EP1171629A1 - Neue essentielle bakterielle gene und ihre proteine - Google Patents

Neue essentielle bakterielle gene und ihre proteine

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Publication number
EP1171629A1
EP1171629A1 EP00920599A EP00920599A EP1171629A1 EP 1171629 A1 EP1171629 A1 EP 1171629A1 EP 00920599 A EP00920599 A EP 00920599A EP 00920599 A EP00920599 A EP 00920599A EP 1171629 A1 EP1171629 A1 EP 1171629A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
proteins
gene
genes
coli
yjee
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00920599A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heike BRÖTZ
Kerstin Ehlert
Christoph Freiberg
Frank Spaltmann
Bernd Wieland
Harald Labischinski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of EP1171629A1 publication Critical patent/EP1171629A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • genes of unknown function and proteins derived from them represent new potential targets if it can be shown that they are essential for the survival of microorganisms (F. Argoni et al., Nature Biotechnology, 16: 851, 1998 ; DT Moir et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43: 439-446, 1999; US 5821076; BJ Akerly et al,
  • Knockout technologies can be used to analyze the essentiality of such gene sequences for an organism. Knockout strategies are based on the exchange of intact (wild-type) gene sequence information in the chromosome of a
  • Knockout experiments are carried out as recombination events of homologous DNA sequences.
  • vectors are used which can controllably lose the ability to replicate the plasmid, as in the case of temperature-sensitive replicons (pKO3, pMAK 700 or pSCIOl) or vectors which cannot replicate in the desired target cell (E. coli): e.g. Gram-positive plasmids (pC194, pT181) in Gram-negative bacteria (E. coli).
  • integration vectors such as pMAK700 also carry markers such as antibiotic resistance (e.g. chloramphenicol), which can be used for selection on plasmid-carrying cells.
  • the invention relates to genes with hitherto unknown function, to show their distribution in the phylogenetically diverse bacterial realm and to select in particular those genes which have no or at most only a very distant homology in eukaryotes, and for these genes their essentiality for
  • genes to be found are to select, by suitable selection of the search strategy, only those whose derived proteins can be expected to be water-soluble due to their physicochemical properties to be expected, so that these can advantageously be used in cell-free assays.
  • gene sequences can be selected that would not have been selected in the conventional way as a target for antibiotic drug binding.
  • the gene products of said genes are expressed and purified within the scope of the invention.
  • the new proteins thus obtained are used in assays for the detection of agonists and antagonists of these proteins.
  • over- or under-expression mutants for the corresponding genes are also used in assays for the detection of agonists and antagonists.
  • the present invention relates to essential genes which encode the proteins from the group YQGF, YHBC, YGGJ, YGBP, YCHB, YGBB, YJEE, KDTB, and genes from other microorganisms which encode the corresponding orthologic gene products, and genes as indicated above for which can be shown that their controllable elimination leads to growth inhibition of the host organism, as well as genes from Escherichia coli as above, which encode gene products which are 95-100% identical and for which it can be shown that their controllable elimination to growth inhibition of the host organism, as well as genes as stated above from other microorganisms, which encode orthologic gene products which have 42-100% identical or conserved exchanged amino acids to the corresponding gene product from E. coli, and for which it can be shown that their controllable deactivation for growth inhibition of the host organism, as well as genes that are part of their nucleins acid sequence completely or partially contain at least one gene from the group of the genes specified above, and the
  • the scope of the invention further includes vectors which contain one or more of the abovementioned genes, and transformed microorganisms which contain one or more of the abovementioned genes, and the use of constructed, recombinant microorganisms in which one of the abovementioned genes can be regulatedly expressed to find substances that bind to said gene products and the use of the gene products of the above-mentioned genes in assays to find substances that bind to said gene products and to use said gene products in assays, said assays being based on the principle of affinity selection , as well as the use of said YQGF gene products in assays, the assay using a flavin mononucleotide or a flavin adenine dinucleotide as a substrate, and an indicator system which indicates the redox state of the protein, or the use of said YQGF gene products in assays, wherein in the assay the hydrolytic gap a phosphodiester bond or another ester
  • Binding to the DNA is measured, and the use of said gene products of YGGJ in assays, the key step of the assay being phosphorylation, and the use of said gene products or the use of parts of said gene products to find or produce antibodies or other proteins that bind to said gene products.
  • the scope of the invention further includes the use of substances which bind said gene products
  • the substances found by the methods listed above, which bind to the gene products mentioned above, and the medicaments produced from these substances can be used for the treatment of infections caused by pathogens in humans and animals.
  • diseases which are selected by one or more bacterial pathogens from the genera Porphyromonas gingivalis, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Yersinia pestis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonnorhoeaert, Neisseria meningitellaidisidellaidisidellaiditis is very particularly preferred.
  • Medicines can be used in humans and animals for the treatment of diseases and in particular for the treatment of infections affecting the blood; the cardiovascular system; the central nervous system and its appendages; the bones, the bone marrow; the muscles and fascia, the teeth; the joints and their appendages and cavities; the internal organs, their cavities, inner and outer skins and appendages; the gastrointestinal tract and its cavities, inner and outer skins and appendages; the skin, skin appendages and soft parts and their appendages; the genitourinary system and its annexes; localized and / or generalized inflammation and / or general bacteremia and sepsis, as may occur in connection with general illness, trauma, polytrauma, and / or after surgery; Opportunistic infections and sepsis also relate to other diseases such as blood disorders, viral diseases, consuming diseases and / or antineoplastic and / or immunosuppressive therapy.
  • diseases can be treated that after infection with Porphyromonas gingivalis in the area of the neck, nose, ear, head and neck, in the wound area of the oral cavity after surgical and / or dental treatment, and / or after bites by humans and animals; Escherichia coli in the area of the
  • Genitourinary system including urinary tract, bladder, kidney, pelvis, urosepsis and sepsis after surgery and other trauma; Staphylococcus aureus as a causative agent of inflammatory diseases of the respiratory tract and nasopharynx, the lungs, bones, skin, appendages and soft tissues, the heart and heart valves, as well as toxic diseases caused by the pathogens, such as haemolysis of the blood, the Epidermolysis of the skin, enterocolitis of the gastrointestinal tract, toxic shock syndrome; Mycobacterium tuberculosis as tuberculosis and / or tuberculoid diseases of the lungs, skin, and other organs and organ systems; Neisseria gonnorhoeae and the resulting clinical picture of gonorrhea; Neisseria meningitidis as a causative agent in acute purulent meningitis; Bordetella pertussis as a cause of whooping cough; Haemophil
  • Streptoccus mutans and resulting endocarditis and / or inflammation of the heart valves Streptococcus pneumoniae and resulting inflammatory diseases of the upper and lower respiratory tract such as pneumonia, otitis media, sinusitis, as well as meningitis, peritonitis, and inflammation of the cardiac membranes and the pericardium, as well as caries
  • Streptococcus pyogenes and resulting inflammatory diseases of the upper respiratory tract such as streptococcal pharyngitis, scarlet fever, otitis media, and pyoderma and erysipelas of the skin and sepsis
  • Vibrio cholerae and the resulting clinical picture of cholera Bacillus subtilis and the resulting clinical picture of oppurtunistic infections, disseminated spread and secondary infections in the context of other bacterial infections such as otitis, mastoiditis, urinary tract infection.
  • Bacteremia Bacteremia,
  • Bioinformatic analysis of various bacterial genomes The amino acid sequences of the 4289 proteins from Escherichia coli K12 MG1655 with the Genbank / EMBL entry U00096 were compared with the sequences of the complete protein sets from the Gram-positive model organism Bacillus subtilis (Genbank / EMBL accession no. AL009126) and from the Gram -negative pathogen Haemophilus influenzae (Genbank / EMBL accession no. L42023) and compared with all other amino acid sequences in the public database (Genpept, Swiss-Prot).
  • Proteins with known function or with homologies to known proteins from other organisms were excluded.
  • KDTB KDTB, SMPB, YBAB, YBAD, YBAK, YBAX, YBEA, YBEY, YCHB, YFGB,
  • YGAG, YGBB, YGBP YGGJ, YGGV, YHBC, YHBJ, YHBY, YHIN, YIBK, YIDA, YIGZ, YJEE, YJEQ, YQGF, YRAL, YRFI.
  • Basic molecular biological techniques such as plasmid isolation. Cutting with restriction endonucleases, modification of DNA (dephosphorylation, replenishment reactions, ligation), production of competent E. coli cells and transformation have been carried out using standard regulations known to the person skilled in the art, such as those described in e.g. in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.
  • DNA polymerases were used for cloning purposes: Pwo, Taq (Boehringer, Mannheim, Germany), Akku Taq (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) and Pfu DNA polymerase (Stratagene, Heidelberg, Germany) .
  • Genes or their flanking regions were amplified from 100 ng chromosomal DNA from E. coli W3110 F in a reaction volume of 25 to 100 ⁇ l.
  • the primer concentrations were 1 ⁇ M and dNTP concentrations were 250 ⁇ M.
  • Twenty-five to thirty reaction cycles of 30-60s at 94 ° C, 30-60s at 48-55 ° C and 1-3 min at 72 ° C were followed by a final 5-minute
  • the vector system pBAD / His contains the sequence which codes for six histidines, including a linker for fusion with the N or C terminus of the desired recombinant protein.
  • the maximum expression of the soluble, recombinant protein is achieved by targeted activation of the araBAD promoter with arabinose.
  • the purification of the proteins was carried out with the aid of affinity chromatography on nickel-NT A-agarose.
  • the cells containing the pBAD construct must first be grown to an optical density (OD 600nm ) of 0.3 to 0.6.
  • the targeted protein production is then started with arabinose [0.002-0.2% (w / v)] and incubated for a further 2-3 hours. After completing the
  • the vector system pQE contains the sequence which codes for six histidines, including a linker for fusion with the N or C terminus of the desired recombinant protein.
  • Protein is achieved by targeted activation of the phage T5 promoter system and induction with IPTG.
  • the purification of the proteins was carried out with the aid of affinity chromatography on nickel-NT A-agarose.
  • knockout plasmids which have the temperature-sensitive origin of replication of pSCIOl. This means that these plasmids can reproduce independently in E. coli at 30 ° C., but not at 42-44 ° C. If DNA regions which are homologous to the E. coli chromosome are cloned into such plasmids, these plasmids can at 42-44 ° C using homologous recombination in the gene locus of the E. coli chromosome to be examined. The subsequent excision of the plasmid at 30 ° C can lead to the exchange of the wild type sequence for the sequence originally cloned in the plasmid.
  • flanking areas of the examined genes in the range of 400-800 bp each were cloned into pMAK705 and pKO3. Instead of the gene examined, either a tetracycline or a kanamycin resistance cassette was integrated into the respective plasmids. Two paths were taken for the cloning strategy:
  • the gene of interest including its flanking regions (400-800 bp), was amplified by means of PCR from chromosomal E. coli W3110-F DNA and converted into one
  • Cloning vector cloned (pCR blunt). With the aid of restriction digests and subsequent ligations, the major part of the coding region of the gene of interest was replaced by an antibiotic cassette or the gene was interrupted by such a cassette (tetracycline or kanamycin resistance cassette). Then the cassette with the original flanking the gene
  • the fusion PCR product could be cloned into pKO3 via restriction sites built into the 5 'ends of the external primers.
