EP1246931A1 - Compositions comprenant des acides nucleiques incorpores dans des particules minerales bilamellaires - Google Patents

Compositions comprenant des acides nucleiques incorpores dans des particules minerales bilamellaires

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EP1246931A1
EP1246931A1 EP00993726A EP00993726A EP1246931A1 EP 1246931 A1 EP1246931 A1 EP 1246931A1 EP 00993726 A EP00993726 A EP 00993726A EP 00993726 A EP00993726 A EP 00993726A EP 1246931 A1 EP1246931 A1 EP 1246931A1
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EP
European Patent Office
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composition according
nucleic acid
formula
dna
composition
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00993726A
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German (de)
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Inventor
Bruno Pitard
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Publication date
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Publication of EP1246931A1 publication Critical patent/EP1246931A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1611—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to compositions comprising at least one nucleic acid and a mineral particle having a structure with exchangeable sheets, their preparation process and their applications for the in vivo, in vitro and / or ex vivo transfection of nucleic acids .
  • nucleic acids into cells that is to say of introducing them into cells so that the gene of interest which they carry is expressed there
  • It may be the transfer of nucleic acids into cells in vitro, for example for the production of recombinant proteins, or in the laboratory for the study of the regulation of gene expression, the cloning of genes or any other manipulation involving DNA. It may also involve the transfer of nucleic acids into cells in vivo, for example for the production of vaccines, labeling studies or also therapeutic approaches. It may also involve the transfer of genes ex vivo into cells taken from an organism, with a view to their subsequent re-administration, for example for the creation of transgenic animals.
  • compositions comprising a nucleic acid and a mineral particle having a structure with exchangeable sheets allow the transfer in vitro, ex vivo or in vivo of said nucleic acid into a cell and / or an organ with an efficiency greater than those obtained to date with conventional non-viral transfer techniques.
  • the compositions of the invention further allow avoid the drawbacks associated with the use of viral vectors or physical transfection techniques.
  • a first object of the present invention relates to the compositions comprising at least one nucleic acid and one mineral particle having a structure with exchangeable sheets.
  • the term “mineral particles having a structure with exchangeable sheets” means mineral particles whose structure is based on a stack of sheets of composition M (OH) 2 similar to those well known in brucite (Mg (OH) 2 ), M representing a divalent metal, but in which part of the divalent metals is replaced by trivalent metals so as to make the sheets generally cationic.
  • M brucite
  • M representing a divalent metal
  • the inter-sheet spaces include anionic entities solvated by water molecules.
  • Such a structure is shown in Figure 1 and is also called "double lamellar hydroxide”.
  • M u represents a divalent metal cation
  • M 111 represents a trivalent metal cation
  • X m ⁇ represents an interfoliar anion and m is an integer greater than or equal to 1
  • x is between 0 and 1 strictly
  • n is strictly greater at 0.
  • Such mineral particles have already been described for applications in many fields such as catalysis or the environment. Indeed, they form nanostructured materials where molecular or colloidal species are interposed in a lamellar host structure.
  • the properties of these structures can thus be used in heterogeneous or homogeneous catalysis on a support, in exchange and separation techniques, in particular optical isomers, for the design of membranes which may be selective for filtration and permeation, for trapping and controlled restitution of molecules, or for the design of electro-active materials and deposits, electrodes and electronic devices.
  • 121 (6), 1399-1400 describes the preparation of hybrid nanoparticles composed of sheets of a Double Lamellar Hydroxide (HDL), pristine ( Mg 2 Al (NO 3 ) -LDH), between which are inserted monophoshated nucleosides or DNA fragments of herring testes.
  • the nucleic molecules intercalated in the particles described in this article have a size less than 1000 base pairs. No use of these molecules is described.
  • the mineral particles having a structure with exchangeable sheets usable within the framework of the present invention are often named after the nature of the major metal cations of the sheets: for example hydrotalcite (Mg-Al), pyroaurite (Mg-Fe) , stichtite (Mg-Cr) or takovite (Ni-Al).
  • hydrotalcite Mg-Al
  • Mg-Fe pyroaurite
  • Mg-Cr stichtite
  • Ni-Al takovite
  • the general formula indicated above underpins the wide variety of mineral particles which it is possible to prepare by varying the nature of the two metal cations M 11 and M ⁇ , their respective proportions with possible extension to more than two types of cations (eg Mg, Zn and Al), the nature of the interfoliar anions, or the state of hydration.
  • the richness of the general formula indicated above is further increased by a structural diversity resulting from the existence of polytypes differing by the sequence of stacking of the sheets as well as from the appearance of over-structures due for example to a classification cationic in the hydroxylated sheet.
  • the divalent metal cations M ⁇ can be chosen for example from magnesium (Mg), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co), copper (Cu), calcium (Ca) or even zinc (Zn).
  • the divalent metal cation is magnesium.
  • Trivalent metal cations M ⁇ may be chosen for example from aluminum (Al), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co) or even gallium (Ga).
  • the trivalent metal cation is aluminum.
  • the two members of the couple M ⁇ and M can also correspond to the same element (for example Fe ⁇ / Fe ffl or Mn ⁇ / Mn ⁇ ).
  • the interfoliar anions X ′′ may for example be chosen from halides, oxoanions, iso- and heteroanions, complex anions or even organic anions. Examples include fluorides, chlorides, bromides, carbonates , nitrates, sulfates or tetrahedral oxoanions such as CrO 2 " .
  • the anion is chosen from carbonates
  • x is strictly between 0 and 1, that is, 0 and 1 are excluded values.
  • x is between 0.05 and 0.95, and preferably between 0.1 and 0.9. Even more preferably, x is between 0.2 and 0.85.
  • x can be equal to 0.25.
  • n this indicates the state of hydration of the particle in question and it is strictly greater than 0.
  • n is greater than or equal to 0.1.
  • n can be equal to 0.5.
  • m is an integer greater than or equal to 1 which represents the charge of the interfoliar anion.
