applications to stimulate the immune reactions of already infected patients.
  • the sequences of these proteins are available on the SWISS-PROT database.
  • the process of identifying potential T epitopes and of designing, from these, convergent peptide libraries or "convertopes” comprises the following steps: - First step.
  • Potential anchoring reasons are identified based on the rules common to the majority of alleles of human MHC class II molecules HLA-DR, that is to say an aliphatic or aromatic amino acid (V, I, L, F, M,, Y ) in the first position of a portion of 9 residues, capable of interacting with the PI pocket.
  • this Pi pocket is not very polymorphic (presence of a simple val / gly dimorphism in position 86 of the ⁇ chain) and represents a recognition rule shared by all the alleles.
  • the presence of a hydrophobic, aliphatic or aromatic residue in the Pi position seems to be an essential condition for interaction with the corresponding anchoring pocket, this anchoring playing a dominant role in the interaction of the antigenic peptide with the molecule.
  • CMH by allowing in particular the formation of a stable complex.
  • sequences of the capsid proteins and NS3 and NS4 which exhibit a high density of these anchoring motifs have been identified and selected. They include 1 or 2 amino acids upstream of the first anchoring pattern and downstream of the last. These ends can be extended from 1 to 6 additional natural amino acids in order to include, in the sequence, charged amino acids which can facilitate the solubility of sequences too rich in hydrophobic residues.
  • 26 sequences were thus chosen: in the capsid protein, sequences ID No. 1 to 8; in the NS3 protein, sequences ID No. 9 to 21; in the protein NS4, the sequences ID No. 22, to 26.
  • positions P2, P3 , P5, P7 and P8 For amino acids not involved in potential anchoring to MHC class II molecules and likely to be involved in the interaction with the specific T cell receptor, i.e. positions P2, P3 , P5, P7 and P8, a substitution of these positions can be made, dedicated to specific recognition by T cells. These substitutions are intended to generate variants related to native peptides capable of generating an enlargement of the number of specific T cells native antigen. This enlargement is envisaged in view of the significant degeneration of the T recognition (Hemmer, B., Immunol. Today 1998 19: 163). Indeed, a clonal T cell has the capacity to recognize a very large number of related peptide antigens but also not related to the native sequence with, in certain cases, better affinity.
  • the substitutions made are based on a replaceable matrix of the Geysen type (Geysen M. et al, J. Mol. Recog 1998. 1, 32-41). This replaceability matrix was developed on the basis of peptide / antibody recognition, which is related to the recognition mode of the T cell receptor. The amino acids in position P2, P3, P5, P7 and P8 can be substituted except if they are involved in an anchoring position at a neighboring motif. Given the various possibilities of replacement suggested by the Geysen matrix, the substitutions will favor the amino acid having one of the best replaceability indexes.
  • amino acids involved in the potential interaction with an anchor pocket are represented by n O.
  • the CMH anchor points Pi, P4, P6 and P9 are associated within an anchor pattern according to a diagonal representation mode.
  • the natural amino acid substitutions, according to the rational method developed in the description, are indicated in subscript.
  • TCR T cell receptor
  • the peptides are synthesized using the conventional solid phase strategy of the Boc-benzyl (or Fmoc) type, in an automated peptide synthesizer (model 430A, APPLIED BIOSYSTEM, INC.).
  • the side chain protection groups are: Asn (Trt), Gln (Trt), Asp (Ochx), Glu (Ochx), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Cys (4-MeBzl), and His (Dnp) (SHEPPARD RC et al., Peptide Synthesis Corp. Org. Che., 1979, 5: 321).
  • the amino acids are introduced using the HBTU / HOBt activation protocol with a systematic double coupling on a Boc-X-Pam resin (X representing the amino acid in the C-terminal position).
  • X representing the amino acid in the C-terminal position.
  • the cleaved and deprotected peptide is precipitated with cold diethyl ether, then dissolved in 5% acetic acid and lyophilized.
  • the peptide is purified to more than 90% on a column of 5 xrm x 250 rrm, 100a Nucleosyl C18 RP-HPLC preparative (MACHERY NAGEL, Duren, Germany).
  • the synthesis is carried out according to the method described above unlike degenerate positions where equimolar amounts of protected amino acids are used in coupling reactions in place of a single amino acid for conventional synthesis.
  • a first coupling is carried out with 1 mol (total amount) of Boc-a ino-acid (or of a mixture).
  • a second coupling using 2 ⁇ rmol (total quantity) is then systematically carried out.
  • the crude peptide is dissolved in trifluoroacetic acid and precipitated in a solution of cold diethyl ether. After centrifugation, the precipitate is dissolved in water and then purified by gel filtration on a TSK HW40S column (MERK, Darmstadt, Germany). An aliquot is subjected to acid hydrolysis to determine the amino acid composition.
  • the sequences of the native peptides and of the convertopes which are derived therefrom are presented in the sequence listing and in Table II. These products and various combinations thereof will be used as antigens for immunizations.
