EP1198567A1 - Nouvelles applications des transporteurs de type abca - Google Patents

Nouvelles applications des transporteurs de type abca

Info

Publication number
EP1198567A1
EP1198567A1 EP00901676A EP00901676A EP1198567A1 EP 1198567 A1 EP1198567 A1 EP 1198567A1 EP 00901676 A EP00901676 A EP 00901676A EP 00901676 A EP00901676 A EP 00901676A EP 1198567 A1 EP1198567 A1 EP 1198567A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
abca
transporter
cells
gene
atp binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00901676A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Giovanna Chimini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1198567A1 publication Critical patent/EP1198567A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening drugs capable of modulating the ABCA transporter as well as to its applications.
  • the present invention also relates to homologous recombination vectors and expression vectors of an ABCA transporter, to eukaryotic cells and to specific sequences derived from ABCA transporters.
  • the present invention also relates to recombinant non-human mammals in which said ABCA transporter is inactivated, as well as to their applications.
  • ABC transporters constitute a superfamily of highly conserved proteins involved in the membrane transport coupled with the hydrolysis of ATP, of a large number of substrates (ions, amino acids, peptides, sugars, vitamins and steroid hormones , for example).
  • a functional ABC transporter requires a symmetrical association of these four protein domains; the specificity of the molecules transported is determined by the transmembrane domains, while the energy required for transport is provided by the degradation of ATP at the level of the NBD.
  • ABC transporter family (ATP binding cassette), in mammals the ABCA subgroup, was described in 1994, following the identification of the prototype transporter ABCA1 (MF Luciani et al., Genomics, 1994, 21, 150-159).
  • the transporters of the ABCA subgroup include a highly hydrophobic domain (HH1 domain included in the regulatory domain R), located between the two halves of the protein ( Figures 1, 2 and 3).
  • ABCAl ABCA2
  • ABCA3 ABCAR
  • the ABCA1 mouse gene is schematically illustrated in FIG. 1: it comprises more than 100 kb on chromosome 4A5-B3 and is divided into 49 coding exons.
  • the organization of these exons and the correspondence between the exons and the different domains of the ABCAl transporter are also illustrated in Figure 1.
  • a cross-analysis of the organization of the genes of different ABCA transporters shows maximum conservation in the regions coding for NBD (NBDl and NBD2: ATP binding cassette) and the transmembrane domains (TD1 and TD2) ( Figures 2 and 3), while the region coding for the regulatory domain, exhibits great variability in the positions of the splicing sites and in the number of exons: 10 exons for ABCA2, 13 for ABCAl, 12 for ABCAR.
  • the known ABCA transporters At the level of the amino acid sequence, the known ABCA transporters have an identity of between 45 and 66%. Comparative analysis of the hydrophobicity pads also reveals similar profiles.
  • the TD domains include the 6 transmembrane zones as well as the aforementioned intermediate loops. This corresponds for the transporter ABCAl to residues 630-846 for the N-terminal transmembrane zones (TDl: transmembrane segments 1-6: exons 14-16) and to residues 1647-1877 for the C-terminal transmembrane zones (TD2: transmembrane segments 7-12: exons 36-40) ( Figure 3).
  • NBDs extend, in the transporter ABCAl for example, from amino acid 885 to amino acid 1152, for the N-terminal sequence (NBDl: exons 17-22) and from amino acid 1919 to amino acid 2132 for the C-terminal sequence (NBD2: exons 42-47).
  • NBDl amino acid 885 to amino acid 1152
  • NBD2 amino acid 1919 to amino acid 2132 for the C-terminal sequence
  • An analysis of the conservation of NBD sequences shows an identity between 55% and 66% (average 59%) for NBDl and between 57% and 69% (average 65%) for NBD2.
  • Table II A more detailed analysis of the conservation of NBDs leads to a definition of patterns unique to the ABCA family, presented in Table II below. Table II
  • At least three other ABCA patterns can also be defined:
  • ABCA transporters are found in mammals as well as in plants, insects and even lower organisms.
  • ABCAl has been associated with the process of taking up cells in apoptosis (MF Luciani et al., EMBO J., 1996, cited above). ; however, the precise molecular function exerted by the ABC transporter during encapsulation is unknown.
  • ABC transporters have also been associated with pathologies; in the ABCA transport subgroup, currently only ABCR has been clearly associated with the pathogenesis of degenerative eye diseases. The inventors have now found that the transporters of the ABCA subgroup are capable of intervening directly in the control of the lipid composition of the membrane.
  • the subject of the present invention is a recombinant non-human mammal carrying at least one allele of the gene coding for an inactivated ABCA type transporter.
  • inactivated gene is understood to mean an altered, modified, inhibited or truncated gene.
  • at least one of the alleles of the gene is truncated at the level of at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDl or ATP micleotide-binding ain omain 1) and / or to the second ATP binding cassette (NBD2).
  • the present invention also relates to the use of said recombinant non-human mammal carrying at least one allele of the gene coding for an inactivated ABCA type transporter, for the selection or screening of products capable of modulating ABCA transporters.
  • heterozygous animals presence of both the wild allele and an inactivated allele, as defined above constitute a model in which the blood level of HDL cholesterol is low; in this context, the stimulation of ABCA transporters leads to a significant increase in HDL particles (restoration of normal HDL cholesterol levels).
  • a subject of the present invention is also the use of cells derived from any tissue of a recombinant non-human mammal for the gene coding for an ABCA-type transporter, which cells are characterized in that they comprise at least one allele of said inactivated gene, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDl or ATP icleotide-binding domain 1) and / or to the second binding cassette ATP (NBD2), for the selection or screening of products capable of modulating ABCA transporters.
  • NBDl or ATP icleotide-binding domain 1 the first ATP binding cassette
  • NBD2 second binding cassette ATP
  • the present invention also relates to a method of screening and selecting molecules capable of modulating, preferably stimulating the ABCA transporters, characterized in that it comprises:
  • the present invention also relates to a vector for the homologous recombination of a gene for a mammalian ABCA-type transporter, characterized in that it comprises a nucleotide sequence derived from a gene coding for an ABCA-type transporter, inactivated, preferably truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDl) and / or to the second ATP binding cassette (NBD2).
  • said gene is truncated at at least one of exons 17 to 22 corresponding to the first ATP binding cassette of the transporter ABCAl.
  • a subject of the present invention is also the use of an expression vector for a mammalian ABCA type transporter, comprising a nucleotide sequence including a gene selected from the group consisting of:
  • the present invention also relates to a vector for expression of an ABCA type transporter, characterized in that it comprises at least one origin of replication in a eukaryotic cell, at least one gene whose expression allows the selection of eukaryotic cells transformed by said vector, an appropriate regulatory sequence, in particular a promoter allowing the expression of a gene for the ABCA type transporter in said eukaryotic cells and a nucleotide sequence containing the gene encoding a wild type or mutated ABCA transporter at least one of the ATP binding cassettes.
  • said nucleotide sequence contains the gene encoding an ABCA-type transporter having at least one point mutation at the Walker motif A of the first ATP binding cassette.
  • said nucleotide sequence contains the gene coding for an ABCA type transporter having at least one point mutation in each of the Walker A motifs of the two ATP binding cassettes.
  • said nucleotide sequence is selected from the group consisting of genomic sequences and cDNAs encoding the transporters ABCAl to ABCA4 and ABCAX.
  • said nucleotide sequence is selected from the group consisting of the genomic sequences SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 33 and the cDNA sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 32 coding the ABCAX transporter.
  • the present invention also relates to eukaryotic host cells obtained by genetic transformation, characterized in that they are transformed by an expression vector as defined above. Such cells have their level of expression of the transporter increased compared to their basal level. Some of said cells thus overexpress said transporter; “overexpression” means any expression greater than the natural level of expression of said transporter.
  • These eukaryotic host cells are preferably HeLa cells stably transfected with an expression vector as defined above and for example characterized in that it consists of an appropriate origin of replication, of a gene for resistance to an antibiotic of a suitable promoter, in particular of the SV40 viral promoter, of a nucleotide sequence containing the gene coding for a wild-type or mutated ABCA type transporter, of a polyadenylation site, for example derived from the SV40 virus, and optionally a reporter gene, for example the gene encoding the protein GFP (green fluorescence protei).
  • an expression vector as defined above and for example characterized in that it consists of an appropriate origin of replication, of a gene for resistance to an antibiotic of a suitable promoter, in particular of the SV40 viral promoter, of a nucleotide sequence containing the gene coding for a wild-type or mutated ABCA type transporter, of a polyadenylation site, for example derived from the SV40 virus,
  • a subject of the present invention is also a method for producing recombinant non-human mammals, in particular recombinant mice carrying at least one allele of the gene coding for an inactivated ABCA type transporter, at at least the first cassette.
  • ATP binding (NBDl) characterized in that:
  • an allele of the gene encoding an ABCA type transporter is truncated at at least one of the exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDl) and / or to the second binding cassette to ATP (NBD2);
  • NBDl first ATP binding cassette
  • NBD2 second binding cassette to ATP
  • Said modified sequence is introduced into a segment of the genomic DNA of said non-human mammal, associated with an appropriate marker, so as to obtain a sequence marked M, containing said truncated allele;
  • the said sequence M is integrated, in vitro, into the stem cells of germ line of embryos of said non-human mammal by transfection and the cells having said allele are selected by homologous recombination events; then
  • said selected stem cells are reinjected into an embryo reimplanted in a non-human mammal of the same type in order to obtain chimeric animals;
  • the present invention also relates to a kit or kit for evaluating a substance capable of modulating ABCA transporters, characterized in that it comprises:
  • a cell culture selected from the group consisting of cells from at least one recombinant non-human mammal carrying at least one allele of the gene coding for an ABCA type transporter, truncated at least one exons corresponding to the first ATP binding cassette (NBDl) and or to the second ATP binding cassette (NBD2) and the transformed eukaryotic cells as defined above; and
  • the present invention also relates to an ABCA type transporter, characterized in that it is selected from the group consisting of the sequences selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 1, the sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 32 or SEQ ID NO: 33 and the sequences which have at least 95% identity with a polypeptide encoded by one of said sequences.
  • the subject of the present invention is a method of screening and selecting molecules capable of modulating the ABCA transporters, characterized in that it comprises:
  • the present invention also relates to a mutated ABCA transporter, characterized in that it has at least one point mutation at one of the ATP binding cassettes, preferably at the Walker motif A.
  • the present invention further relates to reagents for detecting nucleotide sequences specific for ABCA type transporters, characterized in that they are selected from the group consisting of sequences of 15 to 50 nucleotides amplifying the fragments encoding the sequences specific for ABCA transporter, as defined in Table II. Mention may be made, for example, of the sequences SEQ ID NO: 30 and 31.
  • the introns are indicated by black lines; preserved patterns are indicated by shaded areas; HS: hot spot; S: region switch; A: Walker A; B: Walker B; C: active transport signature.
  • the bottom rectangle illustrates a comparison of the organization of an NBDl or a NBD2 typical of the ABCA type transporter. 1: ABCAl; 2: ABCA2; X: ABCA7; R: ABCAR; FIG. 3 illustrates the conservation of the structure of the ABCA gene, for four different ABCA transporters at the level of the transmembrane domains (TD1: N-terminal; TD2: C-terminal);
  • FIG. 4 represents the predictive topology of the transporter ABCAl, considered as the prototype of the subgroup of transporters of type ABCA;
  • FIG. 4A illustrates a topological model comprising two symmetrical halves, interrupted by an R domain (regulatory domain).
  • the highly hydrophobic HHl segment is in the form of a hairpin crossing the membrane twice. Each half is made up of a set of six transmembrane elements and an ATP binding cassette;
  • FIG. 4B illustrates an alternative topological model in which the highly hydrophobic segment HHl crosses only once the membrane (from the inside to the outside, this leads to an asymmetrical structure comprising a large extracellular loop followed by an odd number transmembrane elements in the second half of the transporter;
  • FIG. 7 illustrates the basic vector (Lyl .41oxP21.1) used for the construction of the recombination or targeting vector (ABClloxP-BN8), obtained in FIG. 7;
  • FIGS. 6 and 7 illustrate the strategies for cloning fragments of homologies in 5 ′ (FIG. 6) and in 3 ′ (FIG. 7);
  • FIG. 8 illustrates the origin of the fragments of homologies used;
  • FIG. 9 shows the establishment of mice with zero ABCAl phenotype:
  • Figure 9a shows the genomic organization of part of the locus ABCAl (wild allele), the structure of the targeting vector and the predicted structure of the mutant allele. The exons are in black and the restriction sites indicated are the following; E: EcoRI, B: BamHI, H: HindIII. The position of the probe (HindIII fragment of 500 bp) used for genotyping and the size of the BamHI fragments on the wild allele and on the mutant allele are indicated.
  • FIG. 9b illustrates the genotyping of ABCA1 wild type (+ / +), heterozygous (- / +) and homozygous (- / -) mice by Southern blot analysis on DNA digested with BamHI.
  • the probe corresponds to the homologous recombination region located 5 ′ (see FIG. 9a); FIG. 9c shows that the ABCAl - / - mice do not express the ABCAl transcript.
  • Northern blot analysis on the RNA of liver of ABCA1 wild type (+ / +), heterozygous (- / +) and homozygous (- / -) mice effectively shows an absence of transcripts in mice - / - .
  • the probe used is a PstI fragment of cDNA located downstream of the homologous recombination region. The position of the ribosomal RNA is indicated.
  • FIG. 10 represents the reduction in the transmembrane mobility of phosphatidylserine (PS) in ABCAl KO (- / -) mice evaluated by; a prothrombinase test (figure 10a, upper panel), by the analysis of micro-vesiculation (figure 10a, lower panel), by the movements of the PS and the PC marked in spin (figure 10c, upper panel and lower, respectively) on red blood cells, and by the kinetics of PS exposure on embryonic fibroblasts (FIG. 10c).
  • PS phosphatidylserine
  • the red blood cells obtained from wild mice + / +, ABCAl +/- and ABCAl - / - are analyzed in the basal state (columns in black) or after stimulation with A23187 (0.5 ⁇ M: thick hatching columns; 1 ⁇ M: fine hatching columns).
  • Prothrombinase test the values obtained expressed in nM of PS equivalents exposed on the surface of 10 red blood cells, are as follows: 5.89 ⁇ 1.8 for - / -, 5, 84 ⁇ 1.2 for +/- and 8.53 ⁇ 2.7 for + / + in the basal state; 5.5 ⁇ 0.49 for - / -, 14.21 ⁇ 2.2 for +/- and 15.67 ⁇ 3.9 for + / + at 0.5 ⁇ M A23187 and 7.93 ⁇ 2, 1 for - / -, 17.1 ⁇ 1.7 for +/- and 22.5 ⁇ 6 for + / + at 1 ⁇ M of A23187.
  • FIG. 10a (lower panel): Evaluation in flow cytometry of the microvesiculation of the plasma membrane.
  • the values in% of microvesicles are: 2.59 ⁇ 1.2 for - / -, 4.6 ⁇ 1.3 for +/- and 4.5 ⁇ 1.2 for + / + in the basal state; 2.56 ⁇ 1.1 for - / -, 5.5 ⁇ 1.9 for +/- and 9.1 ⁇ 3.3 for + / + at 0.5 ⁇ M of A23187 and 4.5 ⁇ 2, 2 for - / -, 6.1 ⁇ 2.1 for +/- and 14.97 ⁇ 5.2 for + / + at 1 ⁇ M of A23187
  • FIG. 12 illustrates the specific efflux of spin-labeled choline and cholesterol from mouse embryonic fibroblasts + / + or - / -.
  • a significant reduction in lipid efflux towards the specific ApoAI acceptor and not towards BSA (control) is observed in the absence of a functional ABCAl transporter in mice - / -.
  • FIGS. 13 to 21 illustrate the expression and the functional characterization of the transporter ABCAl and of its mutants of the NBD domain in HeLa cells (stable transfectants):
  • FIG. 13 strategy for obtaining an ABCA1 / GFP construct,
  • FIG. 14 schematic representation of the plasmid pBI ABCA1 / GFP
  • FIG. 15 schematic representation of the ABCA1 / GFP (AG) constructions and its mutants (KM, MK and MM)
  • FIG. 16 schematic representation of the KM, MK and MM mutants
  • FIG. 17 immunoprecipitation (A and B) and immunoblotting (C) of the ABCA1 / GFP proteins and mutants (band at around 250kDa, indicated by the arrow),
  • FIG. 18 cellular localization of the ABCAl transporter in the transfectants by confocal microscopy.