  • m can be 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • Mineral particles having a structure with exchangeable sheets according to the present invention can be chosen for example from the hydrotalcite of formula Mg 6 Al 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 O, the manasseite of formula Mg 6 Al 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 O, the pyroaurite of formula Mg 6 Fe 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 ⁇ , the stichtite of formula Mg 6 Cr 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 O, the takovite of formula Ni 6 Al 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 0, the reevesite of formula Ni 6 Fe 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 ⁇ , or the comblainite of formula Ni 6 C ⁇ 2CO 3 (OH) 16 .4H 2 ⁇ .
  • Other mineral particles having a structure with exchangeable sheets may also be suitable.
  • the compositions according to the present invention comprise at least one nucleic acid and hydrotalcite
  • the mineral particles having a structure with exchangeable sheets according to the present invention are either commercial, or they can be prepared according to methods which are similar to known methods known as “soft chemistry”.
  • the preparation of the mineral particles according to the invention can be based on the controlled precipitation of aqueous solutions or suspensions containing both the metal cations intended to take place in the hydroxylated framework and the anions intended to occupy the interlamellar domains. Under these conditions, there is simultaneously construction of the interlamellar domains consisting of anions and water molecules, and of the sheet.
  • the nature and texture of the phases obtained are highly dependent on the operating conditions (temperature, rate of addition and concentration of the reagents, pH control), but also on the geometry of the reactor and the state of prior association of the metal cations. in reagents (existence of oligomers).
  • the preparation process ultimately always boils down to bringing together, at an appropriate concentration and reactivity, the species leading to the construction of the mineral particles under optimal conditions. These optimal conditions are determined on a case-by-case basis according to the conventional method of trial and error.
  • nucleic acid is understood to mean both a deoxyribonucleic acid and a ribonucleic acid.
  • They can be natural or artificial sequences, and in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA (cDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (RRNA), hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences, of modified or unmodified oligonucleotides.
  • These nucleic acids can be, for example, of human, animal, plant, bacterial or viral origin. They can be obtained by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or even by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries. They can be chemically modified.
  • deoxyribonucleic acids can be single or double stranded or else short oligonucleotides or longer sequences.
  • the nucleic acids advantageously consist for example of plasmids, vectors, episomes or expression cassettes.
  • deoxyribonucleic acids may in particular carry an origin of functional or non-functional replication in the target cell, one or more marker genes, transcription or replication regulatory sequences, genes of therapeutic interest, antisense sequences which may or may not be modified or even regions of binding to other cellular components.
  • said nucleic acid has a size greater than 1000 base pairs. Even more preferably, it has a size of between approximately 1000 base pairs and approximately 2,000,000 base pairs (2 Mb), approximately 1,000 base pairs and approximately 100,000 base pairs (100 kb), and approximately 1,000 base pairs and approximately 20,000 base pairs (20 kb).
  • the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic interest under the control of regulatory sequences, for example one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • the term “gene of therapeutic interest” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can in particular be a protein or a peptide.
  • This protein product can be exogenous homologous or endogenous with respect to the target cell, that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology.
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein having, for example, increased stability or modified activity.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can, for example, supplement or bring about a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
  • trophic factors for example BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5 or HARP / pleiotrophin
  • apolipoproteins for example ApoAI, ApoAIV or ApoE: see FR 93/05125
  • dystrophin or a minidystrophin FR 91/11947
  • the CFTR protein associated with cystic fibrosis for example p53, Rb, RaplA, DCC or k-rev : see FR 93/04745), the genes coding for factors involved in coagulation (Factors VII, VIII, IX),
  • the nucleic acid of therapeutic interest can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic genes also include the sequences coding for ribozymes, which are capable of selectively destroying target RNAs (EP 321,201).
  • the nucleic acid can also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating in humans or animals an immune response.
  • the invention allows the production of either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming virus", d other viruses or tumor-specific antigenic peptides (EP 259,212).
  • the nucleic acid preferably also comprises sequences allowing the expression of the gene of therapeutic interest and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ.
  • These may be sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the infected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • promoters of the El A, MLP, CMV, RSV or HSV genes can be modified, for example, by adding activation or regulation sequences. They can also be inducible or repressible promoters.
  • the nucleic acid can also comprise, in particular upstream of the gene of therapeutic interest, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell.
  • This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the nucleic acid may also have a signal sequence directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
  • compositions according to the present invention can be prepared by mixing an aqueous solution containing a mineral particle having a structure with exchangeable sheets and a solution containing the nucleic acids. More specifically, the compositions according to the present invention can be prepared by bringing the mineral particles having a structure with exchangeable sheets in aqueous solution at a pH close to neutral (for example between 6 and 8, and more preferably between 6.5 and 7 , 5), then by adding the aqueous solution thus obtained to a solution containing the nucleic acids or else by adding said solution containing the nucleic acids to the aqueous solution of mineral particles having a structure with exchangeable sheets.
  • the solution containing the nucleic acids is preferably an isotonic solution in sodium chloride or in glucose.
  • the mineral particles having a structure with exchangeable sheets and the nucleic acids are introduced into the composition in quantities such that the mass ratio between the mineral particles having a structure with exchangeable sheets and the nucleic acids is between 0.01 and 1000 , preferably between 0.01 and 500, more preferably between 0.01 and 100, and even more preferably between 0.5 and 100.
  • the respective amounts of each component can be easily adjusted and optimized by l he skilled in the art by the usual method of trial and error, as a function of the mineral particle having a structure with exchangeable sheets used, of the nucleic acid, and of the desired applications (in particular of the cell type to be transfected).
  • a subject of the invention is also the compositions as defined above for use as a medicament.
  • the invention also relates to the use of the compositions as defined above for the transfer of nucleic acids into cells in vitro, in vivo or ex vivo. More specifically, the subject of the present invention is the use of the compositions as defined above for the preparation of a medicament intended to treat diseases, in particular diseases which result from a deficiency in a protein or nucleic product.
  • the nucleic acid contained in said medicament encodes said protein or nucleic product, or constitutes said nucleic product, capable of correcting said diseases in vivo or ex vivo.
  • Said medicament can also be a vaccine and in this case, the transfected nucleic acid induces an immune response.
  • compositions according to the invention can be formulated for administration in particular by topical or cutaneous route, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal or intraperitoneal.