  • the evaluation of the immunogenicity of the peptides and convertopes is carried out according to two complementary approaches: on the one hand, by in vivo immunization of humanized mice; on the other hand, by in vitro immunization of human cells from typed HLA donors.
  • A) Mice deficient for murine MHC class II molecules (A ⁇ o) and transgenic for different human MHC class II molecules (DR1, DR2, DR3, DQ6, DQ8) are immunized with the mixtures of peptides chosen in proportion to three mice per condition.
  • mice are immunized with 100 micrograrr ⁇ ie ⁇ of peptides in a volume of 100 microliters of a water / complete Freund's adjuvant mixture by subcutaneous route.
  • the mice are restimulated once or twice, 15 days apart, with 50 micrograms of peptides in 100 microliters of Freund's incomplete water / adjuvant mixture.
  • a sample of sera from immunized mice is recovered before each injection in order to evaluate the production of specific antibodies as well as the production of cytokines in vivo.
  • the lymph nodes as well as the spleens of the different groups of animals are collected, mixed by group, then cultured to study the capacity to induce cell proliferation in vitro and the capacity to induce the production of cytokines.
  • B) In vitro communications are carried out as follows: CD14 + blood monocytes isolated by positive selection are differentiated into dendritic cells after placing in the presence of IL4 and "" of GM-CSF for 5 days. CD4 + cells isolated from the same donor are then immunized in vitro with the various mixtures of peptides and convertopes. Subsequent restimulation is carried out under the same conditions and then B lymphocytes from the same donor are used as antigen presenting cells. The production of different cytokines is sought in culture supernatants, 24 and 48 hours after in vitro immunization.

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Abstract

L'invention concerne la conception et la synthèse de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T et à des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes dérivées desdites régions. L'invention s'applique notamment au virus de l'hépatite C et à l'élaboration de préparations vaccinales contre celui-ci.

Description

Bibliothèques peptidiques combinatoires convergentes et leur application à la vaccination contre le virus de l'hépatite C.
L ' invention concerne la conception et la synthèse de mélanges de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus et notamment du virus de l'Hépatite C (VHC) et leur utilisation pour 1 ' élaboration de préparations vaccinales contre lesdits virus .
Le virus de l'hépatite C a été identifié en 1989 (CHOO Q.L. et al., Science, 1989, 244, 359 - 361). Il est l'agent étiologique principal des hépatites chroniques non-A, non-B, à transmission parentérale.
L'infection par le VHC évolue vers une pathologie chronique dans 60 à 80 pour cent des cas. La prévalence de ces infections est élevée dans la population générale, de l'ordre de 1 à 2 pour cent dans les pays industrialisés, en particulier en Europe de l'ouest (ALTER H.J. et al., Blood, 1995, 85, 1681-1695) .
A l'heure actuelle, les traitements antiviraux (interféron, Ribavirine®) ne permettent la guérison que de 20 % des patients et surtout aucun vaccin contre le VHC ne protège réellement contre la maladie.
Le VHC fait partie des virus de la famille des Flaviviridae ayant un génome à AR codant une polyprotéine unique qui est clivée en plusieurs sous-fragments : une protéine de capside, deux glycoprotéines El et E2 et 6 protéines dites non-structurales NS2 , NS3 , NS4A, NS4B, NS5A, NS5B. Ces protéines virales représentent des cibles antigéniques pour la réponse immunitaire : les protéines d'enveloppe El et E2 constituent des cibles pour les anticorps neutralisants et les protéines non-structurales sont capables d'induire une réponse effectrice cytotoxique . Toutefois , des mutations surviennent au. sein du génome du VHC avec une fréquence élevée et génèrent de nombreuses quasi-espèces facilitant l ' échappement du virus face aux défenses antivirales de l ' hôte (WEINER A. J . , Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 1992 , 92 , 2755 ) .
Les mécanismes immunitaires responsables de l'élimination du VHC ne sont pas encore clairement établis. L'observation des groupes de patients, environ 20 %, capables d'éliminer le virus spontanément après une phase d'infection aiguë a permis de mettre en évidence une forte corrélation entre une évolution vers la guérison et une forte prolifération des lymphocytes CD4 spécifiques d'antigènes viraux, notamment de la protéine de capside et des protéines NS3 et NS4
(DIEPOLDER H.M, . Lancet, 1995, 346:1006) . Une réponse de type TEL semble être le support de cette immunité, probablement en contrôlant la réponse cytotoxique médiée par les cellules CD8 ou en sécrétant directement différents facteurs antiviraux. Cette réponse doit néanmoins se maintenir pour permettre un contrôle à plus long terme du virus (GERLACH J.T. ét al. , Gastroenterology, 1999, 117:933) .