  • A AG; D: MK; E: KM, F: MM).
  • FIG. 19 Modification of the exposure of phosphatidylserine on the surface of the plasma membrane by the expression of a functional ABCAl transporter.
  • Figure 19B after a calcium shock, the redistribution of phosphatidylserine is increased in the presence of the functional ABCAl transporter (AG) compared to the control transfected by the vector alone (mock).
  • the mutants MK, KM and MM have a behavior equivalent to the control,
  • FIG. 20 Encapsulation of thymocytes in apoptosis (stained with 7AAD) by the transfectants expressing ABCAl (AG). Analysis by confocal microscopy of sections XY and XZ shows that the apoptotic bodies are completely surrounded by a plasma membrane expressing ABCAl.
  • Figure 20A and 20B (upper panel): images in the XY plane.
  • Figure 20B (middle panel and bottom panel): corresponding images in the XZ plane,
  • FIG. 22A represents the complete sequence of the genomic DNA of the transporter ABCAX (or ABCA7) corresponding to SEQ ID NO: 33; it comprises SEQ ID NO: 2 plus the first 8852 nucleotides of the 5 'end of the gene; FIG.
  • 22B represents the sequence of the cDNA of the transporter ABCAX (or ABCA7) corresponding to the sequence SEQ ID NO: 32; it includes SEQ ID NO: 1 plus the sequence of the first 7 exons of the ABCAX (or ABCA7) gene.
  • FIG. 23 shows the mapping of the ABCAX (or ABCA7) gene with the sequences of the intron-exon junctions.
  • the cells are harvested either from in vitro or ex vivo culture or freshly isolated from mice and placed at a final concentration of 10 7 cells / ml in RPMI culture medium.
  • a fluorophore FITC, PE or Cy5
  • FITC fluorophore
  • a solution A 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl, 10 mM HEPES, pH 7.4
  • the calcium ionophore A23187 (concentration varying between 0.01 ⁇ M and 10 ⁇ M) is added to the cell suspension and the variations in attachment of annexin V to the surface of the cells are recorded by interval of time varying between 100 ms and 1 sec.
  • the kinetic parameters of annexin V fixation are calculated from the processing of registration data. Measurement of phospholipid movements between the lipid sheets of the plasma membrane of mouse erythrocytes
  • Erythrocytes are prepared from mouse blood samples taken by cardiac or retroorbital puncture. After elimination of the lymphocytes, the erythrocytes are washed and suspended at a hematocrit concentration of 30% in potassium buffer A (120 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 10 mM glucose, 20 mM sucrose, 1 mM MgCl 2 , 10 mM Hepes, pH 7.4). The high concentration of K + is necessary to avoid the effect of Gardos in redistribution experiments. .
  • potassium buffer A 120 mM KCl, 30 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 10 mM glucose, 20 mM sucrose, 1 mM MgCl 2 , 10 mM Hepes, pH 7.4
  • phospholipid probes labeled in spin spin labeled
  • spin labeled with a short ⁇ chain (C5) carrying a nitroxide probe
  • PS * l-palmitoyl-2- (4-doxylpentanoyl) -sn-glycero-3-phosphoserine
  • PC * l-palmitoyl-2- (4-doxylpentanoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine
  • the cells are incubated at 0 ° C, for 5 min, in buffer A containing 4 ⁇ M A21387 and 10 ⁇ mol / L of PS * or PC * then the cells are replaced at 37 ° C.
  • aliquots are diluted in the presence of 2% bovine serum albumin (BSA) devoid of fatty acid and kept for 1 minute on ice.
  • BSA bovine serum albumin
  • Residual resonance intensity of the electronic spin field, attributable to the probe located in the internal sheet, is measured with an ER 200D ESR spectrometer (Brucker) and expressed as a percentage of the measurements carried out on aliquots in the absence of BSA and ferricocyanate.
  • the quantity of PS * on the internal sheet at 20 min reflects the activity of the amino-phospholipid translocase.
  • calcium is added (final concentration of 2 mM) and the redistribution associated with the exposure of PS * and PC * to the surface of the outer membrane sheet is observed for 1 h at 37 ° C. Note that after the addition of calcium a low degree of hemolysis is observed with the cells of the mice - / -, +/- and + / +.
  • the cells are lysed after 2 rinses with PB S in a 0.2% SDS solution.
  • the dry lipid pellet is taken up in chloroform / methanol (1: 1, v / v) and the desired quantity (in equivalent of ⁇ g of proteins) deposited on a silica thin layer chromatography (TLC) plate.
  • TLC thin layer chromatography
  • the migration is carried out with a hexane / Et 2 O / AcOH solvent (80: 20: 1, v / v).
  • the revelation is carried out by an 8 second bath in MnCl 2 then heating for 30 minutes at 110 ° C.
  • the analysis of the plate is done in relation to standards by reading the fluorescence emitted following excitation by a mercury lamp. The three peaks are cholesterol (FC), triglycerides (TC), cholesterol ester (CE).
  • the dry lipid pellet is taken up in chloroform / methanol (1: 1 v / v) and the desired quantity (in equivalent of ⁇ g of proteins) deposited on a silica thin layer chromatography (TLC) plate.
  • TLC thin layer chromatography
  • the migration is carried out with a methanol / chloroform / MeAc / N-Prop / 0.25% KCl solvent (10: 25: 25: 25: 9, v / v).
  • the revelation takes place by a 12 second bath in 4 " CuSO and heating for 10 minutes at 110 ° C then 15 min at 170 ° C.
  • the analysis of the plate is done in relation to standards - by reading the fluorescence emitted following excitation by a mercury lamp.
  • SPM sphingomyelin
  • PC phosphatidylcholine
  • PS phosphatidylserine
  • PI phosphatidylinositol
  • PE phosphatidylethanolamines
  • PG phosphatidylglycerol
  • EXAMPLE 2 ABCAl mice in which the ABCAl gene is inactivated: heterozygous mice (- / +) and homozygous mice (- / -).
  • the basic vector (Lyl.41oxP21.1) is derived from the vector pKO (X. Morin et al., Neuron, 1997, 18, 3, 411-423) containing the G418 resistance gene (Neo) from the vector pMCINeoPolyA (STRATAGENE) flanked 5 'from a multiple cloning site and separated 3' from the HSV-Tk cassette by a BamHI site.
  • a loxP site derived from the pZ30 vector and excised Xhol-Sall was added upstream of the Neo gene in the Xhol site (FIG. 5). Genomic fragments of homologies
  • BamHI-NotI fragment an 11.5 kb BamHI-NotI fragment was used.
  • BamHI is located in intron 22 and Notl is an artificial cloning site from phage lambda FIXII and would be located in intron 30.
  • This fragment has been modified by adding a loxP site (in the same orientation as the site vector loxP) in the SphI site located 5.5 kb from the BamHI end (FIGS. 7 and 8). Origin of the fragments of homologies and details of the construction ( Figure 8):
  • This vector pBKS-HindIII-EcoRI has been modified by replacing the EcoRI-SacI region with the linker: AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO: 3) TTAAGAGCTCGCCGGCGAAGCTTCTCGA (SEQ ID NO: 4)
  • This linker contains an Xhol site used to excise the HindIII-EcoRI fragment of 1.8 kb for the Clal-Xhol cloner in the digested recombination vector Clal-Xhol oligonucleotides used to make the linker:
  • AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO: 3) CTTCGAAGCGGCCGCTCGAG (SEQ ID NO: 5)
  • the BamHI-NotI fragment was excised from phage lambda 3.1 (ends: in intron 16 and in intron 30) resulting from the same targeting as above.
  • the NotI site is an artificial site of the lambda vector FIXII which makes it possible to excise the insert of the vector.
  • This fragment was cloned into pBKS digested BamHI and NotI.
  • This vector pBKS-BamHI-Notl was modified by adding a loxP site (with a Spel site) in the Sphl site using the linker:
  • Oligonucleotides used to make the linker CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO: 6) and CACTAGTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCATG (SEQ ID NO: 8)
  • Oligonucleotides used to make the linker GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO: 9) GGACGCGTGGATCC (SEQ ID NO: 11)
  • the initial 11.5 kb BamHI-NotI fragment could therefore be excised BamHI and cloned into the homologous recombination vector containing the 5 'homology region.
  • the vector was linearized Clal before electroporation in the cells
  • the homologous recombination resulting from this electroporation allows a replacement of 5.7 kb of the genomic DNA of ABCAl, or 910 bp of coding sequence corresponding to part of exon 17 and all of exons 18 , 19, 20, 21 and 22, by the Neo gene ( Figure 9).
  • the genotype obtained is verified by PCR and by Southern blot analysis of the DNA digested with BamHI and hybridized with a probe located outside the homologous recombination region.
  • the size of the restriction fragments is 6.8 kb for the wild-type allele and 4.4 kb for the mutant allele (FIGS. 9a and 9b).
  • genotyping by PCR is carried out using two pairs of oligonucleotides:
  • the clones resistant to G418 / gancyclovir are screened by Southern blot analysis and the ES cells carrying the truncated allele are microinjected into embryos at the blastocyte stage 3.5 days. The crossing of chimeras leads to a generation of heterozygous descendants crossed with each other for the production of homozygous - / - mutants. 1-2 Results
  • the mutant allele ABCAL obtained does not include 5 exons encoding the ATP binding cassette age and part of the carrier of the regulatory domain ( Figure 9b).
  • mice carrying the mutant allele in the homozygous state do not express the ABCA1 mRNA (FIG. 9c).
  • the measurement of the prothrombinase activity or the measurement of microvessulation makes it possible to measure the quantity of PS exposed on the surface of the outer layer of the membrane.
  • the measurement of the prothrombinase activity which reproduces the physiological triggering of the generation of thrombin by phosphatidylserine, in the coagulation cascade is an indirect measurement of the amount of PS on the surface of the outer layer of the plasma membrane.
  • mice The exposure of phosphatidylserine to the surface of the red cells of mice was carried out according to the protocol described by Toti et al. (Blood, 1996, 87, 1409-1415) and adapted to the red cells of mice.
  • the results (triplicate averages) are expressed in nM equivalents of PS exposed by 10 6 red cells taken from 4 week old animals, stimulated for 1 h at 37 ° C., in the presence of 2 mM of extracellular calcium and of the indicated concentrations of the ionophore of calcium A23187.
  • the PS equivalents were calculated with reference to a standard curve obtained with liposomes of known concentration and lipid composition.
  • the degree of microvesiculation of the plasma membrane is the consequence of the budding of the membrane induced by an increase in PS in the outer layer. This was measured by flow cytometry on red cells stimulated by a calcium ionophore. The values corresponding to the percentage of microvesicles were determined after defining an appropriate window according to Toti et al. , supra. The sampling and stimulation conditions are identical to those used for the measurement of prothrombinase activity. Analysis of the appearance of PS on the external sheet of the plasma membrane of ABCAl cells - / - (Annexin V binding test)
  • the embryonic fibroblasts the cells are dissected manually from the + / + and - / - embryos, taken at 13.5 days of development, according to conventional protocols, resuspended in DMEM medium supplemented with 10% FCS and seeded in culture dishes. After two passages in culture, the cells are detached and resuspended in annexin V binding buffer. The analysis is carried out as in Example 1 except that the recording time is 15 min. Measurement of phospholipid movements between the lipid sheets of the plasma membrane of mouse erythrocytes
  • Red cells are taken from 4-week-old animals and the measurement of the movements of PS * and PC * marked in spin, between the sheets of the plasma membrane is measured by spectrometry according to the protocol presented in Example 1. Determination of cholesterol, plasma triglycerides and phospholipids
  • Red cells are taken from 4-week-old animals and the quantity of PS exposed on the external sheet of the plasma membrane is evaluated, by measuring the prothrombinase activity (FIG. 10a, upper panel) and measuring the microvesiculation by flow cytometry. ( Figure 10a, lower panel), in basal conditions and after stimulation with a calcium ionophore.
  • FIG. 10a shows that in the basal state, an equivalent quantity of PS is exposed on the surface of the cells of the mice + / +, +/- and - / -.
  • the response to the calcium ionophore is radically different; while the cells of the mice + / + and +/- show an increase in the exposure of PS of 270%, no increase is observed for the red cells of the mice - / - in the presence of 0.5 ⁇ M A23187 and a 34% increase is observed in the presence of 1 ⁇ M A23187 (for mice - / - and + / + we observe respectively: 5.89 ⁇ 1.8 and 8.53 ⁇ 2.7 nM PS equivalent in basal state and 7.93 ⁇ 2.1 and 22.5 ⁇ 6 in the presence of 1 ⁇ M A23187).
  • the upper panel of FIG. 10b shows that the activity of the amino-phospholipid translocase, responsible for the physiological maintenance of the asymmetry of the PS between the internal and external sheets of the plasma membrane, is normal since equilibrium (20 min), equivalent quantities of PS are distributed in the internal sheet of the mouse cells + / + (85.7%), +/- (84.1%) and - / - (86.9%) .
  • the lipid composition measured by the cholesterol / phospholipid ratios and by thin layer chromatography is equivalent for the three types of mouse.
  • mice - / - were specific for the ABCAl transporter deficiency and not a consequence of the significant modifications in the lipid profiles of the plasmas of the ABCAl - / - mice.
  • the exposure of the PS was studied on other mouse cells - / -, not derived from blood, embryonic fibroblasts.
  • the annexin V binding kinetics of embryonic fibroblasts presented in FIG. 10c shows that 76% of fibroblasts + / + (upper panel) and only 30%) of fibroblasts - / - (lower panel) exhibit PS in response to calcium stress (10 ⁇ M A23187).
  • the results show that the lack of mobilization of the PS observed is specific to the deficiency in the ABCAl transporter. 2-2-3 ABCAl - / - mice have a severe HDL plasma deficiency
  • the HDLs are practically completely absent from the serum of the ABCAl - / - mice and, moreover, the total cholesterol is significantly reduced.
  • ABCAl +/- mice exhibit an intermediate phenotype which may reflect a gene-dependent effect.
  • the serum triglyceride levels in the ABCAl - / - mutants are significantly high compared to those observed in wild type + / + mice and in ABCAl +/- mice.
  • EXAMPLE 3 Obtaining and functional characterization of stable transfectants for ABCAl and its mutants of ATP binding cassettes (NBDl or NBD2). 1. Preliminary constructions
  • the complementary DNA coding for the ABCAl protein was constructed from overlapping phage clones ⁇ l3C, ⁇ lOF and ⁇ 8a4 in the prokaryotic cloning vector pBluescript KS +/- (STRATAGENE).
  • the EcoRI / HindIII fragment of phage ⁇ lOF (nucleotides 2568-5665) was cloned upstream of the HindIII / Xbal fragment of phage ⁇ 8q4 (nucleotides 5666-6916) previously cloned HindIII / Xbal in pBluescript KS +/- (KS 8a4 wt).
  • the construct obtained (ks 108 wt) received the NgoMI / EcoRI fragment from the clone ⁇ l3C containing the 5 'region of ABCAl (nucleotides 1-2567) allowing the entire cDNA of ABCAl to be reconstituted.
  • the final construction (KS ABCAlwt) was excised Notl / Apal and cloned into the vector pSP64TN poly (A), modified version of the vector pSP64T ⁇ oly (A) (F. Becq et al., J. Biol.
  • the NotI / Bspl20I fragment of wild type (wt) pSP64TN ABCAl containing all of the ABCAl cDNA was inserted into the NotI site in the second multiple cloning site (MCS II) of the pBI vector (pBI ABCAl wt) .
  • the pBI ABCA1 / GFP construction (FIG. 14) was obtained in 3 steps: The Xba site of the MCS of KS 108 wt was deleted by enzymatic cleavage of the NotI and Spel sites, followed by the filling of their 5 ′ end projecting with the Klenow fragment of the DNA polymerase I of £. coli (Pharmacia).