  • the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, in particular for a direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or on the mucous membrane).
  • compositions according to the invention may contain one or more adjuvants conventionally used in pharmacy.
  • the doses of nucleic acids used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the treatment sought.
  • the mode of administration it may be either a direct injection into the tissues, for example at the level of tumors, or into the circulatory tract, or a treatment of cultured cells followed of their reimplantation in vivo, by injection or graft.
  • the tissues concerned in the context of the present invention are for example the muscles, the skin, the brain, the lungs, the liver, the spleen, the bone marrow, the thymus, the heart, the lymph, the blood, the bones, cartilage, pancreas, kidneys, bladder, stomach, intestines, testes, ovaries, rectum, nervous system, eyes, glands or connective tissue.
  • Another object of the present invention relates to a method for transferring nucleic acids into cells, comprising the following steps:
  • composition comprising at least one nucleic acid and one mineral particle having a structure with exchangeable sheets as defined above, and
  • the present invention relates to a method of therapeutic treatment of the human or animal body comprising the following steps:
  • composition comprising at least one nucleic acid and one mineral particle having a structure with exchangeable sheets as defined above, and
  • the contacting of the cells with the composition according to the present invention can be carried out by incubation of the cells with said composition or by injection of the composition into the organism or part of the organism.
  • the incubation is preferably carried out in the presence of, for example, from 0.01 to 1000 ⁇ g of nucleic acid per 10 cells.
  • doses of nucleic acid ranging from 0.01 to 10 mg can for example be used.
  • compositions of the invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable adjuvants.
  • the adjuvant (s) are mixed beforehand with the aqueous solution containing the mineral particle having a structure with exchangeable sheets according to the invention and / or with the solution of nucleic acid (s).
  • the present invention thus provides a particularly advantageous method for the transfer of nucleic acids, in particular for the treatment of diseases, comprising the administration in vivo or ex vivo of a nucleic acid coding for a protein or capable of being transcribed into a nucleic acid. able to correct said disease, said nucleic acid being associated with a mineral particle having a structure with exchangeable sheets as defined above under the conditions defined above.
  • compositions according to the present invention are particularly useful for the transfer of nucleic acids into primary cells or into established lines. They can be, for example, fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic (for example lymphocytes, CD34, or dendritics) or epithelial, in differentiated or pluripotent forms (precursors).
  • nucleic acids for example, fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic (for example lymphocytes, CD34, or dendritics) or epithelial, in differentiated or pluripotent forms (precursors).
  • the present invention also includes other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • FIGURES Figure 1 idealized structure of the mineral particles having a structure with exchangeable sheets (double lamellar hydroxides) according to the present invention.
  • Figure 2 schematic representation of the hydrotalcite Mg 6 Al 2 CO 3 (OH) ⁇ 6 .4H 2 O.
  • Figure 3 measurement of the zeta potential of hydrotalcite particles alone in solution.
  • Figure 4 measurement of the zeta potential of compositions containing hydrotalcite particles and DNA in a mass ratio equal to 0.5.
  • Figure 5 Measurement of the percentage of DNA remaining in the supernatant relative to the initial amount of DNA introduced, as a function of the hydrotalcite / DNA mass ratio. The measurements were made for three different concentrations of DNA introduced: 20 ⁇ g of DNA / ml, 50 ⁇ g of DNA / ml, and 100 ⁇ g of DNA / ml.
  • Figure 6 Electrophoresis on agarose gel of different DNA formulations.
  • the column “a” constitutes the control (DNA not formulated and not subjected to nucleases)
  • the column “b” represents the unformulated DNA subjected to nucleases
  • the columns “C” to “f” represent hydrotalcite / DNA compositions at mass ratios of 0.125 or 0.25 or 0.5 or 1 which are subjected to nucleases.
  • FIG. 7 visualization in the form of a histogram of the efficiency of gene transfer in vivo (by injection into the cranial tibial muscle of mice) of DNA / hydrotalcite compositions in different mass ratios, compared with the injection of naked DNA.
  • Figure 8 Schematic representation of the plasmid pXL3031 used in DNA transfer experiments in cells
  • mice used in the in vivo gene transfer experiments are 8 week old female C57B16 mice, divided into 9 groups of 12 mice.
  • Mineral particle according to the invention used the mineral particle having a structure with exchangeable sheets used in the various tests is hydrotalcite in aqueous solution at a concentration of 20 g / 1 and at pH 7.
  • This hydrotalcite is sold by the company Sud- Chemie AG (Germany).
  • the plasmid used is pXL3031 which contains the read gene coding for luciferase under the control of the P / E CMV promoter of the cytomegalovirus, represented in FIG. 8. Its size is 3671 bp.
  • the plasmid solution used contains 320 ⁇ g of DNA / ml in a 150 mM solution of sodium chloride (NaCl).
  • the complexes are prepared by equivolumetric mixing of two solutions: one containing hydrotalcite and the other plasmid DNA.
  • the purpose of this example is to show that DNA is capable of associating with a mineral particle having a structure with exchangeable sheets such as hydrotalcite.
  • the measurement of the zeta potential provides information on the nature of the surface charge of a particle placed in a liquid.
  • the zeta potential is not a direct measure of the surface charge, but is the potential that exists around the particle when it moves in a solution when it is subjected to an electric field. Therefore if the particles have a positive surface charge, the zeta potential, which is the only measurable quantity, will also be positive. Zeta potential plays a role determining in the colloidal stability of the particles in solution.
  • the particles do not aggregate because forces of electrostatic repulsions keep them isolated.
  • the particles which have a zeta potential close to zero are not stable because the Van Der Waals forces attract the particles together, and cause them to precipitate.
  • the zeta potential of hydrotalcite and of hydrotalcite / DNA complexes was measured by a Coulter brand zetameter (Delsa 440 SX).
  • the hydrotalcite solution contained 0.15 mg hydrotalcite / ml in a 20 mM solution of sodium chloride (NaCl), giving a conductivity of 2.3 mS / cm.