Des peptides synthétiques issus des protéines de capside et des protéines NS3 et NS4 ont montré leur capacité à induire une réponse de type T helper (DIEPOLDER, J. Virol. , 1997, 71: 6011) . L' induction et le maintien de la réponse CD4 par l 'utilisation d'épi topes peptidiques issus de ces protéines d' intérêt représentent une stratégie prometteuse pour l 'induction d'une immunité protectrice contre le VHC. Toutefois, les peptides sont généralement faiblement immunogènes et surtout sont rarement capables d' induire une réponse immunitaire de manière indépendante de la restriction liée aux molécules polymorphes du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) . C'est pourquoi les Demanderesses se sont fixé pour but de sélectionner des peptides d'intérêt, présentant des propriétés d'épi topes T, semblables à ceux qui ont déjà été décrits, et d'en augmenter le pouvoir immunogène par modification de leur séquence native, à des positions définies, dans le double but d'augmenter leur ancrage aux molécules du CMH et d'élargir leur reconnaissance par les récepteurs des cellules T.
Ainsi, pour chaque peptide d'intérêt, on crée une bibliothèque combinatoire de peptides dans laquelle coexistent, à chacune des positions choisies (qui seront définies plus loin) , l'acide aminé natif et l'acide aminé de remplacement choisi pour créer une dégénérescence artificielle du peptide sélectionné.
Les mélanges de peptides ainsi créés possèdent la même spécificité antigéniqe que le peptide natif. Ces mélanges de peptides sont donc considérés comme "convergents" et seront appelés, ci-après, "convertopes" .
La présente invention concerne donc le procédé de préparation desdits mélanges de peptides immunogènes.
La première étape du procédé concerne la stratégie de sélection des séquences potentiellement capables d'induire l'activation de cellules CD4. La sélection porte sur des régions de la protéine de capside et des protéines NS3 et NS4 du VHC ; ces régions sont choisies pour leur densité importante en motifs d'ancrage pour les molécules du CMH de classe II humaines.
Les molécules du CMH de classe II ont pour rôle de présenter les antigènes dégradés sous forme de peptides aux cellules T CD4. La présentation de ces antigènes dégradés ou épitopes T aux lymphocytes T par les molécules du CMH de classe II est une condition nécessaire à l'induction d'une réponse immune.
Les molécules du CMH sont des protéines polymorphiques, codées par de nombreux allèles dont chacun possède des caractéristiques spécifiques d'interaction avec les épitopes T. Les études cristallographiques de plusieurs molécules du CMH de classe II humaines ont notamment permis la mise en évidence des modalités d'interaction spécifique avec les épitopes T. Plusieurs critères sont importants : d'une part, la longueur des peptides doit être supérieure à 11 résidus pour permettre une interaction efficace ; d'autre part, certains résidus du peptide antigénique jouent un rôle spécifique dans l'interaction en interagissant avec des micro-environnements ou poches d'ancrage de la molécule du CMH. Il existe quatre poches d'ancrage qui jouent un rôle dominant dans la reconnaissance, appelées PI, P4, P6, P9, et ce quel que soit l'allèle de CMH. Ces poches d'ancrage sont indépendantes les unes des autres et possèdent des caractéristiques physico-chimiques particulières qui permettent l'ancrage spécifique de chaînes latérales du peptide.
Les résidus polymorphiques des molécules du CMH sont principalement regroupés au niveau des poches d'ancrage et influencent donc les caractéristiques particulières d'interaction des antigènes peptidiques.
Les caractéristiques des poches d'ancrage de ces allèles majeurs ont été identifiées par STURNIOLO (STURIOLO T. , Nature Biotech., 1999, 17:555).
Les Demanderesses en ont déduit des critères communs à la majorité des allèles de CMH de classe II qui sont applicables à la recherche prédictive des poches d'ancrage, au sein de séquences protéiques natives.
Ainsi, dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position Pi est nécessairement hydrσphobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F, M, W ou Y ; les acides aminés occupant les positions P4, P6 et P9 sont, de préférence, respectivement I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; et A, I, V, Y, L, F ou M.
Ces critères ont été appliqués, de manière prédictive non expérimentale, à l'identification des séquences d'intérêt au sein des protéines de capside et NS3 et NS4 dont les séquences sont disponibles dans la banque de données SWISS PROT (dont la référence est annexée au listage des séquences) .
Plusieurs motifs d'ancrage potentiels ont été identifiés, qui ne diffèrent que par 1 ou 2 acides aminés des critères définis plus haut.
Les portions de séquences protéiques qui présentent une densité importante de ces motifs d'ancrage ont été identifiées et sélectionnées. Les séquences peptidiques retenues ont une longueur comprise entre 19 et 36 résidus. Elles comprennent au moins 1 à 2 résidus en amont du premier motif d'ancrage et en aval du dernier motif d'ancrage. Ces extrémités peuvent être étendues de 1 à 6 acides aminés naturels additionnels afin d'inclure dans la séquence des acides aminés chargés, pouvant faciliter la solubilité de séquences trop riches en résidus hydrophobes.