  • the fusion PCR product contained the flanking areas (400-800 bp each) as well as exactly 18 nucleotides of the 5 'end and 36 nucleotides of the 3' end of the examined
  • E. coli JM101 and E. coli MC 1061 were transformed with the plasmids according to standard protocols and incubated at 43-44 ° C. on LB agar plates with chloramphenicol.
  • 43/44 ° C clones were inoculated in 100 ml LB - chloramphenicol liquid medium and incubated at 30 ° C for 16 h. After two passages in fresh medium with renewed incubation at 30 ° for 16 h each, the plasmids were isolated from 1 ml of the last grown culture. The prepared plasmids were examined for the presence of the wild-type copy of the gene in the plasmid by means of restriction digestion. The culture in which positive plasmids were found were isolated on LB - chloramphenicol plates at 30 ° C.
  • plasmid preparation A number of colonies were picked and grown for plasmid preparation.
  • the prepared plasmids were examined by restriction digestion for the presence of the wild type copy of the gene in the plasmid. Positive clones were verified by PCR for the presence of the antibiotic resistance cassette in the corresponding chromosomal locus. In this way, a chromosomal knockout for the gene under investigation was generated in E. coli with simultaneous complementation by a functional gene copy on the plasmid pMAK705.
  • the clones form a significantly reduced number of colonies on LB chloramphenicol plates at 43/44 ° C compared to the number of colonies on LB +/- chloramphenicol at 30 ° C, since the majority of the clones at 43/44 ° C loses the pMAK705 construct and can therefore no longer develop resistance to chloramphenicol.
  • the number of colonies is reduced by at least a factor of 10. Under these conditions, the clones are not considered to be viable.
  • Criterion for chromosomal knockout in an essential gene clones which, after colony counting on LB without chloramphenicol at 43/44 ° C, formed at least 10 2 fewer colonies than at 30 ° C on LB (with or without chloramphenicol) and at most 10 times more Colonies formed as on LB plates with chloramphenicol at 43/44 ° C, according to our criteria had a chromosomal knockout in an essential gene. The clones were not viable if they lost the plasmid at 43/44 ° C on LB without chloramphenicol (measured in "number of viable colonies").
  • the clones generated with the pKO3 vector system which were chloramphenicol-sensitive and contained a kanamycin resistance cassette instead of the wild-type gene, had a chromosomal knockout in a non-essential gene. A plasmid-coded complementation no longer existed.
  • the E. coli strain MGI 655 was used, which in contrast to MC 1061 has a complete araBAD locus.
  • the araBAD genes from E. coli MGI 655 were replaced by the functional copy of the gene to be examined in each case.
  • the plasmid pAL761 was used for this.
  • the exchange of the araBAD genes for the functional copy of a gene was detected by means of PCR on the clones that were not on M9 minimal medium with 0.2% (w / v) arabinose could grow.
  • the genotype of the deleted chromosomal gene locus with kanamycin cassette was diagnosed by means of PCR among the chloramphenicol-sensitive colonies. If the clones obtained showed a dependence on the growth of arabinose (i.e. no single colony formation on LB agar plates without arabinose in contrast to the growth on LB agar plates with arabinose), the corresponding genes were considered essential.
  • YJEE is likely to be an ATP or GTP binding protein.
  • the protein may have ATPase / GTPase or ATP / GTP synthase activity.
  • KDTB is likely to be a sugar and / or nucleoside and or nucleoside derivative binding protein with phosphorylation or dehydrogenase activity.
  • YQGF may be a flavin derivative binding protein. It can bind flavomononucleotide (FMN) or flavin adenine dinucleotide (FAD) and transfer electrons to another substrate / protein. YQGF may represent hydrolysis that cleaves phosphodiester bonds or other ester bonds.
  • YHBC is a putative DNA-binding protein with a modulatory / regulatory function.
  • YGGJ is a possible phosphotransferase.
  • YGBP is probably a nucleoside diphophate derivative phosphorylase or pyrophosphorylase.
  • YGBP probably cleaves CDP sorbitol or another polyol nucleoside diphosphate with the aid of pyrophosphate or transfers the nucleotide CMP to sorbitol 1-phosphate or another polyol phosphate.
  • YCHB is a putative kinase or putative oxidoreductase.
  • YGBB is a putative hydrolase or NAD (P) H-dependent reductase.
  • the integration plasmid pMAK705 (5.5 kb) can be integrated into the chromosome of E. coli JM101 via homologous recombination.
  • the plasmid contains a chloramphenicol resistance gene for the selection of the plasmid in the host organism.
  • the coding sequence for yjeE and 420 base pairs (bp) upstream and 413bp downstream of the coding sequence for yjeE were amplified by PCR (Cycler Perkin Elmer 480). 100 chromosomal DNA from E.coli W3110 F were in 25 cycles with 45 sec. at 94 ° C, 45 sec. at 48 ° C and 3 min. at 72 ° C and a subsequent incubation at 72 ° C for 5 minutes with Pfu DNA polymerase in
  • Primer A (5'-CCT GCT GGC AAT CAA TCC CGA TA-3 ') and primer B (5'-AGG CGG TGG CGG CAC ATCGGC GTT-3') were used as amplification primers.
  • the amplification product 1482 bp was converted into the vector pCR - blunt using the "pCR - blunt cloning kit" (Invitrogen
  • a tetracycline resistance cassette was cloned into the restriction site Bpml of pCR - blunt / yjee.
  • the tetracycline cassette was isolated from plasmid pBR322 as a 1400bp EcoRI / Aval fragment, and blunt ends were made with Klenow polymerase.
  • the resulting plasmid pCR - blunt / yjeE :: tet was digested with Kpnl / Xbal restriction enzymes.
  • a 2.8 kb DNA band was isolated and cloned into the vector pMAK705 (host organism E. coli JM101) pretreated with Kpnl / Xbal.
  • the resulting construct (pMAK705yjee) was used for the integration experiments.
  • the prepared plasmids were examined by restriction digestion for the presence of the wild type copy of the gene in the plasmid.
  • Cells from the batches containing positive clones (yjeE gene from the wild-type chromosome on the plasmid) were separated on LB plates with chloramphenicol at 30 ° C.
  • the plasmid DNA of the individual clones was tested again for intact yjeE gene from the chromosome and positive colonies were identified.
  • the integration of the copy of yjeE inactivated in the chromosome by insertion of the tetracycline cassette was tested by PCR.
  • the clones checked in this way could now be used for the vitality of the target yjeE for the survival of the E.coli cell.
  • the cells were incubated on LB test plates with and without chloramphenicol at 30 ° and 43 ° C. Table 6: Cell numbers of the incubation +/- chloramphenicol at 30 ° C / 43 ° C
  • the cells can grow at 30 ° C. both with and without chloramphenicol.
  • the growth with chloramphenicol as well as without chloramphenicol is drastically reduced, ie by a factor of 10 4 .
  • DNA regions surrounding the 5 'and 3' end of the ygbP gene were amplified in two separate PCR reactions from 100 ng chromosomal E. coli W31 10-F DNA in a reaction volume of 25 ⁇ l.
  • the primer concentrations were 1 ⁇ M and dNTP concentrations were 250 ⁇ M.
  • Twenty-five reaction cycles of 30s at 94 ° C, 30s at 52 ° C and 1-2 min at 72 ° C were carried out with a final 5 minute step at 72 ° C.
  • the PCR product made with the primers YGBP1A (5'-cgcggatccCCACATGGTCACTGCCTGG-3 ') and YGBP1B (5'-cccatccactaaactgcagctCAAATGAGTGGTTGCCATGTT-3') comprises 18 bp of the 5 'bend-on end and the 6' bend-on end by ygbP.
  • the PCR product that is primed with YGBP2A (5'- agctgcagtttagtggatgggTACCTCACCCGAACCATCC-3 ') and YGBP2B (5'- cgcggatccACCTGGCAGCCTTCCAGTTG-3 '), comprises 36 bp of the 3' end of ygbP and 807 bp of the chromosomal region downstream of ygbP.
  • the inner primers YGBPIB and YGBP2A additionally contained 21mer "tags" at their 5 'ends, which were complementary to one another (small letters of the sequences mentioned above). These were used to assemble both PCR products in a second PCR step using the external primers YGBP1A and YGBP2B. To this end, 1 ⁇ l of the two previous PCR batches were mixed as template for a second PCR with YGBP1A and YGBP2B. This PCR was carried out under the conditions described above. The PCR
  • Product of the expected size was purified using an agarose gel electrophoresis using QIAEX (QIAGEN, Hilden.Germany).
  • the fusion PCR product could be cloned into the BamHI-cut, dephosphorylated pKO3.
  • the plasmid pAL759 was generated which contained the "in-frame" deletion of ygbP.
  • the kanamycin resistance cassette was cloned into pAL759 via the Pstl interface in the 21 bp "day” (5'-ctgcag-3 ') and was obtained from pUC4K by means of a Pstl digest.
  • the resulting construct was named pAL759a.
  • E. coli MC 1061 was transformed with the plasmid pAL759a and opened at 44 ° C
  • E. coli MC 1061 was transformed with the plasmid pAL759 and incubated at 44 ° C. on LB agar plates with chloramphenicol.
  • sucrose clones 100 of the resulting sucrose clones were inoculated again on LB sucrose and LB chloramphenicol plates ("replica -
  • the E. coli strain MG 1655 was used, which in contrast to MC 1061 has a complete araBAD locus.
  • the E. coli MG 1655 araBAD genes were replaced with the functional copy of ygbP.
  • the plasmid pAL763 was used for this.
  • the plasmid pAL763 was generated from the chromosomal E.
  • the primers contain the restriction sites for Xhol (YGBPT) and Nhel (YGBPR) at their 5 'termini.
  • the PCR product was cloned into the vector pAL761 via the interfaces. After transformation of E.
  • coli MG1655 with pAL763 and subsequent integration and excision steps (see above), the exchange of the araBAD genes for the functional copy of ygbP was detected by means of PCR on the clones which were not on M9 minimal medium with 0, 2% (w / v) arabinose could grow.
  • the diagnostic PCR was carried out with the primers YGBPR (see above) and ARA2B (atcgcggccgcAAAGCCGTGCTCGCGC).
  • the primer ARA2B binds in the 3 'region 865 bp downstream of the araD gene, so that together with the primer YGBPR a 1655 bp product was formed in positive clones.
  • YJEE protein was carried out using the pBAD His vector system (Invitrogen).
  • the sequence of yjeE was made from 100 chromosomal DNA from E. coli W3110F for 1 min at 94 ° C. for 1 min. at 52 ° C, 3 min at 72 ° C in 25 cycles with Pfu DNA polymerase in 100 ⁇ l reaction mixture.
  • YJEE-START (5'-TGA AGA TCT AAT CGA GTA ATT CCG CTC CCT GAT-3 ')
  • YJEE-STOP 5'-TCA GAA TTC TTA ACC GGC TAA ACG CGC CAG CAA CAA TC-3'
  • START contains the sequence for the restriction enzyme Bglll.
  • the 5 'end of YJEE-STOP contains the sequence for EcoRI.
  • the PCR mixture was separated in an agarose gel and a band was cut out at 450 bp. The band was then isolated with Qiaex (Qiagen, Hilden, Germany) and incubated with the restriction enzymes BglII and EcoRI for 3 hours at 37 ° C.
  • the DNA fragment treated in this way was cloned into the vector pBAD / HisB pretreated with BglII / EcoRI [host organism: E. coli strain TOP 10 (Invitrogen)]. Successful cloning was demonstrated by plasmid isolation of the transformants obtained and restriction with EcoRI. The clone with the plasmid pBAD / ⁇ isB-YjeE30 has been used for expression and purification.