  • the hydrotalcite / DNA complexes were prepared at concentrations of 250 ⁇ g of DNA / ml in a 20 mM solution of sodium chloride (NaCl), at a mass ratio of 0.5. The measurement was made by applying an electric field of 1.5 mA for 60 seconds.
  • FIG. 3 shows the zeta potential of hydrotalcite alone before being mixed with DNA.
  • This zeta potential is + 32 mV and therefore indicates an overall cationic surface charge, which is consistent with the structure and composition of the hydrotalcite (see Figures 1 and 2).
  • FIG. 4 represents the zeta potential of hydrotalcite / DNA complexes with a mass ratio of 0.5. In this case, the zeta potential is - 41 mV.
  • the surface charge has therefore been modified and is now generally anionic, which indicates that the anionic DNA molecules have associated on the surface of the hydrotalcite thus modifying its surface charge.
  • the purpose of this example is to show that mineral particles having a structure with exchangeable sheets such as hydrotalcite associate with DNA. Adsorption isotherms are achieved by mixing increasing amounts of hydrotalcite with a constant amount of DNA. Hydrotalcite / DNA mixtures are prepared by equivolumetric mixing of a solution containing DNA and a solution containing hydrotalcite. All of these mixtures are then ultracentrifuged at 50,000 rpm for 10 minutes (Ultracentrifuge: Beckman TL100). The graph in FIG. 5 indicates that the quantity of DNA present in the supernatant gradually decreases with the increase in the hydrotalcite / DNA mass ratio. At a hydrotalcite / DNA ratio of 50 w / w, there is no longer any DNA present in the supernatant.
  • the purpose of this example is to show that DNA is protected against enzymatic degradations when it is associated with a mineral particle having a structure with exchangeable sheets such as hydrotalcite.
  • the injections were carried out bilaterally in the cranial tibial muscle of mice at the rate of 25 ⁇ l / muscle, ie 4 ⁇ g of DNA / muscle.
  • the animals are anesthetized with 250 ⁇ l of Ketamine / Xylazine intraperitoneally (3.9 ml of imalgene 1000, 0.6 ml Rompun at 2%, and 40.5 ml of a solution of sodium chloride NaCl at 150 mM ). Then the animals are shaved and injected into the two cranial tibial muscles.
  • Luciferase activity is measured using a luciferase test kit (Promega) and a Dynex MLX luminometer. The reading of this activity is measured in RLU ("Relative Light Unit"). in vivo transfection into the muscle
  • results of the in vivo gene transfer into the muscle are represented in FIG. 7. These results indicate that at the hydrotalcite / DNA mass ratio of 0.5 an increase in the luciferase activity by a factor of 14 is obtained compared to naked DNA. More generally, the DNA / hydrotalcite compositions have an improved transfection efficiency compared to that obtained by injection of naked DNA.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables, leur procédé de préparation et leurs applications pour la transfection in vivo, in vitro et/ou ex vivo d'acides nucléiques. Préférentiellement, lesdites particules minérales sont de formule générale (I): [MII1-xMIIIx(OH)2]x+[Xm-x/m .nH2O]x-.

Description

COMPOSITIONS COMPRENANT DES ACIDES NUCLEIQUES INCORPORES DANS DES PARTICULES MINERALES BILAMELLAIRES
La présente invention se rapporte à des compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables, 5 leur procédé de préparation et leurs applications pour la transfection in vivo, in vitro et/ou ex vivo d'acides nucléiques.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules (c'est-à-dire de les introduire dans les cellules de façon à ce que le gène d'intérêt qu'ils portent y soit exprimé) est 0 devenue une technique de base avec de nombreuses applications biotechnologiques. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro , par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire pour l'étude de la régulation de l'expression des gènes, le clonage de gènes ou tout autre manipulation impliquant l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des 5 cellules in vivo, par exemple pour la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert de gènes ex vivo dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure, par exemple pour la création d'animaux transgéniques.
Il existe à ce jour de nombreuses méthodes de transfert d'acides nucléiques 0 dans des cellules : La précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la micro injection, l'infection virale, l'injection d'ADN nu, ou encore l'utilisation de vecteurs non-viraux, comme par exemple les polymères cationiques, les vecteurs biochimiques (constitués d'une protéine cationique associée à un récepteur cellulaire), ou encore les lipofectants, et plus particulièrement les lipides cationiques.
5 Toutefois, ces techniques développées à ce jour présentent de nombreux inconvénients qui limitent l'efficacité de la transfection et ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au transfert de gènes dans les cellules et/ou l'organisme. Ainsi, la précipitation au phosphate de calcium est une méthode qui est assez inefficace, notamment par rapport à l'injection d'ADN nu, et elle a donc été abandonnée depuis longtemps. S'il a été montré que l'injection d'acides nucléiques « nus », c'est-à-dire non-formulés, permet d'obtenir des niveaux de transfection acceptables dans certains types cellulaires in vivo (voir notamment la demande de brevet WO90/11092), les acides nucléique nus ne jouissent cependant que d'une demi-vie plasmatique courte, en raison de leur dégradation par les enzymes et de leur élimination par les voies urinaires. Le niveau d'efficacité de transfert de gènes par injection d'acide nucléique nu reste trop faible pour la plupart des applications envisagées. L'utilisation de polymères ou de lipides cationiques constitue ainsi un remède possible vis-à-vis des dégradations enzymatiques que subit l'ADN à transfecter, mais il a été souvent constaté que leur utilisation inhibe plus ou moins fortement l'efficacité de transfection dans le muscle et qu'ils induisent en outre une toxicité à l'égard des cellules. Si les virus recombinants permettent d'obtenir une bonne efficacité de transfert des acides nucléiques, leur emploi présente cependant certains risques liés à leur nature virale tels que la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, la transformation, l'immunogénicité, etc.. Il est donc préférable d'éviter les techniques de transfection virale. Enfin, des techniques telles que l'électroporation constituent une alternative intéressante mais limitée à une administration locale. Elles provoquent bien souvent des dégâts irréversibles sur les membranes cellulaires. Il apparaît donc qu'il serait souhaitable de disposer d'un vecteur de transfert qui permette à la fois de protéger les acides nucléiques des dégradations enzymatiques et d'obtenir une efficacité de transfert satisfaisante dans les cellules, sans pour autant les endommager ni induire de toxicité.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. La demanderesse a en effet montré que les compositions comprenant un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables permettent le transfert in vitro, ex vivo ou in vivo dudit acide nucléique dans une cellule et/ou un organe avec une efficacité supérieure à celles obtenues à ce jour avec les techniques classiques de transfert non-viral. Les compositions de l'invention permettent en outre d'éviter les inconvénients liés à l'emploi de vecteurs viraux ou de techniques physiques de transfection.
Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne les compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables.
Au sens de l'invention, on entend par « particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables » des particules minérales dont la structure est basée sur un empilement de feuillets de composition M(OH)2 analogues à ceux bien connus de la brucite (Mg(OH)2), M représentant un métal divalent, mais dans lesquels une partie des métaux divalents est remplacée par des métaux trivalents de façon à rendre les feuillets globalement cationiques. Les espaces inter-feuillets comprennent des entités anioniques solvatées par des molécules d'eau. Une telle structure est représentée à la figure 1 et est également appelée « hydroxyde double lamellaire ». Ces particules ont pour formule générale :
dans laquelle Mu représente un cation métallique divalent, M111 représente un cation métallique trivalent, Xm~ représente un anion interfoliaire et m est un entier supérieur ou égal à 1 , x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
De telles particules minérales ont déjà été décrites pour des applications dans de nombreux domaines tels que la catalyse ou l'environnement. En effet, elles forment des matériaux nanostructurés où des espèces moléculaires ou colloïdales sont intercalées dans une structure hôte lamellaire. Les propriétés de ces structures peuvent ainsi être mises à profit en catalyse hétérogène ou homogène sur support, dans des techniques d'échanges et de séparation notamment des isomères optiques, pour la conception de membranes éventuellement sélectives pour filtration et perméation, pour le piégeage et la restitution contrôlée de molécules, ou encore pour la conception de matériaux et dépôts électro-actifs, d'électrodes et de dispositifs électroniques. Ainsi l'article de Choy et al (1999, J. Am. Chem. Soc. 121(6), 1399-1400) décrit la préparation de nanoparticules hybrides composées de feuillets d'un Hydroxyde Double Lamellaire (HDL), la pristine (Mg2Al(NO3)-LDH), entre lesquels sont intercalés des nucléosides monophoshatés ou des fragments d'ADN de testicules de hareng. Les molécules nucléiques intercalées dans les particules décrites dans cet article présentent une taille inférieure à 1000 paires de bases. Aucune utilisation de ces molécules n'est décrite.
Cependant, de telles particules minérales n'avaient jamais été utilisées pour le transfert d'acides nucléiques et rien ne laissait prévoir qu'il serait possible d'obtenir une très nette amélioration de l'efficacité de transfert, en particulier par rapport aux résultats de transfection obtenus par injection d'ADN nu ou formulé avec les vecteurs synthétiques classiques tels que les lipides cationiques.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables utilisables dans le cadre de la présente invention sont souvent nommées d'après la nature des cations métalliques majeurs des feuillets : par exemple l'hydrotalcite (Mg- Al), la pyroaurite (Mg-Fe), la stichtite (Mg-Cr) ou encore la takovite (Ni-Al). La formule générale indiquée ci-avant sous-tend la grande variété des particules minérales qu'il est possible de préparer en faisant varier la nature des deux cations métalliques M11 et Mπι, leurs proportions respectives avec extension possible à plus de deux types de cations (par exemple Mg, Zn et Al), la nature des anions interfoliaires, ou encore l'état d'hydratation. En outre, la richesse de la formule générale indiquée ci-avant est encore accrue par une diversité structurale résultant de l'existence de polytypes différant par la séquence d'empilement des feuillets ainsi que de l'apparition de surstructures dues par exemple à un classement cationique dans le feuillet hydroxylé.
Les cations métalliques divalents Mπ peuvent être choisis par exemple parmi le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu), le calcium (Ca) ou encore le zinc (Zn). De préférence, le cation métallique divalent est le magnésium. Les cations métalliques trivalents Mπι peuvent être choisis par exemple parmi l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co) ou encore le gallium (Ga). De préférence, le cation métallique trivalent est l'aluminium. En outre, les deux membres du couple Mπ et M peuvent également correspondre au même élément (par exemple Feπ/Feffl ou Mnπ/Mnιπ).
Les anions interfoliaires X " peuvent être par exemple choisis parmi les halogénures, les oxoanions, les iso- et hétéroanions, les anions complexes, ou encore les anions organiques. Citons à titre d'exemple les fluorures, les chlorures, les bromures, les carbonates, les nitrates, les sulfates ou encore les oxoanions tétraédriques tels que CrO 2". De préférence, l'anion est choisi parmi les carbonates
∞3 2-.
La valeur de x est comprise strictement entre 0 et 1, c'est-à-dire que 0 et 1 sont des valeurs exclues. De préférence, x est compris entre 0,05 et 0,95, et de préférence entre 0,1 et 0,9. Encore plus préférentiellement, x est compris entre 0,2 et 0,85. A titre d'exemple, x peut être égal à 0,25. En ce qui concerne la valeur de n, celle-ci indique l'état d'hydratation de la particule en question et elle est strictement supérieure à 0. De préférence, n est supérieur ou égal à 0,1. Par exemple, n peut être égal à 0,5. m est un entier supérieur ou égal à 1 qui représente la charge de l'anion interfoliaire. Par exemple, m peut être égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Des particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention peuvent être choisies par exemple parmi l'hydrotalcite de formule Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O, la manasseite de formule Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O, la pyroaurite de formule Mg6Fe2CO3(OH)ι6.4H2θ, la stichtite de formule Mg6Cr2CO3(OH)ι6.4H2O, la takovite de formule Ni6Al2CO3(OH)ι6.4H20, la reevesite de formule Ni6Fe2CO3(OH)ι6.4H2θ, ou encore la comblainite de formule Ni6Cθ2CO3(OH)16.4H2θ. D'autres particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables peuvent également convenir. De préférence, les compositions selon la présente invention comprennent au moins un acide nucléique et de l'hydrotalcite de formule Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention sont soit commerciales, soit elles peuvent être préparées selon des méthodes qui s'apparentent aux méthodes connues dites de « chimie douce ». Notamment, la préparation des particules minérales selon l'invention peut être basée sur la précipitation contrôlée de solutions ou de suspensions aqueuses contenant à la fois les cations métalliques destinés à prendre place dans la charpente hydroxylée et les anions destinés à occuper les domaines interlamellaires. Dans ces conditions, il y a simultanément construction des domaines interlamellaires constitués d' anions et de molécules d'eau, et du feuillet. La nature et la texture des phases obtenues sont fortement dépendantes des conditions opératoires (température, vitesse d'addition et concentration des réactifs, contrôle du pH), mais aussi de la géométrie du réacteur et de l'état d'association préalable des cations métalliques dans les réactifs (existence d'oligomères). Le procédé de préparation se ramène finalement toujours à mettre en présence, à concentration et réactivité adéquates, les espèces conduisant à la construction des particules minérales dans des conditions optimales. Ces conditions optimales sont déterminées au cas par cas selon la méthode classique des tâtonnements.