Au total, un ensemble de 26 séquences ont été ainsi choisies. Elles sont présentées en annexe dans la rubrique "listage des séquences" . Les séquences TD n° 1 à 8 sont des régions de la protéine de capside, les séquences TD n° 9 à 21 sont des régions de la protéine NS3 et les séquences TD n° 22 à 26 sont des régions de la protéine NS4.
Les séquences d'intérêt étant identifiées, la deuxième étape du procédé selon l'invention consiste à concevoir, à partir de ces séquences, des bibliothèques peptidiques combinatoires convergentes (dénommées convertopes) .
Le choix des substitutions d'acides aminés destinées à créer la bibliothèque cobinatoire est basé sur les caractéristiques moléculaires de reconnaissance des antigènes par les récepteurs iiraminitaires, en particulier par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) et par les récepteurs des lymphocytes T, et, plus particulièrement, sur la notion de dégénérescence de ces mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire (voir notamment Hemmer et al. Immunol. Today 1998, 19, 163-168 "Probing degeneracy in T-cell récognition using peptide coiribinatorial libraries") .
La dégénérescence recherchée, selon la présente invention, est une dégénérescence non naturelle qui se distingue de la dégénérescence dite naturelle qui est élaborée sur la base des mutations existantes, présentes dans les séquences d'antigènes de différents variants naturels des virus (GRAS-MASSE H., Pept. Res., 1992, 5:211-216) . Ce concept de dégénérescence non naturelle pour le développement de mélanges de peptides convergents a été initialement proposé par GRAS-MASSE H. (GRAS-MASSE H., Curr. Cpin. in Immunol., 1999, 11:223-228). L'utilisation desdits mélanges a notamment pour but de stimuler une réponse immunitaire plus large, qui permettra une reconnaissance ultérieure de peptides apparentés mais différents du peptide natif et qui pourraient se rencontrer dans des variants naturels du virus. Dans le procédé selon l'invention, un premier type de dégénérescence est créé dans le but d'augmenter la capacité d'ancrage des épitopes aux molécules du CMH.
Dans les motifs d'ancrage identifiés,on vérifie que les résidus P4, P6 et P9 de la séquence native répondent aux critères communs définis plus haut d'après l'étude de Sturniolo. Si l'acide aminé ne répond pas à ces critères, on envisage sa substitution par un acide aminé plus conforme, et notamment par une alanine.
Un second type de dégénérescence peut être créé dans le but d'augmenter la reconnaissance des épitopes par les récepteurs des cellules T ; il ne concerne que les positions qui n'interviennent pas dans l'ancrage aux molécules du CMH, c'est-à-dire les résidus autres que 1, 4, 6 et 9. Les substitutions envisagées ici sont basées sur une matrice de remplaçabilité élaborée par Geysen (J. Mol. Recog. 1988, 1,32) qui tient compte de la dégénérescence irrportante de la reconnaissance des antigènes par les récepteurs T. Toutes les positions peuvent donner lieu à une substitution, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci. Dans les 26 séquences (séquences H) n° 1 à 26, en annexe) sélectionnées comme épitopes T potentiels, les substitutions retenues conformément aux critères décrits plus haut aboutissent aux 26 convertopes présentés dans le tableau I ci-après et les séquences ID n°27 à 52 et dont la conception sera explicitée dans l'exemple 1 et les figures 1 à 26. Dans les séquences ID 27 à 52, les acides aminés de nature variable sont notés Xaa, par convention. Il convient de préciser que chaque convertope comprend le peptide de séquence native et tous les peptides dont la séquence est totalement ou partiellement substituée, aux positions indiquées. TABLEAU I
∞NVERTOPE
Q D V K F P G G G Q
20-48 V G G V Y L L P R R G P R L G V R A R A S A S A A A A A A A A A
G G Q i V G G V Y L ι_ P r R π R M G la P P R R
27-53 G V R
S A A Δ A Λ A Λ A « A » L G V R A T R K T S A ( A S R A
35-60
Y L L P R R G P R L G V R A T R K T S E R S Q P R G A A A K A A S A K A A A A
S8-86 A R R P E G R T W A Q P G Y P W P L Y
S N A S A A A
P L Y G N E G C G W A G W L L S P R G S R 34-104 S A A A S S A A A A S A A
R R S R N G K V i D T L T C G F A D L M G Y 114-136 ' A A A A A A E l
A G F A D L M G Y I P L V G A P L G G A A R 128-149 S E A A A A S
G V R V L E D G V N Y A T G N L P G A 154-172 K D A A A A A R A
R E I L L G P A D G M V S K G W R L L A P ! T A Y A Q Q 1008-1033 A A A A A A A . A A F A
D G M V S K G W R L L A P I T A Y A Q Q T R G L L G A 1016-1042 I A A A A A A A S A S I
V C W T V Y H G A G T R T I A S P K G P V I Q Y T N 1077-1103 s A A K A S A A R A l
R T I A S P K G P V ! Q M Y T N V D Q D L V G W 1088-1111 S A A A N A A A E
G S L L S P R P I S Y L K G S S G G P L L 1150-1170 A A A A R A A A S A
K A V D F i P V E N L E T T M R S P V F T D N S S P 1191-1216 E A A A D A A A A A A S E A TABLEAU I (suite) CONVERTOPE