  • the KS 108 / GFP construct was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction, overlapping extension technique (VALLEJO et al., Page 603 and sv. In PCR Primers, Ed CW Dieffenbach GS Dveksler, CHSL press, 1995). technique is based on the use of 4 oligonucleotides (A, B, C, D) during two amplification series ( Figure 13):
  • Primer A 5 'sense oligonucleotide, specific for the 3' region of
  • the first series of PCRs was carried out on the one hand with primers A and B on the KS 108 ⁇ XbaI matrix and on the other hand with primers C and D on the pEGFP matrix (Clontech), under the following conditions; 1min 30 sec at 95 ° C, 30 sec at 54 ° C and 2min at 72 ° C (30 cycles).
  • Primers B and C being complementary, the amplification products AB and CD can pair and serve as a new template for a second amplification with primers A and D.
  • the product PCR AD obtained was then cloned in the site BsrGI / Xbal of the vector KS 108 ⁇ XbaI. The construction was checked by sequencing (T7 sequencing Kit, Pharmacia).
  • the point mutations of ABCAl were carried out in the preliminary in the vector pSP64TN ABCAl wt. They consisted in mutating the lysine into methionine of the Walker A motif (GAGKS) of each of the two ATP cassettes of ABCAl.
  • GAGKS Walker A motif
  • the mutation of the lysine of the second ATP cassette was carried out by simple PCR by taking advantage of the presence of the Hpal site near the region to be mutated.
  • the amplification was carried out on the pSP64TN ABCAl wt matrix.
  • K1892R A construction equivalent to pSP64TN ACB 1 KM was carried out according to the same procedure, with the distinction of the nature of the mutation consisting in replacing the lily in arginine (AAG ⁇ AGG).
  • a construct aimed at deleting the HH1 segment and part of the regulatory domain was generated by PCR by overlap extension using pSP64TN ABCAl wt as template.
  • the AD fragment generated is introduced into the BssHII / Hpal site of pSP64TN ABCAl wt to replace the wt fragment.
  • the construction obtained (pSP64TN ABCAl KG) is sequenced then digested Bstl 1071 / NruI and religated on itself (pSP64TN ABCAl ⁇ HH1): the deletion is 132 bp, ie 44aa.
  • a construct aimed at deleting the regulatory domain (R) was generated by PCR by overlap extension using pSP64TN ABCAl wt as a template for amplification.
  • B 3 ′ antisense containing 4 mutations (including one silent) introducing a point mutation (L1554T) creating a single site MIuI in bold underlined: GGTTGGCACGCGTAATGGCA ne: 4848-4866 (SEQ ID NO: 28)
  • C 5 ′ complementary sense of B : TGCCATTACGCGTGCCAACC ne: 4866-4848 (SEQ ID NO: 29)
  • D ABCAl specific 3 'antisense: ne: 6049-6033
  • the AD fragment generated is introduced into the BssHII / Hpal site of pSP64TN ABCAl wt to replace the wt fragment.
  • the construction obtained (pSP64TN ABCAl LT) is sequenced then digested BssHII / MIuI and religated on itself (pSP64TN ABCAl ⁇ R). The deletion is 1848 bp or 616 aa.
  • the DNAs of the recombinant plasmids carrying the different constructs were purified according to the so-called polyethylene glycol purification method following the conventional alkaline lysis protocol (MANIATIS et al.).
  • the Preparations obtained are stored in 20 ⁇ g aliquots at -80 ° C in 0.3 M sodium acetate, 100% ethanol.
  • the cells used are HeLa tet-off cells (Clontech), cultured in complete DMEM medium (supplemented with fetal calf serum (FCS) 10%) penicillin / streptomycin 50Ul / ml at 37 ° C 7.5%> CO.
  • FCS fetal calf serum
  • the commercial cells were amplified and frozen in FCS 90%, DMSO 10%> on passage 2 and 3 at the rate of 2 ⁇ 10 6 cells per ampoule and stored in liquid nitrogen.
  • the pellet is gently decanted under a cell hood.
  • the pellet should not dry too much, it is quickly resuspended in 8 ⁇ l of sterile H O millipore at a concentration of 2.5 ⁇ g / ⁇ l.
  • 2.5 ⁇ g of DNA are mixed with 100 ng of pTK-Hyg (1/50) (Clontech), a vector possessing the hygromycin resistance gene used as a selection agent during the establishment phase of stable transfectants.
  • the DNA mixture is incubated for 15 min. with 5 ⁇ l of Fugene ® previously diluted in 100 ⁇ l of DMEM without FCS or antibiotics.
  • the cells were washed 3 times in complete DMEM and incubated overnight in 900 .mu.l of complete DMEM to which were added 100 .mu.l mixture Fugene ® / DNA.
  • the cells are usually selected around two weeks, leading to the appearance of cell clones which are subcultured by means of cloning cylinders and then transferred to 96-well plates in order to start their expansion (96 wells / 24 wells / 6 wells / 50 ml flask ).
  • the clones are screened by flow cytometry (FACscan Becton-Dickinson): during expansion, two wells of 6 are seeded with half of a well of 24 (previous passage). One of the two wells of 6 is intended for freezing the clone (pending). The second is unhooked in EDTA trypsin.
  • the cell pellet obtained after inactivation of the trypsin is rinsed twice in PBS IX without Ca 2+ and without Mg 2+ and then the cells are fixed in PBS IX solution, 1% PAF>, 5 mM EDTA. The cells are then analyzed according to two criteria: the intensity of the fluorescence and the clonality of the cell population.
  • results obtained are then confirmed by direct or indirect immunofluorescence and by immunoprecipitation with a rabbit antiserum specific for a recombinant protein portion of the first ATP cassette of ABCAl (ser 16: 1/500) and optionally with an anti-GFP antibody ( Boehringer Manheim, FRG).
  • a well of 6 containing approximately 10 6 cells labeled overnight using the 35 S Express (NEN, France) is washed in cold PBSIX. The cells are lysed on ice for 30 'in buffer A with Triton (100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X 100).
  • the cells are centrifuged 5 '1500 rpm 4 ° C and the post nuclear supernatant is then cleaned three times for 30' with stirring at 4 ° C with 100 ⁇ l of Protein A Sepharose ® (PAS) (50%> v / v in Buffer A without newt) in order to eliminate the background fixing noise.
  • PAS Protein A Sepharose ®
  • the cleaned supernatant is then incubated for one hour in the presence of serum 16 (l / 500 th ) and then 100 ⁇ l of PAS.
  • the pellet of PAS- Antibody- Antigen is then washed three times in buffer A with triton, three times in buffer A without newt.
  • the complexes are then solubilized in Laemmli buffer for SDS-PAGE supplemented with 8 M urea.
  • the samples are denatured 5 'at 50 ° C. and loaded on a 6% SDS-PAGE gel.
  • the band revealed is ⁇ 250 kDa (ABCAl ⁇ 220 + GFP ⁇ 30).
  • pBI ABCAl wt the screening was carried out by Western blot with the Serum 16.
  • a well of 6 containing approximately 10 6 cells is. washed in cold PBSIX.
  • the cells are lysed on ice for 30 'in buffer A with triton.
  • the cells are centrifuged at 5 '1500 rpm 4 ° C.
  • the protein quantity of the post nuclear supernatant is quantified according to the Lowry method (Kit Blorad).
  • the membrane revealed in culvert red is then saturated with PBS IX, Milk 5%, Tween 20 0.1%> for one hour at room temperature.
  • the membrane is then incubated overnight in PBSIX, Milk 1%>, Tween 20 0.1%> in the presence of serum 16 (l / 500 th ).
  • the membrane is then washed 5 times in PBSIX, Tween 20 0.1% and then incubated with a secondary antibody (anti-rabbit goat coupled to peroxidase 1/1000 th ) for one hour at room temperature.
  • the membrane is again washed 5 times in PBSIX, Tween 20 0.1%.
  • the membrane is revealed with the ECL Kit (Pharmacia).
  • the clones are screened according to the intensity of the band appearing at 220 kDa relative to a control sample.
  • the clonality is verified by immunofluorescence (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996, cited above).
  • the HeLa line was chosen to establish stable transfectants overexpressing different constructs of the ABCAl protein because it has a low endogenous expression of ABCAl.
  • Stable transfectants corresponding to the wild-type ABCAl construct (wt) and to the C-terminal fusions of GFP either with the wild-type ABCAl protein (AG), or with lysine substitution mutants of each or of the two motifs A of Walker methionine, designated respectively MK, KM and MM ( Figure 15 and Figure 16) were screened according to their direct or indirect fluorescence intensity (ABCAl wt)
  • Clones having equivalent levels of expression of the ABCAl protein were selected by immunoprecipitation and by immunoblotting with an anti-ABCAl antibody and optionally with an anti-GFP antibody (FIG. 17).
  • the fusion proteins have an apparent molecular weight (> 250 kDa) greater than that of the wild-type ABCAl protein.
  • Fluorescence microscopy and confocal microscopy are carried out using permeabilization methods adapted for each antibody, according to conventional techniques known to those skilled in the art.
  • the exposure of PS was evaluated by the measurement in flow cytometry of the binding of the labeled annexin V (annexin V-Cy5), according to protocols known to those skilled in the art. Labeling of the recombinant annexin was produced using the Cy-5-difunctional reactive dye kit (Amersham, United Kingdom).
  • the binding kinetics of annexin V in the basal state (1: 1000 in 10 mM Hepes buffer, pH 7.4; 140 mM NaCl; 2.5 mM CaCl) were recorded at lsec intervals, for 16 min, with FACScalibur (Becton-Dickinson), on 0.5 10 cells freshly peeled off with a PBS-EDTA solution.
  • Apoptotic thymocytes were prepared according to techniques known to those skilled in the art. After 6 h of ⁇ irradiation, the thymocytes were marked with 7AAD [20 ⁇ g / ml of 7-amino-actinomycin (Molecular Probes, United States), for 15 min at room temperature] and seeded with an excess of a factor 20 out of 2 10 5 Hela cells previously cultured overnight on glass slides. After 2 h of incubation at 37 ° C, the slides are washed extensively in medium and fixed in 4%> PFA in phosphate buffer pH 7.2. Two section imaging channels along xy and xz planes were carried out using a confocal microscope (Leica).
  • the lipid effluxes are measured according to the protocol described in Example 1.
  • GFP (AG) revealed equivalent profiles, demonstrating that GFP does not modify the localization of the protein.
  • Confocal microscopy analysis located the ABCAl protein on the plasma membrane with a homogeneous patch distribution which does not correspond to a preferential localization at the level of cell junctions (FIG. 18A).
  • the fluorescence is not modified as a function of the cell attachment substrate (fibronectin, collagen, thrombospondin or vibronectin).
  • the AG transfectant made it possible to colocalize the ABCA1 protein with CD 14, the glypated LPS receptor which is also involved. as in the encapsulation of dead cells and is localized at the level of the membrane microdomains.
  • ABCAl is also visualized in a perinuclear region corresponding to the Golgi ( Figure 18A) as well as in a vesicular compartment (Figure 18B) in which it is partially collocated with markers from the endolysosomal compartment such as Lampl ( Figure 18C).
  • Figure 18D, 18E and 18F is identical to that of AG ( Figure 18A), demonstrating that these mutations do not affect the folding or intracellular routing of the protein and that these transfectants are therefore suitable tools for functional dissection ABCAl-induced phenotypes.
  • PS phosphatidylserine
  • the double mutant MM shows effluxes comparable to those observed for the control (specific efflux of tritiated choline of 0.375%> ⁇ 0.1 1 and specific efflux of cholesterol 14 C of 0.26%> ⁇ 0.07).
  • the simple KM and MK mutants show an intermediate phenotype for the two lipid species.
  • the results show that the expression of the ABCAl transporter on the surface of the plasma membrane simultaneously affects the uptake and the lipid efflux, two cellular functions which had not been linked.
  • the expression of the mutants shows that these two functions require an intact ABCA transporter because they are simultaneously abolished when the NBD domain is inactivated and loses the ATP binding and hydrolysis capacity.
  • Detection tools can be obtained based on the specific patterns identified in Table II.
  • pairs of degenerate oligonucleotides targeting the sequences encoding said motifs make it possible to amplify genomic regions or cDNAs by PCR amplification.
  • the strategy exploits the conservation of the position of the introns, among the different ABCA transporters, each pair of primers being adjacent to an exon-intron limit.
  • the expected amplification product is a multiple band scale resulting from the amplification of the corresponding genes.
  • the expected result of the amplification is a single band containing different sequences from each of the transporters expressed in the cell or the tissue of interest.
  • the PCR conditions are as follows, for 30 cycles: denaturation 5 min at 95 ° C for the first cycle and 1 min 30 for the others, followed by hybridization at 54 ° C for 1 min and elongation at 72 ° C for 5 min (Figure 24).

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Abstract

Méthode de criblage de médicaments aptes à moduler le transporteur ABCA et ses applications. Vecteurs de recombinaison homologue et vecteurs d'expression d'un transporteur ABCA, cellules eucaryotes les contenant et séquences spécifiques issues de transporteurs ABCA. Transporteurs ABCAX.

Description

NOUVELLES APPLICATIONS DES TRANSPORTEURS DE TYPE ABCA.
La présente invention est relative à une méthode de criblage de médicaments aptes à moduler le transporteur ABCA ainsi qu'à ses applications.
La présente invention est également relative à des vecteurs de recombinaison homologue et à des vecteurs d'expression d'un transporteur ABCA, à des cellules eucaryotes et à des séquences spécifiques issues de transporteurs ABCA.
La présente invention est également relative à des mammifères non- humains recombinants dans lesquels ledit transporteur ABCA est inactivé, ainsi qu'à leurs applications. De manière générale, les transporteurs ABC constituent une superfamille de protéines hautement conservées impliquées dans le transport membranaire couplé à l'hydrolyse de l'ATP, d'un grand nombre de substrats (ions, acides aminés, peptides, sucres, vitamines et hormones stéroïdes, par exemple).
Les protéines ABC sont caractérisées par la présence : - de deux cassettes de liaison à l'ATP ( TP Binding Cassette ou domaine de liaison nucléotidique à l'ATP (NBD ou ATP πucleotide-èinding cfomain)), hautement conservées dans la famille des transporteurs ABC et comprenant chacune un motif A de Walker GX4GK(S/T), un motif B de Walker (R/K)X6-8hyd4D (hyd = résidu hydrophobe) et une séquence SS (signature séquence (L/Y)SGG(Q/M)), située entre le motif A de Walker et le motif B de Walker et
- de deux domaines transmembranaires (TD) comprenant chacun six segments ou boucles transmembranaires (Figure 1).
Un transporteur ABC fonctionnel requiert une association symétrique de ces quatre domaines protéiques ; la spécificité des molécules transportées est déterminée par les domaines transmembranaires, tandis que l'énergie requise pour le transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du NBD.
Un nouveau sous-groupe de la famille des transporteurs ABC (ATP binding cassette), chez les mammifères le sous-groupe ABCA, a été décrit en 1994, suite à l'identification du transporteur prototype ABCA1 (M.F. Luciani et al., Genomics, 1994, 21, 150-159). Les transporteurs du sous-groupe ABCA comprennent un domaine hautement hydrophobe (domaine HH1 inclus dans le domaine de régulation R), localisé entre les deux moitiés de la protéine (figures 1, 2 et 3).
Des études fonctionnelles chez la souris ont montré que le transporteur ABCAl est impliqué dans l'englobement (« engulfment ))) des cellules en apop- tose par les macrophages (M.F. Luciani et al., EMBO J., 1996,15, 226-235 ; Y. Hamon et al., Blood, 1997, 8, 2911-2915).
Des études in vitro ont montré que le transporteur ABCAl humain est régulé, dans les macrophages, par les stérols (T. Langmann et al., BBRC, 1999, 257, 29-33).
A l'heure actuelle, d'autres transporteurs de type ABCA ont été décrits, comme il ressort des données disponibles sur le site www.med.rug.nl/mdl/humanabc.htm et résumées dans le Tableau I ci-après.
Tableau I
Parmi ceux-ci, seuls quatre d'entre eux ont été complètement séquences : ABCAl, ABCA2, ABCA3 et ABCAR, soit chez l'homme, soit chez la souris.