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être par exemple d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne ou virale. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin ou encore des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement constitués par exemple par des plasmides, des vecteurs, des épisomes ou des cassettes d'expression. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent notamment porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non ou encore des régions de liaison à d'autres composants cellulaires.
De préférence, ledit acide nucléique présente une taille supérieure à 1000 paires de bases. Encore plus préférentiellement il présente une taille comprise entre environ 1000 paires de bases et environ 2.000.000 paires de bases (2 Mb), environ 1000 paires de bases et environ 100.000 paires de bases (100 kb), et environ 1000 paires de bases et environ 20.000 paires de bases (20 kb).
De manière avantageuse l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou plusieurs promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire ayant par exemple une stabilité accrue ou une activité modifiée. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à- vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines (par exemple les interleukines, les interférons ou le TNF : voir FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (par exemple BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NT5 ou HARP/pléiotrophine), les apolipoprotéines (par exemple ApoAI, ApoAIV ou ApoE : voir FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple p53, Rb, RaplA, DCC ou k-rev : voir FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme ou catabolisme.
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201). Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Comme indiqué précédemment, l'acide nucléique comprend de préférence également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV ou HSV. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par exemple par addition de séquences d'activation ou de régulation. Il peut aussi s'agir de promoteurs inductibles ou répressibles.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les compositions selon la présente invention peuvent être préparées par mélange d'une solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables et d'une solution contenant les acides nucléiques. Plus précisément, les compositions selon la présente invention peuvent être préparées en mettant les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables en solution aqueuse à un pH proche de la neutralité (par exemple entre 6 et 8, et plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5), puis en ajoutant la solution aqueuse ainsi obtenue à une solution contenant les acides nucléiques ou bien en ajoutant ladite solution contenant les acides nucléiques à la solution aqueuse de particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables. La solution contenant les acides nucléiques est de préférence une solution isotonique dans du chlorure de sodium ou dans du glucose. De préférence, les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables et les acides nucléiques sont introduits dans la composition en quantités telles que le rapport massique entre les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables et les acides nucléiques est compris entre 0,01 et 1000, de préférence entre 0,01 et 500, plus préférentiellement entre 0,01 et 100, et encore plus préférentiellement entre 0,5 et 100. En tout état de cause, les quantités respectives de chaque composant peuvent être ajustées et optimisées aisément par l'homme du métier par la méthode habituelle des tâtonnements, en fonction de la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables utilisée, de l'acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type cellulaire à transfecter).
L'invention a également pour objet les compositions telles que définies ci- avant pour utilisation comme médicament.
L'invention a également pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-avant pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro, in vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une déficience en un produit protéique ou nucléique. L'acide nucléique contenu dans ledit médicament code ledit produit protéique ou nucléique, ou constitue ledit produit nucléique, apte à corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo. Ledit médicament peut en outre être un vaccin et dans ce cas, l'acide nucléique transfecté induit une réponse immunitaire.
Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations notamment par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale ou intrapéritonéale. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou sur muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. En outre, les compositions selon l'invention peuvent contenir un ou des adjuvants classiquement utilisés en pharmacie. Les doses d'acides nucléiques utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, ou dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes ou les tissus conjonctifs. Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment, et
(2) la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1).
Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes :
(1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment, et
(2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec la composition formée en (1).
La mise en contact des cellules avec la composition selon la présente invention peut être réalisée par incubation des cellules avec ladite composition ou par injection de la composition dans l'organisme ou une partie de l'organisme. L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 μg d'acide nucléique pour 10 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Les compositions de l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Dans ce cas, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à la solution aqueuse contenant la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables selon l'invention et/ou à la solution d'acide(s) nucléique(s).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou ex vivo d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment dans les conditions définies ci-avant.
Les compositions selon la présente invention sont particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies. Il peut s'agir par exemple de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (par exemple les lymphocytes, CD34, ou dendritiques) ou épitheliales, sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
FIGURES Figure 1 : structure idéalisée des particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables (hydroxydes doubles lamellaires) selon la présente invention.
Figure 2 : représentation schématique de l'hydrotalcite Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O.
Figure 3 : mesure du potentiel zêta de particules d'hydrotalcite seules en solution.
Figure 4 : mesure du potentiel zêta de compositions contenant des particules d'hydrotalcite et de l'ADN dans un rapport massique égal à 0,5.
Figure 5 : Mesure du pourcentage d'ADN restant dans le surnageant par rapport à la quantité initiale d'ADN introduite, en fonction du rapport massique hydrotalcite/ADN. Les mesures ont été faites pour trois concentrations différentes d'ADN introduites : 20 μg d'ADN/ml, 50 μg d'ADN/ml, et 100 μg d'ADN/ml. Figure 6 : Electrophorese sur gel d'agarose de différentes formulations d'ADN. La colonne « a » constitue le contrôle (ADN non-formulé et non-soumis aux nucléases), la colonne « b » représente l'ADN non-formulé soumis aux nucléases, et les colonnes « c » à « f » représentent des compositions hydrotalcite/ADN à des rapports massiques de 0,125 ou 0,25 ou 0,5 ou 1 qui sont soumises aux nucléases.