M R S P V F T D N S S P P V V P Q S F Q V A H L H 1205-1229 S A A A A A A A A i A
A A Y A A Q G Y K V L V L N P S V A A T L G F G A Y M S K 1242-1268 S S A S R A A A A ! A ~
R T 1 T T G S P T Y S T Y G K F L A D G G
1282-1304 S S A A S A S A S A I
T S ! L G 1 G T V L D Q A E T A G A R L V V L A T A T P P G S 1324-1354 S A A A A S A A A A A
A K L V A L G i N A V. A Y Y R G L D V S V I P T S G D V 1405-1432 S A A S K A A A A A S A
V S V I P T S G V V V V A T D A L M T G Y T G D F D S 1423-1450 A A A A A A A S E
T G L T H l D A H F U S Q T K Q S G E N F P Y L V A Y Q A T V A A
1563-1595 S E A A A A A A A A A A I F A S
S Q H L P Y I E Q G M M L A E Q. F K Q K A L G L L T A 1712-1739 A D A A A A A A A A S I
E V I A P A V Q T N W Q K E T F W A K H M W N F ! 5 G ! Q Y L A G L 1744-1778 S A A S A A R A A A A V A A I A
* P A I A S L A F T A A V T S P L T T S Q T L L F N I L G G W V A A. 1785-1818 S A A A A A S A A A A
G G V A A Q L A A P G A A T A F V G A G L A G A A i G S 1813-1841 S A S A S S S A A S
T A F V G A G L A S A A I G S V G L G K V L I D I L A G Y G A G
1827-1862 B A . " * ' S ^AA * ss L A H l " " ' AA ° ' L A A A J A ° A S 2 V A » * La synthèse des peptides est effectuée en deux temps : d'une part la synthèse du peptide de séquence native, d'autre part la synthèse du convertope. Ces synthèses sont effectuées en synthétiseur automatique conventionnel .
L'ensemble des peptides constituant un convertope est obtenu en une seule synthèse au cours de laquelle, pour chaque cycle correspondant à une position pouvant être substituée, on utilise un mélange de l'acide aminé natif et de l'acide aminé de substitution, dont les concentrations sont ajustées pour réaliser un rapport équimolaire dans le peptide synthétisé.
Le procédé selon 1 ' invention a été développé pour le virus de l'Hépatite C et plus particulièrement pour la protéine de capside et les protéines NS3 et NS4 de ce virus .
Il est bien évident que le même procédé de préparation de peptides immunogènes comprenant des régions restreintes de protéines virales choisies et des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes est applicable à tout virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T.
Ainsi, de manière synthétique, ce procédé comprend :
-a) l'identification de séquences d'acides aminésconstituant des épitopes T potentiels, par recherche prédictive non expérimentale - de motifs d'ancrage pour les molécules de CMH de classe II, à partir des séquences natives des protéines du virus - et de zones, qui présentent une densité importante desdits motifs d'ancrage ;
-b) la conception de bibliothèques de peptides combinatoires convergentes (dénommées convertopes ) , dérivées des séquences d' épitopes identifiées en a), par substitution dirigée d'acides aminés à des positions choisies, pour induire une dégénérescence non naturelle de chacun des épitopes,
- d'une part, afin d'augmenter la capacité d'ancrage de 1 ' épitope aux molécules de CMH de classe II
- et d'autre part, afin d'élargir le répertoire de reconnaissance de 1 ' épitope par le récepteur des cellules T ; -c) la synthèse,
- d'une part, de peptides de séquence native choisis parmi les peptides tels qu'identifiés en a) - et d'autre part, des convertopes correspondants tels que définis en b) .
La recherche des motifs d'ancrage est effectuée par application des critères suivants qui sont communs à la majorité des allèles de CMH de classe II : - dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position PI est nécessairement hydrophobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F, M, W ou Y ; - les acides aminés occupant les positions P4, P6 et P9 , sont de préférence, respectivement, I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; et A, I, V, Y, L, F ou M.
La conception des convertopes comprend la substitution, dans chaque motif d'ancrage identifié, d'un ou plusieurs des résidus P4, P6 ou P9 s'ils ne répondent pas aux critères communs tels que définis plus haut, par un acide aminé plus conforme, et, de préférence par une alanine.
La conception des convertopes peut, en outre, comprendre la substitution d'un ou plusieurs résidus autres que 1, 4, 6 ou 9, selon une matrice de remplaçabilité favorisant la reconnaissance de l' épitope par le récepteur des cellules T, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci. Les mélanges de peptides immunogènes obtenus par le procédé selon l'invention sont principalement destinés à la vaccination contre les virus dont ces peptides dérivent . Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition destinée à la vaccination contre le virus de l'Hépatite C. Cette composition comprend des couples de séquences natives et de séquences dégénérées obtenus par le procédé de 1 ' invention et choisis parmi les convertopes présentés dans le tableau I.