Le gène de souris ABCAl est schématiquement illustré à la figure 1 : il comprend plus de lOOkb sur le chromosome 4A5-B3 et est divisé en 49 exons codants. L'organisation de ces exons et la correspondance entre les exons et les différents domaines du transporteur ABCAl sont également illustrées à la Figure 1.
Une analyse croisée de l'organisation des gènes de différents transporteurs ABCA (ABCAl, ABCAR et ABCA2) montre une conservation maximale dans les régions codant pour les NBD (NBDl et NBD2 : cassette de liaison à l'ATP) et les domaines transmembranaires (TD1 et TD2) (figures 2 et 3), alors que la région codant le domaine de régulation, présente une grande variabilité dans les positions des sites d'épissage et dans le nombre d'exons : 10 exons pour ABCA2, 13 pour ABCAl, 12 pour ABCAR. Cette variabilité se reflète au niveau de la séquence en acides aminés, bien que ses caractéristiques principales se retrouvent dans tous les transporteurs de cette famille : grand nombre de résidus chargés, présence de plusieurs sites de phosphorylation putatifs et présence de la zone hautement hydrophobe (HH1) ; toutefois, bien que la zone HH1 soit toujours présente, sa position varie d'un membre de la famille à l'autre ; par exemple la figure 4 illustre deux configurations possibles.
Au niveau de la séquence en acides aminés, les transporteurs ABCA connus présentent une identité comprise entre 45 et 66 %. L'analyse comparative des plots d'hydrophobicité révèle également des profils similaires.
Les domaines TD (domaine transmembranaire) incluent les 6 zones transmembranaires ainsi que les boucles intermédiaires précitées. Ceci correspond pour le transporteur ABCAl aux résidus 630-846 pour les zones transmembranaires N-terminales (TDl : segments transmembranaires 1-6 : exons 14-16) et aux résidus 1647-1877 pour les zones transmembranaires C-terminales (TD2 : segments transmembranaires 7-12 : exons 36-40) (Figure 3).
Une analyse plus précise des séquences TD parmi les différents transporteurs ABC de type A montre un plus grand degré de conservation dans le second groupe (TD2) malgré un degré faible de conservation de la séquence primaire lorsque l'on compare les séquences TD aux séquences NBD (taux d'identité moyen : 44 % pour TDl et 53 % pour TD2). Ceci est particulièrement frappant pour les TM 7, 9 et 10 qui présentent une identité supérieure à 50 %.
En ce qui concerne les NBD, ils s'étendent, dans le transporteur ABCAl par exemple, de l'acide aminé 885 à l'acide aminé 1152, pour la séquence N- terminale (NBDl : exons 17-22) et de l'acide aminé 1919 à l'acide aminé 2132 pour la séquence C-terminale (NBD2 : exons 42-47). Une analyse de la conservation des séquences NBD montre une identité comprise entre 55 % et 66 % (moyenne 59 %) pour NBDl et entre 57 % et 69 % (moyenne 65 %) pour NBD2. Une analyse plus fine de la conservation des NBD conduit à une définition de motifs uniques à la famille ABCA, présentés dans le Tableau II ci-après. Tableau II
Dans ce Tableau II, les acides aminés en gras correspondent aux zones conservées dans tous les transporteurs ABC, les points correspondent aux résidus non-conservés et les résidus en caractères normaux sont conservés dans les transporteurs de type ABCA.
On peut observer une conservation élevée des résidus d'acide aminé entourant soit les glycines conservées du motif A de Walker, soit l'aspartate du motif B de Walker ; des conservations similaires se retrouvent à la fois dans NBDl et dans NBD2.
Au moins trois autres motifs ABCA peuvent également être définis :
- la région autour du résidu histidyle, en aval du motif B de Walker est hautement conservée (switch #162) - le cluster de résidus autour de la glutamine +50 par rapport au motif A de Walker (#50) et
- la région dite « hot spot », qui correspond à la position DF508 dans CFTR (hot spot).
Les transporteurs ABCA se retrouvent aussi bien chez les mammi- fères que chez les plantes, les insectes et mêmes les organismes inférieurs.
Parmi les membres du sous-groupe des transporteurs ABCA, ABCAl a été associé au processus d'englobement des cellules en apoptose (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996, précité). ; toutefois la fonction moléculaire précise exercée par le transporteur ABC pendant l'englobement n'est pas connue. Les transporteurs ABC ont également été associés à des patholo- gies ; dans le sous-groupe des transporteurs ABCA, actuellement seul ABCR a été associé, de manière claire à la pathogénèse des maladies dégénératives de l'œil. Les Inventeurs ont maintenant trouvé que les transporteurs du sous- groupe ABCA sont susceptibles d'intervenir directement dans le contrôle de la composition en lipides de la membrane.
En fait, à la fois chez les souris ABCAl knock-out et chez des cellules eucaryotes transfectantes surexprimant un transporteur de type ABCA (ABCAl, par exemple), on observe une mobilité membranaire modifiée des phospho- lipides.
Ces éléments ont conduit les Inventeurs à mettre au point un modèle adapté au criblage de molécules aptes à stimuler spécifiquement les transporteurs de type ABCA ; de tels transporteurs interviennent ainsi dans le contrôle de la composition lipidique des membranes et ensuite dans le contrôle de l'efflux de ces lipides vers le plasma. Il en résulte une modification des taux de lipide plasmatiques, étroitement liée au risque d'athérosclérose. Une modulation de l'activité des transporteurs ABCA permet donc un contrôle du risque des maladies cardiovasculaires. La présente invention a pour objet un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé.
On entend par gène inactivé aussi bien un gène altéré, modifié, inhibé ou tronqué. Selon un mode de réalisation avantageux desdits mammifères, au moins l'un des allèles du gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl ou ATP micleotide- èinding omain 1) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2).
La présente invention a également pour objet l'utilisation dudit mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA.
En particulier, les animaux hétérozygotes (présence à la fois de l'allèle sauvage et d'un allèle inactivé, tel que défini ci-dessus) constituent un modèle dans lequel le taux sanguin de cholestérol HDL est faible ; dans ce contexte, la stimulation des transporteurs ABCA entraîne une augmentation significative des particules HDL (restauration d'un taux normal de cholestérol HDL). La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu d'un mammifère non-humain recombinant pour le gène codant un transporteur de type ABCA, lesquelles cellules sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un allèle dudit gène inactivé, de préférence, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl ou ATP icleotide-èinding domain 1) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2), pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler, de préférence à stimuler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'extraction d'un échantillon biologique à partir d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) ;
- la mise en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler ;
- la mesure du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et
- la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA. La présente invention a également pour objet un vecteur de recombinaison homologue d'un gène d'un transporteur de type ABCA de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique issue d'un gène codant un transporteur de type ABCA, inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2). Conformément à l'invention, ledit gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons 17 à 22 correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP du transporteur ABCAl .
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA de mammifère, comprenant une séquence nucléotidique incluant un gène sélectionné dans le groupe constitué par :
- le gène sauvage d'un transporteur de type ABCA et
- les gènes d'un transporteur de type ABCA, mutés au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP (NBDl ou NBD2), pour la transformation génétique d'une cellule eucaryote convenable.
Lesdits gènes mutés permettent notamment l'expression de protéines ABCA non-fonctionnelles utiles pour tester la spécificité des substances sélectionnées avec les modèles knock-out tels que définis ci-dessus. La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication dans une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection des cellules eucaryotes transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée, notamment un promoteur permettant l'expression d'un gène du transporteur du type ABCA dans lesdites cellules eucaryotes et une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA pré- sentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker de la première cassette de liaison à l'ATP.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit vecteur, ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau de chacun des motifs A de Walker des deux cassettes de liaison à l'ATP. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques et les ADNc codant les transporteurs ABCAl à ABCA4 et ABCAX.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :33 et les séquences d'ADNc SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :32 codant le transporteur ABCAX.
La présente invention a également pour objet des cellules eucaryotes hôtes obtenues par transformation génétique, caractérisées en ce qu'elles sont trans- formées par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus. De telles cellules voient leur niveau d'expression du transporteur augmenté par rapport à leur niveau basai. Certaines desdites cellules surexpriment ainsi ledit transporteur ; par « surexpression » on entend toute expression supérieure au niveau naturel d'expression dudit transporteur. Ces cellules eucaryotes hôtes sont de préférence des cellules HeLa transfectées de manière stable par un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus et par exemple caractérisé en ce qu'il est constitué d'une origine de réplication appropriée, d'un gène de résistance à un antibiotique d'un promoteur adapté, notamment du promoteur viral SV40, d'une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté, d'un site de polyadénylation, par exemple dérivé du virus SV40, et éventuellement d'un gène rapporteur, par exemple le gène codant la protéine GFP (green fluorescence protei ).
La présente invention a également pour objet une méthode de production de mammifères non-humains recombinants, notamment des souris recom- binantes porteuses d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, au niveau d'au moins la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl), caractérisée en ce que :
- l'on tronque un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) ; - l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique dudit mammifère non-humain, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle tronqué ;
- l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons dudit mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des événements de recombinaison homologue ; puis
- l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifère non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques ; et
- l'on obtient à la génération FI des mammifères non-humains, des souris par exemple, recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains (des souris par exemple) recombinés homozygotes, reconnaissables à la présence du marqueur. La présente invention a également pour objet un kit ou trousse d'évaluation d'une substance apte à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules sélectionnée dans le groupe constitué par les cellules issues d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) et les cellules eucaryotes transformées telles que définies ci-dessus ; et
- des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du transporteur de type ABCA.
La présente invention a également pour objet un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences sélectionnées dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO: l, la séquence SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:32 ou la SEQ ID NO:33 et les séquences qui présentent au moins 95 % d'identité avec un polypeptide codé par l'une desdites séquences. En variante, la présente invention a pour objet un procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'administration à au moins un mammifère non-humain recombi- nant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP et ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) d'au moins une substance à cribler ;
- l'extraction d'un échantillon biologique à partir dudit mammifère non-humain ;
- la mesure in vitro du flux membranaire de lipides (phospholipides et ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon biologique ; et
- la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA.
La présente invention a également pour objet un transporteur ABCA muté, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation ponctuelle au niveau de l'une des cassettes de liaison à l'ATP, de préférence au niveau des motif A de Walker. La présente invention a en outre pour objet des réactifs de détection de séquences nucléotidiques spécifiques des transporteurs de type ABCA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences de 15 à 50 nucléotides amplifiant les fragments codant les séquences spécifiques au transporteur ABCA, telles que définies dans le Tableau II. On peut citer par exemple, les séquen- ces SEQ ID NO: 30 et 31.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la correspondance entre la structure génomique du gène ABCAl et des domaines de la protéine correspondante ; - la figure 2 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des NBD (NBDl = N-terminal ; NBD2 = C-terminal). La structure génomique comparée des quatre transporteurs ABCA est illustrée. Les limites des domaines sont indiquées et correspondent aux exons intéressants. Les introns sont indiqués par des lignes noires ; les motifs conservés sont indiqués par des zones ombrées ; HS : hot spot ; S : switch région ; A : Walker A ; B : Walker B ; C : signature de transport active. Le rectangle du bas illustre une comparaison de l'organisation d'un NBDl ou d'un NBD2 typique du transporteur de type ABCA. 1 : ABCAl ; 2 : ABCA2 ; X : ABCA7 ; R : ABCAR ; - la figure 3 illustre la conservation de la structure du gène ABCA, pour quatre transporteurs ABCA différents au niveau des domaines transmembranaires (TDl : N-terminal ; TD2 : C-terminal) ;
- la figure 4 représente la topologie prédictive du transporteur ABCAl, considéré comme le prototype du sous-groupe de transporteurs de type ABCA ; la figure 4A illustre un modèle topologique comprenant deux moitiés symétriques, interrompues par un domaine R (domaine de régulation). Le segment hautement hydrophobe HHl se présente sous la forme d'une épingle à cheveux traversant deux fois la membrane. Chaque moitié est composée d'un ensemble de six éléments transmembranaires et d'une cassette de liaison à l'ATP ; la figure 4B illustre un modèle topologique alternatif dans lequel le segment hautement hydrophobe HHl ne traverse q'une fois la membrane (de l'intérieur vers l'extérieur, ceci conduit à une structure asymétrique comprenant une grande boucle extracellulaire suivie d'un nombre impair d'éléments transmembranaires dans la seconde moitié du transporteur ;
- les figures 5 à 8 représentent les étapes de construction du vecteur de recombinaison homologue utilisé pour la préparation de souris knock-out pour le transporteur ABCA : la figure 5 illustre le vecteur de base (Lyl .41oxP21.1) utilisé pour la construction du vecteur de recombinaison ou de ciblage (ABClloxP-BN8), obtenu à la figure 7; les figures 6 et 7 illustrent les stratégies de clonage des fragments d'homologies en 5' (figure 6) et en 3' (figure 7) ; la figure 8 illustre l'origine des fragments d'homologies utilisés ;
- la figure 9 représente l'établissement de souris de phénotype ABCAl nul : la figure 9a montre l'organisation génomique d'une partie du locus ABCAl (allèle sauvage), la structure du vecteur de ciblage et la structure prédite de l' allèle mutant. Les exons sont en noir et les sites de restriction indiqués sont les suivants ; E : EcoRI, B : BamHI, H : HindIII. La position de la sonde (fragment HindIII de 500 pb) utilisée pour le génotypage et la taille des fragments BamHI sur l' allèle sauvage et sur l' allèle mutant sont indiqués. La figure 9b illustre le génotypage des souris ABCAl de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) par analyse en Southern blot sur de l'ADN digéré par BamHI. La sonde correspond à la région de recombinaison homologue située en 5' (voir figure 9a) ; la figure 9c montre que les souris ABCAl -/- n'expriment pas le transcrit ABCAl . L'analyse en Northern blot sur de l'ARN de foie de souris ABCAl de type sauvage (+/+), hétérozygotes (-/+) et homozygotes (-/-) montre effectivement une absence de transcrits chez les souris -/-. La sonde utilisée est un fragment PstI d'ADNc situé en aval de la région de recombinaison homologue. La position de l'ARN ribosomal est indiquée.
- la figure 10 représente la réduction de la mobilité transmembra- naire de la phosphatidylsérine (PS) dans les souris ABCAl KO (-/-) évaluée par ; un test à la prothrombinase (figure 10a, panneau supérieur), par l'analyse de la micro- vésiculation (figure 10a, panneau inférieur), par les mouvements de la PS et de la PC marquées en spin (figure 10c, panneau supérieur et inférieur, respectivement) sur des hématies, et par la cinétique d'exposition de la PS sur des fibroblastes embryonnaires (figure 10c).
Les globules rouges obtenus à partir de souris sauvages +/+, ABCAl +/- et ABCAl -/- sont analysées à l'état basai (colonnes en noir) ou après stimulation au A23187 (0,5 μM : colonnes hachurage épais ; 1 μM : colonnes hachurage fin).
- figure 10a (panneau supérieur) : Test à la prothrombinase : les valeurs obtenues exprimées en nM d'équivalents PS exposés à la surface de 10 globules rouges, sont les suivantes : 5,89 ± 1,8 pour -/-, 5,84 ± 1,2 pour +/- et 8,53 ± 2,7 pour +/+ à l'état basai; 5,5 ± 0,49 pour -/-, 14,21 ± 2,2 pour +/- et 15,67 ± 3,9 pour +/+ à 0,5 μM d'A23187 et 7,93 ± 2,1 pour -/-, 17,1 ± 1,7 pour +/- et 22,5 ± 6 pour +/+ à l μM d'A23187. - figure 10a (panneau inférieur) : Evaluation en cytométrie de flux de la microvésiculation de la membrane plasmique. Les valeurs en % de microvésicules sont : 2,59 ±1,2 pour -/-, 4,6 ± 1,3 pour +/- et 4,5 ± 1,2 pour +/+ à l'état basai ; 2,56 ± 1,1 pour -/-, 5,5 ± 1,9 pour +/- et 9,1 ± 3,3 pour +/+ à 0,5 μM d'A23187 et 4,5 ± 2,2 pour -/-, 6,1 ± 2,1 pour +/- et 14,97 ± 5,2 pour +/+ à 1 μM d'A23187
- figure 10b : Evaluation des mouvements des phospholipides PS (panneau supérieur)) et PC (panneau inférieur) entre les deux feuillets lipidiques : - panneau supérieur (PS*) : carré noir (+/+) et triangle noir (-/-) : à
20 min 86,9 % de PS pour (-/-) et 85,7 % de PS pour +/+ sont distribués au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique. Après un stress au calcium (A23187, 2 mM à t=20 min) 23,7 % de PS pour +/+ et 9,9 % de PS pour -/- migrent vers le feuillet externe. Le mouvement net global est diminué de 41,7 % chez les souris -/- et par rapport aux animaux de type sauvage.