Figure 7 : visualisation sous forme d'histogramme de l'efficacité de transfert de gène in vivo (par injection dans le muscle tibial cranial de souris) de compositions ADN/hydrotalcite dans différents rapports massiques, comparativement à l'injection d'ADN nu.
Figure 8 : Représentation schématique du plasmide pXL3031 utilisé dans les expériences de transfert d'ADN dans les cellules
EXEMPLES
Al MATÉRIEL ET MÉTHODES
Souris utilisées ;
Les souris utilisées dans les expériences de transfert in vivo de gènes sont des souris femelles C57B16 âgées de 8 semaines, et réparties en 9 groupes de 12 souris.
Particule minérale selon l'invention utilisée la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables utilisées dans les différents essais est l'hydrotalcite en solution aqueuse à une concentration de 20 g/1 et à pH 7. Cette hydrotalcite est commercialisée par la société Sud-Chemie AG (Allemagne).
ADN
Le plasmide utilisé est le pXL3031 qui contient le gène lue codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus, représenté à la figure 8. Sa taille est de 3671 bp. La solution de plasmide utilisée contient 320 μg d'ADN/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 150 mM.
Complexes hydrotalcite/ADN
Les complexes sont préparés par mélange équivolumétrique de deux solutions : l'une contenant l'hydrotalcite et l'autre l'ADN plasmidique.
Exemple 1 : Mesure des potentiels zêta de l'hydrotalcite seul et des complexes ADN/hydrotalcite
Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est capable de s'associer avec une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite. La mesure du potentiel zêta renseigne sur la nature de la charge de surface d'une particule placée dans un liquide. Le potentiel zêta n'est pas une mesure directe de la charge de surface, mais est le potentiel qui existe autour de le particule lorsque celle ci se déplace dans une solution lorsqu'elle est soumise à un champs électrique. Par conséquent si les particules ont une charge de surface positive, le potentiel zêta, qui est la seule grandeur mesurable, sera lui aussi positif. Le potentiel zêta joue un rôle déterminant dans la stabilité colloïdale des particules en solution. En effet, lorsque le potentiel zêta est fortement positif ou négatif, les particules ne s'agrègent pas car des forces de répulsions électrostatiques les maintiennent isolées. Par contre, les particules qui possèdent un potentiel zêta proche de zéro ne sont pas stables car les forces de Van Der Waals attirent les particules entre elles, et les font précipiter.
Le potentiel zêta de l'hydrotalcite et des complexes hydrotalcite/ADN a été mesuré par un zétamètre de marque Coulter (Delsa 440 SX). La solution d'hydrotalcite contenait 0,15 mg d'hydrotalcite/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 20 mM, soit une conductivité de 2,3 mS/cm. Les complexes hydrotalcite/ADN ont été préparés à des concentrations de 250 μg d'ADN/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 20 mM, au rapport massique de 0,5. La mesure a été effectuée en appliquant un champs électrique de 1,5 mA pendant 60 secondes.
La figure 3 représente le potentiel zêta de l'hydrotalcite seul avant d'être mélangé avec l'ADN. Ce potentiel zêta est de + 32 mV et indique donc une charge en surface globalement cationique, ce qui est cohérent avec la structure et la composition de l'hydrotalcite (voir figures 1 et 2). La figure 4 représente le potentiel zêta de complexes hydrotalcite/ADN au rapport massique de 0,5. Dans ce cas, le potentiel zêta est de - 41 mV. La charge de surface a donc été modifiée et est à présent globalement anionique, ce qui indique que les molécules d'ADN anioniques se sont associées sur la surface de l'hydrotalcite modifiant ainsi sa charge de surface.
Exemple 2 : Mise en évidence de l'association entre l'ADN et les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite
Le but de cet exemple est de montrer que les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite s'associent avec l'ADN. Des isothermes d'adsorption sont réalisées en mélangeant des quantités croissantes d'hydrotalcite avec une quantité constante d'ADN. Les mélanges hydrotalcite/ADN sont préparés par mélange équivolumétrique d'une solution contenant l'ADN et d'une solution contenant l'hydrotalcite. L'ensemble de ces mélanges est ensuite ultracentrifugé à 50000 tour/minute pendant 10 minutes (Ultracentrifugeuse : Beckman TL100). Le graphique de la figure 5 indique que la quantité d'ADN présente dans le surnageant diminue progressivement avec l'augmentation du rapport massique hydrotalcite/ADN. A un rapport hydrotalcite/ADN de 50 poids/poids, il n'y a plus d'ADN présent dans le surnageant. Ceci indique que toutes les molécules d'ADN sont associées avec l'hydrotalcite et se trouvent dans le culot après ultracentrifugation. Le même phénomène a été observé à trois concentrations d'ADN différentes : 20, 50 et 100 μg d'ADN/ml. Par conséquent, on peut en déduire qu'il y a bien association entre l'hydrotalcite et l'ADN.
Exemple 3 : Protection de l'ADN vis-à-vis des dégradations causées par les nucléases
Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est protégé vis-à-vis des dégradations enzymatiques lorsqu'il est associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite.
Des échantillons d'ADN nu et d'ADN formulé avec l'hydrotalcite ont été soumis au test de résistance aux dégradations causées par les nucléases. Pour cela, les échantillons ont été incubés avec un prélèvement de liquide musculaire. La figure 6 indique que lorsque l'ADN est associé avec l'hydrotalcite à différents rapports massiques (colonnes « c », « d », « e » et « f »), il n'est pas dégradé par les nucléases puisqu'il est tout à fait possible d'observer une bande d'ADN sur le gel. Par contre, la colonne « b » qui représente l'ADN nu non-associé avec l'hydrotalcite est totalement dégradé par les nucléases car au lieu d'avoir une bande d'ADN bien identifiée sur le gel, on observe une multitude de petits fragments qui migrent dans le gel.