La composition vaccinale peut trouver des applications non seulement prophylactiques mais également thérapeutiques pour stimuler les réactions immunitaires de patients déjà infectés.
Les exemples suivants illustrent 1 ' invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple 1 :
Conception des convertopes.
Les données bibliographiques ont conduit à retenir, comme protéines potentiellement intéressantes pour préparer des peptides immunogènes constituant des épitopes T potentiels, la protéine de capside et les protéines NS3 et- S4 du virus de l'hépatite C.
Les séquences de ces protéines sont disposibles sur la banque de données SWISS-PROT. Le procédé d'identification des épitopes T potentiels et de conception, à partir de ceux-ci, de bibliothèques peptidiques convergentes ou "convertopes" comprend les étapes suivantes : - Première étape . Des motifs d'ancrage potentiels sont identifiés sur la base des règles communes à la majorité des allèles des molécules de CMH de la classe II humaines HLA-DR, c ' est-à-dire un acide aminé aliphatique ou aromatique (V, I, L, F, M, , Y) en première position d'une portion de 9 résidus, capable d' interagir avec la poche PI. Concernant les allèles HLA-DR, cette poche Pi est peu polymorphe (présence d'un simple dimorphisme val/gly en position 86 de la chaîne β) et représente une règle de reconnaissance partagée par tous les allèles. De plus, la présence d'un résidu hydrophobe, aliphatique ou aromatique en position Pi semble une condition essentielle à l'interaction avec la poche d'ancrage correspondante, cet ancrage jouant un rôle dominant dans l'interaction du peptide antigénique avec la molécule de CMH en permettant notamment la formation d'un complexe stable.
L'identification des résidus acides aminés impliqués potentiellement dans 1 ' ancrage au niveau des poches d'ancrage P4, P6, P9 découle mathématiquement de la première position. Pour chaque position d'ancrage, un consensus a été défini, à partir de l'analyse des résultats de STURNIOLO T. (Nature Biotech. , 1999, 17:555), par recherche des acides aminés majeurs pouvant interagir avec le plus grand nombre d' allèles différents. Le tableau suivant représente les spécificités des quatre poches Pi, P4, P6 et P9 des molécules du CMH de classe II HLA-DR.
TABLEAU II
Les portions de séquences des protéines de capside et NS3 et NS4 qui présentent une densité importante de ces motifs d'ancrage ont été identifiées et sélectionnées. Elles comprennent 1 ou 2 acides aminés en amont du premier motif d'ancrage et en aval du dernier. Ces extrémités peuvent être étendues de 1 à 6 acides aminés naturels additionnels afin d'inclure, dans la séquence, des acides aminés chargés pouvant faciliter la solubilité de séquences trop riches en résidus hydrophobes . Au total, 26 séquences ont été ainsi choisies : dans la protéine de capside, les séquences ID n° 1 à 8 ; dans la protéine NS3 , les séquences ID n° 9 à 21 ; dans la protéine NS4, les séquences ID n° 22 , à 26.
- Deuxième étape .
Les motifs d'ancrage potentiels obtenus ont été comparés au motif d'ancrage consensus pour le CMH de classe II défini plus haut. Si l'acide aminé natif ne répond pas aux conditions énoncées dans le tableau II, une alanine est introduite systématiquement aux positions P4, P6, P9. En effet, une alanine est capable de remplacer les acides aminés intervenant dans 1 ' ancrage aux molécules de CMH de classe II (Fleckenstein B. et al, Eur. J. Bioch. 1996. 240:71, Sturniolo et al., Nature Biotech 1999, 17:555), en permettant de lever l'influence négative d'une chaîne latérale et d'améliorer ainsi l'association aux molécules de CMH sans altérer la reconnaissance par les cellules T (Ahlers et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94:10856). Toutefois, si l'acide aminé natif est impliqué dans une position d'ancrage Pi d'un motif d'ancrage voisin chevauchant, la substitution n'est pas envisagée. - Troisième étape -
Pour les acides aminés n'intervenant pas dans l'ancrage potentiel aux molécules du CMH de classe II et susceptibles d'être impliqués dans l'interaction avec le récepteur spécifique des cellules T, c'est-à-dire les positions P2, P3 , P5, P7 et P8, une substitution de ces positions peut être effectuée, dédiée à la reconnaissance spécifique par les cellules T. Ces substitutions ont pour but de générer des variants apparentés aux peptides natifs capables de générer un élargissement du nombre de cellules T spécifiques de l'antigène natif. Cet élargissement est envisagé compte-tenu de la dégénérescence importante de la reconnaissance T (Hemmer, B., Immunol. Today 1998 19:163). En effet, une cellule T clonale a la capacité de reconnaître un très grand nombre d'antigènes peptidiques apparentés mais également non apparentés à la séquence native avec, dans certains cas, une meilleure affinité.