- panneau inférieur (PC*) : carré blanc (+/+) et triangle blanc(- ). La redistribution de PC n'est pas modifiée chez les souris ABCAl-/- (valeurs à t=40 min ; 40 % pour +/+ et 39 % pour -/-). Chaque courbe est la moyenne de 3 expériences effectuées sur des échantillons différents de sang. - figure 10c : panneau supérieur (+/+), panneau inférieur (-/-) ; cinétique d'exposition de PS à la surface de fibroblastes embryonnaires après un stress en présence de 10 μM A23187. Une expérience sur trois est présentée, la flèche montre l'exposition de PS à l'état basai. 76 % des cellules +/+ et seulement 30 % des cellules -/-expriment la PS au bout de 15 min. - la figure 11 illustre l'évolution des paramètres lipidiques (cholestérol, HDL et triglycérides) chez les souris -/-, -/+ et +/+.
- la figure 12 illustre l'efflux spécifique de choline et de cholestérol marqués en spin à partir des fibroblastes embryonnaires de souris +/+ ou -/-. Une réduction significative d'efflux de lipides vers l'accepteur spécifique ApoAI et non vers la BSA (contrôle) est observée en l'absence de transporteur ABCAl fonctionnel chez les souris -/-.
- les figures 13 à 21 illustrent l'expression et la caractérisation fonctionnelle du transporteur ABCAl et de ses mutants du domaine NBD dans des cellules HeLa (transfectants stables) : - figure 13 : stratégie d'obtention d'une construction ABCA1/GFP,
- figure 14 : représentation schématique du plasmide pBI ABCA1/GFP, - figure 15 : représentation schématique des constructions ABCA1/GFP (AG) et de ses mutants (KM, MK et MM),
- figure 16 : représentation schématique des mutants KM, MK et MM, - figure 17 : immunoprécipitation (A et B) et immunoblotting (C) des protéines ABCA1/GFP et des mutants (bande à environ 250kDa, indiquée par la flèche),
- figure 18 : localisation cellulaire du transporteur ABCAl dans les transfectants par microscopie confocale. (A : AG ; D : MK ; E : KM, F : MM). B et Ç ; les flèches indiquent des vésicules positives dans le compartiment endolysosomal et une colocalisation partielle de la fluorescence de la GFP (B) avec l'immunomarquage de lampl (C),
.- figure 19 : Modification de l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface de la membrane plasmique par l'expression d'un transporteur ABCAl fonctionnel. Figure 19A : Profil en cytométrie de flux de la fixation de l'annexine V à l'état basai. Le rapport des intensités de fluorescence en présence (AG) ou en absence (mock) du transporteur ABCAl fonctionnel est de 1,4 + 0,12, n=3. Figure 19B : après un choc calcique, la redistribution de la phosphatidylsérine est augmentée en présence du transporteur ABCAl fonctionnel (AG) par rapport au témoin transfecté par le vecteur seul (mock). Les mutants MK, KM et MM ont un comportement équivalent au témoin,
- figure 20 : Englobement des thymocytes en apoptose (colorés au 7AAD) par les transfectants exprimant ABCAl (AG). L'analyse en microscopie confocale des sections XY et XZ montre que les corps apoptotiques sont complète- ment entourés de membrane plasmique exprimant ABCAl. Figure 20A et 20B (panneau supérieur) : images dans le plan XY. Figure 20B (panneau du milieu et panneau inférieur) : images correspondantes dans le plan XZ,
- figure 21 : Efflux spécifique de choline et de cholestérol radio- marqués à partir des cellules transfectées par AG, MM ou par le vecteur seul (contrôle). Une augmentation très importante d'efflux vers l'accepteur spécifique ApoAI est induite par l'expression du transporteur ABCAl . - la figure 22A représente la séquence complète de l'ADN génomique du transporteur ABCAX (ou ABCA7) correspondant à la SEQ ID NO :33 ; elle comprend la SEQ ID NO :2 plus les 8852 premiers nucléotides de l'extrémité 5' du gène ; la figure 22B représente la séquence de l'ADNc du transporteur ABCAX (ou ABCA7) correspondant à la séquence SEQ ID NO :32 ; elle comprend la SEQ ID NO : 1 plus la séquence des 7 premiers exons du gène ABCAX (ou ABCA7).
- la figure 23 représente la cartographie du gène ABCAX (ou ABCA7) avec les séquences des jonctions intron-exon.
- la figure 24 représente le protocole PCR (exemple 4). EXEMPLE 1 : Mesure des mouvements lipidiques.
Analyse cinétique de l'apparition de phosphatidylsérine sur le feuillet lipidique externe de la membrane plasmique de différents types cellulaires
Les cellules sont récoltées soit à partir de culture in vitro ou ex vivo soit fraîchement isolées à partir de souris et placées à une concentration finale de 107 cellules/ml en milieu de culture RPMI. Pour chaque point de cinétique, la fixation à la surface des cellules, de l'annexine V conjuguée avec un fluorophore donné (FITC, PE ou Cy5) est enregistrée en fonction du temps par cytométrie de flux ; environ 106 cellules sont incubées à l'équilibre avec une concentration saturante d'annexine V conjuguée au fluorophore dans une solution A (NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4). A l'instant initial, l'ionophore de calcium A23187 (concentration variant entre 0,01 μM et 10 μM) est ajouté à la suspension cellulaire et les variations de fixation de l'annexine V à la surface des cellules sont enregistrées par intervalle de temps variant entre 100 ms et 1 sec. Les paramètres cinétiques de la fixation de l'annexine V sont calculés à partir du traitement des données d'enregistrement. Mesure des mouvements de phospholipides entre les feuillets lipidiques de la membrane plasmique des érythrocytes de souris
Les érythrocytes sont préparés à partir d'échantillon de sang de souris prélevés par ponction cardiaque ou rétroorbitale. Après élimination des lymphocytes, les érythrocytes sont lavés et suspendus à une concentration d'hématocrite de 30 % dans du tampon potassium A (120 mM KCl, 30 mM NaCl, 0,1 mM EGTA, 10 mM glucose, 20 mM sucrose, 1 mM MgCl2, lO mM Hepes,pH 7,4). La concentration élevée de K+ est nécessaire pour éviter l'effet de Gardos dans les expériences de redistribution. .
Pour analyser les mouvements de phospholipides, les sondes phospholipidiques marquées en spin (spin labelled) avec une courte chaîne β (C5) portant une sonde nitroxyde ; PS* (l-palmitoyl-2-(4-doxylpentanoyl)-sn-glycéro-3- phosphosérine, et PC* (l-palmitoyl-2-(4-doxylpentanoyl)-sn-glycéro-3-phosphocho- line), en solution dans le chloroforme, sont séchées et resuspendues dans le tampon A. Les cellules sont incubées à 0°C, pendant 5min, dans le tampon A contenant 4 μM A21387 et 10 μmol/L de PS* ou de PC* puis les cellules sont replacées à 37°C. Il en résulte une incorporation de la sonde dans le feuillet externe de la membrane plasmique à une concentration finale de 1 % des lipides totaux et la distribution transmem- branaire de la sonde est évaluée par la technique de « l'échange en retour ». A différents intervalles de temps, des fractions aliquotes sont diluées en présence de 2% d'albumine sérique bovine (BSA) dépourvue d'acide gras et conservées 1 minute sur la glace. La sonde phospholipidique extraite du feuillet membranaire externe par la BSA est réduite en présence de ferricyanate. L'intensité résiduelle de résonance du champ électronique de spin, attribuable à la sonde localisée dans le feuillet interne, est mesurée avec un spectromètre ER 200D ESR (Brucker) et exprimée en pourcentage des mesures réalisées sur des fractions aliquotes en l'absence de BSA et de ferri- cyanate.
La quantité de PS* sur le feuillet interne à 20 min reflète l'activité de l'amino-phospholipide translocase. A cet instant, le calcium est ajouté (concentration finale de 2mM) et la redistribution associée à l'exposition de PS* et de PC* à la surface du feuillet membranaire externe est observée pendant lh à 37°C. A noter qu'après addition de calcium un faible degré d'hémolyse est observé avec les cellules des souris -/-, +/- et +/+.
Mesure des efflux de lipides à partir de cellules en culture
Des cellules transfectées en tapis subconfluents ont été marquées pendant 24h dans du milieu sans sérum supplémenté avec 0,5% de BSA et contenant l,5μCi de 14C-Cholesterol (Amersham) et lOμCi de 3H-chlorure de choline
(Amersham). Après un lavage dans du PBS-0,5%BSA, les efflux ont été réalisés pendant 16h vers un milieu sans sérum, supplémenté avec 0,5% de BSA, contenant ou non lOμg/ml d' ApoAI (Sigma). Les surnageants cellulaires ont été récoltés et les tapis cellulaires ont été lysés dans 0,2% de SDS. Les lipides ont été extraits selon les techniques décrites ci-après. La radioactivité contenue dans les échantillons de surna- géants et de cellules a été mesurée par comptage de la scintillation en phase liquide. Le pourcentage d'efflux est le rapport comptage surnageant /(comptage surnageant + comptage cellules). Chaque point est mesuré en quadruple pour chaque expérience.
Lvse des cellules
La lyse des cellules s'effectue après 2 rinçages au PB S dans une solution 0,2 % SDS.
Extraction lipidique
0,8 ml de lysat sont mélangés à 3 ml de Blight and dyer (chloro- forme/méthanol 1 :2, v/v) et laissé reposer 1 heure. Après l'addition d' 1 ml d'H2O et
1 ml de chloroforme, l'échantillon est vortexé 15 secondes et centrifugé à température ambiante 10 à 20 min. à 4000 rpm. La phase inférieure (organique) est pipetée et le chloroforme évaporé dans un speed vacuum. Le tube sec se garde à -20°C.
Détermination de la concentration de cholestérol
Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1 :1, v/v) et la quantité voulue (en équivalent de μg de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un solvant hexane/Et2O/AcOH (80:20:1, v/v). La révélation se fait par un bain de 8 secondes dans du MnCl2 puis chauffage 30 minutes à 110°C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards par lecture de la fluorescence émise suite à l'excitation par une lampe à mercure. Les trois pics sont cholestérol (FC), triglycérides (TC), ester de cholestérol (CE).
Dosage des phospholipides
Le culot de lipide sec est repris dans du chloroforme/méthanol (1 :1 v/v) et la quantité voulue (en équivalent de μg de protéines) déposée sur une plaque de chromatographie en couche mince (CCM) de silice. La migration s'effectue avec un solvant méthanol/chloroforme/MeAc/N-Prop/0,25 % KCl (10:25:25:25:9, v/v). La révélation se fait par un bain de 12 secondes dans du CuSO4 " et chauffage 10 minutes à 110°C puis 15 min à 170°C. L'analyse de la plaque se fait par rapport à des standards- par lecture de la fluorescence émise suite à l'excitation par une lampe de mercure. Les différents pics sont sphingomyéline (SPM), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylsérine (PS), phosphatidylinositol (PI) ; les phosphatidyléthanolamines (PE) et le phosphatidylglycérol (PG) ne peuvent pas être dissociés.
EXEMPLE 2 : Souris ABCAl dans lesquelles le gène ABCAl est inactivé : souris hétérozygotes (-/+) et souris homozygotes (-/-).
1- Stratégie d'inactivation par recombinaison homologue du gène ABCAl murin 1.1 Matériels et méthodes Les fragments d'ADN génomiques utilisés pour construire le vecteur de recombinaison homologue sont tous issus de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129/sv clone dans le vecteur lambda FIXII. Vecteur de recombinaison
Le vecteur de base (Lyl.41oxP21.1) est dérivé du vecteur pKO (X. Morin et al., Neuron, 1997, 18, 3, 411-423) contenant le gène de résistance au G418 (Neo) issu du vecteur pMCINeoPolyA (STRATAGENE) flanqué en 5' d'un site multiple de clonage et séparé en 3' de la cassette HSV-Tk par un site BamHI.
Un site loxP issu du vecteur pZ30 et excisé Xhol-Sall a été rajouté en amont du gène Neo dans le site Xhol (figure 5). Fragments génomiques d'homologies
En 5' : un fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb a été utilisé. HindIII est localisé dans l'intron 15 et EcoRI en position 2636 dans l'exon 17 (figures 6 et 8).
En 3' : un fragment BamHI-Notl de 11,5 kb a été utilisé. BamHI est localisé dans l'intron 22 et Notl est un site artificiel de clonage issu du phage lambda FIXII et serait situé dans l'intron 30. Ce fragment a été modifié par ajout d'un site loxP (dans la même orientation que le site loxP du vecteur) dans le site SphI situé à 5,5 kb de l'extrémité BamHI (figures 7 et 8). Origine des fragments d'homologies et détails de la construction (figure 8) :
Fragment 5' : un fragment BamHI-BamHI de 6,8 kb a été excisé du phage lambda 13.1 (extrémités : dans l'intron 11 et dans l'intron 23) issu d'un criblage de la banque de STRATAGENE d'ADN génomique de souris de souche 129SV décrite ci-dessus, par une sonde d'ADNc de ABCAl de 875 pb EcoRI-PstI (2636- 351 1). Ce fragment a été clone dans pBKS (STRATAGENE) dans le site BamHI. Ce vecteur pBKS-BamHI a été digéré par EcoRI et HindIII. Le fragment de 1,8 kb a été clone dans pBKS digéré EcoRI et HindIII. Ce vecteur pBKS-HindIII-EcoRI a été modifié par remplacement de la région EcoRI-SacI par le linker : AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) TTAAGAGCTCGCCGGCGAAGCTTCTCGA (SEQ ID NO :4)
Ce linker contient un site Xhol servant à exciser le fragment HindIII-EcoRI de 1,8 kb pour le cloner Clal-Xhol dans le vecteur de recombinaison digéré Clal-Xhol oligonucléotides utilisés pour faire le linker :
AATTCTCGAGCGGCCGCTTCGAAGAGCT (SEQ ID NO :3) CTTCGAAGCGGCCGCTCGAG (SEQ ID NO :5)
Fragment 3 ' : le fragment BamHI-Notl a été excisé du phage lambda 3.1 (extrémités : dans l'intron 16 et dans l'intron 30) issu du même ciblage que précé- demment. Le site Notl est un site artificiel du vecteur lambda FIXII qui permet d'exciser l' insert du vecteur. Ce fragment a été clone dans pBKS digéré BamHI et Notl. Ce vecteur pBKS-BamHI-Notl a été modifié par ajout d'un site loxP (avec un site Spel) dans le site Sphl grâce au linker :
CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO :6) CGTACGTTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATAATGATCACGTAC (SEQ ID NO :7)
Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : CAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTACTAGTGCATG (SEQ ID NO :6) et CACTAGTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCATG (SEQ ID NO :8)
Puis un linker contenant le site BamHI a été introduit à la place de la région Notl-SacII du polylinker de pBKS-BamHI-Notl : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO :9) CCGGCCTAGGTGCGCAGGCG (SEQ ID NO : 10)
Oligonucléotides ayant servi à faire le linker : GGCCGGATCCACGCGTCCGC (SEQ ID NO :9) GGACGCGTGGATCC (SEQ ID NO : 11)
Le fragment BamHI-Notl de 11,5 kb initial a pu donc être excisé BamHI et clone dans le vecteur de recombinaison homologue contenant la région d'homologie 5'. Le vecteur a été linéarisé Clal avant électroporation dans les cellules
ES DBA-252 issues de souris de souche DBA- 1 Lac J. Recombinaison homologue et génotypage
La recombinaison homologue résultante de cette électroporation, en conditions classiques, permet un remplacement de 5,7 kb de l'ADN génomique d' ABCAl, soit 910 pb de séquence codante correspondant à une partie de l'exon 17 et la totalité des exons 18, 19, 20, 21 et 22, par le gène Neo (figure 9).