  • the cultivation and purification of YjeE from E. coli TOP 10 with plasmid pBAD HisB-YjeE30 was carried out according to the protocol for the purification of histidine-labeled proteins on Ni-NTA agarose (The QIAexpressionist, A handbook for high-level expression and purification of 6xHis- tagged proteins, Quiagen, Hilden, Germany 1997).
  • Various concentrations of imidazole 50, 100, 150 and 200 mM were used to elute the bound protein. The highest yield was obtained at 150 raM
  • Targets of unknown function based on affinity selection and mass spectrometry
  • screening methods can be used that test substance banks with regard to their affinity for the protein.
  • a screening option is the affinity selection from substance mixtures with subsequent detection of the ligands in the mass spectrometer. Defined substance mixtures must be used for this, from which individual substances can be identified with the aid of mass detection. Mixtures of substances that have been prepared from combinatorial syntheses are therefore particularly suitable for this screening method.
  • a liquid chromatography-electrospray mass spectrometer serves as a screening apparatus, the HPLC column being replaced by an ultrafiltration chamber.
  • Ultrafiltration chamber consists of a filtration unit in which the filter disk is replaced by an ultrafiltration membrane (exclusion molecular weight 10 kDa). Mass spectra are generated using a mass spectrometer (from Hewlett-Packard; Palo Alto, CA; "5989B MS Engine Quadrupole Mass Spectrometer”). It is operated as described (van Breemen et al., Pulsed Ultrafiltration Mass Spectrometry. A New Method for Screening Combinatorial: Anal. Chem., 69 [11], 2159-2164, 1997).
  • Ammonium acetate buffer is present.
  • the protein substance mixture is at least Incubated for 15 min at room temperature. After the mixture has been injected into the ultrafiltration chamber, it is washed with water for 8 min at a flow rate of 50 l / min.
  • the mobile phase is then changed to methanol / water (50:50 v / v) in order to dissociate possible ligand-protein complexes and to filter out the ligands.
  • the ligands are detected using electrospray mass spectrometry.
  • the substances from a 96 mixture identified as possible ligands on the basis of their mass peaks are used again as individual substances in the affinity test in order to verify their affinity for the target protein (eg YJEE).
  • Substances that are noticeable in the affinity selection are subjected to further tests such as the MIC test.
  • the MIC values are determined using the microdilution method in BH medium.
  • Each test substance is dissolved in the nutrient medium.
  • Serial dilutions of the test substances are made in the microtiter plate.
  • Overculture cultures of the pathogens are used for inoculation, which are previously diluted 1: 250 in the nutrient medium. 100 ml of the inoculated solution are added to 100 ml of the diluted nutrient solutions containing the active ingredient.
  • microtiter plates are incubated at 37 ° C and read after about 20 hours or after 3 to 5 days.
  • the MIC value (mg / ml) indicates the lowest active substance concentration at which no growth can be seen.
  • Another method is to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) in the liquid dilution test.
  • Overpower cultures of the test germs (S. aureus 133) in isosensitest broth are diluted 1: 1000 in fetal calf serum FKS) or isosensitest broth and incubated with dilutions of the test substances (dilution levels 1: 2).
  • the cultures are incubated at 37 ° C for 18 to 24 hours.
  • the lowest substance concentration at which no visible bacterial growth occurs is defined as the MIC.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nucleinsäuren und davon abgeleitete Proteinsequenzen, die für das Überleben von Escherichia coli essentielle Funktionen besitzen. Sie umfasst darüber hinaus Vektoren und mit diesen transformierte Wirtszellen zur Expression solcher essentiellen Proteine sowie die mit diesen Vektoren erzeugten Proteine. Sie umfasst weiter die Verwendung der mit diesen Vektoren erzeugten Proteine in Screeningverfahren zur Auffindung antibakterieller Substanzen sowie der mit diesen Proteinen gefundenen antibakteriellen Substanzen.

Description

Neue essentielle bakterielle Gene und ihre Proteine
Früher wurden neue innovative Antibiotika vor allem durch Modifikation und Optimierung bekannter Substanzklassen wie z.B. ß-Lactame (Penicillin-Cephalo- sporine I-V) und Testen ihrer Wirkung auf Mikroorganismen in sogenannten MHK Testen erforscht und entwickelt.
Parallel wurde in den letzten Jahren die Suche nach neuen Wirkprinzipien mit Hilfe von biochemisch, mikrobiologisch gut charakterisierten Targets (Angriffspunkten) etabliert. Doch basierte die Auswahl von Targets nach diesen Methoden auf empirischem Vorgehen, was das Auffinden neuer Angriffspunkte sehr aufwendig gestaltete.
In neuerer Zeit eröffnet die Kenntnis vollständiger Genomsequenzen von Pro- und
Eukaryonten in Verbindung mit Methoden der Bioinformatik und Molekularbiologie die Möglichkeit zur systematischen und rationalen Auswahl antibakterieller Angriffspunkte.
So wurde durch Analyse verschiedener bakterieller Genome eine große Anzahl Gene unbekannter Funktion entdeckt.
Unbekannte Proteine aus dem Gram-negativen Modellorganismus Escherichia coli (F. R. Blattner et al, Science 277: 1453-1462, 1997) tragen in der Regel Namen, die mit "Y" beginnen: z. B. YQGF. Einige Proteine unbekannter Funktion besitzen aber von dieser Systematik abweichende Namen, weil die für sie kodierenden Gene in der Nachbarschaft funktionell charakterisierter Gene liegen: z. B. KDTB (T. Clementz und C. R. H. Raetz. J. Biol. Chem. 266: 9687-9696, 1991 ; T. Clementz. J. Bacteriol. 174: 7750-7756, 1992). Vor dem Hintergrund der Auffindung von Antiinfektiva stellen Gene unbekannter Funktion und davon abgeleitete Proteine neue potentielle Angriffspunkte dar, wenn gezeigt werden kann, dass sie für das Überleben von Mikroorganismen essentiell sind (F. Argoni et al., Nature Biotechnology, 16:851 , 1998; D. T. Moir et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43: 439-446, 1999; US 5821076; B.J. Akerly et al,
Proc. Natl. Acad. Si. USA 95: 8927-8932, 1998).
Zur Analyse der Essentialität solcher Gensequenzen für einen Organismus können Knockout - Technologien eingesetzt werden. Knockout Strategien basieren auf dem Austausch der intakten (Wildtyp-) Gensequenzinformation im Chromosom eines
Bakteriums gegen einedurch Insertion oder Deletion zerstörte Gensequenz. Aus der Fähigkeit, nur mit einer intakten komplementären Kopie in der Zelle (auf einem Plasmid oder einer zweiten künstlichen Kopie im Chromosom) überlebensfähig zu sein, qualifiziert eine solche Gensequenz somit das kodierende Genprodukt als essentiell für diese Zelle.
Knockout-Versuche werden als Rekombinationsereignisse homologer DNA Sequenzen durchgeführt. Hierfür werden Vektoren benutzt, die steuerbar die Fähigkeit zur Replikation des Plasmids verlieren können, wie im Falle von temperatur- empfindlichen Replikons (pKO3, pMAK 700 oder pSCIOl) oder Vektoren, die in der gewünschten Zielzelle (E.coli) nicht replizieren können: z.B. Gram-positive Plasmide (pC194, pT181) in Gram-negativen Bakterien (E. coli). Integrationsvektoren wie pMAK700 tragen neben Sequenzen für das temperatursensitive Repli- kon zusätzlich Marker wie Antibiotikaresistenzen (z.B. Chloramphenicol), die zur Selektion auf plasmidtragende Zellen genutzt werden können.
Gegenstand der Erfindung sind Gene mit bisher unbekannter Funktion, deren Verbreitung im phylogenetisch diversen Bakterienreich aufzuzeigen und dabei insbesondere solche Gene zu selektieren, die keine oder allenfalls nur eine sehr entfernte Homologie in Eukaryonten besitzen, und für diese Gene ihre Essentialität für die
Überlebensfähigkeit von Mikroorganismen nachzuweisen. Ein weiterer Anspruch an die aufzufindenden Gene ist, durch geeignete Wahl der Suchstrategie nur diejenigen zu selektieren, deren abgeleitete Proteine aufgrund ilirer zu erwartenden physikochemischen Eigenschaften Wasserlöslichkeit erwarten lassen, damit diese vorteilhaft in zellfreien Assays verwendet werden können.
Aus dieser Analyse können Gensequenzen ausgewählt werden, die auf herkömmlichem Wege nicht als Angriffspunkt zur antibiotischen Wirkstoffindung ausgewählt worden wären.
Dazu werden im Rahmen der Erfindung die Genprodukte besagter Gene exprimiert und gereinigt. Die so erhaltenen neuen Proteine werden in Assays zur Auffindung von Agonisten und Antagonisten dieser Proteine verwendet. Darüber hinaus werden auch Über- oder Unter- expressionsmutanten für die entsprechenden Gene in Assays zur Auffindung von Agonisten und Antagonisten verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft essentielle Gene, die die Proteine aus der Gruppe YQGF, YHBC, YGGJ, YGBP, YCHB, YGBB, YJEE, KDTB kodieren, und Gene aus anderen Mikroorganismen, die die entsprechenden orthologen Genprodukte kodieren, sowie Gene wie vorstehend angegeben, für die gezeigt werden kann, dass ihre steuerbare Ausschaltung zur Wachstumsinhibition des Wirtsorganismus führt, sowie Gene wie oben angegeben aus Escherichia coli, die Genprodukte kodieren, die zu 95-100 % identisch sind, und für die gezeigt werden kann, dass ihre steuerbare Ausschaltung zur Wachstumsinhibition des Wirtsorganismus führt, sowie Gene wie oben angegeben aus anderen Mikroorganismen, die orthologe Genprodukte kodieren, die zum entsprechenden Genprodukt aus E. coli 42-100 % identische oder konserviert ausgetauschte Aminosäuren besitzen, und für die gezeigt werden kann, dass ihre steuerbare Ausschaltung zur Wachstumsinhibition des Wirtsorganismus führt, sowie Gene, die als Bestandteil ihrer Nucleinsäuresequenz mindestens ein Gen aus der Gruppe der oben angegebenen Gene ganz oder teilweise enthalten, sowie die
Genprodukte der oben angegebenen Gene. Zum Umfang der Erfindung gehören weiter Vektoren, die eines oder mehrere der obengenannten Gene enthalten, sowie transformierte Mikroorganismen, die eines oder mehrere der obengenannten Gene enthalten, sowie die Verwendung konstruier- ter, rekombinanter Mikroorganismen, in denen eines der obengenannten Gene regulierbar exprimiert werden kann zur Auffindung von Substanzen, die an besagte Genprodukte binden, sowie die Verwendung der Genprodukte der oben angegebenen Gene in Assays zur Auffindung von Substanzen, die an besagte Genprodukte binden, sowie die Verwendung besagter Genprodukte in Assays, wobei besagte Assays auf dem Prinzip der Affinitätsselektion beruhen, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YQGF in Assays, wobei der Assay ein Flavinmononucleotid oder ein Flavinadenindinucleotid als Substrat verwendet, und ein Indikatorsystem, das den Redoxzustand des Proteins anzeigt, oder die Verwendung besagter Genprodukte von YQGF in Assays, wobei im Assay die hydrolytische Spaltung einer Phosphodiester- bindung oder einer anderen Esterbindung gemessen wird, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YJEE in Assays, wobei der Assay ein ATP/GTP als Substrat verwendet, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von KDTB in Assays, wobei der Assay ein Nucleosidderivat als Substrat verwendet und dessen Phosphorylierung und/oder Dehydrogenierung gemessen wird, sowie die Verwen- düng besagter Genprodukte von YGBP in Assays, wobei der Assay ein Nucleosiddi- phosphat-Derivat als Substrat verwendet und dessen Umsetzung gemessen wird, oder die Verwendung besagter Genprodukte von YGBP, wobei der Assay ein CDP- Sorbitol oder ein anderes Polyol-Substrat verwendet und dessen Pyrophosphorylyse gemessen wird bzw. wobei der Nukleotidtransfer an Sorbitol-1-phosphat oder ein anderes Polyolphosphat gemessen wird, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YGBB in Assays, wobei der Schlüsselschritt des Assays die hydrolytische Spaltung des Substrats ist, oder die Reduktion des Substrats mit NAD(P)H ist, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YCHB in Assays. wobei der Schlüsselschritt des Assays entweder eine Phosphorylierung oder eine Dehydrogenierung ist, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YHBC in Assays, wobei die
Bindung an die DNA gemessen wird, sowie die Verwendung besagter Genprodukte von YGGJ in Assays, wobei der Schlüsselschritt des Assays eine Phosphorylierung ist, sowie die Verwendung besagter Genprodukte oder die Verwendung von Teilen besagter Genprodukte zur Auffindung oder Herstellung von Antikörpern oder von anderen Proteinen, die an besagte Genprodukte binden. Zum Umfang der Erfindung gehört weiter die Verwendung von Substanzen, die besagte Genprodukte binden, zur
Herstellung von Arzneimitteln, sowie die Verwendung von Substanzen, die besagte Genprodukte binden, zur Herstellung von antimikrobiell wirksamen Arzneimitteln, sowie die Verwendung besagter Genprodukte zum Auffinden von Substanzen, die an diese Genprodukte binden, sowie die Herstellung und Verwendung von Antisense- Konstrukten, gerichtet gegen die obengenannten Gene. Weiter gehören Verfahren zur
Reinigung der besagten Genprodukte mit Hilfe von Antikörpern zum Umfang der Erfindung.