Ainsi, lorsque l'ADN est associé avec les particules minérales d'hydrotalcite, il est protégé de l'action de dégradation des nucléases, par opposition à l'ADN nu qui est rapidement dégradé. Cette propriété conférée par les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite est très intéressante car une plus grande quantité d'ADN peut ainsi atteindre le noyau des cellules pour y être transcrit, avec les conséquences bénéfiques que cela implique en terme d'efficacité de transfection. Exemple 4 : Transfection in vivo de complexes hydrotalcite / ADN a) Injections
Les injections ont été réalisées en bilatéral dans le muscle tibial cranial des souris à raison de 25 μl /muscle, soit 4 μg d'ADN/muscle. Les animaux sont anesthésiés avec 250 μl de Ketamine/Xylazine par voie intrapéritonéale (3,9 ml d'imalgène 1000, 0,6 ml Rompun à 2%, et 40,5 ml d'une solution de chlorure de sodium NaCl à 150 mM). Ensuite, les animaux sont rasés et injectés au niveau des deux muscles tibial cranial. b Prélèvement des muscles Les muscles tibial cranial sont repris 6 jours post-injection dans 1 ml de tampon de lyse/muscle (Lysis Buffer de Promega E) supplementé par des inhibiteurs de protéase (coktail tablets - Boehringer). Les muscles sont prélevés dans les tubes spéciaux de chez BIO101 et conservés à -20°C, avant broyage et lecture. c) Extraction de la luciférase exprimée par les cellules musculaires L'extraction de la luciférase est réalisée avec un appareil « Fastprep machine » dans des conditions d'extraction utilisant 1 ml de tampon de lyse par tube à une vitesse de 6,5 m/s, pendant 30 secondes. Les tubes sont ensuite mis dans la glace et centrifugés à 12000 g pendant 10 minutes à 4°C. d Détermination de l'activité luciférase L'activité luciférase est mesurée en utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex MLX. La lecture de cette activité est mesurée en RLU (« Relative Light Unit » : Unité de Lumière Relative). e transfection in vivo dans le muscle
Les résultats du transfert de gène in vivo dans le muscle sont représentés à la figure 7. Ces résultats indiquent qu'au rapport massique hydrotalcite/ADN de 0,5 une augmentation de l'activité luciférase d'un facteur 14 est obtenu par rapport à l'ADN nu. Plus généralement, les compositions ADN/hydrotalcite présentent une efficacité de transfection améliorée par rapport à celle obtenue par injection d'ADN nu.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant au moins un acide nucléique ayant une taille supérieure à 1000 paires de bases et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l' acide nucléique est un plasmide, un vecteur, un épisome ou une cassette d'expression.
3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables a pour formule générale :
dans laquelle Mπ représente un cation métallique divalent, Mιπ représente un cation métallique trivalent, X représente un anion interfoliaire et m est un entier supérieur ou égal à 1 , x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
4. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que le cation métallique divalent Mπ peut être choisis parmi le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu) ou le zinc (Zn).
5. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que le cation métallique divalent Mπ est le magnésium.
6. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que le cation métallique trivalent Mm peut être choisis parmi l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), ou le gallium (Ga).
7. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que le cation métallique trivalent Mm est l'aluminium.
8. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'anion interfoliaire X peut être choisis parmi les halogénures, les oxoanions, les iso- et hétéroanions, les anions complexes, ou les anions organiques.
9. Composition selon la revendication 3 ou 8 caractérisée en ce que l'anion m- ? interfoliaire X est le carbonate CO3 .
10. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que m est égal à 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
1 1. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que x est compris entre 0,05 et 0,95.
12. Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que n est supérieur ou égal à 0, 1.
13. Composition selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables est choisie parmi l'hydrotalcite de formule Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2θ, la manasseite de formule Mg6Al2CO3(OH)ι6.4H2O, la pyroaurite de formule Mg6Fe2CO3(OH)ι6.4H2O, la stichtite de formule Mg6Cr2CO3(OH)j6.4H2O, la takovite de formule Ni6Al2CO3(OH)ι6.4H2O, la reevesite de formule Ni6Fe2CO3(OH)ι6.4H2O ou la comblainite de formule Ni6Co2CO3(OH)ι6.4H2O.
14. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce que ladite particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables est l'hydrotalcite de formule
Mg6Al2CO3(OH)16.4H2O.
15. Composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables de formule
dans laquelle M11 représente le magnésium, Mra représente l'aluminium, Xm~ représente un anion interfoliaire carbonate et m est un entier supérieur ou égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
16. Composition selon la revendication 15 comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables de formule
Mg6Al2CO3(OH)16.4H2O.
17. Composition selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou des adjuvants pharmaceutiquement acceptables.
18. Composition selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
19. Composition selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou les muqueuses.
20. Composition selon l'une des revendications 1 à 19 caractérisée en ce que le rapport massique particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables/acide(s) nucléique(s) est compris entre 0,01 et 1000.
21. Composition selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisée en ce que l'acide nucléique présente une taille comprise entre environ 1000 paires de bases et environ 2.000.000 paires de bases.
22. Composition selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisée en ce que l'acide nucléique présente une taille comprise entre environ 1000 paires de bases et environ 100.000 paires de bases.
23. Composition selon l'une des revendications 1 à 20 caractérisée en ce que l'acide nucléique présente une taille comprise entre environ 1000 paires de bases et environ
20.000 paires de bases.
24. Composition selon l'une des revendications 1 à 23 pour utilisation comme médicament.
25. Utilisation d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 24 pour la préparation d'un médicament destiné à la transfection de cellules.
26. Procédé de préparation d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 24 caractérisé en ce qu'on mélange une solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables et une solution contenant le ou les acides nucléiques.
27. Procédé de préparation selon la revendication 26 caractérisé en ce que, dans le cas où les compositions telles que définies dans les revendications précédentes contiennent en outre un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à la solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables et/ou à la solution d'acide(s) nucléique(s).
28. Méthode de transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro ou ex vivo comprenant les étapes suivantes :
(1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie dans l'une des revendications 1 à 24, et (2) la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1).
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