Le génotype obtenu est vérifié par PCR et par analyse en Southern blot de l'ADN digérée par BamHI et hybridée avec une sonde située hors de la région de recombinaison homologue. La taille des fragments de restriction est de 6,8 kb pour l'allèle sauvage et de 4,4 kb pour l'allèle mutant (figures 9a et 9b).
De manière plus précise, le génotypage par PCR est réalisé par utilisation de deux couples d'oligonucléotides :
(1) un couple qui détecte l'allèle sauvage (environ 800 pb) : oligo KO sens : GGAACCCACTCATCTGAGGC (SEQ ID NO : 12) oligo KO antisens : GGGGACAGACTCCCAGGTTC (SEQ ID NO : 13) et
(2) un couple détectant l'allèle recombiné (environ 2,3 kb) : BglII sens : CACCTCCCCAGGGTGTTGGATAAT (SEQ ID NO : 14) Neo : TGCAATCCATCTTGTTCAATGGCCG (SEQ ID NO : 15) Protocole de la PCR : l-10' à 94°C 2-l ' à 94°C
3-l' à 65°C 4-2'30" à 72°C répéter 2- à 4-, 35 fois En Southern blot : En 5' après digestion de l'ADN génomique par BamHI, une sonde BglII-HindIII de 520pb (BglII dans l'exon 15 en position 2410 et HindIII de clonage dans l'intron 15) détecte un fragment à 6,8 kb pour l'allèle sauvage et 4,4 kb pour l'allèle muté (figure 9). En 3' en utilisant une sonde BglII-Spel de 2,5 kb (BglII dans l'intron 27 et Spel dans l'intron 29). Par digestion de l'ADN génomique avec Spel. La recombinaison a lieu avant le site loxP (contenant un site Spel) : détection d'un fragment de 7,5 kb. Par digestion EcoRI de l'ADN génomique : détection d'une bande de 5,3 kb si la recombinaison s'est produite correctement.
Les clones résistants au G418/gancyclovir sont criblés par analyse en Southern blot et les cellules ES portant l'allèle tronqué sont microinjectées dans des embryons au stade blastocytes 3,5 jours. Le croisement des chimères conduit à une génération de descendants hétérozygotes croisés entre eux pour la production de mutants -/- homozygotes. 1-2 Résultats
L'allèle mutant ABCAl obtenu ne comprend pas les 5 exons codant la lère cassette de liaison ATP et une partie du domaine de régulation du transporteur (figure 9b).
On obtient un phénotype nul ; les souris portant l'allèle mutant à l'état homozygote n'expriment pas l'ARNm d'ABCAl (figure 9c).
L'analyse des différents croisements hétérozygotes montrent que l'allèle muté ABCAl est transmis de manière mendélienne ; cependant, on observe un biais chez les mutants homozygotes, lié à une mortalité élevée dans les premières semaines (50 des 79 nouveau-nés survivent à 4 semaines dans les proportions suivantes : -/- : 5/21 ; +/- 28/40 ; +/+ 17/18).
A l'autopsie, on observe systématiquement des hémorragies péri- viscérales étendues, uniquement chez les animaux homozygotes. Aucune autre ano- malie morphologique visible macroscopiquement n'a été détectée chez ces animaux. Les femelles homozygotes ne donnent pas de portées, quel que soit le génotype du mâle, en raison d'une anomalie de développement placentaire. Les souris ABCA1-/- sont un peu plus petites comparativement aux individus sauvages de la même portée, de la naissance à l'âge de 8 mois (n=19 paires de sauvage et d'homozygote de même portée).
2- Propriétés des souris ABCAl -/- et +/- 2-1 Matériels et méthodes Mesure de l'activité prothrombinase
La mesure de l'activité prothrombinase ou la mesure de la micrové- siculation permettent de mesurer la quantité de PS exposée à la surface du feuillet externe de la membrane. La mesure de l'activité prothrombinase qui reproduit le déclenchement physiologique de la génération de la thrombine par la phosphatidylsérine, dans la cascade de la coagulation est une mesure indirecte de la quantité de PS à la surface du feuillet externe de la membrane plasmique.
L'exposition de la phosphatidylsérine à la surface des hématies de souris a été réalisée selon le protocole décrit par Toti et al.,(Blood, 1996, 87, 1409- 1415) et adapté aux hématies de souris. Les résultats (moyennes de triplicats) sont exprimés en équivalents nM de PS exposés par 106 hématies prélevées sur des animaux de 4 semaines, stimulées pendant lh à 37°C, en présence de 2 mM de calcium extracellulaire et des concentrations indiquées du ionophore de calcium A23187. Les équivalents PS ont été calculés en référence à une courbe standard obte- nue avec des liposomes de concentration et de composition lipidique connue. Analyse de la microvésiculation
Le degré de microvésiculation de la membrane plasmique est la conséquence du bourgeonnement de la membrane induit par une augmentation de PS dans le feuillet externe. Celui-ci a été mesuré par cytométrie de flux sur des hématies stimulées par un ionophore de calcium. Les valeurs correspondant au pourcentage de microvésicules ont été déterminées après avoir défini une fenêtre appropriée selon Toti et al. , précité. Les conditions de prélèvement et de stimulation sont identiques à celles utilisées pour la mesure de l'activité prothrombinase. Analyse de l'apparition de PS sur le feuillet externe de la membrane plasmique de cellules ABCAl-/- (Test de fixation de l'annexine V)
Les fibroblastes embryonnaires, les cellules sont disséquées manuellement à partir des embryons +/+ et -/-, prélevés à 13,5 jours de développement, selon des protocoles classiques, resuspendues dans du milieu DMEM supplé- menté avec 10% de SVF et ensemencées dans des boîtes de culture. Après deux passages en culture, les cellules sont détachées et resuspendues dans du tampon de fixation de l'annexine V. L'analyse est réalisée comme dans l'exemple 1 mis à part que le temps d'enregistrement est de 15min. Mesure des mouvements de phospholipides entre les feuillets lipidiques de la membrane plasmique des érythrocytes de souris
Des hématies sont prélevées sur des animaux de 4 semaines et la mesure des mouvements de PS* et PC* marquées en spin, entre les feuillets de la membrane plasmique est mesurée par spectrométrie selon le protocole présenté dans l'exemple 1. Dosage du cholestérol, des triglycérides et des phospholipides plasmatiques
L'extraction et le dosage du cholestérol, des triglycérides et des phospholipides plasmatiques sont réalisées selon les protocoles décrits dans l'exemple 1.
Mesure des efflux de lipides à partir des fibroblastes embryonnaires
Les mesures sont effectuées selon le protocole décrit dans l'exemple 1 , sur des fibroblastes embryonnaires mis en culture dans les conditions décrites pour le test de fixation de l'annexine V. 2-2 Résultats
2-2-1 La mobilisation transmembranaire de la phosphatidylsérine (PS) des hématies des souris ABCAl -/- . en réponse à un stress calcique est réduite.
Des hématies sont prélevées sur des animaux de 4 semaines et la quantité de PS exposée sur le feuillet externe de la membrane plasmique est évaluée, par mesure de l'activité prothrombinase (figure 10a, panneau supérieur) et mesure de la microvésiculation en cytométrie de flux (figure 10a, panneau inférieur), dans les conditions basales et après stimulation par un ionophore de calcium.
Les résultats montrent que la perte de la fonction ABCAl perturbe les mouvements transmembranaires de lipides après stimulation par le ionophore de calcium A23187.
La figure 10a (panneau supérieur) montre qu'à l'état basai, une quantité équivalente de PS est exposée à la surface des cellules des souris +/+, +/- et -/-. En revanche la réponse au ionophore de calcium est radicalement différente ; alors que les cellules des souris +/+ et +/- montrent une augmentation de l'exposition de PS de 270 %, aucune augmentation n'est observée pour les hématies des souris -/- en présence de 0,5 μM A23187 et une augmentation de 34% est observée en présence de 1 μM A23187 (pour les souris -/- et +/+ on observe respectivement : 5,89±1,8 et 8,53±2,7 nM d'équivalent PS à l'état basai et 7,93±2,1 et 22,5±6 en présence de 1 μM A23187). De plus le contenu en PS des membranes des différentes souches de souris est équivalent (+/+ : 91,5±5 ; +/- : 101,7±-6,8 et -/- : 95,3±64,3 nM d'équivalent PS, n=3 pour chaque type de souris ; le contenu moyen en PS est de 95,6nM d'équivalent PS, n=9 ).
De même l'analyse, en cytométrie de flux, de la microvésiculation membranaire montre sa diminution chez les hématies des souris -/-.
Ces résultats suggèrent un défaut de redistribution des lipides membranaires en réponse à un stress calcique qui évoque le syndrome de Scott, une maladie hémorragique rare dans laquelle la mobilité transmembranaire des lipides en réponse au stress calcique est pour ainsi dire complètement abolie. 2-2-2 La mobilité de la PS* vers le feuillet externe de la membrane plasmique est réduite chez les souris ABCAl-/- (activité de type scramblase . La mobilité de la PS* vers le feuillet interne et la mobilité de la PC* ne sont pas modifiées chez les souris ABCAl-/- (activité de type amino-phospholipide translocase).
Le panneau supérieur de la figure 10b montre que l'activité de l' amino-phospholipide translocase, responsable du maintien physiologique de l'asymétrie de la PS entre les feuillets internes et externes de la membrane plasmique, est normale puiqu'au temps d'équilibre (20 min), des quantités équivalentes de PS sont distribuées dans le feuillet interne des cellules des souris +/+ (85,7 %), +/- (84,1 %) et -/- (86,9 %). La composition lipidique mesurée par les rapports cholesté- rol/phospholipides et par chromatographie en couche mince est équivalente pour les trois types de souris. Cependant après un stress calcique, l'externalisation de la PS est réduite chez les souris homozygotes déficientes -/- (à t=80 min (60 min après le stress calcique), 24 % de PS* des souris +/+ et seulement 9,9 % de PS* des souris -/- sont passées du feuillet interne vers le feuillet externe), (figure 10b, panneau supérieur). Le panneau inférieur de la figure 10b montre que la redistribution de la phosphocholine (PC*) induite par un stress calcique n'est pas affectée (+/+ 40 % et -/- 39 % à t=40 min, n=3). Cette dissociation entre la PC et la PS qui n'est pas observée dans le syndrome de Scott, suggère qu'une partie de l'externalisation de la PS, en présence du calcium cytosolique est associée à un transport sélectif de la PS vers l'extérieur, dépendant du transporteur ABCAl.
Pour confirmer que le phénotype observé chez les souris -/- était bien spécifique de la déficience en transporteur ABCAl et non une conséquence des modifications importantes des profils en lipides des plasmas des souris ABCAl-/-, l'exposition de la PS a été étudiée sur d'autres cellules des souris -/-, ne dérivant pas du sang, les fibroblastes embryonnaires.
La cinétique de fixation de l'annexine V des fibroblastes embryonnaires présentée sur la figure 10c montre que 76% des fibroblastes +/+ (panneau supérieur) et seulement 30%) des fibroblastes -/- (panneau inférieur) exposent de la PS en réponse à un stress calcique (lOμM A23187). Les résultats montrent que le défaut de mobilisation de la PS observé est spécifique de la déficience en transporteur ABCAl. 2-2-3 Les souris ABCAl-/- ont un déficit plasmatique sévère en HDLs
Comme illustré à la figure 11, les HDL sont pratiquement complè- tement absentes du sérum des souris ABCAl -/- et de plus, le cholestérol total est significativement réduit.
Les souris ABCAl +/- présentent un phénotype intermédiaire qui peut refléter un effet gène-dépendant.
Les taux sériques en triglycérides dans les mutants ABCAl -/- sont significativement élevés par rapport à ceux observés chez les souris de type sauvage +/+ et chez les souris ABCAl +/-.
Ces résultats montrent une déficience plasmatique sévère en HDL chez les souris ABCAl -/-.
2-2-4 Les souris ABCA-/- ont un déficit d'efflux de lipides membranaires La figure 12 montre qu'en absence de transporteur ABCAl fonctionnel, les efflux spécifiques des deux types de lipides sont significativement réduits chez les souris ABCA-/- (efflux spécifique de choline tritié : 6,28 % ± 0,63 pour -/- et 10,39% ± 0,63 pour +/+ ; efflux spécifique de cholestérol 1 C : 6,04% ± 0.35 pour -/- et 9,49%) ± 0,54 pour +/+). Les hétérozygotes montrent un phénotype intermédiaire pour les efflux spécifiques de cholestérol.
EXEMPLE 3 : Obtention et caractérisation fonctionnelle de transfectants stables pour ABCAl et ses mutants des cassettes de liaison à l'ATP (NBDl ou NBD2). 1. Constructions préliminaires
L'ADN complémentaire codant pour la protéine ABCAl a été construit à partir des clones phagiques chevauchants λl3C, λlOF et λ8a4 dans le vecteur de clonage procaryote pBluescript KS+/- (STRATAGENE). Le fragment EcoRI/HindIII du phage λlOF (nucléotides 2568-5665) a été clone en amont du fragment HindIII/Xbal du phage λ8q4 (nucléotides 5666-6916) précédemment clone HindIII/Xbal dans pBluescript KS+/- (KS 8a4 wt). La construction obtenue (ks 108 wt) a reçu le fragment NgoMI/EcoRI du clone λl3C contenant la région 5' de ABCAl (nucléotides 1-2567) permettant de reconstituer l'intégralité de l'ADNc de ABCAl. La construction finale (KS ABCAlwt) a été excisée Notl/Apal et clonée dans le vecteur pSP64TN poly(A), version modifiée du vecteur pSP64T ρoly(A) (F. Becq et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 5, 2695-2699) par l'insertion d'un adaptateur (GATCTGGGCCCACTCGAGTTAACG CGGCCGCA) (SEQ ID NO : 16) conférant les sites uniques de clonage Apal, Xhol, Hpal et Notl. La construction finale baptisée pSP64TN ABCAl a servi de base à toutes les constructions dans le vecteur d'expression bidirectionnel et conditionnel pBI (Clontech).
2. Constructions géniques dans le vecteur d'expression eucaryote pBI
2.1. pBI ABCAl wt
Le fragment NotI/Bspl20I de pSP64TN ABCAl de type sauvage (wt) contenant l'intégralité de l'ADNc de ABCAl a été inséré dans le site Notl dans le second site multiple de clonage (MCS II) du vecteur pBI (pBI ABCAl wt).
2.2 pBI ABCA1/GFP
La construction pBI ABCA1/GFP (figure 14) a été obtenue en 3 étapes : Le site Xba du MCS de KS 108 wt a été délété par coupure enzyma- tique des sites Notl et Spel, suivie du remplissage de leur extrémité 5' débordante par le fragment Klenow de la DNA polymérase I d'£. coli (Pharmacia). La construction KS 108/GFP a été obtenue par PCR (Polymérase Chain Reaction, technique d'extension par chevauchement (VALLEJO et al., page 603 et sv. in PCR Primers, Ed C.W. Dieffenbach G.S. Dveksler, CHSL press, 1995). Cette technique repose sur l'utilisation de 4 oligonucléotides (A, B, C, D) au cours de deux séries d'amplification (figure 13) :
L'amorce A, oligonucléotide 5' sens, spécifique de la région 3' de
ABCAl
A : TGAACCAACCACAGGCAT (ABCAl ne 6221-6239) (SEQ ID
NO : 17).
Les amorces B (3' antisens) et C (5' sens), partiellement complémentaires contenant l'extrémité 3' de ABCAl (sans le codon stop) fusionnée avec l'extrémité 5' de EGFP (à partir de l'ATG d'initiation). B : TCGCCCTTGCTCACCATTACATAACTTTCTTTCACTTTC
(GFP ne 17-1 ; ABCAl ne 6798-6786) (SEQ ID NO : 18).