Die mit den vorstehend aufgeführten Verfahren aufgefundenen Substanzen, welche an die obengenannte Genprodukte binden, und die aus diesen Substanzen hergestellten Arzneimittel, können zur Behandlung von Infektionen, verursacht durch Krankheitserreger bei Mensch und Tier, verwendet werden.
Dies umfasst bevorzugt Erkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger, aus- gewählt aus den Familien der Bacillaceae, Bacteroidaceae, Chlamydiales, Entero- bakteriaceae, Micrococcaceae, Mycobakteriaceae, Neisseriaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae. Rickettsiaceae, Spirillaceae, Spirochaetaceae, Streptococcaceae und Vibrionaceae, verursacht werden.
Ganz besonders bevorzugt ist die Behandlung von Erkrankungen, die durch einen oder mehrere bakterielle Krankheitserreger ausgewählt aus den Gattungen Porphyromonas gingivalis, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Yersinia pestis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonnorhoeae, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis. Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia prowazekii, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori,
Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Enterococcus faecalis, Streptoccus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis verursacht werden.
Die mit den vorstehend aufgeführten Verfahren aufgefundenen Substanzen, die an die obengenannten Genprodukte binden, und die aus diesen Substanzen hergestellten
Arzneimittel, können bei Mensch und Tier zur Behandlung von Erkrankungen und insbesondere zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die das Blut; das Herzkreislaufsystem; das Zentralnervensystem und seine Anhangsgebilde; die Knochen, das Knochenmark; die Muskeln und Fascien, die Zähne; die Gelenke und deren Anhangsgebilde und Hohlräume; die inneren Organe, deren Hohlräume, inneren und äußeren Häute und Anhangsgebilde; den Magendarmtrakt und seine Hohlräume, inneren und äußeren Häute und Anhangsgebilde; die Haut, Hautanhangsgebilde und Weichteile und deren Anhangsgebilde; das Urogenitalsystem und seine Anhangsgebilde; lokalisierte und/oder generalisierte Entzündungen und/oder generelle Bakteriaemie und Sepsis, wie sie im Zusammenhang allgemeiner Erkrankung, Trauma, Polytrauma, und/oder nach chirurgischem Eingriff auftreten kann; opportunistische Infektionen und Sepsis auch im Zusammenhang mit anderen Erkrankungen wie Bluterkrankungen, Viruserkrankungen, konsumierenden Erkrankungen und/oder antineoplastischer und/oder immunsuppressiver Therapie, betreffen.
Beispielhaft können Erkrankungen behandelt werden, die nach Infektion mit Porphyromonas gingivalis im Bereich von Hals, Nase, Ohr, Kopf und Nacken, im Wundbereich der Mundhöhle nach chirurgischer und/oder zahnärztlicher Behand- lung, und/oder nach Bissen von Mensch und Tier; Escherichia coli im Bereich des
Urogenitalsystems einschließlich der Harnwege, der Harnblase, der Niere, des Nierenbeckens, sowie Urosepsis und Sepsis nach operativen Eingriffen und anderen Traumen; Staphylococcus aureus als Erreger entzündlicher Erkrankungen der Atemwege und des Nasenrachenraumes, der Lunge, der Knochen, der Haut, der Hautanhangsgebilde und Weichteile, des Herzens und der Herzklappen, sowie durch die Erreger verursachte toxische Erkrankungen wie die Haemolyse des Blutes, die Epidermolyse der Haut, die Enterokolitis des Magen-Darmtraktes, dem toxischen Schocksyndrom; Mycobacterium tuberculosis als Tuberkulose und/oder tuber- kuloider Erkrankungen der Lunge, der Haut, und anderer Organe und Organsysteme; Neisseria gonnorhoeae und dem daraus resultierenden Krankheitsbild der Gonorrhoe; Neisseria meningitidis als Erreger bei akuter eitriger Meningitis; Bordetella pertussis als Erreger des Keuchhustens; Haemophilus influenzae als Erreger bei Meningitis, Epiglottitis, Osteomyelitis, Pneumonie, Septikämie, Laryngotracheitis, Pharyngitis, Sinusitis, Otitis media, septische Arthritis, akuter Endocarditis, Cellulitis; Pseudo- monas aeruginosa und daraus resultierender Entzündung von Wunden, des Urogenitaltraktes, der Herzinnenhäute, des Respirationstrakts, des Gastrointestinal- traktes; Rickettsia prowazekii und daraus resultierendem Fleckfieber; Chlamydia trachomatis und daraus resultierender Conjunktivitis granulosa trachomatosa des Auges; Yersinia pestis und daraus resultierender Pest-Erkrankung; Campylobacter jejuni und daraus resultierender entzündlicher Erkrankungen des Magen-Darmtrakts wie Enteritis, Colins, Proktitis sowie Ulkuserkrankung; Helicobacter pylori und daraus resultierender entzündlicher chronischer Erkrankungen des Magen-Darmtrakts wie Gastritis und ulcus duodeni sowie Ulkuserkrankung; Borrelia burgdorferi und daraus resultierender Lyme-disease und Erythema-Migrans Krankheit; Treponema pallidum und daraus resultierendem Krankheitsbild der Lues; Enterococcus faecalis und daraus resultierender Erkrankung der Hamwege, des Urogenitalsystems, der
Herzinnenhäute, sowie Wundinfektion; Streptoccus mutans und daraus resultierender Endocarditis und/oder Entzündung der Herzklappen; Streptococcus pneumoniae und daraus resultierender entzündlicher Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege wie Pneumonie, Otitis media, Sinusitis, sowie Meningitis, Peritonitis, und Ent- Zündungen der Herzinnenhäute und des Pericards, sowie der Karies; Streptococcus pyogenes und daraus resultierender entzündlicher Erkrankungen des oberen Respirationstrakts wie Streptokokkenpharyngitis, Scharlach, Otitis media, sowie Pyodermie und Erysipel der Haut und Sepsis; Vibrio cholerae und dem daraus resultierenden Krankheitsbild der Cholera; Bacillus subtilis und dem daraus resultierenden Krank- heitsbild der oppurtunistischen Infektionen, disseminierter Streuung und Sekundär- infektionen im Rahmen anderer bakterieller Infektionen wie Otitis, Mastoiditis, Harnwegsinfekt. Bakteraemie, Meningitis, Endocarditis auftreten.
Bioinformatische Analyse verschiedener bakterieller Genome: Die Aminosäuresequenzen der 4289 Proteine von Escherichia coli K12 MG1655 mit dem Genbank/EMBL-Eintrag U00096 wurden mit den Sequenzen der kompletten Proteinsätze vom Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis (Genbank/EMBL accession no. AL009126) und vom Gram-negativen Pathogen Haemophilus influenzae (Genbank/EMBL accession no. L42023) sowie mit allen anderen Aminosäuresequenzen der öffentlichen Datenbank (Genpept, Swiss-Prot) verglichen.
Vergleichende Analysen wurden mit dem Programm FASTA (FASTA vers. 2; Pearson and Lipman 1988) durchgeführt.
Alle E. coli Proteine mit signifikanter [Erwartungswert E(N) < 10"4] Sequenzhomologie zu Proteinen von H. influenzae und B. subtilis wurden ausgewählt.
Sequenzen, die zu Hefe-Proteinen (H.W. Mewes et al., Nature. suppl. Vol. 387: 9, 1997) eine Homologie von einem Erwartungswert E(N) < 10""1 aufweisen, sowie alle
Proteine mit bekannter Funktion oder mit Homologien zu bekannten Proteinen aus anderen Organismen wurden ausgeschlossen.
Weiter wurden die Proteine von E. coli ausgeschlossen, für die innerhalb der Spezies von E. coli selbst homologe Proteinsequenzen vorkommen [Erwartungswert E(N)
<10"4].
Darüber hinaus wurden Sequenzen mit mehr als einer vorhergesagten Transmembrandomäne [Programm: "Peptidestructure", Wisconsin Sequence Analysis Package (Vers. 9, Genetics Computer Group, Madison WI, USA)] ausgeschlossen. Ergebnisse der bioinformatischen Analyse verschiedener bakterieller Genome:
Aus den so erhaltenen Sequenzen potentieller Targets wurden beispielhaft 27
Proteinsequenzen ausgewählt:
KDTB, SMPB, YBAB, YBAD, YBAK, YBAX, YBEA, YBEY, YCHB, YFGB,
YGAG, YGBB, YGBP, YGGJ, YGGV, YHBC, YHBJ, YHBY, YHIN, YIBK, YIDA, YIGZ, YJEE, YJEQ, YQGF, YRAL, YRFI.
"Knockout"-Konstruktion und Essentialitätstests mit Hilfe temperatursensitiver Plasmide
Material und Methoden
1. Bakterielle Stämme und Plasmide
Tabelle 1 : verwendete E. coli Stämme
Tabelle 2: Verwendete Plasmide
Verwendete Nährmedien
LB- (Luria-Bertani-) Medium
10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt. 10 g NaCl auf 11 H2O
M9-Minimal-Medium
6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 1 g NH4C1 auf 11 H2O
Tabelle 3: Antibiotika-Konzentrationen in den verwendeten Medien
Molekularbiologische Techniken
Molekularbiologische Grundtechniken Molekularbiologische Grundtechniken wie Plasmidisolation. Schneiden mit Restrik- tions-Endonukleasen, Modifikation von DNA (Dephosphorylierung, Auffüllreaktionen, Ligation), Herstellung kompetenter E. coli Zellen und Transformation sind mit dem Fachmann bekannten gängigen Vorschriften durchgeführt worden wie sie z.B. in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, beschrieben werden.