Les substitutions réalisées sont basées sur une matrice de remplaçabilité de type Geysen (Geysen M. et al, J. Mol. Recog 1998. 1, 32-41). Cette matrice de remplaçabilité a été élaborée sur la base de la reconnaissance peptide/anticorps, qui est apparentée au mode de reconnaissance du récepteur des cellules T. Les acides aminés en position P2 , P3 , P5 , P7 et P8 peuvent être substitués sauf s'ils sont impliqués dans une position d'ancrage au niveau d'un motif voisin. Compte- tenu des diverses possibilités de remplacement suggérées par la matrice de Geysen, les substitutions privilégieront l'acide aminé ayant l'un des meilleurs index de remplaçabilité.
La conception des convertopes est schématisée dans les figures 1 à 26. Légende des figures 1 à 26
La séquence native d'intérêt est présentée sur la partie supérieure de la figure.
Les acides aminés impliqués dans 1 ' interaction potentielle avec une poche d'ancrage sont représentés par n O.
Les points d'ancrage CMH Pi, P4, P6 et P9 sont associés au sein d'un motif d'ancrage selon un mode de représentation en diagonale. Les substitutions d'acides aminés naturels, selon la méthode rationnelle développée dans la description, sont indiquées en indice.
Les acides aminés substitués pour améliorer la reconnaissance par le récepteur des cellules T (TCR) sont également présentés .
L'addition des deux approches de substitutions (CMH et TCR) est récapitulée sur la partie inférieure encadrée de la figure.
Exemple 2
A) Préparation des peptides .
Les peptides sont synthétisés en utilisant la stratégie en phase solide conventionnelle du type Boc-benzyle (ou Fmoc) , dans un synthétiseur automatisé de peptides (modèle 430A, APPLIED BIOSYSTEM, INC . ) . Les groupes de protection des chaînes latérales sont les suivants : Asn(Trt) , Gln(Trt) , Asp(Ochx) , Glu(Ochx) , Ser(Bzl) , Thr(Bzl) , Cys (4-MeBzl) , et His (Dnp) (SHEPPARD R.C. et al. , Peptide Synthesis Corp. Org. Che . , 1979, 5 :321) . Les acides aminés sont introduits en utilisant le protocole d'activation HBTU/HOBt avec un double couplage systématique sur une résine Boc-X-Pam (X représentant l 'acide aminé en position C-terminale) . Après thiolyse du groupe dinitrophényl Dnp, suivie par une déprotection finale et un clivage à l'acide fluorhydrique, le peptide clivé et déprotégé est précipité avec du diéthyléther froid, puis dissous dans de l'acide acétique 5 % et lyophilisé. Le peptide est purifié à plus de 90 % sur une colonne de 5 xrm x 250 rrm, 100a Nucleosyl C18 RP-HPLC préparative (MACHERY NAGEL, Duren, Allemagne) . L'homogénéité est confirmée par HPLC analytique sur une colonne Vydac éluée avec un système de solvants (acide trifluoroacétique-acétonitrile-eau) . L'identité du peptide est confirmée par la détermination de la composition en acides aminés, et par spectrométrie de masse enregistrée sur un spectromètre de masse Bio Ion 20 plasma (BIO ION AB, Uppsala, Suède) .
B) Préparation des convertopes .
La synthèse s'effectue selon la méthode décrite précédemment à la différence des positions dégénérées où des quantités équimolaires d'acides aminés protégés sont utilisées dans les réactions de couplage à la place d'un seul acide aminé pour une synthèse classique. Pour compenser les différences cinétiques dans les réactivités des différents acides aminés, un premier couplage est réalisé avec 1 mol (quantité totale) de Boc-a ino-acide (ou d'un mélange) . Un deuxième couplage utilisant 2 πrmol (quantité totale) est alors systématiquement réalisé. Après clivage, le peptide brut est dissous dans de l'acide trifluoroacétique et précipité dans une solution de diéthyléther froid. Après centrifugation, le précipité est dissous dans l'eau puis purifié par gel filtration sur une colonne TSK HW40S (MERK, Darmstadt, Allemagne) . Un aliquot est soumis à une hydrolyse acide pour la détermination de la composition en acides aminés.