C : ATGGTGAGCAAGGGCGA (GFP ne 1-17) (SEQ ID NO :19). L'amorce D (3' antisens) spécifique de la région 3' de EGFP, contenant une mutation silencieuse du site BsrGI (en gras) le codon stop de la EGFP (en minuscule) et deux sites de clonage additionnels Notl et Xbal soulignés et séparés par / :
D : CTGCTCTAGA/GCGGCCGCTttaCTTATA ( GFP ne 730-722) (SEQ ID NO :20)
La première série de PCR a été réalisée d'une part avec les amorces A et B sur la matrice KS 108ΔXbaI et d'autre part avec les amorces C et D sur la matrice pEGFP (Clontech), dans les conditions suivantes ; 1min 30 sec à 95°C, 30 sec à 54°C et 2min à 72°C (30 cycles). Les amorces B et C étant complémentaires, les produits d'amplification AB et CD peuvent d'apparier et servir de nouvelle matrice pour une seconde amplification avec les amorces A et D. Le produit PCR AD obtenu a été ensuite clone dans le site BsrGI/Xbal du vecteur KS 108ΔXbaI. La construction a été vérifiée par séquençage (T7 sequencing Kit, Pharmacia).
Le fragment Sphl/SphI contenant l'extrémité 3' de ABCAl wt de pBI ABCAlwt a été remplacé par le fragment Sphl/SphI de KS 108/GFPΔXbaI contenant l'extrémité 3' de ABCAl fusionnée à la EGFP pour donner pBI ABCA1/GFP. 2.3. Constructions mutantes
Les mutations ponctuelles de ABCAl ont été réalisées au préliminaire dans le vecteur pSP64TN ABCAl wt. Elles ont consisté à muter la lysine en méthionine du motif Walker A (GAGKS) de chacune des deux cassettes ATP de ABCAl .
2 3.1. K879M
La mutation de la lysine de la première cassette ATP (Lys 879) par extension par chevauchement par PCR suivant la méthode précédemment décrite :
A : ABCAl spécifique : TTGTCCGGACGCTGTTAG (SEQ ID NO :21) B : comportant la mutation Lys (AAG) en MET (ATG) :
GGTGGTGGTCATGCCGGCTCC (SEQ ID NO :22)
C : complémentaire de l'oligo B : GGAGCCGGCATGACCACCACC (SEQ ID
NO :23)
D : ABCAl spécifique : GGGACGATTCCACATCTT (SEQ ID NO :24) Le fragment AD obtenu a été clone EcoRV/BsshII dans pSP64TN
ABCAl wt en remplacement du fragment wt. La construction pSP64TN ABCAl MK a été validée par séquençage.
2.3.2. K1892M
La mutation de la lysine de la seconde cassette ATP (Lys 1892) a été réalisée par PCR simple en tirant avantage de la présence du site Hpal à proximité de la région à muter.
Deux oligonucléotides ont été dessinés.
Oligo 5' sens contenant le site Hpal (souligné) et la mutation ponctuelle (en gras) : GTTAACGGAGCTGGATGTCA (SEQ ID NO :25). Oligo 3' antisens spécifique du vecteur, en aval du codant stop de
ABCAl.
L'amplification a été réalisée sur la matrice pSP64TN ABCAl wt.
Le fragment PCR obtenu a été clone Hpal/Xbal dans pSP64TN myc
(construction contenant l'épitope antigénique c-myc inséré dans le deuxième site BsrGI de ABCAl wt...) en remplacement du fragment équivalent (possédant l'insertion c-myc et pas la mutation). La construction a été criblée positivement avec une sonde ADNc spécifique du fragment ABCAl Hpal/Xbal et négativement avec une sonde spécifique de l'oligo c-myc. La construction obtenue (pSP64TN ABCAl KM) a été validée par séquençage.
2.3.3. K879M, K1892M Le double mutant a été obtenu par insertion du fragment PCR généré pour la réalisation du mutant de la première cassette ATP dans le vecteur pSP64TN ABCAl KM donnant lieu à la construction pSP64TN ABCAl MM vérifiée par séquençage.
2.3.4. K1892R Une construction équivalente à pSP64TN ACB 1 KM a été réalisée suivant le même mode opératoire à la distinction de la nature de la mutation consistant à remplacer la lys en arginine (AAG→AGG).
2.3.5. ΔHH1
Une construction visant à déléter le segment HHl et une partie du domaine régulateur a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCAl wt comme matrice. A : ABCAl spécifique 5' sens : ne : 2778-2795
B : 3' antisens contenant trois mutations (dont deux silencieuses) introduisant une mutation ponctuelle (K1285G) créant un site unique NruI en gras souligné : GAAACCCTÇGCGACTCCGTC : ne 4036-4055 (SEQ ID NO :26)
C : 5' sens complémentaire de B : GACGGAGTCGCGAGGGTTTC : ne 4055-4036
(SEQ ID NO :27)
D : ABCAl spécifique 3' antisens : ne :6049-6033
Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/Hpal de pSP64TN ABCAl wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCAl KG) est séquencée puis digérée Bstl 1071/NruI et religuée sur elle- même (pSP64TN ABCAl ΔHH1) : la délétion est de 132pb soit 44aa.
2.3.6. ΔR
Une construction visant à déléter le domaine régulateur (R) a été générée par PCR par extension par chevauchement en utilisant pSP64TN ABCAl wt comme matrice pour l'amplification. A : ABCAl spécifique 5' sens : ne : 2778-2795
B : 3' antisens contenant 4 mutations (dont une silencieuse) introduisant une mutation ponctuelle (L1554T) créant un site unique MIuI en gras souligné : GGTTGGCACGCGTAATGGCA ne : 4848-4866 (SEQ ID NO :28) C : 5' sens complémentaire de B : TGCCATTACGCGTGCCAACC ne : 4866-4848 (SEQ ID NO :29) D : ABCAl spécifique 3' antisens : ne : 6049-6033
Le fragment AD généré est introduit dans le site BssHII/Hpal de pSP64TN ABCAl wt en remplacement du fragment wt. La construction obtenue (pSP64TN ABCAl LT) est séquencée puis digérée BssHII/MIuI et religuée sur elle- même (pSP64TN ABCAl ΔR). La délétion est de 1848 pb soit 616 aa.
2.4 Constructions mutantes dans pBI
Toutes les constructions obtenues (MK, KM, MM, ΔHH1, ΔR) sont transférées dans pBI ABCAl/GFP en remplaçant le fragment BsrGI/BsrGI de ABCAl par le fragment équivalent des différentes constructions. pBI ABCAl/GFP MK pBI ABCAl/GFP KM pBI ABCAl/GFP MM pBI ABCAl/GFP ΔHH1 pBI ABCAl/GFP ΔR
Une construction supplémentaire a de plus été réalisée en délétant un fragment de 549 pb (position 3122-3671) en aval de la première cassette ATP, en digérant pBI ABCAl/GFP par Pmll puis religué sur lui-même pBI ABCAl/GFP ΔPmlI. 3. Obtention de cellules transfectantes stables pour ABCAL ABCAl/GFP et ses mutants des cassettes de liaison à l'ATP (NBDl et NBD2
3.1 Matériels et méthodes
3.1.1. Procédure de transfection
Les ADN des plasmides recombinanst portant les des différentes constructions ont été purifiés selon la méthode dite de purification au polyéthylène- glycol faisant suite au protocole classique de lyse alcaline (MANIATIS et al.). Les préparations obtenues sont stockées par aliquotes de 20 μg à -80°C en acétate de sodium 0,3 M, éthanol 100%.
Les cellules utilisées sont des cellules HeLa tet-off (Clontech), cultivées dans du milieu DMEM complet (supplémenté en Sérum de veau fœtal (FCS) 10%) pénicilline/streptomycine 50Ul/ml à 37°C 7,5%> CO . Les cellules commerciales ont été amplifiées et congelées en FCS 90%, DMSO 10%> au passage 2 et 3 à raison de 2 x 106 cellules par ampoule et stockées en azote liquide.
La transfection de ces cellules a été réalisée avec le réactif Fugene® (Boehringer). 5 x 105 cellules sont étalées la veille de la transfection dans un puits d'une plaque 6 puits en DMEM complet.
Un aliquot d'ADN plasmidique recombinant est centrifugé pendant 10 min. à 15000 rpm à 4°C.
Le culot est décanté délicatement sous une hotte cellulaire. Le culot ne devant pas trop sécher, il est rapidement resuspendu dans 8 μl de H O millipore stérile à la concentration de 2,5 μg/μl. 2,5 μg d'ADN sont mélangés à 100 ng de pTK- Hyg (1/50) (Clontech), vecteur possédant le gène de résistance à l'hygromycine utilisé comme agent de sélection lors de la phase d'établissement de lignées de transfectants stables.
Le mélange d'ADN est incubé pendant 15 min. avec 5 μl de Fugene® préalablement dilué dans 100 μl de DMEM sans FCS ni antibiotiques.
Pendant ce temps, les cellules sont lavées 3 fois en DMEM complet et incubées pendant la nuit dans 900 μl de DMEM complet auxquels ont été rajoutés les 100 μl du mélange Fugene® /ADN.
3.1.2. Sélection/Expansion Le surnageant est ensuite éliminé, les cellules sont ensuite lavées deux fois en DMEM complet. Les cellules sont ensuite incubées à nouveau pendant deux heures. Les cellules sont ensuite décrochées en trypsine EDTA et réparties en 7 boîtes de pétri de diamètre 10 cm. Parallèlement, trois lamelles en verre sont ensemencées avec 2,5 x 104 cellules afin de vérifier le pourcentage de transfection par observation des cellules en immunofluorescence directe (constructions GFP) ou indirecte (construction wt). La sélection en hygromycine (200 μg/ml) débute deux jours après l'expansion. Les cellules sont en général sélectionnées environ deux semaines, aboutissant à l'apparition de clones cellulaires qui sont repiqués au moyen de cylindres de clonage puis transférés dans des plaques 96 puits afin de débuter leur expansion (96 puits/24 puits/6 puits/flasque 50 ml...).
3.1.3 Criblage des clones On a pu estimer que en général, 85% des clones sélectionnés étaient en moyenne des clones faussement positifs, ayant intégré uniquement le vecteur de sélection. Parmi les 15% restant, nous devons choisir le meilleurs clone cellulaire. Pour cela, un premier tri est effectué juste après le repiquage en observant ces cellules sous un microscope à fluorescence inversée (Leica), donc sur des cellules vivantes mais dont le milieu de culture a été provisoirement remplacé par de tampon Ringer, BSA 1%.
Dans un second temps, les clones sont criblés par cytométrie de flux (FACscan Becton-Dickinson) : au cours de l'expansion, deux puits de 6 sont ensemencés avec la moitié d'un puits de 24 (passage précédent). L'un des deux puits de 6 est destiné à la congélation du clone (en attente). Le second est décroché en trypsine EDTA. Le culot cellulaire obtenu après inactivation de la trypsine est rincé deux fois en PBS IX sans Ca2+ et sans Mg2+ puis les cellules sont fixées en solution PBS IX, PAF 1 %>, EDTA 5 mM. Les cellules sont ensuite analysées suivant deux critères : l'intensité de la fluorescence et la clonalité de la population cellulaire. Les résultats obtenus sont ensuite confirmés par immunofluorescence directe ou indirecte et par immunoprécipitation avec un antisérum de lapin spécifique d'une protéine recombinante portion de la première cassette ATP de ABCAl (ser 16 : 1/500) et éventuellement avec un anticorps anti-GFP (Boehringer Manheim, RFA). Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules marquées toutes la nuit à l'aide du 35S Express (NEN, France) est lavé en PBSIX froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec Triton (100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% Triton X 100). Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4°C et le surnageant post nucléaire est ensuite nettoyé trois fois pendant 30' sous agitation à 4°C avec 100 μl de Protéine A Sépharose® (PAS) (50%> v/v en Tampon A sans triton) afin d'éliminer le bruit de fond de fixation. Le surnageant nettoyé est ensuite incubé une heure en présence de sérum 16 (l/500ème) puis de 100 μl de PAS. Le culot de PAS- Anticorps- Antigène est ensuite lavé trois fois en tampon A avec triton, trois fois en tampon A sans triton. Les complexes sont ensuite solubilisés en tampon de Laemmli pour SDS- PAGE supplémenté avec de l'urée 8 M. Les échantillons sont dénaturés 5' à 50°C et chargés sur un gel SDS-PAGE 6%.La bande révélée est de ~ 250 kDa (ABCAl ~ 220 + GFP ~ 30). Dans le cas particulier de constructions non GFP, pBI ABCAl wt, le criblage a été réalisé par Western blot avec le Sérum 16. Pratiquement, un puits de 6 contenant environ 106 cellules est. lavé en PBSIX froid. Les cellules sont lysées sur la glace pendant 30' en tampon A avec triton. Les cellules sont centrifugées 5' 1500 rpm 4°C. La quantité protéique du surnageant post nucléaire est quantifié selon la méthode de Lowry (Kit Blorad). 20 μg de lysat total sont chargés sur un minigel SDS-PAGE 6% en tampon de charge Urée 8 M. Le gel est ensuite dégorgé 15' en tampon de transfert (Tris, Glycine, Méthanol 20%>), préalable au transfert humide sur membrane de nitrocellulose pendant une nuit à 0,5A constant.
La membrane révélée au rouge ponceau est ensuite saturée en PBS IX, Lait 5%, Tween 20 0,1 %> pendant une heure à température ambiante. La membrane est ensuite incubée une nuit en PBSIX, Lait 1%>, Tween 20 0,1%> en présence de sérum 16 (l/500ème). La membrane est ensuite lavée 5 fois en PBSIX, Tween 20 0, 1 % puis incubée avec un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin couplé à la peroxydase l/1000ème) pendant une heure à température ambiante. La membrane est à nouveau lavée 5 fois en PBSIX, Tween 20 0,1%. La membrane est révélée avec le Kit ECL (Pharmacia).
Dans ce cas, les clones sont criblés selon l'intensité de la bande apparaissant à 220 kDa par rapport à un échantillon témoin. La clonalité est vérifiée par immunofluorescence (M. F. Luciani et al., EMBO J., 1996, précité). 3.2 Résultats
La lignée HeLa a été choisie pour établir des transfectants stables surexprimant différentes constructions de la protéine ABCAl car elle possède une expression endogène faible d' ABCAl. Des transfectants stables correspondants à la construction ABCAl de type sauvage (wt) et aux fusions C-terminales de la GFP soit avec la protéine ABCAl sauvage (AG), soit avec des mutants de substitution de la lysine de chacun ou des deux motifs A de Walker en méthionine, désignés respectivement MK, KM et MM (figure 15 et figure 16) ont été criblés en fonction de leur intensité de fluorescence directe ou indirecte (ABCAl wt) Des clones possédant des niveaux équivalents d'expression de la protéine ABCAl ont été sélectionnés par immunoprécipitation et par immunoblotting avec un anticorps anti-ABCAl et éventuellement avec un anticorps anti-GFP (figure 17). Comme attendu, les protéines de fusion ont un poids moléculaire apparent (>250 kDa) supérieur à celui de la protéine ABCAl sauvage.
4. Propriétés des transfectants exprimant la protéine ABCAl et ses mutants des cassettes de liaison à l'ATP (NBDl et NBD2) 4.1 Matériels et méthodes 4.1.1 Microscopie
La microscopie en fluorescence et la microscopie confocale sont réalisées en utilisant des méthodes de perméabilisation adaptées pour chaque anticorps, selon des techniques classiques connues de l'homme du métier.
4.1.2 Test cinétique de l'exposition de la phosphatidylsérine (PS), (test de fixation de l'annexine V)
L'exposition de PS a été évaluée par la mesure en cytométrie de flux de la fixation de l'annexine V marquée (annexine V-Cy5), selon des protocoles connus de l'homme du métier Le marquage de l'annexine recombinante a été réalisée à l'aide du kit Cy-5-colorant réactif bifonctionnel (Amersham, Royaume Uni). La cinétique de fixation de l'annexine V à l'état basai (1 :1000 dans le tampon lOmM Hepes, pH 7,4 ; 140mM NaCl ; 2,5mM CaCl) a été enregistrée à des intervalles de lsec, pendant 16min, avec un FACScalibur (Becton-Dickinson), sur 0,5 10 cellules fraîchement décollées par une solution PBS-EDTA. Après addition de 2μM du ionophore de calcium A23187 (Calbiochem, Meudon, France) à T0, la variation de la fixa- tion d' annexine V au cours du temps a été enregistrée de façon similaire. Les résultats obtenus avec des cellules témoin, en bonne santé, dont la fenêtre a été établie manuellement sur la base de paramètres morphologiques a ensuite été analysée à l'aide du logiciel Flowjo (Tree Star, Etats-Unis). La présence simultanée de la fluorescence de la GFP, dans les échantillons, a permis de corréler directement la réponse au A23187 avec l'expression du gène transfecté. L'absence de perméabilisation membranaire a été mesurée, à la fin du test, par un marquage à l'iodure de propidium.