Polymerase - Ketten - Reaktion (PCR)
Alle benutzten PCR - Primer besaßen kalkulierte Schmelztemperaturen von 58°C bis
62°C Für Klonierungszwecke wurden folgende DNA-Polymerasen verwendet: Pwo-, Taq- (Boehringer, Mannheim, Germany), Akku-Taq- (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany) und Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Germany).
Gene bzw. deren flankierende Regionen wurden aus 100 ng chromosomaler DNA von E. coli W3110 F in einem Reaktionsvolumen von 25 bis 100 μl amplifiziert. Die Primerkonzentrationen betrugen jeweils 1 μM und dNTP - Konzentrationen jeweils 250 μM. Fünfundzwanzig bis dreißig Reaktionszyklen von 30-60s bei 94°C, 30-60s bei 48-55°C und 1-3 min bei 72°C wurden mit einem abschließenden 5-Minuten-
Schritt bei 72°C [ref: PCR Protocols: a Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990)] durchgeführt.
Assemblierungs-PCRs Amplifizierte 5'- und 3'- flankierende Genregionen wurden fusioniert, indem jeweils
1 μl der beiden vorhergehenden PCR - Ansätze als Template für eine zweite PCR mit den distal lokalisierten Primern vermischt wurden. Diese PCR wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Diagnostische Kolonie - PCRs
Diagnostische Kolonie - PCRs wurden mit einer Mischung aus Taq-DNA- Polymerase (Boehringer) und ThermoSequenase (Amersham) durchgeführt.
Jeweils eine Kolonie wurde in 50 μl H20 resuspendiert. Davon wurden 5 μl für die PCR eingesetzt, die in einem 50-μl- Volumen unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurde.
Überexpression essentieller Proteine in E. coli
Zur Überexpression essentieller Proteine in E.coli sind verschiedene Vektorsysteme verwendet worden: pBAD/His (Invitrogen), pQE-Vektoren (Quiagen). Es wurden pBAD His-Plasmide (pUC-Vektor Derivate), die für regulierte. Dosisabhängige Expression und Reinigung für rekombinante Proteine in E.coli konstruiert wurden, benutzt:
Das Vektorsystem pBAD/His beinhaltet die Sequenz, welche für sechs Histidine kodiert, inclusive eines Linkers zur Fusion mit dem N- bzw. C-Terminus des gewünschten rekombinanten Proteins. Die maximale Expression des löslichen, rekom- binanten Proteins wird durch gezielte Aktivierung des araBAD Promotors mit Arabinose erreicht. Die Reinigung der Proteine wurde mit Hilfe von Affinitätschromatographie an Nickel-NT A-Agarose durchgeführt.
Zur Reinigung der Fusionsproteine müssen die Zellen, die das pBAD-Konstrukt enthalten, zunächst bis zu einer optischen Dichte (OD600nm ) von 0,3 bis 0,6 angezüchtet werden. Dann wird mit Arabinose [0,002-0,2 % (w/v)] die gezielte Proteinproduktion gestartet und 2-3h weiter inkubiert. Nach Beendigung der
Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation geemtet, das Zellpellet eingefroren. Zellaufschluss und Reinigungsprozedur wurden entsprechend "The QIAexpressionist, A handbook for high-level expression and purification of 6xHis- tagged proteins, Quiagen, Hilden, Germany 1997" durchgeführt. Die Reinigungs- schritte wurden mit Polyacrylamidgelen (und anschließender Färbung mit
Coomassie-Blau) kontrolliert.
Das Vektorsystem pQE beinhaltet die Sequenz, welche für sechs Histidine kodiert, inklusive eines Linkers zur Fusion mit dem N- bzw. C-Terminus des gewünschten rekombinanten Proteins. Die maximale Expression des löslichen, rekombinanten
Proteins wird durch gezielte Aktivierung des Phagen T5 Promotor Systems und Induktion mit IPTG erreicht. Die Reinigung der Proteine wurde mit Hilfe von Affinitätschromatographie an Nickel-NT A-Agarose durchgeführt.
Zellanzucht und Reinigung der Fusionsproteine aus Zellen, die pQE-Konstrukte enthalten, wurden entsprechend der Vorschrift aus „The QIAexpressionist, A handbook for high-level expression and purifϊcation of 6xHis-tagged proteins, Quiagen, Hilden, Germany 1997"durchgeführt.
Klonierungsstrategie
Knockout - Plasmide:
Um die Essentialität der offenen Leserahmen der ausgewählten Gene zu testen, wurden "Knockout"- Plasmide verwendet, die den temperatursensitiven Replika- tionsursprung von pSCIOl besitzen. Das heißt: Diese Plasmide können sich bei 30°C in E. coli selbständig vervielfältigen, nicht aber bei 42-44°C Werden DNA-Bereiche, die zum E. coli - Chromosom homolog sind, in solche Plasmide kloniert, so können diese Plasmide bei 42-44°C mit Hilfe homologer Rekombination gezielt in den zu untersuchenden Genlocus des E. coli - Chromosoms integrieren. Die anschließende Exzision des Plasmides bei 30° C kann zum Austausch der Wildtyp - Sequenz gegen die ursprünglich im Plasmid klonierte Sequenz führen.
Die flankierenden Bereiche der untersuchten Gene im Bereich von jeweils 400-800 bp wurden in pMAK705 bzw. pKO3 kloniert. Anstelle des untersuchten Gens wurde entweder eine Tetracyclin- oder eine Kanamycin - Resistenz - Kassette in die jewei- ligen Plasmide integriert. Für die Klonierungsstrategie wurden zwei Wege be- schritten:
Integration der Resistenzkassette in das Gen:
Das Gen von Interesse wurde inklusive seiner flankierenden Bereiche (400-800 bp) mittels PCR aus chromosomaler E.-coli-W3110-F-DNA amplifiziert und in einen
Klonierungsvektor kloniert (pCR-blunt). Mit Hilfe von Restriktionsverdaus und anschließenden Ligationen wurde der größte Teil des kodierenden Bereichs des Gens von Interesse durch eine Antibiotika - Kassette ersetzt, oder das Gen wurde durch eine solche Kassette unterbrochen (Tetracyclin bzw. Kanamycin-Resistenz-Kassette). Anschließend wurde die Kassette mit den das Gen ursprünglich flankierenden
Sequenzen in das "Knockou '-Plasmid pMAK705 bzw. pKO3 kloniert. Klonierung von "In-frame"- Deletionen mit Integration einer Resistenzkassette: DNA-Regionen mit Längen von 500 bis 800 bp, die das 5'- und 3'-Ende des jeweiligen Gens umgeben, wurden in zwei separaten PCR - Reaktionen aus chromosoma- 1er E.-coli-W31 10-F-DNA amplifiziert. Die dazu nötigen Primer wurden so ausgewählt, dass die Enden der PCR - Produkte, die die 5'- und 3 '-Enden des Gens abdeckten, zusätzlich einen 21-bp-"Tag" mit ein oder zwei Restriktionsschnittstellen besaßen. Demnach enthielten die beiden PCR - Produkte zwei 21-bp lange, zueinander komplementäre Verlängerungen. Diese wurden verwendet, um beide Produkte in einem zweiten PCR - Schritt mit Hilfe der außen liegenden Primer zu assemblieren.
Über Restriktionsschnittstellen, die an den 5 '-Enden der außen liegenden Primer eingebaut waren, konnte das Fusions - PCR - Produkt in pKO3 kloniert werden. Das Fusions - PCR - Produkt enthielt die flankierenden Bereiche (je 400-800 bp) sowie genau 18 Nukleotide des 5 '-Endes und 36 Nukleotide des 3 '-Endes des untersuchten
Gens, wobei das 5'- und das 3 '-Ende des Gens durch ein 21-bp-"Tag" unterbrochen waren. Auf diese Weise wurde eine sogenannte "In - Frame"-Deletion des Gens erzeugt. Über eine Restriktionsschnittstelle wurde in das 21-bp-"Tag" eine Kana- mycin - Resistenz - Kassette integriert.
Temperatur -"Shift" - Experimente (Integration und Exzision)
Zur Integration von pMAK705 und pKO3-Konstrukten wurde E. coli JM101 bzw. E. coli MC 1061 mit den Plasmiden nach Standardprotokollen transformiert und bei 43- 44°C auf LB Agarplatten mit Chloramphenicol inkubiert.
Zur Ermöglichung der Exzision der Plasmide wurden die 43/44°C - Klone (Kointegrate) anschließend auf 30°C - LB überimpft. Je nach dem Vektorsystem (pMAK705 oder pKO3) wurden dabei unterschiedliche Wege beschritten: Temperatur -"Shifts" mit pMAK705:
43/44°C-Klone wurden in 100 ml LB - Chloramphenicol Flüssigmedium überimpft und bei 30°C für 16h inkubiert. Nach zweimaliger Passage in frischem Medium mit erneuter Inkubation bei 30° für jeweils 16h wurden aus 1 ml der letzten gewachsenen Kultur die Plasmide isoliert. Die präparierten Plasmide wurden mittels Restriktions- verdau auf das Vorhandensein der Wildtyp - Kopie des Gens im Plasmid untersucht. Die Kultur, in der positive Plasmide gefunden wurden, wurden auf LB - Chloramphenicol Platten bei 30°C vereinzelt.
Eine Reihe von Kolonien wurden gepickt und zum Zwecke der Plasmidpräparation angezogen. Die präparierten Plasmide wurden mittels Restriktionsverdau auf das Vorhandensein der Wildtyp - Kopie des Gens im Plasmid untersucht. Positive Klone wurden mittels PCR auf das Vorhandensein der Antibiotikaresistenz-Kassette im entsprechenden chromosomalen Locus verifiziert. Auf diese Weise wurde ein chromosomaler Knockout für das untersuchte Gen in E. coli erzeugt bei gleichzeitiger Komplementation durch eine funktionale Genkopie auf dem Plasmid pMAK705.
Temperatur -"Shifts" mit pKO3: Die Kointegrate der pKO3-Derivate in E. coli MC 1061 wurden herausgeschnitten bei gleichzeitiger Eliminierung des pKO3-Plasmids aus der Zelle entsprechend beschriebener Methode [A.J. Link et al., J. Bacteriol. 179: 6228-6237 (1997)]. Dabei wurden drei 43/44°C-Kolonien in Luria-Bertani (LB) - Medium verdünnt und auf LB-5 % (w/v) Saccharose - Kanamycin - Platten ausplattiert und über Nacht inku- biert. Anschließend wurden pro Integrationsklon 50 bis 100 der entstandenen Klone nochmals auf LB - Saccharose - Kanamycin- und LB - Chloramphenicol -Platten überimpft ("Replika - Plating"). Chloramphenicol - sensitive, aber Kanamycin - resistente Kolonien wurden schließlich mittels PCR analysiert, indem das Gen flankierende Primer verwendet wurden. Anhand der Größe des PCR-Produkts konnte gezeigt werden, ob der jeweilige Klon eine Kanamycin - Resistenz-Kassette anstelle des Wildtyp - Gens besaß. Auf diese Weise wurde ein chromosomaler Knockout für das untersuchte Gen in E. coli ohne funktionale Komplementation erzeugt.