Exemple 3 Évaluation de 1 ' immunogénicité des mélanges
Les séquences des peptides natifs et des convertopes qui en dérivent ont été présentées dans le listage des séquences et dans le Tableau II. Ces produits et diverses combinaisons de ceux-ci seront utilisés en tant qu'antigènes pour les immunisations. L'évaluation de l'immunogénicité des peptides et convertopes est réalisée selon deux approches complémentaires : d'une part, par immunisation in vivo de souris humanisées ; d'autre part, par iirmunisation in vitro de cellules humaines de donneurs HLA typés. A) Des souris déficientes pour les molécules du CMH de classe II murines (Aβo) et transgéniques pour différentes molécules du CMH de classe II humaines (DRl, DR2, DR3, DQ6, DQ8) sont imriunisées avec les mélanges de peptides choisis à raison de trois souris par condition. Les souris sont immunisées avec 100 micrograrrπieΞ de peptides dans un volume de 100 microlitres d'un mélange eau/adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Les souris sont restimulées une ou deux fois à 15 jours d'intervalle avec 50 microgrammes de peptides dans 100 microlitres de mélange eau/adjuvant incomplet de Freund. Un échantillon de sera des souris immunisées est récupéré avant chaque injection afin d'évaluer la production d'anticorps spécifiques ainsi que la production de cytokines in vivo. Une semaine après la dernière injection, les ganglions ainsi que les rates des différents groupes d'animaux sont recueillis, mélangés par groupe, puis mis en culture pour étudier la capacité à induire la prolifération cellulaire in vitro et la capacité à induire la production de cytokines de type THL ou TH2 in vitro, afin d'identifier les peptides et les convertopes ayant la meilleure iirmunogénicité. B) Les iirmunisations in vitro sont réalisées de la manière suivante : des monocytes sanguins CD14+ isolés par sélection positive sont différenciés en cellules dendritiqu.es après mise en présence d'IL4 et ""de GM-CSF pendant 5 jours. Les cellules CD4+ isolées à partir du même donneur sont ensuite iαmunisées in vitro par les différents mélanges de peptides et convertopes. Une restimulation ultérieure est réalisée dans les mêmes conditions puis les lymphocytes B du même donneur sont utilisés en tant que cellules présentatrices d'antigènes. La production de différentes cytokines est recherchée dans les surnageants de culture, 24 et 48 heures après immunisation in vitro.

Claims

REVENDICATIONS 1. - Procédé de préparation de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T et à des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes dérivées desdites régions, caractérisé en ce qu'il comprend :
-a) l'identification de séquences d'acides aminés constituant des épitopes T potentiels, par recherche prédictive non expérimentale - de motifs d'ancrage pour les molécules de CMH de classe II, à partir des séquences natives des protéines du virus - et de zones, qui présentent une densité importante desdits motifs d'ancrage ; -b) la conception de bibliothèques de peptides combinatoires convergentes (dénommées convertopes) , dérivées des séquences d' épitopes identifiées en a), par substitution dirigée d'acides aminés à des positions choisies, pour induire une dégénérescence non naturelle de chacun des épitopes,
- d'une part, afin d'augmenter la capacité d'ancrage de 1 ' épitope aux molécules de CMH de classe II
- et d'autre part, afin d'élargir le répertoire de reconnaissance de l' épitope par le récepteur des cellules T ;
-c) la synthèse,
- d'une part', de peptides de séquence native choisis parmi les peptides tels qu'identifiés en a)
- et d'autre part, des convertopes correspondants tels que définis en b) .
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la recherche des motifs d'ancrage est effectuée par application des critères suivants qui sont communs à la majorité des allèles de CMH de classe II : - dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position Pi est nécessairement hydrophobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F, M, W ou Y ; - les acides aminés occupant les positions P4, Pς et P9, sont de préférence, respectivement, I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; et A, I, V, Y, L, F ou M.
3.- Procédé selon la revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que la conception des convertopes comprend la substitution, dans chaque motif d'ancrage identifié, d'un ou plusieurs des résidus P4, Bç ou Pg s'ils ne répondent pas aux critères communs tels que définis dans la revendication 2, par un acide aminé plus conforme, et, de préférence par une alanine. 4.- Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, la substitution d'un ou plusieurs résidus autres que 1,
4, 6 ou 9, selon une matrice de remplaçabilité favorisant la reconnaissance de l' épitope par le récepteur des cellules T, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que chaque convertope est obtenu en une seule synthèse, au cours de laquelle pour chaque cycle correspondant à une position pouvant être substituée, on utilise un mélange de l'acide aminé natif et de l'acide aminé de substitution, ajusté pour réaliser un rapport équimolaire dans le peptide synthétisé.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les protéines du virus sont la protéine de capside et les protéines NS3 et NS4 du virus de l'Hépatite C (VHC) .
7.- Ensemble de séquences d' épitopes potentiels identifiés par le procédé selon la revendication la) comprenant les séquences ID n° 1 à 8 de la protéine de capside, les séquences ID n° 9 à 21 de la protéine NS3 et les séquence ID n° 22 à 26 de la protéine NS4 du VHC.
8. - Convertopes dérivés des séquences selon la revendication 7 par le procédé selon les revendications 2 et 3, tels que représentés sur les séquences ID n°27 à 52.
9.- Composition à base d'un mélange de peptides immunogènes destinée à la vaccination contre le virus de l'Hépatite C, caractérisée en ce qu'elle comprend des couples de séquences natives et de séquences dégénérées (convertopes) obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, choisis parmi les séquences selon la revendication 7 et les convertopes selon la revendication 8.
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