4.1.3 Test à la Prothrombinase Des cellules fraîchement détachées ont été resuspendues à 106cellules /ml dans du tampon TBS supplémenté avec l,8mM de Ca2+ et 0,3% de sérum albumine humaine et l'activité de la prothrombinase a été mesurée selon le protocole décrit dans Toti et al., Blood, 1996, 87, 1409-1415). Les équivalents PS ont été calculés en référence à une courbe standard obtenue avec des liposomes de concentration et de composition lipidique connue.
4.1.4 Préparation d'un repas de phagocytose et analyse confocale
Des thymocytes apoptotiques ont été préparés selon des techniques connues de l'homme du métier. Après 6h d'irradiation γ, les thymocytes ont été marqués avec de la 7AAD [20μg/ml de 7-amino-actinomycine (Molecular Probes, Etats-Unis), pendant 15min à température ambiante] et ensemencés avec un excès d'un facteur 20 sur 2 105 cellules Hela préalablement cultivées toutes la nuit sur des lames de verre. Après 2h d'incubation à 37°C, les lames sont lavées de façon exten- sive dans du milieu et fixées dans 4%>PFA dans du tampon phosphate pH 7,2. Deux canaux d'imagerie des sections selon plans xy et xz ont été réalisés à l'aide d'un microscope confocal (Leica).
4.1.5 Efflux lipidiques
Les efflux lipidiques sont mesurés selon le protocole décrit dans l'exemple 1.
4.2 Résultats 4.2.1 Localisation cellulaire de la protéine ABCAl et de ses mutants
L'analyse préliminaire en microscopie de fluorescence de différents clones de transfectants exprimant la protéine ABCAl seule (wt) ou fusionnée à la
GFP (AG) a révélé des profils équivalents, démontrant que la GFP ne modifie pas la localisation de la protéine. L'analyse en microscopie confocale a localisé la protéine ABCAl à la membrane plasmique avec une distribution homogène en patch qui ne correspond pas à une localisation préférentielle au niveau des jonctions cellulaires (figure 18A).
De même, la fluorescence n'est pas modifiée en fonction du substrat d'attachement des cellules (fibronectine, collagène, thrombospondine ou vibronec- tine). Des expériences de supertransfection du transfectant AG ont permis de colo- caliser la protéine ABCAl avec CD 14, le récepteur au LPS glypié qui est aussi impli- que dans l'englobement des cellules mortes et est localisé au niveau des microdomaines membranaires.
ABCAl est aussi visualisée dans une région périnucléaire correspondant au Golgi (figure 18A) ainsi que dans un compartiment vésiculaire (figure 18B) dans lequel elle est partiellement colocalisée avec des marqueurs du compartiment endolysosomal comme Lampl (figure 18C).
La possibilité d'induire des mouvements centrifuges et centripètes des vésicules contenant la protéine ABCAl par des traitements pharmacologiques connus pour affecter la motilité des lysosomes comme le NH4C1, la nigéricine ou bien l'acidification modérée du cytosol confirme leur appartenance au compartiment endolysosomal.
La distribution de fluorescence des constructions MK, KM et MM
(figure 18D, 18E et 18F) est identique à celle d'AG (figure 18A), démontrant que ces mutations n'affectent ni le repliement ni le routage intracellulaire de la protéine et que ces transfectants sont donc des outils appropriés pour la dissection fonctionnelle des phénotypes induits par ABCAl.
4.2.2 L'expression de la protéine ABC1 fonctionnelle modifie la mobilité transmembranaire de la phosphatidylsérine (PS), l'englobement et l'efflux des lipides.
Une croissance ralentie des transfectants AG a été remarquée au cours de leur passage en culture. Les observations on été confirmées par un test d'incorpration de Thymidine tritiée qui montre un taux d'incorporation de respectivement 54%> ± 7, n=5 et 57%> ± 3,3, n=2 pour les transfectants AG et wt par rapport au cellules témoin (100% ±_12, n=5). En revanche un taux d'incorporation normal est observé chez les mutants ABCAl/GFP (MK 94% ± 12, n=2; KM 118% ± 17, n=2; MM 1 17% ± 13, n=2).
L'exposition des phospholipides à la surface de la membrane des transfectants a ensuite été analysée à l'état d'équilibre et après un stress provoqué par le calcium. L'analyse en cytométrie de flux montre qu'à l'état basai, la fixation de l'annexine V-Cy5 est légèrement augmentée dans les cellules exprimant ABCAl (wt ou AG), par rapport au témoin non-transfectées (figure 19A ; n=3 rapport d'intensité de fluorescence AG/témoin=l,4 ± 0,12). En revanche l'expression des mutants n'a aucune effet significatif sur l'exposition des lipides à l'état basai (figure 19A, MK/témoin 1,1 ± 0,5 n=3 ; KM/témoin 1,1 ± 0,1 n=3 ; MM/témoin 0,9 ± 0,2 n=2).
L'exposition de la phosphatidylsérine (PS) à la surface externe du feuillet membranaire a aussi été quantifiée par le test à la prothrombinase. La quantité de PS a été estimée à 17,14nM équivalent PS/2 ÎO3 cellules pour les transfectants AG , l,3nM équivalent PS/2 103 cellules pour les témoins. De même, les transfectants MM exposent des quantités normales de PS (3,6nM équivalent PS/2 ÎO3 cellules).
L'analyse de l'exposition de PS à la surface du feuillet externe, après un stress provoqué par le calcium, par un test cinétique de redistribution des lipides transmembranaires, a fourni encore plus d'évidence que la réponse à 2 μM A23187 était directement corrélée à l'expression de la protéine ABCAl (figure 19B, n=3 43,5% ± 1,2 pour les transfectants AG et 19,2% ± 2,8 pour le témoin). De même, à chaque fois que la fonction de la protéine ABCAl est modifiée par des mutations (KM, MK ou MM), la distribution de PS après un stress par le calcium est réstorée à des valeurs équivalentes à celles du témoin (MK 19%, KM 17,8% et MM 20,4%). Ces résultats démontrent sans aucune ambiguïté que la protéine ABCAl est impliquée dans l'homéostase des lipides dans la membrane plasmique.
Pour avoir une image complète du phénotype ABCAl, l'effet de l'expression de la protéine ABCAl sur les fonctions plus en aval d'englobement et d'efflux lipidique a été analysée La modulation par ABCAl de la capacité d'englobement des cellules Hela, non-phagocytaires à l'état normal a été testée en mettant un témoin non-transfecté, des transfectants AG ou des transfectants MM en contact avec des thymocytes de souris en apoptose. L'analyse par microscopie confocale montre clairement un nombre conséquent de corps apoptotique en contact étroit avec les cellules exprimant ABCAl (figure 20A), en revanche aucun corps apoptotique n'a été observé pour les témoins ou les mutants. Une analyse selon l'axe XZ a pu confirmer que les corps étaient englobés dans les cellules puisqu'il apparaissent complètement entourés par des membranes exprimant la protéine ABCAl (figure 20A et 20B). De même, la modulation, de l'efflux des lipides cellulaires, médiée par la protéine ABCAl a été évaluée en mesurant l'efflux de phospholipides contenant de la choline ou du cholestérol des transfectants AG, MM et des cellules Hela témoin (mock), vers l'accepteur spécifique Apo-AI. La figure 21 [(n=4), les résultats représentent la moyenne de 4 valeurs expérimentales pour chaque expérience], montre que la présence d'un transporteur ABCAl fonctionnel à la membrane plasmique est capable d'augmenter les efflux spécifiques des deux espèces de lipides (efflux spécifique de choline tritiée de 3,3%) ± 0,7 pour AG et de 0,16% ±.0,08 pour le témoin ; efflux spécifique de cholestérol l4C de 2% ± 0,4 pour AG et de 0,162% ± 0,24 pour le témoin). Le double mutant MM montre des efflux comparables à ceux observés pour le témoin (efflux spécifique de choline tritiée de 0,375%> ± 0,1 1 et efflux spécifique de cholestérol 14C de 0,26%> ± 0,07). Les simples mutants KM et MK montrent un phénotype intermédiaire pour les deux espèces de lipides. Les résultats montrent que l'expression du transporteur ABCAl à la surface de la membrane plasmique affecte simultanément l'englobement et l'efflux lipidique, deux fonctions cellulaires qui n'avaient pas été reliées. De plus l'expression des mutants montre que ces deux fonctions requièrent un transporteur ABCA intact car elles sont simultanément abolies lorsque le domaine NBD est inactivé et perd la capacité de fixation et d'hydrolyse de l'ATP.
EXEMPLE 4 : outils de détection de transporteurs ABCA
Des outils de détection peuvent être obtenus sur la base des motifs spécifiques identifiés au Tableau II.
La définition de paires d' oligonucléotides dégénérés ayant pour cible les séquences codant lesdits motifs permettent d'amplifier des régions génomiques ou des ADNc par amplification PCR.
Pour l'amplification génomique, la stratégie exploite la conservation de la position des introns, parmi les différents transporteurs ABCA, chaque paire d'amorces étant adjacente à une limite exon-intron. Dans la mesure où la taille des introns est variable parmi les différents transporteurs ABCA, le produit d'amplification attendu est une échelle de bandes multiples résultant de l'amplification des gènes correspondants.
Pour l'amplification de l'ADNc, le résultat attendu de l'amplification est une bande unique contenant différentes séquences issues de chacun des transporteurs exprimé dans la cellule ou le tissu d'intérêt.
Exemple d' oligonucléotides pour le ciblage de gènes ABCA au niveau des motifs spécifiques NBD2 : paire GYCP : GGNTAYTGYCCNCARTTYGA (SEQ ID NO :30) paire YSGG : CKYTTRTTNCCNCCRCTRTA (SEQ ID NO :31), dans lesquelles R = A ou G ; Y = C ou T ; N = A, C, G ou T.
Les conditions de la PCR sont les suivantes, pour 30 cycles : dénaturation 5 min à 95°C pour le premier cycle et 1 min 30 pour les autres, suivie d'une hybridation à 54°C pendant 1 min et d'une élongation à 72°C pendant 5 min (figure 24).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA. 2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins l'un des allèles du gène est inactivé par troncature au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2). .
3°) Utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu d'un mam- mifère non-humain recombinant pour le gène codant un transporteur de type ABCA, lesquelles cellules sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un allèle dudit gène inactivé, de préférence, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2), pour la sélection ou le criblage de produits aptes à moduler les transporteurs ABCA.
4°) Procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'extraction d'un échantillon biologique à partir d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) ;
- la mise en contact in vitro dudit échantillon biologique avec au moins une substance à cribler ; - la mesure du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et
- la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA.
5°) Vecteur de recombinaison homologue d'un gène d'un transporteur de type ABCA de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique issue d'un gène codant un transporteur de type ABCA, inactivée, de préférence tronquée au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2). 6°) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit gène est tronqué au niveau d'au moins l'un des exons 17 à 22 correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP du transporteur ABCAl.
7°) Utilisation d'un vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA de mammifère, comprenant une séquence nucléotidique incluant un gène sélectionné dans le groupe constitué par :
- le gène sauvage d'un transporteur de type ABCA et
- les gènes d'un transporteur de type ABCA, mutés au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP (NBDl ou NBD2), pour la transformation génétique d'une cellule eucaryote convena- ble.
8°) Vecteur d'expression d'un transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une origine de réplication dans une cellule eucaryote, au moins un gène dont l'expression permet la sélection des cellules eucaryotes transformées par ledit vecteur, une séquence régulatrice appropriée et une séquence nucléotidique contenant le gène codant un transporteur de type ABCA sauvage ou muté au niveau d'au moins l'une des cassettes de liaison à l'ATP.
9°) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker de la première cassette de liaison à l'ATP.
10°) Vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique contient le gène codant un transporteur de type ABCA présentant au moins une mutation ponctuelle au niveau du motif A de Walker des deux cassettes de liaison à l'ATP. 11°) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques et les ADNc codant les transporteurs ABCAl à ABCA4 et ABCAX.
12°) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 1 1, caractérisé en ce que ladite séquence nucléotidique est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences génomiques SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO :33 et les séquences d'ADNc SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :32 codant le transporteur
ABCAX.
13°) Cellules eucaryotes hôtes obtenues par transformation génétique, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 8 à 12.
14°) Cellules eucaryotes hôtes selon la revendication 13, caractérisées en qu'elles sont constituées par des cellules HeLa transfectées de manière stable par un vecteur d'expression selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, contenant le gène codant un transporteur de type sauvage ou muté et éventuellement un gène rapporteur.
15°) Méthode de production de mammifères non-humains recombinants, porteurs d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, au niveau d'au moins la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl), caractérisée en ce que : - l'on tronque un allèle du gène codant un transporteur de type
ABCA au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) ;
- l'on introduit ladite séquence modifiée dans un segment de l'ADN génomique d'un mammifère non-humain du même type, associé à un marqueur approprié, de manière à obtenir une séquence marquée M, contenant ledit allèle tronqué ;
- l'on intègre ladite séquence M, in vitro, dans les cellules souches de lignées germinales d'embryons d'un mammifère non-humain par transfection et on sélectionne les cellules ayant ledit allèle par des événements de recombinaison homologue ; puis - l'on réinjecte lesdites cellules souches sélectionnées à un embryon réimplanté chez un mammifère non-humain du même type afin d'obtenir des animaux chimériques ; et
- l'on obtient à la génération FI des mammifères non-humains recombinés hétérozygotes et à la génération F2 des mammifères non-humains recombinés homozygotes, reconnaissables à la présence du marqueur.
16°) Kit ou trousse d'évaluation d'une substance apte à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une culture de cellules sélectionnée dans le groupe constitué par les cellules issues d'au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA, tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison de l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) et les cellules eucaryotes transformées selon la revendication 13 ou la revendication 14 ; et - des moyens physiques ou chimiques pour la caractérisation de l'activité biologique du transporteur de type ABCA.
17°) Transporteur de type ABCA, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences sélectionnées dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO:l, la séquence SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:32 ou la SEQ ID NO:33 et les séquences qui présentent au moins 95 %> d'identité avec un polypeptide codé par l'une desdites séquences.
18°) Transporteur ABCA muté, caractérisé en ce qu'il présente au moins une mutation ponctuelle au niveau de l'une des cassettes de liaison à l'ATP, de préférence au niveau des motif A de Walker. 19°) Procédé de criblage et de sélection de molécules aptes à moduler les transporteurs ABCA, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'administration à au moins un mammifère non-humain recombinant porteur d'au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé, de préférence tronqué au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2) d'au moins une substance à cribler ; - l'extraction d'un échantillon biologique à partir dudit mammifère non-humain ;
- la mesure in vitro du flux membranaire de lipides (phospholipides et/ou cholestérol) et/ou de la mobilité des phospholipides membranaires des cellules dudit échantillon ; et
- la comparaison des valeurs obtenues avec celles des cellules d'un échantillon biologique obtenu à partir d'un mammifère non-humain du même type, porteur de deux allèles sauvages du gène codant un transporteur de type ABCA.
20°) Réactifs de détection de séquences nucléotidiques spécifiques des transporteurs de type ABCA, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les séquences de 15 à 50 nucléotides amplifiant les fragments codant les séquences spécifiques au transporteur ABCA, telles que définies dans le
Tableau II, et notamment les séquences SEQ ID NO:30 et NO:31.
21°) Mammifère non-humain recombinant, caractérisé en ce qu'il porte au moins un allèle du gène codant un transporteur de type ABCA inactivé.
22°) Mammifère non-humain recombinant selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'au moins l'un des allèles du gène est inactivé par troncature au niveau d'au moins l'un des exons correspondant à la première cassette de liaison à l'ATP (NBDl) et/ou à la deuxième cassette de liaison à l'ATP (NBD2).
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