Essentialitätsbeweise: Die Essentialität der Gene wurde auf unterschiedliche Weise gezeigt:
Essentialitätsbeweis mittels Temperaturshifts mit dem pMAK705 Vektorsystem: Aus 5-ml der über-Nacht-LB-Chloramphenicol-Kulturen der jeweiligen komplementierten Knockout-Stämme, die am Ende der pMAK705-Experimente erhalten wurden, wurden Aliquots entnommen. Diese wurden auf eine einheitliche OD6OÖ von
0,1 eingestellt. Verdünnungen davon wurden auf LB-Platten jeweils mit bzw. ohne Chloramphenicol ausplattiert und bei 30°C und 43/44°C über Nacht inkubiert.
Die Klone bilden auf LB-Chloramphenicol-Platten bei 43/44°C eine deutlich redu- zierte Zahl an Kolonien aus im Vergleich zur Koloniezahl auf LB+/-Chlor- amphenicol bei 30°C, da der größte Teil der Klone bei 43/44°C das pMAK705- Konstrukt verliert und somit keine Resistenz gegenüber Chloramphenicol mehr ausbilden kann. Die Koloniezahl ist mindestens um den Faktor 10 reduziert. Unter diesen Bedingungen gelten die Klone als nicht überlebensfähig.
Kriterium für den chromosomalen Knockout in einem essentiellen Gen: Klone, die nach der Kolonieauszählung auf LB ohne Chloramphenicol bei 43/44°C mindestens 102 weniger Kolonien bildeten als bei 30°C auf LB (mit oder ohne Chloramphenicol) und höchstens 10 mal mehr Kolonien bildeten als auf LB - Platten mit Chloramphenicol bei 43/44°C, besaßen nach unseren Kriterien einen chromosomalen Knockout in einem essentiellen Gen. Die Klone waren nicht lebensfähig, wenn ihnen das Plasmid bei 43/44°C auf LB ohne Chloramphenicol verlorenging (gemessen in "Zahl an überlebensfähigen Kolonien").
Hingegen besaßen all die Klone, die bei 43/44°C auf LB ohne Chloramphenicol ähnlich viele (+/- Faktor 10) Kolonien bildeten wie auf LB (mit und ohne Chlor- amphenicol) bei 30°C, einen chromosomalen Knockout in einem nicht-essentiellen Gen. Die Entfernung des Plasmids mit der komplementierenden funktionalen Kopie aus den E. coli - Zellen auf LB ohne Chloramphenicol bei 43/44°C führt nicht zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Klone (gemessen in "Zahl an überlebens- fähigen Kolonien").
Essentialitätsbeweis mittels Knockoutgenerierung ausschließlich in Gegenwart einer komplementierenden Genkopie (pKO3-System):
Die mit dem pKO3-Vektor-System erzeugten Klone, die Chloramphenicol - sensitiv waren und eine Kanamycin - Resistenz - Kassette anstelle des Wildtyp - Gens enthielten, besaßen einen chromosomalen Knockout in einem nicht - essentiellen Gen. Eine plasmidkodierte Komplementation existierte nicht mehr.
Blieben alle Kolonien Chloramphenicol - resistent, konnte kein Knockout im Chromosom erzeugt werden bei gleichzeitigem Verlust des Plasmids.
Zur weiteren Überprüfung der Essentialität dieser Gene wurde versucht, ein Knockout der entsprechenden Gene im Chromosom bei gleichzeitiger funktionaler Komplementation zu erzeugen.
Dazu wurde der E. coli - Stamm MGI 655 verwendet, der im Unterschied zu MC 1061 einen vollständigen araBAD-Locus besitzt. Zuerst wurden die araBAD- Gene von E. coli MGI 655 durch die funktionale Kopie des jeweils zu untersuchenden Gens ersetzt. Dazu wurde das Plasmid pAL761 verwendet. Nach Trans- formation der pAL761 -Derivate und folgenden Integrations- und Exzisionsschritten wurde der Austausch der araBAD-Gene gegen die funktionale Kopie eines Gens mittels PCR an den Klonen nachgewiesen, die nicht auf M9-Minimal-Medium mit 0,2 % (w/v) Arabinose wachsen konnten.
Positive Klone wurden im Folgenden mit dem pKO3-Derivat des entsprechenden
Gens transformiert. Die anschließende Kointegration und Exzision wurde wie oben beschrieben durchgeführt mit der Ausnahme, dass der Integrations- und Exzisions- schritt in Anwesenheit von 0,2 % (w/v) Arabinose durchgeführt wurde.
Mittels PCR wurde unter den Chloramphenicol-sensitiven Kolonien der Genotyp des deletierten chromosomalen Genlocus mit Kanamycin-Kassette diagnostiziert. Zeigten die erhaltenen Klone eine Wachstumsabhängigkeit von Arabinose (d.h. keine Einzelkoloniebildung auf LB-Agarplatten ohne Arabinose im Gegensatz zum Wachstum auf LB-Agarplatten mit Arabinose), so galten die entsprechenden Gene als essentiell.
Essentialitätsbeweis mit Hilfe von "In - Frame"- Deletionen (pKO3-System):
In einigen Fällen ließ sich ein Austausch der Gene gegen entsprechende unterbrochene oder deletierte Kopien mit Antibiotika - Resistenz - Kassetten auch in Gegenwart einer Komplementation nicht erzeugen. Ursache hierfür können durch die Kassetten verursachte polare Effekte sein, die dazu führen, dass die Expression essentieller, stromabwärts vom untersuchten Gen lokalisierter Gene beeinträchtigt wird. Aus diesem Grunde wurden die oben beschriebenen "In - Frame"-Deletions- plasmide der entsprechenden Gene ohne Kanamycinkassette für die folgenden Experimente verwendet.
"In - Frame" - Deletionsklone wurden in E. coli MC 1061 transformiert. Integration,
Exzision und Eliminierung von pKO3 sowie das anschließende "Replika - Plating" wurden wie oben beschrieben durchgeführt mit der Modifikation, dass nicht mehr auf Kanamycin selektioniert wurde. Die Chloramphenicol - sensitiven Kolonien sollten statistisch gesehen zu 50 % die Gen-Deletion tragen. Wenn unter 50 mittels PCR getesteten Kolonien, kein Klon die Deletion trug, schlössen sich weitere Experimente zur Bestätigung der Essentialität des untersuchten Gens an.
Dazu wurde eine Deletion des Gens im Chromosom bei gleichzeitiger Komplementation, wie oben beschrieben, erzeugt, und die Wachstumsabhängigkeit von Arabinose gezeigt. Essentialitätsbeweis an komplementierten Knockouts ohne Arabinose-abhängiges Wachstum:
An den komplementierten Knockout - Stämmen, die kein Arabinose abhängiges Wachstum zeigten, wurde versucht, die funktionale Kopie des Gens im araBAD -
Locus durch eine Kanamycinkassette zu ersetzen. Dazu wurden die entsprechenden Stämme mit pAL767 transformiert, einem pKO3-Derivat mit Kanamycin-Resistenz- kassette und araBAD - flankierenden Regionen.
Waren nach Integration, Exzision und Eliminierung des pAL767 100 % der resultierenden Klone (200 betrachtete Klone) sowohl Kanamycin- als auch Chloramphenicol-resistent, wurde gezeigt, dass pAL767 immer noch im Chromosom integriert vorlag. Es war also nicht möglich, die intakte Kopie des Gens aus dem araBAD-Locus zu entfernen. Dieser Befund unterstreicht die Essentialität des betreffenden Gens. Konnte in den eventuell vorhandenen Kanamycin - resistenten und Chloramphenicol - sensitiven Klonen über PCR der erfolgreiche Austausch der funktionalen Genkopie gegen die Kanamycin - Resistenzkassette gezeigt werden, war das Gen nicht essentiell.
Ergebnisse der Essentialitätsbeweise:
Tabelle 4: Gene deren Essentialität nach den o.g. Methoden beurteilt wurde:
Es wurden demnach aus den 27 untersuchten Genen acht essentielle Gene identifiziert. Mit den von diesen Genen abgeleiteten Proteinsequenzen wurde eine Homologie-Suche gegen Nucleotidsequenzen vollständig und unvollständig entschlüsselter bakterieller Genome mit Hilfe des Programms TBLASTN durchgeführt.
Mit dieser Methode können durch Wahl eines Schwellenwertes, dem Erwartungswert P(N), alle signifikant homologen Proteinsequenzen von zufallig übereinstimmenden Sequenzen unterschieden werden. Unter Verwendung eines stringenten Schwellenwertes (Erwartungswert P(N) < 10 ) konnten Genprodukte mit einer signifikanten Sequenz-Homologie in einer großen Zahl krankheitsrelevanter Bakterien gefunden werden.
Aus den so aufgefundenen Homologen einer bakteriellen Spezies wurden als Ähnlichste diejenigen ausgewählt, die über die maximale Anzahl an identischen und/oder konserviert ausgetauschten Aminosäuren im Vergleich zum entsprechenden E. coli Protein verfugen (Tabelle 5). Solche Proteine werden als orthologe Proteine (Genprodukte) bezeichnet, da der Fachmann weiß, dass sie die gleiche Funktion ausüben wie in Escherichia coli.
Die in Tabelle 5 aufgelisteten orthologen Proteine besitzen mindestens 21 % identische bzw. 42 % identische oder konserviert ausgetauschte Aminosäuren, d.h. 21 % Identität/42 % Ähnlichkeit . Tabelle 5:
Verbreitung der orthologen Proteine der identifizierten essentiellen Genprodukte von E. coli in pathogenen Bakterien. Ergebnisse einer TBLASTN-Suche mit den für essentiell befundenen Proteinsequenzen aus E. coli gegen Nucleotidsequenzen vollständig oder unvollständig entschlüsselter bakterieller Genome wie sie zum Beispiel in der öffentlich zugänglichen Genomdatenbank des National Center for Bio- technology Information (NCBI) abgelegt sind: Kriterium für signifikante Homologie ist ein Erwartungswert P(N) < 10"4. Die Identität und Ähnlichkeit der Orthologen im Vergleich zum entsprechenden E. coli Protein werden angegeben als
%Identität/%Ähnlichkeit. Vollständig sequenzierte Genome sind mit (*) markiert. Fehlende Homologie in unvollständig entschlüsselten Genomen ist mit einem (?) gekennzeichnet.
Aufgrund von Sequenzmotiven in der Aminosäureabfolge der acht essentiellen Genprodukte und/oder ihrer durch die Aminosäureabfolge zu erwartenden Raumstruktur lassen sich folgende Funktionen vorhersagen: YJEE stellt wahrscheinlich ein ATP- oder GTP-bindendes Protein dar. Das Protein kann eine ATPase/GTPase- oder ATP-/GTP-Synthase- Aktivität besitzen.
KDTB ist wahrscheinlich ein Zucker- und/oder Nukleosid- und oder Nukleosid- derivat-bindendes Protein mit Phosphorylierungs- oder Dehydrogenase- Aktivität.
YQGF stellt möglicherweise ein Flavin-Derivat-bindendes Protein dar. Es kann Flavomononukleotid (FMN) oder Flavinadenindinukleotid (FAD) binden und Elektronen auf ein anderes Substrat/Protein übertragen. YQGF stellt möglicherweise eine Hydrolyse dar, die Phosphodiesterbindungen oder andere Esterbindungen spaltet.
YHBC ist ein putatives DNA-bindendes Protein mit modulatorischer/regulatorischer Funktion. YGGJ ist eine mögliche Phosphotransferase. Bei YGBP handelt es sich wahrscheinlich um eine Nukleosiddiphophat-Derivat-Phosphorylase oder Pyrophos- phorylase. Wahrscheinlich spaltet YGBP CDP-Sorbitol oder ein anderes Polyol- Nukleosiddiphosphat mit Hilfe von Pyrophosphat bzw. transferiert das Nukleotid- CMP an Sorbitol-1-phosphat oder ein anderes Polyolphosphat. YCHB ist eine puta- tive Kinase oder eine putative Oxidoreduktase.YGBB ist eine putative Hydrolase oder NAD(P)H-abhängige Reductase.
Beispiele
Beispiel I zu YJEE
Konstruktion des Integrationsvektors mit der Gensequenz für yjeE
Dem Integrationsplasmid pMAK705 (5,5kb) ist es möglich, über homologe Rekombination in das Chromosom von E. coli JM101 zu integrieren. Das Plasmid enthält neben einem temperaturempfindlichen Replikations-Ursprung aus pSCIOl, ein Chloramphenicolresistenz - Gen zur Selektion des Plasmids im Wirtsorganismus.
Die kodierende Sequenz für yjeE sowie 420 Basenpaare(bp) stromaufwärts und 413bp stromabwärts der kodierenden Sequenz für yjeE wurden mit PCR amplifiziert (Cycler Perkin Eimer 480). lOOng chromosomale DNA aus E.coli W3110 F wurden in 25 Zyklen mit 45 sec. bei 94°C, 45 sec. bei 48°C und 3 min. bei 72°C sowie einer anschließenden Inkubation bei 72°C für 5 Minuten mit Pfu-DNA-Polymerase im
Reaktionsvolumen von lOOμl amplifiziert. Als Amplifikationsprimer wurden Primer A (5'-CCT GCT GGC AAT CAA TCC CGA TA-3') und Primer B (5'-AGG CGG TGG CGG CAC ATCGGC GTT-3') verwendet. Das Amplifikationsprodukt (1482bp) wurde nach Reinigung mit Qiaex (Qiagen, Hilden, Germany) in den Vektor pCR - blunt unter Verwendung des "pCR - blunt cloning kit" (Invitrogen
Corporation, Carlsbad,CA) subkloniert. In die Restriktionsschnittstelle Bpml von pCR - blunt/yjee wurde eine Tetracyclin-Resistenzkassette hineinkloniert. Die Tetracyclinkassette wurde aus dem Plasmid pBR322 als 1400bp EcoRI/Aval Fragment isoliert, und glatte Enden wurden mit Klenow Polymerase hergestellt.
Das so entstandene Plasmid pCR - blunt/yjeE::tet wurde mit Kpnl/Xbal Restriktionsenzymen verdaut. Eine 2.8 kb große DNA- Bande wurde isoliert und in den mit Kpnl/Xbal vorbehandelten Vektor pMAK705 (Wirtsorganismus E.coli JM101) kloniert. Das entstandene Konstrukt (pMAK705yjee) wurde für die Integrationsexperimente verwendet.
Herstellung und Analyse des yjeE Knockouts Zellen mit dem Plasmid pMAK705yjee wurden über Nacht in LB Medium bei 30°C angezüchtet und am nächsten Tag auf LB -Testplatten mit Chloramphenicol ausplattiert und 16 h bei 43°C inkubiert. Die Integration des Plasmids ins Chromosom von E.coli JM101 wurde durch Selektion Chloramphenicol-resistenter Kolonien, die bei 43°C wachsen konnten, identifiziert. Nach der Identifikation der Integration (bei 43°C) wurden die Zellen in 100 ml LB Medium bei 30°C für 16 h inkubiert. Diese
Zellen wurden zweimal in frisches Medium überführt und für jeweils 16 h weiter bei 30°C inkubiert.
Nach dieser Inkubationsserie wurden Plasmid-Schnellpräparationen von jeweils 1 ml der letzten Inkubationsansätze mit Qiaprep (Qiagen,Hilden,Germany) durchgeführt.
Die präparierten Plasmide wurden mittels Restriktionsverdau auf das Vorhandensein der Wildtyp - Kopie des Gens im Plasmid untersucht. Zellen aus den Ansätzen, die positive Klone enthielten (yjeE Gen aus dem Wildtyp-Chromosom auf dem Plasmid), wurden auf LB-Platten mit Chloramphenicol bei 30°C vereinzelt.
Die Plasmid-DNA der vereinzelten Klone wurde erneut auf intaktes yjeE-Gen aus dem Chromsom getestet und positive Kolonien identifiziert. Die Integration der durch Insertion der Tetrazyclinkassette inaktivierten Kopie von yjeE im Chromosom wurde über PCR getestet.
Die so überprüften Klone konnten nun auf Essentalität des Targets yjeE für das Überleben der E.coli Zelle eingesetzt werden. Die Zellen wurden auf LB Testplatten mit und ohne Chloramphenicol bei 30° und 43°C inkubiert. Tabelle 6: Zellzahlen der Inkubation +/-Chloramphenicol bei 30°C/43°C
Wie aus der Tabelle ersichtlich, können die Zellen bei 30°C sowohl mit als auch ohne Chloramphenicol wachsen. Bei 43°C ist das Wachstum sowohl mit Chloramphenicol als auch ohne Chloramphenicol drastisch, d.h. um den Faktor 104, reduziert. Dies zeigt deutlich die Notwendigkeit der Anwesenheit des Plasmids mit der komplementierenden Sequenz von yjeE für das Wachstum der E. coli Zelle bei 43°C ohne Chloramphenicol und somit die Essentialität von yjeE für das Überleben dieser Zellen.
Beispiel: Essentialitätsbeweis für ygbP
Klonierung von "In-frame"- Deletionen mit bzw. ohne Integration einer
Resistenzkassette:
DNA-Regionen, die das 5'- und 3 '-Ende des Gens ygbP umgeben, wurden in zwei separaten PCR - Reaktionen aus 100 ng chromosomaler E.-coli-W31 10-F-DNA in einem Reaktionsvolumen von 25 μl amplifiziert. Die Primerkonzentrationen betrugen jeweils 1 μM und dNTP - Konzentrationen jeweils 250 μM. Fünfundzwanzig Reaktionszyklen von 30s bei 94°C, 30s bei 52°C und 1-2 min bei 72°C wurden mit einem abschließenden 5-Minuten-Schritt bei 72°C durchgeführt. Das PCR-Produkt, das mit den Primern YGBP1A (5'- cgcggatccCCACATGGTCACTGCCTGG-3') und YGBP1B (5'- cccatccactaaactgcagctCAAATGAGTGGTTGCCATGTT-3') hergestellt wurde, umfasst 18 bp des 5' -Endes von ygbP und 776 bp der chromosomalen Region stromaufwärts von ygbP. Das PCR-Produkt, das mit den Primern YGBP2A (5'- agctgcagtttagtggatgggTACCTCACCCGAACCATCC-3') und YGBP2B (5'- cgcggatccACCTGGCAGCCTTCCAGTTG-3') hergestellt wurde, umfasst 36 bp des 3 '-Endes von ygbP und 807 bp der chromosomalen Region stromabwärts von ygbP.
Die inneren Primer YGBPIB und YGBP2A enthielten an ihren 5 '-Enden zusätzlich 21mer-"Tags", die zueinander komplementär waren (kleine Buchstaben der oben erwähnten Sequenzen). Diese wurden verwendet, um beide PCR-Produkte in einem zweiten PCR - Schritt mit Hilfe der außen liegenden Primer YGBP1A und YGBP2B zu assemblieren. Dazu wurden jeweils 1 μl der beiden vorhergehenden PCR - Ansätze als Template für eine zweite PCR mit YGBP1A und YGBP2B vermischt. Diese PCR wurde unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Das PCR-
Produkt der erwarteten Größe wurde über eine Agarosegelelektrophorese mittels QIAEX (QIAGEN, Hilden.Germany) aufgereinigt.
Über die BamHI-Schnittstelle, die an den 5 '-Enden der außen liegenden Primer YGBP1A und YGBP2B eingebaut waren (kleine Buchstaben der oben erwähnten
Sequenzen), konnte das Fusions - PCR - Produkt in den BamHI-geschnittenen, dephosphorylierten pKO3 kloniert werden. Auf diese Weise wurde das Plasmid pAL759 erzeugt, das die "In - Frame"-Deletion von ygbP enthielt. Über die Pstl- Schnittstelle im 21-bp-"Tag" (5'-ctgcag-3') wurde die Kanamycin - Resistenz - Kassette in pAL759 kloniert, die mittels eines Pstl-Verdaus aus pUC4K erhalten wurde. Das entstandene Konstrukt wurde als pAL759a bezeichnet.
Temperatur -"Shifts" mit pAL759a:
E. coli MC 1061 wurde mit dem Plasmid pAL759a transformiert und bei 44°C auf
LB Agarplatten mit Chloramphenicol inkubiert.
Drei der erhaltenen 44°C - Klone (Kointegrate) wurden in LB - Medium verdünnt, auf LB-5 % (w/v) Saccharose - Kanamycin - Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Pro Integrationsklon wurden 100 der entstandenen Saccharose - Kanamycin - Klone nochmals auf LB - Saccharose - Kanamycin- und LB - Chloramphenicol -Platten überimpft ("Replika - Plating") und bei 30°C über Nacht inkubiert. 100 % der Kanamycin-resistenten Klone waren gleichzeitig Chloramphenicol-resistent. Ein Austausch von ygbP gegen eine Kanamycin-Kassette konnte demnach nicht erfolgreich durchgeführt werden.
Temperatur -"Shifts" mit pAL759:
E. coli MC 1061 wurde mit dem Plasmid pAL759 transformiert und bei 44°C auf LB Agarplatten mit Chloramphenicol inkubiert.
Drei der erhaltenen 44°C - Klone (Kointegrate) wurden in LB - Medium verdünnt, auf LB-5 % (w/v) Saccharose -Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert.
Pro Integrationsklon wurden 100 der entstandenen Saccharose - Klone nochmals auf LB - Saccharose - und LB - Chloramphenicol -Platten überimpft ("Replika -
Plating") und bei 30°C über Nacht inkubiert. Jeweils 50 Chloramphenicol - sensitive Kolonien wurden schließlich mittels PCR analysiert, indem YGBP1 A und YGBP2B als Primer verwendet wurden. Anhand der Größe des PCR-Produkts konnte gezeigt werden, dass keiner der getesteten Klone die Deletion von ygbP besaß (PCR-Produkt bei ygbP-Deletion: 1637 bp). In allen Kolonien konnte der Wildtyp-Gen-Locus von ygbP amplifiziert werden (2294 bp). Ein Austausch von ygbP gegen eine Deletion konnte demnach nicht erfolgreich durchgeführt werden.
Erzeugung einer ygbP-Deletion in Gegenwart einer chromosomalen Komplemen- tation:
Im nächsten Schritt wurde versucht, eine Deletion von ygbP im Chromosom bei gleichzeitiger funktionaler Komplementation zu erzeugen. Dazu wurde der E. coli - Stamm MG 1655 verwendet, der im Unterschied zu MC 1061 einen vollständigen araBAD-Locus besitzt. Zuerst wurden die araBAD-Gene von E. coli MG 1655 durch die funktionale Kopie von ygbP ersetzt. Dazu wurde das Plasmid pAL763 verwendet. Das Plasmid pAL763 wurde erzeugt, indem aus chromosomaler E.-coli-W3110-F- DNA mit den Primern YGBPR (5'-atcgctagcATCAGCCCGGGAATTAACATG-3') und YGBPT (5'-atcctcgagAATTCGCATTATGTATTCTCCTG-3') das vollständige Gen YGBP inklusive seiner ribosomalen Bindungsstelle (18 bp stromaufwärts vom 5 '-Ende) und inklusive 8 bp stromabwärts vom 3 '-Ende von ygbP amplifiziert wurde. Die Primer enthalten an ihren 5 '-Termini die Restriktionsschnittstellen für Xhol (YGBPT) und Nhel (YGBPR). Über die Schnittstellen wurde das PCR-Produkt in den Vektor pAL761 kloniert. Nach Transformation von E. coli MG1655 mit pAL763 und folgenden Integrations- und Exzisionsschritten (siehe oben) wurde der Austausch der araBAD-Gene gegen die funktionale Kopie von ygbP mittels PCR an den Klonen nachgewiesen, die nicht auf M9-Minimal-Medium mit 0,2 % (w/v) Arabinose wachsen konnten. Die diagnostische PCR wurde mit den Primern YGBPR (s. o.) und ARA2B (atcgcggccgcAAAGCCGTGCTCGCGC) durchgeführt. Der Primer ARA2B bindet in der 3 '-Region 865 bp stromabwärts vom araD-Gen, so dass zusammen mit dem Primer YGBPR bei positiven Klonen ein 1655-bp-Produkt entstand. Positive Klone wurden im Folgenden mit dem "In-Frame"-Deletions- plasmid pAL759 transformiert. Die anschließende Kointegration und Exzision wurde wie oben beschrieben durchgeführt mit der Ausnahme, dass der Integrations- und Exzisionsschritt in Anwesenheit von 0,2 % (w/v) Arabinose durchgeführt wurde. Mittels PCR wurde unter den Chloramphenicol-sensitiven Kolonien der Genotyp des deletierten chromosomalen Genlocus diagnostiziert. Die ygbP-Deletions-Klone, die eine Arabinose-regulierbare ygbP-Kopie im araBAD-Locus enthielten, zeigten eine Wachstumsabhängigkeit von Arabinose. Auf LB-Agarplatten ohne Arabinose konnten keine Einzelkolonien gebildet werden, wobei Einzelkolonien auf LB- Agarplatten mit Arabinose erhalten wurden. Das Gen ygbP ist demnach essentiell. Beispiel 3
Herstellung und Reinigung von rekombinantem YJEE Proteins
Die Expression und Reinigung von YJEE-Protein ist mit dem pBAD His - Vektorsystem (Invitrogen) durchgeführt worden. Die Sequenz von yjeE wurde aus lOOng chromosomaler DNA aus E. coli W3110F 1min bei 94°C, 1 min. bei 52°C, 3 min bei 72°C in 25 Zyklen mit Pfu-DNA-Polymerase im lOOμl Reaktionsansatz amplifiziert. Als Primer wurden YJEE-START (5'-TGA AGA TCT AAT CGA GTA ATT CCG CTC CCT GAT-3') und YJEE-STOP (5'-TCA GAA TTC TTA ACC GGC TAA ACG CGC CAG CAA CAA TC-3') eingesetzt. Das 5'-Ende von YJEE-
START enthält die Sequenz für das Restriktionsenzym Bglll. Das 5 '-Ende von YJEE-STOP enthält die Sequenz für EcoRI. Der PCR-Ansatz wurde in einem Agarosegel aufgetrennt und eine Bande bei 450bp ausgeschnitten. Anschließend wurde die Bande mit Qiaex (Qiagen, Hilden,Germany) isoliert und mit den Restriktionsenzymen Bglll und EcoRI 3 h lang bei 37°C inkubiert.
Das so behandelte DNA-Fragment wurde in den mit Bglll/EcoRI vorbehandelten Vektor pBAD/HisB kloniert [Wirtsorganismus: E.coli Stamm TOP 10 (Invitrogen)]. Die erfolgreiche Klonierung wurde durch Plasmid-Isolierung der erhaltenen Transformanden und Restriktion mit EcoRI gezeigt. Der Klon mit dem Plasmid pBAD/ΗisB-YjeE30 ist für die Expression und Reinigung eingesetzt worden.
Die Anzucht und Aufreinigung von YjeE aus E. coli TOP 10 mit Plasmid pBAD HisB-YjeE30 wurde nach der Vorschrift zur Reinigung von histidin- markierten Proteinen an Ni-NTA Agarose (The QIAexpressionist, A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, Quiagen, Hilden, Germany 1997) durchgeführt. Die Induktion der YjeE-Expression wurde mit 0.02 % Arabinose(w/v) bei einer optischen Dichte der Kultur von OD6oo = 0,5 gestartet. Zur Elution des gebundenen Proteins wurden verschiedene Konzentrationen Imidazol verwendet (50,100,150 und 200 mM). Bei 150 raM wurde die höchste Ausbeute an
Protein erhalten. Mit Polyacrylamidgel-Auftrennung und anschließender Coomassie- Färbung wurde die Aufreinigung kontrolliert. Aus 1 1 Anzuchtmedium (LB-Medium) konnten 10 mg Protein mit einem Reinheitsgrad >90 % isoliert werden.
Beispiel 4 Screening von Banken niedermolekularer chemischer Verbindungen mit
Targets unbekannter Funktion basierend auf Affinitätsselektion und Massenspektrometrie
Zur Auffindung von Inhibitoren für die Targetproteine mit unbekannter, aber für das bakterielle Überleben essentieller Funktion (wie z.B. YJEE) können Screeningver- fahren eingesetzt werden, die Substanzbanken im Hinblick auf Affinität zum Protein testen. Eine Screening-Möglichkeit ist die Affinitätsselektion aus Substanzgemischen mit anschließender Detektion der Liganden im Massenspektrometer. Dazu müssen definierte Substanzgemische verwendet werden, aus denen mit Hilfe der Massen- detektion einzelne Substanzen identifiziert werden können. Deshalb eignen sich für diese Screeningmethode insbesondere Substanzgemische, die aus kombinatorischen Synthesen hergestellt worden sind.
Ein Flüssig-Chromatographie-Elektrospray-Massenspektrometer dient als Screening- apparat, wobei die HPLC-Säule durch eine Ultrafiltrationskammer ersetzt ist. Die
Ultrafiltrationskammer besteht aus einer Filtrationseinheit, in der die Filterscheibe durch eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschluss-Molekulargewicht 10 kDa) ersetzt ist. Massenspektren werden mit Hilfe eines Massenspektrometers (von Hewlett- Packard; Palo Alto, CA; "5989B MS Engine Quadrupole Mass Spectrometer") erzeugt. Die Bedienung erfolgt wie beschrieben (vanBreemen et al., Pulsed Ultrafiltration Mass Spectrometry. A New Method for Screening Combinatorial: Anal. Chem., 69 [11], 2159-2164, 1997).
Ein äquimolares Gemisch von 96 Verbindungen (jeweils ca. 200 μM) in 10 μl DMSO wird zu 90 μl 2 μM Protein (z. B. YJEE) gegeben, das in einem 20 mM
Ammoniumacetat-Puffer vorliegt. Das Protein-Substanzgemisch wird mindestens 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Injektion des Gemisches in die Ultrafiltrationskammer wird mit Wasser für 8 min bei einer Flussgeschwindigkeit von 50 1/min gewaschen. Danach wird die mobile Phase zu Methanol/Wasser (50:50 v/v) verändert, um mögliche Liganden-Protein-Komplexe zu dissozieren und die Liganden herauszufiltern. Die Liganden werden mit Hilfe der Elektrospray- Massenspektrometrie nachgewiesen. Die anhand ihrer Massenpeaks als mögliche Liganden identifizierten Substanzen aus einem 96-Gemisch werden als Einzelsubstanzen im Affinitätstest erneut eingesetzt, um ihre Affinität für das Targetprotein (z.B. YJEE) zu verifizieren.
Beispiel 5
Substanzen, die in der Affinitätsselektion auffallen, werden weiteren Prüfungen wie dem MHK-Test unterworfen.
Dazu werden die MHK- Werte mit Hilfe der Mikrodilutionsmethode in BH-Medium bestimmt. Jede Prüfsubstanz wird im Nährmedium gelöst. In der Mikrotiterplatte werden durch serielle Verdünnung Konzentrationsreihen der Prüfsubstanzen angelegt. Zur Inokulation werden Übemachtkulturen der Erreger verwandt, die zuvor im Nährmedium 1 :250 verdünnt werden. Zu 100 ml der verdünnten, wirkstoffhaltigen Nährlösungen werden je 100 ml Inokulationslösung gegeben.
Die Mikrotiterplatten werden bei 37°C bebrütet und nach ca. 20 Stunden oder nach 3 bis 5 Tagen abgelesen. Der MHK- Wert (mg/ml) gibt die niedrigste Wirkstoff-Konzentration an, bei der kein Wachstum zu erkennen ist.
Eine weitere Methode ist die Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) im Flüssigdilutionstest. Übemachtkulturen der Testkeime (S. aureus 133) in Isosensitest-Bouillon werden 1 : 1000 in fötalem Kälberserum FKS) oder Isosensi- test-Bouillon verdünnt und mit Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungs- stufen 1 :2) inkubiert. Die Kulturen werden bei 37°C für 18 bis 24 Stunden inkubiert. Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert.
Referenzen:
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B.J. Akerly et al. Proc. Natl. Acad. Si. USA 95: 8927-8932, 1998
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T. Clementz, J. Bact. 1992 174: 7750-7756, 1992 D. T. Moir et al., Antimicrob. Agents Chemother. 43: 439-446, 1999;

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung der Proteine aus der Gruppe YQGF, YHBC, YGGJ, YGBP, YCHB, YGBB, YJEE, KDTB und deren orthologen Genprodukte in einem Assay zum Auffinden von Substanzen, die an diese Proteine binden.
2. Verwendung gemäß Anspmch 1, wobei die Proteine zu 95-100 % identisch mit den aufgeführten sind.
3. Vektoren enthaltend eines oder mehrere der Gene, die für die Proteine gemäß
Anspmch 1 und 2 codieren.
4. Transformierte Mikroorganismen enthaltend eines oder mehrere der Gene, die für die Proteine gemäß Anspmch 1 und 2 codieren.
5. Verbindungen, die an die Proteine gemäß Anspmch 1 und 2 binden.
6. Verbindungen, die an die Proteine gemäß Anspmch 1 und 2 binden und deren Aktivität modulieren.
7. Arzneimittel enthaltend eine oder mehrere Verbindungen gemäß Anspmch 5 oder 6.
8. Verwendung von Verbindungen gemäß den Ansprüchen 5 und 6 zur Herstellung von Arzneimitteln.
9. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, die Proteine aus der Gmppe YQGF, YHBC, YGGJ, YGBP, YCHB. YGBB, YJEE, KDTB und deren orthologen Genprodukte modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen mit den Proteinen zusammenbringt und prüft, ob sie binden.
0. Verfahren zum Auffinden von antibakteriell wirksamen Verbindungen, die Proteine aus der Gmppe YQGF, YHBC, YGGJ, YGBP, YCHB, YGBB, YJEE, KDTB und deren orthologen Genprodukte modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindungen mit den Proteinen zusammenbringt und prüft, ob sie binden und anschließend einem MHK-Test unterwirft.
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